FI86439B - Stabiliserade plasmider. - Google Patents

Description

1 86439

Stabiloidut plasmidit Tämä keksintö kohdistuu plasmidien stabilointiin. Plasmidit ovat hyödyllisiä yhdistelmä-DNA-tekniikan alalla geenien ja niiden tuotteiden tuottamiseksi.

Useimpien luonnollisten plasmidien jatkuva ylläpito, jopa valintapaineen puuttuessa (tekijä, joka takaa vain niiden organismien kasvun, joissa plasmidi on; esimerkkinä tästä on kas-vatusliuoksessa oleva antibiootti sellaisessa tapauksessa, että plasmidin kantama geeni saa antibiootin vastustuskyvyn aikaan), antaa olettaa, että plasmidin ylläpitotoiminnot ovat kehittyneet takaamaan tehokkaasti näiden kromosomien ulkopuolisten osasten jatkuvan läsnäolon. Plasmidin ylläpitotoiminnot koostuvat pääasiassa replikaatiogeeneistä mukaan lukien niiden säätöpiirit, jotka säätelevät solun plasmidipitoisuutta. Kasvavassa solussa replikaation säätöjärjestelmä osoittaa plasmidikopioiden lukumäärän, ja korjaa poikkeamat keskimääräisestä arvosta nostamalla tai laskemalla plasmidin replikaation todennäköisyyttä. Kuitenkaan mikään replikaation säätöjärjestelmä ei voi estää sellaisten solujen esiintymistä, joissa on erittäin vähän tai vain yksi plasmidin kopio, ja plasmidittomien tytärsolujen muodostumistodennäköisyys tämänkaltaisista soluista on ilmeistä. Tämä ongelma on tietysti suurin sellaisille plasmideille, joiden kopioiden lukumäärä on pieni. Lisäksi plasmidimolekyylien passiivinen jakautuminen solun jakaantuessa johtaa väistämättä tiettyyn plasmidittomien solujen esiintymistiheyteen. Koska plasmidimolekyylin poistuminen solusta on peruuttamatonta, niin tämän kaltaisen epävakaan tilanteen seurauksena tulee olemaan se, että mahdollisesti koko populaatiosta tulee plasmiditon.

Sen ohella, että plasmidit jakautuvat satunnaisesti solun jakaantuessa, saattavat myös muut tekijät vaikuttaa plasmidien katoamisnopeuteen sellaisesta soluviljelmästä, jota on kasvatettu plasmidien ylläpidon valintatekijän puuttuessa.

2 86439

Esimerkiksi jotkut plasmidit vaativat erityisen yhdistymis-järjestelmän, jotta ne vapauttaisivat kaksi uutta replikoitua molekyyliä (Austin et al.f Cell 25, 1981, sivut 729-36). Resoluution puuttuessa muodostuu multimeereja (toisiinsa kytkeytyneet) ja tällä tavoin jopa sellainen plasmidi, jonka kopioiden lukumäärä on suuri, saattaa vaikuttaa plasmidilta, jolla on vain vähän kopioita tytärsoluihin jakautumisen tasolla, sillä plasmidittomien solujen muodostumistodennäköisyys kasvaa, kun multimeerisiksi rakenteiksi kytkeytyneiden plas-midien lukumäärä lisääntyy. Toinen ilmiö, joka havaitaan usein yhdistelmä-DNA-tekniikassa on stabiilin kloonausvektorin muuntuminen epästabiiliksi hybridiplasmidiksi DNA-kappaleen istuttamisen seurauksena. DNA-kappaleen läsnäolo aiheuttaa joko plasmidin kopioiden lukumäärän pienenemisen tai saa aikaan haitallisen tuotteen, joka vaikuttaa negatiivisesti solun kasvuun .

Kaikissa tällaisissa tapauksissa plasmidien erittymistä ja hävikkiä tapahtuu sellaisella esiintymistiheydellä (alhainen tai korkea),joka ei helposti ole säädeltävissä ulkopuolelta.

Luonnollisten plasmidien stabiilisuus, ja erityisesti sellaisten plasmidien stabiilisuus, joiden kopioiden lukumäärä on alhainen, antaa olettaa, että replikaation säätelyjärjestelmän lisäksi on olemassa myös toinen ylläpitotoimintojen sarja, joka osallistuu aktiivisesti plasmidimolekyylien järjestelmälliseen jakautumiseen solun jakaantuessa. Tällaisia toimintoja on alettu kutsua jakotoiminnoiksi, ja tutkimukset, kuten Meacock et ai., Cell 20, 1980, sivut 529-42, Nordström et ai., Plasmid 4, 1980, sivut 332-49, Seelke et ai., Plasmid 7, 1982, sivut 163-79, ovat jo osoittaneet, että itse plasmidit (par-alueillaan) ainakin osittain koodaavat näitä. Täten tietyt plasmideja hävittävät mutantit ovat menettäneet stabiilin ylläpitonsa tai periytymisensä huolimatta niiden normaalista villin tyypin replikaatiokäyttäytymisestä, mikä osoittaa sen, että stabiilisuuden turvaava, plasmidi-spesifinen toiminto on kadonnut (ks. Nordström et ai., mainittu edellä).

3 86439

Koska useista niistä plasmideista, joita käytetään vektoreina DNA-tekniikassa, suuri määrä DNA:ta on hävinnyt verrattuna villin tyypin emoplasmidiin, niin niillä on taipumusta periytyä epästabiilisti. Tämä aiheuttaa vakavia ongelmia, sillä plasmidin epästabiilisuus johtaa lopulta plasmidin täydelliseen häviämiseen solusta, ja joka tapauksesa tämä pienentää plasmi-dien koodaamien geenituotteiden suhteellista saantoa. Tämä ongelma korostuu erityisesti geenituotteiden teollisessa tuotannossa, jossa mikro-organismien kasvattaminen valintapaineessa, esim. antibiootin läsnäollessa, ei tavallisesti ole kannattavaa ja harvoin toivottavaakaan, kun ympäristönäkökohdat otetaan huomioon, ja kun mikro-organismeja kasvatetaan usean sukupolven ajan. Vektorit, joita on vain muutama kopio solussa, periytyvät mitä todennäköisimmin epästabiilisti ja tästä syystä ne katoavat solusta. Jopa sellaisten plasmidien, joiden kopioiden määrä on tavallisesti suuri, mikä takaa plasmidin suhteellisen stabiilisuuden, tiedetään tulleen epästabiileiksi, kun niihin istutetaan sellaisia DNA-kappaleita, joissa on plasmidille epäluonnollisen outoja geenejä.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

Tämä keksintö kohdistuu sellaisiin plasmideihin, joihin on istutettu sellainen geeni tai sellaisia geenejä, joilla ei .*.<a luonnostaan ole mitään sukulaisuutta plasmidin kanssa, ja . joihin on lisäksi istutettu sellainen DNA-kappale, joka saa ____: jakotoiminnon aikaan. Termillä "istutettu" on tarkoitus osoit- . taa, että geeni tai geenit tai DNA-kappale on viety plasmidin sisään lopullisen plasmidin rakentamisen yhden vaiheen aikana.

Tässä yhteydessä termi "jakotoiminto" tarkoittaa sellaista ;.**: toimintoa, joka takaa plasmidimolekyylin järjestäytyneen ja kautumisen solun jakaantuessa, ja jonka plasmidin osa-alue koodaa, ja tämä osa-alue voi käsittää yhden tai useampia geenejä riippuen toiminnan esiin tuovan plasmidin tyypistä. Kuten edellä on mainittu, tämän kaltaisia osa-alueita tavataan luonnollisesti esiintyvissä eli villin tyypin plasmideissa, mutta niiden plasmidien, joissa Par+-fenotyyppi tulee esiin, < 86439 so. joissa jakogeenejä on läsnä, ja joihin on myös istutettu sellainen geeni tai sellaisia geenejä, joilla ei luonnostaan ole sukulaisuutta plasmidin kanssa, arvellaan olevan uusia.

Tässä yhteydessä plasmidit määritellään luonnollisesti esiintyvinä, mikro-organismien kromosomien ulkopuolisina osasina, joita on mahdollista eristää joko sinänsä tai johdannaisinaan.

Keksinnön plasmideja voidaan käyttää kloonaukseen tai tuotan-tovektoreina yhdistelmä-DNA-tekniikassa, kun tarkoituksena on saada suuri joukko tuotteita teknisiin tai lääketieteellisiin tarkoituksiin, kun nämä tuotteet ovat suoraan tai epäsuoraan istutetun geenin tai istutettujen geenien välittämiä, erityisesti polypeptidejä ja proteiineja tai näiden kappaleita, entsyymejä sekä lukuisa joukko entsyymireaktioissa syntyviä proteiineista poikkeavia tuotteita, tuotteita, joiden molekyyli-paino on alhainen, kuten hormoneja ja nukleiinihappoja; erityisen mielenkiinnon kohteena ovat eukarioottisten, erityisesti imettäväisistä peräisin olevien geenien tuotteet.

Tämän keksinnön edullisimman toteutusmuodon kanssa on yhtäpitävää se, että villin tyypin resistenssiplasmidin Rl osa-alue tuo luonnostaan tässä tarkoitetun jakotoiminnon esiin, ja tästä syystä tätä osa-aluetta nimitetään seuraavassa Rl par-osa-alueeksi. Tämän keksinnön mukaisesti tämän osa-alueen on todettu aiheuttavan ei ainoastaan epästabiilien Rl miniplasmi-dien osittaista tai täydellistä stabiilisuutta, kun näissä miniplasmideissa on geeni tai geenejä, joilla ei luonnostaan ole sukulaisuutta plasmidin kanssa, vaan myös usein erittyvien plasmidien osittaista tai täydellistä stabiilisuutta, kun näillä plasmideilla ei ole sukulaisuutta plasmidiin Rl, jossa on geeni tai geenejä, joilla ei ole luonnostaan sukulaisuutta plasmidin kanssa. Toinen esimerkki erityisen arvokkaasta jako-toiminnosta on se, joka on löydetty villin tyypin plasmidista F (Seelke et ai., mainittu edellä) ja joka myös saa vastaan-ottajaplasmidin korkean stabiilisuusasteen aikaan. Seuraavassa viitataan lähinnä Rl par-toimintoon, vaikkakin tulisi ymmärtää.

5 86439 että monet Rl par-toimintoon liittyvät ilmiöt pätevät myös muille par-toiminnoille, ja että keksinnön yleinen sisältö laajimmassa muodossaan ei rajoitu Rl par-toimintoon.

Aiemmin on jo huomautettu, että niinsanottu EcoRl-A-kappale saa Rl-plasmidin jakotoiminnon aikaan (ks. Nordström et ai., Plasmid 4, 1980, sivut 332-49). Tähän keksintöön johtavan tutkimustyön aikana havaittiin yllättävästi, että pituudeltaan noin 19 kb:tä (19 000 emäsparia) olevat EcoRl-A-kappaleet käsittävät kaksi ja vain kaksi sellaista selvää osa-aluetta, jotka vastaanottajaplasmidissa aiheuttavat par+-fenotyypin. Nämä osa-elueet ovat sijoittuneet EcoRl-A-kappaleen jompaan kumpaan päähän, ja tällä hetkellä uskotaan, ettei millään muulla EcoRl-A-kappaleessa olevalla DNA-sekvenssillä ole mitään plas-midia stabiloivaa toimintoa. Tämän keksinnön tarkoituksiin nämä kaksi osa-aluetta on merkitty par-osa-alueena A ja par-osa-alueena B, jotka vastaavasti lyhennetään parA ja parB.

