NO172350B - Plasmidstabilisering - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører et plasmid som replikerer i gram-negative bakterier, og stabilisering av plasmider som er nyttige på området rekombinant-DNA-teknologi for fremstilling av gener . og deres produkter.

Den fortsatte opprettholdelse av de fleste naturlige plasmider, selv i fravær av seleksjonstrykk (faktorer som sikrer vekst av bare de organismer som huser plasmidene; et eksempel på slike er et antibiotikum i næringsmediet i tilfellet av et plasmid som bærer et gen som formidler resistens til antibio-tikumet) , antyder at plasmidopprettholdelsesfunksjoner er blitt utviklet for å sikre det fortsatte nærvær av disse ekstrakromosomale elementer med høy effektivitet. Plasmidopprettholdelses-funksjonene består primært av replikeringsgenene inklusive deres kontrollkretser som regulerer plasmidkonsentrasjonen i cellen.

I voksende celler overvåker replikeringskontrollsystemet antall plasmidkopier og korrigerer avvik fra gjennomsnittet ved å øke eller nedsette sannsynligheten for plasmidreplikering. Imidler-tid kan intet replikeringskontrollsystem forhindre forekomst av celler med svært få eller bare én kopi av plasmidet, og fra slike celler er muligheten for dannelse av en plasmidfri dattercel-le innlysende. Dette problem er naturligvis størst for plasmider med lavt kopitall. Videre vil en passiv fordeling av plasmidmolekyler ved celledeling uunngåelig resultere i en viss frekvens av plasmidfrie celler. Siden tapet av et plasmidmolekyl fra en celle er irreversibelt, vil konsekvensene av en slik ustabil situasjon være at hele populasjonen til slutt blir plasmidfri.

Ved siden av en vilkårlig fordeling av plasmider ved celledeling kan andre faktorer influere på tapsraten fra en kultur av celler som dyrkes i fravær av seleksjon for opprettholdelse av plasmidet. Eksempelvis krever noen plasmider et spesifikt rekombinasjonssystem for oppløsning av to nylig replikerte molekyler (Austin et al., Cell 25, 1981, ss. 729-36). I fravær av oppløsning vil det danne seg multimerer (låst inn i hverandre) , og på denne måte kan selv et plasmid med høyt kopitall frem-tre som et plasmid med lavt kopitall ved fordelingsnivået til datterceller, siden sannsynligheten for å utvikle plasmidfrie celler vil øke med økende antall plasmidmolekyler som er låst inn i hverandre i multimere strukturer. Et annet fenomen som ofte observeres i rekombinant-DNA-teknologi er omdannelse av en stabil kloningsvektor til et ustabilt hybridplasmid som et re-sultat av innsettelse av et DNA-fragment, hvis nærvær enten for-årsaker nedsettelse i plasmidkopitall eller foranlediger et skadelig produkt som interfererer negativt med cellevekst.

I alle slike tilfeller inntreffer plasmid-segregering og -tap med en frekvens (høy eller lav) som ikke lett kan kontrol-leres utenfra.

Stabiliteten til naturlige plasmider, og spesielt til plasmider med lavt kopitall, antyder at i tillegg til replikeringskontrollsystemet eksisterer det et annet sett av opprettholdel-sesfunksjoner som tar aktivt del i en ordnet fordeling av plas-midmolekylene ved celledeling. Slike funksjoner er blitt betegnet fordelingsfunksjoner, og studier, f.eks. Meacock et al.; Cell 20, 1980, ss. 529-42, NordstrSm et al.> Plasmid 4, 1980, ss. 332-49, Seelke et al., Plasmid 7, 1982, ss. 163-79, har nå vist at disse i det minste delvis kodes for av plasmidene selv (i par-regioner). Således har visse plasmid-delesjonsmutanter mistet sin stabile opprettholdelse eller arv til tross for sin normale vill-type-replikeringsoppførsel, hvilket indikerer at en plasmid-spesifisert funksjonssikrende stabilitet er blitt fjernet (kfr.Nordstrom et al., op. eit.).

Da mange av de plasmider som anvendes som vektorer i rekombinant-DNA-teknologi er blitt fratatt en stor mengde DNA sammenlignet med vill-typeopphavsplasmidet, er de utsatt for å bli ustabilt nedarvet. Dette stiller et alvorlig problem siden ustabilitet hos et plasmid til slutt vil resultere i fullstendig tap av plasmidet fra cellene, og vil i ethvert tilfelle redusere det relative utbytte av plasmid-kodede genprodukter. Dette problem er spesielt uttalt i produksjon i stor skala av genprodukter hvor vekst av mikroorganismer under seleksjonstrykk, f. eks. et antibiotikum, normalt ikke er gjørlig og ofte i det minste uønsket fra et miljøsynspunkt, og hvor mikroorganismene dyrkes i et stort antall generasjoner. Vektorer som bare er til stede i noen få kopier pr. celle vil høyst sannsynlig bli ustabilt nedarvet og derfor gå tapt fra cellene. Selv plasmider som ordinært har et relativt høyt kopitall som sikrer en rela-tiv stabilitet hos plasmidet har vært kjent for å bli ustabile når DNA-fragmenter som bærer gener som ikke er naturlig relatert til plasmidet innsettes deri.

Foreliggende oppfinnelse vedrører plasmider som bærer et innsatt gen eller innsatte gener som ikke naturlig er relatert til plasmidet og som i tillegg bærer et innsatt DNA-fragment som øver en fordelende funksjon. Betegnelsen "innsatt" skal be-ty at genet eller genene eller DNA-fragmentet er blitt innført i plasmidet ved ett stadium under konstruksjonen av det endelige plasmid. Det henvises i denne forbindelse til krav 1.

I foreliggende sammenheng betegner uttrykket "en fordelende funksjon" en funksjon som sikrer en ordnet fordeling av plasmidets molekyler ved celledeling og som kodes for av en region i et plasmid som, avhengig av den type av plasmid som uttrykker funksjonen, kan omfatte et eller flere gener. Som omtalt ovenfor, finnes slike regioner i naturlig forekommende, eller vild-type-, plasmider, men plasmider som uttrykker en Par<+->fenotype, dvs. på hvilken de fordelende gener er til stede, og som også bærer et eller flere innsatte gener som ikke naturlig er relatert til plasmidet, menes å være nye. I denne sammenheng defineres plasmider som naturlig forekommende ekstrakromosomale elementer i mikroorganismer, nemlig elementer som det er mulig å isolere som sådanne, eller derivater derav.

Plasmidene i henhold til oppfinnelsen kan anvendes som klonings- eller produksjonsvektorer på området rekombinant-DNA-teknologi for det formål å oppnå et stort utvalg av produkter for tekniske eller medisinske formål direkte eller indirek-te formidlet av det eller de innsatte gener, spesielt polypepti-der og proteiner eller fragmenter derav, enzymer, samt et antall ikke-proteinholdige produkter av reaksjoner med enzymer, produkter med lav molekylvekt, f.eks. hormoner, samt nukleinsyrer; produkter av eukaryotiske, spesielt pattedyr-, gener er av spesiell interesse.

I overensstemmelse med en foretrukken utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er fordelingsfunksjonen en som, av natur, uttrykkes av en region av vill-typeresistensplasmidet RI, og derfor i det følgende referert til som en Rl- par-region♦

I forbindelse med oppfinnelsen er en slik region blitt funnet å forårsake delvis eller full stabilitet hos ikke bare ustabile Rl-miniplasmider som bærer et eller flere gen som ikke naturlig er relatert til plasmidet, men også hos hyppig segre-gerende plasmider som ikke er relatert til plasmid Ri som bærer et eller flere gen som ikke naturlig er relatert til plasmidet. Et annet eksempel på en spesielt verdifull fordelingsfunksjon er den som finnes på vild-typeplasmidet F (Seelke et al.> op.eit.) som også medfører en høy grad av stabilitet til resipientplasmidet. I det følgende vil det primært bli henvist til Ri Par-funks jonen, selv om det må forstås at mange av de fenomener som er assosiert med Ri Par-funksjonen også vil ha anvendelse på andre Par-funksjoner, og at den generelle idé ved foreliggende oppfinnelse i sitt brede omfang ikke er begrenset til Ri Par-funks jonen.

Det er tidligere blitt indikert at fordelingsfunksjonen til plasmid Ri øves av det såkalte EcoRl-A-fragment (kfr. Nord-str6m et al., Plasmid 4, 1980, ss. 332-49). Under forskningens forløp som førte til foreliggende oppfinnelse er det overraskende funnet at det EcoRjhA-fragment som har en lengde på ca. 19 kb (19 000 basepar) omfatter to, og bare to, distinkte regioner som medfører en Par<+->fenotype til resipientplasmidet. Disse regioner er beliggende i hver ende av EcoRl-A-fragmentet og ingen annen DNA-sekvens i EcoRl-A-fragmentet er for tiden antatt å ha noen plasmidstabiliserende funksjon. For de her omtalte formål er de to regioner blitt betegnet henholdsvis par-region A og par-region B, forkortet som henholdsvis parA og parB.

