HU201350B - Process for stabilization of plasmids - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás a gének és termékeik előállításához alkalmazott rekombináns DNS technológia területén használatos plazmidok stabilizálására.

A legtöbb természetes plazmid folyamatos fenntartása, még szelekciós kényszer hiányában is (azaz olyan tényezők hiányában, amelyek csak azoknak az organizmusoknak a növekedését teszik lehetővé, amelyek magukba foglalják a plazmidot; erre példa egy antibiotikum a tápközegben olyan plazmid esetében, amely az illető antibiotikum- rezisztenciát közvetítő gént hordozza) azt sugallja, hogy a plazmid-fenntartási funkciók úgy fejlődtek ki, hogy biztosítsák ezeknek az extrakromoszomális elemeknek a folyamatos jelenlétét nagy hatékonysággal. A plazmid-fenntartási funkciók elsődlegesen a gének replikációjából állnak, beleértve ezek szabályozó köreit is, amelyek szabályozzák a plazmid koncentrációját a sejtben. A növekvő sejtekben a replikációs szabályozó rendszer a plazmid-kópiák számától függően a plazmid-replikáció valószínűségének növelésével vagy csökkentésével helyreállítja az átlagtól való eltéréseket. Nincs azonban olyan szabályozó rendszer, amely meg tudná akadályozni olyan sejtek előfordulását, amelyekben nagyon kevés vagy éppen csak egy plazmid van, és nyilvánvaló, hogy ilyen sejtekből vagy lehetőség arra is, hogy plazmidmentes leánysejt képződjék. Ez a probléma természetesen a kis kópiaszámú plazmidoknál a legnagyobb. Sőt, a plazmidmolekulák passzív eloszlása a sejtosztódásnál szükségszerűen eredményez bizonyos gyakorisággal plazmidmentes sejteket. Mivel a plazmidmolekula elvesztése a sejtből irreverzibilis, egy ilyen nem-stabil szituáció következménye az lesz, hogy a teljes populáció végül is plazmidmentessé válik.

A plazmidok sejtosztódásnál történő véletlenszerű eloszlása mellett más tényezők is befolyásolhatják a plazmidok elvesztésének arányát a plazmid fenntartásához szolgáló, szelekció hiányában nőtt sejtek tenyészetéből. igy pl. néhány plazmid speciális rekombinációs rendszert igényel abból a célból, hogy a két újonnan replikáit molekula szétváljon (Austin és munkatársai, Cell, 25, 1981, 729-36 oldal). A szétválás hiányában multimerek képződnek (egymásba kapcsoltak), és ilyen módon a leánysejtekké osztódás szintjén még egy nagy kópiaszámú plazmid ie úgy tűnhet, mint egy kis kópiaszámú plazmid, mivel a plazmidmentes sejtek keletkezésének valószínűsége növekszik a multimer szerkezetben egymásba kapcsolt plazmidmolekulák számának növekedésével. Egy másik jelenség, amelyet gyakran meg lehet figyelni a rekombináns DNS technológiában, egy stabil klónozó vektor átalakulása nem-stabil hibrid vektorrá, egy DNS fragmens beiktatásának eredményeképpen, amelynek jelenléte vagy csökkenést okoz a plazmid kópiaszámában, vagy egy sérült terméket szolgáltat, amely negatívan hat a sejtnövekedésre.

Minden ilyen esetben a plazmid kiválása és elvesztése egy bizonyos (kisebb vagy nagyobb) gyakorisággal történik, amelyet nem könnyű kívülről befolyásolni.

A természetes plazmidok stabilitása, különösen a kis kópiaszámú plazmidoké, azt sugallja, hogy a replikációs szabályozó rendszeren kívül a fenntartási funkciók egy második sorozata is létezik, amely aktivan részt vesz a plazmidmolekulák rendezett elosztásában a sejtosztódásnál. Az ilyen funkciókat megosztási funkcióknak nevezzük, és tanulmányok (pl. Meacock és munkatársai: Cell 20, 1980, 529-42 oldal; Nordström és munkatársai: Plasmid, 4, 1980, 332-49 oldal, Seelke és munkatársai: Plasmid, 7, 1982, 163-79 oldal) már rámutattak, hogy ezeket legalábbis részben maguk a plazmidok kódolják (.pár' területekben). igy bizonyos plazmid-hiányos mutánsok elvesztették stabil fenntarthatóságukat vagy öröklődésüket annak ellenére, hogy normál vadtipusü viselkedést mutatnak, jelezve, hogy egy plazmid-fajlagos funkció, amely a stabilitást biztosítja, kiiktatódott (lásd Nordström és munkatársai fentebb idézett munkáját).

Mivel sok a rekombináns DNS technológiában vektorként alkalmazott plazmid nagy mennyiségű DNS-t veszít a vad típusú szülő-plazmidokhoz viszonyítva, ezek hajlamosak a nem-stabil öröklődésre. Ez komoly problémát vet fel, mivel a plazmid instabilitása végül is a plazmid teljes elvesztését eredményezi a sejtekből, ami csökkenti a plazmiddal kódolt géntermékek relatív kitermelését. Ez a probléma különösen jelentős a géntermékek nagy mennyiségű termelésénél, ahol a mikroorganizmusok növekedése szelekciós kényszer, pl. egy antibiotikum, mellett nem vihető keresztül, de gyakran környezeti szempontokból legalábbis nem kívánatos, és ahol a mikroorganizmusok generációk nagy számán keresztül növekednek. Az olyan vektorok, amelyek sejtenként csak néhány kópiában vannak jelen, a legvalószínűbb, hogy nem stabilan öröklődnek és ezért eltűnnek a sejtből. Még azokról a plazmidokröl is ismeretes, amelyek szokásosan viszonylag nagy kópiaszámúak a plazmidnak viszonylag jó stabilitást biztosítva, hogy nem-stabillá válnak, amikor a plazmiddal természet szerint nem rokon gént hordozó DNS fragmenseket iktatnak beléjük.

A jelen találmány tárgyát olyan plazmidok képezik, amelyek a plazmiddal természet szerint nem rokon beiktatott gént vagy géneket hordoznak, és amelyek ezen túl egy olyan beiktatott gént Í6 hordoznak, amely megosztási funkciókat lát el. A .beiktatott* kifejezés azt jelenti, hogy a gén(ek)et vagy DNS fragmenst a végső plazmid kialakítása valamely szakaszában vezetjük be a plazmidba.

HU 201350 Β

A leírásban a .megosztási funkció* olyan funkciót jelent, amely a plazmidmolekulák rendezett elosztását biztosítja sejtosztódásnál, és amelyet a plazmidnak egy olyan területe kódol, amely - a funkciót kifejező 5 plazmid típusától függően - egy vagy több génből áll. Amint korábban említettük, ilyen területeket találtak a természetben előforduló vagy vad típusú plazmidokban; de az olyan plazmidok, amelyek egy Pár* fenotipust 10 fejeznek ki, vagyis amelyekben a megosztó gének jelen vannak, és ugyanakkor a plazmidokkal természet szerint nem rokon beiktatott gént vagy géneket is hordoznak, újnak tekinthetők. Ebben a szövegben a plaz- 15 midokat úgy határozzuk meg, mint természetben előforduló extrakromoszomális elemeket a mikroorganizmusokban, amely elemeket önmagukban vagy származékaikként izolálni lehet.

A találmány szerinti plazmidok a rekom- 20 bináns DNS technológia területén klónozó vagy termelő vektorként alkalmazhatók abból a célból, hogy technikai vagy orvosi célú termékek széles választékát nyerjük, amelyek előállítását közvetve vagy közvetlenül a be- 25 iktatott gén vagy gének közvetítik, ilyen termékek elsősorban a polipeptidek, peptidek vagy ezek fragmensei, enzimek, az enzimek reakcióinak nagy számú nera-fehérjeszerű termékei, olyan kis molekulatömegű termékek, 30 mint hormonok és nukleinsavak; különösen jelentősek az eukarióta, elösorban az emlős gének termékei.

A találmány szerinti eljárás előnyös megvalósítási módja értelmében a megosztási 35 funkció egy olyan funkció, amelyet a természetben Rí vadtipusú rezisztencia plazmid területe fejez ki, és ezért a továbbiakban ezt RÍ pár területnek fogjuk nevezni. A jelen találmány szerint egy ilyen területről azt 40 találtuk, hogy részleges vagy teljes stabilitást idéz elő nemcsak a plazmiddal természet szerint nem rokon gént vagy géneket hordozó nem-stabil RÍ miniplazmidoknál, hanem a plazmiddal természet szerint nem rokon gént 45 vagy géneket hordozó, RÍ plazmiddal nem rokon, gyakran kiválasztódó plazmidoknál is.

Egy másik példa a különösen értékes megosztási funkcióra az, amelyet a vadtipusú F plazmidra találtak (Seelke és munkatársai, 50 fentebb idézett munka), amely szintén nagy mértékű stabilitást ad a befogadó plazmidnak. A következőkben elsősorban az RÍ Pár funkcióra hivatkozunk, de belátható, hogy a legtöbb jelenség, amely az RÍ Pár funkcióval 55 kapcsolatos, más Pár funkciókra is érvényes, és hogy a találmány nem korlátozódik csupán az RÍ Pár funkcióra.

Azt már korábban jelezték, hogy az RÍ plazmid megosztási funkcióját az úgynevezett 60 EcoRl-A fragmens fejti ki (Nordström és munkatársai, Plasmid, 4, 1980, 332-49 oldal).

A jelen találmányhoz vezető kutatás folyamán meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az EcoRl-A fragmes, amely Kb. 19 kb (19000 bá- 65 4 zispár) hosszúságú, két és csak két elhatárolható területet tartalmaz, amely Pár* fenotipust ad a befogadó plazmidnak. Ezek a területek az EcoRl-A fragmens egyik végén helyezkednek el, és nincs olyan más DNS szekvencia az EcoRl-A fragmensben, amelyről jelenleg úgy hinnénk, hogy bármiféle plazmidstabilizáló funkciója van. A jelen célokra a két területet pár A és pár B területnek nevezzük, és a későbbiekben rövidítve csak pár A-nak és pár B-nek jelöljük.

Előnyös olyan kis DNS fragmensekkel dolgozni, amilyen kicsikkel csak lehetséges, mivel a kis fragmensek beiktatása könnyebb a plazmidba, és az igy kialakult plazmidot is könnyebb transzformálni a gazdasejtbe; ezért a jelen találmány egyik tárgya eljárás olyan plazmid előállítására, amely olyan beiktatott DNS fragmenst hordoz, amely rovidebb, mint az RÍ plazmid EcoRl fragmense, és tartalmazza az RÍ pár területet. Ez a beiktatott DNS fragmens normálisan főkomponensként tartalmazza az RÍ pár terület A területét, vagy az RÍ pár terület B területét, vagy mind az RÍ pár terület A, mind az RÍ pár terület B területét. Ez azt jelenti, hogy lényegileg mindegyik, a gazdaplazmidba beiktatott DNS fragmens vagy egyik, vagy mindkét pár területből van kialakítva, és a fragmenseken levő többi DNS elsősorban azért van jelen, hogy megfelelő restrikciós helyeket szolgáltasson, és olyan DNS fragmensek alakuljanak ki, amelyek a megkívánt végekkel rendelkeznek, amely végek könnyen összeférhetők a befogadó plazmidon levő megfelelő vagy összeférhető restrikciós helyekkel. Ilyen végeket kapcsolók segítségével is ki lehet alakítani. A pár A területet tartalmazó DNS fragmenst és a pár B területet tartalmazó DNS fragmenst lehet külön-külön, egymás után is bevezetni ugyanabba a plazmádba, amely azután fenotipusosan azonos lesz egy olyan plazmiddal, amelyben a Pár A*, Pár B* fenotípus az ugyanabban a DNS fragmensben levő pár A terület és pár B terület beiktatásával alakult ki. így pl. ha egy olyan plazmidot kívánunk tovább stabilizálni, amely már hordoz egy pár területet, pl. a pár B területet, a plazmidot el lehet hasítani egy megfelelő restrikciós enzimmel, és egy olyan DNS fragmenst lehet ide beiktatni, amelynek végei összeférhetők ezzel a restrikciós hellyel, és amely hordozza a másik pár területet, jelen példában a pár A területet. Egy pár B terület beiktatását hasonló módon egy olyan plazmádba, amely már hordoz egy pár A területet, szintén lehet alkalmazni.