On edullista työskennellä niin pienillä DNA-kappaleilla kuin mahdollista, koska pienet kappaleet on helpompi istuttaa plas-midiin, ja näin saadut plasmidit on helpompi siirtää isäntä-soluun, eräs tämän keksinnön kohdista kohdistuukin sellaisiin plasmideihin, joihin on istutettu Rl plasmidin EcoRl-kappaletta lyhyempi DNA-kappale, joka sisältää myös Rl par-osa-alueen. Pääasiallisina komponentteinaan tämä istutettu DNA-kappale käsittää tavallisesti Rl par-osa-alueen A-osa-alueen, Rl par-osa-alueen B-osa-alueen tai molemmat Rl par-osa-alueen A ja Rl par-osa-alueen B. Tämä tarkoittaa sitä, että itseasiassa koko isäntäplasmidiin istutettu DNA-kappale koostuu joko jommasta kummasta tai molemmista par-osa-alueista, ja muu kappaleissa oleva DNA on pääasiassa läsnä vain tarjotakseen sopivia restriktiokohtia, ja ne muodostavat sellaisia sopivia DNA-kappaleita, joiden päät ovat halutunlaisia. Nämä päät kykenevät helposti kilpailemaan vastaanottajaplasmidissa olevan vastaavan kohdan tai kilpailevan restriktiokohdan kanssa.

Näitä päitä saadaan myös aikaan sitojien avulla. Tärkeätä on 6 86439 kuitenkin pitää mielessä, että DNA-kappaleet, jotka käsittävät par-osa-alueen A, sekä DNA-kappaleet, jotka käsittävät par-osa-alueen B voidaan viedä erikseen tai peräkkäin samaan plasmidiin, jonka tällöin tulee fenotyypiltään olla identtinen sellaisen plasmidin kanssa, johon fenotyyppi ParA+, ParB+ on vakiintunut sen seurauksena, että par-osa-alue A ja par-osa-alue B on istutettu samaan DNA-kappaleeseen. Esimerkiksi mikäli halutaan stabiloida edelleen sellaista plasmidia, jossa on jo par-osa-alue, kuten parB-osa-alue, niin plasmidi voidaan pilkkoa sopivalla restriktioentsyymillä, ja tämän jälkeen voidaan istuttaa sellainen DNA-kappale, jonka päät voivat kilpailla tämän restriktiokohdan kanssa, ja jossa on toinen mahdollinen par-osa-alue, kuten parA-osa-alue.

Päinvastaista toimenpidesarjaa, so. parB-osa-alueen istuttamista plasmidiin, jossa on jo parA-osa-alue, voidaan myös käyttää samaan tapaan. Tämän kanssa yhtäpitävää on se, että mielenkiintoisia plasmideja ovat ne plasmidit, joissa istutetun.

Rl par-osa-alueen A ja Rl par-osa-alueen B käsittävän DNA-kappa-leen pituus ei ylitä noin 6 kb, erityisesti ei ylitä 4 kb, ja erityisesti ei ylitä 3 kb. Kun istutettu DNA-kappale käsittää Rl par-osa-alueen A, niin sen pituus ei tavallisesti ylitä noin 4 kb, erityisesti se ei ylitä noin 2,5 kb ja erityisesti se ei ylitä noin 2 kb. Kun istutettu DNA-kappale käsittää Rl par-osa-alueen B, niin sen pituus ei tavallisesti ylitä 2 kb, erityisesti se ei ylitä noin 1,5 kb, ja erityisesti ei ylitä noin 1 kb. Se, että edellä mainituista syistä pieniä DNA-kappaleita suositaan, ei kuitenkaan saisi aiheuttaa sen mahdollisuuden unohtamista, että plasmidin stabiilisuus saavutetaan istuttamalla koko EcoRl-A-kappale; tämä saattaa olla hyväksyttävää esimerkiksi silloin, kun stabiloitavan plasmidin koko ei ole niin kriittinen. Mikäli kappale istutetaan in toto, saattaa seurantatarkoituksia silmällä pitäen olla edullisempaa varustaa DNA-kappale antibioottiresistenssin välittävällä geenillä. Mikäli kuitenkin jostakin syystä on toivottavaa pienentää EcoRl-kappaleen kokoa, voidaan tämä toteuttaa lukuisilla tavoilla, kuten restriktioentsyymin Pstl avulla tapahtu- 7 86439 valla EcoRl-A-kappaleen osittaisella pilkkomisella, tai leikkaamalla jokainen Rl par-osa-alue irti suuresta kappaleesta ja siirtämällä jokainen osa-alue peräkkäin samaan DNA-kappaleeseen, joka tämän jälkeen voidaan istuttaa stabiloitavaan plasmidiin.

Plasmidit, jotka on stabiloitu tämän keksinnön periaatteiden mukaisesti voivat olla joko sellaisia plasmideja, joilla on luonnollista sukulaisuutta istutettuun jakoalueeseen, esimerkkinä tästä ovat Rl-miniplasmidit, jotka on stabiloitu istuttamalla Rl par-osa-alue (Rl-miniplasmideista suuri osa alkuperäisestä Rl DNA:sta on kadonnut, joten tavallisesti ne eivät itse sisällä Rl par-osa-aluetta), tai ne voivat olla sellaisia plasmideja, joilla ei ole luonnollista sukulaisuutta jakotoi-minnon kanssa. On mielenkiintoista havaita, että tämän keksinnön mukaisesti hyödylliset, tehokkaat jakotoiminnot kykenevät takaamaan tyydyttävän stabiilisuuden ei vain sellaisille plas-mideille, joihin niillä luonnostaan on sukulaisuutta, mistä esimerkkinä on Rl-miniplasmidin stabiloiminen Rl par-osa-alueel-la, vaan myös sellaisille plasmideille, joihin jakotoiminnolla oi luonnostaan ole sukulaisuutta. Jälkimmäisestä esimerkkinä on Rl par-osa-alueen istuttaminen plasmidiin, joka ei ole Rl-plasmidi, kuten pMBl-plasmidi tai sen johdannainen, kuten pBR322-plasmidi tai sen johdannainen (nämä plasmidit ovat tavallisesti stabiileja, mutta niillä on taipumusta muuttua epästabiileiksi, kun niihin istutetaan sellainen geeni tai sellaisia geenejä, joilla ei ole sukulaisuutta plasmidiin). Toisena esimerkkinä on Rl par-osa-alueiden käyttö tietyn tyyppisten plasmidien stabilointiin, kun vähintään plasmidin sisältävien bakteerien kasvatuksen yhden vaiheen aikana näiden tyyppien kopioiden lukumäärä on alhainen, so. kopioiden lukumäärä on 0,5-5 kopiota solua kohden, tästä esimerkkinä ovat plasmidit, joiden kopioiden lukumäärä on alhainen ja jotka voidaan siirtää useaan erilaiseen isäntään (plasmidit, jotka kykenevät replikoituinaan useassa erilaisessa isäntäkan-nassa tai -lajissa; tähän luokkaan kuuluvat nk. edestakaisvek-torit, jotka kykenevät replikoituinaan kahdessa tai useamman 8 86439 tyyppisessä mikro-organismissa), sekä näiden johdannaiset, kuten esim. RK2. Rl:n lisäksi yhteensopimattomien plasmidien ryhmään IncFll kuuluu muita stabilointia vaativia plasmideja, kuten R100 ja R6. Rl par-osa-alueen käyttö epästabiilien plas-midin F johdannaisten stabilointiin kuuluu myös tämän keksinnön piiriin.

Erään plasmidityypin, jolle tämän keksinnön mukainen stabilointi on tärkeätä, muodostavat ehdolliset kiitoreplikaation plasmidit, so. sellaiset plasmidit, joiden, kun plasmidit sisältäviä isäntänä toimivia mikro-organismeja kasvatetaan tietyissä olosuhteissa, plasmidikopioiden lukumäärä on pysyvän alhainen, ja jotka, kun plasmidit sisältäviä mikro-organismeja kasvatetaan tietyissä, erilaisissa olosuhteissa, menettävät replikaation säätelynsä, niin että niiden plasmidikopioiden lukumäärä kasvaa eksponentiaalisesti niin kauan, kunnes isäntä-solu lakkaa kasvamasta. Kiitoreplikaatioplasmideja, joille tämän keksinnön mukainen stabilointi on erityisen elintärkeätä, ovat sellaiset kiitoreplikaatioplasmidit, joiden kopioiden lukumäärä ei ylitä noin 3-5 kopiota solua kohden, ja erityisesti sellaiset plasmidit, joiden kopioiden lukumäärä ei ylitä noin 0,5-1 kopiota solua kohden (luvulla 0,5 tarkoitetaan sitä, että replikaation esiintymistiheys solusykliä kohden on pienempi kuin yksi), kun plasmidit sisältäviä mikro-organismeja kasvatetaan sellaisissa olosuhteissa, joissa tämänkaltainen alhainen kopioiden lukumäärä on mahdollinen, ja sellaisille plasmideille, joiden kopioiden lukumäärä on vähintään suuruusluokkaa 500-1000 kopiota solua kohden, kun isäntinä toimivia mikro-organismeja kasvatetaan tietyissä, erilaisissa olosuhteissa, jotka takaavat oleellisesti suuremman plasmidikopioiden lukumäärän.

Tietyissä olosuhteissa alhainen plasmidikopioiden lukumäärä on toivottavaa (tyypillisesti alhaisessa lämpötilassa, kuten noin 30°C:n lämpötilassa), kun plasmideja käytetään vektoreina istutettaessa sellaisia vieraita geenejä, joiden koodaamat tuotteet ovat isäntäsolulle osittain toksisia tai tappavia, 9 86439 sillä johtuen plasmidien alhaisesta replikaationopeudesta, minkä esim. alhainen lämpötila aiheuttaa, vain pieni määrä geenejä, mikäli lainkaan, ekspressoi, niin että solut pysyvät vahingoittumattomina kasvatuksen lisääntymisvaiheessa. Kuitenkin niissä plasmideissa, joiden kopioiden lukumäärä lisäänty-misvaiheen olosuhteissa on erittäin alhainen, kuten edellä on mainittu, esimerkkinä solujen kasvattaminen alhaisessa lämpötilassa, par-osa-alueen puuttuminen aiheuttaa plasmidin katoamisen mikrobipopulaatiosta 1 %:n esiintymistiheydellä sukupolvea kohden, kun kyseessä on sellainen plasmidi, joiden kopioiden lukumäärä ei ylitä 3-5 kopiota solua kohden, kun näitä soluja kasvatetaan sellaisissa olosuhteissa, jotka takaavat tämänkaltaisen alhaisen kopioiden lukumäärän. Katoamisen esiintymistiheys sellaisille plasmideille, joiden kopioiden lukumäärä ei ylitä noin 0,5-1 kopiota solua kohden on noin 5 %/solu/sukupolvi. On ilmeistä, että ilman mitään plasmideja stabiloivaa jakotoimintoa plasmidit katoaisivat soluista ennen kuin solut olisivat saavuttaneet kasvatusliuoksessa sellaisen tiheyden, että kiitoreplikaation indusoiminen olisi taloudellista; asianlaita on näin erityisesti teollisessa tuotannossa, jossa solun kasvulta vaaditaan useita satoja sukupolvia tuotantoon soveltuvan viljelykoon saavuttamiseksi.

Tämä kiitoreplikaatio on voitu tehdä ehdolliseksi istuttamalla säädeltävissä oleva promoottori plasmidin luontaisten repli-kaatiota säätelevän geenin tai säätelevien geenien ylävirran puolelle (yksityiskohtainen kuvaus tästä ilmiöstä on löydettävissä tämän hakijan yhtä aikaa käsiteltävnä olevasta hakemuksesta, jonka otsikko on "Plasmids with Conditional Uncontrolled Replication Behaviour", ja joka on annettu käsiteltäväksi (filed) samana päivänä tämän hakemuksen kanssa). Plasmidit, joilla on kiitoreplikaatiokäyttäytymistä, voivat olla monen eri tyyppisiä, mutta edullisimmat plasmidit, joissa kiitorepli-kaatiota esiintyy, ovat tyypiltään Rl-plasmideja.