Da det er fordelaktig å operere med så små DNA-fragmenter som mulig, fordi små fragmenter er lettere å innsette i plasmidet og de resulterende plasmider er lettere å transformere til vertsceller, vedrører ett aspekt av foreliggende oppfinnelse plasmider som bærer et innsatt DNA-fragment som er kortere enn EcoRl-fragmentet i plasmid Ri og inneholder en Ri par-region. Dette innsatte DNA-fragment omfatter normalt, som sin hovedkom-ponent, Ri par-region A-region, Ri par-region B-region eller både Ri par-region A og Ri par-region B. Dette betyr at vesentlig alt DNA-fragment som er innsatt i vertsplasmidet utgjøres av en av eller begge par-regionene, og resten av DNA på fragmentene er til stede primært for å tilveiebringe egnede restrik-sjonsseter, hvilket forsyner DNA-fragmentene med de ønskede ender som er lett kompatible med et tilsvarende eller kompatibelt restriksjonssete på resipientplasmidet. Slike ender kan også tilveiebringes ved hjelp av koblere. Det er imidlertid viktig å huske på at det DNA-fragment som omfatter par-region A og det DNA-fragment som omfatter par-region B.kan innføres separat og sekvensielt i det samme plasmid som så vil være fenotypisk iden-tisk med et plasmid i hvilket fenotypen ParA<+>f ParB<+> er blitt etablert ved innsettelse av par-region A og par-region B på det samme DNA-fragment. Hvis det f.eks. er ønskelig ytterligere å stabilisere et plasmid som allerede bærer en par-region, f .eks. p_arB-regionen, kan plasmidet bli avgrenset med et passende re-striks jonsenzym og et DNA-fragment som har ender som er forlikelige med dette restriksjonssete og som bærer den annen par-region, f.eks. parA-regionen, kan så bli innsatt. Den omvendte pro-sess, dvs. innsettelse, på lignende måte, av en parB-region på et plasmid som allerede bærer en parA-region, kan også anvendes.

I overensstemmelse med dette er interessante plasmider slike hvor det innsatte DNA-fragment som omfatter Ri par-region A og Ri par-region B har en lengde som ikke overstiger ca. 6 kb, spesielt ikke over ca. 4 kb, mer spesielt ikke over 3 kb. Når det innsatte DNA-fragment inkluderer Ri par-region A, vil det normalt ha en lengde som ikke overstiger ca. 4 kb > spesielt ik-ke over 2,5 kb, mer spesielt ikke over ca, 2 kb. Når det innsatte DNA-fragment omfatter Ri par-region B, vil det normalt ha en lengde som ikke overstiger ca. 2 kb, spesielt ikke over ca.

1,5 kb, mer spesielt ikke over ca. 1 kb. Preferansen for små DNA-fragmenter av de grunner som er angitt ovenfor bør imidlertid ikke utelukke den mulighet å oppnå plasmidstabilitet ved å innsette hele EcoRl-A-fragmentet; dette kan f.eks. være aksepta-belt hvis størrelsen på plasmidet som skal stabiliseres er mindre kritisk. Hvis fragmentet innsettes i sin helhet, kan det

være fordelaktig for klassifiseringsformål å forsyne DNA-fragmentet med et gen som formidler antibiotisk resistens. Hvis imidlertid av en eller annen grunn det er ønskelig å redusere størrelsen på EcoRl-A-fragmentet, kan dette gjøres på forskjellige måter, f.eks. ved partiell restriksjon av EcoRl-A-fragmentet med restriksjon-enzymet Pstl, eller ved å kutte ut hver

RI par-region fra det store fragment, og overføre hver region sekvensielt til det samme DNA-fragment som så kan innsettes i det plasmid som skal stabiliseres.

De plasmider som stabiliseres i overensstemmelse med prin-sippene ved foreliggende oppfinnelse kan enten være plasmider som har en naturlig forbindelse med den fordelende region som innsettes, f.eks. Rl-miniplasmider som stabiliseres ved hjelp av en innsatt RI par-region (Rl-miniplasmider er fjernet for meget av det opprinnelige Ri-DNA og inneholder følgelig vanligvis ikke i seg selv en RI pareregion), eller de kan være plasmider som ikke har noe naturlig forhold til den fordelende funksjon. Det er interessant å merke seg at effektive fordelingsfunksjoner som er nyttige i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse er i stand til å sikre en tilfredsstillende stabilitet ikke bare for plasmider som de naturlig er relatert til, så som når det gjelder stabilisering av Rl-miniplasmider med en Ri par-region, men også hos plasmider som fordelingsfunksjonen ikke er naturlig relatert til. Et eksempel på sistnevnte er innset-telsen av en Ri par-region i et ikke-Rl plasmid, f.eks. et pMBl-plasmid eller et derivat derav, f.eks. et pBR322-plasmid eller et derivat derav (disse plasmider er vanligvis stabile, men er tilbøyelige til å bli ustabile når et eller flere gener som naturlig ikke er relatert til plasmidet, innsettes). Et annet eksempel er anvendelse av en Ri par-region for stabilisering av visse plasmid-typer som, i det minste i ett stadium under dyrkningen av bakterier som huser plasmider, har et lavt kopitall, f.eks. et kopitall på 0,5-5 kopier pr. celle, f.eks. plasmider med bredt vertsområde og lavt kopitall (plasmider som har evne til å replikere i mange forskjellige vertsstammer eller -arter; denne klasse inkluderer de såkalte "shuttle"-vektorer som har evne til å replikere i to eller flere typer av mikroorganismen) og derivater derav, f.eks. RK2. Bortsett fra RI inkluderer andre plasmider fra inkompatibilitetsgruppen IncFII som krever stabilisering f.eks. R100 og R6. Anvendelse av en Ri par-region for stabilisering av ustabile plasmid-F-derivater ligger også innen rammen for foreliggende oppfinnelse.

En type av plasmider for hvilke en stabilisering

ved hjelp av foreliggende oppfinnelse er viktig, er kondi-sjonelle "runaway"-replikeringsplasmider, dvs. plasmider som, når vertsmikroorganismer som huser plasmidene dyrkes under visse betingelser, har et konstant lavt plasmidkopitall, og som, når mikroorganismene som huser plasmidet dyrkes under visse forskjellige betingelser, taper sin replikeringskontroll slik at plasmidkopitallet øker eksponensielt inntil vertscellen opphører å vokse. "Runaway"-replikeringsplasmider for hvilke en slik stabilisering er spesielt vital, er "run-away"-replikeringsplasmider med et kopitall som ikke overstiger ca. 3-5 kopier pr. celle, og spesielt slike plasmider hvis kopitall ikke overstiger ca. 0,5-1 kopi pr. celle (tallet 0,5 skal forstås å bety at frekvensen av replikering er mindre enn én pr. cellesyklus) når de mikroorganismer som huser plasmidene dyrkes under disse betingelser som sikrer et slikt lavt plasmidkopitall og som, når vertsmikroorganismene dyrkes under visse forskjellige betingelser sikrer et vesentlig økt plasmidkopitall, har et kopitall i området minst ca. 500-1000 kopier pr. celle.

Det lave plasmidkopitall er under visse betingelser (typisk en lav temperatur, f.eks. ca. 30°C) ønskelig når plasmider anvendes som vektorer for innsettelse av fremmede gener som koder for produkter som er delvis toksiske eller letale for vertscellen, slik som på grunn av den lave replikeringsrate hos plasmidet ved f.eks. en lav temperatur, blir genene bare uttrykt i små mengder, om i det hele tatt, slik at cellene forblir uskadet i utbredelsesstadiet til kulturen. Imidlertid resulterer, i plasmider med et så ekstremt lavt kopitall som det som er angitt ovenfor under utbredelsesstadiumbetingelser, så som voksende celler ved lav temperatur, tapet av en par-region i tap av et plasmid fra den mikrobielle populasjon med en frekvens på ca. 1 % pr. generasjon for plasmider med et kopitall som ikke overstiger 3-5 kopier pr. celle når disse dyrkes under betingelser som sikrer et så lavt kopitall. Tapsfrekvensen for plasmider med et kopitall som ikke overstiger ca. 0,5-1 kopi pr. celle er ca. 5%/celle/generasjon. Det er innlysende at uten noen fordelingsfunksjon for å stabilisere dem ville plasmidene gå tapt fra cellene før cellene hadde nådd en slik densitet i næringsmediet at det ville være økonomisk å indusere <n>runaway<n->replikering; dette er spesielt tilfelle ved produksjon i stor skala som krever mange hundre generasjoner med cellevekst for å nå produksjons-størrelseskultur.

