DK171215B1 - Plasmider med betinget ukontrolleret replikationstærskel samt fremgangsmåde til fremstilling af et genprodukt ved dyrkning af en mikroorganisme indeholdende et sådant plasmid - Google Patents

Description

DK 171215 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte plasmider, der er nyttige som klonings- og produktionsvektorer inden for rekombinant DNA-teknologiområdet, hvis replikationsopførsel er ukontrolleret under betingelser, der er gunstige derfor, samt en fremgangsmåde til fremstilling af genprodukter ved dyrkning af mikroorganismer indeholdende sådanne plasmider.

δ I Mol. Gen. Genet. 184. 1981, 56-61 er beskrevet, at replikationen af plasmidet RI styres af generne copA. copB og repA. Derimod er det ikke beskrevet, at der ved indsætning af en regulerbar promotor, der transskriberer ind i replikationsregionen, kan opnås en væsentlig forøgelse af plasmidkopitallet.

Plasmider med betinget ukontrolleret replikationsopførsel (såkaldte runaway-plasmider) er 10 kendte fra & beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 78101877.5. Disse plasmiders replikation er temperaturafhængig, idet plasmideme har et kontrolleret, konstant, lavt kopital, når værtsbakterier, som bærer plasmideme, dyrkes ved én temperatur, fx en temperatur på ca. 30°C, og et ukontrolleret kopital, når værtsbakterierae dyrkes ved en anden temperatur, & en temperatur over ca. 36°C.

15 De plasmider, der er beskrevet i ovennævnte patentansøgning, blev isoleret ved kemisk mutagenisering af plasmidet RI, som er et vildtypeplasmid, som vides at replikere autonomt i Escherichia coli. Mutageniseringen blev udført i to trin, idet det første trin omfattede isoleringen af en plasmidbærende bakterieklon, i hvilken plasmidkopitallet var ca. 1-2 ved 30°C og 4-5 gange højere ved 40°C, og det andet trin omfattede isoleringen af en bakterieklon, i hvilken plasmidet 20 havde et ukontrolleret kopital ved den højere temperatur. Plasmideme, som udviste runaway-opførsel, var således dobbeltmutanter af stamplasmidet.

I den ovennævnte patentansøgning blev der også beskrevet miniplasmider, som er nyttige som kloningsvektorer, fordi de relativt let kan transformeres til værtsbakterier som følge af deres lille størrelse. Disse miniplasmider har bevaret de gener, som er ansvarlige for den temperatur-25 afhængige runaway-replikationsopførsel.

Som klonings- og produktionsvektorer kan de plasmider, som beskrives i ovennævnte patentansøgning, anvendes til at udvinde genprodukter af indsatte fragmenter af fremmed DNA.

Pias midernes temperaturafhængige replikation kan udnyttes til at fremstille amplificerede mængder af genprodukter fra DNA-fragmenter af fe eukaiyot oprindelse. En sådan amplifi-30 kation af genprodukt har ikke været mulig med de konventionelle plasmid DNA-amplifikations-teknikker, som fe virker ved tilsætning af chloramphenicol til dyrkningsmediet, idet tilstedeværelsen af chloramphenicol får proteinsyntesen til at standse.

2 DK 171215 B1

De plasmider, som beskrives i ovennævnte patentansøgning, kan fordelagtigt anvendes som klonings· og produktionsvektorer i tilfælde, hvor et indsat fremmed gen koder for et produkt, som er skadeligt for den bakterie, hvortil plasmiderne transformeres, da plasmiderne ved lave temperaturer har et lavt kopital og som følge deraf kun ringe genudtrykkelse. Dette betyder, at 5 det under opformeringstrinnet for kulturen, som udføres ved lave temperaturer, ikke er sandsynligt, at bakterierne tager skade.

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte plasmider, som bærer i det mindste én regulerbar promotor, som er indsat på en sådan måde, at transkription derfra regulerer plasmid-replikation. Opfindelsen angår plasmider, i hvilke den regulerbare promotor forårsager væsent-10 ligt forøget eller ukontrolleret replikation, når værtsmikroorganismer, som indeholder plasmiderne, dyrkes under betingelser, der sikrer forøget transkription fra promotoren. Plasmiderne er nyttige som klonings- og produktionsvektorer.

Det er kendt at indsætte en regulerbar promotor for at kontrollere udtiykkelsen af et strukturgen, som er indsat i plasmidet, og som koder for et ønsket genprodukt. Det formodes imidlertid 15 at være hidtil ukendt at indsætte en regulerbar promotor i plasmider, ved hvis hjælp det er muligt at regulere antallet af dannede plasmidkopier.

I et første aspekt angår opfindelsen et plasmid, der er nyttig som en kloningsvektor og som har en størrelse i området ca. 2,5 - 15,0 x 106 daltons, hvilket plasmid han a) en indsat regulerbar promoter i en stilling og i en retning, der tillader transkription fra 20 promotoren ind i replikationsregionen; b) replikationsregion omfattende et gen, der koder for en genprodukt, som er positivt nødvendigt for replikation, idet forøget transkription fra den regulerbare promotor fører til et forøget niveau af genproduktet, som er positivt nødvendigt for replikation, idet det forøgede niveau resulterer i en plasmidreplikationshastighed, som er højere end værtscellens væksthastighed, hvilket fører til et forøget plasmidkopital, som sædvanligvis 25 efter 4-5 celledelinger vil være forøget med en faktor på 25-1000.1 nærværende beskrivelse og krav betegner udtrykket "regulerbar promotor" en promotor, hvis aktivitet med hensyn til den hyppighed, hvormed transkriptionen indledes, kan reguleres ved at tilpasse de betingelser, hvorunder værtsmikroorganismer, som indeholder de promotorbærende plasmider, dyrkes. En sådan regulerbar promotor kan fx være en fremmed promotor, dvs. en promotor, som ikke 30 naturligt er knyttet til det plasmid, i hvilket den er indsat. Promotoren kan i sig selv være regulerbar som følge af en bestemt DNA-struktur inde i promotorområdet. Et eksempel på en sådan promotor er den promotor, som findes i de kendte runaway-plasmider (jfr. beskrivelsen nedenfor). Alternativt kan promotoren være kontrollerbar ved hjælp af en regulerende faktor, som enten kan udøve positiv kontrol, dvs. plasmidet opnår ikke ukontrolleret replikation, 35 medmindre promotoren induceres positivt, fx ved at tilsætte et inducerende stof til det medium, 3 DK 171215 B1 hvori værtscellerne dyrkes, eller den regulerende faktor kan udøve negativ kontrol. Sidstnævnte type af kontrollerende faktor er også kendt som en repressor, hvis aktivitet også kan reguleres ved hjælp af en tilpasning af værtscellernes vækstbetingelser. Repressorgenet kan være anbragt på selve plasmidet sammen med promotoren, på et separat plasmid i samme værtsmikroor-5 ganisme eller på værtsmikroorganismens kromosom. Repressorgenet koder for et produkt, der inhiberer transkription fra den indsatte promotor, således at replikationen holdes på et lavt, konstant niveau. Når repressoren af en eller anden grund bliver inaktiveret, findes der ingen sådan kontrol, og transkriptionen forøges.

Medmindre andet er angivet, skal udtrykket "promotor", som det anvendes i nærværende 10 beskrivelse og krav, sædvanligvis omfatte både en promotor, hvis aktivitet i sig selv reagerer på ændringer i værtscellernes vækstbetingelser, og en promotor, som kontrolleres af en regulerende faktor. Udtrykket "et plasmid, i hvilket der er indsat en regulerbar promotor" skal også omfatte plasmider ifølge opfindelsen, i hvilke promotoren og det af promotoren regulerede replikon er blevet indsat på det samme DNA-fragment, hvor promotoren og replikonet i sidste instans 15 stammer fra forskellige kilder; dette betyder, at promotoren på et eller andet trin under konstruktionen af det ønskede slutplasmid er blevet indsat i det plasmid, hvorfra replikonet stammer. Udtrykket "væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital" skal henvise til det forhold, at når betingelserne for dyrkning af værtsmikroorganismeme ændres for at sikre forøget transkription fra promotoren, således at plasmidet mister sin replikationskontrol, forøges 20 plasmidkopitallet eksponentielt med en generationstid på ca. 40-50%, eller mindre, af den mikrobielle populations generationstid. Denne forøgelse fortsætter, indtil værtscellen ophører med at vokse, sædvanligvis efter 4-5 celledelinger eller mindre, på hvilket stadium indholdet af plasmid DNA i cellen er ca. 40-70% af den samlede mængde DNA, dvs. plasmidkopitallet forøges med en faktor på ca. 25-1000 eller endog mere. Med andre ord når plasmidkopitallet ikke et 25 stabilt niveau. Denne type ukontrolleret replikationsopførsel betegnes også "runaway"-opførsel.

Den viden om Rl-type plasmiders replikationskontrolprincip, som nærværende opfindere for nylig har opnået, udnyttes til konstruktion af plasmider ifølge opfindelsen (en yderligere forklaring af dette princip er angivet i afsnittet "DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN"). Når en regulerbar promotor indsættes i plasmidet i overensstemmelse med 30 opfindelsens princip, kan forøget transkription fra promotoren, som fører til et væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital, fx forårsages af derepression af promotoren. Dette betyder, at et repressorgen, som er indsat sammen med promotoren, og som koder for et genprodukt, der kontrollerer promotoren under visse betingelser, bliver inaktiveret under andre betingelser, således at transkription fra promotoren ikke længere inhiberes, hvilket i sidste instans medfører 35 et ukontrolleret plasmidkopital.

4 DK 171215 B1

Dette udgør en væsentlig forbedring sammenlignet med de kendte runaway-plasmider, der under varierende betingelser kan udvise forskelle i deres replikationsegenskaber. Der er ingen tegn på, at dette er tilfældet med plasmiderne ifølge opfindelsen, da den fremmede promotor, der indsættes, sædvanligvis vil være en promotor, der er så stærk (dvs. hyppigheden af 5 transkriptionsindledning er høj), at sådanne skiftende betingelser er uden virkning.

En af de betingelser for dyrkning, som gør det muligt at regulere den regulerbare promotors aktivitet, er den temperatur, ved hvilken værts mikroorganismerne dyrkes. Promotorens aktivitet kan i sig selv være temperaturafhængig, dvs. reagere over for temperaturforandringer under dyrkning, eller den regulerende faktor kan være temperaturfølsom, & en temperaturfølsom 10 repressor.

Den regulerbare promotor kan være en promotor fra bacteriophagen λ, som kan indsættes som en del af et DNA-fragment, som derudover bærer genet for en temperaturfølsom λ d-repressor, der kontrollerer transkription fra promotoren. λ-Promotoren kan enten være λΡΒ eller XPL, især λΡΒ. Imidlertid kan andre promotorsystemer, som indsættes i plasmiderne i overensstemmelse 15 med opfindelsens princip og under indflydelse af andre ydre faktorer end temperaturen, også anvendes, såsom promotorer, som kan induceres med kemikalier eller reguleres ved hjælp af metabolitter såsom lac-, tro- og deo-promotorer.

En foretrukken udførelsesform for plasmidet ifølge opfindelsen er en udførelsesform, hvor promotorens reguleringssystem medfører en temperaturafhængig replikationsopførsel hos 20 plasmidet. Især er den temperatur, ved hvilken plasmidet har et væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital, en temperatur, som er højere end den temperatur, ved hvilken kopitallet er lavt. Plasmider ifølge opfindelsen, som bærer en regulerbar promotor, hvis tran-skriptionsmønster er temperaturafhængigt, & som følge af tilstedeværelsen af en temperaturfølsom repressor, har et konstant, lavt kopital ved én temperatur såsom en temperatur på ca.

25 30°C, fordi promotoren ved denne temperatur er undertiykt, og transkriptionen derfra holdes følgelig på et lavt niveau, og et væsentligt forøget eller ukontrolleret kopital ved en højere temperatur såsom en temperatur i området ca. 36-42°C, da reguleringssystemet bliver inakti-veret i dette temperaturområde, hvilket medfører derepression af promotoren og følgelig forøget transkription fra promotoren. Det foretrækkes, at runaway-replikation opstår ved temperaturer 30 over ca. 39°C.

I nedenstående beskrivelse henvises der kun til plasmider, hvis replikation kontrolleres af et reguleringssystem, som er temperaturfølsomt, især af en temperaturfølsom repressor, selv om det er klart, at andre typer betingelser, ved hvilke plasmidreplikation kan reguleres, også kan udnyttes på analog måde som beskrevet ovenfor.

5 DK 171215 B1

En type plasmid ifølge opfindelsen er et plasmid, i hvilket en regulerbar promotor er blevet indsat i stedet for en del af et naturligt replikationsregulerende gen i plasmidet. I nærværende beskrivelse og krav betegnes et sådant plasmid et type A plasmid. Når plasmidet er et derivat af plasmidet RI, er det regulerende gen, som slettes fra plasmidet, copB-genet som koder for én af 5 plasmidets naturlige replikationsinhibitorer. Sletningen af conB-genet medfører en lille, stabil forøgelse i plasmidkopitallet. Således har plasmidet et kopital på ca. 20-40, fortrinsvis 20-30 og især 20-25 kopier, pr. celle ved ca. 30°C. Når temperaturen hæves til ca. 40°C, inaktiveres den regulerbare promotors repressorfunktion imidlertid, og repbkationen bliver ukontrolleret, hvilket medfører et plasmidkopital i området mindst ca. 500-1000 kopier pr. celle, som bl.a. afhænger af 10 størrelsen af et eventuelt fremmed DNA-fragment, som er indsat i plasmidet (jo større DNA-fragmentet er, jo lavere er antallet af dannede plasmidkopier), virkningen af genprodukter af noget sådant fremmed DNA og/eller den mikrobielle stamme, hvortil plasmidet transformeres. I nogle tilfælde kan plasmidet imidlertid danne op til flere tusinde kopier pr. celle ved den højere temperatur. Hvorom alting er, er indholdet af plasmid DNA ved den høje temperatur i forhold 15 til det samlede DNA-indhold ca. 40-75%, sædvanligvis 50-60%.