Az eddigiekkel összhangban azok az érdekesebb plazmidok, amelyekben az RÍ pár A területet és RÍ pár B területet tartalmazó beiktatott DNS fragmens hossza nem haladja meg a kb. 6 kb-t, előnyösen nem haladja meg a 4 kb-t és különösen előnyösen nem haladja meg a 3 kb-t. Amikor a beiktatott DNS fragmens az RÍ pár A területet foglalja

HU 201350 Β magában, ez normálisan kb. 4 kb-t meg nem haladó hosszúságú, előnyösen nem több, mint kb. 2,5 kb hosszúságú és különösen előnyösen nem több, mint kb. 2 kb hosszúságú. Amikor a beiktatott DNS fragmens az Rl pár B területet foglalja magában, ez normálisan kb. 2 kb-t meg nem haladó hosszúságú, előnyösen nem több, mint kb. 1,5 kb hosszúságú és különösen előnyösen nem több, mint 1 kb hosszúságú. A kis DNS fragmensek fentebb jelzett előnyÖB volta azonban nem zárja ki azt a lehetőséget, hogy a plazmidot a teljes EcoRl-A fragmens beépítésével stabilizáljuk; ez pl. akkor lehetséges, amikor a stabilizálandó plazmid mérete kevésbé kritikus. Ha a fragmenst teljes egészében iktatjuk be, előnyös lehet átvizsgálási célok miatt olyan DNS fragmenst alkalmazni, amely antibiotikum rezisztenciát közvetítő génnel rendelkezik. Ha azonban bizonyos okból kívánatos az EcoRl-A fragmens méretét csökkenteni, ezt különböző utakon lehet végrehajtani, pl. az EcoRl-A fragmens részleges restrikciójával Pst I restrikciós enzim segítségével, vagy ügy, hogy az Rl pár területeket a nagy fragmenstől levágjuk, és a területeket egymás után ugyanabba a DNS fragmensbe átvisszük, amelyet azután a stabilizálandó plazmidba beiktatunk.

A találmány szerinti módon stabilizált plazmidok lehetnek vagy olyan plazmidok, amelyek természetes rokonságban vannak a beiktatott megosztó területtel, mint pl. Rl miniplazmidok, amelyeket egy beiktatott Rl pár terület segítségével stabilizálunk (az Rl miniplazmidokból el van távolitva sok eredeti Rl DNS, következésképpen önmagukban általában nem tartalmaznak Rl pár területet), vagy olyan plazmidok lehetnek, amelyeknek nincs természetes rokonságuk a megosztási funkcióval. Érdekes megemlíteni, hogy a találmány szerint hasznos, hatásos megosztási funkció nem csupán azoknak a plazmidoknak a kielégítő stabilitását képes biztosítani, amelyekkel természet szerint rokon, mint pl. az Rl miniplazmid stabilizálása esetében egy Rl pár területtel, hanem olyan plazmidoknak is, amellyel a megosztási funkciónak nincs természet szerinti rokonsága. Az utóbbira példa egy Rl pár terület beiktatása egy nem-Rl plazmidba, mint pl. egy pMBl plazmidba vagy annak származékába, pl. pBR 322 plazmidba vagy annak származékába (ezek a plazmidok rendesen stabilak, de hajlamosak nem-stabillá válni, amikor a plazmiddal természet szerint nem rokon gént vagy géneket iktatnak beléjük). Egy másik példa egy Rl pár terület alkalmazása bizonyos plazmidtípusok stabilizálására, amelyek a plazmidot befogadó baktériumok tenyésztésének legalább egy szakaszában, kis kópiaszámmal rendelkeznek, pl. 0,5-5 kópia sejtenként, ilyenek a kis kópiaszámú, széles gazdatartománnyal rendelkező plazmidok [olyan plazmidok, amelyek képesek replikálódni több különböző gazdatörzsben vagy fajban; ide tartoznak az úgynevezett .ingázó' (shuttle) vektorok, amelyek két vagy több típusú mikroorganizmusban képesek replikálódni és származékaik, pl. az RK2. A stabilizálást igénylő Inc F II összeférhetetlenségi csoportba tartozik az Rl plazmidon kívül az R100 és R6 is. Egy Rl pár terület alkalmazása nem stabil F plazmidok stabilizálására szintén a jelen találmány oltalmi körébe esik.

A találmány szerinti stabilizálás fontos az úgynevezett feltételesen .megvaduló replikációs plazmidok esetén, azaz olyan plazmidok esetén, amelyek abban az esetben, ha az illető plazmidot befogadó gazda mikroorganizmust bizonyos körülmények között tenyésztjük, konstans kis plazmid kópiaszámot mutatnak, míg abban az esetben, ha az illető plazmidot befogadó mikroorganizmust bizonyos más körülmények között tenyésztjük, elvesztik replikációs szabályozásukat, és a plazmid kópiaszáma exponenciálisan növekszik mindaddig, amíg a gazdasejt meg nem szűnik növekedni. A .megvaduló (.runaway) replikációs plazmidok, amelyek esetén a találmány szerinti stabilizálás különösen létfontosságú, az olyan plazmidok, amelyek kópiaszáma nem haladja meg a 3-5-öt sejtenként, és különösen azok, amelyek kópiaszáma nem haladja meg a 0,5-1 kópiát sejtenként (a 0,5 szám úgy értendő, hogy a replikációs gyakoriság kevesebb, mint 1 sejt-ciklusonként), abban az esetben, ha az illető plazmidot befogadó mikroorganizmust olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek ilyen kis plazmid kópiaszámot biztosítanak, míg abban az esetben, ha a gazda mikroorganizmust bizonyos más körülmények között tenyésztjük, amelyek egy lényegesen megnövekedett plazmid kópiaszámot biztosítanak legalább 500-1000 kópia/sejt kópiaszámot mutatnak.

A bizonyos körülmények közötti (általában alacsony hőmérsékleten, kb. 30 °C körüli hőmérsékleten) kis plazmid-kópiaszám akkor kívánatos, amikor plazmidot használunk vektorként olyan idegen gének beiktatására, amelyek a gazdasejtre részben toxikus vagy letális termékeket kódolnak, mivel a plazmid pl. alacsony hőmérsékleten kis sebességgel replikálódik, a gének csupán kis mennyiségben fejeződnek ki, ha egyáltalán kifejeződnek, így a sejtek nem károsodnak a tenyésztés sokszorozódási szakaszában. Az ilyen rendkívüli kis kópiaszámmal rendelkező plazmidokban azonban - amely kis kópiaszám a fentebb említett sokszorozódási szakasz körülményei között, pl. alacsony hőmérsékleten történő tenyésztés esetén alakul ki - a pár terület hiánya azt eredményezi, hogy a 3-5 kópia/sejt kópiaszámmal rendelkező plazmid a mikrobiológiai populációból generációnként mintegy 1% gyakorisággal elvész, amikor ezeket a sejteket kis kópiaszámot biztosító körülmények között tenyésztjük. A plazmid elvesztésének gyakorisága olyan plazmidok5

HU 201350 Β nál, amelyek kópiaszáma nem haladja meg a 0(5-1 kópia/sejtet, körülbelül 5%/sejt/generáció.

Nyilvánvaló, hogy valamiféle megosztási funkció nélkül, amely stabilizálja ezeket, a 5 plazmid eltűnhet a sejtekből, mielőtt a sejtek elérnék azt a sűrűséget a tápközegben, amely gazdaságos lenne a .megvaduló replikáció beindításához; ez különösen fontos nagy mennyiségű termelés esetében, amikor a 10 sejt több száz generációja szükséges, hogy elérjük a termelő méretű tenyészetet.

Az ilyen .megvaduló' replikációt feltételessé lehet tenni egy szabályozható promotor beiktatásával a plazmid eredeti replikációs 15 szabályozó génje(i)vel ellenkező irányban (ennek a részletes leírása megtalálható jelen bejelentők ezzel a bejelentéssel összefüggő másik bejelentésében, amelynek címe: .Feltételesen szabályozatlan replikációs viselkedésű 20 plazmidok, és amelyet ugyanazon napon nyújtottak be, mint a jelen bejelentést). Számos különböző típusú plazmid lehetséges, amely .megvaduló replikációs viselkedéssel rendelkezik, de az előnyős .megvaduló rep- 25 likációs plazmidok az Rl-tipusú plazmidok.

A jelen értelmezésben a .stabilitás (és az ezzel rokon kifejezések) azt kívánják jelenteni, hogy a gazdasejtből a plazmid elvesztésének gyakorisága kevesebb, mint 2 · 30 • 10*⁴ (sejt) generáció. Valójában egy Pár funkció beiktatásával a plazmidba lehet olyan plazmidokat is nyerni, amelyek éppen olyan stabilak, mint a vadtipusú plazmidok, azaz az elvesztésük gyakorisága kevesebb, mint 3 35 • 10*® (sejt) generáció, amely megfelel a gének mutációs gyakorisági szintjének. Ez utóbbi elvesztési gyakorisági (LF) érték akkor valósul meg, amikor a plazmidot mind Rl pár A területtel, mind Rl pár B területtel 40 stabilizáljuk, mint pl. amikor a teljes EcoRl-A fragmenst beiktatjuk a plazmidba.

