DK175068B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af proteiner ved hjælp af værtsorganismer, fortrinsvis mælkesyrebakterier - Google Patents
Fremgangsmåde til fremstilling af proteiner ved hjælp af værtsorganismer, fortrinsvis mælkesyrebakterier Download PDFInfo
- Publication number
- DK175068B1 DK175068B1 DK560686A DK560686A DK175068B1 DK 175068 B1 DK175068 B1 DK 175068B1 DK 560686 A DK560686 A DK 560686A DK 560686 A DK560686 A DK 560686A DK 175068 B1 DK175068 B1 DK 175068B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- dna
- lactic acid
- acid bacteria
- gene
- plasmid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01085—6-Phospho-beta-galactosidase (3.2.1.85)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
1 DK 175068 B1
Opfindelsen angår anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi med det formål at fremstille peptider i bakterier på en effektiv måde, især i mælkesyrebakterier, i B. subtilis og i E. coli. Opfindelsen angår i særdeleshed tilvejebringelsen 5 af plasmidvektorer, som kan kopieres i værtsorganismer - ‘ både Gram-negative og Gram-positive bakterier - incl·.
mælkesyrebakterier, som er anvendelige til kloning, og som kan bringe gener til udtryk i de pågældende bakterier, navnlig genet for phospho-B-galactosidase.
10
Opfindelsen angår i særdeleshed tilvejebringelsen af DNA-fragmenter eller plasmidvektorer, som indeholder et sekvensspecifikt bindingssted for replikon, promotor og ribosom samt et gen, som med fordel har sin oprindelse fra 15 mælkesyrebakterier, og som er funktionelt i mælkesyrebakterier, i B. subtilis og i E. coli. Desuden angår opfindelsen en fremgangsmåde til behandlingen af disse. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til molokylær kloning af gener i mælkesyrebakterier. Endvidere omfatter 20 opfindelsen værtsorganismer, som er udstyret med et eller flere plasmider i henhold til opfindelsen.
Udviklingen og anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi i genetiske modelsystemer, såsom den Gram-negative E. coli og 25 den Gram-positive B. subtilis har vist, at bakterier . effektivt kan producere artsfremmede (heterologe) peptider, og desuden kan de stimuleres til at hæve eller sænke produktionen af egne (homologe) peptider. De grundlæggende elementer for anvendelsen af denne rekombinant-DNA-teknologi 30 er: 2 DK 175068 B1 1. En vektor, normalt et plasmid, til hvilken der kan indføres homologe eller heterologe gener for herved at opnå en stabil replikation og en stor ekspression af disse gener, hvilken vektor indeholder et eller flere 5 DNA-fragmenter, som sikrer en stabil replikation (replikon); for at opnå en enkel genetisk udvælgelse er « vektoren ofte forsynet med gener, som let kan udvælges, såsom gener for antibiotisk resistens.
10 2. Et DNA-fragment, som indeholder et gen, som koder for den ønskede egenskab, som kan være artsspecifik (homolog) eller artsfremmed (heterolog), hvilket DNA-fragment er forsynet med en passende kontrol-DNA-sekvens.
15 3. Et eller flere DNA-fragmenter, som indeholder kontrol- DNA-sekvenser, som sikrer ekspressionen i værtsorganismen, såsom en promotor (en DNA-sekvens, som sikrer en effektiv transscription af det gen, som skal bringes til udtryk) og et ribosombindingssted (en DNA-20 sekvens, som starter den effektive translation af det dannede transscript).
4. En passende værtsbakterie, i hvilken vektoren indeholder det nødvendige gen og den nødvendige kontrol-DNA-sekvens, 25 som kan overføres (transformeres), og som kan bibeholdes stabilt; og som er i besiddelse af cellesystemer, som kan bringe det aktuelle gen til udtryk.
Anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi har ført til 30 produktionen af peptider, som er i besiddelse af enzymatisk aktivitet og kan katalysere biologiske forandringer, såsom α-amyLase og glukose-isomerase eller sådanne, som har fundet 3 DK 175068 B1 farmaceutisk anvendelse, såsom insulin og inteferon. Hjælpestoffer såsom chymosin, β-galactosidase og β-glucanase kan tilsyneladende produceres ved hjælp af rekombinant-DNA-teknologi.
5
Inden for rekombinant-DNA-teknologien i bakterier har der hidtil som værts- og produktionsorganisme overvejende været anvendt E. coli og mere begrænset B. subtilis. Den væsentligste årsag til anvendelsen af disse bakterier er, at 10 deres gener er bedst karakteriserede, da de anvendes som modelsystem for Gram-negative bakterier (E. coli) og Grampositive (B. subtilis) bakterier. Alle hidtidige opdagelser og opfindelser med hensyn til rekombinant-DNA-teknologi er udført med E. coli som vært. Imidlertid er E. coli og 15 subtilis ikke de bedst egnede bakterier til føde vareindustriens kommercielle produktion af polypleptider. E. coli kan nemlig producere toxiner og pyrogener og må derfor ikke forekomme i fødevarer; B. subtilis danner store mængder -protease, og herved reduceres udbyttet af de producerede 20 peptider drastisk. Nedbrydningen (fermenteringen) af næringsemner (substrater) foregår normalt i et anaerobt medium. Imidlertid er E. coli mindre anvendelig og B. subtilis (overvejende aerob) helt ubrugelig. Anvendelsen af begge bakterityper inden for fødevareindustrien er desuden meget 25 begrænset af, at disse bakterietyper efterlader en særlig ubehagelig smag. Dette forhold er i særdeleshed en væsentlig ulempe for anvendelsen i mejeriprodukter, da forurening (kontaminering) med B. subtilis eller E. coli medfører en uacceptabel smagsændring.
Mælkesyrebakterier har været anvendt i flere tusinde år ved tilberedningen af gærede fødevarer og fortæres i store 30 4 DK 175068 B1 mængder; man kan derfor trygt anvende disse bakterier.
Desuden er mælkesyrebakterier af væsentlig betydning for konsistensen og smagen af disse produkter, og det er let at foretage en anaerobisk fermentering i stor skala af disse 5 mikroaerobe bakterier. Derfor er mælkesyrebakterier i særdeleshed anvendelige som Gram-positive værts- og produktionsorganismer til rekombinant-DNA-teknologi inden for fødevareindustrien.
10 De (temperatur-) mesofile mælkesyrebakterier, som tilhører
slægterne Streptococcus lactis og S. cremoris anvendes ved fremstillingen af mange forskellige mejeriprodukter såsom ost, kvark, smør og kærnemælk. Det har vist sig, at det er normalt for disse mælkesyrebakterier at indeholde fra 1 til 15 mere end 6 plasmider med molrkylevægte fra ca. 106 til mere I
end 100 x 106. Selv om de fleste af disse plasmider ikke har nogen kendt funktion (såkaldte kryptiske plasmider) har det i flere tilfælde vist sig, at plasmid-DNA helt eller delvis koder for vigtige funktioner såsom lactose- og 20 citratmetabolisme, proteinase- og bakteriocinproduktion samt resistens- og bakteriofagresistensmekanismer.
Ved konstruktionen af vektorer til mælkesyrebakterier kan der ud fra analogibetragtninger af værts-vektorsystemerne 25 til modelbakterierne E. coli og B. subtilis anvendes endogene plasmider. Et eksempel på dette er den nyligt beskrevne vektor pGK 12, som forefindes på S. cremoris-plasmidet pWVOl's replikon. Denne vektor replikeres i S. lactis, B. subtilis og E. coli. Denne vektor er imidlertid 30 mindre egnet ved anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi i mælkesyrebakterier, fordi antallet af vektorkopier er meget lavt i mælkesyrebakterien S. lactis (ca. 4 kopier pr. celle; 5 DK 175068 B1
Appl. Environ. Microbiol. 48 (1984) 726-731). Et andet eksempel på dette er vektoren Pgb 301, som består af et S. sanguis replikon, og som tilsyneladende kopieres i mælkesyrebakterien S. lactis (Appl. Environ. Microbiol. 48 5 (1984) 252-259). Ulempen ved denne vektor er ligeledes dannelsen af forholdsvis få kopier og deres store størrelse (9,8 kb; Plasmid 4 (1938) 130-138).
Ud fra de hidtidige resultater, som er opnået under 10 anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi, er det kendt, at niveauet af genekspressionen for klonede gener i bakteriesystemer er meget afhængig af kopiantallet af det aktuelle gen og derfor af kopiantallet af vektorerne, som anvendes til kloningen. Små vektorer, som replikeres i et 15 stort antal kopier i mælkesyrebakterier, har hidtil været ukendt.
Opfindelsen angår en vektor - lille i størrelse, som danner et stort antal kopier i mælkesyrebakterier, og en 20 fremgangsmåde, som fører til dannelsen af en sådan vektor.
Denne fremgangsmåde indbefatter en såkaldt replikon-screenings-strategi, hvor modelorganismen B. subtilis ved den indledende udvælgelse af DNA-fragmenter med replikonaktivitet anvendes som mellemvært (intermediate 25 host). B. subtilis anvendes, fordi den kan transformeres med meget højere frekvens end mælkesyrebakterier (Mol. Gen.
Genet. 168 (1979) 111-115; Appl. Environ. Microbiol. 43 (1982) 1213-1215), og desuden på grund af den lighed, som helt tydeligt forekommer mellem disse Gram-positive 30 organismer med hensyn til replikon-aktivitet, fordi mælkesyreplasmi det pWVOl, som oprindeligt stammer fra S. cremoris, har vist sig, at blive replikeret i B. subtilis 6 DK 175068 B1 (Lactic Acid Bacteria in Foods, published by Neth. Soc. Micro-biol. (1983) p. 33).
