NL8801529A - Werkwijze voor het selecteren en stabiel handhaven van recombinant dna in melkzuurbacterien. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het selecteren en stabiel handhaven van recombinant DNA in melkzuurbacteriën.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het selecteren van melkzuurbacteriën, die recombinant DNA bevatten en het stabiel handhaven van dat DNA met behulp van een in voedingsmiddelen aanvaardbare merker.

Door de ontwikkeling van verschillende gastheer-vector systemen is het mogelijk recombinant DNA technieken toe te passen bij de verbetering van de eigenschappen van melkzuurbacteriën die gebruikt worden bij een groot aantal industriële zuivel- en andere voedselfermentaties (zie FEMS Microbiol. Rev. 4b (1987), 281-325, FEMS Microbiol. Letters kk_ (1987), 173-177). Een aantal verbeteringen waarbij gebruik gemaakt wordt van homologe en heterologe genen is reeds beschreven (zie EP-A 01574414, EP-A-0228726, Nederlandse octrooiaanvrage 87.01378). Onmisbaar bij deze technieken zijn selectie-merkers die gebruikt worden om de bacterie die op de gewenste wijze is veranderd te selecteren. Daarnaast is het in veel gevallen noodzakelijk om selectiedruk uit te oefenen op de verkregen genetisch veranderde bacterie om te voorkomen, dat de gewenste verandering verloren gaat. Dit laatste geldt met name, maar niet uitsluitend, wanneer het recombinante DNA onderdeel is van een recombinant plasmide dat in staat is tot autonome replicatie in de gebruikte melkzuurbacterie.

Een ideale selectie merker voldoet onder meer aan de volgende criteria: (i) verschaft de mogelijkheid tot eenvoudige en dominante selectie; (ii) bestaat uit goed gedefinieerd, bij voorkeur homoloog, DNA; (iii) biedt de mogelijkheid op industriële schaal toegepast te worden; en (iv) is bij gebruik in melkzuurbacteriën, bedoeld voor bijvoorbeeld menselijke consumptie volkomen voedselveilig.

Tot nu toe zijn in melkzuurbacteriën slechts antibioticum-resisten-tie merkers gebruikt die slechts voldoen aan de eerste van de hierboven gestelde criteria. Grote bezwaren bij het gebruik van deze merkers zijn de hoge kosten en het feit, dat in het medium, waarin de bacteriën worden gekweekt, steeds een of meer antibiotica aanwezig moeten zijn, hetgeen een directe toepassing in de voedingsmiddelenindustrie onmogelijk maakt.

Er bestaat derhalve een sterke behoefte aan zogenaamde voedselvei-lige selectie·*merkers, die gebruikt kunnen worden bij de constructie van genetisch gemodificeerde melkzuurbacteriën, die in industriële processen kunnen worden toegepast.

Sommige voedselveilige selectie-merkers, die toepassing zouden kunnen vinden in melkzuurbacteriën, zijn beschreven zoals bacteriofaag-resistentie, bacteriocine-resistentie en het vermogen proteinase te produceren. Deze merkers zijn echter ongeschikt om in industriële processen te worden toegepast omdat bacteriofagen onder praktijkomstandigheden ongewenst zijn, de toevoeging van bacteriocines een kostbare zaak is die niet altijd wettelijk is toegestaan, en proteinase producerende melkzuurbacteriën niet op eenvoudige wijze te herkennen zijn en bovendien snel door mutanten, die geen proteinase produceren worden overgroeid.

Daarnaast bestaat de mogelijkheid om gebruik te maken van zg. auxo-trofe mutanten die, in tegenstelling tot de zg. prototrofe, wild-type stammen, niet in staat zijn tot optimale groei in media zonder supple-mentatie van nutriënten. De genetische informatie voor de synthese van dergelijke nutriënt(en) kan door recombinant DNA-technieken worden verkregen en al of niet samen met een replicon, maar bij voorkeur samen met gen(en) die aanleiding geven tot de synthese van gewenste eiwitten en/of eigenschappen, gebruikt worden als middel om selectiedruk op het genetisch veranderde bacterie te handhaven.

Omdat de meeste wild-type melkzuurbacteriën al een groot aantal nutriënten nodig hebben voor optimale groei is het niet eenvoudig dergelijke auxotrofe mutante melkzuurbacteriën te isoleren. Tevens wordt in industriële processen gebruik gemaakt van media waarin melkzuurbacteriën optimaal groeien en die daarom al zeer rijk zijn aan een groot aantal nutriënten, waardoor een direkte selectiedruk in hoge mate wordt belemmerd. Een oplossing voor vergelijkbare problemen in Bacillus wordt geboden door gebruik te maken van een gastheer, die deficiënt is in een element van de synthese of handhaving van de celenveloppe, in dit geval D-alanine, in combinatie met een extrachromosaal element dat deze behoefte kan onderdrukken, in dit geval coderend voor het D,L-alanine racemase (EP-A-0.185.512). Het is echter de vraag wat de betekenis is van D-alanine voor de integriteit van de celenveloppe van melkzuurbacteriën, of melkzuurbacteriën een D,L-alanine racemase bezitten, of mutanten te verkrijgen zijn, die gestoord zijn in de synthese van D,L-alanine racemase, ên/of bij groei op de complexe media, die gebruikt worden voor het kweken van melkzuurbacteriën, de eigen synthese van D-alanine noodzakelijk is.