Amint korábban említettük, az Rl plazmid Pár* fenotipusa viszont az EcoRl-A fragmensen elkülönült pár területeken he- 45 lyezkedik el. Úgy találtuk, hogy ezeknek a pár területnek mindegyike stabilizáló hatást fejt ki a nem stabil plazmidokra, amely plazmidokat úgy is meghatározhatjuk, mint stabilizáló- vagy megosztási funkció-hiányos plaz- 50 midokat. Az ilyen plazmidok, amelyek fenotipusosan Pár* típusúak, általában kisebb vagy nagyobb gyakorisággal elvesznek a gazdasejtból; igy pl. az Rl plazmid származékok, amelyekből a pár terület hiányzik, mintegy 1,5 · ΙΟ*² (sejt) generáció gyakorisággal vesznek el a gazdasejtből. Hasonlóképpen a pl5 plazmid származékok, amelyek Pár* típusúak, kb. 1 · 10*² (sejt) generáció gyakorisággal tűnnek el, és néhány pMBl plazmidszármazék (pBR 322) (pl. egy olyan, amelyet a 3.3 példában leírunk), 6 · 10*³ (sejt) generáció gyakorisággal tűnhet el. Ezzel szemben a vagy pár A-val, vagy pár B-vel stabilizált Rl plazmidok kb. 10*Vsejt/generáció LF-órtékkel rendelkeznek, ez százszoros stabilizálásnak felel meg, amely egy nem-etabil vektorba beiktatott, ezeknek a pár területeknek valamelyikét hordozó DNS fragmensnek tulajdonítható; ugyanezek a számok a megfelelő pl5 származéknál kb. 8 · 10*⁴ (Pár A*), 1 · 10*® (Pár B‘), a megfelelő pMBl származéknál 5 · 10*⁵ (Pár B‘). Az olyan plazmidok, amelyek mind a pár A, mind a pár B területet hordozzák, kb. 10*®/se jt/generáció LF-értékkel bírnak, vagyis egy 10⁴-szeres stabilizáló hatásról van szó. A könynyebb áttekintés érdekében a különböző eredetű stabilizált és nem stabilizált replikonok eredményeit az 1. táblázatban mutatjuk be. Ez azt jelzi, hogy mindegyik pár terület a másiktól függetlenül működik, valamint azt, hogy a pár területek hozzávetőlegesen egyformán hatásosak a stabilizálásban, legalábbis az Rl és pl5 plazmidoknál, és azt, hogy ténykedésük és hatásuk összeadódik. Ezt a jelenséget akkor lehet hasznosítani, amikor meghatározzuk azt a mértéket, amelyre egy nem-stabil plazmidot stabilizálni kell. Ha kevésbé drasztikus stabilizálás szükséges, azaz ha úgy becsüljük, hogy a stabilizálandó plazmid nem túlságosan labilis [kisebb, mint 10*²/sejt/generáció LF-értékű], elegendő beiktatni egy olyan DNS-fragraenst, amely a pár területeknek csak egyikét tartalmazza, igy is kielégítő stabilitást lehet elérni, azaz olyan stabilitást, amely elejét veszi a plazmidok fokozatos elvesztésének nagy-méretarányú baktériumpopuláció előállításánál több száz generáción keresztül. Másrészt viszont ha a plazmid nagyon kevéssé stabil [nagyobb, mint ΙΟ*²/sejt/ generáció LF-értékű], szükséges vagy legalábbis előnyös mindkét pár területet beiktatni, hogy biztosítsuk a plazmidok rendkívüli stabilitását.

1. Táblázat

Különböző replikonok veszteség/sejt/generáció gyakoriságai

A replikon tipusa	A veszteség gyakorisága (10*4/sejt/generáció)
Pár fenotípus	Pár B*
Pár*	Pár A* Pár B*	Pár A*
Rl	150	0,6 1,0		0,04
pl5	100	8,0 0,01		0,01
pMBl (pBR 322)	60	ND1 0,5		0,1

³ND = nincs adat

-5HU 201350 B

Ezeket a mérhető LF-értékeket akkor lehet hasznosítani, amikor bármely fentebb meghatározott típusú plazmidot vektorként alkalmazunk géntermékek előállításában, és ezek legalább egy olyan gént tartalmaznak, 5 amely a plazmiddal természet szerint nem rokon. A találmány egy további tárgya tehát egy géntermék előállításának eljárása plazmid DNS-ről, amely szerint egy, a fentebb leírt jellemzők bármelyikével bíró par-stabilizált 10 plazmidot befogadó baktériumot tenyésztünk, és a plazmid géntermékét a baktériumtenyészetből kinyerjük. A tenyésztést önmagában ismert módon végezzük, beleértve a hagyományos tápközegeket, amelyek optimálisak a 15 szóban forgó baktériumfaj számára. Érdemes megjegyezni, hogy a stabilizálás következtében nincs szükség speciális tápközeg-összetételre. A géntermék kinyerése szintén jól ismert módszerekkel történik, amelyeket a 20 szóban forgó, elkészített géntermékekhez és tulajdonságaihoz, a gazdabaktérium tulajdonságaihoz, stb.-hez igazítunk. A tenyésztést legalább 100 baktériumgeneráción át folytatjuk, nagy mennyiségű termelésnél a sejtge- 25 nerációk száma, amely szükséges a baktériumok szaporításához, meghaladhatja a 100 generációt. Ilyen körülmények között a plazmid LF értékét úgy lehet megválasztani a benne levő pár terület segítségével, hogy a plaz- 30 mid-veszteség kevesebb legyen, mint 2 · • 10-Vsejt/generáció. Ezt az LF értéket általában el lehet érni egyetlen pár területtel is. Bizonyos esetekben azonban előnyös kevesebb, mint 10⁵/sejt/generáció, még elönyő- 35 sebb kevesebb, mint 5 · 10^(sejt)generáció LF értéket beállítani.

Bér ezeket a nagyon kis LF értékeket bizonyos esetekben el lehet érni csak egyetlen pár terület beiktatásával (elsősorban Rl 40 pár B területtel), mégis általában szükséges mindkét Rl pár terület jelenléte.

A találmány egy további tárgya eljárás olyan baktériumok előállítására, amelyek a fentebb meghatározott típusú plazmidokat 45 tartalmazzák. A találmány szerinti plazmidok különleges előnye, hogy nem szükséges különleges mutánsok vagy törzsek a plazmid fenntartásának biztosítására. így bármilyen ilyen plazmidot befogadni képes baktériumfaj 50 és törzs alkalmazható, mint pl. gram-negatív baktériumok. A találmány szerinti eljárásban alkamazható olyan baktérium, amelyben a plazmidok szaporodni és stabilitásukat fenntartani képesek, például az Escherichia coli. 55

Végül a találmány tárgya eljárás olyan DNS fragmens előállítására, amely fő komponensként egy Rl pár területet tartalmaz. Ez azt jelenti, hogy lényegileg minden DNS fragmens, amely be van iktatva a gazda- 60 -plazmidba, valamelyik vagy mindkét pár területet tartalmazza, és a DNS többi része azt a célt szolgálja, hogy alkalmas restrikciós helyeket szolgáltasson a befogadó plazmidon levő megfelelő restrikciós helynél történő be- 65 iktatáshoz. Az Rl pár A és Rl pár B területet tartalmazó, beiktatott DNS fragmens hoszsza - ezzel az elvvel összhagban - nem haladhatja meg a kb. 6 kb hosszúságot, előnyösen a kb. 4 kb hosszúságot, és még előnyösebben a 3 kb hosszúságot. Amikor a DNS fragmens az Rl pár A területet foglalja magában, ez normálisan nem haladja meg a kb. 4 kb hosszúságot, előnyösen a kb. 2,5 kb hosszúságot, és különösen előnyösen a kb. 2 kb hosszúságot. Amikor a DNS fragmens az Rl pár B területet foglalja magában, ez normálisan nem haladja meg a kb. 2 kb hosszúságot, előnyösen a kb. 1,5 kb hosszúságot, és különösen előnyösen a kb. 1 kb hosszúságot. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az ilyen kicsiny és ennélfogva könnyen beiktatható DNS fragmensek megőrzik stabilizáló funkciójukat akkor is, amikor a restrikciós enzimes térképezéssel a pár A terület egy kb. 1800 bp (bázispár) területre szűkül és a pár B terület kb. 900 bp-re szűkül. Lehetséges, hogy a Pár* fenotipust ténylegesen szolgáló gén vagy gének még ennél is kisebbek.

A Pár* fenotípussal rendelkező hibrid plazmidok megalkotásában komoly problémát jelent az ilyen fenotipusra történő átvizsgálás gyors és egyszerű módszerének hiánya. Általában az alkalmas hibrid-plazmidot a Pár* fenotípussal lehet azonosítani, amely a plazmid nagy stabilitását eredményezi a plazmid szelekciós kényszer nélküli növekedése során. Az ilyen típusú átvizsgálás azonban hosszadalmas, és csak akkor helytálló, ha a szülő plazmid nem stabilan öröklődött. Egy másik átvizsgálási módszert fejlesztettünk ki, amelyet az alábbiakban ismertetünk:

a.) Átvizsgálás a pár A fragmens beiktatására nézve.

Ha ugyanabban a sejtben két különböző, (össze nem férő csoportokból származó), plazmid van jelen, amelyek mindegyike hordoz pár A* területet, ezek kiűzik egymást egy bizonyos gyakorisággal (összeférhetetlenség), valószínűleg azért, mert ezek versengenek a sejtben levő megosztási apparátusért. Az ilyen pár által közvetített összeférhetetlenségi fenotipus-fajtát a pár hibridek átvizsgálásához lehet hasznosítani. így pl. egy Pár A⁺ plazmidot át lehet vinni egy olyan alac E. coli törzsbe (pl. CSH 50 törzsbe), amely más olyan plazmidot is tartalmaz, amely lac géneket és a pár A* területet hordozzák. Normálisan a belépő plazmid pár* által közvetített összeférhetetlenséget fejt ki a bent lévő Pár A* plazmid ellen. A bent levő plazmid Lac* fenotipusa miatt az ilyen összeférhetetlenség könnyen kimutatható, ha a transzformánsokat csak a belépő plazmidban talált rezisztencia-marker alapján szelektáljuk, míg a bent levő plazmid jelenléte vagy távolléte jelezhető egy indikátor szubsztratumon, pl. McConkey laktóz lemezen. Az ilyen

-611

HU 201350 Β lemezekről egy újabb, hasonló lemezre készített (replika lemez telepek) kimutatják a bent levő (rezidens) plazmid kiűzésének még alacsony szintjét is színtelen telepek formájában, amelyek a Lac sejtek megjelenésére utalnak. További stabilitási vizsgálat vagy még kiterjedtebb összeférhetetlenségi vizsgálat szükséges a lehetséges pár A* hibrid plazmid tulajdonságainak vizsgálatához. Ezen az úton - a belépő és bent levő plazmidok megfelelő (összeférhető) kombinációját is beleértve - az Inc* (Pár·) fragmensek bármilyen, etabil vagy nem stabil plazmidba történő beiktatására nézve gyorsan elvégezhető az átvizsgálás.

b. ) Átvizsgálás a pár B· fragmens beiktatására nézve.

Mivel azt már bemutattuk, hogy két nem rokon plazmid, amelyek mindegyike hordoz pár B· területet, összeférhetetlen egymással, ugyanazt az átvizsgálási stratégiát lehet alkalmazni a pár B* hibridek kialakításánál, mint amelyet a pár A· hibridek kialakításánál leírtunk.

c. ) Átvizsgálás a pár A*, pár B· fragmensek beiktatására nézve.

A fenti leírás szerint lehetséges mind a pár A·, mind a pár B· hibrid plazmidok kiűzése, ezen kívül azonban az EcoRl-A fragmens a Tn 5 beiktatással lehetővé teszi a pár A·, pár B· fragmenseket hordozó plazmidok közvetlen szelekcióját (Km^B). igy a fragmens nagy mérete ellenére még nagyon kis hibridek is könnyen szelektálhatok. Egy kisebb DNS fragmens, amely mindkét pár· területet tartalmazza, természetesen összeférhetetlenséget mutat mind a pár A·, mind a pár B· plazmidok ellen.