Det er desuden en væsentlig fordel ved denne fremgangsmåde, 5 at hver enkelt vektor, som konstrueres, vil blive replikeret i B. subtilis, hvilket øger mulighederne ved genmanipuleringen.
En væsentlig bestanddel af replikon-screenings-strategien, 10 som beskrives her, er udviklingen af et plasmid, som ikke kan replikeres i B. subtilis eller mælkesyrebakterier, men derimod i E. coli, og som desuden indeholder Gram-positive gener, som koder for antibiotika-resistens, hvilke er anbragt på et passende lille restriktions-DNA-fragment, og 15 hvilket udtrykkes i E. coli, B. subtilis og ligeledes - som forventet - i mælkesyrebakterier (replikon-screenings-vektor). Sammensplejsningen af dette restriktions-fragment, som indeholder gener for antibiotisk resistens, med restriktions-fragmenter fra plasmider, som stammer fra og 20 replikeres i mælkesyrebakterier, efterfulgt af transformation af B. subtilis, kan føre til dannelsen af antibiotika-resistente transformanter. Plasmid-DNA'et, der er isoleret fra transformanterne, overføres herefter til mælkesyrebakterier, som eventuelt kan indeholde plasmider, 25 hvorefter mælkesyrebakterier, der er antibiotikaresistente, udvælges. Plasmidstrukturen og antallet af kopier, i de mælkesyrebakterier, som er blevet transformeret, bestemmes ved hjælp af standardteknikker. Ved at anvende den oven for beskrevne fremgangsmåde med replikon-screen- vektor pNZIO 30 serening, er der blevet udviklet flere vektorer, som kan transformere en mælkesyrebakterie. Et særligt tilfælde er vektoren pNZ12, som er på 4,1 kb, hvilken er forsynet med η DK 175068 B1 gener, som sørger for resistens mod antibiotika chloramphenicol og kanamycin, og hvilken replikeres og videreføres med et stort antal kopier (ca. 100 kopier pr. celle) i mælkesyrebakterier. Udover at vektoren pNZ12 bliver 5 replikeret i mælkesyrebakterier og i B. subtilis, kan den også transformere den Gram-negative modelbakterie S. coli. Desuden er de unikke Sall- og Bglll DNA-sekvenser på vektoren vigtige ved kloningseksperimenter i disse værter. I disse sekvenser er det muligt at· indsætte DNA-fragmenter, 10 som efter transformering af rekombinant-plasmiderne til mælkesyrebakterier fortsætter med at være tilstede i mange kopier i den aktuelle mælkesyrebakterie. Der forekommer et specialtilfælde ved indsættelse af DNA i et Bglll DNA-sekvens, da det befinder sig i genet, som koder for 15 kanamycin-resistens. Som en konsekvens heraf inaktiveres denne markør, hvilket gør en enkelt genetisk udvælgelse mulig (insertion inactivation; W.M. de Vos, academic thesis of the State University of Groningen, 1983, Bariet, Ruinen).
20 Direkte kloning af mælkesyrebakterier ved hjælp af såkaldte haglbøsseforsøg er meget besværlig, da der ikke forefindes et effektivt transformationssystem. Selvom de transformationsfrekvenser, som blev opnået i starten for S. lactis (Appl. Environ. Microbiol. 43 (1982) 1212-1215), 25 siden er blevet øget ved hjælp af nogle tekniske ændringer med en faktor 10 til ca. 103 transformanter pr. yg (Appl. Environ. Microbiol. 48 (1984) 252-259), er der ikke blevet tilvejebragt et optimalt transformationssystem for mælkesyrebakterier, således som for E. coli eller B_^ 30 subtilis (107 transformationer pr. yg). Genkloning i mælkesyrebakterier vil derfor generelt blive udført under anvendelse af mellemværter. Vektoren pNZ12, der er beskre 8 DK 175068 B1 vet heri, replikeres både i E. coli, B. subtilis, og i mælkesyrebakterier, og den er derfor særdeles velegnet i forbindelse med genkloning i de let tilgængelige mellemværter E. coli og B. subtilis og mælkesyrebakterier.
5 Anvendelsen af mellemværter for genkloningen i mælkesyre bakterier under anvendelse af E. coli og B. subtilis med vektoren pNZ12 i den foretrukne udførelsesform, som beskrevet ovenfor, er en del af den foreliggende opfindelse.
Ved således at gøre brug af den enestående Sall DNA-sekvens 10 på vektoren pNZ12 blev et DNA-fragment, som nedstammer fra S. lactis, og som indeholder genet for phospho-B-ga- lactosidase, klonet i E. coli. Dette rekombinant- plasmid pNZ32 blev herefter transformeret i både B. subtilis og en mælkesyrebakterie. I alle de nævnte værter udtrykker genet 15 for fosfo-B-galactosidase. Denne ekspression kan bestemmes på en meget enkel måde ved hjælp af en enzymatisk reaktion.
Heraf følger således en ny mulighed for måling af genekspressionen i både E. coli og B. subtilis, men i særdeleshed i mælkesyrebakterier.
20
For at få et gen udtrykt i mælkesyrebakterier skal dette gen altid have to DNA-kontrol-elementer: et promotor- og et ribosom-bindingssted, som er funktionsdygtigt i mælkesyrebakterier, og disse skal befinde sig opstrøms i 25 forhold til genet. Gener som allerede har to sådanne DNA- elementer (generelt for homologe gener) kan derfor komme til udtryk; men hvis der yderligere placeres en kraftigere promotor opstrøms, kan niveauet af genudtrykket generelt øges. Gener, som kun er forsynet med et ribosom-bindings-30 sted, kan kun komme til udtryk, når der anbringes en promotor opstrøms. Gener, som ikke har nogen af de to DNA kontrolelementer (generelt for heterologe gener) kan kun 9 DK 175068 B1 komme til udtryk, hvis de forsynes med omtalte DNA-elementer. Det gen, som skal bringes til udtryk, bliver derfor koblet til et gen, som allerede er forsynet med et promotor- og et ribosom-bindingssted. Når de to geners 5 nucleotidsekvenser støder helt op til hinanden, bliver der dannet fusionerede proteiner. I nogle tilfælde kan dette fusionerede protein være i besiddelse af den ønskede biologiske aktivitet. I andre tilfælde er det muligt at fjerne det ønskede protein fra et sådant fusioneret protein.
10
Det promotor- og ribosombindingssted for genet, som befinder sig nedstrøms, bestemmer overvejende ekspressionen af genet.
DNA fragmenter, på hvilke der er anbragt et promotor- og et ribosom-bindingssted, og hvilke hidrører fra og er 15 funktionsdygtige i mælkesyrebakterier, har hidtil været ukendte; derfor har udviklingen inden for anvendelsen af rekombinant-DNA teknologien for disse bakterier i vid udstrækning været forhindret. Opfindelsen tilvejebringer imidlertid en fremgangsmåde til isolering af DNA fragmenter, 20 som er forsynet med de omtalte DNA-kontrol-sekvenser, og som er specifik for mælkesyrebakterier. Fremgangsmåden, som blev udviklet med dette mål for øje, er baseret på anvendelsen af en såkaldt promotor-screenings-vektor og mellemværterne E. coli og B. subtilis. Sådanne vektorer er med fordel blevet 25 anvendt til kloning af promotor-fragmenter i E. coli og B.
subtilis. Disse vektorer indeholder generelt et gen, som koder for antibiotisk resistens, hvor genets egen promotor er blevet fraspaltet, hvorfor dette gen ikke (eller i meget begrænset omfang) kommer til udtryk. Anvendeligheden af en 30 promotor-screenings-vektor øges væsentligt, når der indføres et anvendeligt restriktionssted umiddelbart opstrøms i forhold til det amputerede resistensgen. Isolering af DNA- 10 DK 175068 B1 kontrol-elementer kan herefter foretages ved at inkorporere DNA-fragmenter i det indførte restriktionssted efterfulgt af transformering af mellemværten B. subtilis eller E. coli og udvælgelse af transformanter i hvilke det amputerede 5 restriktionsgen igen kommer til udtryk (antibiotisk- resistens-transformanter). DNA-fragmenterne, som anvendes til indføjning, kan hidrøre fra kromosomalt-DNA, plasmid-DNA og fra mælkesyrebakteriofag-DNA. Det er kendt, at meget kraftige promotorer først og fremmest forekommer i 10 bakteriofag-DNA.
Anvendelsen af den oven for beskrevne fremgangsmåde for promotor-screenings-vektoren pNZ220, som er afledt fra den tidligere omtalte vektor pNZ12, og som derfor replikeres i 15 B. subtilis, E. coli og i mælkesyrebakterier, resulterer i isoleringen af ekspression-plasmidet pNZ221, hvilket indeholder et DNA- fragment, som hidrører fra en mælkesyrebakteriofag, som har en meget kraftig promotoraktivitet i disse værter.