En slik "runaway"-replikering kan gjøres kondisjonelt ved innsettelse av en regulerbar promoter oppstrøms for det eller de native replikeringskontrollgener i plasmidet (en detaljert beskrivelse av dette fenomen finnes i vår samtidige søknad nr. 84.1935. Plasmider som har en <M>runaway"-replikerings-oppførsel kan være av mange forskjellige typer, men foretrukne "runaway"-replikeringsplasmider er plasmider av Rl-type.

I foreliggende beskrivelse skal betegnelsen "stabilitet"

(og beslektede termer) menes en tapsfrekvens for plasmidet fra vertscellen på mindre enn 2 x 10 -4 pr. celle pr. generasjon.

Det er faktisk mulig å oppnå plasmider som er så stabile som vild-typeplasmider, dvs. med en tapsfrekvens på mindre enn 3 x 10 ^ pr. celle pr. generasjon, hvilket tilsvarer nivået for mutasjonsrate for gener, ved inkorporering av en Par-funksjon i plasmidet. Sistnevnte tapsfrekvens's (LF) verdi er innlysende når plasmider stabiliseres av både Ri par-region A og Ri par-region B, f.eks. som når hele EcoRl-A-fragmentet er blitt innsatt i plasmidene.

Som nevnt ovenfor, er imidlertid Par<+->fenotypen av plasmid RI, blitt lokalisert til hver separat par-region på EcoRl-A-fragmentet.

Det er funnet at hver av disse par-regioner utøver en stabiliserende effekt på ustabile plasmider, hvilket kan defineres som et plasmid som mangler en stabiliserende, eller fordelende, funksjon. Slike plasmider som fenotypisk er Par går vanligvis tapt fra vertscellen med høyere eller lavere frekvens; således går f.eks. plasmid Rl-derivater som er fjernet fra par-regionen, tapt fra vertscellen med en frekvens på ca. 1,5 x 10 -2 pr. celle pr. generasjon. Likeledes går plasmid pl5-derivater, som er Par — tapt med en frekvens på ca. 1 x 10 —2/celle/generasjon, og noen plasmid pMBl (pBR322)-derivater (f.eks. det som er beskrevet i eksempel 3.3) kan gå tapt med en frekvens på ca. 6 x 10 ^ I celle/generasjon. Motsatt har Rl-plasmider som er stabilisert med enten parA eller parB alene en LF-verdi på ca. 10 -4 pr. celle pr. generasjon, tilsvarende en 100 gangers stabilisering når et DNA-fragment som bærer en av disse par-regioner innsettes i en ustabil vektor; tallene for et tilsvarende pl5-derivat er

-4 -6

ca. 8 x 10 (Par A+) , 1 x 10 (Par B+), og tallene for et tilsvarende pMBl-derivat er 5 x 10~<5> (Par B+). Plasmider som bærer både par A- og par B-regionen har en LF-verdi på tilnærmet 10 <6> pr. celle pr. generasjon, eller en 10<4> gangers stabilisering. For lett henvisning er resultatene for stabiliserte og ustabile replikoner fra forskjellig opprinnelse vist i tabell 1. Dette indikerer at hver par-region virker uavhengig av den annen, at p_ar-r eg ionene er tilnærmet like effektive med hensyn til å stabilisere minst Ri- og pl5-plasmider og at deres virkning eller effekt er kumulativ. Dette funn kan benyttes ved bestemmelse av den grad som et ustabilt plasmid trenger å bli stabilisert til. Hvis en mindre drastisk stabilisering kreves, dvs. hvis det anslås at plasmidet som skal stabiliseres ikke er overdrevent ustabilt (med en LF-verdi på mindre enn 10 -2/celle/generasjon), kan det være tilstrekkelig å innsette et DNA-fragment som inneholder én av par-regionene i den hensikt å oppnå tilfredsstillende stabilitet, dvs. å forhindre et gradvis tap av plasmidet fra en populasjonsproduksjon i stor skala av bakterier over flere hundre generasjoner. På den annen side, hvis plasmidet er svært ustabilt (med en LF-verdi på

-2 mer enn 10 ), kan det være nødvendig eller i det minste fordelaktig å innsette begge par-regioner i den hensikt å sikre eks-trem stabilitet hos plasmidene.

Disse målbare LF-verdier kan benyttes når plasmider av hvilke som helst av de typer som er definert ovenfor skal anvendes som vektorer ved produksjon av genprodukter, og bør - - således inneholde minst ett gen som ikke har et naturlig forhold til plasmidet. Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er således - i henhold til krav 12 - en fremgangsmåte for fremstilling av et gen-produkt av plasmid-DNA hvor bakterier som huser et par-stabilisert plasmid med hvilke som helst av de ovenfor beskrevne karakteristikker dyrkes og genproduktet av plasmidet innhøstes fra den bakterielle kultur. Kultiveringen utføres i og for seg passende ved å anvende konvensjonelle teknikker inklusive konvensjonelle næringsmedier som er kjent for å være optimale for de bakteriearter som kommer på tale. Det er verd å merke seg at på grunn av stabiliseringen trenges ikke en spesifikk sammensetning av næringsmediet. Dessuten utføres innhøstingen av genproduktet i overensstemmelse med velkjente metoder tilpasset iden-titeten og egenskapene til det spesielle genprodukt som fremstil-les, egenskapene til vertsbakterien osv. Dyrkningen fortsettes i minst 100 generasjoner for bakteriene; ved produksjon i stor skala kan antall cellegenerasjoner som trenges for å utbre bakteriene overstige 100 generasjoner. Under disse omstendigheter vil LF-verdien til plasmidet bli selektert slik ved nærvær av en pagregion deri at tapet av plasmidet er mindre enn 2 x 10 -4/celle/generasjon. Denne LF-verdi vil vanligvis være oppnåelig ved hjelp av én par-region alene. I noen tilfeller foretrekkes det imidlertid å oppnå LF-verdier for plasmidet på mindre enn 10 ^/celle/generasjon, spesielt mindre enn 5 x 10 ^/celle/generasjon.

Selv om disse svært lave LF-verdier i noen tilfeller kan være oppnåelige ved innsettelse av bare én par-region (spesielt Ri par-region B), vil de vanligvis trenge nærvær av begge Ri par-regioner.

Det er en spesiell fordel ved plasmidene i henhold til oppfinnelsen at ingen spesielle mutanter eller stammer trenges for å sikre plasmidopprettholdelse. Således kan hvilke som helst av arter og stammer av bakterier som har evne til å huse et slikt plasmid anvendes, feks. gram-negative bakterier. Et spesifikt eksempel på en bakterie i hvilken plasmider i henhold til foreliggende oppfinnelse har evne til å replikere og opprettholde sin stabilitet er Escherichia coli.

Som nevnt, utgjøres i alt vesentlig alt av det DNA-fragment som innsettes i vertsplasmidet av en av to par-regioner, og resten av DNA er til stede for å tilveiebringe passende restrik-sjonsseter for innsettelse i et kompatibelt restriksjonssete på resipientplasmidet. Det innsatte DNA-fragment omfattende RI par-region A og Ri par-region B bør, i henhold til dette prinsipp,

ha en lengde som ikke overstiger ca. 6 kb, spesielt ikke over ca. 4 kb, mer spesielt ikke over 3 kb. Når DNA-fragmentet inkluderer Ri par-region A, vil det normalt ha en lengde som ikke overstiger ca. 4 kb, spesielt ikke over 2,5 kb, mer spesielt ikke over ca. 2 kb. Når DNA-fragmentet omfatter Ri par-region B vil det normalt ha en lengde som ikke overstiger ca. 2 kb, spesielt ikke over ca. 1,5 kb, mer spesielt ikke over ca. 1 kb. Det er overraskende funnet at slike små, og derfor lett innsettbare, DNA-fragmenter har bevart sin stabiliserende funksjon, da parA-regionen, ved restriksjonsenzymkartlegging, er blitt innsnevret ned til en region med en lengde på ca. 1800 bp (basepar), og parB-regionen er blitt innsnevret til ca. 900 bp. Det er mulig at genet eller genene faktisk tilveiebringer en Par<+->fenotype som er enda mindre.