En anden type plasmid ifølge opfindelsen er et plasmid med et kopital på ca. 3-5 kopier pr. celle ved én temperatur, såsom en temperatur på ca. 30°C, og et ukontrolleret kopital i området mindst 500-1000 kopier pr. celle, afhængigt af de ovennævnte faktorer, og i visse tilfælde op til flere tusinde kopier pr. celle ved en højere temperatur såsom en temperatur på ca. 42°C. Et 20 sådant plasmid kan fås ved at indsætte den regulerbare promotor oven for plasmidets naturlige replikationskontrolgen eller -gener. I nærværende beskrivelse og krav betegnes et sådant plasmid et type B plasmid. Hvad angår plasmid Rl-derivater, er den regulerbare promotor blevet indsat oven for både conB- og copA-genet, således at begge disse naturlige replikationsinhibitorer er blevet bevaret, hvilket får plasmideme til at udvise det ovennævnte kopital-25 mønster. Hvis plasmidet imidlertid er et plasmid, som mangler par-området (tilstedeværelsen på plasmidet af det område, som er ansvarligt for fordeling, har den virkning, at plasmidet nedarves stabilt; denne virkning kan tilskrives ét eller flere gener i nar-området), vil plasmidet gå tabt med en frekvens på ca. 1% pr. generation ved den lave temperatur på grund af det lave kopital ved den lave temperatur. Det kan derfor være en fordel at indsætte par-området i et sådant 30 plasmid for at sikre, at plasmidets runaway-replikation senere finder sted i alle celler i populationen.

Type B plasmidet har den yderligere fordel, at det har en stor kopitalsspredning. Da kopitallet ved den lave temperatur er meget lavt, er det muligt at indsætte fremmede gener i plasmiderne, hvis produkter er delvis toxiske (nedsætter væksthastigheden) eller endog dødelige for de 35 mikroorganismer, hvortil plasmidet er blevet transformeret. Dette er sommetider tilfældet med produkter fra eukaryote gener, som sædvanligvis er de produkter, som har størst interesse for fx 6 DK 171215 B1 medicinalindustrien. På grund af den lave replikationshyppighed ved den lave temperatur udtrykkes fremmede gener enten slet ikke eller kun i så små mængder, at cellerne ikke beskadiges deraf og kan dyrkes ved den lave temperatur under normale betingelser. Dette fremmer eller letter i høj grad fremgangsmåden til fremstilling af visse polypeptider, som hidtil slet ikke 5 har været mulig eller har været forbundet med store vanskeligheder.

En tredje type plasmid ifølge opfindelsen er et plasmid med et kopital i området ca. 0,5-1 kopi pr. celle (tallet 0,5 betyder, at replikationsfrekvensen er mindre end 1 pr. cellecyklus) ved én temperatur såsom en temperatur på ca. 30°C og et ukontrolleret kopital i området mindst ca. 500-1000 kopier pr. celle afhsengig af de ovennævnte faktorer og i visse tilfælde op til flere 10 tusinde kopier pr. celle ved en højere temperatur såsom en temperatur på ca. 42°C. Et sådant plasmid kan være et plasmid, som bærer den regulerbare promotor i replikationsområdet, hvorfra en del af et naturligt replikationsregulerende gen er slettet, hvilket gen derefter er blevet indsat uden for replikationsområdet, dvs. på et sted, hvor det ikke naturligt er placeret. I nærværende beskrivelse og krav betegnes dette plasmid et type C plasmid. Hvad angår plasmid 15 Rl-derivater, hvorfra copB-genet er hlevet slettet, genindsættes copB-genet ikke på dets oprindelige sted, men på EeoRI-stedet uden for replikationsområdet. Selv da influerer copB-in-hibitorproteinet plasmidets replikation, men på en sådan måde, at plasmidet udviser det ovennævnte kopitalmønster. Hvis plasmidet imidlertid er et plasmid, som mangler par-området går plasmidet tabt med en frekvens på ca. 5% pr. generation ved den lave temperatur på grund 20 af det ekstremt lave kopital ved den lave temperatur. Som følge heraf er det endnu mere fordelagtigt for denne type plasmid end for type B plasmiderae at indsætte par-området i plasmidet for at sikre, at plasmidets runaway-replikation senere vil finde sted i alle celler i populationen. Replikationsopførslen ved henholdsvis de lave og høje temperaturer og således fordelene ved at anvende dette plasmid ligner i øvrigt type B plasmidernes replikationsopførsel. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 I et andet aspekt angår opfindelsen et plasmid, i hvilket der udover den første regulerbare 2 promotor, som regulerer transkription fra replikationsområdet, er indsat en anden promotor på 3 en måde, som muliggør indsættelsen af et strukturgen, hvis udtrykkelse kontrolleres fra den 4 anden promotor. Denne anden promotor kan være kontrollerbar, dvs. det kan være muligt at 5 regulere dens funktion ved at tilpasse de betingelser, hvorunder værtscellen dyrkes, på til- 6 svarende måde som ved regulering af den første regulerbare promotor. For tiden antages 7 forskellige promotorer at være nyttige til dette formål såsom en lgc-promotor, trp-promotor. deo- 8 promotor, recA-promotor. XPL-promotor, etc. XPL-Promotoren kan vise sig at være særlig for 9 delagtig som en anden promotor, som kontrollerer udtrykkeisen af strukturgenet, da den også 10 reguleres af den temperaturfølsomme cl-repressor, hvorfor amplifikationsbetingelserne er de 11 samme, således at dyrkningen af værtscellerne forenkles, og produktamplifikation foregår 7 DK 171215 B1 samtidig med amplifikationen af plasmid DNA. Det skal bemærkes, at den anden promotor også kan være identisk med den første regulerbare promotor.

Den anden promotor kan indsættes i type A, type B og type C plasmider. Et sådant plasmid har et konstant, lavt kopital og meget ringe eller ingen genudtiykkelse ved ca. 30°C og et væsentligt 5 forøget eller ukontrolleret plasmidkopital og genudtiykkelse ved en temperatur i området ca. 36-42°C. Plasmidet har fortrinsvis et ukontrolleret plasmidkopital og en meget høj genudtiykkelse ved temperaturer over 39°C.

Plasmiderne ifølge opfindelsen kan anvendes som klonings- og produktionsvektorer, dvs. plasmider, der kan anvendes inden for rekombinant DNA-teknologiområdet med det formål at 10 fremstille en lang række produkter til tekniske eller medicinske formål, især polypeptider og proteiner eller fragmenter deraf, enzymer og ikke-proteinøse produkter af reaktioner af enzymer med en forbindelse i næringsmediet, produkter med lav molekylvægt såsom hormoner, og nukleinsyrer; produkter fra eukaryote gener, især pattedyrsgener, er særlig interessante. For at være nyttigt som klonings- og produktionsvektor er det en fordel, selv om det ikke er essentielt, 15 at plasmidet i det mindste for én restriktionsendonuklease har et unikt sted, som kan spaltes af denne endonuklease. Stedet bør være et sted, som ved indsætning af et fragment af fremmed DNA muliggør det resulterende rekombinante plasmid at replikere autonomt, og som tillader den regulerbare promotor, som er indsat i plasmidet, at regulere transkriptionen af replikations-området, hvilket, når transkriptionen fra denne promotor forøges, fører til et væsentligt forøget 20 eller ukontrolleret plasmidkopital. Restriktionssteder, som er placeret inde i replikationsområdet, er således ikke tilladelige som kloningssteder, da dette ville få plasmidet til at miste sine replikationsegenskaber.

Plasmidet ifølge opfindelsen konstrueres ved en fremgangsmåde, som omfatter indsætning af en regulerbar promotor i et plasmid på en sådan måde, at transkription fra denne promotor 25 regulerer replikationen, og identifikation af det således behandlede plasmid ved screening for de plasmider, som har et væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital, når transkription fra promotoren forøges. Når den regulerbare promotor er XPR) kan den indsættes ved at blande plasmid og phag DNA, kløve med en hensigtsmæssig endonuklease, varmeinaktivere og ligatere blandingen og transformere ligationsblandingen til en mikroorganisme.

30 Konstruktionen af sådanne plasmider kan foretages ved at indsætte promotoren tilfældigt forskellige steder på plasmidet. Ved screening for plasmider med ukontrolleret replikationsop-førsel under betingelser, som sikrer forøget transkription fra den regulerbare promotor, identificeres den korrekte indsætning. En enkel screening for sådanne plasmider omfatter analyse af de plasmidbærende cellers vækstegenskaber ved de forskellige betingelser. Mængden af plasmid DK 171215 Bl 8 DNA i værtscellerne kan måles på forskellige måder, især ved tyælp af agarosegelelektroforese på i og for sig kendt måde. Denne screeningsmetode udføres let og hurtigt.

I en specifik udførelsesform for opfindelsen, som går ud på konstruktion af type A plasmider, omfatter konstruktionsmetoden sletning af en del af et naturligt regulerende gen og dets 5 promotor, i tilfælde af copB-genet fra plasmidet RI ved spaltning med restriktionsendonukleasen Bglll. og indsætning af et DNA-fragment såsom et Bglll-fragment der omfatter den regulerbare promotor, på dette sted.

I en anden udførelsesform for opfindelsen, der går ud på konstruktion af type B plasmider, omfatter konstruktionsmetoden indsætning af den regulerbare promotor i plasmidet oven for det 10 naturlige replikationskontrolsystem, i tilfælde af plasmid Rl-derivater ved Bglll-stedet oven for copB-genet ved hjælp af delvis restriktion med Bglll, ligation og transformation til den pågældende mikroorganisme såsom E. coli. Alternativt kan plasmidet konstrueres ved at anvende type A plasmidet med det delvis slettede naturlige replikationsregulerende gen som udgangsmateriale og genindsætte det naturlige regulerende gen på dets oprindelige sted, i tilfælde af Rl-15 type plasmider ved genindsætning af copB-genet i Bglll-stedet.

En tredje udførelsesform for opfindelsen, som går ud på konstruktion af type C plasmider, omfatter indsætning - under anvendelse af type A plasmidet som udgangsmateriale - af et naturligt regulerende gen i et område af plasmidet, hvor det ikke er placeret i vildtypestamplas-midet, i tilfælde af Rl-type plasmider ved indsætning af copB-genet som et EcoRI-fragment på 20 EcoRI-stedet uden for plasmidets replikationsområde ved hjælp af restriktion med EcoRI. ligation og transformation.

En fjerde udførelsesform for opfindelsen omfatter indsætning af en anden promotor udover indsætning af den regulerbare promotor på et hensigtsmæssigt restriktionssted, som muliggør indsætning af et strukturgen, hvis udtiykkelse kan reguleres fra den anden promotor. Som 25 nævnt ovenfor må dette sted ikke være placeret inde i plasmidets replikationsområde.

Plasmiderne ifølge opfindelsen er miniplasmider, dvs. de er væsentligt mindre end deres vildtypestamplasmider. De har en størrelse i området ca. 2,5-15,0x10® daltons, ofte 2,5-10,0x10® daltons, sædvanligvis 4,0-12,5x10® daltons, især 4,0-5,0xl06 daltons.

De kendte runaway-plasmiders ukontrollerede replikationsopførsel afhænger tilsyneladende af 30 den bestemte bakteriestamme, hvortil de transformeres, det dyrkningsmedium, i hvilket bakterierne dyrkes, og det indsatte DNA. Denne afhængighed skyldes formodentlig, at de kendte plasmiders runaway-replikationsopførsel delvis er forårsaget af substitution af et enkelt 9 DK 171215 B1 nukleotid i copB-promotoren. hvilket forårsager en lille forøgelse i transkriptionshyppigheden, som kan være påvirket af miljøforandringer, hvad angår den anvendte bakterieart og -stamme og/eller dyrkningsmediet tillige med fremmed DNA, som er indsat i plasmiderne. Plasmiderne ifølge opfindelsen synes ikke at være tilsvarende begrænset, da den stærke fremmede promotor, 5 når den aktiveres/derepresseres, forøger transkriptionshyppigheden i en sådan grad, at sådanne forandringer er uden betydning. Disse plasmider kan følgelig transformeres til en lang række stammer og er også mere pålidelige at håndtere end de kendte runaway-plasmider.

Den foreliggende opfindelse omfatter også plasmider, som stammer fra andre vildtypeplasmider end RI, og/eller som findes i andre plasmidbærende mikroorganismer end E. coli. Man kan også 10 forestille sig muligheden af at konstruere et plasmid af den ovenfor beskrevne type, der kan holdes i mikroorganismer, som ikke i naturen indeholder plasmider. Flere forskellige mikrobielle plasmiders replikationssystem er blevet påvist at ligne hinanden på mange måder. Fx kræver alle kendte plasmider transkription, hvis replikation skal finde sted. Ved at udnytte opfindelsens princip er det muligt at overføre den ukontrollerede replikationsfænotype til andre plasmider, 15 således at plasmider, som allerede anvendes som kloningsvektorer og vides at fungere godt i en ønsket mikroorganisme, kan opnå runaway-opførsel. Ved at indsætte en regulerbar promotor, fx λΡχ, på et passende sted i sådanne plasmider på en sådan måde, at transkription fra denne promotor regulerer replikation, vil ukontrolleret replikation således finde sted under betingelser, som sikrer forøget transkription fra promotoren.

20 DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

Rl-type plasmiders replikationskontrolsystem

Det basale replikon

Indtil for nylig var Rl-1ype plasmiders replikationskontrolsystem ikke kendt. Det har nu vist sig, at den genetiske information, som er nødvendig for plasmid Ri-replikation og replikations-25 kontrol, bæres i et 2500 basepar langt område, som består af tre Pstl-fragmenter, som er placeret inde i resistensoverførselsfaktoren (Molin et al., J. Bact. 138. 1979, s. 70-79).

Dette område defineres som det basale replikon og indeholder fire vigtige elementer, tre gener (copA. copB og repA) og replikationsorigin (Molin et al., Microbiology. 1981, s. 408-411). Et fysisk, genetisk og funktionelt kort over det basale replikon er vist i fig. 1. Genet repA koder for 30 en funktion, som positivt behøves for replikation. Genproduktet (i henhold til DNA-sekvensen) er et protein på 278 aminosyrer og en molekylvægt på ca. 33.000 daltons (Rosen et al., Mol. Gen. Genet. 179. 1980, s. 527-537). Dette protein er ikke entydigt blevet identificeret, men evnen til at 10 DK 171215 B1 danne protein fra repA-genet er tydeligt blevet påvist ved anvendelse af translationelle genfusioner med lacZ-genet (Light & Molin, Mol. Gen. Genet. 184. 1981, s. 56-61). RepA-proteinets biokemiske funktion er endnu ikke blevet undersøgt fuldt ud, men RepA-proteinet formodes at være en replikationsinitieringsfiaktor.