Tässä spesifikaatiossa termillä "stabiilisuus" (ja muilla vastaavilla termeillä) tarkoitetaan sitä isäntäsolusta tapahtuvaa 10 86439 plasmidin katoamisen esiintymistiheyttä, joka on pienempi kuin -4 2 x 10 solua ja sukupolvea kohden. Itse asiassa sellaisia plasmideja on mahdollista saada, jotka ovat yhtä stabiileja kuin villi-tyypin plasmidit, so. joiden katoamisen esiintymistiheys on vähemmän kuin 3 x 10 solua ja sukupolvea kohden, mikä vastaa geenien mutaationopeuden tasoa, kun plasmidiin liitetään Par-toiminto. Jälkimmäinen katoamisen esiintymistiheyden arvo (LF) on ilmeinen, kun plasmidin stabilointiin on käytetty sekä Rl par-osa-aluetta A ja Rl par-osa-aluetta B, mistä esimerkkinä on se, että koko EcoRl-A-kappale on istutettu plasmidiin.

Kuten edellä on mainittu, plasmidin Rl Par+-fenotyyppi on kuitenkin paikallistettu EcoRl-A-kappaleen kuhunkin erilliseen par-osa-alueeseen. On todettu, että kukin näistä par-osa-alueista aiheuttaa epästabiileissa plasmideissa stabiloivan vaikutuksen, jolloin nämä plasmidit voidaan määritellä sellaisiksi plasmideiksi, joilta puuttuu stabiloiva toiminto, eli jakotoiminto. Fenotyypiltään Par -muotoiset plasmidit katoavat tavallisesti isäntäsolustaan suurella tai pienellä esiintymistiheydellä; täten esimerkiksi Rl-plasmidin johdannaiset, joista par-osa-alue puuttuu, katoavat isäntäsolustaan suurinpiirtein -2 esiintymistiheydellä 1,5 x 10 solua ja sukupolvea kohden.

Samoin pl5-plasmidin johdannaiset, tyypiltään Par , katoavat -2 suurin piirtein esiintymistiheydellä 1 x 10 solua ja sukupolvea kohden, ja jotkut pMBl-plasmidin (pBR322) johdannaiset (kuten esimerkissä 3.3 esitetty) saattavat kadota suurin piir- -3 tein esiintymistiheydellä 6 x 10 /solu/sukupolvi. Kääntäen, joko parA:lla tai parB:llä yksin stabiloitujen Rl-plasmidien -4 LF-arvo on noin 10 solua ja sukupolvea kohden, mikä vastaa 100-kertaista stabiloitumista, kun DNA-kappale, jossa on jompi kumpi näistä par-osa-alueista, istutetaan epästabiiliin vekto- -4 rim; vastaavan pl5-johdannaisen lukemat ovat noin 8 x 10 + “6 + (Par A ), 1 x 10 (Par B ), ja vastaavan pMBl-johdannaisen — 5 + lukemat ovat 5 x 10 (Par B ). Plasmidien, joissa on sekä — £ par A- että par B-osa-alue, LF-arvo on noin 10 solua ja n 86439 4 sukupolvea kohden, eli 10 -kertainen stabiloituminen. Jotta yksinkertainen vertaaminen olisi mahdollista, alkuperältään erilaisten, stabiloitujen ja epästabiilien replikonien tulokset on esitetty taulukossa 1. Tämä osoittaa, että kukin par-osa-alue toimii toisistaan riippumatta, ja että par-osa-alueet ovat suurin piirtein yhtä tehokkaita stabiloimaan vähintään Rl- ja pl5-plasmideja ja että niiden toiminta tai vaikutus on kumuloituva. Tätä havaintoa voidaan käyttää, kun määritetään sitä astetta, johon epästabiili plasmidi on stabiloitava.

Mikäli voimakasta stabilointia ei tarvita, eli mikäli arvioidaan, että stabiloitava plasmidi ei ole liian epästabiili -2 (sen LF-arvo on vähemmän kuin 10 /solu/sukupolvi), saattaa olla riittävää istuttaa toisen par-osa-alueen sisältävä DNA- kappale riittävän stabiilisuuden saavuttamiseksi, eli estämään plasmidin asteittainen katoaminen teollisen tuotannon bakteeri- populaatiosta usean sukupolven aikana. Toisaalta, jos plasmidi _2 on erittäin epästabiili (sen LF-arvo on suurempi kuin 10 ), saattaa olla välttämätöntä tai vähintään edullista istuttaa molemmat par-osa-alueet plasmidien äärimmäisen stabiilisuuden takaamiseksi.

Taulukko 1

Eri replikonien häviämisen esiintymistiheydet solua ja suku- polvea kohden_ — 4 Häviämisen esiintymistiheydet x 10 solua ja sukupolvea kohden

Replikoni- _ Par-fenotyyppi +

tyyppi Par ParA+ ParB+ ParA+ ParB

Rl 150 0,6 1,0 0,04 pl5 100 8,0 0,01 0,01 pMBl (pBR322) 60 ND1 0,5 0,1 ^ND = ei tunneta Näitä mitattavia LF-arvoja voidaan käyttää käytettäessä mitä tahansa edellä kuvattua plasmidityyppiä vektorina geenituot-teiden tuotannossa, ja plasmidin tulisi sisältää vähintään i2 86439 yksi sellainen geeni, jolla ei ole luonnollista sukulaisuutta plasmidin kanssa. Tämän keksinnön lisänäkökohta kohdistuu täten menetelmään tuottaa geenituotteita plasmidi-DNA:sta, jossa par-stabiloituja, millä tahansa edellä kuvatuilla ominaisuuksilla varustettuja plasmideja sisältäviä bakteereita viljellään, ja plasmidin geenituote otetaan talteen bakteeri-viljelmästä. Kasvatuksen per se sopiva suorittaminen tapahtuu käyttämällä tavanomaisia menetelmiä, ne tavanomaiset kasvatus-liuokset mukaanlukien, joiden tiedetään olevan optimaalisia kyseessä olevalle bakteerilajille. Huomionarvoista on se, että stabiloinnista johtuen kasvatusliuoksen erityistä koostumusta ei tarvita. Täten geenituotteen erottaminen suoritetaan hyvin tunnettujen menetelmien mukaisesti, kunhan nämä menetelmät on sovitettu vastaamaan kyseessä olevaa valmistettua geeni-tuotetta ja sen ominaisuuksia, isäntäbakteerin ominaisuuksia, jne. Kasvatusta jatketaan vähintään 100 bakteerisukupolven ajan; teollisessa tuotannossa bakteerien lisääntymiseen tarvittavien solun sukupolvien lukumäärä voi olla enemmän kuin 100 sukupolvea. Näissä olosuhteissa plasmidissa olevan par-osa- alueen läsnäolon avulla plasmidin LF-arvo valitaan siten, -4 että plasmidien katoaminen on vähäisempää kuin 2 x 10 /solu/ sukupolvi. Tämä LF-arvo voidaan tavallisesti saavuttaa vain yhden par-osa-alueen avulla.

Kuitenkin joissain tapauksissa on suotavaa saavuttaa plasmi- -5 din LF-arvoksi vähemmän kuin 10 /solu/sukupolvi, erityisesti “6 vähemmän kuin 10 /solu/sukupolvi.

Vaikkakin nämä hyvin alhaiset LF-arvot voidaan joissakin tapauksissa saavuttaa istuttamalla vain yksi par-osa-alue (erityisesti Rl par-osa-alue B), kuitenkin alhaiset arvot vaativat molempien Rl par-osa-alueiden läsnäolon.

Keksinnön lisänäkökohta kohdistuu sellaisiin bakteereihin, joissa on edellä määritetyn tyyppisiä plasmideja. Keksinnön plasmidien erityinen etu on se, ettei mitään erityistä mutant-tia tai kantaa tarvita turvaamaan plasmidin ylläpitoa. Täten i3 86439 voidaan käyttää mitä tahansa sellaista bakteerilajia tai -kantaa, joka kykenee säilyttämään tämänkaltaisen plasmidin, tästä esimerkkinä ovat gram-negatiiviset bakteerit. Escherichia coli on erityinen esimerkki sellaisesta bakteerista, jossa tämän keksinnön mukaiset plasmidit kykenevät replikoitumaan ja säilyttämään stabiilisuutensa.

Lopuksi tämä keksintö kohdistuu sellaisiin DNA-kappaleisiin, jotka käsittävät pääasiallisena osanaan Rl par-osa-alueen.

Tästä seuraa se, että itse asiassa koko isäntäplasmidiin istutettu DNA-kappale on muodostunut jommasta kummasta par-osa-alueesta, ja muu jäljellä oleva DNA on läsnä taatakseen sopivia restriktiokohtia istuttamista varten, ja tällöin vastaanottavassa plasmidissa on näiden kanssa yhteen sopivia restriktiokohtia. Rl par-osa-alueen A ja Rl par-osa-alueen B sisältävän, istutetun DNA-kappaleen pituus, tämän periaatteen mukaisesti, ei saisi ylittää noin 6 kb, erityisesti ei saisi ylittää noin 4 kb ja erityisesti ei saisi ylittää 3 kb. Kun DNA-kappale käsittää Rl par-osa-alueen A, niin tällöin sen pituus ei tavallisesti ylitä noin 4 kb, erityisesti ei ylitä noin 2,5 kb ja erityisesti ei ylitä noin 2 kb. Kun DNA-kappale käsittää Rl par-osa-alueen B, niin tällöin sen pituus ei tavallisesti ylitä 2 kb, erityisesti ei ylitä noin 1,5 kb ja erityisesti ei ylitä noin 1 kb. Yllättävästi on todettu, että tämänkaltaiset pienet, ja pienuutensa johdosta helposti istutettavat DNA-kappaleet ovat säilyttäneet stabiloivat toimintonsa, koska parA-osa-alue on kaventunut alueeksi, jonka pituus on noin 1800 bp (emäsparia), ja parB-osa-alue on kaventunut noin 900 bp pituiseksi. Tämä on todettu restriktioentsyymien avulla. On mahdollista, että Par+-fenotyypin itse asiassa aikaansaava geeni tai aikaansaavat geenit ovat vieläkin pienempiä.

Par+-fenotyyppisten hybridiplasmidien muodostamisessa on vakavana ongelmana ollut tälle fenotyypille soveltuvan, nopean ja yksinkertaisen toteamismenetelmän puuttuminen. Yleensä todelliset hybridiplasmidit voidaan identifioida Par+-fenotyypistään, i4 86439 mikä johtaa plasmidin huomattavaan stabiilisuuteen plasmidin kasvatuksen aikana ilman valintapainetta. Kuitenkin tämänkaltainen toteamismenetelmä on aikaa vievä, ja se on joka tapauksessa vain silloin asianmukainen, mikäli emäplasmidi periytyy epästabiilisti. Vaihtoehtoisia toteamismenetelmiä on nyt myös kehitetty, ja niitä kuvataan seuraavassa.