AZ ÁBRÁK MAGYARÁZATA

Többször hivatkozunk az ábrákra, amelyek közül a 1-5. és 7-17. ábrák a példákban leirt plazmidok restrikciós térképét mutatják be.

A 6. ábra az Rl-ből származó Pstl-D fragmens részletes (nem méretarányos) térképét mutatja, és a

18. ábra a különböző pár területeket hordozó replikon különböző típusú stabilitási görbéit mutatja be a Pár^- replikonokkal összehasonlítva.

Az 1-5. és 7-17. ábrákon a példákban leírt plazmidok lineáris restrikciós térképét mutatjuk be, amelyekben a plazmidok fenotipusát és genotípusát a vízszintes vonal fölött jelezzük, amely a szülő plazmidokat jelenti. igy pár A képviseli az Rl plazmid plazmid-fenntartást biztosító területeinek egyikét, pár B képviseli az Rl plazmid másik plazmid-fenntartást biztosító területét, ice I egy gént képvisel, amely a colicin El-re való immunitást közvetíti; őri vagy őri V képviseli a plazmid-replikáció kezdetét; bla egy olyan 8 gént jelent, amely az ampicillin-rezisztenciát kódolja; IR egy fordított ismétlő szerkezetet jelent Tn 5-ön; Km^g kanamicin-rezisztenciát jelent; Cm^R klóramfenikol rezisztenciát jelent; Ap^R ampicillin-rezisztenciát jelent; Tc^B tetraciklin-rezisztenciát jelent; rep A egy olyan gént képvisel, amely egy, az Rl replikációhoz szükséges fehérjét kódol; lac Z, lac Y és lac A a beiktatott lac operont jelentik, amelyek közül lac Z kódolja a β-galaktozidázt, lac Y kódolja a permeázt, és lac A kódolja a transzacilázt; rep A - lac Z’ a rep A és lac Z gének közötti fúziót jelenti; cop B egy olyan gént jelent, amely egy olyan polipeptidet kódol, amely (az Rl plazmidok) rep A promotorjárói történő átírást visszaszorítja; cop A egy olyan gént jelent, amely egy olyan RNS molekulát kódol, amely gátolja a Rep A-RNS átírást; CIsm egy olyan gént képvisel, amely egy a A, Pb promotor-aktivitást szabályozó hőmérséklet-érzékenyét represszort kódol; Pdeo pedig a deo promotort képviseli. A nyilak mutatják az átírás irányát és a .háromszög'-ek mutatják a DNS-beiktatásokat. A betöltött területek és az üres területek a beiktatott géneket, a pontozott vonalak a kihagyást (deléciót) jelzik.

A vízszintes vonal alatt a restrikciós enzimekhez tartozó helyeket jelöltük, amelyben E jelzi az EcoRl-t; P jelzi a Pstl-t; Bi jelzi a BamHI-t az 1. és 5. ábra kivételével, ahol a Tn 5 DNS-en kívül, az Bal I-t jelöl; Hí jelzi a Hpal-t; Ev jelzi az EcoRV-t; B2 jelzi a Bgl ΙΙ-t; Sí jelzi a Sál I-t; H3 jelzi a Hind 111-at; és C jelzi a Cla 1-et.

A 6. ábrán a Pst I-D-fragmens további térképezését mutatjuk be, a vízszintes vonal fölötti számjegyek a restrikciós helyek közötti bázispárok számát jelzik. A vízszintes vonal alatt a restrikciós enzimekhez szolgáló helyek vannak jelölve, ahol Rí jelentése Rsal; P Pst I-et; és Hl HPA I-et jelent.

A 18. ábrán a példákban megalkotott és vizsgált Rí, pl5 és pBR 322 származékokhoz tartozó stabilitási görbéket ábrázoltuk. Minden egyes görbe legalább két folyadéktenyészetnek az átlagát képviseli, amelyeket több, mint 100 generáción át folytattunk. A számokból az tűnik ki, hogy a mind a pár A-t, mind a pár B-t tartalmazó plazmidok rendkívül stabilan öröklődnek, amely ugyanúgy igaz abban az esetben is, amikor egyedül pár B-t tartalmazó plazmidokról és egyedül pár A-val stabilizált mini Rl plazmidokról van szó.

A Pár plazmidokhoz tartozó görbékből az tűnik ki, hogy kezdetben a plazmidhordozó sejtek gyakorisága exponenciálisan csökken, ahogyan ez el is várható az elvesztés konstans sebessége miatt. A későbbi szakaszokban a plazmidhordozó sejtek gyakorisága gyorsabban csökkenőnek látszik (teljes vonallal jelölve), ami a plazmidmentes sejtek kiesé gyorsabb növekedési sebességének tulajdonítható. A szaggatott vonallal jeleztük a

-713

HU 201350 Β gyorsabb növekedés alapján történt kiigazítást, ami a tényleges elvesztési gyakoriságot mutatja.

Ezzel ellentétben azok a plazmidok, amelyek fenotipikusan Pár típusúak, 1,5 · 10*²- 5 /sejt/generáció gyakorisággal vesznek el Rl plazmidoknál, 1 10*²/sejt/generáció gyakorisággal a pl5 plazmidoknál és 6 10*³/sejt/generáció gyakorisággal néhány pBR 322 plazmidnál (egy ilyet mutatunk be a 3.3 10 példában). Valóban, a pl5 Pár* és a pBR 322 Pár* származékok elvesztési gyakorisága meglepően nagy, ha ezeknek a vektoroknak a kópiaszámát figyelembe vesszük. így pl. a pl5 kópiaszáma 15-20 körül mozog sejten- 15 ként, ami 10*⁹/sejt/generáció elvesztési sebességet jelent, ha a plazmidok binomiális eloszlását tételezzük fel. A megfigyelt nagy elvesztési arány könnyen megmagyarázható azzal a ténnyel, hogy a pl5 replikonok a rec 20 A-függően kapcsolt egységet képeznek, valószínűleg egy loxP-szerű felbontó (resolűciós) funkció hiánya miatt. (Austin és munkatársai, Cell, 25, 1981, 729-36 oldal). A pBR 322 származékokról is ismeretes, hogy kapcsolt egy- 25 ségeket képeznek, és amikor a kópiaszám csökken pl. a nagy klónozott fragmensek miatt, jelentős instabilitás jön létre.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 30

Az alkalmazott Escherichia coli K-12 törzs CSH50 volt (apro-lac, rpS L; lásd: Miller, J.: Experiments in Molecular Genetics,

Cold Spring Harbor, New York, 1972). Több- 35 féle plazmidot és bakteriofágot használtunk (lásd 2. táblázat).

Az alkalmazott kísérleti technikák standard technikák, amelyeket a mikrobiológiai genetika terén (Miller, J.: Experiments in Mo- 40 lecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972), valamint a genetikai manipulációk terén (Davis, Batstein és Roth: A Manual fór Genetic Engineering; Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 45 1980) általában használnak.

Az összes sejtet LB tápközegen tenyésztettük (Bertani: J. Bact. 62, 1951, 293 oldal), amely 0,2% glükózzal és 1 Mg/ml tiaminnal volt kiegészítve; vagy A+B minimális 50 tápközegen (Clark és Male, J. Mól. Bioi. 23, 1967, 69. oldal), amely 0,2% glükózzal és 1% kazamino-savval volt kiegészítve. Az alkalmazott lemezek LB tápközeget és 1,5% agart tartalmazó LA lemezek voltak. 55

A McConkey laktóz indikátorlemezeket a gyártó cég (Difco) ajánlása szerint készítettük, és az X-gal lemezeket 20-40 Mg/ml 5-bróm-4-klór-indolil-/i-D-galaktozid hozzáadásával A+B minimáltápközegből készítettük, 60 amely még 0,2% glükózzal és 1 Mg/ml tiaminnal volt kiegészítve.

Fiziko-kémiai módszerek

A tiszta lizátumokat a Clewell és Helinski által leirt módszerrel készítettük (Proc. 65

Natl. Acad. Sci. USA, 62, 1962, 1159-66. oldal).

A plazmid DNS kis mennyiségű készítését Bimbóim és munkatársai módszere szerint hajtottuk végre (Nucl. Acids Rés. 7, 1979, 1513-23. oldal).

A plazmid DNS nagy mennyiségű készítését Boyant festék sűrűség gradiens centrifugálással hajtottuk végre Stougaard ós Molin szerint (Anal. Biochem. 118, 1981, 181. oldal).

A DNS-preparátumok poliakrilamid-gél elektroforézisét és agaróz gél elektroforézisét lényegében a Molin és Nordström által leírt módszerrel hajtottuk végre [Methods in Plasmid Biology, Odense University (Odense Egyetem) 1982].

A restrikciós endonukleázokat a gyártó által nyújtott előírásokkal összhangban használtuk (Boehringer, Mannheim vagy Biolabs, New England) 37 °C hőmérsékleten. Kétszeres és háromszoros emésztést, azzal az enzimmel kezdtük, amely a legkisebb sókoncentrációt igényli, majd további pufferrel végeztünk beállítást, mielőtt a következő enzimet hozzáadtuk volna.

A Bal 31 exonukleázzal történő kezelést a következőképpen hajtottuk végre; 0,1 egység Bal 31-et adtunk 50 Mg lineáris DNS-hez, és mintákat vettünk ki az 1., 2., 4., 8., 16., 32. és 60. percben 60 mmól/literes EDTA-hoz, fenollal extraháltuk, etanollal kicsaptuk, és újra szuszpendáltuk 20 m1 TE pufferban. A 20 /ml felét a megfelelő restrikciós enzimmel emésztettük, és agaróz gél elektroforézisnek vetettük alá, hogy meghatározzuk a törölt DNS-törlések átlagos méretét. A másik feléhez a megfelelő kapcsolót (linkért) adtuk hozzá, és a keveréket összekapcsoltuk (ligáltuk) 48 órán át a fölös mennyiségű T4 DNS ligázzal.

A hasított polazmid DNS összkapcsolását a gyártó által ajánlott módszerrel hajtottuk végre a tompa vég-kapcsolás kivételével, ahol a T4 DNS ligáz és ATP feleslegét adagoltuk.

Mikrobiológiai módszerek

I. megosztási vizsgálat: A Lac⁴ vektorok megalkotása lehetővé tette a plazmid Pár⁴ fenotipusának meghatározását egyszerűen szélesztve nem-szelektív McConkey laktóz lemezen vagy X-Gal lemezen. Az ezeket a plazmidokat befogadó baktériumok (alac) Lac⁴ fenotípust közvetítenek, amelyet könnyen lehet jelezni színes telepként az indikátor lemezen, mig a piazmidmentes sejtek Lac* fenotipusűak és színtelen telepekként jelennek meg.

IL megosztási vizsgálat (Lac* plazmidokhoz használt): Egy szelektív lemezről (antibiotikumot tartalmazó lemez) egy telepet szélesztettünk egy másik szelektív lemezre. Erről a lemezről egy telepet szélesztettünk egy LA lemezre, ügy, hogy egyedi telepek képződjenek. Az LA lemezről mintegy 10 telepet szuszpendáltunk 1 ml 0,9%-os NaC] oldatban

-815

HU 201350 Β

10**, illetve 1O*⁵ arányú hígításban. A 10** és ΙΟ*⁵ hígításokból 0,1 ml-t szélesztettünk LA lemezeken. Ezekről a lemezekről 50 telep ellenálló mintáját vizsgáltuk a megfelelő szelektív lemezeken (illetve 200 telepét, ha az instabilitás várhatóan gyenge volt). Az elvesztés gyakoriságát (LF érték) a következő képlet alapján számítottuk ki:

LF = 1 - (7)<ι/2ϊ) ahol V jelentése a plazmidot hordozó sejtek gyakorisága, feltételezve, hogy egy telep 27 generáción keresztül nő. Ehhez a módszerhez hozzátartozik a nagy statisztikai ingadozás.