Et alvorlig problem ved konstruksjon av hybdridplasmider med en Par<+->fenotype har vært mangelen på en hurtig og enkel metode for klassifisering for denne fenotype. Generelt kan de riktige hybridplasmider bli identifisert ved den Par<+->fenotype som resulterer i høy stabilitet av plasmidet under vekst av plasmidet uten seleksjonstrykk. Imidlertid er denne type klassifisering brysom, og i alle fall er det bare relevant hvis opphavsplasmidet er ustabilt nedarvet. Alternative klassifiseringsme-toder er nå utviklet, hvilket fremgår av det følgende.

a) Klassifisering for innsettelse av parA-t—fragmenter

Hvis to forskjellige plasmider (fra separate uforlikelig-hetsgrupper) som begge bærer p_arA+-regionen er til stede i den samme celle, vil de fordrive hverandre med en viss frekvens (Lnkompatibilitet), mest sannsynlig fordi de konkurrerer om forde-lingsapparaturen i cellen. Denne type par-formidlet inkompatibili-tetsfenotype kan utnyttes ved klassifisering på par-h<y>brider♦

For eksempel kan et ParA<+->plasmid transformeres til en Alac

E. coli stamme (f.eks. CSH50) som huser et annet plasmid som bærer lac-genene og parA<+->regionen. Normalt vil det innkommende plasmid utøve par<+->formidlet inkompatibilitet mot det residerende ParA<+->plasmid. På grunn av Lac<+->fenotypen til det residerende plasmid påvises en slik inkompatibilitet lett hvis transformanter utvelges på basis av en resistensmarkør som ba-re finnes på det innkommende plasmid, mens nærvær eller fravær av det residerende plasmid registreres på indikatorsubstrater, f.eks. McConkey-laktoseplater. Replikkutplatingskolonier fra slike plater til nye lignende plater vil avsløre endog lave ni-våer av avskaffelse fra det residerende plasmid som farveløse kolonier som viser forekomst av Lac~-celler. En ytterligere stabilitetstest eller en mer utstrakt inkompabilitetstest kan kreves for å teste egenskapene til potensielle parA<+->hybridplasmider. På denne måte er det mulig - ved å involvere den riktige (forlikelige) kombinasjon av innkommende og residente plasmider - hurtig å klassifisere på innsettelse av Inc<+> (Par<+>)-fragmenter i ethvert plasmid hva enten det er ustabilt eller stabilt.

b) Klassifisering på innsettelse av parB<+->fragmenter

Siden det også er blitt vist at to urelaterte plasmider

som begge bærer parB<+->reqionen er inkompatible med hverandre, passer den samme klassifiseringsstrategi som beskrevet for konstruksjon av p_arA<+->hybrider på konstruksjonene av parB<+->hybrider.

c) Klassifisering på innsettelse av p_arA+-, B+-fragmenter

Ved siden av å ha potensialet angående avskaffelse av både

parA+ og p_arB+-hybridpla smider i overensstemmelse med de ovenstå-ende beskrivelser, tillater EcoRl-A-fragmentet med Tn5-inset-telsen en direkte seleksjon (Km ) for plasmider som bærer parA+, parB+-fragmentet. således, til tross for den store størrelse på fragmentet, selekteres det lett for endog svært få hybrider. Et mindre DNA-fragment omfattende begge par+-regioner vil naturligvis også utøve inkompabilitet mot både parA<+-> og parB<+->plasmider.

Det henvises til tegningen, hvor:

Fig. 1-5 og 7-17 viser restriksjonskart for plasmidene

som er beskrevet i eksemplene,

Fig. 6 viser et detaljert kart (ikke trukket opp i måle-stokk) for Pstl-D-fragmentet fra Ri, og Fig. 18 viser stabilitetskurver av forskjellige typer av replikon som bærer forskjellige par-regioner sammenlignet med Par -replikoner.

I figurene 1-5 og 7-17 er det vist lineære restriksjonskart for de plasmider som er beskrevet i eksemplene, hvor fenotypene og genotypene av plasmidene er indikert over den horisontale linje som betegner opphavsplasmidet. Således representerer parA én av regionene til plasmid Ri som sikrer plasmidopprettholdelse, parB representerer den annen region i plasmid Ri som sikrer plasmidopprettholdelse; icel representerer et gen som formidler immunitet til colicin El; ori eller oriV representerer opprinnelsen til plasmidreplikering, bla representerer et gen som koder for resistens overfor ampicillin; IR representerer en invertert gjentagelsesstruktur på Tn5; Km representerer kana-

R R

mycin-resistens; Cm representerer kloramfenikolresistens; Ap representerer ampicillinresistens; Tc p representerer tetracyklin-resistens; repA representerer et gen som koder for et protein som kreves for Rl-replikering; lacZ, lacY og lacA representerer det innsatte lac-operon for hvilket lacZ koder for 8-galaktosidase, lacY koder for permease og lacA koder for transacetylase; repA- lacZ' representerer en fusjon mellom repA- og lacZ-genene; copB representerer et gen som koder for et polypeptid som re-presserer transkripsjon fra repA-promoteren (i Rl-plasmider); copA representerer et gen som koder for et RNA-molekyl som in-hiberer translasjon av RepA-RNA; clg^ representerer et gen som koder for en temperaturfølsom X-repressor som kontrollerer XPR-promoteraktivitet; Pdeo representerer deo-promoteren. Pilen betegner retningen på transkripsjonen og "trianglene" betegner innsettelser av DNA. De skraverte arealer og blanke arealer betegner innsatte gener; den stiplete linje betegner en stryk-ning .

Under den horisontale linje er setene for restriksjonsenzymer vist i hvilke E betegner EcoRl; P betegner Pstl; B^ betegner

BamHI med unntagelse av i figurene 1 og 5 hvor, utenfor

Tn5 DNA, den betegner Ball; H1 betegner Hpal; Ev betegner EcoRV; B2 betegner Bglll; S1 betegner Sali; H3 betegner Hindlll, og C betegner Clal.

I fig. 6 er Pstl-D-fragmentet kartlagt videre; tallene over den horisontale linje indikerer antall basepar mellom re-striks jonssetene . Under den horisontale linje er setene for re-striks jonsenzymene vist i hvilke R1 betyr Rsal; P betyr Pstl;

og betyr Hpal.

I fig. 18 er stabilitetskurver vist for Ri-, pl5- og pBR322-derivatene som er konstruert og testet i eksemplene.

Hver kurve representerer gjennomsnittet av minst to flytende kulturer som er fulgt i mer enn 100 generasjoner. Det fremgår av figuren at plasmider som inneholder både parA og parB er ekstremt stabilt nedarvet, hvilket også er tilfelle hos plasmider som inneholder parB alene og med mini-Rl-plasmider stabilisert med parA alene.

Det fremgår av kurvene for Par -plasmider at innledningsvis avtar frekvensen av plasmidbærende celler eksponensielt, som ventet, på grunn av en konstant tapsrate. I senere stadier viser frekvensen av plasmidbærende celler seg å avta hurtigere (antydet med heltrukne linjer) på grunn av en noe hurtigere vekstrate hos plasmidfrie celler. Den stiplete linje indikerer kurven som er justert med hensyn til denne hurtigere vekstrate for å vise den aktuelle tapsfrekvens.

I motsetning til dette går plasmider som er fenotypisk Par" tapt med en frekvens på 1,5 x 10 /celle/generasjon for Rl-plas--2 -3 mider, 1 x 10 /celle/generasjon for pl5-plasmider og 6 x 10 /celle/generasjon for noen pBR322-plasmider, og et eksempel på dette er beskrevet i eksempel 3.3. Faktisk er tapsfrekvensene for pl5 Par - og pBR322 Par -derivatene overraskende høye når kopitallene til disse vektorer betraktes. For eksempel er kopitallet for pl5 av størrelsesorden 15-20 pr. celle, hvilket forut-sier en tapsrate på 10 —9/celle/generasjon hvis binominell fordeling av plasmidene antas. Ikke desto mindre forklares den ob-serverte høye tapsrate lett ved det faktum at pl5-replikoner danner recA-avhengige kointegrater, antagelig på grunn av mangelen på en loxP-1ignende oppløsningsfunksjon (Austin et al.,

Cell 25, 1981, ss.729-36). Også pBR322-derivater er kjent for

å danne kointegrater, og når kopitallet avtar på grunn av f.eks. store, klonede fragmenter, blir resultatet en betydelig ustabilitet.

MATERIALER OG METODER

Den 3tamme av Escherichia coli K-12 som ble brukt, var CSH50 (A pro- lac, rpsL; se J. Miller: "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor, New York, 1972). Flere plasmider og bakteriofager ble brukt (tabell 2).

De eksperimentelle teknikker som ble brukt var standardtek-nikker som anvendes på områdene mikrobiell genetikk (J. Miller: "Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972) og genetisk manipulasjon (Davis, Botstein og Roth: "A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor, New York, 1980).

Alle celler ble dyrket i LB-medium (Bertani,"J. Bact" 62, 1951, s. 293) med 0,2 % glukose og 1 ug/ml tiamin, eller A+B-minimal^mediumy (Clark og Måløe,"J. Mol. Biol.", 23, 1967, s. 99) supplert med 0,2 % glukose og 1 % kasaminosyrer. De plater som ble anvendt var LA-plater inneholdende LB-medium og 1,5 % agar.

McConkey-laktose-indikatorplater ble fremstilt som anbefalt av produsenten, og X-gal-plater ble fremstilt ved tilsetning av 20-40 u<g>/ ml av 5-brom-4-klor-indolyl-/3-D-galaktosid til A+B-minimal-medium supplert med 0,2 % glukose og 1 nq/ ml tiamin.

Fysikokjemikalske metoder

Det ble fremstilt klare lysater i henhold til den metode som er beskrevet av Clewell og Helinski, "Proe. Nati. Acad. Sei.", USA 62, 1969, ss. 1159-66.