5 Genet cqpA koder for et lille (80-90 nukleotider langt) ustabilt RNA-molekyle med en høj grad af sekundær struktur (dvs. det danner håmåleløkker) (Stougaard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78. 1981, s. 6008-6012). CopA-RNAet er en replikationsinhibitor; mutationer, som påvirker CopA-RNAets nukleotidsekvens, kan føre til et forøget kopital (cop-mutanter). DNA-sekvensana-lyse af copA-mutanter viser, at alle mutationer påfaldende er samlet i et løkkeområde inden for 10 5 basepar. Disse mutationer medfører en drastisk nedsættelse eller et fuldstændigt tab af inhibitoraktivitet mod vildtypeplasmidet. Det kan derfor konkluderes, at inhibitorens specificitet findes i løkken. Det er også påfaldende, at i alle de copA-mutanter, hvis nukleotidsekvens er kendt, er et cytosin i CopA-RNAet blevet erstattet med et uracil (eller i ét tilfælde med et adenin). Dette tyder stærkt på, at CopA-RNAet virker ved nukleinsyre/nukleinsyre-samvirken.

15 Denne konklusion støttes yderligere af, at selv de copA-mutanter, som har mistet al CopA-aktivitet mod vildtypeplasmidet, bevarer en vis CopA-aktivitet mod sig selv. Endvidere har vildtypens CopA-RNA som oftest nedsat inhibitorisk virkning mod copA-mutantplasmider. Som følge heraf er en copA-mutant ikke alene forandret i inhibitoren, men også i målet, copT: en enkelt basesubstitution fører således til, hvad der fænotypisk er en dobbeltmutant.

20 copB-Genet koder for et basalt protein på 86 aminosyrer med en molekylvægt på 11.000 daltons. Dette protein dannes i betydelige mængder. Sletning af copB-genet og dets promotor medfører en 8 ganges forøgelse i kopital; det konkluderes derfor, at copB-proteinet virker som replikationsinhibitor, dvs. som et negativt virkende kontrolelement i reguleringen af plasmidet Rl’s replikation (Molin et al., Mol. Gen. Genet. 181. 1981, s. 123-130).

25 En dobbeltmutant (copAcopB) er ubetinget dødelig for værtsmikroorganismen som følge af den såkaldte runaway-replikation. De to kontrolgenprodukter virker således synergistisk.

Transkriptionsaktivitet i det basale replikon

Der er tre transkriptionsindledningssteder i det basale replikon, copB-promotoren, repA-promotoren (Light & Molin, Mol, Gen. Genet. 184. 1981, s. 56-61) og promotoren for copA-genet 30 (Stougaard et al., op. cit.). Sidstnævnte transkriberer væk fra replikationsinitieringsstedet, hvorimod de to førstnævnte transkriberer hen imod replikationsinitieringsstedet. Som følge heraf transkriberes begge strenge i copA-området. CopB-transkriptet fortsætter forbi copB-genet, 11 DK 171215 B1 og dette transkript og det transkript, som starter ved repA-promotoren, transkriberer begge repA-genet.

Sletninger af copB-genet konstrueret ved restriktion med Bell! medfører et 8-10 gange forøget kopital af plasmidet RI. Dette er overraskende, da copB-genets promotor og den proksimale del 5 af copB-strukturgenet slettes, hvilket medfører 1) tab af copB-aktivitet og derepression af repA-promotoren og 2) tab af copB-promotorens bidrag til den samlede repA-udtrvkkelse. således at den derepresserede reoA-promotor effektivt overtager den totale repA-transkription fra copB-promotoren. Den totale effekt burde kun være en 2 ganges forøgelse i transkriptionshyppigheden af repA-genet da repA-promotoren har en styrke, som er 2 gange forøget i forhold til copB-10 promotoren.

Dette tilsyneladende paradoks forklares ved copA-genets aktivitet. CopA-RNA afsluttes i en normal afslutningsstruktur med en stilk, som ender i en serie U’er. CopA-RNA-kontrol af dannelsen af RepA-protein afhænger af en sådan korrekt afslutning. Hvis transkription af den modsatte streng er stærk (konvergerende transkription), nedsættes afslutningseffektiviteten.

15 Forøget transkription fra renA-promotoren medfører en forlængelse af CopA-transkriptet til ca. 150-200 nukleotider. Det forlængede CopA-transkript fungerer ikke som replikationsinhibitor, dvs. det er i det væsentlige inaktiveret, hvilket fører til en forøget mængde RepA-protein og sluttelig til et forøget plasmidkopital (Stougaard et al., EMBO Journal 1. 1982, s. 323-328).

Replikationskontrol 20 Produkterne fra to gener, cqpA og copB. kontrollerer negativt replikationen af plasmidet RI, dvs. de fungerer som replikationsinhibitorer. Ved konstruktion og analyse af repA-lac-fusioner kan det påvises, at de to cop-genprodukter virker ved negativt at kontrollere udtrykkeisen af repA-genet (Light & Molin, Mol. Gen. Genet. 184. 1981, s. 56-61). Plasmid Rl-replikation synes derfor at være kontrolleret af reguleringen af dannelsen af et protein, som positivt behøves for antage-25 ligvis indledning af plasmidets replikation.

Ved hjælp af lac-genfusioner er det også blevet påvist, at copA- og copB-produkterne har forskellige mål. Målet for CopB-proteinet er renA-promotoren. hvor det virker ved at inhibere transkriptionsindledningen. CopB-proteinet er imidlertid ude af stand til at gribe ind i transkription, som indledes oven for repA-promotoren. CopA-RNAet påvirker ikke transkription, men 30 virker på et post-transkriptionelt plan, dvs. ved at inhibere translation af RepA-mRNA.

12 DK 171215 B1

Runaway-mutantemes replication

Replikationssystemet af de plasmider, som er beskrevet i offentliggjort europæisk patentansøgning nr. 78101877.5, er i det væsentlige det samme som det, der er beskrevet ovenfor med hensyn til vildtype Rl-plasmiderne. Nylig forskning foretaget af nærværende opfindere har nu 5 delvis fastlagt årsagen til eksistensen af temperaturafhængige plasmidmutanter med runaway-replikationsopførsel. Som forklaret ovenfor kan forøget transkription hen imod repA-genet føre til inaktivering af CopA-RNA-molekylet. I de i ovenstående patentansøgning beskrevne runaway-mutantplasmider er copB-promotoren muteret ved substitution af et enkelt nukleotid i en sekvens, som vist: 10 a) Vildtypeplasmid 5’-......TTCTCAAGTCGCT...-3’ b) Runaway-mutant 5’-......TTCTCAAGTTGCT...-3’

De kursiverede bogstaver viser nukleotidsubstitutionen. Det viste område er RNA-polymerase-bindingsstedet.

Denne mutation viste sig at forårsage forøget transkription fra copB-promotoren. især ved højere 15 temperaturer.

Replikation af plasmider, som bærer en regulerbar promotor

Til konstruktion af plasmideme ifølge den foreliggende opfindelse er nærværende opfinderes nyligt erhvervede viden om vildtype Rl-plasmidernes replikationssystem blevet udnyttet. Replikationen af plasmideme ifølge den foreliggende opfindelse er imidlertid ikke gjort afhængig 20 af mutationer i plasmidet, som det er tilfældet med de runaway-plasmider, som er beskrevet i offentliggjort europæisk patentansøgning nr. 78101877.5.1 stedet er en fremmed promotor blevet indsat således, at transkription af replikationsområdet i det mindste delvis er kontrolleret fra denne promotor. Promotoren kan være regulerbar ved tilpasninger i de betingelser, hvorunder værtsmikroorganismerne dyrkes, og reguleringen af promotoraktiviteten kan udføres på 25 forskellig måde såsom ved at ændre dyrkningstemperaturen eller sammensætningen af vækstmediet.

Når den regulerbare promotor er en promotor, som er valgt blandt temperaturafhængige promotorer, er den fortrinsvis en promotor, som stammer fra bacteriophag λ såsom XPR eller XPL, især XPR. I phag λ kontrolleres PR-promotoren af cl-repressoren, der i overensstemmelse 30 med opfindelsens principper fås fra phag λ sammen med XPR og indsættes i et plasmid i form af et Bglll-fraement (jfr. de i fig. 4-11 viste plasmidkort). Vildtype cl-repressoren er ikke i sig selv 13 DK 171215 B1 temperaturfølsom, så for at gøre replikationssystemet regulerbart ved hjælp af tilpasninger i dyrkningstemperaturen er den specifikke cl-repressor, som anvendes (jfr. nedenstående eksempler), temperaturfølsom, indkodet af mutantallelen cl0t.„ (Sussman & Jacob, Compt.

Rend. Acad. Sci. 254. 1962, s. 1517). Repressoren er aktiv, dvs. den represserer XPR-promotoren, 5 ved lave temperaturer såsom en temperatur på ca. 30°C, hvorimod den ved højere temperaturer såsom temperaturer over ca. 39°C denatureres, hvilket forårsager en inaktivering af repressor-funktionen og derepression af XPR. Da den indsatte promotor er meget stærk, medfører dette en drastisk forøget transkription hen imod repA. hvilket på sin side fører til ukontrolleret plasmid-replikation.

10 Alternativt kan reguleringen af promotoren udføres ad kemisk vej, dvs. ved at tilpasse sammensætningen af det medium, hvori værtsmikroorganismerne dyrkes, enten ved at tilsætte et kemikalie, som inducerer promotoren, fis ved at forårsage inaktivering af repressoren, som kontrollerer promotoraktivitet, og som følge heraf derepression af promotoren eller ved at sikre dannelsen af en promotorinducerende metabolit førende til aktivering af promotoren. Et specifikt 15 eksempel på en kemisk inducerbar promotor er deo-promotoren fra E. coli. som er underkastet negativ kontrol fra to kromosomale repressorproteiner, nemlig produkterne af deoR- og cvtR-generne. deo-Promotoren kan derepresseres ved tilsætning af cytidin til vækstmediet, eftersom cytidin virker ved affinitet til repressoren og forårsager en konformationsændring deraf, således at den ophører med at fungere som repressor. Desuden kan der udøves positiv kontrol med 20 udtrykkeisen fra deo-promotoren via effekten af katabolitrepression. Aktivering af crp (katabo-litrepressorprotein)-proteinet ved hjælp af cyklisk AMP (cAMP) fører til stimulering af deo-promotoraktiviteten; høje cellulære niveauer af cAMP vides at være forbundet med lave niveauer af glucose eller mangel på glucose i vækstmediet, hvilket kan opnås ved kun at tilsætte en begrænset mængde glucose til mediet, & en mængde på ca. 0,01% sammen med en anden 25 carbonkilde såsom glycerol eller succinat. Når glucosen er forbrugt af cellen, aktiverer den resulterende forøgelse i det intracellulære niveau af cAMP deo-promotoren. hvilket medfører en forøget replikationshyppighed af det plasmid, som bærer promotoren. Hvis deo-promotoren således indsættes oven for copB-genet i et plasmid RI-derivat, fører induktion af promotoren til forøget eller fuldstændig ukontrolleret replikation. Den ukontrollerede replikationsopførsel kan 30 vendes ved at tilsætte glucose til vækstmediet, således at plasmidets kopital langsomt nedsættes til præ-induktionsniveauet. Et andet eksempel på en kemisk regulerbar promotor er lac-promotoren, som induceres af tilstedeværelsen af lactose i næringsmediet, hvilket medfører forøget eller ukontrolleret replikation. Også i dette tilfælde kan processen vendes ved at dosere den mængde lactose, der sættes til mediet, således at det til sidst er forbrugt af cellerne.

35 Indsætning i den korrekte position og orientering af et DNA-fragment, som bærer en regulerbar promotor i stedet for en del af et naturligt replikationsregulerende gen, fe i stedet for BgllT- 14 DK 171215 B1 fragmentet, som dækker en del af conB-eenet på plasmid Ri, fører til et plasmidderivat, hvis replikationshyppighed i det mindste delvis kontrolleres af den indsatte promotor (et type Λ plasmid).

Indsætning i den korrekte orientering af et DNA-fragment, som bærer en regulerbar promotor, 5 umiddelbart oven for det naturlige replikationsregulerende gen, hvilket er copB-genet i tilfælde af plasmid Rl-derivater, fører til et plasmid med lidt andre replikationsegenskaber (et type B plasmid).

Som nævnt ovenfor går type B plasmider, som mangler par-området tabt med en frekvens på ca. 1% pr. generation. Uden udvælgelse for tilstedeværelsen af plasmiderne i en kultur, går 10 plasmidet til sidst tabt fra celler, som dyrkes ved ca. 30°C. For at stabilisere plasmidet er det muligt at indsætte et DNA-fragment som bærer et par-område fra fx et vildtype Rl-plasmid i et type B plasmid, hvilket medfører fuldstændig stabilitet (intet tab) af plasmidet fra celler, som dyrkes under tilsvarende betingelser. Plasmidstabilitet kan bestemmes ved først at dyrke celler, som indeholder type B plasmider, i hvilke der er indsat lac-gener tillige med par-området og 15 som kontrol celler, der indeholder type B plasmider, der bærer lac-generne, men ikke par-området, selektivt på plader indeholdende et antibiotikum (over for hvilket plasmiderne medierer resistens) for at sikre tilstedeværelsen af begge slags plasmider i udgangskolonierne. Prøver af begge kolonier stryges derefter ud på plader, som ikke indeholder noget antibiotikum, således at cellerne lades vokse uden selektion i et antal generationer (celledelinger) såsom & 25 20 generationer. Endelig stryges celler fra begge de resulterende kolonier ud på McConkey-lac-toseindikatorplader, hvor de celler, som oprindeligt indeholdt plasmider bærende par-området danner røde kolonier, hvilket viser, at plasmiderne er blevet bevaret hvorimod kontrolcellerne, som oprindeligt indeholdt plasmider uden par-området danner både røde og farveløse kolonier, hvilket betyder, at plasmiderne er gået tabt fra nogle af cellerne i løbet af den selektionsfrie 25 periode. Det er således vist, at plasmider, i hvilke par-området er blevet indsat er blevet fuldstændigt stabile (jfr. eksempel 11). Denne stabiliserende virkning er særlig vigtig, hvis et indsat DNA-fragment forårsager en nedsættelse af de plasmidbærende cellers væksthastighed sammenlignet med plasmidfri celler.