III. megosztási vizsgálat: A Lac’ és Lac* plazmidok stabilitásának kvantitatív mérése. Egy teljes telepet felvettünk egy szelektív lemezről, és 10® sejt/ml koncentrációban szuszpendáltuk kb, 1 ml 0,9%-os NaCl oldatban. 10*³ higitásü szuszpenziókból 2 x x 0,1 ml-t használtunk 2 x 10 ml LB-tápközeg inokulálására, és az inkubálást 30 °C hőmérsékleten rázás közben hajtottuk végre. Kb. 5 · 10⁸ sejt/ml sejtsűrűségnél a tenyészeteket 10*-szeresre illetve 10⁵-szeresre hígítottuk. 0,1 ml-t használtunk fel a 10*-szeres hígításból (5 · 10³ sejt), hogy inokuláljunk 10 ml friss LB tápközeget, és 0,4 ml-t szélesztettünk a 10⁵-szeres hígításból McConkey lak tóz lemezeken, és a lemezeket 30 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáltuk. A higulás 5 · 10® /ml-ről 5 · 10²/ml-re 20 növekedési generációnak felel meg (2²⁰), igy a változás a plazmidot viselő sejtek gyakoriságában az egyik hígítástól a következőig megfelel annak, amely a növekedés 20 generációja alatt történik. Általánosabban, az LF értéket a következőképpen lehet kiszámítani:

= (1 - LF)81 és? 2 = (1-LF)82 aholV í ésV 2 a plazmidot viselő sejtek gyakorisága gi, illetve g2 generációk után, és LF az elvesztés gyakorisága/sejt/generáció. Ebből az következik, hogy γΐ/γ2 = (1 - LF)8l*82 és

LF = 1 - (’/ι/ΫζμίΛβί-βΖΠ

EzL a képletet használva a zéró időpontban az inokuláló sejtek számában levő ingadozás miatti hibák elkerülhetők. A képletnek egy sokkal kényelmesebb megközelítése a következő képlet:

LF = ln(\’iA^2)/(gi-g2)

Összeférhetetlenségi vizsgálat.

Olyan plazmidokat, amelyekről azt lehetett vélni, hogy beiktatott pár területet hordoznak, vizsgáltunk át azon az alapon, hogy két egyébként összeférhető replikon, amelyek ugyanazt a pár területet hordozzák, összeférhetetlen egymással, és szelekciós kényszer hiányában egyik vagy másik elvész. A vizsgálatot úgy végeztük, hogy a vizsgálandó plazmidot transzformáltuk egy másik plazmidot hordozó baktériumtörzsbe, mindkét plazmidra szelektálva duplán szelektív lemezen. A duplán szelektív lemezen (két különböző antibiotikumot tartalmazó lemez) szélesztés után az öszszeférhetetlenség mind kvalitatívan, mind kvantitatívan mérhető.

A kvalitatív összeférhetetlenségi vizsgálathoz egy telepet a duplán szelektív lemezről szélesztettünk egy LA lemezen, egyedi telepeket képezve. Erről a lemezről kb. 10 telepet szuszpendáltunk 1 ml 0,9%-os NaCl oldatban, és 10**, illetve 10*⁵ arányban hígítottuk. A 10** és 10*^s hígításból 0,1 ml szuszpenziót szélesztettünk LA lemezeken. Ezekről a lemezekről 50 telepet (vagy ha gyenge összeférhetetlenség volt várható, 200 telepet) vizsgáltunk a megfelelő szelektív lemezeken. Ha egy Lac’ plazmid volt érdekelve a vizsgálatban, McConkey laktóz indikátor lemezeket használtunk a szelektív lemezeken történő replika-lemezkészités helyett. Lac’ plazmidok esetében az átvizsgálást úgy hajtottuk végre, hogy a Pár’ plazmidnak vélhető plazmidot transzformáltuk egy olyan törzsbe, amely már tartalmazott egy Lac· fenotípust közvetítő Pár· hibrid plazmidot. A plazmid-összeférhetetlenség és következésképpen a belépő plazmid fajlagos Pár’ fenotipusának bizonyítása könnyen észlelhető a Lac* telepekre történő átvizsgálással McConkey lemezeken, kimutatva, hogy a bent levő (rezidens) Pár’ plazmid destabilizálódott. Az ilyen átvizsgálás! eljárást mutatunk be a 4. példában.

A kvantitatív összeférhetetlenséget a Lac’ plazmidok elvesztési gyakoriságának mérésével végeztük, miután a fentebb leírt heteroplazmid populáció kialakult. Az LF értékeket a korábban leírt .III. megosztási vizsgálat szerint mértük.

Genetikai technikák

A baktériumok transzformációját Cohen és munkatársai szerint végeztük (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 62, 1972, 2110-2114. oldal), azzal a módosítással, hogy amikor kis transzformációs gyakoriság volt várható, a megfelelő sejtek DNS-sel történő kezelését jégen több óra hosszat végeztük, és hó-sokk után a sejteket jégben 5-30 percre ismét lehűtöttük. Ez a kezelés szignifikánsan megnövelte a transzformációs gyakoriságot.

A Λ. bakteriofággal végzett fertőzést úgy hajtottuk végre, hogy 10 ml tenyészetet LB tápkőzegben, amelyet 0,2% maltózzal egé10

-917

HU 201350 Β szitettünk ki (hogy indukáljuk a mai B fehérjét, amely a Λ receptor) egy éjszakán át növesztettünk rázatás mellett. A sejteket 0,9% NaCl oldattal mostuk, és 2 ml 0,01 mól/literes MgSO< oldatban szuszpendáltuk, majd 5 1 óra hosszat inkubáltuk. A szuszpenzióból hígításokat készítettünk (10°, 10¹, 10*²), és 0,1 ml-nyi hígított fág-oldatokat használtunk 0,2 ml éhező sejtszuszpenziő megfertőzésére.

A fertőző keverék 10°, 10^_1 és 10^-2 hígítása- 10 it szelektív lemezekre szélesztettük.

A plazmidok Tn 5-tel (Km^B) történő transzponálásához (a Tn 5 /_b 221 : : Tn 5 fág eredetű, amely a kapcsolás oldaláról törlést tartalmazott, igy nem volt képes lizoge- 15 nizálni), a fág szuszpenzióját alkalmaztuk az olyan sejtek fertőzésére, amelyek azokat a plazmidokat tartalmazták, amelyekre a transzponálást végre akartuk hajtani. A fertőzést a fentebb leírtak szerint hajtottuk végre és a kanamicin-rezisztens sejteket kiválasztottuk. Több ezer Km* telepet gyűjtöttünk össze, és ezek 10*^z hígításaiból 0,1 ml-t alkalmaztunk 100 ml LB tápközeg inokulálására. A tenyészetet egy éjszakán át növesztettük, és a plazmid DNS-t ebből a sejtkeverékből kinyertük és felhasználtuk E. coli K 12 törzs (CSH50) kanamicin rezisztenciára történő transzformálásához. (Az E. coli K12 CSH50 törzs beszerezhető a Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor New York, USA intézettől).

2. táblázat

Plazmidok és fágok

Plazmid/Fág	Forrós
PKN184	Nordstrom és munkatársai: Plasmid 4, 1980, 322. oldal
pSF 2124	So és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 142, 1975, 239-49. oldal
pJL 99	Light és Molin: Mól. Gén. Génét. 184, 1981, 56-61. oldal
pGA 46	An és Friesen: J. Bact. 140, 1979, 70-79 oldal
pKN 501	Molin és munkatársai: J. Bact. 138, 1979, 70-79. oldal
pF 1403-11	Az F plazmid alap-replikonból származó AluINae I fragmens pMC 1403 Sma I helyére történő beiktatásával előállítva (Casadaban és munkatársai: J. Bact 143, 1980, 971. oldal), ezáltal az F plazmid E génje és a pMC 1403 lac Z génje között egy fúziót alakítva ki.
pHP 34	Prentki és munkatársai: Gene 17, 1982, 189-96. oldal
pMC 903	Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971. oldal
pKN 1562	Molin és munkatársai: J. Bact. 138, 1979, 70-79. oldal
pVH 1424	Valentin-Hansen P. szerint állítva elő, egy pVH 17 plazmidból (Valentin-Hansen és munkatársai: EMBO J. 1982, 317) származó deo promotort hordozó Sau 3 A fragmens beiktatásával a PMC 1403 plazmid BamH I helyébe (Casadaban és munkatársai, fentebb idézett hely, 971. oldal)
pSKS 104	Casadaban M. szerint állítva elő, a pM 13 mp 7-ből (Messing és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 9, 1981, 309) származó lac promotort és transzlációs beinditó területet tartalmazó Pvu II fragmens beiktatásával a pMC 1403 Sma I helyére, amely műveletet homológ rekombináció követ a lac Z szegmensek között
pBR 322	Bolivár és munkatársai: Gene 2, 1977, 95. oldal
pMB 1	Betlock és munkatársai: Fed. Proc. 35, 1976, 2037-43. oldal
Jt b 221 : : Tn 5	Berg, D. E.: .transzponálható kanamicin rezisztenciát meghatározó Tn 5 beiktatása és kivágása* DNS Insertion Elements, Plasmids and Episomes (A.l.Bukhari és munkatársai szerkesztésében)
ED4.4	Dempsey és Willets: J. Bact. 126, 1976, 166. oldal

-1019

HU 201350 Β

1. példa

Τη 5 (KnFj beiktatása az Rl-ből származó EcoRl-A fragmensbe:

E. coli K 12 törzs (CSH50) sejtjeit amelyek a pKN 184 plazmidot foglalják magukban, vagyis azt a plazmidot, amely pSF 2124 plazmidból és az Rl plazmidból származó 19 kb hosszúságú EcoRl-A fragmensből (amely a pár A és pár B területeket tartalmazza, áll - az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint a^b 211 : : Tn 5 bakteriofág szuszpenziójával fertőztünk. A 200 Mg/ml kanamicint tartalmazó LA lemezeken kanamicin rezisztenciára történő szelekció után a telepeket összegyűjtöttük és öszszekevertük. A fenti keverék 1 hígításából 0,1 ml-t használtunk 100 ml LB tápközeg inokulálásához. A tenyészetet egy éjszakán át növesztettük, és a tenyészetből preparált plazmid DNS-t az E, coli K 12 törzs (CSH50, trnszformálására használtuk, 200 pg/ml kanamicint tartalmazó lemezeken kanamicin rezisztenciára szelektálva.

Ilyen módon egy pOUl plazmidot találtunk, amely a kanamicin-rezisztenciát közvetíti és amelynek van egy kb. 5 kb-nak (5000 bázispár) megfelelő fág-DNS beiktatása. A plazmid molekulatömege/mérete 34 kb, amelyet a plazmid DNS preparálásával és agaróz gélen történő analízisével mértünk, és fenotipusa a következő: Km®, Ap^E, Pár A*, Pár B*.