Een voorbeeld van een auxotrofe merker waarop deze beperkingen niet van toepassing zijn, is het vermogen lactose te vergisten. Omdat lactose de enige vergistbare suiker is, die in melk of van melk afgeleide media aanwezig is, kunnen melkzuurbacteriën die het vermogen om lactose als energiebron te gebruiken hebben verloren (zg. lactose-deficiënte, lac-mutanten) niet in deze media groeien» Alle in de zuivelindustrie gebruikte melkzuurbacteriën bezitten derhalve het vermogen om lactose te vergisten.

De wijze waarop deze lactosevergisting plaats vindt is in een aantal gevallen goed beschreven. Met name de wijze waarop de mesofiele melkzuurbacteriën Streptococcus lactis en Streptococcus cremoris (recent hernoemd tot Lactocoecus lactis subsp. lactis en Lactococcus lactis subsp. cremoris, respectievelijk; Syst.Appl.Microbiol. (1985) 183-195) lactose vergisten tot lactaat is goed onderzocht en weergegeven in Fig. 1. Hieruit valt af te leiden dat de lactosevergisting in deze melkzuurbacteriën een complex proces is, waarbij ten minste 19 verschillende, door enzymen gekatalyseerde, reakties betrokken zijn.

Genetisch onderzoek heeft uitgewezen, dat in deze groep melkzuurbacteriën in veel gevallen de genen, coderend voor de enzymen, betrokken bij de lactose vergisting, gedeeltelijk op het bacteriële chromosoom en gedeeltelijk op extrachromosomaal plasmide DNA gelegen zijn. Wanneer uit een dergelijke stam het plasmide coderend voor genen die bij de lactosevergisting betrokken zijn (zg· lactose-plasmide) verloren gaat, is de bacterie niet meer in staat om lactose te vergisten. Dergelijke lac- mutanten kunnen op eenvoudige wijze verkregen worden door het toepassen van plasmide-curings-methoden en zijn op eenvoudige wijze van een lac+ stam te onderscheiden (J.Bacteriol· 154 (1983) 1-9; Appl.Microbiol. 23_ (1972) 1090-1096).

Lactose-plasmiden kunnen met behulp van diverse genetische methoden als conjugatie, transductie, protoplast-fusie en transformatie worden overgebracht van een lac+ naar lac- stammen (Ant.van Leeewenhoek 49^ (1983), 257-282; Appl.Environ.Microbiol. 48_ (1984), 252-259). Bij plas-mide-transfer met behulp van transductie bestaat de mogelijkheid, dat een lactoseplasmide geheel of gedeeltelijk geïntegreerd wordt in het chromosomale DNA van de recipiënte melkzuurbacterie (Appl.Microbiol. 36 (1978), 360-367).

Het is aangetoond dat in L.lactis C2 de genen coderend voor de lactose specifieke enzymen, Enzyme II, Factor III en P-/6 -galactosidase (*7* -Gal), zg. lactose-genen, gelegen zijn op een ca. 50 kb. plasmide DNA (J.Bacteriol. 102 (1970), 804-809; Appl.Environ.Microbiol. 35 (1978), 592-600). Voorts bestaan er aanwijzingen dat in L.lactis stammen tevens de tagatose- genen coderend voor de enzymen van de tagatose-6P-pathway, te weten galactose-6-P-isomerase, tagatose-6-P-kinase en tagatose-l,6-diP-aldolase, op een lactoseplasmide DNA zijn gelokaliseerd (J.Bacteriol. 153 (1983) 76-83)· Opmerkelijk is, dat de door de lactose-en tagatose-genen gecodeerde enzymen niet onmisbaar zijn voor een melkzuurbacterie omdat de vèrgisting van suikers anders dan lactose (en soms galactose), zoals glucose, mogelijk blijft. De L.lactis genen coderend voor -Gal en tagatose-l,6-diP-aldolase zijn gekloneerd in Escheri-chia coli (J.Gen.Microbiol. 132 (1986), 331-340; FEMS Microbiol. Letters 33 (1986), 79-83), terwijl alleen het -Gal gen eveneens in L.lactis is gekloneerd en tot expressie gebracht (EP-A-0.228.726).

In L.lactis NCDO 712 is aangetoond, dat de plasmide-gelokaliseerde genen van het lactosemetabolisme mogelijk gelegen zijn op een circa 12 kb restrictie-fragment (zg. BclIB fragment) afkomstig van het grootste, 56,5 kb plasmide pLP712 (J.Bacteriol. 154 (1983), 1-9). Dezelfde genen zijn gelegen op een deletiederivaat van pLP712, het lactose miniplasmide pMG820, dat echter nog steeds een afmeting heeft van 23,7 kb (J.Gen. Microbiol. 132 (1986), 331-340).

Door een plasmide-vector, waarin opgenomen het 12 kb BclB restrictief ragment, bevattende de pLP7l2 lactose-genen, te introduceren in een L.lactis stam waruit het lactoseplasmide is verwijderd, zou wellicht het vermogen lactose te vergisten weer kunnen worden hersteld. Deze methode wordt in EP-A-0.157.441 als mogelijk beschreven, hoewel er geen daadwerkelijk voorbeeld van een uitvoering wordt gegeven. Een probleem hierbij is de afmeting van het BclIB fragment dat niet alleen de drie lactose-genen maar waarschijnlijk ook drie tagatose-genen bevat. Omdat een klo-neringsvector inclusief de selectie-merker bij voorkeur zo klein mogelijk is in verband met manipuleerbaarheid en kopie-aantal, ligt het gebruik van dit grote BclB fragment in de praktijk niet voor de hand.