20
Ved en nærmere analyse af disse DNA-fragmenter har det vist sig, at de sandsynligvis indeholder to promotorer, som er anbragt med samme orientering i umiddelbar forlængelse af hinanden. Disse promotorer efterfølges - på kort afstand -25 af et ribosom-bindingssted, et start-kodon (ATG), en såkaldt åben læseramme (open reading frame) og til sidst et antal anvendelige restriktionsfrekvenser. Fagmænd på området vil ved hjælp af de anførte oplysninger angående DNA- fragmenterne, som er specifikke for mælkesyrebakterier, 30 kunne indse, at den tilvejebragte fremgangsmåde med meget stor fordel kan anvendes til at bringe såvel homologe som heterologe gener til udtryk i mælkesyrebakterier.
n DK 175068 B1
Vektorerne og de deraf afledte plasmider, som er beskrevet heri, er i stand til at replikeres i både mælkesyrebakterier, B. subtilis og i E. coli. Heraf følger, 5 at alle de teknikker, som er blevet udviklet, og som vil blive udviklet ved hjælp af rekombinant- DNA-teknologien inden for gensplejsningsteknologien, kan overføres til de nævnte vektorer og de deraf afledte plasmider.
10 Indtil nu har der kun været beskrevet transformation af mælkesyrebakteriestammen, S. lactis, hvilken havde fået fjernet sit naturlige indhold af DNA-plasmid i laboratoriet (Appl. Environ. Microbiol. 48 (1984) 252-259; 726-731). Men S. lactis-stammer, som indeholder plasmider, har også vist 15 sig at kunne transformeres med vektoren beskrevet heri. Det er desuden muligt effektivt at overføre plasmider fra en mælkesyrebakterie til en anden ved hjælp af konjugation.
Dette er også tilfældet for vektoren, som er beskrevet heri.
På denne måde er det således muligt at tilvejebringe 20 adskillige anvendelige plasmidkombinationer i mælkesyrebakterier, uden at være begrænset af den lave transformationsfrekvens, som hidtil er opnået for disse organismer. Det faktum, at S. lactis indtil nu har været den eneste mælkesyrebakterie, som kunne transformeres, udelukker 25 således ikke muligheden for, at andre mælkesyrebakterier kan anvendes som værtsorganisme for vektoren og plasmider afledt heraf. S. cremoris vil være en særdeles anvendelig vært for udviklingen af DNA-ekspressions-elementerne, som er tilstede i ekspressions-vektoren pNZ221, hvilket hidrører fra en 30 cremoris-faq.
12 DK 175068 B1
Anvendelsen af vektoren, som er beskrevet her, ekspressionsvektoren afledt heraf og kloningssystemet for mælkesyrebakterier kan føre til udviklingen af mælkesyrebakterier, som på en effektiv og stabil måde 5 producerer polypeptider. Fagmænd på området vil kunne indse, at anvendelsen af sådanne mælkesyrebakterier vil medføre store fordele inden for fødevareindustrien. En øget, stabil produktion af enzymer, som er en del af mælkesyrebakteriens proteolytiske-system (såsom proteinase og peptidase), vil 10 accelerere udviklingen af den ønskede smag af mejeriprodukter, såsom ost. Desuden kan en mælkesyres bakteriofag-resistens forbedres ved at øge og stabilisere ekspressionen af gener, som hindrer bakteriofagadsorptionen eller ved kloning og ekspression af såkaldte restrik-15 tionsmodifikationssystemer. Tilsvarende kan der udvikles mælkesyrebakterier, som har evnen til at producere chymosin eller andre mælkesyrnende enzymer.
Eksempel I
20
Konstruktion af replikon-screenings vektoren pNZIO. For at kunne isolere og identificere DNA-fragmenter, som har replikonaktivitet i mælkesyrebakterier, blev der konstrueret en replikon-screenings-vektor med betegnelsen pNZIO. Til 25 dette formål blev der som basis anvendt E. coli-plasmid pAT153 (Nature 283 (1980) 216-218) og B. subtilis-plasmid pGL112 (Mol. Gen. Genet. 190 (1983) 56-62); et genkort (physical map) over disse plasmider er vist på fig. 1. Plasmidet pGL112 indeholder tre små Taql-fraqmenter, som 30 hidrører fra pUBHO (J. Bacteriol. 134 (1978) 318-329), hvilke indeholder replikationssignaler for plasmidet (Plasmid 6 (1981) 67-66; J. Bacteriol. 154 (1983) 1184- 13 DK 175068 B1 1194), og et Taql-fragment på 2,5 kb. Taql-fragmentet på 2,5 kb indeholder et Taql-Hpa 11-fragment på 1,3 kb fra pUBHO, hvilket indeholder genet, som koder for kanamycin-(Km)-resistens (J. Bacteriol. 160 (1984) 413-420) og et Hpall- 5 Tagl-fragment på 1,2 kb fra pC194, hvilket indeholder genet, som koder for chloramphenicol-(Cm)-resistens (J. Bacteriol.
150 (1982) 815-825) . Disse antibiotika-resistens-markører kan ikke alene komme til udtryk i Gram-positive bakterier, såsom S. aureus og B. subtilis, men også i E. coli (Proc.
10 Natl. Acad. Sci. 75 (1978) 1433-1436; Mol. Gen. Genet. 183 (1981) 220-226) .
For at fremstille . pNZIO blev 5 yg pGL112 DNA, der var isoleret (som beskrevet i Mol. Gen. Genet. 181 (1981) 424- 15 433) fra B. subtilis-stamme IG33, fuldstændig nedbrudt med 20 enheder restriktionsenzym Taql (Boehringer, Mannheim) i 50 μΐ opløsning indeholdende 10 mM tris,HCL (pH 7,5), 10 mM MgCL2 og 10 mM 2-mercaptoethanol, ved 65°C i 2 timer. Desuden blev 5 yg pAT153 DNA isoleret (som beskrevet i Molecular 20 Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) fra E. coli stamme HB101 rettet ud ved hjælp af 20 enheder restriktionsenzym Clal (Boehringer, Mannheim) i 50 yl opløsning indeholdende 10 mM tris,HCL (pH 8,0) og 10 mM MgCL2, ved 37°C i to timer. Restriktionsfragmenterne blev 25 herefter adskildt på en 0,7% agarose-gelelektroforese (Appl.
Environ. Microbiol. 43 (1982) 1272-1277) og pAT153 DNA'et udrettet med Clal, desuden blev Taql fragmenterne på 2,5 kb fra pGLH2 isoleret på gelen (som beskrevet i Anal. Biochem.
66 (1975) 213-220); de isolerede DNA-fragmenter blev 30 blandet, fældet med ethanol (Biochim. Biophys. Acta 607
(1980) 1-9) og herefter opløst i 17 yl TE- stødpude (10 mM
14 DK 175068 B1 tris,HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA) , opvarmet i 10 minutter ved 68°C og afkølet til 4°C. 2 pi af en 10-gange koncentreret ligase-stødpude (500 mM tris,HCl (pH 7,5); 60 mM MgCl2; 10 mM ATP; 50 mM dithiotreitol) og en enhed af T4-DNA-ligase 5 (Boehringer, Mannheim) blev herefter tilsat. Blandingen blev til sidst inkuberet ved 14°C natten over. Restriktionsenzymet Clal genkender sekvensen CTCGAG og danner såkaldte udragende (protruding) CG 5’ ender, restriktionsenzymet Taql genkender sekvensen TCGA og danner ligeledes protruding CG 5' ender, 10 derfor kan Clal og Taql-fragmenter splejses på en enkel måde ("sticky end" ligation). Desuden kan Clal-Taql-fusioner altid skilles ad igen ved hjælp af restriktionsenzymet Taql, men de behøver ikke nødvendigvis at blive genkendt af restriktionsenzym Clal. Halvdelen af legeringsblandingen 15 blev anvendt til transformering af E. coli stamme BHB2600 (som beskrevet i Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor). Transformerede bakterier, som var resistente over for ampicillin (50 pg/ml) og chloramphenicol (10 yg/ml), blev isoleret ved høj frekvens (2,1 x 103 pr. pg 20 DNA). Fra nogle af disse transformanter blev plasmid-DNA'et isoleret i mikro-skala (Nucl. Acids. Res. 7 (1979) 1513-1523) og analyseret - blandt andet ved hjælp af nedbrydning med Taql. En af transformanterne indeholdt et plasmid kaldet pNZIO med en opbygning, som fremgår af fig. 1. Dette plas-25 mid, pNZIO, replikeres i E. coli ved hjælp af pAT153- replikonet, og det synes at være ansvarlig for værtsorganismens resistens over for canamysin (10 pg/ml). Da pAT153-replikonet ikke er funktionsdygtigt i B. subtilis eller i mælkesyrebakterier, såsom S. lactis, replikeres 30 pNZIO ikke i disse værtsorganismer, derfor er den i særdeleshed anvendelig som replikon-screenings-vektor. pAT153- 15 DK 175068 B1 sektionen af pNZIO indeholder desuden et stort antal genkendelsessteder for Taql, en nedbrydning af pNZIO DNA med Taql medfører, at kun 2,5 kb fragmentet bevares intakt, og som vist på fig. 1 er det netop her, at generne, som koder 5 for antibiotisk resistens, er placeret.
Eksempel II
Anvendelsen af replikon-screenings-vektoren pNZIO ved 10 konstruktionen af kloningsvektoren pNZ12.