Fremstilling i liten skala av plasmid-DNA ble utført ved metoden til Birnboim et al., "Nucl. Acids Res." 7, 1979, ss. 1513-23.

Fremstilling i stor skala og analyse av plasmid-DNA ble utført ved anvendelse av farvestoff-oppdrifts-densitetgradient-sentrifugering i henhold til Stougaard og Molin, "Anal. Bio-chem." 118, 1981, s. 181.

Polyakrylamidgel-elektroforese og agarosegel-elektroforese av DNA-preparater ble utført i det vesentlige som beskrevet av Molin og Nordstr6m, "Methods in Plasmid Biology", Odense Universitet 1982.

Restriksjonsendonukleasene ble anvendt i overensstemmelse med de forskrifter som er tilveiebragt av produsenten ved 37°C. Dobbelte og tredobbelte digereringer ble utført ved å starte med det enzym som krever den laveste saltkonsentrasjon og deretter justere med ytterligere puffer før tilsetning av det neste enzym, re med ytterligere puffer før tilsetning av det neste enzym.

Behandling med exonuklease Ba131 ble utført som følger: 0,1 enhet av Bal31 ble tilsatt til 50 pg lineær DNA, og det ble tatt prøver ved 1', 2', 4', 8', 16', 32' og 60' til 60 mM EDTA, ekstrahert med fenol, etanol-utfelt og resuspendert i 20 ul TE puffer. Halvparten av de 20 Ml ble digerert med det aktuelle restriksjonsenzym utsatt for agarosegelelektroforese for å bestemme gjennomsnittsstørrelsen på de fjernede DNA-fjerninger. Til den annen halvpart ble den aktuelle kobler tilsatt og bland-ingen ligert i 48 timer med et overskudd av T4 DNA-ligase.

Ligering av avgrenset plasmid-DNA ble utført som anbefalt av produsenten med unntagelse av "blunt end"-ligering, hvor et overskudd av T4 DNA-ligase og ATP ble tilsatt.

Mikrobiologiske metoder

Fordelingstest I: Konstruksjon av Lac<+->vektorer gjorde det mulig å bestemme Par<+->fenotypen av et plasmid simpelthen

ved å streke opp på ikke-selektive McConkey-laktose-plater eller X-Gal-plater. Bakterier (A lac) som huser disse plasmider formidler en Lac<+->fenotype som lett registreres som farvede kolonier på indikatorplatene, mens plasmidfrie celler har en Lac - fenotype og fremtrer som farveløse kolonier.

Fordelingstest II: (Anvendt for Lac -plasmider): En koloni fra en selektiv plate (en plate inneholdende et antibiotikum) ble streket opp på en annen selektiv plate. Fra denne plate ble én koloni streket opp på en LA-plate slik at det skul-le danne seg enkeltkolonier. Fra LA-platen ble tilnærmet 10 kolonier suspendert i 1 ml av 0,9 % av NaCl til en fortynning henholdsvis 10 og 10 . 0,1 ml av de 10 - og 10 - fortynninger ble bredt ut på LA-plater. Fra disse plater ble resistensmønsteret for 50 kolonier (200 kolonier hvis svak ustabilitet forventes) testet på de aktuelle selektive plater. Tapsfrekvensen (LF-verdi) beregnes deretter på basis av føl-gende formel:

hvor v er frekvensen hos plasmid-bærende celler og hvor det antas at én koloni vokser i 27 generasjoner. Iboende i denne metode er en stor statistisk fluktuasjon. Fordelingstest III: Kvantitative målinger av stabiliteten til Lac<+-> og Lac~-plasraider. Én komplett koloni ble tatt fra en selektiv plate og resuspendert i 1 ml av 0/9 % av NaCl til 8 —3 en konsentrasjon av 10 celler/ml. 2x0,1 ml av 10 -fortynningen ble anvendt for å inokulere 2x10 ml av LB-medium, og in-okuleringen ble utført ved 30°C under rysting. Ved en celle-densitet på ca. 5 x 10 o celler/ml ble kulturene fortynnet 10 4 og 10 5 ganger. 0,1 ml av 10 4 -fortynningen (5 x 10 3 celler) ble anvendt for å inokulere 10 ml friskt LB-medium, og 0,4 ml av 10^-fortynningen ble bredt ut på McConkey-laktose-plater, og platene ble inokulert ved 30°C natten over. Fortynningen fra 5 x 10 8 /ml til 5 x 10 2/ml tilsvarer 20 generasjoners vekst (2^°), så endringen i frekvensen til plasmidbærende celler fra én fortynning til den neste tilsvarer den som inntreffer under 20 generasjoners vekst. Mer generelt kan LF-verdien beregnes som følger: hvor og v2 er frekvensen til plasmidbærende celler etter henholdsvis g^ og g2 generasjoner, og LF er tapsfrekvensen pr. celle pr. generasjon. Det følger derfor at og

Ved anvendelse av denne formel unngås feil på grunn av fluktu-asjoner i antall inokulerende celler ved tiden null. En mer bekvem tilnærmelse av denne formel er

Plasmider som menes å bære en innsatt p_ar-region klassifisert ved benyttelse av den observasjon at to ellers kompatible replikoner som bærer den samme par-region er inkompatible med hverandre, hvilket fører til tap av en av de to i fravær av seleksjonstrykk. Testen utføres ved transformering av plasmidet som skal testes til en bakteriestamme som bærer et annet plasmid, som selekterer for begge plasmider på dobbelte selektive plater. Etter utstrekning på en dobbelt selektiv plate

(en plate som inneholder to forskjellige antibiotika) ble uforlikeligheten målt enten kvalitativt eller kvantitativt.

For den kvalitative inkompabilitetstest ble en koloni fra den dobbelte selektive plate streket opp på en LA-plate for å danne enkeltkolonier. Ca. 10 kolonier fra denne plate ble resuspendert i 1 ml av 0,9 % NaCl og fortynnet til henholdsvis IO og 10 . 0,1 ml av 10 - og 10 -fortynningene ble bredt ut på LA-plater. Fra disse plater ble 50 kolonier (eller 200 kolonier hvis svak inkompabilitet ble forventet) testet på de aktuelle selektive plater. Hvis et Lac<+->plasmid var inkludert i testen, ble McConkey-laktose-indikatorplater anvendt isteden-for replikkutplating på selektive plater. I tilfellet av Lac<+->plasmider ble klassifiseringen således utført ved transformering av mistenkte Par<+->plasmider til en stamme som allerede huset et Par<+->hybridplasmid som formidlet en Lac<+->fenotype. Plasmid-inkompabilitet, og følgelig bevis på en spesifikk Par<+->fenotype av det innkommende plasmid påvises lett ved klassifisering på Lac -kolonier i McConkey-plater, hvilket viser at det residerende Par<+->plasmid var blitt destabilisert. Et eksempel på denne klassifiseringsprosess er beskrevet i eksempel 4.

Kvantitative inkompabilitetsmålinger ble utført ved måling av tapfrekvensene for Lac<+->plasmider etter etablering av hetero-plasmidpopylasjoner som beskrevet ovenfor. LF-verdiene ble målt som beskrevet under "Fordelingstest III".

Genetiske teknikker

Transformasjon av bakterier ble gjort i henhold til

Cohen et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." USA 62, 1972, ss. 2110-2114, med den modifikasjon at når en lavtransformasjons-frekvens var forventet, ble behandlingen av de kompetente celler med DNA på is forlenget flere timer, og etter varmesjokk ble cellene igjen avkjølt på is i 5-30 minutter. Denne behandling økte transformasjonsfrekvensen signifikant.

Infeksjon med bakteriofagen X ble utført ved dyrking av

10 ml kulturer natten over i LB-medium supplert med 0,2 % malt-ose (for å indusere malB-proteinet som er X-reseptoren) under rysting. Cellene ble vasket med 0,9 % NaCl og resuspendert i 2 ml 0,01 M MgSO, og inkubert i 1 time. Fortynninger av X-sus-0 -1 -2

pensjonen (10 , 10 ,10 ) ble laget og 0,1 ml av fagfortynnin-gen ble anvendt for å infisere 0,2 ml av suspensjonen av utsul-0 -1 -2

tede celler. 10 -, 10 - og 10 -fortynningene av infeksjons-blandingene ble utbredt på selektive plater.

For å transposere plasmider med Tn5 (Km ) hvis kilde var fagen X b221::Tn5, som var blitt fratatt tilknytningsstedet, slik at den var uegnet til å lysogenisere, ble en suspensjon av .fagen anvendt for å infisere celler som huset plasmidet på hvilket transposisjon var ønsket. Infeksjonen ble utført som beskrevet ovenfor, og kanamycinresistente celler ble selektert.