Het gebruik van lactose-deficiënte melkzuurbacteriën waarin, anders dan de hierboven vermelde mutanten, slechts een of twee van de lactose-genen gemuteerd zijn, en die gecomplementeerd kunnen worden met kleine, goed gedefinieerde DNA-fragmenten, zijn daarom te prefereren. Beschrijving van de uitvinding

De uitvinding verschaft nu een werkwijze voor een in voedingsmiddelen aanvaardbare en toepasbare merker waarbij een melkzuurbacterie die een of twee, voor de lactosevergisting onmisbare, enzymen met voldoende aktiviteit mist wordt getransformeerd met een DNA-fragment dat, als merker, codeert voor de in bedoelde melkzuurbacterie ontbrekende, voor lactosevergisting onmisbare enzymen.

In deze vinding staan twee onderdelen centraal: de lactose-deficiënte melkzuurbacterie en het DNA-fragment coderend voor ten minste één of meer enzymen van het lactosemetabolisme.

De lactose-deficiënte melkzuurbacterie is niet in staat lactose te vergisten omdat bedoelde melkzuurbacterie êén of twee van de enzymen die essentieel zijn voor de vergisting van lactose, hetzij volledig mist, hetzij bezit, met dien verstande, dat dit enzym of deze enzymen onvoldoende enzymatische aktiviteit bezit, resp. bezitten, om met de gewenste snelheid lactose om te zetten. Het is daarbij gewenst dat de bedoelde melkzuurbacterie zich, afgezien van het onvermogen lactose te vergisten, niet onderscheidt van andere melkzuurbacteriën die in industriële fermentaties worden toegepast. De aard van de genetische deficiëntie kan zijn een deletie, insertie of puntmutatie in het DNA, coderend voor een enzym dat betrokken is bij het lactosemetabolisme. Bij voorkeur betreft de deficiëntie de lactose- of tagatose-genen. In het bijzonder zijn de Factor III- of P-^-Gal-genen zeer geschikt, omdat bekend is, dat deze coderen voor relatief kleine, biochemisch goed gekarakteriseerde intracellulaire, oplosbare enzymen.

Bedoelde deficiëntie kan op diverse wijzen worden gerealiseerd zoals door klassieke, lukrake mutagenese met behulp van bestraling met ultraviolet licht of behandeling met mutagene stoffen als ethylmethaan-sulfonaat of nitrosoguanidine. Tevens kunnen lactose-deficiënte mutanten worden verkregen door middel van transposon-mutagenese. Eveneens kan gebruik gemaakt worden van plaatsgerichte mutagenese met behulp van recombinant DNA-technieken in combinatie met de beschreven transformatiesy-stemen. Een mogelijkheid hierbij is de vervanging van het wild-type gen door het veranderde lactose-gen door middel van integratie in het DNA van de melkzuurbacterie. Indien het te muteren lactose-gen op een plas-mide is gelokaliseerd, bestaat de mogelijkheid om in vitro het wild-type gen te vervangen door het veranderde lactose-gen, en het zodanig gemuteerd lactoseplasmide weer in een melkzuurbacterie te introduceren. Bij voorkeur vindt een dergelijke manipulatie plaats met een klein lactoseplasmide. Het lactose-mini-plasmide pMG820 is hiervoor zeer geschikt. Daarnaast is het mogelijk om een lactoseplasmide, hetzij voor, hetzij na mutagenese, te integreren in het chromosomale DNA van de melkzuurbacterie door gebruik te maken van transductie. Deze techniek biedt tevens de mogelijkheid om geïntegreerde lactosegenen van de ene melkzuurbacterie-stam op de andere over te dragen.

Voor toepassingen is het gewenst, dat de lactose-deficiënte melkzuurbacterie een stabiele mutant is, waarin slechts met een lage frequentie terugmutatie naar een lactose-proficient phenotype optreedt.

Bij voorkeur gebruikt men als melkzuurbacterie een Lactococcus of een Lactobacillus. Het is bekend dat bacteriën van die soort geschikt zijn voor toepassing in verschillende industriële fermentaties en tevens dat ze lactose vergisten volgens de wijze aangegeven in Fig. 1. Daarnaast kunnen recombinant DNA-technieken worden toegepast in deze melkzuurbacteriën. In het bijzonder is Lactococcus lactis zeer geschikt vanwege het gebruik van deze melkzuurbacterie in een groot aantal zuivel-fermentaties waarin lactose de enige vergistbare suiker is.

Het DNA-fragment, dat in de lactose-deficiënte melkzuurbacteriën als merker wordt gebruikt, moet coderen voor de één of twee enzymen, die in bedoelde melkzuurbacterie ontbreken of onvoldoende aktiviteit bezitten. Dit betekent, dat bedoeld DNA-fragment zowel de structurele informatie voor deze een of twee enzymen moet bevatten alsook mogelijkerwijs de expressiesignalen, die noodzakelijk zijn om een zodanige expressie te realiseren, dat wild-type vergisting van lactose mogelijk wordt. Een dergelijk DNA-fragment is te verkrijgen door de bedoelde lactose-deficiënte melkzuurbacterie te complementeren onder toepassing van de voor melkzuurbacteriën en andere bacteriën ontwikkelde gastheer-vector- en expressiesystemen. Een bijzonder voorbeeld hiervan wordt gegeven in EP-A-0.228.726, waar de stapsgewijze klonering en expressie in L.lactis van het pMG820 gecodeerde P-y^-Gal gen wordt beschreven.