Endelig medfører indsætning af et DNA-fragment, som bærer det naturlige replikations-30 regulerende gen, såsom copB-genet på plasmid RI, i et sted uden for et type A plasmids replika-tionsområde, at der fås et plasmid med særlige replikationsegenskaber (et type C plasmid).

Ønskværdigheden af plasmidstabilitet, som er beskrevet ovenfor med hensyn til type B plasmider, er endnu mere udtalt, når det drejer sig om type C plasmider, eftersom disse som nævnt ovenfor har et endnu lavere kopital ved den lave temperatur og derfor går tabt med en 15 DK 171215 B1 højere frekvens end type B plasmider, hvis de mangler par-området. Type C plasmiderne kan stabiliseres tilsvarende ved at indsætte par-området i plasmiderne i tilfælde af plasmider, hvor det ikke allerede er til stede.

I henhold til et særligt aspekt af opfindelsen bærer plasmidet udover den første regulerbare 5 promotor en anden promotor, som er anbragt uden for replikationsområdet, hvilken promotor regulerer udtrykkeisen af et indsat fremmed strukturgen, som fx koder for et ønsket polypeptid. Denne yderligere promotor kan fx være cl-promotoren, som er placeret på det fragment, som desuden bærer XPR-promotoren og cl-genet, hvilken cl-promotor kontrolleres af cl-genproduktet og transkriberer i den modsatte retning af λΡβ. Neden for cl-promotoren er det muligt at 10 indsætte et strukturgen, hvis udtiykkelse kan reguleres af denne promotor. Fx er lac-gener (kendt som lac-operon), der mangler lac-promotoren, blevet indsat neden for d-genet, og den opnåede genproduktamplifikation tyder på, at transkriptionen af lac-geneme i det mindste delvis er kontrolleret af cl-promotoren (jfr. eksempel 8). Herved blev det påvist, at det er muligt at anvende plasmiderne ifølge opfindelsen som kloningsvektorer for indsætningen af et fremmed gen.

15 cl-Promotoren har den fordel, at den også kan reguleres af cl-repressoren, således at amplifika-tion af genproduktet finder sted samtidigt med amplifikation af plasmid DNA.

Den anden promotor kan også være en λ promotor såsom XPL, eller den kan være en recA-promotor. Når den anden promotor er XPL, kan den indsættes i plasmidet som et BamHI-Bglll-fragment fra phag λ, hvorved der dannes et hensigtsmæssigt kloningssted (BamHD til ind-20 sætning af DNA-fragmenter, som genereres af flere restriktionsenzymer såsom BamHI. Bgin. Sau3A og Bell. XPL kan også indsættes på et hensigtsmæssigt DNA-fragment fra et plasmid, som bærer promotoren. XPL er fordelagtig som en anden promotor, fordi den også kontrolleres af den temperaturfølsomme cl-repressor, således at amplifikationsbetingelserne er de samme.

Hvis promotoren derimod er recA, kan den indsættes i plasmidet ifølge opfindelsen som et 25 BamHI-fragment fra fx pBEU14 (Uhlin og Clark, J. Bact. 148. 1981, s. 386-390). Denne promotor fungerer på forskellige måder afhængig af den mikrobielle stamme, hvortil det recA-promotorbærende plasmid er blevet transformeret. I en recA-stamme kontrolleres recA af lexA-repressoren, som er anbragt på mikroorganismens kromosom. Ved fx en temperaturinduktion af ukontrolleret replikation forøges plasmidets kopital og dermed antallet af recA-promotorer 30 gradvis. Da lexA-repressoren kun dannes i små mængder og fungerer ved at binde tæt til recA-promotorområdet, vil den forhåndenværende mængde af lexA-repressor gradvis blive titreret, når kopitallet stiger. Således foregår der en gradvis derepression af recA og når plasmidkopi-tallet bliver højere, forøges transkriptionen fra recA tilsvarende.

Plasmiderne ifølge opfindelsen som klonings- og produktionsvektorer 16 DK 171215 B1 I deres egenskab som klonings- og produktionsvektorer har plasmideme ifølge opfindelsen en række karakteristiske egenskaber: 1) Plasmideme er små med en molekylvægt på ca. 4,0-12,5x10® daltons. Den lille størrelse letter håndtering og forbedrer transformationseffektiviteten.

5 2) Plasmideme har et antal unikke steder for restriktionsendonukleaser. Udtrykket "unik" betegner, at for en specifik restriktionsendonuklease har plasmidet ét og kun ét sted, som kan spaltes af enzymet.

Som allerede nævnt er restriktionssteder, som er placeret inde i replikationsområdet, ikke tilladelige som kloningssteder. I de plasmider, som er beskrevet i nedenstående eksempler, 10 er restriktionsstederne Sall og PstI således ikke egnede som kloningssteder, da de er placeret i plasmidets replikon, hvorimod restriktionsstederae EcoRI og BamHI ikke er placeret i dette kritiske område og således udgør nyttige steder til indføring af fremmed DNA. Hvis et hensigtsmæssigt restriktionssted ikke findes på selve plasmidet, kan det konstrueres ved at indsætte et lille DNA-fragment (kendt som en linker), som indeholder 15 et sådant sted, i plasmidet som beskrevet i eksempel 4.

For at sikre udtrykkeisen af det indsatte strukturgen er det imidlertid også nødvendigt at have et hensigtsmæssigt translationsstartsignal (ribosombindingssted) anbragt oven for selve strukturgenet, men neden for den anden promotor. En måde, hvorpå man kan sikre tilstedeværelsen af ribosombindingsstedet, er at indsætte forskellige DNA-fragmenter (fx 20 som linkere), der kan fremstilles syntetisk, og som hver især bærer translationsstartsigna let for et forskelligt strukturgen. Alternativt kan et DNA-fragment, som bærer et gen, der allerede vides at blive udtiykt i mikroorganismer, indsættes i runaway-kloningsvektoreme in toto. hvorved man sikrer sig tilstedeværelsen af det korrekte translationsstartsignal.

3) Selv om det som nævnt ovenfor er en fordel at have en så lille kloningsvektor som muligt, 25 er det til mange formål praktisk, at kloningsvektoren bærer gener til udtrykkelse af en såkaldt markør, som er nyttig til identifikation og/eller udvælgelse af celler, som bærer plasmidet. Den mest anvendelige markør er antibiotikaresistens, & ampicillinresistens, da denne efter behandling for transformation af et rekombinant plasmid til en mikrobiel vært muliggør en let mod-selektion af mikroorganismer, som ikke har modtaget det rekombi-30 nante plasmid. En anden markør, som findes i alle de i nedenstående eksempler be skrevne plasmider, er λ-immunitet, som indkodes af cl-genet. En yderligere nyttig egenskab ved plasmider ifølge den foreliggende opfindelse kan være tilstedeværelsen af et gen, som medierer en selekterbar fænotype, i hvilket der er placeret et unikt restriktions- 17 DK 171215 B1 sted. Indsætning af et DNA-fragment på dette sted medfører indsætningsinaktivering af genet. Et eksempel herpå er beskrevet i eksempel 9 med hensyn til det gen, som medierer Lac+-fænotypen, og eksempel 12 med hensyn til det gen, som indkoder chloramphenicol -resistens. Når det ønskes at indføre en markør, & antibiotikaresistens, i et plasmid ifølge 5 opfindelsen, som skal anvendes som kloningsvektor, kan dette gøres ved transposition eller ved at indsætte et fremmed DNA-fragment på i og for sig kendt måde. Et eksempel på en sådan transposition er vist i eksempel 4.

Dyrkningsmetoder

Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde til fremstilling af et genprodukt af 10 plasmid DNA, hvilken fremgangsmåde omfatter dyrkning af mikroorganismer, som bærer et plasmid som beskrevet ovenfor, i hvilket der er blevet indsat en regulerbar promotor på en sådan måde, at transkription regulerer replikation, især på en sådan måde, at forøget tran-skription fra denne promotor fører til et væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital, idet fremgangsmåden omfatter i det mindste en dyrkningsperiode under betingelser, som sikrer 15 forøget transkription fra den regulerbare promotor førende til et forøget niveau af det genprodukt, der er positivt nødvendig for replikation, hvilket forøgede niveau resulterer i en plasmid-replikationshastighed, som er højere end værtscellens væksthastighed, hvilket fører til et forøget plasmidkopital, som sædvanligvis efter 4-5 celledelinger vil være forøget med en faktor på 25-1000 eller ukontrolleret plasmidkopital, og udvinding af et genprodukt af plasmidet fra den 20 mikrobielle kultur. Selve dyrkningen udføres hensigtsmæssigt under anvendelse af sædvanlige teknikker, herunder sædvanlige næringsmedier, som vides at være optimale for den pågældende mikrobielle art. Udvindingen af genproduktet udføres også i henhold til velkendte metoder, som er tilpasset det bestemte fremstillede genprodukts identitet og egenskaber, værtsmikroorganismens egenskaber, etc. Den foreliggende opfindelse angår endvidere en fremgangsmåde til 25 dyrkning af værtsmikroorganismen, hvortil plasmidet ifølge opfindelsen er blevet transformeret under betingelser, som medfører et konstant, lavt plasmidkopital i podnings- og opformeringstrinnene, indtil det ønskede antal celler er blevet opnået, hvorefter værtsmikroorganismen dyrkes under betingelser, som fører til et væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital.

Dyrkningen kan således indledningsvis udføres under betingelser, hvor eventuel transkription 30 fra promotoren ikke væsentligt influerer på plasmidets kopital, hvorefter et stof, som inducerer promotoraktivitet, sættes til dyrkningsmediet i en mængde, som fører til væsentligt forøget eller ukontrolleret replikation. Om ønsket kan disse dyrkningsbetingelser vendes efter et tidsrum, som er tilstrækkeligt til at opnå en væsentlig amplifikation af plasmidet, men tilstrækkeligt kort til at undgå nogen væsentlig beskadigelse af den mikrobielle kultur, idet stoffet fjernes fra 35 dyrkningsmediet, hvilket fører til en langsom nedsættelse af plasmidkopitallet, indtil det til sidst 18 DK 171215 B1 Dår præ-induktionsniveauet I denne forbindelse behøver udtiykket "flernes" ikke at betegne en fuldstændig fraværelse af det pågældende stof fra dyrkningsmediet men kun en nedsættelse i koncentrationen af stoffet til en mængde, hvor det ikke længere har nogen virkning.

I en alternativ fremgangsmåde, hvor der anvendes en promotor, som inhiberes snarere end 5 induceres af et bestemt stof, kan den mikrobielle kultur først dyrkes i nærværelse af det stof, som inhiberer aktiviteten af den bestemte promotor, der anvendes, hvorefter koncentrationen af stoffet nedsættes, fx ved at fortynde dyrkningsmediet eller ved, at det gradvis forbruges af cellerne, i en grad, som medfører aktivering af promotoren, hvorved der opnås et væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital. Om ønsket kan dyrkningsbetingelserne vendes efter et 10 tidsrum, som er tilstrækkeligt til at opnå en væsentlig amplifikation af plasmidet, men tilstrækkeligt kort til at undgå nogen væsentlig beskadigelse af den mikrobielle kultur, ved at tilsætte stoffet, som inhiberer promotoraktivitet, i en mængde, som fører til en langsom nedgang i plasmidkopital, til det når præ-induktionsniveauet.

De betingelser, hvorunder mikroorganismen dyrkes, kan også omfatte i det mindste en dyrk-15 ningsperiode ved eller nær ved en temperatur, ved hvilken plasmidkopitallet er væsentligt forøget eller ukontrolleret.

Hvis den regulerbare promotor er temperaturafhængig eller reguleret af en temperaturfølsom faktor, foretrækkes det, at opformeringen af den mikroorganisme, som er transformeret med et plasmid ifølge opfindelsen, til en kultur af produktionsstørrelse udføres ved eller nær ved den 20 temperatur, ved hvilken plasmidet har et konstant, lavt kopital for at undgå enhver inhibering af mikrobiel vækst på grund af en forøget plasmid- og genproduktkoncentration. Derefter kan temperaturen ændres til en temperatur, ved hvilken plasmidet har et væsentligt forøget eller ukontrolleret kopital. Efter en hensigtsmæssig produktionsperiode, ofte til væksten af mikroorganismen er blevet inhiberet på grund af dannelsen af plasmid DNA og/eller genprodukter fra 25 plasmidet, foretages udvindingen af genproduktet. Afhængig af de bestemte betingelser kan det være ønskeligt at udføre produktionsdyrkningen kontinuerligt ved en temperatur, der kun nærmer sig den temperatur, ved hvilken plasmidkopitallet er væsentligt forøget eller ukontrolleret, således at værtsmikroorganismens overlevelse og fortsatte vækst muliggøres samtidigt med dannelsen af forøgede mængder af et genprodukt af plasmidet (som derefter kontinuerligt 30 eller intermitterende kan udvindes fra kulturen på i og for sig kendt måde).

Alternativt kan mikroorganismen opformeres til en kultur af produktionsstørrelse ved den temperatur, ved hvilken plasmidkopitallet er konstant, hvorpå temperaturen ændres til en temperatur ved eller nær ved den temperatur, ved hvilken plasmidkopitallet er væsentligt forøget eller ukontrolleret, og denne temperatur opretholdes i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til 19 DK 171215 B1 opnå en væsentlig amplifikation af plasmidet, men tilstrækkeligt kort til at undgå nogen væsentlig beskadigelse af den mikrobielle kultur, hvorefter temperaturen igen ændres til en temperatur, som sikrer et lavt, konstant plasmidkopital, og produktionsdyrkning fortsættes ved denne temperatur, hvilket forårsager en langsom nedgang i plasmidkopitallet, indtil det når be-5 gyndelsesniveauet Denne dyrkningsmetode er særlig vigtig, når det fremmede gen, der indsættes i plasmidet, stammer fra en organisme, der ikke er levedygtig ved en temperatur på over ca. 30°, således at genprodukter fra et sådant gen kan blive denatureret ved højere temperaturer. Endvidere er udbyttet af genprodukt sædvanligvis højere, når denne dyrkningsmetode anvendes (jfr. eksempel 16; sammenlign Uhlin et al., Gene 6. 1979, s. 91-106, tabel II).