A pOUl-ből a plazmid DNS-t kipreparáltuk és a plazmidot restrikciós enzimekkel feltérképeztük a plazmid DNS tisztításával, restrikciós enzimekkel történő elhasitásával és a keletkezett fragmensek agaróz gél elektroforézissel történő analízisével (lásd 1. ábra). Ezen a módon a pKN 184 plazmid EcoRl-A fragmensébe beiktatott : : Tn 5 fragmenst aznositottuk mint a Km^R-t kódoló gén hordozóját, és a fragmens elhelyezkedését az 1. ábrában bemutatottak szerint meghatároztuk. A pOUl plazmidot további analízishez és plazmidkészítéséhez használtuk.

Az E. coli CSH50/pOUl törzset a Német Mikroorganizmusok Gyűjteményében (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebach strasse 8, D-3400 Göttingen), amely törzsgyűjteményt a továbbiakban DSM-nek fogunk rövidíteni, a 2712. számon helyeztük letétbe.

2. példa

Par+ fragmensek klónozásához alkalmazható plazmidok készítése:

A pJL 99 plazmid (Light és Molin: Mól. Gén. Génét. 184, 1981, 56-61. oldal) egy fúziót hordoz az Rl plazmidból származó rep A gén és a lac operon között; ez a plazmid egy Lac* fenotipust közvetít. A rep A-lac fúziót 12 hordozó Pst I - Sál I fragmenst kivágtuk a pJL 99-ből és beiktattuk a pGA46-ba, amely egy pl5 replikon (An és Friesen: J. Bact. 140, 1979, 400-407. oldal), ilyen módon alkot5 tűk meg a pJL 124 plazmidot. A plazmid térképét a 2. ábra mutatja be. A pJL 124 szintén közvetít egy Lac* fenotipust McConkey laktóz indikátor lemezeken, de úgy találtuk, hogy olyan DNS fragmens beiktatás, amely10 nek a pJL 124 Pst I helyén nincs vagy csak nagyon csekély promotor aktivitása van, a rep A promotor aktivitásával olyan módon interferál, hogy ezek a hibridek már nem mutatnak Lac*-t McConkey laktóz indikátorleme15 zeken. A sokkal érzékenyebb X-gal indikátorlemezeken azonban a transzformáns telepek Lac* típusúak, jelezve, hogy a β-galaktozidáz kifejeződése csökkent, de nem teljesen szorult vissza ezekben a hibridekben.

Ennél fogva a pJL 124-et a Pst 1 fragmeneek klónozására lehet használni, mivel a hibrid plazmidok könnyen kimutathatók McConkey laktóz indikátor lemezeken, mint Lac' transzformánsok. Sót, mivel a pJL 124 egy pl5 replikon, és igy nem stabil, amely könnyen kimutatható olyan sejtekként, amelyből a plazmid elveszett, igy színtelen telepeket képez laktóz indikátorlemezeken szelekciós kényszer nélkül, a pJL 124-et stabilizálni képes Pst I-et ki lehet válogatni X-gal lemezeken.

A Pst I-par* fragmensek izolálásának programja így a következő lépésekből áll:

1. ) A Pst I-el hasított pJL 124 Ö8szekapcso35 lása (ligációja) egy másik plazmidból származó Pst I fragmenssel.

2. ) Klóramfenikolt tartalmazó McConkey laktóz lemezeken transzformáció CSH 50-be.

3. ) A kiónok vizsgálata, amelyek Lac*-ként jelennek meg McConkey laktóz lemezeken, a

Lac* fenotípus stabil öröklődésére nézve X-gal indikátorlemezeken (lásd Anyagok és módszerek c. fejezet).

Az E. coli CSH 50/pJL 124 törzset a 2760 számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben.

3. példa pár A és pár B területekkel rendelkező nem stabil plazmidok stabilizálása

1.) Mini Rl-replikon pOU 71 plazmidot (DSM 2471) - ez a plazmid a pKN 1562 plazmid .megvaduló* replíkációs származéka, amely az Rl plazmid alap-replikonját, az ED A 4 fágból származó θθ .>(Pr promotort és cle57 represezor gént, a Tn 3 transzpozonból származó β-laktamázt kódoló gént és egy egyedi EcoRl helyet tartalmaz (a pOU 71 megalkotásának részletesebb leírása megtalálható a jelen találmány bejelentőinek a jelen bejelentéssel ósszefüg-1121

HU 201350 Β g& bejelentésében, amelynek címe: .Plazmidok feltételesen szabályozatlan replikációs viselkedéssel*, és amelyet ugyanaznap nyújtottak be, mint a jelen bejelentést) - EcoRl-el hasítottunk és a pOUl-ből származó Ecorl-A : : Tn 5 fragmenst (lásd 1. példa) iktattuk bele, ligáltuk, és E. coli CSH 50 törzsbe transzformáltuk, a kanamicin-rezisztens sejteket 50 Mg/ml kanamicint tartalmazó LA lemezeken szelektálva.

A transzformánsokat pOU 71 .megvaduló* replikációs fenotipusra 50 Mg/ml kanamicint tartalmazó LA lemezeken szélesztve és 42 °C hőmérsékleten inkubálva válogatjuk. Azok a sejtek, amelyek a .megvaduló* replikációs plazmidot tartalmazzák, abbahagyják a növekedést ilyen körülmények között. Ilyen módon a pOU 71-184 plazmidot azonosítottuk, amely 25,5 kb méretű és fenotipusa a következő: Pár A⁴, Pár B⁴, Ap^B, Km^B.

A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 3. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy az EcoRl-A : : Tn 5 fragmens korrektül beiktatódott a pOU 71 plazmid EcoRl helyére.

A plazmidot befogadó sejteket LA lemezeken 100 generáción keresztül, szelekciós kényszer nélkül növesztettük, vagyis nem olyan lemezeken növesztve, amely antibiotikumot tartalmaz; amikor az Anyagok és módszerek fejezetben leírt módszer szerint (II. megosztási vizsgálat) meghatároztuk, a sejtekből nem volt megfigyelhető a plazmid elvesztése, mig a pOU 71 a hasonló körülmények között nőtt sejtekből 1%/generáció gyakorisággal eltűnt, igy meghatározható tehát, hogy a pOU 71-184 stabilan öröklődik mintegy 10-®/sejt/generáció elvesztési gyakorisággal.

Az E. coli CSH 50/pOU 71-184 törzset 2763. számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben.

2.) pl5 replikon

A pJL 124 plazmidot (lásd 2. példa), amely Pár pl5 replikon, Pst I restrikciós enzimmel elhasitottuk és összekevertük pKN 184 plazmiddal (lásd 1. példa), amelyet előzőleg Pst I-el elhasitottunk, majd ligáltuk. A ligáit keveréket E. coli CSH 50 törzsbe transzformáltuk, 50 Mg/ml klóramfenikolt tartalmazó McConkey laktóz indikátor lemezen szelektálva klóramfenikol-rezisztenciára.

A pJL 124-et befogadó sejteket, amelyek egy vagy több Pst I fragmenst hordoznak (lásd 2. példa) a Lac⁴ fenotipus stabil öröklődésére vizsgáltuk X-gal lemezeken. A stabilan öröklődő plazmidok egyikéről úgy találtuk, hogy mind pár A, mind pár B területet tartalmaz. Ez a plazmid, a pOU2, 24 kb méretű és fenotipusa a kővetkező: Cm^B, Lac⁴, Pár A⁴, Pár B⁴.

A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 4. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy egy Pst I fragmens törölve van az EcoRl-A fragmensböl.

A plazmidot befogadó sejteket X-gal lemezeken 100 generáción át szelekciós kényszer nélkül növesztettük, és ilyen módon meghatároztuk, hogy a pOU2 stabilan öröklődik kevesebb, mint 10~⁶/sejt/generáció LP értékkel, ellentétben a pJL 124-el, amely 0,5-1%/sejt/generáció gyakorisággal eltűnik a sejtekből.

Az E. coli CSH 50/pOU2 törzset 2713. számmal helyeztük letétbe a DSM gyűjteményben.

3. ) pMBl replikon

A pF 1403-11 (lásd 2. táblázat) a pBR 322-nek (amely egy pMBl-replikon) egy nem stabilan Öröklődő származéka, amely egy F plazmidból származó gén és a lac operon közötti fúziót hordoz. A plazmid Ap^B, Lac⁴ fenotípust közvetít. Az EcoRl-A : : Tn 5 fragmenst, amely a pOU 1-plazmidból (1. példa) származik, beiktattuk a pF1403-ll plazmid egyetlen EcoRl helyére közvetlenül a génfúzióval ellentétes irányban, ligáltuk és az E. coli CSH 50 tőrzsbe transzformáltuk, 50 Mg ampicillint tartalmazó lemezeken Ap^re szelektálva, 50 Mg/ml kanamicint tartalmazó lemezeken Km^B-re szelektálva és McConkey indikátor lemezeken Lac⁴-ra szelektálva.

Az igy létrejött pOUlO plazmidot az 1. példa szerint leirt módszerrel restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 5. ábra), és az EcoRl-A : : Tn 5 fragmens beiktatását igazoltuk. A plazmid 34 kb méretű és fenotípusa a következő: Km⁸, Ap^B, Lac⁴, Pár A⁴, Pár B⁴.

A plazmidot a 3. példa 1. részében leirt módszerrel stabil öröklődésre megvizsgáltuk. Ilyen módon demonstráltuk, hogy a pOU 10 stabilan öröklődik kevesebb, mint lO^/sejt/generáció LF-értékkel, mig a pF 1403-11 6 · 10^_3/generáció gyakorisággal tűnik el a sejtből.

Az E. coli CSH 50/pOU10 törzset 2714 számmal helyeztük letétbe a DSM gyűjteményben.

4. példa

Az EcoRl-A fragmensböl származó Pst I fragmens klónozása, amely stabilizálja a pJL 124-et.

Az EcoRl-A fragmenst egy sor restrikciós enzimmai hasítottuk, és az így nyert fizikai térképet az 1. ábrán mutatjuk be. Amint látható, a fragmens több Pst I fragmensből tevődik össze. Abból a célból, hogy csökkentsük a Pár⁴ fenotípust közvetítő fragmens méretét, megkíséreltük szubklónozni a pJL124 átvizsgáló vektorban a pár területeket, amelyeket valószinüleg egy vagy több Pst I fragmens hordoz (lásd 2. példa). Több korrekt fenotipusú - vagyis Lac 13

-1223

HU 201350 Β

McConkey laktóz lemezen és stabil öröklődés szelekciós kényszer távollétében - klón elemzése azt mutatja, hogy a Pst I-D fragmens (lásd 1. ábra) közvetíti ezt a fenotipust. Más Pst I fragmens egyedül nem volt képes stabilizálni a pJL 124-et. A pJL 124 stabilizálásáért felelős területet, amely egy 1,8 kb-s Pst I fragmensen belül helyezkedik el, pár B-vel jelöljük.