De lactose-deficiëntie van de gebruikte melkzuurbacterie bepaalt het aantal en de aard van de genen, die coderen voor de in bedoelde melkzuurbacterie ontbrekende, voor de lactosevergisting onmisbare enzymen. Bij voorkeur wordt gebruik gemaakt van de lactose- en tagatose-genen. In het bijzonder bruikbaar zijn de genen coderend voor P-yS-gal en Factor III, die klein van afmeting zijn, op bruikbare restrictie-fragmenten kunnen worden geïsoleerd, en die L.lactis mutanten, deficiënt in de synthese van deze enzymen, kunnen complementeren.

Tevens kan het bedoelde DNA-fragment coderen voor een of meer functies, die de melkzuurbacterie een verbeterde of nieuwe eigenschap(pen) geeft, resp. geven. Voorbeelden hiervan zijn de structurele genen inclusief expressie- en regulatiesignalen die coderen voor proteinases en peptidases die de melkzuurbacterie in staat stellen eiwit af te breken in peptiden en/of aminozuren, of voor bacteriofaag-resistentie-mechanis-men, of voor enzymen die de afbraak van citraat beïnvloeden, of voor enzymen betrokken bij bacteriocine-produktie en/of -immuniteit, of coderen voor heterologe eiwitten zoals het lactose-hydrolyserende β -galac-tosidase, het zetmeel splitsende oC -amylase of het melkstremmende chymo-sine, die al dan niet door de melkzuurbacterie kunnen worden gesecre-teerd.

Daarnaast kan het DNA-fragment een replicon bevatten dat in melk- zuurbacteriën functioneel is en waardoor het DNA-fragment, indien gecir-culariseerd, als extrachromosomaal plasmide verdeeld wordt over de nakomelingen van de gebruikte melkzuurbacterie. Een dergelijk DNA-fragment kan dan direkt, of na enige verbeteringen die voor een ieder die bekend is met de stand van de techniek duidelijk zijn, gebruikt worden als klonerings-, expressie- of secretievector. Voorbeelden van goed bruikbare replicons zijn die afkomstig van het L.lactis plasmide pSH71 of het conjugatieve plasmide pAHySl, die met een hoog dan wel met een laag kopieaantal in een groot aantal melkzuurbacteriën kunnen repliceren.

In het complementaire geval dat het DNA-fragment juist geen functioneel replicon bezit, kan overerving slechts worden bereikt indien het DNA-fragment geheel of gedeeltelijk geïntegreerd wordt in een replicon (hetzij een plasmide, hetzij het chromosomale DNA) dat reeds in de getransformeerde melkzuurbacterie aanwezig is. De efficiëntie van deze gebeurtenis wordt in het algemeen verhoogd wanneer bedoeld DNA-fragment tevens DMA-sequenties bezit die homoloog zijn met delen van deze reeds aanwezige replicons. Integratie in het bacteriële chromosoom biedt tevens de mogelijkheid om het geïntegreerde DNA te amplificeren. Selectie hierop kan op eenvoudige wijze plaats vinden indien het als merker gebruikte DNA-fragmênt, bijvoorbeeld door de aanwezigheid van zwakke ex-pressiesignalen, slechts na amplificatie tot een hoog kopie-aantal resulteert in wild-type expressie van het DNA dat codeert voor de complementerende en voor de lactosevergisting onmisbare enzymen.

De combinatie van bedoelde melkzuurbacterie en DNA-fragment dient tenslotte zo gekozen te worden, dat daadwerkelijke selectie en stabiele handhaving van het DNA-fragment plaats kan vinden wanneer lactose als enige vergistbare suiker aanwezig is in het te gebruiken kweekmedium. mrPRBTMRNTRRT. THÜVT.

Gebruikte bacteriële stammen en plasmiden

De E.coli stammen JM83 (Gene 19_ (1982) 259-268) werd gebruikt voor de routinematige subkloneringen met pUC-vectoren. Voorts werd E.coli JM1G3 (Nucl.Acids Res. _9 (1981) 309-321) gebruikt voor M13 kloneringen en E.coli MC1061 (J.Mol.Biol. 138 (1980) 179-207) voor kloneringen gebruikmakend van de vector pAT153 en pNZ12. Stam MG1363 is een plasmide-vrije afgeleide stam van L.lactis NCDO 712 (J.Bacteriol. 154 (1983) 1-9). Stam MG1820 is een derivaat van MG1363 dat het mini-lactose plasmide pMG820 bevat (J.Gen.MIcrobiol. 132 (1986) 331-340). Beide L.lactis stammen zijn afkomstig van M.J. Gasson, AFRC Institute of Food Research, Norwich U.K.). L.lactis Y2-5 is een Factor III-deficiënte mutant, verkregen door ethylmethaansulfonaat mutagenese van stam YP2. L.lactis YP2 is een lactose-constitutieve afgeleide van L.lactis C2, waarin de plas-mide gecodeerde genen coderend voor het lactose-metabolisme zijn geïntegreerd in het chromosomale DNA met behulp van transductie (J.Bacteriol. 149 (1982) 420-427, J.Dairy Sc. 67_ (1984), 950-959). L.lactis Y2-5 is afkomstig van L.L. McKay, University of Minnesota, St. Paul, USA.