a) Toteamis- ja valikointimenetelmä parA+-kappaleiden istuttamiseen_

Mikäli solussa on kaksi erilaista plasmidia (erillisistä yhteen-sopimattomuusryhmistä), joissa kummassakin on parA+-osa-alue, niin nämä plasmidit karkoittavat toinen toistaan tietyllä esiintymistiheydellä (yhteensopimattomuus), todennäköisemmin siitä syystä, että ne kilpailevat solun jakautumismekanismista. Tätä tyyppiä par-toiminnon välittämää yhteensopimattomuusfenotyyppiä voidaan käyttää hyväksi par-hybridien toteamiseen. Esimerkiksi ParA+-plasmidi on voitu siirtää Alac E. coli-kantaan (esim. CSH50), jossa on toinen lac-geeneillä ja parA+-osa-alueella varustettu plasmidi. Tavallisesti sisään tuleva plasmidi saa aikaan par+-välitteisen yhteensopimattomuusilmiön solussa jo olevaa ParA+-plasmidia kohtaan. Solussa jo olevan plasmidin Lac+-fenotyypin avulla tämänkaltainen yhteensopimattomuus on helposti todettavissa, mikäli transformantit valikoidaan ainoastaan sisäänvietävistä plasmideista löytyneiden resistenssin merkkiaineiden perusteella, kun taas solussa jo olevan plasmidin läsnäolo tai plasmidin puuttuminen havaitaan indikaattori-substraattien avulla, joista esimerkkinä McConkey-laktoosi-alusta. Replikoitujen pesäkkeiden siirtäminen tämänkaltaisilta maljoilta uusiin samanlaisiin maljoihin paljastaa jo alhai-setkin, solussa jo olevan plasmidin karkoittamisen tasot värittöminä pesäkkeinä, jotka osoittavat Lac -solujen esiintymisen. Muun stabiilisuuskokeen tai perinpohjaisemman yhteensopimattomuuden osoittavaft kokeen suorittaminen saattaa olla välttämätöntä, jotta potentiaalisten parA+-hybridiplasmidien ominaisuudet saataisiin testatuiksi. Tällä tavalla Inc+(Par+)-kappaleiden epästabiilisuus tai stabiilisuus on mahdollista is 86439 todeta nopeasti näiden kappaleiden mihin tahansa plasmidiin tapahtuvaa istuttamista varten - kun käytetään sisään vietävän ja solussa jo olevan plasmidin asianmukaista (yhteen sopivaa) yhdistelmää.

b) Toteamis- ja valikointimenetelmä parB+-kappaleiden istuttamiseen___

Koska on myös osoitettu, että kaksi sellaista plasmidia, joilla ei ole sukulaisuutta keskenään ja joissa molemmissa on parB+-osa-alue, ovat toinen toisiinsa nähden yhteensopimattomia, niin parB+-hybridien muodostamiseen on käytettävissä sama toteamis- ja valikointimenetelmä, kuin joka kuvattiin parA+-hybridien muodostamiseen.

c) Toteamis- ja valikointimenetelmä parA+, B+-kappaleiden istuttamiseen_

Sen lisäksi, että EcoRl-A-kappale, jossa on Tn5-istutus, kykenee karkoittamaan sekä parA+- että parB+-hybridiplasmidit edellä kuvatun mukaisesti, se sallii parA+, parB+-kappaleita kantavien £ plasmidien suoran valikoinnin (Km ). Huolimatta kappaleen suuresta koosta voidaan täten valita helposti vain hyvinkin pieni hybridien määrä. Molemmat par+-osa-alueet sisältävä pienempi DNA-kappale aiheuttaa luonnollisesti yhteensopimattomuutta molempia parA+- ja parB+-plasmideja kohtaan.

Tässä viitataan piirustukseen, jossa kuvat 1-5 ja 7-17 esittävät esimerkeissä kuvattujen plasmidien restriktiokarttaa, kuva 6 esittää Rl:stä peräisin olevan Pstl-D-kappaleen yksityiskohtaista karttaa ( ei ole piirretty oikeaan mittakaavaan) , ja kuva 18 esittää eri replikonityyppien stabiilisuuskäyriä Par--replikoneihin verrattuna, kun näissä eri replikonityypeissä on eri par-osa-alueita.

Kuvissa 1-5 ja 7-17 esitetään esimerkeissä kuvattujen plasmidien lineaarisia restriktiokarttoja, joihin plasmidien feno- i6 86439 tyypit ja genotyypit on merkitty emäplasmidia tarkoittavan vaakasuoran viivan yläpuolelle. Täten parA edustaa yhtä plas-midin Rl niistä osa-alueista, jotka takaavat plasmidin ylläpidon, parB edustaa plasmidin Rl muuta osa-aluetta, joka takaa plasmidin ylläpidon; icel edustaa geeniä, joka välittää kolisiini El-immuniteetin; ori tai oriV edustaa plasmidin replikaation alkuperää; bla edustaa geeniä, joka koodaa ampi- silliiniresistenssin; IR edustaa Tn5:n käänteistä toistoraken-

R R

netta; Km edustaa kanamysiiniresistenssiä; Cm edustaa kloram- p fenikolin resistenssiä; Ap edustaa ampisilliiniresistenssiä;

Te edustaa tetrasykliiniresistenssiä; repA edustaa geeniä, joka koodaa Rl:n replikaatioon tarvittavaa proteiinia; IacZ,

IacY ja IacA edustavat istutettua lac-operonia, joista lacz koodaa [->-galaktosidaasia, IacY koodaa permeaasia ja IacA koodaa transasetylaasia; repA-lacZ edustaa repA- ja IacZ-geenien välistä fuusiota; copB edustaa sellaisen polypeptidin koodaavaa geeniä, joka polypeptidi estää transkription (Rl-plasmidin) repA-promoottorista; copA edustaa sen RNA-molekyylin koodaavaa geeniä, joka RNA estää RepA-RNA:n translaation; clg^ edustaa geeniä, joka koodaa lämpötilaherkän λ-repressorin, joka puolestaan säätelee APR-promoottorin aktiivisuutta; Pdeo edustaa deo-promoottoria. Nuoli osoittaa transkription suunnan, ja "kolmiot" osoittavat DNA:n istuttamisen. Täytetyt alueet ja paljaat alueet osoittavat istutettuja geenejä; katkoviiva osoittaa katoamisen.

Restriktioentsyymien vaikutuskohdat on merkitty vaakasuoran viivan alapuolelle, ja tässä E tarkoittaa EcoRl:a; P tarkoittaa Pstl:a; tarkoittaa BamHlia, paitsi kuvissa 1 ja 5, se tarkoittaa Ballia Tn5-DNA:n ulkopuolella; tarkoittaa Hpalia,

Ev tarkoittaa EcoRV:a; B2 tarkoittaa Bglllia; tarkoittaa Sallia; tarkoittaa Hindlllia; C tarkoittaa Clalia.

Kuvassa 6 Pstl-D-kappale on kartoitettu edelleen; vaakasuoran viivan yläpuolella olevat luvut tarkoittavat restriktiokohtien välissä olevien emäsparien lukumäärää. Restriktioentsyymien i7 86439 vaikutuskohdat on osoitettu vaakasuoran viivan alapuolella, jossa tarkoittaa Rsal:a; P tarkoittaa Pstl:a; ja tarkoittaa Hpal:a.

Kuvassa 18 esitetään Rl-, pl5- ja pBR322-johdannaisten stabii-lisuuskäyrät, ja nämä johdannaiset muodostetaan ja testataan esimerkeissä. Jokainen käyrä edustaa vähintään kahden nestemäisen viljelmän keskiarvoa, kun näitä viljelmiä on seurattu pitemmän kuin 100 sukupolven ajan. Kuvasta ilmenee, että sekä parA:n että parB:n samanaikaisesti sisältämät plasmidit periytyvät erittäin stabiilisti, ja tämä tapahtuu myös vain parB:n sisältämillä plasmldellla, sekä vain parA :.l.la stabiloiduilla mini-Rl-plasmideilla.

Par -plasmidien käyristä ilmenee, että plasmidia kantavien solujen esiintymistiheys pienenee alunperin eksponentiaalisesti, kuten on odotettuakin, johtuen vakioisesta katoamisnopeu-desta. Myöhemmissä vaiheissa plasmideja kantavien solujen esiintymistiheys näyttää pienenevän nopeammin (osoitettu yhtenäisillä viivoilla), mikä johtuu plasmidittomien solujen hieman suuremmasta kasvunopeudesta. Katkoviiva osoittaa sitä käyrää, jota on muokattu tämän suuremman kasvunopeuden perusteella osoittamaan todellista katoamisen esiintymistiheyttä.

Sitä vastoin fenotyypiltään Par -plasmideja katoaa Rl-plasmi- -2 dille esiintymistiheydellä 1,5 x 10 /solu/sukupolvi, pl5-plas-_2 midille 1 x 10 /solu/sukupolvi ja joillekin pBR322-plasmideil- -3 le tämä arvo on 6 x 10 /solu/sukupolvi, esimerkki joka on esitetty esimerkissä 3.3. Itse asiassa pl5 Par - ja pBR322 Par -johdannaisten katoamisen esiintymistiheydet ovat yllättävän korkeita, kun näiden vektoreiden kopioiden lukumäärä otetaan huomioon. Esimerkiksi pl5:n kopioiden lukumäärä solua kohden on suuruusluokkaa 15-20, joten katoamisnopeudeksi voi-daan ennustaa 10 /solu/sukupolvi, mikäli oletetaan plasmidien binomijakautuminen. Kuitenkin havaittu suuri katoamisnopeus voidaan helposti selittää sen tosiasian avulla, että pl5- i8 86439 replikonit muodostavat recAista riippuvia kointegraatteja, ja tämä johtuu oletettavasti loxP-kaltaisen resoluutio-toiminnon puuttumisesta (Austin et ai., Cell 25, 1981, sivut 729-36). Myös pBR322-johdannaisten tiedetään muodostavan kointegraatteja, ja kun kopioiden lukumäärä pienenee johtuen esimerkiksi suurista kloonatuista kappaleista, niin seurauksena on huomattava epästabiilisuus.

Materiaalit ja menetelmät Käytetty Escherichia coli K-12-kanta oli CSH50 (Δ pro-lac, rpsL; vertaa J. Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972). Lukuisia plasmideja ja bakteriofaage-ja käytettiin (taulukko 2).

Käytetyt kokeelliset tekniikat olivat standarditekniikoita, joita käytetään mikrobigenetilkan alalla (J. Miller:

Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972) ja geneettisen manipulaation alalla (Davis, Botstein and Roth: A Manual for Genetic Engineering; Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1980).

Kaikki solut kasvatettiin LB-alustalla (Bertani, J. Bact 62, 1951, sivu 293), jossa oli 0,2 % glukoosia ja 1 ^ug tiamiinia/ml, tai A+B-minimialustalla (Clark and MälΦ&, J.Mol.Biol. 23, 1967, sivu 99), jota oli täydennetty 0,2 % glukoosilla ja 1 % kasaminohapolla. Maljoina käytettiin LA-maljoja, joissa oli LB-alustaa ja 1,5 % agaria.

Mc-Conkey-laktoosi-indikaattorimaljät valmistettiin valmistajan (Difco) suositusten mukaisesti, ja X-gal-maljat valmistettiin lisäämällä 20-24 ^ug 5-bromo-4-kloro-indolyl-8-D-galaktosidia/ml A+B-minimialustaan, jota oli täydennetty O,2 % glukoosilla ja 1 yug tiamiinia/ml.

Fysikokemlalliset menetelmät

Kirkkaat lysaatit valmistettiin menetelmällä, joka on esitetty Clewell and Helinski, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 62, 1969, sivut 1159-66.

i9 86439

Pienimittainen plasmidi-DNA:n valmistaminen suoritettiin menetelmällä Birnboim et ai., Nucl.Acids Res. 7, 1979, sivut 1513-23.

Suurimittainen plasmidi-DNA:n valmistaminen ja analysointi suoritettiin käyttämällä värillistä kelluvaa tiheyden gradientti-sentrifugointia, joka on ohjeen Stougaard ja Molin, Anal. Biochem. 118, 1981, sivu 181 mukainen.

DNA-preparaattien polyakryyliamidi-geelielektroforeesi ja aga-roosi-geelielektroforeesi suoritettiin oleellisilta osiltaan ohjeen Molin ja Nordström, Methods tn Plasmid Biology, Odense University 1982 mukaisesti.

Restriktioendonukleaaseja käytettiin valmistajalta saatujen ohjeiden mukaisesti (Boehringer, Mannheim tai Biolabs, New England) 37°C:n lämpötilassa. Suoritetut inkuboinnit olivat kaksin- tai kolminkertaisia, ja ne aloitettiin sillä entsyymillä, jonka vaatima suolapitoisuus oli alhaisin, ja tämän jälkeen liuos sovitettiin puskurilisäyksin seuraavalle entsyymille ennen sen lisäämistä.