Anvendeligheden af replikon-screenings-vektoren kan kontrolleres ved hjælp af eksperimenter, hvor pNZIO DNA nedbrudt med restriktionsenzymet Taql splejses sammen med 15 restriktionsfragmenter, som er udstyret med udragende CG
5'ender, (hvilke dannes ved nedbrydning med restriktionsenzymerne: Clal, Taql, AsulI, Acyl, Maell, Mspl,
Narl og deres isoschizomere - i nogle tilfælde Acc I; jævnfør Gene 33 (1985), 1- 102), og som fortrinsvis hidrører 20 fra mælkesyrebakterie-plasmid. Ligeringsblandingen kan anvendes til transformerning af B. subtilis protoplaster og til selektering af Cm- og/eller Km-resistente transfor-manter. Disse transformanter vil således indeholde rekombinant-plasmider, som i det mindste indeholder 2,5 kb 25 pNZIO TaqI-fragmentet, på hvilket generne for antibiotisk resistens og DNA-fragmenter med replikon-aktivitet i B. subtilis forefindes. Da disse fragmenter ikke er tilstede i pNZIO (jævnfør eksempel I) kan DNA-fragmenter, som optræder med replikon-aktivitet hidrørende fra mælkesyrebakterier 30 udvælges. Det er naturligvis muligt at isolere DNA- fragmenter, som er i besiddelse af replikon-aktivitet, og som hidrører fra andre bakterier, ved at erstatte DNA fra 16 DK 175068 B1 mælkesyrebakterien i ovenstående eksempel med DNA fra den ønskede bakterie.
Kloningsvektoren pNZ12 er en af de vektorer, som er blevet 5 konstrueret ifølge ovenstående fremgangsmåde. Til konstruktionen af denne blev der isoleret DNA- plasmid fra mælkesyrebakteriestammen S. lactis NCD0712 (J. Bacteriol.
154 (1983) 1-9) ved hjælp af en alkalisk ekstraktion (modificeret efter Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523; 10 Third European Congress on Biotechnology, published by
Verlag Chemie, III, 201,206). Til dette formål blev mælkesyrebakterierne dyrket i 1 liter glucose-M17 medium (
Appl. Microbiol. 29 (1975) 807-813) til de havde opnået en extinktionsværdi, E6ocn på ca. 1,0, derefter blev de høstet 15 ved hjælp af centrifugering (10 minutter ved 6.000 omdrejninger pr. minut; GSA rotor Sorvall) ved 4°C, vasket med en sucrose-stødpude (25% sucrose; 20 mM tris,HCl (pH 8,0); 100 mM NaCl; 5 mM EDTA) og resuspenderet i 75 ml sucrose-stødpude indeholdende 500 pg lysozym (55.700 enheder 20 pr. ml; Sigma) pr. ml. Denne blanding blev opvarmet og holdt
ved 37°C, indtil en fuldstændig lysering blev observeret, hvilket indikeres ved afklaringen af opløsningen (normalt efter 10 til 15 minutters inkubation ved 37°C) ; der blev udørt testeksperimenter i mikro-skala, i hvilke 100 μΐ af 25 blandingen blev blandet med 200 μΐ hydroxidopløsning (0,2 N
NaOH; 1% natriumdodecylsulfat) . Til 75 ml af den lyserede blanding blev der tilsat 150 ml friskt fremstillet hydroxidopløsning, den samlede mængde blev efter omhyggelig blanding sat på is i 10 minutter. Herefter blev der tilsat 30 115 ml iskold 3 M kaliumacetatopløsning (pH 4,5 indeholdende eddikesyre); efter blanding blev den samlede mængde igen sat 17 DK 175068 B1 på is - i 10 minutter. Efter centrifugering (20 minutter) ved 4°C blev supernatanten filtreret igennem ostelærred for at fjerne bundfaldspartikler, som var blevet hvirvlet op. Nucleinsyrerne i supernatanten blev fældet med ethanol eller 5 isopropanol og udsat for ligevægtscentrifugering i CsCl- ethidiumbromid (som beskrevet i Appl. Environ. Microbiol. 43 (1982) 1272-1277) for at isolere DNA-plasmidet. 5 yg DNA- plasmid fra S. lactis NCD0712, isoleret på denne måde blev dispergeret med restriktionsenzym Taql og blandet med 2 yg 10 pNZIO DNA, som ligeledes blev nedbrudt med restriktionsenzym
Taql. Restriktionsenzymet blev fjernet ved hjælp af en phenolekstraktion efterfulgt af en ekstraktion med chloroform; DNA'et blev fældet med ethanol og herefter splejset i et slutvolumen på 100 yl, som beskrevet.
15 Halvdelen af ligeringsblandingen blev anvendt til transformering fra B. subtilis stamme IG33 protoplast, (som beskrevet i Mol. Gen. Genet. 168 (1979) 111-115); Mol. Gen.
Genet. 182 (1981) 39-43) og CmR transformanter blev selekteret. En af disse transformanter indeholdt et lille 20 plasmid (4,1 kb) som både producerede KmR og CmR i B. .subtilis . Et genkort over plasmid pNZ12 er ligeledes anført på fig. 1, og det viser, at der er flere unikke genkendelsessteder for restriktionsenzymer på plasmidet, blandt andet for restriktionsenzymerne Bqlll og Apal (begge 25 befinder sig på KmR-genet) samt Sall. Ud fra hybridiseringseksperimenter (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, 1982) var det muligt at fastslå, at pNZl2 ud over 2,5 kb Taql-fragmentet fra pNZIO indeholdt to små Taql-fragmenter (på hhv. 1079 og 599 kb) , 30 som hidrører fra det mindste S. lactis NCD0712 plasmid, pSH71 (J. Bacteriol. 154 (1983) 1-9). Der er blevet foretaget en fuldstændig bestemmelse af nucleinsyresekvensen 18 DK 175068 B1 for dette plasmid på 2.060 bp ved hjælp af standardsekventeringsmetoder (Proc. Natl. Acad. Sci. 7 4 (1977) 5463-5467; Methods in Enzymology 101 (1983) 20-78; ibid. 65 (1980) 499- 560). DNA-sekvensen af samt et genkort 5 over plasmidet pSH71 er vist på fig. 2. Det fremgår heraf, at nucleotidsekvensen af DNA'et, som har replikonaktivitet i pNZ12, omslutter pNZ71 DNA'et fra basesekvens nr. 2-1680.
Fagmænd på området vil kunne indse, at det også er muligt at 10 konstruere plasmider bestående af pNZ12 DNA forlænget med en
eller flere af de andre fem Taql- fragmenter fra pSH71, I
hvilke replikeres i de samme værter som pNZ12. Det har desuden vist sig, at såkaldte miniplasmider, som består af pNZ12's 2,5 kb Taql-fraqment og pSH71's 599 bp Taql-15 fragment, også kan replikeres i B. subtilis og E. coli, hvis pSH71's 2-1680 basesekvens er tilstede i et andet replikon.
EKSEMPEL III
20 Bestemmelse af mulige værter for og kopiantallet af plasmid pNZ12.
For at kunne afgøre, i hvilke værter pNZ12 kan anvendes som vektor, blev pNZ12 DNA transformeret ind i repræsentanter 25 for både Gram-positive og Gram-negative bakterier, i hvilke det var forventet, at generne for antibiotisk resistens ville komme til udtryk. Til dette formål blev E. coli stamme MC1061 (J. Bacteriol. 143 (1983) 971-980) transformeret med 0,5 pg pNZ12 DNA, hvilket resulterede i ca. 106 transforman-30 ter, som var resistente over for 10 pg Cm/ml. Hver tyvende transformant blev undersøgt nærmere for indholdet af plasmider med samme fysiske strukturer som pNZl2. Det viste 19 DK 175068 B1 sig desuden, at pNZ12 også kunne danne Km-resistens i E. coli (10 pg/ml). Protoplast fra S. aureus stamme RN451 (J.
Gen. Microbiol. 33 (1963) 121-136) blev transformeret (som beskrevet i Mol. Gen. Genet. 168 (1979) 111-115; Proc. Natl.
5 Acad. Sci. 79 (1982) 4108-4112) med 1 pg pNZ12 DNA, hvilket
medførte dannelsen af ca. 103 resistente transformanter (10 pg Cm/ml og 50 pg Km/ml). Nogle af disse transformanter blev anvendt til isolering af plasmid-DNA - ifølge den basiske ekstraktionsmetode beskrevet ovenfor - udfra 1 ml 10 cellesuspension, men yderligere tilsat 30 pg lysostaphin pr. I
ml (200 enheder pr. mg; Sigma) under lyseringstrinet. I alle de tolv undersøgte transformanter var der plasmid-DNA med pNZ12's fysiske struktur.
15 S. lactis stamme MG1363 (J. Bacteriol. 154 (1983) 1- 9) blev transformeret ved hjælp af protoplast-transformationsystemet på følgende måde: 50 ml celler dyrket i glucose-M17 bouillon ved 30°C til en extinktionsværdi, Εβοο» på ca. 0,8 blev høstet ved centrifugering (10 minutter, 6.000 omdrejninger pr.
20 minut; SS34 rotor Sorvall) ved 20°C; de blev resuspenderet i 50 ml GSM17 (M17 bouillon indeholder 0,5 M sucrose og 1% glucose) indeholdende 40 mM ammoniumacetatstødpude (pH 7,0) og 1 itiM magnesiumacetat (FEMS Microbiol. Letters 9 (1980) 99-102) samt 1-4 mg lysozym pr. ml (55.700 enheder/mg; 25 Sigma), herefter blev de inkuberet i 2 timer ved 37°C.
Protoplasterne blev isoleret ved centrifugering (10 minutter, 12.000 omdrejninger/minut; SS 34 rotor Sorvall) ved 20°C, vasket med 20 ml SMMC-stødpude (SMM-stødpude (Mol.