R

Flere tusen Km -kolonier ble oppsamlet, og 0,1 ml av en 10 fortynning av disse ble anvendt for å inokulere 100 ml LB-medium. Kulturen ble dyrket natten over og plasmid-DNA fremstilt av denne blanding av celler og anvendt for transformering av E. coli K12 stamme CSH50 for kanamycinresistens.

EKSEMPEL 1

Innsettelse av Tn5 (Km p) i EcoRl-A-fragmentet fra_Rl

Celler av E.coli K-12 stamme CSH50 som huser plasmid pKNl84, et plasmid som består av plasmid pSF2124 og 19 kb EcoRl-A-fragmentet (som bærer parA- og parB-regionene) fra plasmid RI (Nordstrom et al., Plasmid 4, 1980, s. 322), ble infisert som beskrevet under "Materialer og metoder" med en suspensjon av bakteriofagen Ab211::Tn5. Etter selektering med hensyn på kanamycin-resistens på LA-plater inneholdende 200 Mg/ml av kanamycin, ble kolonier oppsamlet og blandet. 0,1 ml av en 10 - 2-fortynning av disse ble anvendt for å inokulere 100 ml LB-medium. Kulturen ble dyrket natten over og plasmid-DNA fremstilt fra kulturen anvendt for å transformere E.coli K-12 stamme CSH50 ved selektering på kanamycinresistens på plater som inneholdt 200 Mg/ml kanamycin.

På denne måte ble et plasmid, pOUl, funnet som formidler resistens overfor kanamycin og har en innsettelse av fag DNA

som tilsvarer ca. 5 kb (5000 basepar). Plasmidet hadde en molekylvekt/størrelse på 34 kb målt ved fremstilling av plasmid-DNA og analyse på agarosegeler, og følgende fenotyp: Km R , Ap R, ParB<+.>

Plasmid-DNA ble fremstilt fra pOUl og plasmidet kartlagt med restriksjonsenzymer ved rensing av plasmid-DNA, spalte det med restriksjonsenzym(er) og analyse av de resulterende fragmenter ved hjelp av agarosegel-elektroforese (kfr. fig. 1). På denne måte ble A::Tn5-fragmentet som var innsatt i EcoRl-A-fragmentet til pKNl84 identifisert som bærende det gen som koder for Km p, og lokaliseringen av fragmentet ble bestemt som vist i

fig. 1. Plasmid pOUl ble anvendt for ytterligere analyse og plasmidkonstruksjoner.

Stammen av E.coli CSH50/pOUl er deponert i den tyske kolleksjon av mikroorganismer (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 GSttingen, i det følgende forkortet til DSM), under tilgjengelighetsnummer 2712.

EKSEMPEL 2

Konstruksjon av et plasmid som er nyttig for kloning av par<+->fragmenter

Plasmid pJL99 (Light & Molin, Mol. Gen. Genet. 184, 1981, ss.56-61) bærer en fusjon mellom repA-genet fra plasmid Ri og lac-operonet; plasmidet formidler en Lac<+->fenotype. Det PstI-Sali-fragment som bærer repA - lac-fusjonen ble kuttet ut fra pJL99 og innsatt i pGA46 som er et pl5-replikon (An & Friesen, J. Bact. 140, 1979, ss.400-407) for å konstruere plasmid, pJL124. Et kart over plasmidet er vist i fig. 2. Plasmid pJL124 formidler også en Lac<+->fenotype på McConkey-laktose-indikatorplater, men det viste seg at innsettelse av DNA-fragmenter med liten eller ingen promoter-aktivitet i Pstl-setet til pJLl24 interferer med aktiviteten til repA-promoteren på en slik måte at disse hybrider ikke lenger viser seg som Lac<+> på McConkey-laktose-indikatorplater. Imidlertid er, på de mer sensitive X-gal-indikatorplater, transformantkolonier Lac<+>, hvilket indikerer at ekspresjon av S-galaktosidase er redusert, men ikke helt undertrykt i hybridene. Derfor kan pJL124 anvendes for å klone Pstl-fragmenter siden hybridplasmider lett påvises på McConkey-laktose-indikatorplater som Lac""-transformanter. Videre, siden pJL124 er et pl5-replikon og således ustabil, hvilket lett påvises da celler fra hvilke plasmidet er gått tapt danner farveløse kolonier på laktose-indikatorplater uten seleksjonstrykk, kan Pstl-fragmenter som har evne til å stabilisere pJL124 klassifiseres for på X-gal-plater.

Programmet for å isolere Pstl - par<+->fragmenter består således av følgende trinn: 1) Ligering av pJLl24 avgrenset med Pstl og Pstl-fragmenter fra et annet plasmid. 2) Transformering til CSH50 ved utplating på McConkey-laktose-plater som inneholder kloramfenikol. 3) Testing av kloner som viser seg som Lac på McConkey-laktoseplater for stabil nedarving av Lac<+->fenotype på X-gal-indikatorplater (kfr. "Materialer og metoder").

Stammen E. coli CSH50/pJLl24 er deponert i DSM under tilgjengelighetsnummer 2760.

EKSEMPEL 3

Stabilisering av ustabile plasmider med parA- og parB-regionene

1. Mini-Rl-replikon.

Plasmid pOU71 (DSM tilgjengelighetsnr. 2471) , et "runaway"-replikeringsderivat av plasmid pKNl562 som omfatter basisreplikonet til plasmid Ri, \PR-promoteren og cIg57-repressorgenet fra fag EDA4, det gen som koder for B-laktamase fra Tn3-transposonet og et unikt EcoRl-sete (en detaljert beskrivelse av konstruksjonen av pOU71 finnes i vår samtidige søknad nr. 84.193 5, ble avgrenset med EcoRl, og EcoRl-A::Tn5-fragmentet fra pOUl (kfr. eksempel 1) ble innsatt, fulgt av ligering og transformering av E. coli stamme CSH50, ved selektering av kanamycinresistente celler på LA-plater inneholdende 50 jug/ml kanamycin.

Transformantene ble klassifisert med hensyn på "runaway"-replikeringsfenotyp av pOU71 ved oppstreking på LA-plater inneholdende 50 Mg/ml kanamycin og inkubering ved 42°C. Celler som inneholdt "runaway"-replikeringsplasmider opphører til slutt å vokse under disse betingelser. På denne måte ble plasmid POU71-184 identifisert, som hadde en størrelse på 25,5 kb og følgende fenotype: ParA<+>, ParB<+>, Ap R , Km R.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 3). Fra restriksjonskartet fremgår det at EcoRl-A::Tn5-fragmentet var innsatt korrekt i EcoRl-setet til pOU71.

Celler som huser plasmidet ble dyrket på LA-plater i 100 generasjoner uten seleksjonstrykk, dvs. uten å bli dyrket på plater som inneholdt et antibiotikum; ved bestemmelse i henhold til den fremgangsmåte som er beskrevet i "Materialer og metoder"

(fordelingstest II), ble cellene ikke observert å tape plasmidet, mens pOU71 gikk tapt fra celler som ble dyrket under lignende betingelser med en frekvens på 1 % pr. generasjon. Det ble således bestemt at pOU71-184 nedarves stabilt med en tapsfrekvens på ca. 10 ^/celle/generasjon.

Stammen av E.coli CSH50/pOU71-184 deponeres i DSM under tilgjengelighetsnummer 2763.

2. pl5-replikon

Plasmid pJL124 (kfr. eksempel 2), som er et par~-pl5-replikon, ble spaltet med restriksjonsenzymet Pstl og blandet med plasmid pKNl84 (kfr. eksempel 1) som var blitt delvis avgrenset med Pstl fulgt av ligering. Den blandede ligering ble transformert til E.coli stamme CSH50 under selektering for kloramfenicol-resistens på McConkey-laktose-indikatorplater inneholdende 50 ug/ml kloramfenicol.

Celler som huser pJL124 som bærer et eller flere Pstl-fragmenter (kfr. eksempel 2) ble testet på stabil nedarving av Lac<+->fenotypen på X-gal-plater. Ett av de stabilt nedarvede plasmider viste seg å inneholde både parA- og p_arB-regionen.. Dette plasmid, pOU2, har en størrelse på 24 kb og følgende fenotype: CmR, Lac<+>, ParA<+>, ParB<+>.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 4). Fra restriksjonskartet fremgår det at et Pstl-fragment er blitt fjernet fra EcoRl-A-fragmentet.

Celler som huser plasmidet ble dyrket på X-gal-plater i 100 generasjoner uten seleksjonstrykk, og det ble bestemt at pOU2 er stabilt nedarvet med en LF-verdi på mindre enn 10 6/celle/generasjon i kontrast til pJLl24 som gikk tapt fra cellene med en frekvens på 0,5-1 % celle/generasjon.

Stammen E.coli CSH50/pOU2 er deponert i DSM under tilgjen--gelignetsnummer 2713.