Käsittely eksonukleaasilla Bal31 suoritettiin seuraavasti: 0,1 Bal31-yksikköä lisättiin 50 ^ugraan lineaarista DNA:ta ja näytteitä otettiin hetkinä 1', 2', 4', 8', 16', 32' ja 60' 60 mM:een EDTA-liuokseen, uutettiin fenolilla, saostettiin etanolilla ja suspendoitiin uudestaan 20 ^ul:aan TE-puskuria. Puolet 20 yul:sta käsiteltiin asiaankuuluvalla restriktioentsyy-millä, jolle oli suoritettu agaroosi-geelielektroforeesi hylättyjen DNA-hylkyjen keskimääräisen koon määrittämiseksi.

Toiseen puoleen lisättiin asianmukainen sitoja ja seoksen komponentit saivat sitoutua 48 tunnin ajan T4 DNA-ligaasiylimää-rän läsnäollessa.

Pilkotun plasmidi-DNA:n sitominen suoritettiin valmistajan suositusten mukaisesti, poikkeuksena kuitenkin leikatun pään sitominen, jonka aikana lisättiin ylimäärä T4 DNA-ligaasia ja ATP:tä.

2o 86439

Mikrobiologiset menetelmät

Jakokoe I: Lac+-vektorin muodostaminen teki plasmidin Par+- fenotyypin määrittämisen mahdolliseksi yksinkertaisesti vain sivelemällä näyte epäselektiivisille McConkey-laktoosimaljoille tai X-Gal-maljoille. Bakteerit (Alac), joissa näitä plasmideja on, tuottavat Lac+-fenotyypin, joka voidaan helposti todeta värillisinä pesäkkeinä indikaattorimaljoilla, kun taas plasmi-dittomilla soluilla on Lac -fenotyyppi, ja ne muodostavat värittömiä pesäkkeitä.

Jakokoe II: (Käytetty Lac -plasmideille): Selektiiviseltä maljalta (antibioottia sisältävä malja) saatu pesäke vedettiin toiselle selektiiviselle maljalle. Yksi pesäke tältä maljalta vedettiin LA-maljalle siten, että se muodostaa yksittäisiä pesäkkeitä. Suurin piirtein 10 LA-maljan pesäkettä suspendoi- -4 tiin 1 ml:aan 0,9 % NaCl siten, että laimennos oli 10 ja -5 -4 -5 10 , vastaavasti. 0,1 ml 10 - ja 10 -laimennoksista levitet tiin LA-maljoille. Näiltä maljoilta 50 pesäkkeen resistenssi-kuvio testattiin asiaankuuluvilla selektiivisillä alustoilla (200 pesäkettä testattiin, mikäli heikko epästabiilisuus oli odotettavissa). Katoamisen esiintymistiheys (LF-arvo) laskettiin tämän jälkeen kaavan LF = 1 - (v) (1/27) perusteella, kun v on plasmideja kantavien solujen esiintymistiheys ja kun oletetaan, että yksi pesäke kasvaa 27 sukupolvea. Luontaista tälle menetelmälle on huomattava tilastollinen heilahtelu.

Jakokoe III: Lac+- ja Lac -plasmidien stabiilisuuden kvanti tatiiviset mittaukset. Selektiiviseltä maljalta otettiin yksi pesäke kokonaan ja se suspendoitiin uudestaan 1 ml:aan 0,9 % g

NaCl-liuokseen siten, että pitoisuudeksi tuli 10 solua/ml.

- 3 10 -laimennoksesta käytettiin 2 x 0,1 ml:aa 2 x 10 ml:n LB-alustan siirrostamiseen ja siirrostaminen suoritettiin 30°C:n g lämpötilassa ravistelemalla. Kun solutiheys oli noin 5 x 10 solua/ml, kasvatukset laimennettiin 10^ ja 10^ kertaa. 10^- 2i 86439 3 laimennoksesta käytettiin 0,1 ml:aa (5 x 10 solua) 10 ml:n 5 tuoreen LB-alustan siirrostamiseen ja 10 -laimennoksesta 0,4 ml:a levitettiin McConkey-laktoosimaljoille, ja maljoja inkuboitiin yön yli 30°C:n lämpötilassa. Laimennoksen 8 2 5 x 10 /ml muuttuminen tiheydeksi 5 x 10 /ml vastaa 20 suku- 20 polven kasvua (2 ), täten plasmideja kantavien solujen esiin tymistiheyden muuttuminen laimennoksesta toiseen vastaa sitä muutosta, joka tapahtuu 20 sukupolven kasvun aikana. Yleisemmin, LF-arvo voidaan laskea seuraavasti: νχ = (1 - LF)gl ja V2 = (1 - LF)g2 missä ja v2 ovat plasmideja kantavien solujen esiintymistiheydet ja g2 sukupolven jälkeen, vastaavasti, ja LF on katoamisen esiintymistiheys solua ja sukupolvea kohden. Täten, tästä seuraa, että νχ/ν2 = (1 - LF)gl"g2 ja LF = 1 - (v1/v2)<1/<gl-g2>) Tätä kaavaa käytettäessä ajankohtana nolla vältetään siirros-tettavien solujen lukumäärän virhe, jonka vaihtelut aiheuttavat. Sopivampi likiarvio tälle kaavalle on LF = In(v1/v2)/(g2“gl)

Yhteensopimattomuuskoe

Plasmtdit, joiden arveltiin kantavan istutettua par-osa-aluetta, tutkittiin toteamis- ja valintakokein käyttäen hyväksi sitä havaintoa, että kaksi muuten yhteen sopivaa replikonia, jotka kantavat samaa par-osa-aluetta, ovat yhteensopimattomia toinen toisiinsa nähden, ja tämä johtaa jomman kumman kahdesta katoamiseen valintapaineen puuttuessa. Koe suoritetaan viemällä testattava plasmidi sellaiseen bakteerikantaan, joka kantaa toista plasmidia, kun molempien plasmidien valinta tapahtuu kaksinkertaisesti selektiivisellä alustalla. Sen jälkeen, kun näyte on vedetty kaksinkertaisesti selektiiviselle maljalle 22 86439 (malja sisältää kahta eri antibioottia), yhteensopimattomuus mitattiin joko kvalitatiivisesti tai kvantitatiivisesti.

Kvalitatiivista yhteensopimattomuuskoetta varten kaksinkertaisesti selektiiviseltä alustalta otettu pesäke vedettiin LA-maljaan siten, että syntyi yksittäisiä pesäkkeitä. Noin 10 tästä maljasta otettua pesäkettä laimennettiin uudestaan -4 -5 1 ml:aan 0,9 % NaCl:a ja tehtiin 10 - ja lO -laimennokset, -4 -5 vastaavasti. 0,1 ml 10 - ja 10 -laimennoksista levitettiin LA-maljoille. 50 näiden maljojen pesäkettä (tai 200, mikäli heikko yhteensopimattomuus oli odotettavissa (kokeiltiin asiaankuuluvilla selektiivisillä maljoilla. Mikäli Lac+-plasmidi oli sisällytetty kokeeseen, niin McConkey-laktoosi-indikaattorimaljoja käytettiin replikamaljojen tai selektiivisten maljojen sijasta.

Lac+-plasmidien tapauksessa toteamis- ja valintakokeet suoritettiin viemällä epäillyt Par+-plasmidit sellaiseen kantaan, jossa oli jo Lac+-fenotyypin välittävä Par+-hybridiplasmidi. Plasmidien yhteensopimattomuus ja täten myös tae sisään tulevan plasmidin spesifisestä Par+-fenotyypistä todetaan helposti valikoimalla Lac -pesäkkeitä McConkey-maljoilla, mikä osoittaa sen, että kannassa jo ollut Par+-plasmidi oli muuttunut epästabiiliksi. Esimerkki tästä toteamis- ja valikointimenetel-mästä on kuvattu esimerkissä 4.

Kvantitatiiviset yhteensopimattomuusmittaukset suoritettiin mittaamalla Lac+-plasmidien katoamisen esiintymistiheyksiä sen jälkeen kun heteroplasmidipopulaatioita oli muodostettu yllä esitetyn mukaisesti. LF-arvojen mittaaminen suoritettiin, kuten kohdassa "jakokoe III" on esitetty.

Geneettiset tekniikat

Bakteerien transformaatio tehtiin ohjeen Cohen et ai., Proc.

Natl.Acad.Sei. USA 62, 1972, sivut 2110-2114 mukaan, kuitenkin sellaisella muutoksella, että kun odotettavissa oli alhainen 23 86439 transformaation esiintymistiheys, niin jäissä suoritettua kilpailukykyisten solujen käsittelyä DNA:11a pidennettiin useita tunteja ja lämpöshokin jälkeen solut jäähdytettiin uudestaan jäissä 5-30 minuutin ajan. Tämä menetelmä lisää transformaation esiintymistiheyttä merkittävästi.

Infektointi bakteeriofaagilla λ suoritettiin kasvattamalla 10 ml:n viljelmiä yön yli LB-alustalla, joka oli täydennetty 0,2 %:lla maltoosia (malB-proteiinin indusoimiseksi, sillä tämä proteiini on λ-reseptori). Kasvatuksia ravistettiin.

Solut pestiin O,9 % NaClrlla ja ne suspendoitiin uudestaan 2 ml:aan 0,01 M MgSO. ja niitä inkuboitiin 1 tunti. λ-suspensios- 4 0-1-2 ta valmistettiin laimennokset (10 , 10 ,10 ), ja 0,1 ml tätä faagilaimennosta käytettiin infektoimaan 0,2 ml ravinnon puutteessa olevien solujen suspensiota. Infektioseoksen O -1 -2 10 -, 10 - ja 10 -laimennokset levitettiin selektiivisille maljoille.

Plasmidion Lrunsponoimtseksi Tn5:llö (Km**) käytettiin lähteenä faagia Ab221::Tn5, jonka kiinnittymiskohta oli hävitetty, joten se ei kyennyt lysogenoimaan, ja faagisuspensiota käytettiin sellaisten plasmideja kantavien solujen infektoimiseen, joihin plasmideihin transpositio haluttiin. Infektointi suoritettiin, kuten edellä on esitetty ja kanamysiinille resistentit solut valittiin. Useita tuhansia Km -pesäkkeitä kerättiin ja -2 näistä valmistettua 10 -liuosta käytettiin 0,1 ml 100 ml:n LB-alustan siirrostamiseen. Viljelyä kasvatettiin yli yön ja tästä soluseoksesta valmistettiin plasmidi-DNA:ta, jota käytettiin transformoimaan E.coli Kl2-kanta CSH50 kanamysiinille resistentiksi.

24 86 439

Taulukko 2 Plasmidit ja faagit Plasmidi/ Lähde faagi_ _ pKNl84 Nordström et ai., Plasmid 4, 1980, sivu 322.

pSF2124 So et ai., Mol.Gen.Genet. 142, 1975, sivut 239-49.

pJL99 Light & Molin, Mol.Gen.Genet. 184, 1981, sivut 56-61.

pGA46 An & Friesen, J.Bact. 140, 1979,sivut 400-407.

pKN501 Molin et ai., J.Bact. 138, 1979, sivut 70-79.

pFl403-ll Muodostettu istuttamalla plasmidi F:n emäksisestä replikonista saatu Alul-Nael-kappale pMCl403:n Smal-kohtaan (Casadaban et ai., J.Bact. 143, 1980, sivu 971), jolloin syntyy yhtyminen plasmidi F:n E-geenin ja pMCl403:n IacZ-geenin välille.

pHP34 Prentki et ai., Gene 17, 1982, sivut 189-96.

pMC903 Casadaban et ai., J.Bact. 143, 1980, sivu 971.