Abból a célból, hogy tovább elemezzük a Pst I-D fragmenst, a fragmenst egy pBR 322 plazmid bla-génjében levő egyedüli Pst I helyre klónoztuk, amely a pOU 93-at eredményezi (lásd 7. ábra; a plazmidot 2724 számmal helyeztük letétbe a DSM törzsgyüjteményben). Ennek a plazmidnak a restrikciós térképezése azt mutatja, hogy a Pst I-D fragmens három Rsa I helyet tartalmaz (lásd

6. ábra). Az Rsa I tompa végeket alakít ki, ezért a 900 bp-s Rsa I fragmenst a következő módon iktattuk be a pHP34 plazmid (Prentki és munkatársai: Gene, 17, 1982, 189-96 oldal) Sma I helyére. pOU 93-at hasítottunk Rsa I-el, és összekevertük Sma I-el hasított pHP 34-el, majd ligáltuk. A ligációs keveréket olyan E. coli CSH 50 törzsbe transzformáltuk, amely már befogadott pOU 94 plazmidot (ez egy pl5 származék, amely fenotipusa szerint Lac* és Pár B*; lásd 8. ábra, ezt a plazmidot 2725 számmal helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben), ampicillin rezisztenciára szelektálva 50 üg/ml ampicillint tartalmazó lemezeken.

A különböző plazmidokban hordozott pár B* területek által kifejezett összeférhetetlenség következtében a pOU 94 elvész, amikor egy másik plazmidot, amely Pár B* fenotípusú, bevezetünk az E. coli sejtbe, így lehetővé válik, hogy a helyes beiktatásokra és transzformánsokra a sejteket McConkey lemezre szélesítve és kiválogatva a színtelen telepeket (Lac·) szelektáljunk. Az egyik ilyen összeférhetetlen pHP 34 plazmidszármazékot, amelyről azt találtuk, hogy tartalmazza a 900 bp-s Rsa I fragmenst, pOU 13-al jelöltük. A plazmid 5,3 kb méretű és fenotípusa a következő: Tc^B, Ap^B, Pár B*.

A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel föltérképeztük (9. ábra). A térképezés azt mutatja, hogy az Rsa I fragmens átalakult egy 900 pb-s EoRl fragmenssé, mivel a pHP34 Sma I helyét a két EcoRl hely szegélyezi.

Az E. coli CSH 50/pOU 13 törzset 2716 számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben.

A pOU13-ból származó 900 bp-s EcoRl fragmenst beiktattuk a pOUlOl EcoRl helyére, amely egy Ap^B, Cm^B .megvaduló' mini-Rl származék (a pOUlOl konstrukciójának részletes leírása megtalálható a bejelentőknek a jelen bejelentéssel összefüggő bejelentésében, amelynek címe: Plazmidok feltételesen szabályozatlan replikáciös viselkedéssel; és amelyet ugyanazon a napon nyújtottak be, 14 mint a jelen bejelentést) egy egyedi EcoRl hellyel a cat génben (ez a gén kódolja a Cm^B-t), igy alkottuk meg a pOU14 plazmidot, amely 8,2 kb méretű és fenotípusa a következő: Cm⁵, Ap^B, Pár B*.

A plazmidot az 1. példában leírt módszer szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 10. ábra).

A plazmidot stabil öröklődésre megvizsgáltuk a 3.1. példában leírtak szerint, igy demonstráltuk, hogy 30 °C hőmérsékleten a pOU14 stabilan öröklődik kisebb, mint 1 · • 10'⁴/sejt/generáció LF értékkel, ugyanakkor a pOUlOl 1%/generáció gyakorisággal elvesz a sejtekből.

Az E. coli CSH 50/pOU14 törzset 2717. számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben.

5. példa

Mini-Rl plazmidok stabilizálása pár B fragmenssel pOU 90 plazmidot - amely a pKN 1562 .megvaduló replikációs származéka, és amely az RÍ plazmid alapreplikonját, az ED(_4 fágból szórmazó^PH promotort és cle57 represszort, a β-laktamázt kódoló gént a Tn 3 transzpozonból, valamint a pKN184-böl származó EcoRl-A fragmenst tartalmazza, úgy állítottuk elő, hogy a pOU82-t (DSM 2482) EcoRl-gyal hasítottuk, és ezen a helyen a pKN184 vad típusú pár területét tartalmazó EcoRl-A fragmenst iktattuk bele, majd ligáltuk. A pOU90-t Sál I-el elhasítottunk, és ligáltunk a pOU61 plazmidot nyerve. A plazmidot E. coli CSH 50 törzsbe trnszformáltuk, McConkey lemezeken Lac' fenotípusra szelektálva.

A pOU61-et az 1. példában leírt módszerrel feltérképeztük (lásd 11. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy a pOU61 hordozza az Eco Rl-A fragmens jobboldali végét, amely a pár B területet tartalmazza. A plazmid mérete 10 kb és fenotípusa a következő: Pár B*, Ap^R, Lac.

A plazmidot a 3.1 példában leírtak szerint stabil öröklődésre vizsgáltuk. Azt találtuk, hogy a pOU61 stabilan öröklődik kevesebb, mint 1 · 10^_4/6ejt/generéció LF értékkel.

Az E. coli CSH 50/pOU61 törzset 2723 számmal helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben.

6. példa

A pF 1403-11 plazmid stabilizálása a pár B fragmenssel

A pOUl plazmidot (lásd 1. példa) Sál I-el hasítottuk, és összekevertük pF 1403-11 plazmiddal, amelyet előzőleg Sál I-el elhasi-1325

HU 201350 Β tottunk, majd ligáltuk, és E. coli CSH 50 törzsbe transzformáltuk ampicillin rezisztens telepekre szelektálva McConkey laktóz indikátorlemezeken. Néhányat ezek közül a Lac* kiónok közül a Lac* fenotipus stabil öröklő- 5 désére McConkey lemezeken átvizsgáltunk, ahogyan ezt az Anyagok és módszerek fejezetben leírtuk.

A stabilan Öröklődő plazmidokat az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimek- 10 kel feltérképeztük (lásd 12. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy ezek a pOUl-nek azt a Sál I fragmensét hordozzák, amelyen a pár B terület elhelyezkedik. A pF 1403-11-et és a pOUl-ből származó Sál I 15 fragmenst tartalmazó plazmidot pOU 12-nek neveztük. Ennek mérete 16 kb és fenotipusa a következő: Pár B*, Lac*, Ap^R. A pOU 12 stabilan öröklődik kevesebb, mint 5 · 10*⁵/sejt/generáció LF értékkel.

Az E. coli CSH 50/pOU12 törzset 2715 számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben.

7. példa

A pl5 plazmid stabilizálása pár A fragmenssel pMC 903 plazmidot (Casadaban és mun- 30 katársai: J. Bact. 143, 1980, 971. oldal) hasítottunk EcoRl-el, és a pOU43 plazmidból (13. ábra; 2720. DSM szám) származó, a pár A területet hordozó EcoRl fragmenst iktattuk bele, majd ligáltuk, és az E. coli CSH 50 törzs- 35 be transzformáltuk. Az így létrejött plazmidot pOU 45-nek jelöltük, ennek mérete

13,4 kb és fenotipusa a kővetkező: Pár A*, Lac', Ap^B, Km^R.

A plazmidot az 1. példában leírtak sze- 40 rint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 14. ábra). A restrikciós térképekből kitűnik, hogy a pár A terület beiktatódott a lac operonba, amely ez által inaktiválódott.

Amikor az Anyagok és módszerek feje- 45 zetben ismertetett módon stabilitásra vizsgáltunk, a plazmidot stabilan öröklődőnek találtuk 8 10**/sejt/generáció LF értékkel, míg a pMC 903 LF értéke 1%/sejt/generáció.

Az E. coli CSH 50/pOU45 törzset 2721 50 számmal helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben. ⁸

8. példa 55

Mini-Rl plazmid stabilizálása pár A területtel

A pOU43-ból származó EcoRl fragmenst beiktattuk a pOU82 mini-Rl plazmidba (DSM 60 száma 2482), amely tartalmazza az Rl plazmid alap-replikonját, az EdA4-fágból eredő u(Ph promotort és cl represszor gént, a β-laktamázt kódoló gént a Tn 3 transzpozonból, a pVH 1424-ból a deo-promotort és a lac Z gén 65 amino-terminális végét, továbbá a pSKS 104-ból a lac operon maradványát (a pOU82 konstrukciójának részletes leírása megtalálható a bejelentőknek a jelen bejelentéssel összefüggő bejelentésével, amelynek címe: Plazmidok feltételesen szabályozatlan replikációs viselkedéssel; és amelyet ugyanazon a napon nyújtottak be, mint a jelen bejelentést). A pOU82 plazmid hordozza az Ap^R és Lac* fenotípust és van egy egyedi EcoRl helye, amely használható ez EcoRl fragmensek klónozásához. Ez a plazmid lX/generáció frekvenciával vész el szelekciós kényszer távollétében.

A plazmidot, amelyben 2,4 kb-s EcoRl fragmenst iktattunk be azonos orientációban, pOU47-nek jelöltük. A plazmid mérete 14 kb és fenotipusa a következő: Pár A*, Lac*, Ap^R.

A pOU47-et az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 15. ábra).

Az E. coli CSH 50/pOU47 törzset 2722 számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyüjteményben.

A pár A területet hordozó EcoRl fragmenst tovább csökkentettük 400 bp-vel a Bal 31 exonukleáz segítségével; a törlést az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak alapján hajtottuk végre, pOU47 egyedüli BamHI helyét hasznosítva. Az igy megalkotott plazmidot pOU472-vel jelöltük. A plazmid 13 kb méretű és fenotipusa a következő: Pár A*, Lac*, Ap^R.

A pOU472-t az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (lásd 16. ábra). A restrikciós térképből kitűnik, hogy a pOU472 hordozza a Bal 31 delécíó által létrehozott 2,0 kb-s EcoRl fragmenst.

Amikor az Anyagok és módszerek fejezet szerint stabilitásra vizsgáltunk, a plazmidot stabilan öröklődőnek találtuk, amely azt jelenti, hogy a teljes pár A területet tartalmazza a 2,0 kb nagyságú EcoRl fragmens.

Az E. coli CSH 50/pOU472 törzset 2726. számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben.

9. példa pár A területet hordozó mini Rl plazmid létrehozása pOU 90 plazmidot (lásd 5. példa) BamHl-vel és részlegesen Sau 3A-val elhasitottuk, hogy kitöröltük az EcoRl-A fragmens egy részét, a nagyobb 6 kb-s rész visszamaradt, majd ligáltuk. Az így nyert pOU91 plazmidot E. coli CSH 50 törzsbe transzformáltuk. A pOU 91 mérete 18,75 kb, fenotipusa a következő: Pár*, Ap^R, Lac*. A plazmidot az 1. példában leírtak szerint restrikciós enzimekkel feltérképeztük (17. ábra).

-1427

HU 201350 Β

A plazmid stabilitását ügy határoztuk meg, hogy pOU 91-et tartalmazó sejteket (és kontrollként a pOU 82-t tartalmazó sejteket) McConkey lemezeken, szelekciós kényszer nélkül, 30 °C hőmérsékleten 25 generáción át növesztettünk; a pOU 91-el transzformált sejtek vörös telepeket képeznek (Lac*), míg a pOU 82-vel transzformált sejtek mind vörös, mind fehér telepeket képeznek, jelezve, hogy a szelekciómentes periódus során a pOU 82 elveszett jónéhány sejtből.