De E.coli plasmidevectoren pUC7 en pUC18/19 hebben een afmeting van circa 2,7 kb en coderen voor ampicillineresistentie (ApR) (Gene 19_ (1982), 259-268; Gene 33_ (1985), 103-119). De E.coli vector pAT153 (Nature 283 (1980) 216-218) is circa 3.7 kb en codeert voor ApR ook voor tetracyclineresistentie (TcR). De M13 vectoren MplO en Mpll zijn beschreven (Nucl. Acids Res. 9_ (1981), 309-321).

De L.lactis plasmidevector pIL253 (Biochimie 70_ (1988), deel3 en 4) heeft een afmeting van ca. 4.8 kb, codeert voor erythromycine-resisten-tie (EmR) en is een hoog kopie-aantal derivaat van het conjugatieve plasmide pAM^l (Appl.Environ.Microbiol. 52^ (1986), 394-399) en is afkomstig van A. Chopin, INRA, Jouy-en-Josas, Frankrijk. De constructie van de 4.3 kb plasmidevector pNZ12, replicerend onder meer in E.coli en melkzuurbacteriën, en coderend voor resistentie tegen chloramphenicol (CmR) en kanamycine (KmR), is beschreven, evenals pNZ32 (7.5 kb) en pNZ367 (8.3 kb) die beide het L.lactis pMG820 P^-Gal, gekloneerd in pNZ12, bevatten (EP-A-0.228.726).

Manipulatie van E. coli, S. lactis en DNA

Alle manipulaties met E.coli en van DNA in vitro werden uitgevoerd volgens standaardprocedures (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 1982) en/of zoals beschreven door de leveranciers van de restrictie- en andere DNA modificerende enzymen (Bethesda Research Laboratories en Boehringer). Specifieke technieken voor L.lactis zoals kweek en media, plasmide-isolatie en protoplasttransformatie zijn beschreven (Appl.Environ.Microbiol. 48^ (1984), 252-259); EP-A-0.228.726). M17 medium (Difco) aangevuld met 0,5 % lactose (LM17) of 0.5 % glucose (GM17) werd routinematig gebruikt voor het kweken van L.lactis. Tevens werd in de stabiliteitsexperimenten met L.lactis gebruik gemaakt van een weipermeaat (WP) medium dat bestaat uit 5 % geultrafiltreerde en gedroogde wei bevattend 1,9 %/4 -glycerofosfaat, 0,05 % gistextract en i 0,05 % caseïnehydrolysaat. Dit in de zuivelindustrie toepasbare WP medium bevat lactose als enige vergistbare suiker. Lactose-indicator agar (LIA) bevattend Elliker bouillon, lactose en de pH-indicator bromo-cresolpurple werd gebruikt voor de selectie van lac+ en lac- kolonies zoals beschreven (Appl.Microbiol. 23^ (1972), 1090-1096). Hele cellen van L.lactis, voorgekweekt in M17 medium bevattend 40 mM D,L-threonine, werden getransformeerd met behulp van een Gene Pulser Electroporator in electroporatie buffer bestaande uit 25 % sucrose, 1 M MgCl2 en 5 mM K-fosfaatbuffer pH 7,0, in wezen volgens instructies van de leverancier (Biorad) met een enkelvoudige elektrische puls van 6250 V/cm en een capaciteit van 25 uF.

Bepaling DNA-nucleotide volgorde en DNA-synthese

Geschikte restrictiefragmenten werden gekloneerd met behulp van M13-vectoren gekloneerd in JM103 (Nucl.Acids Res. _9 (1981), 309-321) en de nucleotide-volgorde werd bepaald met de dideoxyketen-terminerings-methode (Proc. Natl.Acad.Sci. 74_ (1977), 5463-5467). DNA-oligonucleoti-den, te gebruiken als primer voor de DNA-volgordebepaling of voor de constructie van mutaties, werden gesynthetiseerd volgens de foforoamidi-te-methode met behulp van een Cyclone DNA synthesizer volgens aanwijzingen van de leverancier (New Brunswick Scientific).

Eiwitanalyse

Eiwitten werden geanalyseerd met behulp van SDS-polyacrylamidegel-elektroforese (Nature 227 (1970), 680-685), in voorkomende gevallen gevolgd door kleuring met Coomassie-blauw. Bepaling van de NH2-terminus van geblot eiwit vond plaats met behulp van een gasfase-sequenator (Applied Biosystems) als beschreven (Eur.J.Biochem. 152 (1986), 9-19). Immunoblotting vond plaats met behulp van konijn-antilichamen in combinatie met peroxidase gelabelde geit-antikonijn-antilichamen als beschreven door de leverancier (Bethesda Research Laboratories). De aktiviteit van het P-^-Gal werd bepaald als beschreven (J.Gen.Microbiol. 132 (1986) 331-340).

VOORBEELDEN

Voorbeeld 1

Identificatie, karakterisering en klonering van de S.lactis pMG820 gecodeerde lactose-genen.