PKN1562 Molin et ai., J.Bact. 138, 1979, sivut 70-79.

pVHl424 Muodostettu P.Valentin-Hansenin mukaan istutta malla deo-promoottoria kantava Sau3A-kappale plasmidista pVHl7 (Valentin-Hansen et ai., EMBO J., 1982, 317) plasmidin pMCl403 BamHl-kohtaan (Casadaban et ai., op.cit., 971).

pSKSl04 M.Casadaban muodostama, muodostettu istuttamalla lac-promoottoria ja translaation aloituskohtaa kantava PvuII-kappale pMl3mp7:stä (Messing et ai., Nucleic Acids Res.9, 1981, 309) pMCl403:n Smal-kohtaan, jota seurasi IacZ-segmenttien homologinen yhdistäminen.

pBR322 Bolivar et ai., Gene 2, 1977, sivu 95.

p.MBl Betlach et ai., Fed.Proc. 35, 1976, sivut 2037-43.

Ab221::Tn5 Berg, D.E., "Insertion and excision of the trans- posable kanamycin resistance determinant Tn5", teoksessa DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes (toimittanut A.I. Bukhari et al.).

EDA4 Dempsey and Willetts, J. Bact. 126, 1976, sivu 166.

Esimerkki 1 £

Tn5:n (Km ) istuttaminen EcoRl-A-kappaleeseen Riistä Plasmidia pKNl84 kantavia E.coli K-12-kannan CSH50 solut, plasmidin pSF2124 käsittävä plasmidi ja 19 kb:n EcoRl-A-kappale infektoitiin kuten kohdassa Materiaalit ja menetelmät on esitetty bakteriofaagin Äb211::Tn5-suspensiolla. Kanamysiini- 25 86439 resistenssin valikointi suoritettiin LA-maljoilla, jotka sisälsivät 200 ,ug kanamysiiniä/ml, jonka jälkeen pesäkkeet -2 kerättiin ja sekoitettiin. Näistä valmistettiin 10 -laimennos, jota käytettiin 0,1 ml 100 ml:n LB-alustan siirrostukseen. Viljelmää kasvatettiin yön yli, ja viljelmästä valmistettua plasmidi-DNA:ta käytettiin E.coli K-12-kannan CSH50 trans-formointiin, ja kanamysiiniresistenssin valikointi suoritettiin maljoilla, jotka sisälsivät 200 ^ug kanamysiiniä/ml.

Tällä tavoin löydettiin plasmidi pOUl, joka välittää kanamysii- niresistenssiä ja jossa on faagi-DNA:n istutus, joka vastaa noin 5 kb:tä (5000 emäsparia). Plasmidin molekyylipaino/koko oli 34 kb, joka mitattiin preparoimalla plasmidi-DNA, ja analy- £ soimalla agaroosigeeleillä, sekä seuraavat fenotyypit: Km ,

ApR, ParA+, ParB+.

Plasmidi-DNA preparoitiin pOUlrsta ja plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä puhdistaen plasmidi-DNA, ja se pilkottiin restriktioentsyym(e)illä ja syntyneet kappaleet analysoitiin agaroosi-geelielektroforeesilla (vrt. kuva 1) . Tällä tavoin EcoRl-A:n kappaleeseen pKNl84 istutetun λ::Tn5-kappa- £ leen tunnistettiin kantavan Km :ää koodaavan geenin, ja kappale paikallistettiin kuten kuvassa 1 on esitetty. Plasmidia pOUl käytettiin lisäanalyyseihin ja plasmidien muodostamiseen.

E.coli CSH50/p0Ul-kanta on tallennettu viitenumerolla 2712 saksalaiseen mikro-organismikokoelmaan (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 Göttingen), josta seuraavassa käytetään lyhennystä DSM.

Esimerkki 2 par+-kappaleiden kloonauksessa hyödyllisten plasmidien muodostaminen___

Plasmidissa pJL99 (Light & Molin, Mol. Gen. Genet. 184, 1981, sivut 56-61) on tapahtunut yhtyminen plasmidista P.l olevan geenin repA ja lac-operonin välillä; plasmidi välittää Lac - 26 86439 fenotyypin. repA-lac-fuusiota kantava Pstl-Sall-kappale leikattiin pJL99:stä ja istutettiin pGA46:een, joka on pl5-replikoni (An & Friesen, J. Bact. 140, 1979, sivut 400-407), jolloin saatiin plasmidi pJLl24. Plasmidin kartta on esitetty kuvassa 2. Plasmidi pJLl24 välittää myös Lac+-fenotyypin McConkey-läktoosi-indikaattorimaljoilla, mutta havaittiin, että DNA-kappaleiden, joissa on vain vähän tai ei lainkaan promoottoriaktiivisuutta, istuttaminen pJLl24:n Pstl-kohtaan häiritsee repA-promoottorin aktiivisuutta siten, että nämä hybridit eivät enää ilmaannu Lac+-muotoisina McConkey-laktoosi-indikaattorimaljoilla. Kuitenkin herkemmillä X-gal-indikaat-torimaljoilla transformoidut pesäkkeet ovat Lac+, mikä osoittaa, että hybrideissä β-galaktosidaasin ekspressio on heikentynyt, mutta se ei ole kokonaan kadonnut. Tästä johtuen pJLl24:a voidaan käyttää Pstl-kappaleiden kloonaamiseen, koska hybridi-plasmidit voidaan helposti osoittaa McConkey-laktoosi-indi-kaattorimaljoilla Lac -transformantteina. Lisäksi, koska pJLl24 on pl5-replikoni ja täten epästabiili, mikä on helposti todettavissa, sillä ne solut, joista plasmidi on kadonnut, muodostavat värittömiä pesäkkeitä laktoosi-indikaattorimaljoilla ilman selektiopainetta. Pstl-kappaleet, jotka kykenevät stabiloimaan pJLl24:n, voidaan osoittaa X-gal-maljoilla.

Pstl - par+-kappaleiden eristämisohjelma muodostuu siis seu-raavista askeleista: 1) Pstl:llä pilkotun pJLl24:n ja toisesta plasmidista peräisin olevien Pstl-kappaleiden liittäminen.

2) Transformointi CSH50:een kloramfenikolia sisältäville McConkey-laktoosimaljoille valaen.

3) Kloonit, jotka McConkey-laktoosimaljoille ilmestyvät Lac -tyyppisinä, testataan X-gal-indikaattorimaljoilla Lac+-feno-tyypin stabiilin periytymisen selvittämiseksi. (vrt. Materiaalit ja menetelmät).

E.coli CSH50/pJLl24-kanta on taltioitu DSM:ään viitenumerolla 2760.

27 86439

Esimerkki 3

Epästabiilien plasmidien stabilointi parA- ja parB-osa-alueilla 1. Mini-Rl-replikoni

Plasmidi pOU71 (DSM viitenumero 2471), plasmidin pKNl562 kiito-replikaation johdannainen, joka koostuu plasmidin Rl emäksisestä replikoinnista, ED 4-faagista peräisin olevasta λΡ -promoottorista ja clg^^-repressorigeenistä, Tn3-transposonista peräisin olevasta 3-laktamaasia koodaavasta geenistä ja ainutlaatuisesta EcoRl-kohdasta (pOU71:n muodostamisen yksityiskohtainen kuvaus on esitetty saman hakijan samanaikaisesti haettavana olevasta hakemuksesta, jonka otsikko on "Plasmids with Conditional Uncontrolled Replication Behaviour" ja joka on julkaistu samana päivänä tämän hakemuksen kanssa), pilkottiin EcoRl:llä ja pOUl:stä saatu kappale EcoRl-A::Tn5 (vrt. esimerkki 1) istutettiin, jota seurasi E.coli-kannan CSH50 ligatointi ja transformointi, kanamysiinille resistentit solut valikoitiin LA-maljoilla, jotka sisälsivät 50 ^,ug kanamysiiniä/ml. Transformantit analysoitiin toteamis- ja valikointikokeilla kiitoreplikaation fenotyypin pOU71 löytämiseksi, vetämällä näytteet LA-maljoille, jotka sisälsivät 50 ^ug kanamysiiniä/ml ja inkuboimalla 42°C lämpötilassa. Kiitoreplikaatioplasmideja sisältävät solut lakkaavat mahdollisesti kasvamasta näissä olosuhteissa. Tällä tavalla plasmidi pOU71-184 tunnistettiin, ja sen koko oli 25,5 kb ja sen fenotyyppi oli seuraava:

ParA+, ParB+, ApR, KmR.

Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä, kuten esimerkissä 1 on esitetty (vrt. kuva 3). Restriktiokartasta käy ilmi, että EcoRl-A::Tn5-kappale on istutettu asianmukaisesti pOU71:n EcoRl-kohtaan.

Plasmidin kantavia soluja kasvatettiin LA-maljoilla 100 sukupolven ajan ilman valintapainetta, so. kasvattamatta niitä antibiootteja sisältävillä maljoilla; kun määrittäminen suoritettiin kohdassa Materiaalit ja menetelmät kuvatun toimenpiteen mukaisesti (jakokoe II), niin solujen ei havaittu kadottavan plasmidia, kun taas pOU71 katosi soluista, joita kasva- 28 86439 tettiin samanlaisissa olosuhteissa, esiintymistiheydellä 1 % sukupolvea kohden. Täten määritettiin, että pOU71-184 on _ 6 stabiilisti periytyvä, ja sen katoamistiheys on noin 10 /solu/ sukupolvi.

E.coli CSH50/p0U71-184-kanta on tallennettu DSM:ään viitenumerolla 2763.

2. pl5-replikoni

Plasmidi pJLl24 (vrt. esimerkki 2), joka on Par -replikoni, pilkottiin restriktioentsyymillä Pstl ja sekoitettiin plasmi-din pKNl84 (vrt. esimerkki 1) kanssa, kun tämä plasmidi oli pilkottu osittain Pstl:llä, jota seurasi ligatointi. Sekoitettu ligatoija transformoitiin E.coli-kantaan CSH50, ja kloramfeni-kolin resinstenssi valikoitiin McConkey-laktoosi-indikaattori-maljoilla, jotka sisälsivät 50 ^ug kloramfenikolia/ml.

Solut, joissa oli pJL124 ja jotka kantoivat yhden tai useamman Pstl-kappaleen (vrt. esimerkki 2), testattiin X-gal-maljoilla Lac+-fenotyypin stabiilin periytymisen selvittämiseksi. Yhden stabiilisti periytyvistä plasmideista todettiin sisältävän sekä parA- että parB-osa-alueen. Tämän plasmidin koko on 24 kb £ | j ja sen fenotyyppi on seuraava: Cm , Lac , ParA , ParB .

Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä, kuten esimerkissä 1 (vrt. kuva 4) on esitetty. Restriktiokartasta ilmenee, että EcoRl-kappaleesta on kadonnut Pstl-kappale. Plasmidin kantavia soluja kasvatettiin X-gal-maljoilla 100 sukupolven ajan ilman valintapainetta, ja määritettiin p0U2:n stabiili *6 periytyminen LF-arvon ollessa vähemmän kuin 10 /solu/sukupolvi, päin vastoin kuin pJL124:n kohdalla, joka katosi soluista esiintymistiheydellä 0,5-1 %/solu/sukupolvi.

Kanta E.coli CSH50/p0U2 on tallennettu DSM:ään viitenumerolla 2713.

29 86439 3. pMBl-replikoni

Plasmidi pF1403 (vrt. taulukko 2) on pBR322:n epästabiilisti

periytyvä johdannainen (pMBl-replikonijossa plasmidista F

peräisin olevan geenin ja lac-operonin välillä on fuusio.

R +

Plasmidi välittää Ap , Lac -fenotyypin. EcoRl-A::Tn5-kappale plasmidista pOUl (esimerkki 1) istutettiin plasmidin pF1403-ll ainutkertaiseen EcoRl-kohtaan välittömästi geeni-fuusion yläpuolelle, ja tätä seurasi ligaatio ja transformaatio E.colin

R

kantaan CSH50, ja Ap :n valinta 50 ,ug ampisilliinia/ml sisältä-

R

villä maljoilla. Km :n valinta 50 ,ug kanamysiiniä/ml sisältä- + ' villä maljoilla ja Lac :n valinta McConkey-laktoosi-indikaatto-rimaljoilla.

