JP4469005B2 - 選択された生物のための人工プロモーターライブラリー及び該ライブラリー由来のプロモーター - Google Patents
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Description
要約すると、流量最適化は、1)何部もの過剰発現でなく酵素濃度の細かい調節及びしばしば2)速度制限ステップを見つけ出すのでなく経路中のいくつかの酵素のレベルの最適化を必要とする。
我々が目指すプロモーターライブラリーは、特定の種の工学技術のための関心の活性になり得る全体の範囲のプロモーター活性、好ましくは検出できる最も弱いプロモーターから可能な最も強力なプロモーターをカバーするはずである。更に、我々は、小さなステップにおいてこの広範な活性範囲をカバーすること、即ち、上述のような流量最適化の目的に適したものであるために、ステップ当り50〜100 %だけ活性を増加させることを目指す。
本発明は、所定の生物又は生物の群のための人工的なプロモーターライブラリーであって、それらのセンス鎖が前記生物もしくは生物の群からの有効なプロモーターの少なくとも2の共通配列を含む二本鎖 DNAフラグメントの混合物、又は各々の少なくとも半分を含むその一部と、少なくとも7のヌクレオチドがヌクレオベースA,T,C及びGから無作偽に選択された種々の長さの周囲の又は介在するヌクレオチド配列(スペーサー)と、を含む人工プロモーターライブラリーを供する。但し、以前から周知であるプロモーター配列及び天然のソースから単離されたプロモーター配列は含まれない。
二本鎖 DNAフラグメントのセンス鎖は、ライブラリーのプロモーターに特定の調節特性を与える調節 DNA配列も含み得る。このような特定の調節特性は、好ましくは、増殖条件の変化、例えばpH、浸透度、温度又は増殖相の変化による活性化である。
選択される生物又は生物のグループは、原核生物から及び真核生物から、特に、原核及び真核微生物、例えばイースト、他の真菌及び高等生物の細胞系から選択することができる。
最も多くの場合、原核生物のための人工プロモーターライブラリー内に保持された共通配列は、−35シグナル(−35〜−30):TTGACA及び−10シグナル(−12〜−7):TATAAT又は各々の少なくとも3の保存されたヌクレオチドを含む両方の一部を含むであろう。
真核生物において、前記共通配列は、TATAボックス及び少なくとも1の上流活性化配列(UAS) を含むべきである。
調節可能な人工プロモーターライブラリーを得るために、合成される一本鎖 DNA配列は、特定の調節特性をライブラリーのプロモーターに与える調節 DNA配列を含み得る。このような特定の調節特性は、好ましくは、増殖条件の変化、例えばpH、浸透性、温度又は増殖相の変化による活性化である。
b)該一セットのプロモーターを、前記遺伝子を各々のクローン内で該セットからの少なくとも1のプロモーターの制御下におくように、前記生物内にクローニングし、
c)該選択されたクローンを増殖させ、そして産物形成の最適な流れを示すものを見い出すためにそれらをスクリーニングすることを含む方法を更に供する。
図1。実施例1からのL.ラクチス(L. lactis )のための人工プロモーターのライブラリー。プロモーター活性(Miller単位)を、2μg/mlエリトロマイシンを補給したGM17培地中で増殖した株MG1363におけるプロモータークローニングベクター pAK80上での異なる合成プロモータークローンから転写されたb−ガラクトシダーゼをコードするリポーター遺伝子(lacLM )の発現からアッセイした。データ点のパターンは、−35もしくは−10共通配列のいずれかにおいて又はこれら2つの共通配列の間のスペーサーの長さにおいてプロモータークローンが異なることを示す。
文献によれば(de Vos及びSimons, 1994の報告を参照のこと)、L.ラクチスにおける強力なプロモーターは共通して次のヌクレオチド配列(数字は番号+1で与えられる転写開始部位に対する位置を示す):−12〜−7:TATAAT;−15〜−14:TG;−35〜−30:TTGACAを有する傾向がある。−10と−35との間のスペーシングは17ヌクレオチドであるようである。しかしながら、L.ラクチスについて出版されているプロモーター配列の親密な比較は、上述の1つを除くいくつかの位置において、ヌクレオチドが多少よく保存されていることを示す。
このオリゴヌクレオチド混合物は、最初は一本鎖であり、クローニングの目的のために二本鎖 DNAフラグメントに変換されなければならない。これは、プロモーターオリゴヌクレオチドの3′末端に相補的な配列を有する10bpオリゴヌクレオチドを試験管内で合成することにより行った。次にこのオリゴヌクレオチドをdATP, dCTP, dGTP及びdTTPの存在下での DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントによる第2鎖合成のためのプライマーとして用いた。この方法において第2 DNA鎖は正確に第1 DNAに相補的になった。
1)混合物をBamHI及び PstIで消化し、ベクター pAK80を PstI及び BglII(BglIIはBamHIに適合する)で消化した。
両方の場合、ベクター DNAを、クローニングベクターの再連結を防ぐために子ウシインテスチンホスファターゼ(CIP) で更に処理した。次に、そのフラグメント混合物及びベクター DNAを、T4 DNAリガーゼ及び標準連結条件を用いて16℃で一晩、連結した。
上述の46のクローンの DNA配列決定は、挿入されたプロモーターフラグメントのほとんどが、オリゴヌクレオチドデザインについてもとから特定された DNA配列を有していたが(上述を参照のこと)、残りのフラグメントの配列はその配列から少しずれていた。
先の種々の酵素反応に用いられる酵素は、 Pharmacia及びBoehringerから得て、それらにより推奨されるように用いた。