Het 4.4 kb Xhol fragment van het L.lactis mini-lactose plasmide pMG820 bevat het P-y5-Gal gen (J.Gen.Microbiol. 132 (9186), 331-340; zie Fig. 2A). De DNA-sequentie van dit gen en circa 2 kb van het stroomopwaarts gelegen DNA zijn bepaald en weergegeven in Fig. 2B. Naast een open leesraam op de positie verwacht voor het P-y5"Gal gen zijn er twee open leesramen aanwezig in dit stroomopwaarts gelegen gebied. De volgende experimenten ondersteunen de conclusie dat het eerste open leesraam (129-448) codeert voor de Factor III-lactose, het tweede open leesraam (450-2158) codeert voor Enzyme II-lactose, en het derde open leesraam (2262-3669) codeert voor het P-^-Gal: (i) de NH2-termini van gezuiverd Factor III en P-^-Gal komen overeen met die afgeleid uit de DNA-sequentie van de eerste en laatste open leesramen.

(ii) een DNA-fragment bevattend het eerste open leesraam geeft, wanneer gekloneerd in E.coli, aanleiding tot de synthese van een eiwit met een subunit molecuulgewicht van circa 10 kD, dat reageert met anti-Factor III antilichamen.

(iii) een DNA-fragment bevattend het derde open leesraam geeft, wanneer gekloneerd in E.coli, aanleiding tot de synthese van een circa 60 kD eiwit dat -Gal aktiviteit bezit.

(iv) de aminozuurvolgorde afgeleid uit de DNA-sequentie van het tweede open leesraam geeft, wanneer geanalyseerd in een zg. hydrofibiciteits-plot (J.Mol.Biol. 157 (1982) 105-132) de transmembraan-domeinen, die verwacht worden voor een integraal membraaneiwit als Enzyme II.

(v) zowel de nucleotidenvolgorde van het DNA in alle drie open leesramen als ook de hieruit afgeleide aminozuurvolgorde vertonen een hoge mate van homologie met die van Factor III, Enzyme II en Py^-Gal van Sta-phylococcus aureus (J.Biol.Chem. 262 (1987) 16444-16449).

De lactose-genen worden gevolgd door een mogelijk intercistronisch gebied van 23Γ nucleotiden, waarna op positie 3959 een nieuw open reading frame van minimaal 700 nucleotiden start dat waarschijnlijk codeert voor het 50 kD protein X, waarvan het bestaan eerder is aangetoond (J.Gen.Microbiol. 132 (1986) 331-340) en dat mogelijk een rol speelt bij de expressie van de lactose-genen.

Voorbeeld II

Complementatie van een L.lactls Y2-5 door een DNA-fragment bevattend het pMG820 Factor III gen.

Het plasmide pMG820 werd geknipt met het restrictie-enzym BstEII waarna de ontstane restrictiefragmenten blunt werden gemaakt met Klenow-polymerase. Een circa 4 kb fragment, bevattende het complete Factor III gen en stroomopwaarts gelegen gebieden, werd geïsoleerd en gekloneerd in de Hindll site van de E.coli vector pUC7. Het resulterende plasmide pNZ301 werd gebruikt als bron voor de isolatie van het Factor III gen met zo weinig mogelijk flankerende DNA-sequenties. Dit vond plaats door het Factor III gen als een 0.4 kb NcoI-XmnI-fragment (zie Fig. 2B) te isoleren en na het blunt te maken met T4 Polymerase te kloneren in de

Hindll site van de E.coli vector pUC7. Uit het resulterende plasmide pNZ302 werd het Factor III gen als een BamHI fragment geïsoleerd en gekloneerd in de BamHI site van de E.coli vector pUC18. Twee oriëntaties werden verkregen, aangeduid als pNZ303 en pNZ304. Uit pNZ303 werd het Factor III gen als een 0.4 kb Xbal-EcoRI-fragment geïsoleerd en geli-geerd met het 4.8 kb Xbal-EcoRI-fragment van de L.lactis vector pIL253 (Fig. 3). Evenzo werd uit pNZ304 het Factor III gen (0.4 kb) bevattende Xbal-EcoRI-fragment geïsoleerd en geligeerd met het 4.8 kb Xbal-EcoRI-fragment van pIL253. Beide ligatiemengsels werden getransformeerd naar L.lactis Y2-5. Uit zowel de transformatie met het ligatiemengsel bevattende pNZ303 DNA als die met het ligatiemengsel bevattende pNZ304 DNA werden EmR kolonies verkregen die de gewenste plasmiden bleken te bevatten met een afmeting van 5.2 kb, resp. pNZ305 en pNZ3Q6, waarvan de re-strictiekaart is afgebeeld in Fig. 3. Echter alleen pNZ305 bleek de lac-tosedeficiëntie van de gastheer Y2-5 te complementeren. De verklaring hiervoor is gelegen in het feit dat het geïsoleerde Factor III gen geen eigen promoter bevat en derhalve aangewezen is op een externe promoter, die in de juiste oriëntatie voor het gen gekloneerd kan worden, die in het construct pNZ305 reeds op het vectorgedeelte aanwezig is. Hierdoor is L.lactis bevattend pNZ305 in staat tot de vorming van in-gele kolonies op lactose indicator agar en wild-type groei op media die lactose als enige suiker bevatten.

L.lactis Y2-5 bevattend pNZ305 is gedeponeerd* bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures te Baarn op 13 juni 1988 onder nummer CBS 416.88.

Voorbeeld III

Selectie van S.lactis Y2-5 transformanten bevattend pNZ305 zonder gebruik te maken van antibiotica.