Jäljellä oleva plasmidi pOUlO kartoitettiin restriktioentsyy-meillä kuten esimerkissä 1 on esitetty (vrt. kuva 5), ja EcoRl-A::Tn5-kappaleen istutus todettiin ja varmistettiin. Plasmidin koko on 34 kb ja sen fenotyyppi on seuraava:

KmR, ApR, Lac+, ParA+, ParB+.

Plasmidin stabiili periytyminen testattiin esimerkissä 3.1 esitetyllä tavalla. Täten osoitettiin, että pOUlO periytyy stabiilisti LF-arvon ollessa vähemmän kuin 10 ^/solu/sukupolvi, kun taas pFl403-ll katosi soluista esiintymistiheydellä 6 x -3 10 sukupolvea kohden.

Kanta E.coli CSH50/p0Ul0 on tallennettu DSM:ään viitenumerolla 2714.

Esimerkki 4

EcoRl-A-kappaleesta peräisin olevien, pJLl24:n stabiloivien

Pstl-kappaleiden kloonaaminen__

EcoRl-A-kappale pilkottiin lukuisilla restriktioentsyymeillä, ja tuloksena oleva fysikaalinen kartta on esitetty kuvassa 1. Kuten kuvasta ilmenee, kappale muodostuu useasta Pst1-kappalees-ta. Jotta Par+-fenotyypin välittävän kappaleen kokoa saataisiin pienennettyä, niin par-osa-alueita, joita mahdollisesti 3o 86439 yksi tai useampi Pstl-kappale kantoi, yritettiin alikloonata lajitteluvektoriin pJLl24 (vrt. esimerkki 2). Usean, fenotyypiltään oikean kloonin analysointi - Lac McConkey-laktoo-simaljoilla, ja stabiili periytyminen valintapaineen puuttuessa -osoittivat, että Pstl-D-kappale (vrt. kuva 1) välitti tämän fenotyypin. Mikään muu Pstl-kappale ei yksin kyennyt stabiloimaan pJLl24:ää. pJLl24:n stabiloinnista vastaava osa-alue, joka sijoittuu Pstl-kappaleen 1,8 kb:een, nimitettiin parB:ksi.

Pstl-kappaleen edelleen analysoimiseksi kappale kloonattiin ainutkertaiseen Pstl-kohtaan bla-geenissä pBR322, jolloin tuloksena oli pOU93 (vrt. kuva 7; plasmidi on taltioitu DSM:ään viitenumerolla 2724). Tämän plasmidin restriktiokartoitus osoitti, että Pstl-D-kappale sisältää kolme Rsal-kohtaa (vrt. kuva 6). Rsal saa aikaan leikattuja päitä, ja tästä syystä 900 kb:n Rsal-kappale istutettiin plasmidin pHP34 Smal-kohtaan (Prentki et ai., Gene 17, 1982, sivut 189-96) seuraavalla tavalla. pOU93 pilkottiin Rsal:11a ja sekoitettiin Smal:lla pilkotun pHP34:n kanssa, jota seurasi ligatointi. Ligaatio-seos transformoitiin E.colin kantaan CSH50, jossa oli jo plasmidi p0U94 (pl5-johdannainen, jonka fenotyyppi on Lac+ ja ParB+; vrt. kuva 8; plasmidi on taltioitu DSMrään viitenumerolla 2725), ampisilliinin resistenssin valikointi suoritettiin maljoilla, jotka sisälsivät 50 ^ug ampisilliiniä/ml.

Johtuen eri plasmidien kantamien parB+-osa-alueiden ekspressoi-masta yhteensopimattomuudesta, pOU94 katoaa, kun E.colin soluihin tuodaan toinen plasmidi, joka on fenotyypiltään ParB+, mikä täten tekee oikean istutuksen ja transformantin valikoinnin mahdolliseksi vetämällä solut McConkey-maljoille ja toteamalla värittömät pesäkkeet (Lac ). Yksi sellainen yhteensopimaton plasmidin pHP34-johdannainen, jonka todettiin sisältävän 900 kb:n Rsal-kappale, nimettiin pOU13:ksi. Plasmidin R R + koko on 5,3 kb ja sen fenotyyppi on seuraava: Te , Ap , ParB .

3i 86439

Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä, kuten esimerkissä 1 on esitetty (vrt. kuva 9). Kartoitus osoitti, että Rsal-kappale oli muuttunut 900 kb:n EcoRl-kappaleeksi, koska pHP34:n Smal-kohta on vahvistettu kahdella EcoRl-kohdalla.

Kanta E.coli CSH50/p0Ul3 on tallennettu DSM:ään viitenumerolla 2716.

pOUl3:sta peräisin oleva 900 kb:n EcoRl-kappale istutettiin p0Ul01:n EcoRl-kohtaan, pOUlOl on ApR, CmR kiito-mini-Rl-johdannainen (p0Ul01:n muodostumisen yksityiskohtainen kuvaus on löydettävissä saman hakijan samaa asiaa käsittelevästä hakemuksesta, jonka otsikko on "Plasmids with Conditional Uncontrolled Replication Behaviour" ja joka on jätetty samana päivänä tämän hakemuksen kanssa), jossa on ainutkertainen EcoRl-kohta cat-geenissä (Cm :n koodaava geeni), plasmidin pOUl4 muodostamiseksi, jonka plasmidin koko on 8,2 kb ja jonka feno- SR + tyyppi on seuraava: Cm , Ap , ParB .

Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä,kuten esimerkissä 1 on esitetty (vrt. kuva 10).

Plasmidi testattiin stabiilin periytymisen selvittämiseksi, kuten esimerkissä 3.1 on esitetty. Täten osoitettiin, että 30°C:n lämpötilassa p0Ul4 periytyy stabiilisti LF-arvon ollessa -4 vähemmän kuin 1 x 10 /solu/sukupolvi, kun taas pOUlOl katoaa soluista 1 %:n esiintymistiheydellä sukupolvea kohden.

Kanta E.coli CSH50/p0Ul4 on tallennettu DSM:ään viitenumerolla 2717.

Esimerkki 5

Mini-Rl-plasmidien stabilointi parB-kappaleella Plasmidi p0U90, pKNl562:n kiitoreplikaation johdannainen, joka käsittää plasmidin Rl emäksisen replikonin, faagista EDX4 peräisin olevan XPR-promoottorin ja clg^-repressorin, Tn3-transposonista peräisin olevan 8-laktamaasin koodaavan 32 86439 geenin, ja pKNl84:sta peräisin olevan EcoRl-kappaleen (p0U90:n muodostumisen yksityiskohtainen kuvaus on löydettävissä saman hakijan samaa aihetta käsittelevästä hakemuksesta, jonka otsikko on "Plasmids with Conditional Uncontrolled Replication Behaviour" ja joka on jätetty tämän hakemuksen kanssa samana päivänä), johon johdannaiseen oli istutettu pKNl84:stä peräisin oleva EcoRl-kappale, pilkottiin Sali :11a ja ligatoitiin tuottamaan plasmidi pOU61. Plasmidi transformoitiin E.colin kantaan CSH50, ja Lac~-fenotyyppi valikoitiin McConkey-maljoilla.

pOU61 kartoitettiin restriktioentsyymeillä, kuten esimerkissä 1 on esitetty (vrt. kuva 11). Restriktiokartasta ilmenee, että pOU61 kantaa EcoRl-A-kappaleen 3,6 kb:n oikeata päätä, joka sisältää parB-osa-alueen. Plasmidin koko on 10 kb ja sen + R — fenotyyppi on seuraava: ParB , Ap , Lac . Plasmidi testattiin stabiilin periytymisen selvittämiseksi, kuten esimerkifesä 3.1 on esitetty. Täten osoitettiin, että pOU61 periytyy stabii-listi LF-arvon ollessa vähemmän kuin 1 x 10 ^/solu/sukupolvi.

Kanta E.coli CSH50/p0U61 on tallennettu DSMrään viitenumerolla 2723.

Esimerkki 6

Plasmidin pFl403-ll stabilointi parB-kappaleella Plasmidi pOUl (vrt. esimerkki 1) pilkottiin Sali :11a ja sekoitettiin plasmidin pF1403-ll kanssa, joka oli samoin pilkottu Sall:lla, jota seurasi ligatointi ja transformointi E.colin kantaan CSH50, ja ampisilliinille resistentit pesäkkeet valikoitiin McConkey-laktoosi-indikaattorimaljoilla. Jotkut näistä Lac+-pesäkkeistä tutkittiin Lac+-fenotyypin stabiilin periytymisen toteamiseksi McConkey-alustoilla, kuten kohdassa Materiaalit ja menetelmät on esitetty.

Stabiilisti periytyvät plasmidit kartoitettiin restriktioentsyymeillä, kuten esimerkissä 1 on esitetty (vrt. kuva 12).

33 8 6 439

Restriktiokartasta ilmenee, että ne kantavat pOUl:stä peräisin olevaa Sali-kappaletta, johon parB-osa-alue on sijoittunut. pF1403-ll:n ja pOUlistä peräisin olevan Sali-kappaleen käsittävä plasmidi nimettiin pOUl2:ksi. Sen koko oli 16 kb, ja

+ + R

sen fenotyyppi oli seuraava: ParB , Lac , Ap . pOUl2 periytyi -5 stabiilisti LF-arvon ollessa vähemmän kuin 5 x 10 /solu/suku-polvi.

Kanta E.coli CSH50/p0Ul2 on tallennettu DSM:ään viitenumerolla 2715.

Esimerkki 7 p!5-plasmidin stabilointi parA-kappaleella Plasmidi (Casadaban et ai., J.Bact. 143, 1980, sivu 971) pMC 903 pilkottiin EcoRlillä, ja plasmidista pOU43 (vrt. kuva 13; DSM-viitenumero 2720) peräisin oleva, parA-osa-aluetta kantava EcoRl-kappale istutettiin, jota seurasi ligatointi ja transformaatio E.colin kantaan CSH50. Tuloksena oleva plasmidi nimettiin pOU45:ksi ja sen koko oli 13,4 kb ja fenotyyppi

+ — R R

seuraava; ParA , Lac , Ap , Km ).

Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä kuten esimerkissä 1 on esitetty (vrt. kuva 14). Restriktiokartasta ilmenee, että parA-osa-alue on istutettu lac-operoniin, joka täten inaktivoituu.

Kun stabiilisuutta testattiin, kuten kohdassa Materiaalit ja menetelmät on esitetty, plasmidin todettiin periytyvän stabii- -4 listi LF-arvon ollessa 8 x 10 /solu/sukupolvi, kun taas pMC903:n LF-arvo on 1 %/solu/sukupolvi.

Kanta E.coli CSH50/p0U45 on taltioitu DSM:ään viitenumerolla 2721.

34 8 6 4 3 9

Esimerkki 8

Mini-plasmidien Rl-stabilointi parA-osa-alueella EcoRl-kappale pOU43:sta istutettiin mini-Rl-plasmidiin pOU82 (DSM-viitenumero 2482), joka käsittää plasmidin Rl emäksisen replikonin, faagista EDA4 peräisin olevan APR-pro-moottorin ja cl-repressorin, Tn3-transposonista peräisin olevan β-laktamaasin koodaavan geenin, geenistä pVHl424 peräisin olevan IacZ-geenin deo-promoottorin ja aminoterminaalisen pään ja pSKSl04:sta peräisin olevan lac-operonin lopun (pOU82:n muodostumisen yksityiskohtainen kuvaus on löydettävissä tämän saman hakijan samaa asiaa käsittelevästä hakemuksesta, jonka nimi on "Plasmids with Conditional Uncontrolled Replication

Behaviour" ja joka on jätetty tämän hakemuksen kanssa samana R + päivänä). Plasmidi pOU82 välittää Ap - ja Lac -fenotyypit ja sillä on ainutlaatuinen EcoRl-kohta, joka on hyödyllinen EcoRl-kappaleiden kloonauksessa. Tämä plasmidi katoaa esiintymistiheydellä 1 % sukupolvea kohden valintapaineen puuttuessa.

