JP2018500920A - ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターおよびその利用 - Google Patents
ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターおよびその利用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(1)本発明の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターは、常用のsacB遺伝子の代わりに、斬新な逆方向での選択遺伝子vmi480を用いる。vmi480は、致死作用が強く、致死対象が広く、致死効果の発揮がNaClに影響されないメリットがある。それは、本発明の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターが好塩ビブリオ遺伝子のノックアウトに広く利用されることの基礎となるものである。
(2)本発明の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターのマルチクローニング部位は、2つのAhdI部位を導入している。酵素切断後、Tベクターを形成してもよい。ベクターが1度形成された後、繰り返し使用される。PCR産物についての酵素切断を必要としないとともに、酵素切断部位を考慮する必要もないため、時間が大きく節約される。
(3)本発明の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターは一般的な自殺プラスミドにおける大量の冗長部分を要さないため、自殺ベクターが小さくなり、接合伝達の頻度および正しい統合の確率の向上に寄与する。
(4)PBADプロモーターおよび致死遺伝子の効率性に基づいて、逆方向での選択プレートにおける欠損突然変異クローンの比率が大きく向上し、クローンを選別する工数が大分減少する。
(付記1)
環状ベクターである遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12において、
PBADプロモーターと、抑制タンパク遺伝子araCと、RP4伝達開始部位と、クロロマイセチン耐性遺伝子と、R6K複製開始部位と、マルチクローニング部位領域と、致死遺伝子vmi480と、を含み、
前記マルチクローニング部位領域は、少なくとも2つのAhdI酵素切断部位を含み、
前記致死遺伝子vmi480のヌクレオチド配列は、配列番号1の第21位−第617位の塩基配列に示され、
前記致死遺伝子vmi480は、PBADプロモーターの下流に位置し、PBADプロモーターに制御されることを特徴とする、
遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12。
前記遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12のヌクレオチド配列は、配列番号1に示されることを特徴とする、付記1に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12。
線形ベクターである遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12Tにおいて、
付記1に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12について、AhdIを用いてマルチクローニング部位領域における2つのAhdI酵素切断部位に対して酵素切断を行った線形ベクターが、当該遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12Tであることを特徴とする、
遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12T。
前記遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12Tのヌクレオチド配列は、配列番号2に示されることを特徴とする、付記3に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12T。
付記3に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12Tの遺伝子ノックアウトでの利用。
前記利用は、前記遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12Tのビブリオ遺伝子ノックアウトでの利用であることを特徴とする、付記5に記載の利用。
目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片を遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12Tに連結して、目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片を含むpLP12Tを取得してpLP12T−Xと命名し、pLP12T−Xが形質転換を介してドナー菌に入ってから、そのドナー菌を受容体菌に混合して、接合作用によりpLP12T−Xを伝達させて受容体菌に入れて、クロロマイセチン選択を介して、pLP12T−Xが受容体菌のゲノム標的部位に統合された目的遺伝子挿入突然変異型菌株を取得し、それから、当該目的遺伝子挿入突然変異型菌株を、アラブ糖でのvmi480遺伝子の誘導で生成された毒素Vmi480の逆方向での選択圧において、選別により、目的遺伝子を欠損したクローンを取得し、これにより、目的遺伝子のノックアウトを実施して目的遺伝子を欠損した菌株を取得することを特徴とする、付記5に記載の利用。
前記受容体菌は、ビブリオであることを特徴とする、付記7に記載の利用。
Claims (8)
- 環状ベクターである遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12において、
PBADプロモーターと、抑制タンパク遺伝子araCと、RP4伝達開始部位と、クロロマイセチン耐性遺伝子と、R6K複製開始部位と、マルチクローニング部位領域と、致死遺伝子vmi480と、を含み、
前記マルチクローニング部位領域は、少なくとも2つのAhdI酵素切断部位を含み、
前記致死遺伝子vmi480のヌクレオチド配列は、配列番号1の第21位−第617位の塩基配列に示され、
前記致死遺伝子vmi480は、PBADプロモーターの下流に位置し、PBADプロモーターに制御されることを特徴とする、
遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12。 - 前記遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12のヌクレオチド配列は、配列番号1に示されることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12。
- 線形ベクターである遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12Tにおいて、
請求項1に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12について、AhdIを用いてマルチクローニング部位領域における2つのAhdI酵素切断部位に対して酵素切断を行った線形ベクターが、当該遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12Tであることを特徴とする、
遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12T。 - 前記遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12Tのヌクレオチド配列は、配列番号2に示されることを特徴とする、請求項3に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12T。
- 請求項3に記載の遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12Tの遺伝子ノックアウトでの利用。
- 前記利用は、前記遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12Tのビブリオ遺伝子ノックアウトでの利用であることを特徴とする、請求項5に記載の利用。
- 目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片を遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターpLP12Tに連結して、目的遺伝子のフレーム内欠損結合断片を含むpLP12Tを取得してpLP12T−Xと命名し、pLP12T−Xが形質転換を介してドナー菌に入ってから、そのドナー菌を受容体菌に混合して、接合作用によりpLP12T−Xを伝達させて受容体菌に入れて、クロロマイセチン選択を介して、pLP12T−Xが受容体菌のゲノム標的部位に統合された目的遺伝子挿入突然変異型菌株を取得し、それから、当該目的遺伝子挿入突然変異型菌株を、アラブ糖でのvmi480遺伝子の誘導で生成された毒素Vmi480の逆方向での選択圧において、選別により、目的遺伝子を欠損したクローンを取得し、これにより、目的遺伝子のノックアウトを実施して目的遺伝子を欠損した菌株を取得することを特徴とする、請求項5に記載の利用。
- 前記受容体菌は、ビブリオであることを特徴とする、請求項7に記載の利用。
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