3. pMBl-replikon

Plasmid pFl403-ll (kfr. tabell 2) er et ustabilt nedarvet derivat av pBR322 (et pMBl-replikon) som bærer en fusjon mellom et gen fra plasmid F og lac-operonet. Plasmidet formidler en Ap p, Lac<+->fenotype. EcoRl-A:;Tn5-fragmentet fra plasmid pOUl (eksempel 1) ble innsatt i det unike EcoRl-sete i plasmid PF1403-11 umiddelbart oppstrøms for genfusjonen fulgt av ligering og transformering til E.coli stamme CSH50 som selekterer for Ap R på plater inneholdende 50 Mg/ml ampicillin, Km R på plater inneholdende 50 Mg/ml kanamycin og Lac<+> på McConkey-laktose-indikatorplater.

Det resulterende plasmid pOUlO ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 5), og innsettel-sen av EcoRl-A;:Tn5-fragmentet ble verifisert. Plasmidet hadde en størrelse på 34 kb og følgende fenotype: Km R , Ap R, Lac<+, >ParA<+>, ParB<+>.

Plasmidet ble testet på stabil nedarving som beskrevet i eksempel 3.1. Det ble således vist at pOUlO er stabilt nedarvet med en LF-verdi på mindre enn 10 ^/celle/generasjon, mens pF1403-ll gikk tapt fra cellene med en frekvens på 6 x 10 —3 pr. generasjon.

Stammen E. coli CSH50/pOUlO deponeres i DSM under tilgjengelighetsnummer 2714.

EKSEMPEL 4

Kloning av Pstl-fragmenter fra det EcoRl-A-fragment som stabiliserer pJL124

EcoRl-A-fragmentet ble avgrenset med et antall restriksjonsenzymer, og det resulterende fysikalske kart er vist i fig. 1. Som det fremgår av denne figur, er fragmentet sammensatt av mange Pstl-fragmenter. I den hensikt å redusere størrelsen på det fragment som formidler Par<+->fenotypen, ble det forsøkt å subklone par-regioner som muligens ble båret på et eller flere av Pstl-fragmentene i klassifiseringsvektoren pJL124 (kfr. eksempel 2). Analyse av et antall kloner med den korrekte fenotype - Lac" på McConkey-laktoseplater og stabil nedarving i fravær av seleksjonstrykk - viste at Pstl-D-fragmentet (kfr. fig. 1) formidlet denne fenotype. Intet annet enkelt- Pstl-fragment var i stand til å stabilisere pJLl24. Den region som er ansvarlig for stabilisering av pJLl24 beliggende i 1,8 kb Pstl-fragmentet ble betegnet parB.

For å analysere Pstl-D-fragmentet videre ble fragmentet klonet inn i det unike Pstl-sete i bla-genet til pBR322 hvilket resulterte i pOU93 (kfr. fig. 7; plasmidet er deponert i DSM under tilgjengelighetsnummeret 2724). Restriksjonskartlegging av dette plasmid viste at Pstl-D-fragmentet inneholder tre Rsal-seter (kfr. fig. 6). Rsal utvikler "blunt ends", og det 900 bp store Rsal-fragment ble derfor innsatt i Smal-setet til plasmid pHP34 (Prentki et al., Gene 17, 1982, ss. 189-96) på følgende måte: pOU93 ble avgrenset med Rsal og blandet med pHP34 avgrenset med Smal fulgt av ligering. Ligeringsblandin-gen ble transformert til E.coli stamme CSH50 som allerede huset plasmid pOU94 (et pl5-derivat som fenotypisk er Lac<+> og ParB<+>, kfr. fig. 8; plasmidet er deponert i DSM under tilgjengelighetsnummer 2725) , og det selekterer for ampicillin-resistens på plater inneholdende 50 Mg/ml ampicillin.

På grunn av uforlikeligheten som uttrykkes av parB<+->regioner som bæres på forskjellige plasmider, går pOU94 tapt når et annet plasmid som fenotypisk er ParB<+>, innføres i celler fra E.coli, hvilket således gjør det mulig å selektere for korrekte innsettelser og transformanter ved oppstreking av cellene på McConkey-plater og klassifisering for farveløse kolonier (Lac ). Ett slikt uforlikelig plasmid pHP34-derivat som ble funnet å inneholde det 900 bp store Rsal-fragment ble betegnet pOU13. Plasmidet hadde en størrelse på 5,3 kb og følgende fenotype:

Tc<R>, ApR, ParB<+.>

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 9). Kartleggingen viste at Rsal-fragmentet er blitt omdannet til et 900 bp stort EcoRl-fragment da Smal-setet til pHP34 er flankert av to EcoRl-seter.

Stammen av E.coli CSH50/pOU13 er deponert i DSM under tilgjengelighetsnummer 2716.

Det 900 bp store EcoRl-fragment fra pOUl3 ble innsatt i EcoRl-setet til pOUlOl, et Ap R / Cm R-"runawayn-mini-Rl-derivat

(en detaljert beskrivelse av konstruksjonen av pOUlOl finnes i tidligere nevnte søknad nr. 84.1935 med et unikt EcoRl-sete i cat-genet (det gen som koder for Cm<R>), for å konstruere plasmid pOU14

SR

som har en størrelse på 8,2 kb og følgende fenotype: Cm , Ap , ParB<+>.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 10).

Plasmidet ble testet på stabil nedarving som beskrevet i eksempel 3.1. Det ble således vist at, ved 30°C, er p0U14 stabilt nedarvet med en LF-verdi på mindre enn 1 x 10 <4>/celle/- generasjon, mens pOUlOl går tapt fra cellene med en frekvens på

1 % pr. generasjon.

Stammen av E.coli CSH50/pOU14 deponeres i DSM under tilgjengelighetsnummer 2717.

EKSEMPEL 5

Stabilisering av mini-Rl-plasmider med parB-fragmentet

Plasmid pOU90, et "runaway"-replikeringsderivat av pKNl562 som omfatter basisreplikonet til plasmid Ri, APR-promoteren og clgc^-repressoren fra fag EDX4, det gen som koder for B-laktamase fra Tn3-transposonet og EcoRl-A-fragmentet fra pKN184 (en detaljert beskrivelse av konstruksjonen av pOU90 finnes i søknad nr. 84.1935, i hvilket derivat EcoRl-A-fragmentet fra pKN184 er blitt innsatt, ble avgrenset med Sali og ligert for å produsere plasmid pOU61. Plasmidet ble transformert til E.coli stamme CSH50 ved selektering for en Lac~-fenotype på McConkey-plater.

pOU61 ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 11). Fra restriksjonskartet fremgår det at pOU61 bærer den 3,6 kb store høyre ende av EcoRl-A-fragmentet inneholdende parB-regionen. Plasmidet har en størrelse på 10 kb og følgende fenotype: ParB<+>, Ap<R>, Lac". Plasmidet ble testet på stabil nedarving som beskrevet i eksempel 3.1.

Det ble således vist at pOU61 er stabilt nedarvet med en LF-verdi på mindre enn 1 x 10 4/celle/generasjon.

Stammen av E.coli CSH50/pOU61 deponeres i DSM under til-gjenge lighetsnummer 2723.

EKSEMPEL 6

Stabilisering av plasmid pF1403-ll med parB-fragmentet

Plasmid pOUl (kfr. eksempel 1) ble kuttet med Sali og blandet med plasmid pFl403-ll som også var blitt avgrenset med Sali fulgt av ligering og transformering til E. coli stamme CSH50, ved selektering for ampicillinresistente kolonier på McConkey-laktose-indikatorplater. Noen av disse Lac<+->kloner ble klassifisert for stabil nedarving av Lac<+->fenotype på McConkey-plater, som beskrevet i "Materialer og metoder".

De stabilt nedarvete plasmider ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 12) . Fra restriksjonskartet fremgår det at de bærer Sali-fragmentet til pOUl på hvilket parB-regionen er beliggende. Det plasmid som består av pF1403-ll og Sali-fragmentet fra pOUl ble betegnet P0U12. Det hadde en størrelse på 16 kb og følgende fenotype: Par B<+>, Lac<+>, Ap . pOU12 var stabilt nedarvet med en LF-verdi på mindre enn 5 x 10 ^/celle/generasjon.

Stammen av E. coli CSH50/pOUl2 deponeres i DSM under til-gjenge lighetsnummer 2715.

EKSEMPEL 7

Stabilisering av p! 5- plasmider med parA- fragmentet

Plasmid pMC903 (Casadaban et al., J. Bact. 14 3, 1980, s.971) ble kuttet med EcoRl, og EcoRl-fragmentet fra plasmid pOU43 (kfr. fig, 13, DSM tilgjengelighetsnummer 2720) som bærer parA-regionen ble innsatt, fulgt av ligering og transformering til E. coli stamme CSH50. Det resulterende plasmid ble betegnet pOU45 og hadde en størrelse på 13,4 kb og følgende fenotype: ParA<+>, Lac", Ap R , Km R.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 14). Fra restriksjonskartet fremgår det at parA-regionen var blitt innsatt i lac-operonet som derved blir inaktivert.