Gen. Genet. 168 (1979) 111-115) tilsat 10 mM CaCl2) og re-30 suspenderet i 5 ml SMMC. Transformationen af de vaskede protoplaster blev udført ved, at 100 pi af suspensionen blev 20 DK 175068 B1 tilsat 10 μΐ pNZ12 DNA, som i forvejen var blevet fortyndet med lige dele (v/v) dobbeltkoncentreret SMMC indeholdende 1 pg pNZ12 DNA, samt 300 μΐ 40% polyethylenglycol 6.000 i SMMC. Efter inkubering i fem minutter ved 20°C blev der 5 tilsat 1 ml GSM17; protoplasterne blev isoleret ved centrifugering (1 minut, 12.000 omdrejninger/minut i en Eppendorf 5414 S centrifuge) og opløst i 1 ml GSM17. Efter en ekspressionstid på en time ved 30°C blev der tilberedt forskellige protoplastfortyndinger i GSM17. Disse 10 fortyndinger blev efter gelering med 3 ml GSM17 tilsat 0,7% agar udsået på GSM17 agarplader indeholdende 1,5% agar og 4 pg Cm/ml.
Efter tre dages inkubation ved 30°C blev der fundet ca. 103 15 CmR transformanter pr. pg pNZ12 DNA. Nogle af disse transformanter (udfra 1 ml cellesuspension) blev anvendt til isolering af plasmid-DNA - ved hjælp af den alkaliske ekstraktionsmetode beskrevet ovenfor. I alle de undersøgte transformanter blev der fundet plasmid-DNA med pNZ12's 20 fysiske struktur.
Antallet af pNZ12-kopier i værterne: B. subtilis, E. coli og S. lactis blev bestemt ved hjælp af en hybridiseringsmetode, i hvilken alt det frigjorte DNA fra en kendt mængde celler i 25 log-fase blev påsat Gene Screen Plus filtre (New England
Nuclear) som beskrevet (Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1541— 1550) . Filtrene blev herefter hybridiseret med 32P-mærket pNZ12 DNA (J. Mol. Biol. 113 (1977) 237-251), vasket, tørret og autoradiograferet (Molecular Cloning: A Laboratory 30 Manual, Cold Spring Harbor 1982). Radioaktivitetsmængden (et mål for mængden af pNZ12 DNA i prøverne) blev bestemt og 21 DK 175068 B1 sammenlignet med radioaktivitetsmængden fra et parallelt eksperiment, hvor kendte mængder rent pNZ12 DNA blev anbragt på filtrene. Herefter var det muligt at beregne antallet af pNZ12-kopier pr. bakteriecelle, når antallet af bakterier i 5 den oprindelige kultur tages i betragtning. Som det fremgår af de anførte resultater i tabel 1, er der et stort antal pNZ12-kopier i E. coli og i S. lactis, hvilke er af samme størrelse som den mest anvendte kloningsvektor pAT153 (100-150 kopier pr. celle) i E. coli. Beregningen af udbyttet af 10 plasmid-DNA i S. aureus har vist, at denne bakterie kan indeholde lige så mange pNZ12-kopier. Derimod er antallet af pNZ12-kopier en faktor fem lavere i B. subtilis.
15 Tabel 1 Vært Antal pnZ12-kopier pr. celle E. coli MC1061 98 20 B. subtilis IG33 19 S. lactis MG1363 110
EKSEMPEL IV
25
Kloning af phospho-B-D-galactosidase-genet fra S. lactis i vektor-plasmidet, pNZ12, og ekspression i E. coli, B. subtilis og S. lactis.
30 For at kontrollere anvendeligheden af den oven for beskrevne kloningsvektor pNZ12, blev phospho-β-Ο- galactosidase- (Ρ-β-Gal) genet fra S. lactis klonet i S. lactis, under 22 DK 175068 B1 anvendelse af mellemværter, i hvilke pNZ12 kan replikeres, Ρ-β-Gal-genet blev valgt, fordi genprodukterne kan bestemmes spektrofotometrisk på en enkel måde, når der anvendes chromogensubstratet, o-nitrophenyl-B-D-galactopyranosid-6-5 phosphat (Agric. Biol. Chem. 43 (1979) 2389-2390), derfor er dette gen meget anvendeligt som model-gen ved måling af genekspression. Som udgangspunkt valgtes plasmid pSM76, hvilket indeholder pAT153, hvor Clal-Sall-fragment er udskiftet med et 3,5 kb Clal-Xhol-fragment fra S. lactis 10 NCD0712 plasmidet, pLP712, som netop indeholder Ρ-β-Gal- genet (Genetic Engineering of Microorganisms Important for Agro-Food Industries, CEC, Marseille (1984) 34-35). Eftersom Sall-Xhol-fusionen ikke genkendes af Sall eller Xhol, blev Ρ-β-Gal-genet frigjort fra pSM76 ved nedbrydning med Clal og 15 Nael. Det er tidligere blevet fundet, at Nael ikke "klipper" i S. lactis-sektionen i pSM7 6, derimod er der et Nael-genkendelsessted i pAT153-sektionen - 120 bp fra Clal-Xhol-fusionen (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43 (1978) 77-85) . Eftersom restriktionsenzymet Nael danner DNA-20 fragmenter med såkaldte blunt-ender, blev der valgt en blunt-ende-splejsning for at indsætte DNA-fragmentet, som indeholder Ρ-β-Gal-genet, i pNZ12; på fig. 3 angiver fSN, Sall-Nael-fusionen. Til dette formål blev 5 pg pSM76 DNA nedbrudt med Clal- som beskrevet, det lineære DNA blev 25 fældet med ethanol og overført til 50 pi polymerasestødpude (25 mM tris,HCl (pH 7,8)/ 10 mM MgCl2/ 10 mM dithiothreitol; 0,1 mM dATP; 0, 1 mM dGTP; 0,1 mM dCTP og 0,1 mM dTTP) .
ClaI-genkendelsesstedet blev herefter udfyldt ved tilsætning af 5 enheder DNA-polymerase I "large (Klenow) fragment" 30 (Boehringer, Mannheim) og inkuberet i 20 minutter ved 20°C.
Reaktionen blev stoppet ved inkubering ved 65°C i 10 23 DK 175068 B1 minutter, og DNA'et blev fældet med ethanol, overført til 50 μΐ Nael- stødpude (10 mM tris,HCl (pH 7,5); 10 mM MgCl2/ 50 mM NaCl og 10 mM 2-mercaptoethanol) og nedbrudt ved 37°C i 2 timer med 20 enheder Nael (Boehringer, Mannheim). 3,9 kb 5 fragmentet, som indeholder Ρ-β-Gal-genet blev herefter adskilt fra pAT153-fragmenterne ved hjælp af agarose-gelelektroforese, isoleret, fældet med ethanol og overført til 20 μΐ TE-stødpude (jævnfør eksempel I) . Vektoren pNZ12 blev rettet ud og forsynet med blunt-ender på følgende måde: 10 5 pg pNZ12 blev nedbrudt med 20 enheder Sall (Boehringer,
Mannheim) i 50 μΐ Sall-stødpude (50 mM tris,HCl (pH 7,5); 100 mM NaCl; 10 mM MgCl2 og 10 mM 2-mercaptoethanol) i 2 timer ved 37°C. pNZ12 DNA-strengene blev herefter fældet med ethanol og overført til 50 μΐ polymerase-stødpude. Sall-15 enden blev udfyldt med DNA-polymerase I large (Klenow) fragmenter, som beskrevet tidligere, adskilt ved hjælp af agarose-gelelektroforese, isoleret, fældet med ethanol og overført til 20 μΐ TE- stødpude. 10 μΐ af de udfyldte Clal-Nael fragmenter - beskrevet ovenfor, som indeholder Ρ-β-Gal-20 genet, samt 10 μΐ af vektoren pNZ12, som var blevet rettet ud med Sall og ligeledes udfyldt, blev kombineret, fik til sat 2,5 μΐ 10-gange koncentreret ligasestødpude og splejset sammen ved hjælp af 2,5 enheder T4 DNA-polymerase (jævnfør eksempel I) ved 15°C i 20 timer. 10 μΐ af denne 25 ligeringsblanding blev anvendt til transformering af E. coli stamme MC 1061 til CmRKmR. Transformanter som indeholdt Ρ-β-Gal-genet blev identificeret ved hjælp af kolonihybridisering (Proc. Natl. Acad. Sci. 72 (1975) 3961- 3966) med 32P-mærket pSM76 DNA. En af de positive kloner 30 indeholdt et plasmid pNZ32 med en opbygning, som fremgår af fig. 3. Celler som indeholdt pNZ32 udviste Ρ-β-Gal-aktivi- 24 DK 175068 B1 tet, hvilken efter toluenbehandling blev målt som tidligere beskrevet, hvilket viste, at det intakte S. lactis Ρ-β-Gal-gen blev klonet i pNZ12. For at påvise anvendeligheden af pNZ12 som vektor for Ρ-β-Gal-genet, når de klones i 5 subtilis og i S. lactis, blev pNZ32 isoleret fra E. coli stamme MC 1061 anvendt til transformering af protoplaster fra B. subtilis og fra S. lactis som beskrevet i eksempel II. I B. subtilis stamme IG33 blev der fundet ca. 105 CmRKmR transformanter pr. ug; fra nogle af disse blev der isoleret 10 plasmid DNA, som med hensyn til den fysiske sammensætning var identisk med pNZ32.
I S. lactis stamme MG1363 blev der fundet ca. 103 CmR transformanter pr. yg; fra nogle af disse transformanter 15 blev der isoleret plasmid DNA, som med hensyn til den fysiske sammensætning ligeledes viste sig at være identisk med pNZ32. Ρ-β-Gal-genet udtrykkes både i de to Grampositive bakterier og i E. coli (se tabel 2) . Dette er et udtryk for, at pNZ12 er anvendelig som kloningsvektor i 20 disse værter. Derfor er Ρ-β- Gal-genet desuden anvendelig som model-gen i både E. coli, B. lactis og mælkesyrebakterier.