10 Den temperatur, ved hvilken plasmidkopitallet er væsentligt forøget eller ukontrolleret, kan være højere end den temperatur, ved hvilken plasmidet har et konstant, lavt kopital. Denne højere temperatur kan fe være en temperatur i området ca. 36-42°C.

TEGNINGSFORKLARING

Opfindelsen belyses nærmere under henvisning til tegningen, hvor 15 fig. 1 skematisk viser replikationsområdet for vildtypeplasmidet RI, fig. 2 er en forklaring af de symboler, som anvendes i de følgende figurer, og fig. 3-23 viser restriktionskort over de plasmider, som er beskrevet i eksemplerne.

Fig. 1 viser skematisk det basale replikon fra plasmidet RI, hvor de skraverede områder betegner de translaterede områder, de uudfyldte områder betegner transkripterne, og de stiplede 20 linjer betegner mulige transkripter. I cirklen viser forstørrelsen af hårnåleløkkerne den høje grad af sekundær struktur af CopA-RNAet. Ori betegner replikationsinitieringsstedet. De vandret anbragte pile betegner transkriptionsretningen.

Fig. 2 viser en forklaring af symbolerne, som anvendes i de følgende figurer, hvor A betegner DNA fra Rl-type plasmider; B betegner DNA fra bacteriophag λ (EDA4); C betegner DNA fra 25 Tn3-transposonen (fra EDATn3); D betegner DNA fra plasmidet pBR322; E betegner DNA fra plasmidet pMC871; F betegner DNA fra plasmidet pVH1424; G betegner DNA fra plasmidet pSKSl04; H betegner strukturgener og vigtige steder; I betegner en promotor med en indikation af transkriptionsretningen; og J betegner en målestok for plasmidemes størrelse. Det uudfyldte område betegner DNA fra plasmidet pBEU14.

30 Fig. 3-23 viser lineære restriktionskort over plasmiderne, som er beskrevet i eksemplerne, hvor genotyperne af de viste Rl-type plasmider er vist over den vandrette linie. Således betegner DK 171215 B1 20 copB et gen, der koder for et polypeptid, som represserer transkription fra repA-promotoren mellem copB- og copA-generne: copA betegner et gen, der koder for et RNA-molekyle, som inhiberer translation af RepA-mRNA; repA betegner et gen, der koder for et protein, som er nødvendigt for plasmid Rl-replikation; ori betegner det vegetative replikationsinitieringssted; 5 aphA betegner et gen, som indkoder resistens over for kanamycin; bla betegner et gen, som indkoder resistens over for ampicillin; lacA. lacY og lacZ betegner det indsatte lac-operon, hvoraf lacA koder for transacetylase, lacY koder for permease, og lacZ koder for β-galactosidase; cl0,„ betegner et gen, der koder for en temperaturfølsom repressor af XPR-promotoren; tnpR og tnpA betegner gener, der koder for Tn3-transpositionsfunktioner; par betegner det område, som er 10 ansvarligt for plasmidfordeling, recA betegner et gen, der koder for et rekombinationsprotein; og PrecA betegner recA-promotoren. Under den vandrette Urge vises stederne for restriktionsenzymerne, hvor P betegner PstI; B2 betegner BglH: Sj betegner Sall; E betegner EcoRI: H3 betegner HindHI; Bj betegner BamHI; S betegner Smal: B2Bj betegner en fusion af et Bglll-sted og et BamHI-sted; og C betegner Clal. I fig. 11 er det viste plasmid tegnet i samme målestok 15 som plasmiderne i de andre figurer, og den med klammer angivne indsætning betegner de indsatte lac-gener.

MATERIALER OG METODER

Den anvendte stamme af Escherichia coli K-12 var CSH50 (Δ pro-lac, rosL: jfr. J. Miller, Exnerimants in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratoiy, Cold Spring Harbor, New 20 York, 1972). Der anvendtes flere plasmider (tabel 1) og bacteriophager (tabel 2).

De anvendte forsøgsteknikker var standardteknikker, som anvendes inden for området mikrobiel genetik (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor, New York, 1972) og genetisk manipulation (Davis, Botstein og Roth, A Manual for Genetic Engineering: Advanced Bacterial Genetics. Cold Spring Harbor, New York, 1980).

25 Alle celler blev dyrket i LB-medium (Bertani, J, Bact. 62. 1951, s. 293) eller i A+B-mini- malmedium (Clark og Maaløe, J. Mol, Biol. 23. 1967, s. 99), og de anvendte plader var LA-plader indeholdende LB-medium og 1,5% agar. Fremstilling og analyse af plasmid DNA blev udført under anvendelse af "dye buoyant" densitetsgradientcentrifugering i henhold til den af Stougaard & Molin, Anal. Biochem, 118. 1981, s. 191 beskrevne metode. Mærkning af DNA og fremstilling 30 af lysater til bestemmelse af plasmidindhold blev udført i henhold til Molin et al., J. Bact. 138. 1979, s. 70. Det relative indhold af plasmid DNA blev målt som de mængder mærket thymidin, som var til stede i plasmidbåndet i forhold til de mængder mærket thymidin, som var til stede i kromosombåndet i gradienterne.

DK 171215 Bl 21

De restriktionsendonukleaser, som anvendes i eksemplerne, blev anvendt i henhold til fabrikantens anvisninger. Delvis restriktion blev udført med en 10 ganges fortynding af enzymerne.

Desuden anvendtes nedenstående screeningsmetoder: 1. Screening for λ-immunitet (immX + ) 5 I alle de beskrevne eksempler anvendes clgg^-mutantallelen. Plasmider, som bærer dette gen, gør K_coli-værtscellen resistent over for infektion med lytiske λ-phager ved 30°C. TU udvælgelse af resistente celler sættes mere end 108 Ab2-phagpartikler til pladerne, før bakterierne udsttyges. Overlevende kolonier testes yderligere for deres plasmidindhold.

2. Screening for codB+ 10 Genetiske fusioner mellem repA-promotoren og lac-operon’et, hvorfra lac-promotoren er blevet slettet, konstrueres og indsættes i et pl5-plasmid (pGA46). Et resulterende hybridplasmid, pJL217, er ansvarligt for en Lac+-fænotype, når det bæres af en Δ lac E. coli værtsstamme.

Lac+-fænotypen detekteres let på McConkey-lactoseindikatorplader (røde kolonier). TUstede-værelsen af et copB+ gen i celler, som bærer pJL217, resulterer i en Lac'*fænotype, som 15 optræder som hvide kolonier på indikatorpladerne. Således genfindes copB+ hybrider let som Lac"kolonier, når plasmid DNA transformeres til E, coli δ lac celler, som indeholder plasmidet pJL217.

TABEL 1

Anvendte plasmider 20

Plasmid Kilde pKN1562 S. Molin et al., J. Bact. 138. 1979, s. 70-79.

pBR322 F. Bolivar et al., Gene 2. 1977, s. 95.

25 pJL217 Konstrueret ved at indsætte et Sau3A-fragment fra pKN1562 bærende repA-promotoren i Bolstedet af pJL207, et hybridplasmid, som bærer lac-gener uden lac-promotoren.

pOUl6 Light & Molin, Mol. Gen. Genet. 184, 1981, 30 s. 57.

22 DK 171215 B1 pGA46 An & Friesen, J. Bact. 140, 1979, s. 400-407.

pMC903 Casadaban et al., J. Bact. 143. 1980, s. 971.

pMC871 Casadaban et al., od. cit.. s. 971.

pVH1424 Konstrueret af P. Valentin-Hansen ved indsæt- 5 ning af et Sau3A-fragment der bærer deo-pro- motoren fra plasmid pVH17 (Valentin-Hansen et al., EMBO J„ 1982, s. 317) i BamHI-stedet på plasmidet pMC1403 (Casadaban et al., op. -cit.. s. 971).

10 pSKS104 Konstrueret af M. Casadaban ved indsætning af et PvuII-fragment indeholdende lac-promotoren og translationsindledningsområdet fra pMl3mp7 (Messing et al., Nucleic Acids Res. 9.

1981, s. 309) i Smal-stedet på pMC1403, efter-15 fulgt af homolog rekombination mellem lacZ- segmenterne.

pKN184 Nordstr5m et al., Plasmid 4, 1980, s. 322.

pJL3 Molin et al., Mol. Gen. Genet. 181, 1981, s. 123- 130.

20 pVH1451 Valentin-Hansen et al., op, cit.

pBEU14 Uhlin & Clark, J, Bact. 148. 1981, s. 386-390.

pMC1403 Casadaban et al., J. Bact. 143. 1980, s. 971.

TABEL 2 25 Anvendte bacteriophager

Phag Kilde EDA4 Dempsey & Willetts, J. Bact. 126. 1976, s. 166.

30 EDXTn3 Nordstrom, Molin, Aagaard-Hansen, Plasmid 4.

1980, s. 215-227.

23 DK 171215 B1

Stamplasmider

Plasmidet pKN1562 er et derivat af plasmid Ri, som i alt væsentligt er konstrueret som beskrevet i Molin et al., "Clustering of Genes Involved in Replication, Copy Number Control, Incompatibility, and Stable Maintenance of the Resistance Plasmid Rldrd-19".

5 J. Bact. 138, 1979, s. 70-79, med undtagelse af nogle få modifikationer, som er tilføjet ved senere forskning. pKN1562 har en molekylvægt på 6,9xl06 daltons og følgende genotype: copA-k copB +. repA+. aphA-t-, Δ par (jfr. fig. 3). Det meddeler resistens over for kana-mycin. Plasmidet har vildtypeplasmidets replikationsegenskaber, et kopital på 3-5 pr. hurtigtvoksende celle og går tabt med en frekvens på 1% pr. generation som følge af 10 mangel på par-genet (genet for fordeling).

Ved restriktion af pKN1562 med Bglll for at slette en del af copB-genet og ligation af hæfteenderne konstrueres et andet plasmid, pJL20. Dette plasmids molekylvægt er c 6,7x10 daltons, og dets genotype er som følger: copA+. Δ copB. reoA+. aphA+. Δ par.

Plasmidet har et kopital på 25-40 pr. hurtigt voksende celle, og plasmidet går ikke tabt.

15 Også dette plasmid medierer resistens over for kanamycin.

Plasmidbetegnelse

Det skal bemærkes, at plasmiderne med betegnelsen pJEL... i eksemplerne og på tegningen i basisansøgningen er blevet omdøbt pOU... i nærværende ansøgning.

EKSEMPEL 1 20 Konstruktion og karakterisering af nOU51 DNA fra plasmidet pJL20 og phagen EDX4 blev fremstillet i henhold til standardmetoder. Plasmid- og phag DNA blev blandet i en slutkoncentration på 20 pg/ml af hver og i et slutvolumen på 100 μΐ, kløvet med Bglll i 30 minutter, varmeinaktiveret ved 70°C i 10 minutter og ligateret med T4 DNA ligase natten over ved 15°C. Alikvoter af ligations-25 blandingen blev transformeret til E. coli stamme CSH50. Transformanter blev udvalgt på plader, som indeholdt 50 pg/ml kanamycin, hvorpå en suspension med ca. 109 Xb2-partikler var blevet udstrøget. Pladerne blev inkuberet i 20 timer ved 30°C.

Overlevende kolonier blev på ny isoleret og testet for resistens over for Ab2 ved kiyds-strygning ved 30°C, for vækst ved 42°C ved udstrygning på kanamycinplader ved 42°C og 30 for plasmidmolekylvægt ved fremstilling af plasmid DNA og analyse på agarosegeler.

24 DK 171215 B1

Herved blev der fundet et plasmid, pOU51, som medierer resistens over for kanamycin og λ-infektion, gør værtsbakterien temperaturfølsom for vækst og har en indsætning af phag DNA i pJL20 svarende til ca. I,6xl06 daltons. Plasmidets samlede molekylvægt var 8,4xl06 daltons. Disse egenskaber bæres alle af plasmidet, eftersom nye E. coli-modtager-5 stammer får alle plasmidets fænotypiske egenskaber, når de transformeres med pOU51-DNA.

DNA blev fremstillet fra pOUSl og plasmidet kortlagt med restriktionsenzymer ved rensning af plasmid DNAet, spaltning med restriktionsenzym(er) og analyse af de resulterende fragmenter ved hjælp af agarosegelelektroforese (jfr, fig. 4). Herved blev det 10 indsatte l,6xl06 daltons lange fragment identificeret som et Bglll-fragment fra phag λ bærende cl-repressorgenet (ansvarligt for λ-immunitet ved 30°C) og λΡ^-promotoren, og orienteringen af det indsatte fragment blev bestemt til at være som vist i fig. 4. Det fremgår endvidere af restriktionskortet, at pOU51 har et unikt sted for restriktions-endonukleasen EcoRI. som gør det muligt at anvende plasmidet som kloningsvektor.

15 Plasmidets indvirkning på cellernes vækst blev undersøgt ved at dyrke en kultur i medium ved 30°C. På et tidspunkt, da væksten var eksponentiel, blev temperaturen ændret til 42°C, og cellevæksten overvåget (bestemt spektrofotometrisk). Kulturen ophørte med at vokse inden for 1,5-2 timers vækst ved 42°C.

Indholdet af plasmid DNA blev målt som beskrevet under MATERIALER OG METO-20 DER ud fra 10 ml’s kulturer, som voksede i A+B-minimalmedium beriget med 0,2% glucose og 1% casaminosyrer. En 10 ml’s kultur blev mærket med 50 pCi af 3H-thymidin ved 30°C, den anden modtog isotopen umiddelbart efter et temperaturskift til 42°C, indtil cellerne ophørte med at vokse. Det relative indhold af plasmid DNA var 2% ved 30°C svarende til 25-40 plasmidkopier pr. celle. Ved 42°C var det relative indhold mere end 25 50% svarende til over 1000 plasmidkopier pr. celle.