この例は、L.ラクチスのための温度制御されたプロモーターライブラリーの開発を示す。L.ラクチスのヒートショック応答に関連することが示されている8塩基対逆反復を含む調節因子を、−35配列の数塩基対上流に挿入する。これらの調節因子の最小の範囲は、9(又はそれ未満の)塩基対により分離された9bp(又はそれより長い)逆反復(IR)を含む27塩基対:
グラム陽性バクテリアバチルス・サブチリスは、所定範囲の異種タンパク質の生産のための工業用バイオリアクターとして広範囲に用いられる。それゆえ、本発明のランダムスペーサー法がこの生物のためのプロモーターライブラリーを作るのにも用いることができるか否かをテストすることに関心がある。バチルス・サブチリスのための共通配列は、大腸菌及びL.ラクチスのための共通配列に極めて類似しており、それゆえ、我々は、そのアプローチがバチルス・サブチリスにあてはまるか否かを、いくつかのCPプロモーターをこのバチルス・サブチリスのためのプロモータークローニングベクターにサブクローニングすることによりテストし、次に1)CPプロモーターがバチルス・サブチリス内で活性であるか否か及び2)更に、この生物内で、共通配列間のスペーサーがプロモーターの強さのために重要な役割を果たすか否かを問うことができよう。
実施例1のCPプロモーターを、L.ラクチスにおける使用のためにデザインしたが、大腸菌プロモーターの共通配列は、実施例1に供されるオリゴヌクレオチドの配列内に含まれる。更に、実施例1においてCPプロモーターライブラリーを作るために用いたベクターは、L.ラクチス及び大腸菌のためのシャトルベクターであり、これは、我々がグラム陰性バクテリア宿主大腸菌内のCPプロモーターの活性を分析するのを許容する。図3は、大腸菌内のCPプロモーターの33の活性を示す。明らかに、個々のCPプロモーターの活性も極めて異なり、そして同時に、プロモーターは広範囲の活性をカバーする。興味あることに、大腸菌及びL.ラクチスにおける個々のプロモーターの強さの間の相関はあまり強くなく;L.ラクチス内で強力なプロモーターであることが見出されたいくつかのプロモーターは大腸菌内で弱くその逆も成り立つことが見出された。
グラム陰性種に属するバクテリア、シュードモナスは、それらの適用において、例えば汚染された土壌中の化学老廃物のバイオデグラデーションにおける適用のため、次第に重要になってきている。しかしながら、ここでも、遺伝子工学は適切なプロモーター及び発現システムの欠如により妨げられている。シュードモナスプロモーターに関する文献は、シュードモナスのための共通配列は大腸菌、L.ラクチス及びバチルス・サブチリスのものほど十分には規定されていないことを示す。
我々は、実施例5に記載される共通配列に基づくオリゴヌクレオチドをデザインし、実施例1に記載されるように多重クローニング部位を組み込んだ。次のオリゴヌクレオチドを合成した。
MCS-(N)8-TTGR-N19-TATRAT-(N)8-MCS
5′端からはじめて:EcoRI制限部位(後のクローニングストラテジーに用いるためのもの、以下を参照のこと)、共通な UASGCN4p 、59bpスペーサー(スペーサー1)、共通なTATAAA配列(TATAボックス)、38bpスペーサー(スペーサー2)、23bpレプレッサー結合配列(転写が開始される領域でもある)、T1ボックスとARG8遺伝子の最初のコドンとの間のスペーサー配列(このスペーサーはARG8遺伝子の最初のコドン、 ATGも含むARG8遺伝子からのネイティブ配列である)、並びに最後にBamHI部位を含む 199bpオリゴヌクレオチドをデザインした。これは、β−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子との枠内融合物を供するようにデザインされる(以下を参照のこと)。
アミノ酸及び特定のアルギニン制御に基づく結果は、本発明のランダムスペーサー法は、広範囲のプロモーター活性をカバーし、そして外部シグナルにより制御することができるプロモーターを作るのに用いることができることを証明する。本発明の制御態様は、アミノ酸及びアルギニン制御により例示されるが、これらに限られない。
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Claims (5)
- 原核生物において遺伝子の発現を最適化するのに適したプロモーターライブラリーであって、該ライブラリーが、異なる個々の二本鎖 DNAプロモーター配列のセットを含み、当該二本鎖 DNA配列のセンス鎖が、配列番号5〜42に記載の個々のプロモーター配列群を含み、ここで前記プロモーターのセットが、プロモーターの強さに関して、小ステップにおいてある範囲のプロモーター活性をカバーし、ここで各々のステップが、前記活性を50〜100 %だけ変化させる、
ことを特徴とするプロモーターライブラリー。 - 前記プロモーター配列が、前記プロモーター配列のプロモーターに特定の調節特性を与える調節 DNA配列を含む、請求項1に記載のプロモーターライブラリー。
- 前記プロモーター配列が、制限エンドヌクレアーゼのための少なくとも1の認識部位を含む、請求項1又は2に記載のプロモーターライブラリー。
- 原核生物において遺伝子の発現を最適化する方法であって、
(i)請求項1〜3のいずれかに記載のプロモーターライブラリーから、プロモーター活性の要求される範囲をカバーするプロモーターのセットを選択し、
(ii)前記プロモーターのセットを、前記生物内に、各々のクローンにおいて発現されるべき遺伝子を前記セットの少なくとも1のプロモーターの制御下におくようにクローニングし、
(iii )該クローンを培養して、遺伝子産物形成の最適な流れを示すクローンを選択する、
ことを含む方法。 - 前記プロモーターのセットの1のプロモーターから他のプロモーターへの活性の増加が、50〜100 %を超えないステップにおいてである、請求項4に記載の方法。
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