S. lactis Y2-5 werd getransformeerd met 1 /ug pIL253, pNZ305 of geen DNA, en lactose-proficiënte en/of erythromycine-resistente kolonies werden geselecteerd. Het resultaat weergegeven in tabel 1 geeft aan dat vergelijkbare hoeveelheden lac+ EmR en EmR transformanten verkregen werden met pNZ3Q5 DNA maar niet met de vector pIL253 DNA. Ook directe selectie van pNZ3Q5 DNA bevattende transformanten op LIA zonder antibioticum bleek mogelijk. De achtergrond van lactose-proficiente revertanten (ca. 4 10^ met geen DNA of pIL253 DNA) gaf hierbij geen grote problemen omdat van de 6 10^ lae+ transformanten verkregen met pNZ305 DNA er 20 % ook EmR bleken te zijn. Deze lac+ transformanten bleken zoals te verwachten het pNZ305 plasmide DNA te bevatten. Selectie van lac+ trans formanten op lactose indicator agar gevolgd door een eenvoudige plasmide screening is dus voldoende om zonder gebruik te maken van antibioticum-resistentie-merkers S.lactis Y2-5 transformanten te verkrijgen die het recombinante plasmide pNZ305 coderend voor onder meer Factor III bevatten.

Voorbeeld IV

Stabiliteit van S. lactis Y2-5 bevattend pNZ305.

Vanuit een losliggende kolonie van S.lactis Y2-5 bevattend pNZ305 werd een overnacht-culture gemaakt in LM17 medium met 5 /ug/ml Em. Door een duizendvoudige verdunning werden hieruit drie 10 ml cultures op LM17, WP en GLM 17 medium bereid. Deze werden geïncubeerd bij 30°C en elke 10-14 uur 1 op 1000 doorverdund in vers medium van dezelfde samenstelling.

Regelmatig werd de hoeveelheid lac+ en lac- alsmede lac+ EmR-cellen bepaald door uitplaten op LIA zonder of met 5 /ug/ml Em of door het overstrepen van lac+ of lac- kolonies op LIA met 5 /ug/ml Em. Het resultaat na 50 of 100 generaties groei in de verschillende media zoals in Tabel 2 is weergegeven, geeft aan dat pNZ305 instabiel is onder niet-selectieve condities (glucose als suiker). Het plasmide wordt echter gestabiliseerd bij groei onder selectieve condities (lactose als suiker), zowel in de bouillon LM17 als in het industrieel toepasbare medium WP. Alle lac+ cellen blijken verder EmR te zijn, waaruit geconcludeerd kan worden dat er geen genconversie van het chromosomale gemuteerde Factor III gen naar de plasmide-gelokaliseerde homologe kopie optreedt, wat zou resulteren in een lac+ phenotype en plasmideverlies onder niet-selectieve condities.

Tenslotte blijkt, dat het gehele plasmide DNA in het chromosoom geïntegreerd wordt indien stam S. lactis Y2-5 bevattende pNZ305 gedurende 50 generaties op een LM17-medium wordt gekweekt. Hybridisatie-experi-menten hebben aangetoond, dat in dit geval er amplificatie tot meer dan 25 kopieën van het gehele plasmide DNA bereikt wordt.

Voorbeeld V

Constructie van een deficiënt pMG820 P-^-Gal gen*

Een circa 4.6 kb Clal (ClaC) fragment van pMG820 DNA bleek geïsoleerd en gekloneerd in de E.coli vector PAT153. Van de twee oriëntaties die verkregen werden, pNZ310 en pNZ311, bleek pNZ310 de hoogste specifieke P-/0-Gal aktiviteit te bezitten, omdat in dit construct het p-/3-Gal gen onder controle van de anti-tet promoter van de vector is gelegen. pNZ310 DNA werd geïsoleerd en gedigesteerd met Apal, een unieke site, gelegen in het strukturele ΐ-β-Gal-gen (zie Fig. 4). In het aldus gelineariseerde pNZ310 DNA werd een 21 bp synthetisch DNA fragment (s-DNA) gekloneerd bestaande uit dubbelstrengs DNA waarvan de basenvolgorde van de enkele strengen de volgende is: 5*-CGGGATCCGTCGACTAGGGCC-3' en S’-CCGGGCCCTAGGCAGCTGATC-S'. Dit s-DNA is zo gekozen dat Apal sites het fragment flankeren, waardoor het altijd door een digestie met dit enzyme is te verwijderen, dat het unieke Smal, Sall en BamHI restrictie sites bevat en tenslotte het leesraam van het P-yj-Gal gen interrumpeert met een TAG stopcodon. Het resulterende plasmide pNZ325 geeft in E.coli geen P-y5"*Gal aktiviteit en bevat de verwachte nieuwe Smal, Sall en BamHI sites. Bovendien kan een aktief P-^ -Gal-gen verkregen worden door digestie van pNZ325 door Apal, gevolgd door transformatie van MC1061 met het gezuiverde lineaire pNZ325 DNA. Hieruit blijkt dat uitgaande van de bepaalde nucleotide-volgorde van de lactose-genen het eenvoudig is om in vitro een geïnaktiveerd lactose-gen te verkrijgen met plaatsgerichte mutagenese.

LEGENDA

Figuur 1: Wijze waarop door L. lactis lactose wordt gefermenteerd tot lactaat (volgens FEMS Microbiol. Rev. 46_ (1987) 221-231; Ant. van Leeuwenhoek 49^ (1983) 209-224; Biochimie 70^(1988) Deel 3 en 4).