TABEL 2 25 Ρ-β-Gal-aktivitet (nmol/min/mg protein) uden pNZ32 med pNZ32 30 E.coli MC1061 1 186 B.subtilisIG33 0,1 10 S.lactis MG1363 1 58 25 DK 175068 B1
EKSEMPEL V
Konstruktion af promotor-screeningsvektoren pNZ220.
5 B. subtilis plasmidet pPL603 er en såkaldt promotor screeningsvektor, som kan anvendes til isolering af DNA-fragmenter med promotoraktivitet (J. Bacteriol. 148 (1981) 1162-1165). Udover replikationsfunktionerne og KmR-genet fra pUB 110 (jævnfør eksempel I) indeholder dette plasmid også 10 strukturgenet, som koder for enzymet, chloramphenicol- acetyl-transferase, (CAT), som hidrører fra B. pumilis. De voksende celler har imidlertid ikke CAT-promotor-aktivitet. Umiddelbart opstrøms for CAT-genet ligger et EcoRI-PstI fragment på 203 bp, som let kan udskiftes ved hjælp af 15 EcoRI-PstI polylinkersekvensen, hvilket er blevet beskrevet for dannelsen af pPL703, hvor 21 bp polylinkeren fra M13mp7 blev anvendt (J. Bacteriol. 155 (1983) 1399-1406). Som et resultat heraf bliver der ikke alene dannet nye, supplerende genkendelsessteder for restriktionsenzymer umiddelbart 20 opstrøms for CAT-strukturgenet, men desuden berøves CAT- genet fuldstændigt promotorsekvenserne, som er funktionsdygtige i B. subtilis (J. Bacteriol. 158 (1984) 784-790). På tilsvarende måde udskiftedes pPL603 fragmentet i plasmid pNZ22, som anvendes her (fig. 4), ved hjælp af 28 25 bp EcoRI-Pstl-polylinkeren fra M13mp8 (Gene 19 (1984) 269- 276), som en konsekvens heraf blev der tilført unikke
genkendelsessteder for restriktionsenzymerne: Smal, Bam HI
og Sall. På fig. 4 er genkendelsesstederne for restriktionsenzymerne: EcoRI, Xmal, BamHI, Sall, PstI, 30 Hindlll, Taql og Mbol angivet ved bogstaverne E, X, B, S, P, Η, T og M. Mbol og Xmal er isochizomerer med henholdsvis Sau 3A og Smal. På fig. 4 er placeringen af generne, som koder 26 DK 175068 B1 for antibiotisk resistens ligeledes angivet, og CAT-genet uden promotor fra B. subtilis er anført med en stiplet linie. De fremhævede linier i pNZ12 og pNZ22 angiver de sektioner, som er kombineret i pNZ220.
5
Anvendeligheden af en promotor-screeningsvektor, såsom
pNZ22, kan øges væsentligt ved at udskifte pUBHO
replikationsfunktionerne med de tilsvarende fra pNZ12 (jævnfør eksempel II og III), herved opnås, at antallet af 10 mulige værter øges. På grund af den favorable beliggenhed af genkendelsesstedet for restriktionsenzym Sau3A og tilstedeværelsen af det samme KmR-gen (kanamycin- nucleotidyltransferase-KNT-genet fra pUBllO, J. Bacteriol.
160 (1984) 413-420) i både pNZ22 og pNZ12 kan dette udføres 15 ved ganske enkelt at erstatte 2,2 kb BamHI-BcjlIl-fragmentet i pNZ22 med 3,5 kb Sau3A-fragmentet fra pNZ12 (se fig. 4).
Da restriktionsfragmenterne Sau3A, Bglll og BamHI desuden er udstyret med udstikkende 51GATC-ender, er det muligt at foretage en såkaldt sticky end ligation. Ved denne 20 konstruktion gendannes BamHI's genkendelsessted ved hjælp af sekvensen GATCC.... i det lille Sau3A- Sall-fragment i pNZ12 (hidrørende fra pC194: J.Bacteriol. 150 (1982) 815-825). Et eksempel på et sådant plasmid er promotor-screeningsvektoren pNZ220. Som basis for konstruktionen af denne vektor 25 anvendtes 5 pg pNZ22 DNA, som blev nedbrudt med 20 enheder af restriktionsenzymet BamHI og Bglll (Boehringer, Mannheim) i 50 μΐ Sall stødpude (jævnfør eksempel IV) i 2 timer ved 37°C. Restriktionsfragmenterne blev adskilt ved hjælp af agarose-gelelektroforese, og BamHI- Bglll-fragmentet på 2,2 30 kb blev isoleret og opkoncentreret som beskrevet tidligere og opløst i 20 μΐ TE- stødpude. 5 pg pNZ12 DNA blev nedbrudt i 50 μΐ Sall stødpude med 10 enheder af restriktionsenzym 27 DK 175068 B1
Sau3A (Boehringer, Mannheim) i to timer ved 37°C, og Sau3A-fragmentet på 3,5 kb blev isoleret og opkoncentreret efter en adskillelse - som beskrevet ovenfor - og opløst i 20 μΐ TE-stødpude. 10 μΐ af hver af de to fragmenter (BamHI-BqllI-5 fragmentet fra pNZ22 og Sau3A-fragmentet fra pNZ12) blev blandet og splejset sammen i et volumen på 50 μΐ ved hjælp af T4 ligase - som beskrevet ovenfor. Ligaseblandingen blev anvendt til transformering af E. coli stamme MC1061 - som beskrevet tidligere, transformanter som var resistente 10 overfor 6 pg Km/ml blev dannet med en frekvens på ca. 102 pr.
pg DNA. I en af disse transformanter var der et DNA-plasmid pNZ220, med en struktur som vist på fig. 4. Dette plasmid indeholdt pNZ12's replikationsfunktion, derfor kan det replikeres i B. subtilis, E. coli, S. aureus og 15 mælkesyrebakterier.
Rettes pNZ22 eller pNZ220 ud med et restriktionsenzym, som har et genkendelsessted, der ligger opstrøms i forhold til CAT-genet, og splejses DNA-fragmenter af forskellig 20 herkomst, men fortrinsvis fra maelkesyrebakterier, sammen med det udrettede plasmid-DNA, kan der konstrueres rekombinant-plasmider, som kan transformeres ind i B. subtilis· Med
pNZ220 kan der desuden konstrueres rekombinant-plasmider, som kan transformeres ind i E. coli, S. aureus og mælkesyre-25 bakterier. CmR transformanter kan indeholde DNA-fragmenter I
med promotoraktivitet. Herved bliver resistensniveauet et udtryk for styrken af promotoren.
EKSEMPEL VI 30
Konstruktion af ekspresionsvektoren pNZ221.
28 DK 175068 B1
Anvendeligheden af promotor-screeningsvektoren pNZ22 og pNZ220 til isolering af DNA-fragmenter med promotoraktivitet blev kontrolleret ved konstruktionen af ekspressionsvektoren pNZ221, hvilken består af pNZ220 indeholdende et Sau3A-5 fragment, hvor der befinder sig en kraftig mælkesyrespecifik promotor. Den virulente S. cremoris bakteriofag øSKHG (FEMS Microbiol. Letters 23 (1984) 175-178) blev valgt som kilde for DNA med promotoraktivitet. Det er kendt, at bakteriofager generelt har meget kraftige promotorer (Gene 10 15 (1981) 81-93; Proc. Natl.Acad.Sci. 78 (1981) 4936- 4940; J.Mol.Biol. 153 (1981) 527-544). Fag øSKllG blev multipliceret i S. cremoris stamme SK112 (og oprenset som beskrevet i FEMS Microbiol. Letters 23 (1984) 175-178). 1013 øSKHG partikler svarende til ca. 500 pg øSKHG blev 15 isoleret som beskrevet for larubdabakteriofager (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 1982).