Dette plasmids egenskaber er vist i tabel 5.

Stammen E. coli CSH50/pQU51 er deponeret i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 Gottingen, som i det følgende er forkortet til DSM, under deponeringsnummeret 2467. Deponering af denne stamme og øvrige deponeringer 30 af mikroorganismer, som er omtalt i nærværende beskrivelse, er sket i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

EKSEMPEL 2

Konstruktion og karakterisering af dOU53 25 DK 171215 B1

Ved at anvende det i eksempel 1 beskrevne plasmid som udgangsmateriale og ved delvis restriktion af pOU51 med Hindlll blev titelplasmidet konstrueret, fra hvilket genet til 5 indkodning af kanamycinresistens var blevet slettet, men som havde bevaret genet for indkodning af λ-immunitet. Plasmidet blev transformeret til E. coli stamme CSH50. pOU53 havde en molekylvægt på 3,2xl06 daltons og følgende genotype: cqdA+. Δ codB. repA+. Δ par, immX + , Δ aphA.

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 5).

10 Det fremgår af restriktionskortet, at pOU53 har et unikt sted for restriktionsendonuklea-sen EcoRI, hvilket gør det muligt at anvende plasmidet som kloningsvektor.

For at påvise tilstedeværelsen af det ønskede plasmid i værtscellerne blev cellekulturer dyrket på plader, der indeholdt Xb2-phagpartikler, som beskrevet ovenfor for at teste for resistens over for λ-infektion. Cellerne blev yderligere testet for følsomhed over for 15 kanamycin ved replikaudpladning af kolonier på plader indeholdende 50 pg/ml kana- mycin. For at teste for temperaturfølsom vækst blev cellerne udstrøget på plader ved 42°C og dyrket som beskrevet i eksempel 1.

Da indholdet af plasmid DNA blev målt på den i eksempel 1 beskrevne måde, viste cellerne sig at indeholde 20-40 plasmidkopier ved 30°C og mere end 1000 plasmidkopier 20 ved 42°C. Der var intet tab af plasmidet.

Dette plasmids egenskaber er vist i tabel 5.

Stammen E. coli CSH50/pOU53 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2468. EKSEMPEL 3

Konstruktion og karakterisering af pOU56 25 Ved in vivo indsætning af Tn3-transposonen fra en X::Tn3-phag, som indeholdt generne for transposition og ampicillinresistens (β -lactamase) (Nordstrom, Molin og Aagaard-Hansen, Plasmid 4. 1980, s. 215-227), i pOU53 blev titelplasmidet konstrueret. Plasmid DNA blev isoleret fra en stamme, som bar λ Tn3-phagen i kromosomerne og plasmidet pOU53. Plasmid DNAet blev transformeret til E. coli stamme CSH50, idet der blev 26 DK 171215 B1 udvalgt for ampicillinresistens og λ-immunitet. pOU56 havde en molekylvægt på 6,5xl06 daltons og følgende genotype: copA+. Δ copB. repA+. Δ aphA. immU. bla+ (::Tn3).

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 6). Restriktionskortet viser, hvor Tn3-transposonen er blevet indsat i pOU56, og viser 5 endvidere, at plasmidet har et unikt sted for hver af restriktionsendonukleaserne EcoRI og BamHI. Medens plasmidet er nyttigt som udgangsmateriale til fremstilling af plasmidet pOU57 (jfr. eksempel 4 nedenfor), er det ikke foretrukkent som kloningsvektor, da antihiotikaresistens kan overføres til andre bakterier som følge af tilstedeværelsen af transpositionsgenet.

10 For at påvise tilstedeværelsen af det ønskede plasmid i værtscellen blev cellekulturer dyrket på plader indeholdende Ab2-phagpartikler som beskrevet ovenfor for at teste for resistens over for λ-infektion. Cellerne blev endvidere testet for ampicillinresistens på plader, som indeholdt 50 pg/ml ampicillin. Testen for temperaturfølsom vækst blev udført på den ovenfor beskrevne måde.

15 pOU56 viste sig at have de samme replikationsegenskaber som pOU53.

Dette plasmids egenskaber er vist i tabel 5.

Stammen E. coli CSH50/pOU56 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2469. EKSEMPEL 4

Konstruktion og karakterisering af pOU57 (et type A plasmid) 20 For at eliminere muligheden for transposition af Tn3 fra plasmidet pOU56 som følge af, at det bærer hele transposonen, blev plasmidet spaltet på BamHI- og EcoRI-stederne for at slette transpositionsgenet, hvorimod genet, som koder for β -lactamase, blev bevaret.

For at sammenføje hæfteenderne blev et lille BamHI-EcoRI-fragment fra plasmid pBR322 indsat, hvorved dannedes plasmidet pOU57. Plasmidet blev transformeret til E. coli 25 stamme CSH50. pOU57 havde en molekylvægt på 4,2xl06 daltons og følgende genotype: copA+. Δ copB. repA+, Δ par. Δ aphA. imm λ + , bla+ (ΔΤη3).

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 7).

Af restriktionskortet fremgår det, at pOU57 har unikke steder for hver af restriktionsendonukleaserne BamHI og EcoRI. hvilket gør det anvendeligt som kloningsvektor.

27 DK 171215 B1

For at påvise tilstedeværelsen af det ønskede plasmid i værtscellen blev cellekulturer dyrket på plader indeholdende Xb2-phagpartikler som beskrevet ovenfor for at teste for resistens over for phaginfektion. Cellerne blev yderligere testet for ampicillinresistens på den ovenfor beskrevne måde. Plasmidets molekylvægt blev bestemt ved hjælp af agarose· 5 gelelektroforese. Testen for temperaturfølsom vækst blev udført på den ovenfor beskrevne måde.

pOU57 viste sig at have de samme replikationsegenskaber som pOU53.

Dette plasmids egenskaber er vist i tabel 5.

Stammen E. coli CSH50/pOU57 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2470.

10 EKSEMPEL 5

Konstruktion og karakterisering af pOU71 (et type B plasmid)

Ved at anvende det i eksempel 4 beskrevne plasmid som udgangsmateriale og ved at indsætte et Bglll-fragment fra pKNl562, som omfattede en del af copB-genet i Bglll-stedet på pOU57 blev titelplasmidet konstrueret, hvilket plasmid bar såvel cI-APR-15 repressorpromotorsystemet som vildtypegenet for copB-inhibitoren fra Rl-type plasmider. Plasmidet blev transformeret til E. coli stamme CSH50. Molekylvægten af pOU71 var 4,3xl06 daltons, og genotypen var som følger: copA-k copB-k repA+. Δ par. Δ aphA. imm λ+, bla+.

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 8).

20 Det fremgår af restriktionskortet, at pOU71 har de samme unikke restriktionssteder som pOU57.

For at påvise tilstedeværelsen af det ønskede plasmid i værtscellen blev cellekulturer testet for resistens over for λ-infektion og ampicillinresistens på den ovenfor beskrevne måde. Plasmiderne blev derefter screenet for tilstedeværelsen af copB-genet ved hjælp af 25 den metode, som er beskrevet i afsnittet "Screening for copB+" (side 27 i nærværende ansøgning). Testen for temperaturfølsom vækst blev udført på den ovenfor beskrevne måde. Endelig blev antallet af plasmidkopier ved 30°C bestemt ved hjælp af radiomærkning og gradientcentrifugering.

28 DK 171215 B1

Da indholdet af plasmid DNA blev målt på den i eksempel 1 beskrevne måde, viste cellerne sig at indeholde 3-5 plasmidkopier ved 30°C og over 1000 plasmidkopier ved 42eC.

Ved 30°C gik plasmidet tabt med en frekvens på 1% pr. generation.

Plasmidets egenskaber er vist i tabel 5.

5 Stammen E. coli CSH50/pOU71 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2471. EKSEMPEL 6

Konstruktion og karakterisering af pOU73 (et type C plasmid)

Ved at anvende det i eksempel 4 beskrevne plasmid som udgangsmateriale og ved at indsætte et EcoRI-fragment fra pOU16 bærende copB-genet i EcoRI-stedet på pOU57 blev 10 titelplasmidet konstrueret, hvilket havde genet for copB-inhibitoren samt cI-XPR-repres-sor/promotorsystemet. Plasmidet blev transformeret til E. coli stamme CSH50. pOU73 havde en molekylvægt på 4,4x106 daltons og følgende genotype: cop A+. copB+. repA+.

Δ nar. Δ aohA. imm λ + , bla+.

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 9).

15 Det fremgår af restriktionskortet, at copB-genet er blevet indsat i et område på plasmidet, hvor det ikke naturligt hører hjemme. Det fremgår endvidere, at plasmidet har et unikt sted for restriktionsendonukleasen BamHI. således at det kan anvendes som klonings-vektor.

Der anvendtes de samme screeningsmetoder som for pOU71.

20 Da indholdet af plasmid DNA blev målt på den i eksempel 1 beskrevne måde, viste cellerne sig at indeholde 0,5-1 plasmidkopi ved 30°C og over 1000 plasmidkopier ved 42°C.

Ved 30°C gik plasmidet tabt med en frekvens på over 5% pr. generation.

Dette plasmids egenskaber er vist i tabel 5.

Stammen E. coli CSH50/pOU73 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2472.

EKSEMPEL 7

Konstruktion og karakterisering af dOU75 (et type B plasmid) 29 DK 171215 B1

Ved at anvende det i eksempel 5 beskrevne plasmid som udgangsmateriale og ved delvis restriktion af pOU71 med Hindlll blev titelplasmidet konstrueret, hvorfra EcoRI-stedet 5 var blevet slettet. Plasmidet blev transformeret til E. coli stamme CSH50. pOU75 havde en molekylvægt på 4,2xl06 daltons og følgende genotype: copA+. copB+, repA+. Δ par.

Δ aphA. imm λ+, bla+.

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 10).

Det fremgår af restriktionskortet, at sletningen af HindlH-fragmentet medfører fjernelse 10 af EcoRI-stedet på pOU71.

For at påvise tilstedeværelsen af det ønskede plasmid i værtscellen blev cellekulturer testet for resistens over for λ-infektion og ampicillinresistens samt temperaturfølsom vækst på den ovenfor beskrevne måde. Plasmidet blev også testet for tab af EcoRI-stedet ved restriktion med enzymet.

15 pOU75 viste sig at have de samme replikationsegenskaber som pOU71.

Dette plasmids egenskaber er vist i tabel 5.

Stammen E. coli CSH50/pOU75 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2473.

EKSEMPEL 8 Genproduktamplifikation 20 Plasmidet pMC903 (Casadaban et al., J. Bact. 143. 1980, s. 971) blev spaltet med restriktionsenzymerne BamHI og Belli, hvorved der dannedes et BamHI-Bglll-fragment, som bar lac-generne. Plasmidet pOU71 blev spaltet med BamHI. og det ovenfor vundne BamHJ-Bgin-fragment blev indsat på dette sted som vist i fig. 11 efterfulgt af ligation med T4 DNA ligase, hvorved der dannedes plasmidet pOUl06, som blev transformeret til 25 E. coli stamme CSH50. Cellerne blev udstrøget på McConkey-lactoseindikatorplader (jfr.

J. Miller, Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor, 1972), som indeholdt 50 pg/ml ampicillin, og inkuberet ved 30°C for at udvælge for røde kolonier (Lac+).

Temperaturen blev derefter ændret til 42°C, og amplifikationen af genproduktet (β- 30 DK 171215 B1 galactosidase) blev målt som vist i tabel 3. Målingen blev udført i henhold til den af J. Miller, od. rit., beskrevne metode.

TABEL 3

Anplifikatian af genprodukt

Plasmid ifølge opfindelsen Kendt plasmid (pKN410)

Minutter Akkumuleret Minutter Akkumuleret efter skift relativ specifik efter skift relativ specifik til 42°C aktivitet1 af til 42eC aktivitet af genprodukt2 gerprodukt3 0 10 0 10 10 21 25 34 55 62 60 20 83 107 90 47 1 Enzymaktivitet pr. samlet mængde protein, dvs. forøgelsen af β-galactosidase pr. celle.

2 β-galactosidase medieret af plasmid pOU106.

5 3 β-lactamase medieret af plasmid pKN410 (Uhlin et al., Gene 6, 1979, Tabel Π, s. 100).

Det fremgår af tabellen, at niveauet af genproduktamplifikation er sammenligneligt med det niveau, som opnås med andre runaway-vektorer (fe Uhlin et al., Gene 6. 1979, s. 91-106).

Den promotor, hvorfra β-galactosidasegenet udtrykkes, er cl-promotoren og/eller tetracyclinpro-motoren, som er placeret på DNA-fragmentet fra pBR322, der, skønt den er relativt svag, ikke kan 10 udelukkes som en influerende faktor, og som transkriberer i samme retning som cl-promotoren.

pOUl06 blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 11). Det fremgår af restriktionskortet, at plasmidet har et unikt sted for restriktionsendonukleasen BamHI umiddelbart neden for de indsatte lac-gener, hvilket gør plasmidet anvendeligt som kloningsvektor.

Dette plasmids egenskaber er vist i tabel 5.

15 Stammen E, coli CSH50/pOU106 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2474.

EKSEMPEL 9

Konstruktion og karakterisering af pOU79 (et tvne B plasmid) 31 DK 171215 B1

Plasmid pOU71 blev spaltet fuldstændigt med BamHI og delvis med PstI og ligateret med et DNA-fragment (bærende lac-operonet) fra plasmid pMC871 (Casadaban et al., J. Bact. 143. 1980, s. 971), 5 som var blevet spaltet fuldstændigt med BamHI og PstI.

Ligationsblandingen blev transformeret til E. coli stamme CSH50, idet der blev udvalgt for resistens over for ampicillin på McConkey-lactoseindikatorplader, som indeholdt 50 pg/ml ampicillin, og som blev inkuberet ved 30°C. Efter 20 timers inkubation ved 30°C blev pladerne inkuberet i et kort tidsrum (1-2 timer) ved 42°C, og kolonier, som skiftede fra en Lac‘ (hvid) til en Lac+ (rød) fænotype, 10 blev analyseret yderligere. Titelplasmidet blev identificeret ud fra en sådan koloni. pOU79 havde en molekylvægt på 8,8xl06 daltons og følgende genotype: copA+. copB+. repA. Δ par, imm λ + , bla+. lac+.