Plasmidi, johon 2,4 kb:n EcoRl-kappale oli istutettu tietyssä suunnassa nimitettiin pOU47:ksi. Plasmidin koko on 14 kb

+ + R

ja sen fenotyyppi on seuraava: ParA , Lac , Ap .

pOU47 kartoitettiin restriktioentsyymeillä kuten esimerkissä 1 on esitetty (vrt. kuva 15).

Kanta E.coli CSH50/p0U47 on tallennettu DSM:ään viitenumerolla 2722.

par-A-osa-aluetta kantavaa EcoRl-kappaletta pienennettiin edelleen 400 kb:llä eksonukleaasin Bal31 avulla; hävittämistoimenpiteet suoritettiin kuten kohdassa Materiaalit ja menetelmät on esitetty käyttäen pOU47:n ainutkertaista BamHI-kohtaa.

Muodostunut plasmidi nimettiin pOU472:ksi. Plasmidin koko

+ + R

oli 13 kb ja sen fenotyyppi oli seuraava: ParA , Lac , Ap .

35 86439 pOU472 kartoitettiin restriktioentsyymeillä, kuten esimerkissä 1 on esitetty (vrt. kuva 16). Restriktiokartasta ilmenee, että pOU472 kantaa 2,0 kb:n EcoRl-kappaletta, jonka Bal31:n katoaminen on saanut aikaan.

Kun stabiilisuus testattiin, kuten kohdassa Materiaalit ja menetelmät on esitetty, niin plasmidin todettiin periytyvän stabiilisti, mikä tarkoittaa, että koko parA-osa-alue on sisältynyt 2,0 kb:n EcoRl-kappaleeseen.

Kanta E.coli CSH50/p0U472 on tallennettu DSM:ään viitenumerolla 2726.

Esimerkki 9 parA-osa-aluetta kantavan mini-Rl-plasmidin muodostaminen Plasmidi p0U90 (vrt. esimerkki 5) pilkottiin BamHlrllä ja osittain Sau3A:lla, jotta osa EcoRl-A-kappaleesta saatiin häviämään, jolloin äärimmäisenä vasemmalla olevat 6 kb jäivät jäljelle, ja tätä seurasi ligatointi. Tuloksena saatava plasmidi p0U91 transformoitiin E.colin kantaan CSH50. pOU:n koko on 18,75 kb ja sen fenotyyppi on seuraava: Par , Ap , Lac .

Plasmidi kartoitettiin restriktioentsyymeillä, kuten esimerkissä 1 on esitetty (vrt. kuva 17).

Plasmidin stabiilisuus määritettiin kasvattamalla pOU91:n sisältäviä soluja (ja vertailuna pOU82:n sisältäviä soluja) McConkey-maljoilla ilman valintapainetta 30°C:n lämpötilassa 25 sukupolven ajan; solut, jotka oli transformoitu pOU91:llä muodostivat punaisia pesäkkeitä (Lac+), kun taas pOU82:lla transformoidut solut muodostivat sekä punaisia että valkoisia pesäkkeitä, mikä osoitti sen, että pOU82 oli kadonnut joistakin soluista sen jakson aikana, jolloin valintaa ei ollut.

Kanta E.coli CSH/pOU91 on taltioitu DSM:ään viitenumerolla 2483.

p 36 86439

Esimerkki 10 parA+-, parB+-mini-Rl-plasmidin muodostaminen Plasmidi pOU82 (vrt. esimerkki 8) pilkottiin EcoRl:llä, ja pOU43:sta peräisin oleva, parA-osa-aluetta kantava EcoRl-kappale (vrt. esimerkki 7 ja kuva 13) istutettiin. Tämä EcoRl-kappale häviää äärimmäisenä vasemmalla olevasta 500 bp:sta (emäsparista), yksi EcoRl-kohta mukaanlukien, ekso-nukleaasilla Bal31. pOUl3:sta peräisin oleva EcoRl-kappale istutetaan tämän plasmidin ainutkertaiseen EcoRl-kohtaan (vrt. esimerkki 4 ja kuva 9). Tuloksena oleva plasmidi, joka välittää ParA+-, ParB+-fenotyypin, voidaan tämän jälkeen transformoida E.colin kantaan CSH50, joka kantaa jo plasmidia pOU94, ja toteamis- ja valikointikokeet voidaan pääpiirteissään tehdä kuten esimerkissä 4 on esitetty, kuitenkin sillä poikkeuksella, että pOU82-johdannainen välittää heikon Lac+-feno-tyypin,mikä tarkoittaa sitä, että tämän plasmidin sisältävien solujen pesäkkeet ovat punaisia vain keskeltä ja valkeita reunoiltaan, kun ne kasvatetaan McConkey-laktoosi-indikaattori-maljoilla.

Esimerkki 11 parA+-, parB*-mini-Rl-plasmidin muodostaminen Plasmidi pOU61 (vrt. esimerkki 5) pilkottiin EcoRl:llä ja pOU43:sta peräisin oleva, parA-osa-aluetta kantava EcoRl-kappale istutetaan, jota seuraa ligatointi. Tuloksena oleva plasmidi, joka välittää ParA+-, ParB+-fenotyypin, voidaan tämän jälkeen transformoida E.colin kantaan CSH50, joka jo kantaa plasmidia pOU2, ja toteamis- ja valintakokeet voidaan suorittaa esimerkissä 4 esitettyjen toimenpiteiden mukaisesti. Toivotun plasmidin sisältämien solujen pesäkkeet ilmaantuvat värittöminä pesäkkeinä (Lac ) McConkey-laktoosimaljoilla.

(Kaikkialla näissä spesifikaatioissa ja patenttivaatimuksissa, missä par :sta. Par :sta, par+:aa tai Par+:aa ei erityisesti mainita, niin termit par ja Par tarkoittavat jakotoiminnon ekspressiota).

Claims (29)

37 86439

1. Plasmidi, joka replikoituu gram-negatiivisissa bakteereissa, tunnettu siitä, että siinä on yksi tai useampi istutettu geeni, joka ei luonnollisesti liity plasmidiin, ja että se on stabiloitu istutetulla DNA-fragmentilla, joka on lyhyempi kuin 19 kb, ja joka käsittää Rl-par-alueen A, Rl-par-alueen B tai sekä Rl-par-alueen A että Rl-par-alueen B.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että Rl-par-alue saa jakotoiminnon aikaan.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että DNA-kappale käsittää pääasiallisena komponenttinaan Rl-par-alueen A, Rl-par-alueen B tai sekä Rl-par-alueen A että Rl-par-alueen B.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että istutetun DNA-kappaleen, joka käsittää Rl-par-alueen A ja Rl-par-alueen B, pituus ei ylitä noin 6 kb:iä, erityisesti ei ylitä noin 4 kb:iä ja erityisesti ei ylitä 3 kb:iä.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että istutetun, Rl-par-alueen A käsittävän DNA-kappaleen pituus ei ylitä noin 4 kb:iä, erityisesti ei ylitä noin 2,5 kb:iä ja erityisesti ei ylitä noin 2 kb:iä.

” 6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että istutetun, Rl-par-alueen B käsittävän DNA-kappaleen pituus ei ylitä noin 2 kb:iä, erityisesti ei ylitä noin 1,5 kb:iä ja erityisesti ei ylitä noin 1 kb:iä.

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, etä se tämän lisäksi kantaa geeniä, joka välittää antibioottiresistenssin. 38 86439

8. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se olisi epästabiilisti periytyvä sellaisen istutetun DNA-kappaleen puuttuessa, joka saa jakotoiminnon aikaan.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on pl5-plasmidi tai sen johdannainen, tai plasmidi, jonka kopioiden lukumäärä on suuri ja mahdollinen isäntävalikoima suuri tai tämän kaltaisen johdannainen.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se periytyy epästabiilisti sen kantamasta DNA-kappaleesta, joka käsittää sellaisen geenin tai sellaisia geenejä, jolla tai joilla ei ole luonnollista sukulaisuutta plasmidin kanssa.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on pMBl-plasmidi tai sen johdannainen, kuten pBR322-plasmidi tai sen johdannainen.

12. Patenttivaatimuksen 8 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että sen kopioiden lukumäärä on alhainen vähintään yhden vaiheen aikana, kun plasmidin sisältämiä bakteereita viljellään.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että sen kopioiden lukumäärä on noin 0,5-5 kopiota/-solu.

14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on valikoitu yhteensopimattomuusryhmän IncFII plasmidien joukosta. Rl ja sen johdannaiset mukaan lukien; F ja sen johdannaiset mukaan lukien; sekä plasmidit, joiden kopioiden lukumäärä on alhainen ja joiden mahdollinen isäntävalikoima on suuri, sekä näiden johdannaiset mukaan lukien. 39 86439

15. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on ehdollinen kiitoreplikaatioplasmidi.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että sen kopioluku ei ylitä noin 3-5 kopiota solua kohden, kun plasmidin sisältämiä isäntämikro-organismeja kasvatetaan olosuhteissa, jotka takaavat alhaisen, vakioilleen plasmidin kopioluvun, ja jonka kopioiden lukumäärä on suuruusluokaltaan vähintään 500-1000 kopiota solua kohden, kun isäntämikro-organismeja kasvatetaan tietyissä erilaisissa olosuhteissa.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että sen kopioiden lukumäärä ei ylitä noin 3-5 kopiota solua kohden eräässä lämpötilassa, ja sen kopioiden lukumäärä on vähintään alueella 500-1000 kopiota solua kohden korkeammassa lämpötilassa.

18. Patenttivaatimuksen 16 tai 17 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että siinä plasmidikopioiden lukumäärä on noin suuruusluokkaa 0,5-1 kopiota solua kohden, kun plasmidikopioiden lukumäärä ei ylitä noin 3-5 kopiota.

19. Patenttivaatimuksen 1, 16, 17 tai 18 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että siihen säädeltävä promoottori on istutettu plasmidin luontaisen tai luontaisten replikaation ; " säätelygeenin tai -geenien ylävirtaan.

20. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 16-18 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on Rl-tyypin plasmidi.

21. Menetelmä plasmidi-DNA:n geenituotteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että siinä viljellään sellaisia bakteereita, jotka sisältävät minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-20 mukaisen plasmidin, ja jossa plasmidin geenituote otetaan talteen bakteeriviljelmästä. 40 86 4 59

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä kasvatusta suoritetaan vähintään 100 bakteerisukupolven ajan.

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä plasmidin katoaminen on vähäisempää kuin 2 x 10“^/solu/sukupolvi.

24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä plasmidin katoaminen on vähäisempää kuin 10“5/solu/sukupolvi.

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä plasmidin katoaminen on vähäisempää kuin 5 x 10“6/solu/sukupolvi.

26. DNA-kappale, tunnettu siitä, että se on lyhyempi kuin 19 kb ja että se käsittää Rl-par-alueen A, Rl-par-alueen B tai sekä Rl-par-alueen A että Rl-par-alueen B.

27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää Rl-par-alueet A ja B ja sen pituus ei ylitä noin 6 kb:iä, erityisesti ei ylitä noin 4 kb:iä ja erityisesti ei ylitä 3 kb:iä.

28. Patenttivaatimuksen 26 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää Rl-par-alueen A ja sen pituus ei ·.·' ylitä noin 4 kb:iä, erityisesti ei ylitä noin 2,5 kb:iä ja erityisesti ei ylitä noin 2 kb:iä.

: 29. Patenttivaatimuksen 26 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää Rl-par-alueen B ja sen pituus ei .·. : ylitä noin 2 kb:iä, erityisesti ei ylitä noin 1,5 kb:iä ja .*./ erityisesti ei ylitä noin 1 kb:iä. 41 86439