øSKHG DNA er lineært, dobbeltstrenget DNA på cirka 50 kb forsynet med vedhængs- (cohesive) ender. øSKHG DNA’et blev opløst i TE-stødpude i en koncentration på 500 pg/ml. 10 μΐ 20 af øSKllG DNA'et blev nedbrudt fuldstændigt med re striktionsenzymet Sau3A ved de samme betingelser som beskrevet i eksempel V. Restriktionsenzymet blev fjernet ved hjælp af en phenol- og en chloroform-ekstraktion, og DNA-fragmenterne blev fældet med ethanol og opløst i 20 μΐ TE-25 stødpude. Herefter blev 5 pg pNZ22 DNA rettet ud ved hjælp af restriktionsenzymet BamHI, som beskrevet i eksempel V, deproteiniseret, fældet og opløst i 50 μΐ TE-stødpude. 10 μΐ af dette lineære pNZ22 DNA blev blandet med 20 μΐ øSKUG-Sau3A-fragmenter - fremstillet som beskrevet ovenfor, og 30 DNA-blandingen blev splejset med T4 DNA-ligase i et volumen på 50 μΐ. Halvdelen af denne ligeringsblanding blev anvendt til transformering af protoplast fra B. subtilis stamme 29 DK 175068 B1 IG33, og transformanter, som var resistente over for 10 yg Cm/ml, blev udvalgt; der blev fundet cirka 103 sådanne transformanter. En af disse transformanter var resistent overfor 75 yg Cm/ml, og plasmid-DNA'et i denne transformant 5 blev undersøgt nærmere. Dette plasmid, pNZ250 indeholdt et
Sau3A-fragment på 495 bp - hidrørende fra øSKHG, hvilket blev fastslået ved hjælp af hybridiseringseksperimenter med pNZ22's genkendelsessted for BamHI. Fragmentet på 495 bp har promotoraktivitet og nucleotidsekvensen af dette fragment, 10 som er vist på fig. 5, er blevet fastlagt ved hjælp af standardsekventeringsmetoder. På fig. 5 er der understreget 2 promotorsekvenser, og RBS (ribosomal-bindings-sted) er tilkendegivet ved en stiplet linie, desuden er den åbne læseramme, som begynder med startkodon ATG, og de 15 korresponderende aminosyrer anført. Fra DNA-sekvensen i omegnen af genkendelsesstedet for Sau3A kan det udledes, at dette sted også er genkendelsessted for restriktionsenzymet BamHI i pNZ250. Derfor er det let at frigøre promotorfragmentet på de 4 95 bp fra pNZ250 ved nedbrydning med 20 restriktionsenzym BamHI. Der blev gjort anvendelse heraf ved subkloning af promotorfragmentet på 495 bp i pNZ220. Til dette formål blev 5 yg pNZ250 DNA nedbrudt med
restriktionsenzymet BamHI; promotorfragmentet blev isoleret efter polyacrylamid-gelelektroforese (Molecular Cloning: A
25 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 1982), opkoncentreret og opløst i 10 yl TE-stødpude. Herefter blev 5 yg pNZ220 DNA rettet ud med restriktionsenzymet BamHI, deproteiniseret, opkoncentreret og overført til 50 yl TE-stødpude. 10 yl fra hver fragmentopløsning blev splejset sammen i et volumen på 30 50 yl ved hjælp af T4 DNA-ligase, og ligeringsblandingen blev anvendt til transformering af B. subtilis IG33 protoplast; CmR-transformanter blev analyseret for 30 DK 175068 B1 plasmidindholdet. I alle de undersøgte transformanter blev der fundet et plasmid med samme struktur som pNZ221 (vist på fig. 6). Fordi pNZ12's replikationsfunktioner (jævnfør eksempel II, III) er tilstede i pNZ221, kan denne 5 ekspressionsvektor ikke alene benyttes i S. subtilis, men også i E. coli, S. aureus og mælkesyrebakterier.
Placeringen og orienteringen af DNA-sekvensen med promotoraktivitet i pNZ221's 495 bp BamHI-fragment blev 10 undersøgt ved hjælp af subkloningseksperimenter, hvor der blandt andet blev gjort brug af Haelll's asymmetriske genkendelsessted (se fig. 5, position 163). Kun det højrevendte HaeIII-BamHI-fragment viste sig at have promotoraktivitet i både B. subtilis og E. coli. DNA-15 sekvensen i denne fragmentsektion (se fig. 5) viser, at der forekommer to områder efter hinanden, som er homologe med DNA-sekvensen for E. colis og B. subtilis' promotorer (Mol.Gen.Genet. 186 (1982) 339-346). De to afledte S.
cremoris øSKHG promotorer efterfølges af sekvensen 20 AGAAAGGACG (se fig. 5), hvilken er meget komplementær med 16S rRNA's 3’ ender i de Gram-positive bakterier B. subtilis, S. aureus og S. lactis (J.Biol.Chem. 256 (1981) 11283- 11292; J.Gen.Microbiol. 131 (1985) 543-551), og kan derfor fungere som ribosom-bindingssted, RBS. Det forhold,
25 at der forekommer et startkodon (ATG) elleve basepar fra det I
ribosomale-bindingssted, og at dette RBS efterfølges af en åben læseramme på 61 kodoner op til genkendelsesstedet for I
BamHI, tyder på, at det ribosomale-bindingssted er funktionsdygtigt.
Funktionsdygtigheden af de afledte promotor-sekvenser og det formodede RBS, som er udstyret med et start-kodon, ATG, med 30 31 DK 175068 B1
hensyn til ekspression af gener uden disse kontrolelementer, blev demonstreret ved at konstruere et plasmid, pNZ280, inden i E. coli bakterier. Dette plasmid består af plasmid pMC14 03 (J.Bacteriol. 143 (1980) 971-980), i hvilket 495 bp 5 promotor-fragmentet er blevet indført i det unikke BamHI
genkendelsessted. β-galactosidase-(β-Gal)-genet kommer ikke til udtryk i pMC1403, fordi både promotoren og RBS for β-Gal-genet mangler i dette plasmid; de syv første N-terminal-aminosyrer mangler også.
10
Ekspressionen af β-Gal-genet kan kun blive foretaget, hvis det indsatte fragment er udstyret med promotoraktivitet, et RBS med et ATG start-kodon og hvis læserammen er i fase med det ottende kodon i β-Gal- fragmentet.
15 5 pg pMC1403 blev nedbrudt med 20 enheder af restriktionsenzymet BamHI, behandlet med phenol, opkoncentreret og overført til 50 μΐ TE-stødpude. Oprenset 495 bp promotorfragment (udfra 5 pg pNZ250 DNA - fremstillet som beskrevet 20 tidligere) blev splejset sammen med 5 pi pMC 1403 DNA, som var blevet rettet ud ved hjælp af T4-ligase. Kompetente E. coli-celler stamme MC1061 blev transformeret med ligeringsblandingen og udsået på LB-plader indeholdende 100 pg carbenicillin og 40 pg 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-25 galactosid pr. ml. Udover et stort antal farveløse transformanter forekom der også blåfarvede transformanter; blåfarvningen er et udtryk for β-galactosidase-aktivitet (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor 1972). I alle de blåfarvede transformanter, som blev 30 undersøgt, var 495 bp promotor-fragmentet blevet indsat i det unikke genkendelsessted for BamHI i pMC1403, de farveløse transformanter indeholdt blot pMC 1403. Til sidst 32 DK 175068 B1 blev funktionsdygtigheden af 495 bp BamHI-promotor-fragmentet i mælkesyrebakterier demonstreret ved at isolere genet som et 0,6 kb Sall-fragment fra pNZ221 (fig. 6) og ved at indsætte dette i det unikke genkendelsessted for Sall, 5 som er placeret opstrøms i forhold til Ρ-β-Gal-genet i pNZ36
(fig. 7). pNZ32 plasmidet er afledt af pNZ36 (jævnfør eksempel IV) . Ved at fjerne et Sall-Sstl-fragment på cirka 0,6 kb fra pNZ32 efterfulgt af en behandling af de frie ender i den resterende plasmid-fragment med DNA-polymerase I 10 (Klenow fragment) og T4 DNA-polymerase (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 1982) dannes pNZ32 ved en ringslutning af det således behandlede plasmid ved hjælp af T4 DNA-ligase under gendannelse af genkendelsesstedet for Sall.
15
Promotor-fragmentet klones både højre- og venstrevendt i genkendelsesstedet for Sall: promotor-sekvensen, som vender i samme retning som Ρ-β-Gal-genet, afstedkommer pNZ367, og promotor-sekvensen, som vender modsat, afstedkommer pNZ361.
20 Begge plasmider har været transformeret ind i S. Iactis og i begge tilfælde blev ekspressionen af Ρ-β-Gal-genet målt (tabel 3). Det viste sig, at der kun måles høj Ρ-β-Gal-akti-vitet, når promotor-fragmentet har den korrekte orientering i forhold til Ρ-β-Gal-genet, hvilket viser, at promotor-25 fragmentet fungerer effektivt i mælkesyrebakterier.
TABEL 3 Ρ-β-Gal-aktivitet (nmol/min./mg protein) i S. Iactis MG1363 30 _ pNZ361 20 pNZ367 78 33 DK 175068 B1
Bemærkninger til figurerne
Fig. 1 Gen-kort over plasmiderne pGLH2, pAT153, pNZIO og 5 pNZ12 med angivelse af antibiotika resistensgenerne.
Fig. 2 Gen-kort over S. lactis plasmidet pSH71 og nucleotidsekvensen af dette plasmid.
10
Fig. 3 Gen-kort over plasmiderne pSM76 og pNZ32 med angivelse af antibiotikaresistensgenerne og Ρ-β-Gal-genet.
15 Fig. 4 Gen-kort over plasmiderne pNZ22, pNZ12 og pNZ220.
Genkendelsesstederne for restriktionsenzymerne EcoRI, Xmal, BamHI, Sall, PstI, Hindlll, Tagl og Mbol tilkendegives af bogstaverne E, X, B, S, P, Η, T og M. Mbol og Xmal er isochizomere med 20 henholdsvis Sau3A og Smal. Placeringen af antibio tika-resistensgenerne er anført og B. pumilis' promotorløse CAT-gen er angivet ved en punkteret linie. De fremhævede linier i pNZ12 og pNZ22 angiver de sektioner, som kombineres i pNZ220.
25
Fig. 5 Nucleotidsekvensen af pNZ250's Sau3A-fragment på 495 bp indeholder to promotor-sekvenser (understreget), et RBS (prikket linie) og en åben læseramme, som starter med et startkodon (ATG), 30 oversættelsen af sekvensen til aminosyrer er ligeledes anført på figuren.
34 DK 175068 B1
Fig. 6 Gen-kort over ekspressionsvektoren pNZ221 med angivelse af antibiotika-resistensgenerne; B. pumilis1 promotorløse CAT-gen er angivet ved en stiplet linie.
5
Fig. 7 Gen-kort over plasmidet pNZ36 med angivelse af antibiotika-resistensgenerne og Ρ-β- Gal-genet.