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 12). Det fremgår af restriktionskortet, at plasmidet har et unikt sted for restriktionsendonukleasen BamHI umiddelbart 15 oven for lac-generne. Indsætning af promotorbærende DNA-fragmenter i den korrekte orientering på dette sted medfører transkription af lac-generne, hvilket medfører en Lac-t- fænotype hos celler, som bærer sådanne hybridplasmider, ved 30°C. Lac-t- celler identificeres let på McConkey-lactoseindikator-plader.

Plasmidet har også et unikt sted for restriktionsendonukleasen EcoRI. som er placeret ved den ene 20 ende af lacZ-genet. Indsætning af EcoRI-fraementer på dette sted eliminerer aktiviteten af lacZ-genproduktet, β-galactosidase, hvilket medfører en Lac' fænotype, som let kan iagttages som dannelsen af farveløse kolonier på McConkey-lactoseindikatorplader efter et temperaturskift fra 30°C til 42°C (jfr. ovenstående beskrivelse). Plasmidet er således anvendeligt som kloningsvektor.

pOU79 viste sig at have de samme replikationsegenskaber som pOU71.

25 Dette plasmids egenskaber er vist i tabel 5.

Stammen E. coli CSH50/pOU79 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2481.

EKSEMPEL 10

Konstruktion og karakterisering af dOU82 (et type B plasmid) 32 DK 171215 B1

Plasmid pOU79 blev spaltet fuldstændigt med BamHI og delvis med Sall, og et BamHI-Sall-fragment fra pSKS104 bærende lac-operonet, hvorfra lac-promotoren var blevet slettet, og de første fire kodoner 5 af lacZ-genet blev indsat til konstruktion af pOU80 (ikke vist).

pOU80 er Lac' og har et BamHI-sted og et EcoRI-sted umiddelbart oven for Jac-generne. Endvidere mangler det EcoRI-sted. som normalt findes i lacZ-genet, da lac-generne i pSKS104 stammer fra pMC1403 (Casadaban et al’., J. Bact. 143. 1980, s. 971).

Titelplasmidet blev konstrueret ved at erstatte et EcoRI-Clal-fragment i lacZ-genet (jfr. kortet over 10 pOU79, fig. 12) fra pOU80 med et EcoRI-Clal-fragment fra pVH1424, som bar deo-promotoren og lacZ-genets aminoterminale ende. Erstatningen medfører en rekonstruktion af lacZ-genet og som følge af tilstedeværelsen af deo-promotoren medierer det resulterende hybride plasmid pOU82 en Lac+ fænotype, når det transformeres til E. coli stamme CSH50. pOU82 havde en molekylvægt på 8,lxl06 daltons og følgende genotype: codA+. cqpB+. repA+. Δ par> imm λ + , bla+. lac+.

15 Plasmidet går til sidst tabt fra cellerne ved 30°C som følge af mangelen på par-området hvilket let iagttages på ikke-selektive McConkey-lactoseindikatorplader (jfr. eksempel 11).

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 13). Det fremgår af restriktionskortet, at plasmidet har et unikt sted for hver af restriktionsendonukleaserne EcoRI og BamHI. hvilket gør det muligt at anvende plasmidet som kloningsvektor.

20 pOU82 viste sig at have de samme replikationsegenskaber som pOU71.

Dette plasmids egenskaber er vist i tabel 5.

Stammen E. coli CSH50/pOU82 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2482.

EKSEMPEL 11

Konstruktion og karakterisering af pQU91 (et type B plasmid) 25 Til konstruktion af et plasmid, som er stabilt med hensyn til fordeling, blev pOU82 spaltet med

EcoRI. og EcoRI-A-fragmentet, som omfatter vildtype par-området fra et plasmid Rl-derivat, pKNl84 (Nordstrom et al., Plasmid 4. 1980, s. 322), blev indsat på dette sted efterfulgt af ligation. Det 33 DK 171215 B1 resulterende plasmid (pOUdO, ikke vist) blev transformeret til E. coli stamme CSH50, og cellerne blev dyrket selektivt på plader, som indeholdt 50 pg/ml ampicillin, ved 30°C. Som kontrol blev celler, som indeholdt pOU82, dyrket på tilsvarende måde for at sikre tilstedeværelsen af plasmiderne i begge udgangskolonier. Derefter blev prøver af begge kolonier udstrøget på plader, som ikke indeholdt noget 5 antibiotikum, og cellerne lodes vokse i 25 cellegenerationer. Til screening for den stabile arv af Lac+ fænotypen blev celler fra begge de resulterende kolonier udstrøget på McConkey-lactoseindikatorpla-der ved 30°C, hvor de celler, hvortil pOU90 var blevet transformeret, dannede røde kolonier, hvilket viste, at dette plasmid var blevet bevaret, hvorimod kontrolcellerne, hvortil pOU82 var blevet transformeret, dannede både røde og farveløse kolonier, hvilket betyder, at pOU82 var gået tabt fra 10 nogle af cellerne i løbet af den selektionsfri periode.

Mellemproduktplasmidet, pOU90, blev derefter spaltet fuldstændigt med BamHI og delvis med Sau3A for at reducere plasmidets størrelse, hvorved der dannedes titelplasmidet. Efter transformation til E. coli stamme CSH50 blev plasmidets stabilitet bestemt på den ovenfor beskrevne måde. pOU91 havde en molekylvægt på 12,5xl06 daltons og følgende genotype: copA+. copB+. repA+. par+. imm 15 λ+, bla+. lac+.

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 14). Af restriktionskortet fremgår det, at pOU91 har unikke steder for hver af restriktionsendonukleaserne EcoRI og BamHI. hvilket gør plasmidet anvendeligt som kloningsvektor.

pOU91 viste sig at have de samme replikationsegenskaber som pOU71, men i modsætning til pOU71 20 er plasmidet fuldstændigt stabilt ved 30°C.

Dette plasmids egenskaber er vist i tabel 5.

Stammen E. coli CSH50/pOU91 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2483.

EKSEMPEL 12

Konstruktion og karakterisering af pOUIOI (et type B plasmid) 25 Ved at anvende det i eksempel 7 beskrevne plasmid som udgangsmateriale og ved at indsætte et

SauSA-ffagment der bar genet kodende for chloramphenicolacetyltransferase (cat+). i BamHI-stedet på pOU75 blev titelplasmidet konstrueret, som meddelte værtscellen chloramphenicolresistens. Plasmidet blev transformeret til E. coli stamme CSH50. pOUIOI havde en molekylvægt på 4,7xl06 daltons og følgende genotype: copA-t-. copB-k repA-κ Δ par, Δ aphA, immX + , bla+. cat+.

34 DK 171215 Bl

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 15). Det fremgår af restriktionskortet, at pOUlOl har et unikt sted for restriktionsendonukleasen EcoRI. som gør det muligt at anvende plasmidet som kloningsvektor. Endvidere inaktiverer indsætning af EcoRI-fragmenter cat +-genet, hvilket gør det muligt at screene for EcoRI-hvbrider.

5 For at påvise tilstedeværelsen af det ønskede plasmid i værtscellen blev cellekulturer testet for resistens over for λ-infektion og ampicillinresistens på den ovenfor beskrevne måde. Endvidere blev cellerne testet for resistens over for chloramphenicol ved at dyrke kulturer på plader indeholdende 20 pg/ml chloramphenicol. Cellerne blev også testet for temperaturfølsom vækst på den ovenfor beskrevne måde. pOUlOl viste sig at have de samme replikationsegenskaber som pOU71.

10 Dette plasmids egenskaber er vist i tabel 5.

Stammen E. coli CSH50/pOUl01 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2757.

EKSEMPEL 13

Konstruktion og karakterisering af pOUHO

EcoRI-Clal-fragmentet indeholdende en del af lacZ-genet blev slettet fra plasmid pOU80 (beskrevet i 15 eksempel 10; jfr. kortet over pOU79, fig. 12) og erstattet med et EcoRI-Clal-fragment ffa plasmidet pVH1451 (Valentin-Hansen et al., EMBO Journal 1. 1982), der bar deo-promotoren og lacZ-genets aminoterminale ende. Det resulterende plasmid blev betegnet pOU83 (jfr. fig. 16).

Plasmidet pOU83 blev delvis restringeret med BamHI og Bglll for at slette lac-generne og det DNA-fragment, som bar cl-repressorgenet og XPR-promotoren. Efter ligation og transformation til CSH50 20 blev et plasmid med de ønskede egenskaber isoleret, hvilket resulterede i en tæt fusion af deo- promotoren og copB-genet. Plasmidet, der blev betegnet pOUllO, havde en molekylvægt på 3,2xl06 daltons og følgende genotype: copA+. copB-k repA+. Δ par, bla+.

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 17). Af restriktionskortet fremgår det, at plasmidet har et unikt sted for hver af restriktionsendonukleaserne 25 EcoRI og BamHI. som gør det muligt at anvende plasmidet som kloningsvektor.

Da kulturer af E. coli stamme S0929 (cvtR. lac. deo; recA). hvortil pOUllO var blevet transformeret, blev dyrket natten over i LB-medium uden glucose, indtraf der ukontrolleret plasmidreplikation ved en celledensitet på over 2 x 108 celler/ml.

Stammen E. coli CSH50/pOU110 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2758.

EKSEMPEL 14

Konstruktion og karakterisering af pQU130 35 DK 171215 B1

Plasmidet pOU91 blev spaltet med BamHI. og BamHI-stedet blev slettet ved hjælp af exonukleasen Bal31 til dannelse af plasmidet pOU92 (ikke vist). Plasmidet blev restringeret med EcoRI og Clal. og 5 et tilsvarende EcoRI-Clal-fragment fra plasmidet pMC1403 (Casadaban et al., J. Bact. 143. 1980, s. 971) blev indsat til dannelse af plasmidet pOU93, som bar lac-operonet uden deo-promotoren. På det således dannede BamHI-sted blev der indsat et Bglll-fragment som bar et conB-gen. til dannelse af plasmidet pOUl30 (jfr. fig. 18) efterfulgt af ligation og transformation til E. coli stamme CSH50. Cellerne blev udstrøget på McConkey-lactoseindikatorplader indeholdende 50 pg/ml ampicillin og 10 inkuberet ved 30°C til udvælgelse for røde kolonier (Lac+). Temperaturen blev derefter hævet til 42°C, og amplifikationen af β-galactosidase er vist i tabel 4. Efter 45 minutters inkubation ved 42°C blev temperaturen sænket til under 38°C. Den målte β-galactosidaseamplifikation efter temperaturskiftet er vist i tabel 4.

TABEL 4

Udtrykkelse af Ø-galactosidase fra pOUl30 efter amplifikation af plasmid DNA

Vækstbetingelser dSpec. akt. af Ampiifikations- Ø-galactosidase faktor a 30°C; stabil tilstand 0,03 1 b 30°C 42°C 0,7 23 c 30°C 42°C 37°C 2,5 83 a Celler af CSH50 indeholdende pOUl30 dyrket eksponentielt i LB-medium ved 15 30°C.

b Efter eksponentiel vækst ved 30°C blev kulturen dyrket ved 42°C, ved hvilken temperatur væksten fortsatte i 2 timer.

c Efter eksponentiel vækst ved 30°C blev kulturen dyrket ved 42°C i 45 minutter, hvorefter temperaturen blev sænket til 37°C i 90 minutter.

36 DK 171215 B1 d Jfr. MATERIALER OG METODER. Specifikke aktiviteter af β-galactosidase er udtrykt som beskrevet af Light og Molin, Mol, Gen. Genet.. 1981, s. 56-61.

Det fremgår af tabellen, at genproduktamplifikationen er væsentligt forbedret, når der skiftes tilbage til en lavere temperatur, hvilket viser, at denne metode er særlig nyttig til 5 opnåelse af en maksimal udtiykkelse af de pågældende genprodukter.

Eftersom β-galactosidase udtrykkes konstitutivt fra en sådan genfusion (Light & Molin, J. Bact. 151. 1982, s. 1129-1135), afspejler niveauerne af enzymaktivitet nøjagtigt genproduktamplifikationsevnen hos plasmiderne ifølge opfindelsen.

Stammen E. coli CSH50/pOU130 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2759.

10 EKSEMPEL 15

Konstruktion og karakterisering af pLC31 pOU75 blev spaltet med BamHl. og et BamHI-fragment fra plasmid pBEUl4 (Uhlin og Clark, J. Bact. 148. 1981, s. 386-390), der bar recA-promotoren og -genet, blev indsat efterfulgt af transformation til E. coli stamme CSH50. Titelplasmidet havde en molekyl-15 vægt på 6,3xl06 daltons og følgende genotype: recA. bla+. codA+. cqpB+. repA+, immX + .

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 19).

Det fremgår af restriktionskortet, at pLC31 indeholder et unikt sted for restriktionsenzymet EcoRI neden for recA-promotoren. som egner sig til indsætning af fremmede 20 gener.

pLC31 viste sig at have de samme replikationsegenskaber som pOU71.

Når celler indeholdende pLC31 blev dyrket ved 30°C, forblev promotoren fuldt ud represseret, hvorimod lexA-repressoren efter et temperaturskift til 42°C gradvis blev titreret, og transkription fra recA blev indledt, hvilket medførte en amplificeret dannelse 25 af rgcA-genproduktet, som kunne detekteres ved polyacrylamidgelelektroforese.

Dette plasmids egenskaber er vist i tabel 5.

Stammen E. coli CSH50/pLC31 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2718.

EKSEMPEL 16

Konstruktion og karakterisering af pLC32 DK 171215 B1 37

Plasmid pLC28 (Remaut et al., Gene 15. 1981, s. 81-93) bærende XPL-promotoren og Magenet og forsynet med en linker, som omfattede restriktionsstedeme EcoRI. Smal.