Figuur 2A: Restrictiekaart van pMG820 waarin aangegeven de positie van de lactose-genen.

Figuur 2B: Nucleotide-volgorde van deze in Fig. 2A aangegeven genen. Figuur 3: Restrictiekaarten van pNZ305 en pNZ306, bestaande uit de vector pIL253 en het L.lactis Factor III gen. MCS geeft de multiple cloning site van pIL253 aan die bestaat uit sites voor achtereenvolgens: Clal, Xbal, Xhol, SacI, Xho I, Xbal, Clal, HindlII, PstI, Sall, BamHI, Smal, EcoRI. De MCS van pNZ305 en pNZ306 (niet weergegeven) is voor het grootste deel afkomstig uit pUC18 en bestaat uit Clal-Xbal-BamHI-SmalKpnl-SacI-EcoRI sites, waarbij het Factor III-gen in de unieke BamHI Site is geïnserteerd in de aangegeven oriëntaties.

Figuur 4: Restrictiekaart van pNZ310 en pNZ325. s-DNA geeft het 21 bp synthetische DNA-fragment aan bevattende de Apal-Smal-BamHI-Sall-Apal sites en het TAG stopcodon zoals beschreven in de tekst.

TABEL 1 DNA TRANSFORMANTEN per ml

EmR Lac+ EmR Lac+ geen < 101 4.0 102 < 101 pIL253 1.1 102 4.5 ΙΟ2 < 101 pNZ305 1.2 102 6.0 102 1.1 102

Tabel 1: Transformatie van S.lactis Y2-5 gevolgd door selectie van de gele lac+ en lac+ EmR transformanten op LIA zonder of met 5 /ug/ml Em en EmR transformanten op GM17 agar met 5 /ug/ml Em. trans formanten op LIA zonder of met 5 /ug/ml Em.

TABEL 2

Medium Frequentie van lac+ & EmR kolonies na 50 generaties na 100 generaties

Lac+ EmR Lac+ EmR

LM17 > 99 % >99 % > 99 % > 99 % WP > 99 % >99 % > 99 % >99 % GM17 35 % 35% <5% <5%

Tabel 2: Stabiliteit van S.lactis Y2-5 bevattend pNZ305 gegroeid gedurende 50 of 100 generaties op lactose bevattende (LM17, WP) of glucose bevattende (GM17) media.

Claims (11)

1. Werkwijze voor het selecteren van melkzuurbacteriën die recombinant DNA bevatten, en het stabiel handhaven van dat DNA, met behulp van een in voedingsmiddelen voor menselijke consumptie aanvaardbare merker, met het kenmerk, dat een melkzuurbacterie, die één of twee, voor de lactosevergisting onmisbare enzymen met voldoende aktiviteit mist, wordt getransformeerd met een DNA-fragment dat, als merker, ten minste codeert voor het in bedoelde melkzuurbacterie ontbrekende, voor de lactose-vergisting onmisbare enzym of enzymen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de melkzuurbacterie behoort tot de soort Lactococcus of Lactobacillus.

3. Werkwijze volgens conclusies 1-2, met het kenmerk, dat de melkzuurbacterie een Lactococcus lactis is.

4. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat de toegepaste melkzuurbacterie door een deletie, een insertie of puntmutatie in lactosegenen, die op het chromosomale DNA zijn gelegen, deficiënt is in de synthese van enzymen met voldoende aktiviteit, welke onmisbaar zijn voor de lactosevergisting.

5. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat de toegepaste melkzuurbacterie door een deletie, een insertie of een puntmutatie in de lactosegenen, die op plasmide DNA gelegen zijn, deficiënt is in de synthese van enzymen met voldoende aktiviteit, welke onmisbaar zijn voor de lactosevergisting.

6. Werkwijze volgens conclusies 1-4, met het kenmerk, dat de toegepaste melkzuurbacterie deficiënt is in de synthese van een lactose-spe-cifieke Factor III met voldoende aktiviteit, en het DNA-fragment ten minste codeert voor deze Factor III.

7. Werkwijze volgens conclusies 1-3 en 5, met het kenmerk, dat de melkzuurbacterie deficiënt is in de synthese van een fosfo-/#-galactosi-dase met voldoende aktiviteit, en het DNA-fragment ten minste codeert voor deze fosfo-y^-galactosidase.

8. Werkwijze volgens conclusies 1-7, met het kenmerk, dat het DNA-fragment tevens codeert voor een functie die de melkzuurbacterie een verbeterde of nieuwe eigenschap geeft.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het DNA-fragment tevens codeert voor de produktie van proteolytische enzymen zoals protefnase(n) of peptidase(n), codeert voor ongevoeligheid voor bac-teriofagen, codeert tegen afbraak van citraat, codeert voor bacterio-cine-produktie en/of -immuniteit of codeert voor /3 -glactosidase, fi(-amy- lase, chymosine of pepsine.

10. Werkwijze volgens conclusie 8 of 9, met het kenmerk, dat het DNA-fragment tevens bevat een replicon dat in de gebruikte melkzuurbacterie functioneel is.

11. Werkwijze volgens conclusies 8-10, met het kenmerk, dat het DNA-fragment tevens bevat een DNA-volgorde, die homoloog is met het DNA van de gebruikte melkzuurbacterie, waardoor het gehele DNA-fragment, of essentiële delen daarvan, in het DNA van deze melkzuurbacterie geïntegreerd en mogelijk geamplificeerd wordt, resp. worden.