Ved testing på stabilitet som beskrevet i "Materialer og metoder", ble plasmidet funnet å være stabilt nedarvet med en LF-verdi på 8 x 10 —4/celle/generasjon, mens pMC903 har en LF-verdi på 1 %/celler/generasjon.

Stammen av E. coli CSH50/pOU4 5 deponeres i DSM under tilgjengelighetsnr. 2721.

EKSEMPEL 8

Stabilisering av mini-Rl-plasmider med parA-regionen

EcoRl-fragmentet fra pOU43 ble innsatt i et mini-Rl-plasmid, pOU82 (DSM nr. 2482) , som omfatter basisreplikonet fra plasmid Ri, XPR-promoteren og cl-repressorgenet fra fag EDX4, det gen som koder for 6-laktamase fra Tn3-transposonet, deo-promoteren og aminoterminalenden til lacZ-genet fra pVHl424 og resten av lac-operonet fra pSKSl04 (en detaljert beskrivelse av konstruksjonen av pOU82 finnes i søknad nr. 84.1935.

Plasmid p0U82 formidler Ap R og Lac +-fenotypene og har et unikt EcoRl-sete nyttig for kloning av EcoRl-fragmenter. Dette plasmid går tapt med en frekvens på 1 % pr. generasjon i fravær av selsksjonstrykk.

Et plasmid i hvilket det 2,4 kb store EcoRl-fragment var blitt innsatt i én orientering ble betegnet pOU47. Plasmidet hadde en størrelse på 14 kb og følgende fenotype: ParA"1", Lac + , Ap .

pOU4 7 ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 15) .

Stammen av E. coli CSH50/pOU4 7 deponeres i DSM under tilgjengelighetsnr. 2722.

Det EcoRl-fragment som bærer parA-regionen ble videre redusert med 400 bp ved hjelp av exonukleasen Bal31; fjerningspro-sessen ble utført som beskrevet i "Materialer og metoder" ved anvendelse av det unike BamHI-sete i pOU4 7. Det plasmid som ble konstruert ble betegnet pOU4 72. Plasmidet hadde en størrelse på 13 kb og følgende fenotype: ParA<+>, Lac<+>, Ap<R>.

pOU4 72 ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet

i eksempel 1 (kfr. fig. 16). Fra restriksjonskartet fremgår det at pOU4 72 bærer det 2,0 kb store EcoRl-fragment utviklet ved Bal31-fjerningen.

Ved testing på stabilitet som beskrevet i "Materialer og metoder", ble plasmidet funnet å være stabilt nedarvet, hvilket betyr at hele parA-regionen inneholdes i det 2,0 kb store EcoRl-fragment.

Stammen av E.coli CSH50/pOU4 72 deponeres i DSM under tilgjengelighetsnr. 2726.

EKSEMPEL 9

Konstruksjon av et mini-Rl-plasmid som bærer parA-regionen

Plasmid pOU90 (kfr. eksempel 5) ble spaltet med BamHI og delvis med Sau3A for å fjerne en del av EcoRl-A-fragmentet, idet de 6 kb helt til venstre ble beholdt, fulgt av ligering. Det resulterende plasmid, pOU91, ble transformert til E. coli stamme CSH50. pOU91 har en størrelse på 18,75 kb og følgende fenotype: Par<*>, Ap<R>, Lac<+.> Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 17). ;Plasmidets stabilitet ble bestemt ved å dyrke celler inneholdende pOU91 (og, som kontroll, celler inneholdende pOU82) på McConkey-plater uten seleksjonstrykk ved 30°C i 25 generasjoner; de celler som ble transformert med pOU91 utviklet røde kolonier (Lac<+>), mens celler som ble transformert med pOU82 utviklet både røde og hvite kolonier, hvilket indikerer at under den seleksjonsfrie periode var pOU82 blitt tapt fra noen av cellene. ;Stammen av E. coli CSH/pOU91 deponeres i DSM under tilgjengelighetsnr. 2483. ;EKSEMPEL 10 ;Konstruksjon av et parA<+>, parB<+->mini-Rl-plasmid ;Plasmid pOU82 (kfr. eksempel 8) kuttes med EcoRl, og EcoRl-fragmentet fra pOU43 (kfr. eksempel 7 og fig. 13) som bærer parA-regionen innsettes. Dette EcoRl-fragment fjernes fra de 500 bp som er helt til venstre, inklusive ett EcoRl-sete, ved hjelp av exonukleasen Bal31. I det unike EcoRl-sete i dette plasmid innsettes EcoRl-fragmentet fra pOU13 (kfr. eksempel 4 og fig. 9). Det resulterende plasmid, som formidler en. ParA<+>, ParB<+->fenotype, kan deretter bli transformert til E. Coli stamme CSH50 som allerede bærer plasmid pOU94, og klassifiseres for i det vesentlige som beskrevet i eksempel 4 med unntagelse av at pOU82-derivatet formidler en svak Lac<+->fenotype hvilket betyr at kolonier av celler som huser dette plasmid bare vil være røde i senteret og farveløse ved kantene når de dyrkes på McConkey-laktose-indikatorplater. ;EKSEMPEL 11 ;Konstruksjon av et parA+, parB+-mini-Rl-plasmid ;Plasmid pOU61 (kfr. eksempel 5) kuttes med EcoRl, og EcoRl-fragmentet fra pOU43 som bærer parA-regionen innsettes, fulgt av ligering. Det resulterende plasmid, som formidler en ParA<+>, ParB<+->fenotype, kan deretter bli transformert til E. coli stamme som CSH50 som allerede bærer plasmid pOU2, og klassifiseres på en måte som tilsvarer den metode som er beskrevet i eksempel 4. Kolonier av celler som huser det Ønskede plasmid vil fremstå som farveløse kolonier (Lac~) på McConkey-laktose-plater. ;(I hele foreliggende beskrivelse og i kravene, der hvor par", Par", par<*> eller Par<+> ikke er spesifikt angitt, betegner uttrykkene par og Par ekspresjon av en fordelingsfunksjon).

Claims (14)

1. Plasmid, som replikerer i gramnegative bakterier, karakterisert ved at det bærer ett eller flere innsatte gener som ikke er naturlig forkommende i plasmidet, og at det er stabilisert ved et innsatt DNA-fragment som er kortere enn 19 kb, og som omfatter (a) RI par-region A, eller en par-region som gjør det stabiliserte plasmid inkompatibelt med et ellers kompatibelt plasmid omfattende RI par-region A, (b) RI par-region B, eller en par-region som gjør det stabiliserte plasmid inkompatibelt med et ellers kompatibelt plasmid omfattende RI par-region B, eller (c) såvel (a) som (b).

2. Plasmid som angitt i krav 1, karakterisert ved at det innsatte DNA-fragment omfattende RI par-region A og RI par-region B har en lengde som ikke er over 3 kb.

3. Plasmid som angitt i krav 1, karakterisert ved at det innsatte DNA-fragment som omfatter RI par-region A har en lengde som ikke er over 2 kb.

4. Plasmid som angitt i krav 1, karakterisert ved at det innsatte DNA-fragment som omfatter RI par-region B har en lengde som ikke er over 1 kb.

5. Plasmid som angitt i krav 1, karakterisert ved at det er et pl5-plasmid eller et derivat derav, eller et promiskuøst plasmid med høyt kopitall, eller et derivat derav.

6. Plasmid som angitt i krav 1, karakterisert ved at det blir ustabilt nedarvet på grunn av at det bærer et DNA-fragment som omfatter ett eller flere gener som ikke er naturlig forbundet med plasmidet.

7. Plasmid som angitt i krav 6, karakterisert ved at det er et pMBl-plasmid eller et derivat derav, f.eks-et pBR322-plasmid eller et derivat derav.

8. Plasmid som angitt i krav 1, karakterisert ved at det, i det minste i ett stadium under dyrkningen av bakterier som inneholder plasmidet, har et lavt kopitall.

9. Plasmid som angitt i krav 8, karakterisert ved at det har et kopitall på ca. 0,5-5 kopier pr. celle.

10. Plasmid som angitt i krav 8 eller 9, karakterisert ved at det velges blant plasmider av inkompatibilitetsgruppen IncFII, inklusive RI og derivater derav; F og derivater derav; og promiskuøse plasmider med lavt kopitall, og derivater derav.

11. Plasmid som angitt i krav 8 eller 9, karakterisert ved at det er et betinget "runaway"-rep1ikeringsp1asmid.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av et genprodukt av plasmid-DNA, karakterisert ved at bakterier som inneholder et plasmid i henhold til hvilket som helst av kravene 1 til 11 dyrkes i minst 100 generasjoner av bakteriene, idet tapet av plasmidet er mindre enn 2 x 10"<4>/celle/generasjon, og genproduktet av plasmidet utvinnes fra bakteriekulturen.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, karakterisert ved at tapet av plasmidet er mindre enn 10"<5>/celle/generasjon.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at tapet av plasmidet er mindre enn 5 x 10"<6>/celle/generasjon.