5 BamHI. Sall. PstI og Hindlll. blev spaltet med EcoRI og indsat i EcoRI-stedet på plasmid pOU51 (jfr. eksempel 1) efterfulgt af ligation og transformation til E, coli stamme CSH50.

Dette plasmid, pLC32’, (jfr. fig. 20), der havde en molekylvægt på 10,6xl06 daltons, blev delvis digereret med PstI efterfulgt af ligation og transformation til E. coli stamme CSH50, idet der blev selekteret for plasmider, som er kanamycinresistente og ampicillin-10 følsomme. Det resulterende plasmid fik betegnelsen pLC32 og havde en molekylvægt på 7,7xl06 daltons og følgende genotype: cqpA+. copB-. repA+. aphA+. immX + .

Plasmidet blev kortlagt med restriktionsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (jfr. fig. 21).

Det fremgår af restriktionskortet, at λΡ^ρΓΟίηοίΟΓβη er placeret umiddelbart oven for det unikke EcoRI-sted. hvilket gør plasmidet hensigtsmæssigt som kloningsvektor.

15 pLC32 viste sig at have de samme replikationsegenskaber som pOU51.

Dette plasmids egenskaber er vist i tabel 5.

Stammen E. coli CSH50/pLC32 er deponeret i DSM under deponeringsnummeret 2719.

38 DK 171215 B1 TABEL 5

MiniRl-XP^-plasmiders egenskaber som kloningsvektorer

Relevant unikke re- Screening Kapital Stabil fænotype strikticns- (indsætnings- pr. celle nedarv-

Plasnid sted (er) inaktivering) 30°C 42°C ning pOU51 Km, λ EcoRI Ingen 25 >1000 Ja pOU53 λ ' EcoRI Ingen 25 >1000 Ja pOU56 Αρ,λ EcoRI. BairHI Ingen 25 >1000 Ja pCU57 Αρ,λ EcoRI. BamHI Ingen 25 >1000 Ja pCU71 Αρ,λ EcoRI. BamHI Ingen 3 >1000 Nej pCU73 Αρ,λ BairHI Ingen 1 >1000 Nej pCU75 Αρ,λ BamHI Ingen 3 >1000 Nej pOU106 Αρ,λ BairHI Ingen 3 >1000 Nej pCU79 Ap,X,Lac{+) EcoRI. BairHI LaC (EcgRI) 3 >1000 Nej pCU82 Ap,X,Lac+ EcoRI. BamHI Ingen 3 >1000 Nej pCXJ91 Αρ,λ,Lac+, EcoRI. BairHI Ingen 3 >1000 Ja

Par+ pCUlOl Αρ,Οη,λ EcoRI Otf3 (EcoRI) 3 >1000 Nej pCU130 Ap,X,Lac+ EcoRI Ingen 3 >1000 Ja pLC31 Ap,RecA+,X EcoRI RecA' 3 >1000 Nej pLC32 Km, λ EcoRI Ingen 25 >1000 Ja pCUllO Ap ’ EcoRI. BamHI Ingen a) Nej a) Kopitallet er ikke temperaturafhængigt.

BIBLIOGRAFI

1. Offentliggjort europæisk patentansøgning nr. 78101877.5.

2. Molin et al., J, Bact. 138. 1979, s. 70-79.

3. Molin et al., Microbiology. 1981, s. 408-411.

4. Rosen et al., Mol. Gen. Genet. 179. 1980, s. 527-537.

DK 171215 Bl 39 5. Light og Molin, Mol. Gen. Genet. 184, 1981, s. 56-61.

6. Stougaard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78. 1981, s. 6008-6012.

7. Molin et al., Mol. Gen. Genet. 181. 1981, s. 123-130.

8. Stougaard et al., EMBO Journal 1. 1982, s. 323-328.

9. Sussman og Jacob, Compt. Rend. Acad. Sci. 254. 1962, s. 1517.

10. Sninsky et al., Gene 16. 1981, s. 275.

11. Uhlin et al., Gene 6, 1979, s. 91-106.

12. J. Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor, New York, 1972.

13. Davis, Botstein og Roth: A Manual for Genetic Engineering Advanced Bacterial Genetics. Cold

Spring Harbor, New York, 1980.

14. Bertani, J. Bact. 62. 1954, s. 293.

15. Bolivar et al., Gene 2. 1977, s. 95.

16. An & Friesen, J. Bact. 140. 1979, s. 400-407.

17. Casadaban et al., J. Bact. 143. 1980, s. 971.

18. Dempsey & Willetts, J. Bact. 126. 1976, s. 166.

19. Nordstrom, Molin, Aagaard-Hansen, Plasmid 4. 1980, s. 215-217.

20. Stougaard & Molin, Anal. Biochem. 118. 1981, s. 191.

21. Nordstrom et al., Plasmid 4. 1980, s. 322.

22. Valentin-Hansen et al., EMBO Journal 1. 1982, s. 317.

40 DK 171215 B1 23. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 1981, s. 309.

24. Uhlin & Clark, J. Bact. 148. 1981, s. 386-390.

Claims (29)

1. Plasmid, der er nyttig som en kloningsvektor, og som har en størrelse i området ca. 2,5 - 15,0 x 106 daltons, hvilket plasmid har: a) en indsat regulerbar promoter i en stilling og i en retning, der tillader transkription fra promotoren ind i replikationsregionen; b) replikationsregion omfattende et gen, der koder for et genprodukt, som er positivt nødvendigt for replikation, idet forøget transkription fra den regulerbare promotor fører til et forøget niveau af genproduktet, som er positivt nødvendigt for replikation, idet det forøgede niveau resulterer i en plasmidreplikationshastighed, som er højere end værtscellens væksthastighed, hvilket fører til et forøget plasmidkopital, som sædvanligvis efter 4-5 celledelinger vil være forøget med en faktor på 25-1000.

2. Plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at promotoren er kontrollerbar ved hjælp af en regulerende faktor.

3. Plasmid ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den regulerende faktor er en faktor, som udøver positiv kontrol, eller en faktor, som udøver negativ kontrol.

4. Plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den forøgede transkription fra den regulerbare promotor førende til et væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital er forårsaget af derepression af promotoren.

5. Plasmid ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at promotoren er en kemisk regulerbar promotor såsom en lac-promotor, tro-promotor eller deo-promotor.

6. Plasmid ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at aktiviteten af promotoren er temperaturafhængig eller kontrolleret af en temperaturfølsom regulerende faktor.

7. Plasmid ifølge krav 6, kendetegnet ved, at promotoren er en λ-promotor, og at genet for en temperaturfølsom λ cl-repressor, som kontrollerer transkription fra promotoren, også er til stede.

8. Plasmid ifølge krav 7, kendetegnet ved, at λ-promotoren enten er λΡκ eller kTL, især λΡκ. DK 171215 B1

9. Plasmid ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at transkription fra den regulerbare promotor får plasmidet til at udvise et konstant, lavt kopital ved lave temperaturer, fe en temperatur på ca. 30°C, og et væsentligt forøget eller ukontrolleret kopital ved højere temperaturer, fe en temperatur i området ca. 36-42°C.

10. Plasmid ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at en del af et naturligt replikationsregulerende gen er blevet slettet og erstattet med den regulerbare promotor.

11. Plasmid ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det, når værtsmikroorganismer indeholdende plasmidet dyrkes under betingelser, som sikrer et konstant, lavt plasmidkopital, har et kopital i området 20-40, fortrinsvis 20-30 og især 20-25, kopier pr. celle, og at det, når værtsmikroorganismerne dyrkes under andre betingelser, som medfører et væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital, har et kopital i området mindst ca. 500-1000 kopier pr. celle.

12. Plasmid ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det har et plasmidkopital i området ca. 20-40, fortrinsvis 20-30 og især 20-25, kopier pr. celle ved én temperatur såsom en temperatur på ca. 30°C, og et ukontrolleret plasmidkopital i området mindst ca. 500-1000 kopier pr. celle ved en højere temperatur såsom en temperatur på ca. 42°C.

13. Plasmid ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, kendetegnet ved, at en regulerbar promotor er blevet indsat oven for det eller de naturlige replikationskontrolgener på plasmidet.

14. Plasmid ifølge krav 13, kendetegnet ved, at det, når værtsmikroorganismer indeholdende plasmidet dyrkes under betingelser, som sikrer et konstant, lavt plasmidkopital, har et kopital i området ca. 3-5 kopier pr. celle, og at det, når værtsmikroorganismer dyrkes under andre betingelser, som fører til et væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital, har et kopital i området mindst ca. 500-1000 kopier pr. celle.

15. Plasmid ifølge krav 14, kendetegnet ved, at det har et plasmidkopital i området ca. 3-5 kopier pr. celle ved én temperatur såsom en temperatur på ca. 30°C og et ukontrolleret plasmidkopital i området mindst ca. 500-1000 kopier pr. celle ved en højere temperatur såsom en temperatur på ca. 42°C. DK 171215 Bl

16. Plasmid ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, kendetegnet ved, at det bærer en regulerbar promotor i replikationsområdet, hvorfra en del af et naturligt replikationsregulerende gen er blevet slettet, og i hvilket det naturlige replikationsre-gulerende gen er blevet indsat i et område, hvor det ikke naturligt er placeret.

17. Plasmid ifølge krav 16, kendetegnet ved, at det, når værtsmikroorganismer indeholdende plasmidet dyrkes under betingelser, der sikrer et konstant, lavt plasmidkopital, har et kopital i området ca. 0,5-1 kopi pr. celle, og at det, når værtsmikroorganismer dyrkes under andre betingelser, som fører til et væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital, har et kopital i området mindst ca. 500-1000 kopier pr. celle.

18. Plasmid ifølge krav 17, kendetegnet ved, at det har et plasmidkopital i området ca. 0,5-1 kopi pr. celle ved én temperatur såsom en temperatur på ca. 30°C og et ukontrolleret plasmidkopital i området mindst ca. 500-1000 kopier pr. celle ved en højere temperatur såsom en temperatur på ca. 42°C.

19. Plasmid ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at der udover den første regulerbare promotor, der regulerer transkription fra replikationsområdet, i plasmidet er indsat en anden promotor på en måde, der muliggør indsætning af et strukturgen, hvis udtrykkelse kontrolleres fra den anden promotor, hvilken anden promotor er kontrollerbar, og fx er XPL-promotoren.

20. Plasmid ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at det bærer et gen, som muliggør genfusion ved indsætning af et andet gen, hvilken fusion gør det muligt at detektere udtiykkelse.

21. Plasmid ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at det desuden bærer ét eller flere gener, der ikke er naturligt forbundne med plasmidet.

22. Fremgangsmåde til fremstilling af et genprodukt af plasmid DNA, kendetegnet ved, at mikroorganismer, som bærer et plasmid ifølge et hvilket som helst af kravene 1-21, dyrkes, hvilket omfatter mindst én dyrkningsperiode under betingelser, som sikrer forøget transkription fra den regulerbare promotor, hvilket medfører et forøget niveau af det genprodukt, der er positivt nødvendig for replikation, hvilket forøgede niveau resulterer i en plasmidreplikationshastighed, som er højere end værtscellens væksthastighed, hvilket fører til et forøget plasmidkopital, som sædvanligvis efter 4-5 celledelinger vil være forøget med en faktor på 25- DK 171215 B1 1000 et væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital, og et genprodukt af plasmidet høstes fra den mikrobielle kultur.

23. Fremgangsmåde ifølge krav 22, kendetegnet ved, at værtsmikroorganismen, til hvilken et plasmid ifølge et hvilket som helst af kravene 1-21 er blevet transformeret, dyrkes under betingelser, som medfører et konstant, lavt plasmidkopital under podnings- og opformeringsstadierne, indtil det ønskede antal celler er blevet opnået, og værtsmikroorganismen derefter dyrkes under betingelser, som fører til et væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital.

24. Fremgangsmåde ifølge krav 22 eller 23, kendetegnet ved, at koncentrationen af et stof, der i det væsentlige inhiberer promotoraktivitet, efter en dyrkningsperiode i nærværelse af dette stof, nedsættes i et omfang, som medfører aktivering af promotoren og et væsentligt forøget eller ukontrolleret plasmidkopital.

25. Fremgangsmåde ifølge krav 24, kendetegnet ved, at der, efter at de betingelser, som medfører et væsentligt forøget eller ukontrolleret kopital, er blevet opretholdt i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til at opnå en væsentlig amplifikation af plasmidet, men tilstrækkelig kort til at undgå nogen væsentlig beskadigelse af den mikrobielle kultur, tilsættes det stof, der inhiberer promotoraktivitet, i en mængde, som fører til en langsom nedgang i plasmidkopital til præ-induktionsniveauet.

26. Fremgangsmåde ifølge krav 22 eller 23, kendetegnet ved, at de betingelser, hvorunder mikroorganismen dyrkes, omfatter mindst en dyrkningsperiode ved eller nær ved en temperatur, ved hvilken plasmidkopitallet er væsentligt forøget eller ukontrolleret.

27. Fremgangsmåde ifølge krav 26, kendetegnet ved, at dyrkningen ved den temperatur, ved hvilken plasmidkopitallet er væsentligt forøget eller ukontrolleret, fortsættes, indtil væksten af værtsmikroorganismen inhiberes ved dannelsen af plasmid DNA eller genprodukter fra plasmiderne.

28. Fremgangsmåde ifølge krav 26, kendetegnet ved, at temperaturen efter opformering af den mikrobielle kultur til produktionsstørrelse ændres til en temperatur ved eller nær ved den temperatur, ved hvilken plasmidkopitallet er væsentligt forøget eller ukontrolleret, og denne temperatur opretholdes i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til at opnå en væsentlig amplifikation af plasmidet, men tilstrækkelig kort til at undgå nogen væsentlig beskadigelse af den mikrobielle kultur, hvorefter temperaturen igen ændres DK 171215 B1 til en temperatur, der sikrer et lavt, konstant plasmidkopital, hvilket medfører en langsom nedgang i plasmidkopitallet, indtil det når begyndelsesniveauet.

29. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 26-28, kendetegnet ved, at den temperatur, ved hvilken plasmidkopitallet er væsentligt forøget eller ukontrolleret, er højere end den temperatur, ved hvilken plasmidet har et konstant, lavt kopital, fe en temperatur i området ca. 36-42°C.