Az E. coli CSH/pOU91 törzset 2483. számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben.

10. példa pár A*, pár B* mini-fii plazmid megalkotása pOU 82 plazmidot (8. példa) hasítottunk EcoRl-el, és a pOU43-ból (lásd 7. példa és

13. ábra) származó, a pár A területet hordozó EcoRl fragmenst iktattuk bele. Ebből az EcoRl fragmensből töröltünk legalább 500 bázispárt, beleértve egy EcoRl helyet is, Bal 31 exonukleáz segítségével. A plazmid egyedüli EcoRl helyére a pOU13-ból (lásd 4. példa és 9. ábra) származó EcoRl fragmenst iktattuk be. A keletkezett plazmid, amely egy Pár A*, Pár B* fenotípust hordoz, ezután transzformálható olyan E. coli CSH 50 törzsbe, amely már pOU94-et hordoz, és kiválogatható lényegileg ugyanolyan módszerrel, mint a 4. példában, azzal a különbséggel, hogy a pOU82 származék gyenge Lac* fenotipust közvetít, ami azt jelenti, hogy az ezt a plazmidot befogadó sejtek telepei csak a középen lesznek vörösek és a szélén színtelenek, amikor McConkey laktóz-indikátor lemezeken nőnek.

11. példa pár A+, pár B+ mini-Rl-plazmid létrehozása pOU61 plazmidot (lásd 5. példa) hasítottunk EcoRl-el, és a pár A területet hordozó pOU43-ból eredő EcoRl fragmenst iktattuk bele, majd ligáltuk. Az így nyert plazmidot, amely Pár A*, Pár B* fenotípust közvetít, lehet azután transzformálni E. coli CSH 50 törzsbe, amely már hordoz pOU2 plazmidot, és ilyen módon lehet válogatni a 4. példában leírt módszer szerint. A kívánt plazmidot befogadó sejtek telepei színtelen telepekként (Lac*) mutatkoznak McConkey laktóz lemezeken.

Megjegyzés. A jelen leírásban és igénypontokban, ahol külön nem jelezzük a pár, Pár*, pár* vagy Pár⁴ jeleket, a pár és Pár kifejezés a megosztási funkció kifejeződését jelenti.

Claims (24)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás örökletesen instabil plazmidok stabilizálására, azzal jellemezve, hogy a stabilizálandó plazmidba egy olyan DNS fragmentumot iktatunk be, amely magában foglalja az Rl plazmid EcoRl-Α fragmentumát vagy annak egy rövidebb fragmentumát, amely egy Rl pár területet tartalmaz. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Rl pár A területet, Rl pár B területet vagy Rl pár A és Rl pár B területet tartalmazó DNS fragmentumot alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan, Rl pár A és Rl pár B területet tartalmazó DNS fragmentumot alkalmazunk, amelynek hossza legfeljebb 6 kb, előnyösen legfeljebb 4 kb, különösen legfeljebb 3 kb. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan, Rl pár A területet tartalmazó DNS fragmentumot alkalmazunk, amelynek hossza legfeljebb 4 kb, előnyösen legfeljebb 2,5 kb, különösen legfeljebb 1 kb, (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
5. 5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Rl pár B területet tartalmazó DNS fragmentumot alkalmazunk, amelynek hossza legfeljebb 2 kb, előnyösen legfeljebb 1,5 kb, különösen legfeljebb 1 kb. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmádként pl5 plazmidot vagy egy származékát vagy egy nagy kópiaszámú, széles gazdaszervezet tartományú plazmidot vagy annak származékát alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmádként pMBl plazmidot vagy annak származékét, előnyösen pBR322 plazmidot vagy annak származékát alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmádként IncPII összeférhetetlenségi csoportba tartozó plazmidokat, beleértve az Rl-et és származékait, F plazmidot vagy származékait vagy kis kópiaszámú, széles gazdaszervezet tartományú plazmidokat vagy származékaikat használjuk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmádként egy vagy több, a plazmiddal természet szerint nem-rokon gént tartalmazó plazmidot alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
10. 10. Eljárás pOUl, pOU71-184, pOU2, pOUlO, pOU13, pOU14, pOU61, pOU12, pOU45, pOU47 és pOU472 stabilizált plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy a, pOUl plazmid előállítására pKN184 plazmidot tartalmazó E. coli sejteket b211 : : Tn5 bakteriofág szuszpenzióval fertőzünk, és

    -1529

    HU 201350 Β a kanamicin rezisztenciát (Km^B) és ParA*, ParB* fenotipuet közvetítő plazmidokat kiválasztjuk,

    b) pOU71-184 plazmid előállítására pOU71 plazmidot EcoRl enzimmel kezelünk, a pOUl EcoRl-A : : Tn5 fragmensét beiktatjuk, majd ligálás után E. coliba transzformáljuk, és a Km^t és ParA*, ParB* fenotípust közvetítő plazmidokat kiválasztjuk,

    c) pOU2 plazmid előállítására pJL124 plazmidot PstI enzimmel kezelünk, PstI enzimmel részlegesen emésztett pKN184 plazmáddal keverjük, ligáljuk és E. coliba transzformáljuk, és a ParA*, ParB* fenotípust közvetítő plazmidokat kiválasztjuk,

    d) pOUlO plazmid előállítására a pOUl plazmid EcoRl-A : : Tn5 fragmensét pF1403-11 plazmid EcoRl helyére iktatjuk be, majd E. coliba transzformáljuk, és a ParA*, ParB* fenotípust közvetítő plazmidokat kiválasztjuk,

    e) pOU13 plazmid elóállitására EcoRl-A fragmentum Petl-D fragmentumát pBR322 PstI helyére iktatjuk be, a kapott pOU93 plazmidot Rsal enzimmel kezeljük, az Rsal fragmentumot, amely a parB területet hordozza, a pHP34 plazmid Smal helyére beiktatjuk, majd E. coliba transzformáljuk, és a ParB* fenotípust közvetítő plazmidokat kiválasztjuk,

    f) pOU14 plazmid előállítására pOU13 plazmidot EcoRl enzimmel kezelünk, a pOU13 plazmid EcoRl fragmentumát, amely a parB területet hordozza, pOUlOl plazmid EcoRl helyére iktatjuk be, majd E. coliba transzformáljuk és a ParB* fenotípust közvetítő plazmidokat kiválasztjuk,

    g) pOU61 plazmid előállítására pKN184 plazmid EcoRl-A fragmentumát pOU90 plazmádba iktatjuk be, Sall-gyel kezeljük, ligáljuk, és a ParB* fenotípust közvetítő plazmidokat kiválasztjuk,

    h) pOU13 plazmid előállítására pOUl plazmidot Sall-gyel kezelünk, Sall-gyel kezelt pF1403-ll plazmiddal keverjük, ligáljuk, és E. coliba transzformáljuk, és a ParB* fenotípust közvetítő plazmidokat kiválasztjuk,

    i) pOU45 plazmid előállítására pMC903 plazmidot EcoRl-gyel kezelünk, pOU43 plazmid EcoRl fragmentumát, amely a parA területet hordozza, iktatjuk be, ligáljuk és E. coliba transzformáljuk, majd a ParA* fenotípust közvetítő plazmidokat kiválasztjuk,

    j) pOU47 plazmid előállítására pOU43 EcoRl fragmentumát pOU82 plazmid EcoRl helyére iktatjuk be, E. coliba transzformáljuk és a ParA* fenotípust közvetítő plazmidokat kiválasztjuk,

    k) pOU472 plazmid elóállitására pOU47 EcoRl fragmentumát, amely a parA területet hordozza, 400 bp-vel csökkentjük Bal31 exonukleáz segítségével, E. coliba transzformáljuk és a ParA* fenotípust közvetítő plazmidokat kiválasztjuk. (Elsőbbsége: 1983. 09. 09.)
11. 11. Eljárás pOU91 stabilizált plazmid elóállitására, azzal jellemezve, hogy pOU90 plazmidot BamHI-gyel és részlegesen Sau3A-val hasítjuk, ligáljuk és E. coliba transzformáljuk és a ParA* fenotípust közvetítő plazmidokat kiválasztjuk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 24.)
12. 12 Eljárás stabilizált plazmidot befogadó Gram-negativ baktériumok elóállitására, azzal jellemezve, hogy valamely Gram-negativ baktérium törzsbe valamely, az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti módon előállított plazmidot transzformálunk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
13. 13. Eljárás stabilizált plazmidot befogadó Gram-negativ baktérium előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely Gram-negativ baktérium törzsbe valamely, a 10. igénypont szerinti módon előállított plazmidot transzformálunk. (Elsőbbsége: 1983. 09. 09.)
14. 14. Eljárás stabilizált plazmidot befogadó Gram-negativ baktérium előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely Gram-negativ baktérium törzsbe egy, a 11. igénypont szerinti módon előállított plazmidot transzformálunk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 24.)
15. 15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Gram-negativ baktériumként E. coli törzset alkamazunk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
16. 16. Eljárás plazmid DNS géntermékének előállítására, azzal jellemezve, hogy egy az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított plazmidba egy vagy több, a plazmiddal természetes módon nem kapcsolatos gént iktatunk be, az ezt a plazmidot tartalmazó Gram-negativ baktériumot tenyésztjük, és kívánt esetben a génterméket kinyerjük. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
17. 17. Eljárás plazmid DNS géntermék előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 10. igénypont szerinti eljárással előállított plazmidba egy vagy több, a plazmiddal természetes módon nem kapcsolatos gént iktatunk be, az ezt a plazmidot tartalmazó Gram-negativ baktériumot tenyésztjük, és kívánt esetben a génterméket kinyerjük. (Elsőbbsége: 1983. 09. 09.)
18. 18. Eljárás plazmid DNS géntermék előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 11. igénypont szerinti eljárással előállított plazmidba egy vagy több, a plazmiddal természetes módon nem kapcsolatos gént iktatunk be, az ezt a plazmidot tartalmazó Gram-negativ baktériumot tenyésztjük, és kívánt esetben a génterméket kinyerjük. (Elsőbbsége: 1982. 09. 24.)
19. 19. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést legalább 100 baktériumgeneráción át folytatjuk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
20. 20. Eljárás egy pár terület egy plazmidba történő korrekt beiktatásának szelektálására, azzal jellemezve, hogy egy feltételezetten beiktatott pár területet hordozó plazmidot olyan baktériumba transzformálunk, amely egy másik, nem-rokon, azonos pár te17

    -1631

    HU 201350 Β rületet, valamint egy megfelelő tápkózegben felismerhető fenotipust közvetítő plazmidot hordoz, a transzformált baktériumot ezen a megfelelő tápközegen növesztjük, és a pár terület korrekt beiktatását ennek a fenoti- 5 pusnak az elvesztésével azonosítjuk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy felismerhető fenotipusként egy antibiotikum rezisztenciát alkalma- 10 zunk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
22. 22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy felismerhető fenotipusként Lac*-t alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1982.

    09. 16.) 15
23. 23. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett másik plazmidon levő pár területként pár A területet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)
24. 24. A 20. igénypont szerinti eljárás, az- 20 zal jellemezve, hogy az említett másik plazmidon levő pár területként parB területet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1982. 09. 16.)