Claims (11)
1. DNA fragment, som koder for (a) en replikonaktivitet i mælkesyrebakterier, og for (b) i det mindste et 5 antibiotika-resistensgen, kendetegnet ved, at DNA-fragmentet, som koder for replikonaktiviteten, i alt væsentligt har DNA-sekvensen 2 - 1680, som vist i figur 2, eller en muteret form med samme aktivitet.
2. DNA fragment ifølge krav 1, kendetegnet ved, I at det også har en DNA-sekvens, som koder for en promoteraktivitet og et ribosom - bindingssted i mælkesyrebakterier, som vist i figur 5, eller en muteret form med same aktivitet. 15
3. Fremgangsmåde til isolering af DNA - fragmenter, som koder for replikonaktivitet, kendetegnet ved, at den replikon-screeningvektor, pNZIO, som er vist i figur 1, anvendes i sådanne mikroorganismer, i hvilke i det 20 mindste ét antibiotika-resistensgen kommer til udtryk, men i hvilke replikon fra E. coli ikke er funktionsdygtigt.
4. Rekombinant DNA-plasmid, som indeholder (a) et DNA-frag-ment, som koder for en replikonaktivitet i mælkesyrebakte- 25 rier, og (b) i de mindste ét antibiotika-resistensgen, k e ndetegnet ved, at DNA-fragmentet som koder for en replikonaktivitet, i alt væsentligt har DNA-sekvensen 2 -1680, som vist i figur 2, eller en muteret form med samme aktivitet. 30
5. Rekombinant DNA-plasmid ifølge krav 4, kendetegn e t ved, at det også indeholder et DNA-fragment, som koder
36 DK 175068 B1 for promoteraktivitet og et ribosom-bindingssted i mælkesyrebakterier og som har den DNA-sekvens, der er vist i figur 5, eller en muteret form med samme aktivitet.
6. Rekombinant DNA-plasmid ifølge krav 4 eller 5 , k e n d e t e g e t ved, at det også indeholder et phospho-β -galactosidase gen.
7. Værtsorganisme, som indeholder ét eller flere rekombi- 10 nante DNA-plasmider, kendeteget ved, at re- I kombinant-DNA plasmiderne svarer til plasmiderne, som er defineret i krav 4-6.
8. Værtsorganisme ifølge krav 7, kendetegnet 15 ved, at værtsorganismen udgøres af mælkesyrebakterier, S. aureus, B subtilis eller E. coli.
9. Værtsorganisme ifølge krav 8, kendetegnet ved, at værtsorganismen udgøres af mælkesyrebakterier. 20
10. Værtsorganisme ifølge krav 8, kendeteget ved, at værtsorganismen udgøres af S. lactis
11. Fremgangsmåde til fremstilling af proteiner ud fra 25 dyrkning af en mikroorganisme, som indeholder ét eller flere rekombinant-DNA-plasmider, kendetegnet ved, at en mikroorganisme, som er defineret ved ét eller flere af kravene 7 - 10, dyrkes. 30
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NL8503316 | 1985-11-29 | ||
NL8503316A NL8503316A (nl) | 1985-11-29 | 1985-11-29 | Werkwijze voor het bereiden van proteinen met behulp van gastheer-organismen, in het bijzonder melkzuurbacterien, welke recombinant dna-plasmiden met een hoge replicon-aktiviteit en een hoge promotor-aktiviteit voor het betreffende proteine-coderende gen bevatten, de van dergelijke recombinant dna-plasmiden voorziene gastheerorganismen, de recombinant dna-plasmiden zelve, de replicon-aktiviteit en promotor-aktiviteit coderende dna-fragmenten, alsmede de verkregen proteinen. |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK560686D0 DK560686D0 (da) | 1986-11-21 |
DK560686A DK560686A (da) | 1987-05-30 |
DK175068B1 true DK175068B1 (da) | 2004-05-17 |
Family
ID=19846947
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK560686A DK175068B1 (da) | 1985-11-29 | 1986-11-21 | Fremgangsmåde til fremstilling af proteiner ved hjælp af værtsorganismer, fortrinsvis mælkesyrebakterier |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0228726B1 (da) |
DE (1) | DE3678552D1 (da) |
DK (1) | DK175068B1 (da) |
IE (1) | IE59562B1 (da) |
NL (1) | NL8503316A (da) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL8801529A (nl) * | 1988-06-15 | 1990-01-02 | Nl Zuivelonderzoek Inst | Werkwijze voor het selecteren en stabiel handhaven van recombinant dna in melkzuurbacterien. |
US5149532A (en) * | 1989-11-01 | 1992-09-22 | Cedars Sinai Medical Center | Method of vaccine or toxoid preparation and immunization by colonization with recombinant microorganisms |
WO1991009131A1 (en) * | 1989-12-20 | 1991-06-27 | Valio Finnish Cooperative Dairies Association | Cloning vector for use in lactic acid bacteria |
GB9006400D0 (en) * | 1990-03-22 | 1990-05-23 | Ciba Geigy Ag | Bacterial vectors |
WO1994016086A1 (en) * | 1992-12-30 | 1994-07-21 | Bioteknologisk Institut | Recombinant lactic acid bacterium containing an inserted promoter and method of constructing same |
US5837509A (en) * | 1992-12-30 | 1998-11-17 | Bioteknologisk Institut | Recombinant lactic acid bacterium containing an inserted promoter and method of constructing same |
US6833260B1 (en) | 1999-10-08 | 2004-12-21 | Protein Scientific, Inc. | Lactose hydrolysis |
CA3124393A1 (en) * | 2020-07-10 | 2022-01-10 | Lallemand Hungary Liquidity Management Llc | Process for modulating the nutritional value of whole stillage and distillers products associated thereto |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL8400687A (nl) * | 1984-03-02 | 1985-10-01 | Unilever Nv | Recombinant plasmiden; recombinant plasmiden bevattende bacterien; werkwijze voor het bereiden of vervaardigen van een zuivelproduct; werkwijze voor het bereiden van een eiwit. |
-
1985
- 1985-11-29 NL NL8503316A patent/NL8503316A/nl not_active Application Discontinuation
-
1986
- 1986-11-20 DE DE8686202061T patent/DE3678552D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-11-20 EP EP86202061A patent/EP0228726B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-21 IE IE308086A patent/IE59562B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-11-21 DK DK560686A patent/DK175068B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IE59562B1 (en) | 1994-03-09 |
EP0228726B1 (en) | 1991-04-03 |
NL8503316A (nl) | 1987-06-16 |
EP0228726A1 (en) | 1987-07-15 |
DE3678552D1 (de) | 1991-05-08 |
IE863080L (en) | 1987-05-29 |
DK560686D0 (da) | 1986-11-21 |
DK560686A (da) | 1987-05-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Reverchon et al. | Characterization of kdgR, a gene of Erwinia chrysanthemi that regulates pectin degradation | |
JP4469005B2 (ja) | 選択された生物のための人工プロモーターライブラリー及び該ライブラリー由来のプロモーター | |
US6117651A (en) | Expression vectors | |
US4965197A (en) | Coryneform expression and secretion system | |
US5300431A (en) | Positive selection vector for the bacteriophage P1 cloning system | |
Yamagata et al. | Cloning and characterization of the 5'region of the cell wall protein gene operon in Bacillus brevis 47 | |
JPH0829091B2 (ja) | ハイブリッドpma配列の製造方法及び該方法に使用するベクター | |
Haima et al. | Development of a β-galactosidase α-complementation system for molecular cloning in Bacillus subtilis | |
Smith et al. | Physical and functional characterization of the Bacillus subtilis spoIIM gene | |
US5837509A (en) | Recombinant lactic acid bacterium containing an inserted promoter and method of constructing same | |
Ferino et al. | A promoter-probe vector-host system for the cyanobacterium, Synechocystis PCC6803 | |
Perez-Martinez et al. | Protein export elements from Lactococcus lactis | |
Zukowski et al. | Hyperproduction of an intracellular heterologous protein in a sacUh mutant of Bacillus subtilis | |
JPH04346787A (ja) | Dna、組換えベクター、微生物、dnaの取得法、組換え蛋白質の取得法及び組換え蛋白質 | |
DK175068B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af proteiner ved hjælp af værtsorganismer, fortrinsvis mælkesyrebakterier | |
US5529908A (en) | Lactococcus promoters and signal sequences for heterologous gene expression in bacteria | |
US4634678A (en) | Plasmid cloning and expression vectors for use in microorganisms | |
EP0677110B2 (en) | Recombinant lactic acid bacterium containing an inserted promoter | |
AU652920B2 (en) | Promoter probe vectors, able to replicate in E.coli, B.subtilis, lactococci and lactobacillus as well as uses thereof | |
EP0925364B1 (en) | A lactic acid bacterial regulatable expression system | |
DK173773B1 (da) | Rekombinante plasmider, bakterier med indhold heraf og fremgangsmåde til fremstilling af fermenterede næringsmiddelprodukter, dyrefoder eller proteiner ved hjælp af sådanne bakterier | |
van der Vossen et al. | Characterization of transcription initiation and termination signals of the proteinase genes of Lactococcus lactis Wg2 and enhancement of proteolysis in L. lactis | |
JP2004321013A (ja) | Rhodococcus属細菌における組換えタンパク質を生産する方法 | |
JP3058186B2 (ja) | 新規なクローニング及び/又は発現ベクター、それらの製造方法及びそれらの使用 | |
JP2003504027A (ja) | ラクトバシラス・デルブリュッキイのラクトースオペロンと細菌細胞における遺伝子の転写及び/または発現のコントロールのためのその利用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |