CN110317807A

CN110317807A - 一种谷氨酸棒杆菌人工启动子文库

Info

Publication number: CN110317807A
Application number: CN201810268290.6A
Authority: CN
Inventors: 刘君; 魏亮; 周威; 徐宁
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2019-10-11

Abstract

本发明公开了一种在谷氨酸棒杆菌中具有不同表达强度的人工启动子调控元件文库。首先根据谷氨酸棒杆菌持家基因的启动子的核心区域，‑10区和‑35区的保守序列，设计、构建谷氨酸棒杆菌人工启动子调控元件文库。调控元件包含启动子区和核糖体结合位点区，启动子上游区域区。随后将人工启动子调控元件文库分别经过流式细胞筛选，平板筛选和96孔板筛选的三步筛选方法，获得了具有不同表达强度的和调控范围较广的人工启动子调控元件文库。

Description

一种谷氨酸棒杆菌人工启动子文库

技术领域

本发明属于合成生物学和代谢工程技术领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌人工启动子调控元件文库及其构建方法。

背景技术

谷氨酸棒杆菌是一种从土壤中分离的，食品安全级的革兰氏阳性菌株，被广泛应用于氨基酸等产品的生产。近年来，随着合成生物学的发展，以谷氨酸棒杆菌为底盘的人工细胞工厂用于合成多种生物能源和精细化学产品越来越受到广泛关注。然而，由于细胞内代谢网络的复杂性，在代谢通路的构建和靶向代谢节点的改造过程中，由于基因表达不适当的表达，通常会扰乱宿主细胞代谢，引起代谢通量的不平衡，进而影响目标代谢产物的合成。因此，调控代谢途径中各个基因的表达，实现目标代谢通量最优化，已经成为合成生物学研究的一个重要内容。在之前的研究中，许多研究者开发了一系列基于模式生物大肠杆菌和酿酒酵母的控制元件来调控代谢途径中基因的表达强度，包括启动子元件，核糖体结合位点(RBS)元件以及终止子元件等。例如，张学礼课题组通过构建人工启动子调控元件及其文库调控大肠杆菌中β-胡萝卜素代谢途径中基因的表达，从而获得了性状最优的重组菌株(卢焦,张学礼,朱欣娜,等.利用人工调控元件及其文库调控微生物染色体上基因表达强度的方法:,CN102286517A[P].2011.)。但是在谷氨酸棒杆菌中，对基因表达控制元件的研究仍然较少，尤其是对组成简单、调控精确、即插即用的生物学元件的发掘尚未有报道，极大的限制了谷氨酸棒杆菌的进一步应用。因此，很有必要获得一系列基于谷氨酸棒杆菌的具有不同表达强度的调控元件，能对基因进行精准的调控。

启动子是位于基因上游，活化RNA聚合酶启动基因转录，从而决定基因活动的特定的核苷酸序列。不同强度的启动子能够有效调节基因的表达。在RNA聚合酶复合体中，σ因子能够识别启动子序列并激活RNA聚合酶，在基因转录过程中具有非常重要的作用。在谷氨酸棒杆菌中，σ因子包含σ^A，σ^B，σ^C，σ^D，σ^E，σ^H和σ^M七种类型，其中σ^A和σ^B是分别最广，应用最多的σ因子。在之前的研究中，通过对持家基因启动子的统计分析发现，σ^A依赖的启动子的核心区域包括TTGNCA(-35区)和GNTANANTNG(-10区)，σ^B依赖的启动子的核心区域包括GNGNCN(-35区)和TAMAATTGA(-10区)。因此，构建的工启动子元件应该包含σ^A和σ^B识别的核心区域。

本发明首次通过结合谷氨酸棒杆菌中σ^A和σ^B识别的启动子的核心区域，设计并构建了随机人工启动子调控元件。结合流式细胞仪，平板筛选以及96孔板筛选三步高通量筛选的方法，获得了一系列具有不同表达强度的人工启动子调控元件文库。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可在谷氨酸棒杆菌中具有不同表达强度的人工启动子调控元件文库及其构建方法，为基因表达调控提供有效工具。

本发明第一个方面，提供一种人工启动子调控元件文库。

所述人工启动子调控元件文库为一段含有随机碱基的核苷酸序列，包括一个含6个特定碱基或6个随机碱基的启动子-35区、一个含6个特定碱基或6个随机碱基的启动子-10区、一个在-35区和-10区之间的含10-25个特定碱基或10-25个随机碱基的间隔区、一个含5-25个特定碱基或5-25个随机碱基的核糖体结合位点区。

所述人工启动子调控元件文库的序列为序列表中的SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.30。

所述人工启动子调控元件文库表达强度较高的启动子序列为序列表中序列SEQID NO.1～SEQ ID NO.10；表达强度中等的启动子序列为序列表中序列SEQ ID NO.11～SEQID NO.20；表达强度较低的启动子序列为序列表中序列SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30。

所述-10区域和-35区域之间的间隔区长度为10～25个碱基，优选为16～18个碱基，更优选为17个碱基。

所述-10区和核糖体结合位点区之间的随机序列区长度为5～25个碱基，优选为8～15个碱基，更优选为12个碱基。

本发明的第二个方面，提供一种人工启动子调控元件文库的构建方法。包括以下步骤：

将所述人工启动子调控元件序列、报告基因序列上游引物和BsaI酶切位点整合在一条引物上，通过PCR的方法扩增出一段核苷酸片段，其包含50～500个碱基启动子调控元件文库和报告基因序列。将上述片段连接到质粒pXMJ19上，构建人工启动子调控元件文库质粒。

所述报告基因序列为序列表中的SEQ ID NO.31。

本发明的第三个方面，提供一种人工启动子调控元件文库的高通量筛选方法。包括以下步骤：

将构建的人工启动子调控元件文库转化到谷氨酸棒杆菌RES167中，培养至稳定期。然后利用流式细胞仪进行流式分选，获得荧光强度前0.1～1％的细胞。将上述获得细胞在培养在LBHIS固体培养基，在蓝光照射下根据荧光强度将细胞转移至新鲜的LBHIS的固体培养基中。将上述获得的细胞在96孔板中进行培养，利用酶标仪检测荧光强度，可获得具有不同表达强度的启动子元件文库。

附图说明

图1为谷氨酸棒杆菌人工启动子文库设计示意图

图2为谷氨酸棒杆菌人工启动子文库构建示意图

图3为谷氨酸棒杆菌人工启动子文库流式细胞筛选示意图

图4为谷氨酸棒杆菌人工启动子文库平板筛选示意图

图5为谷氨酸棒杆菌人工启动子文库96孔板筛选的760个重组子的荧光强度。

图6为谷氨酸棒杆菌人工启动子文库中30个重组子的荧光强度

图7为谷氨酸棒杆菌人工启动子文库中30个重组子的绿色荧光蛋白表达强度。

图8为谷氨酸棒杆菌人工启动子文库中11个重组子的β-半乳糖苷酶的酶活。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例汇总所用的材料、试剂等，无特殊说明。均可从商业途径得到。

实施例1谷氨酸棒杆菌人工启动子元件文库的构建

谷氨酸棒杆菌人工启动子元件构建的策略是基于整合谷氨酸棒杆菌中σ^A和σ^B依赖的启动子的核心区域，其特征在于其核心区域为-35区(NNGNCN)和-10区(NNTANANT)，以及核糖体结合位点(AAAGGANNNNN)。为了构建谷氨酸棒杆菌人工启动子元件文库，将设计的谷氨酸棒杆菌人工启动子元件、报告基因上游引物和BsaⅠ酶切位点整合设计长度120个碱基的随机引物(图1)。

通过PCR的方法，以绿色荧光蛋白为模板，扩增含有BsaⅠ酶切位点、谷氨酸棒杆菌人工启动子元件和报告基因的核苷酸片段Ⅰ。引物序列为：

Random promoter GFP-F：

CACACCAGGTCTCAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTANANTNNNNNNNNNNNNAAAGGANNNNNATGGCGATGAGTAAAGGAGAAG

GFP-R:

CACACCAGGTCTCACCCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATCCC

扩增体系为：Thermo Fisher scientific Phusion 5×buffer 10μL，10mM dNTP4μL，核苷酸模板20ng，10μM引物2.5μL，Phusion High-Fidelity核苷酸Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，ddH₂O 2.5μL，总体积为50μL。扩增条件为98℃预变性30s(1个循环)；98℃变性10s，60℃退火10s；72℃延伸1min(35个循环)；72℃延伸5min(一个循环)。

随后通过PCR的方法，以质粒pXMJ19为模板，扩增质粒骨架，获得核苷酸片段Ⅱ。引物序列为：

pXMJ19-F：CACACCAGGTCTCAAGGGCTGTTTTGGCGGATGAGAG

pXMJ19-R：CACACCAGGTCTCAGAGCCGACGATACCGAAGACAGC

PCR扩增体系为：Thermo Fisher scientific Phusion 5×buffer 10μL，10mMdNTP 4μL，核苷酸模板20ng，10μM引物2.5μL，Phusion High-Fidelity核苷酸Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，ddH₂O 2.5μL，总体积为50μL。PCR扩增条件为98℃预变性30s(1个循环)；98℃变性10s，60℃退火10s；72℃延伸1min(35个循环)；72℃延伸5min(一个循环)。

随后将获得的两个核苷酸片段通过Golden Gate的克隆方法连接起来构建谷氨酸棒杆菌人工启动子元件文库。连接体系为：Thermo Fisher scientific T4ligase10xbuffer 1.5μL，0.1mg/mL牛血清蛋白(BSA)1.5μL，Thermo Fisher scientificT4ligase 1μL，Thermo Fisher

scientific BsaI1μL，核苷酸片段Ⅰ4μL，核苷酸片段Ⅱ6μL。反应程序为：37℃3min，22℃4min(30个循环)，22℃20min(一个循环)，50℃5min(一个循环)，80℃(一个循环)，25℃5min(一个循环)。然后将Golden Gate反应液通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌DH5α中。转化过程为：将100μL感受态细胞置于冰上，加入10μL转化液冰浴30min，42℃热击90s，加入1mL LB培养基孵育1h。取200μL菌液涂布含有氯霉素的LB平板上。37℃过夜培养。随后将上述获得的含有重组质粒的大肠杆菌从平板上用5mL水冲洗，12000rpm离心10min收集菌体，提质粒。

将上述获得的重组质粒电转至谷氨酸棒杆菌RES167。电转条件为：将100μL感受态细胞置于冰上，加入200ng重组质粒，冰上放置30min，转移至0.1cm的Bio-Rad电击杯中。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪。电击参数为电压1.8kv。电击后迅速用1mL LBHIS培养基转移至电击杯中，吹打5～10次后转移至EP管中，46℃热击6min，然后32℃孵育2h。将菌液涂布在含有氯霉素的LBHIS平板上。

实施例2谷氨酸棒杆菌人工启动子元件文库的高通量筛选

将上述构建的含有人工启动子元件文库的谷氨酸棒杆菌32℃培养48h。用1～5mLddH₂O冲洗菌体，转接至100mL LBHIS液体培养基中，32℃，200rpm培养2h。取1mL菌液，用灭菌的PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L)洗涤3次并重悬。将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.1～0.5。将获得的菌体利用流式细胞仪MoFlo XDP FlowCytometry Sorter(Beckman Coulter,USA)进行流式分选。选择荧光通道为激发波长488nm，发射波长为530/40通道。选择流式细胞仪纯化模式提高筛选文库中阳性克隆的比例。分选荧光强度前0.1～1％的细胞进行进一步分析，获得10⁴～10⁶个细胞(图3)。

将上述获得的细胞涂布在含有氯霉素抗性的LBHIS平板上，32℃培养48h。随后将平板在蓝光(476～495nm)照射下，细胞中不同含量的绿色荧光蛋白发出不同强度的荧光信号。根据荧光信号强度将获得的阳性克隆转移至新鲜的LBHIS平板上进行下一步分析(图4)。

将上述获得细胞随机选择760个，分别接种于含有氯霉素抗性的LBHIS液体培养基中，96孔板培养，32℃，800rpm培养16h。然后利用多功能酶标仪进行荧光强度检测，检测时激发波长为488nm，发射波长为530nm(图5)。

实施例3谷氨酸棒杆菌人工启动子元件的表征

将上述获得的谷氨酸棒杆菌人工启动子元件进行表征，其步骤如下：

在挑选的760个重组菌株中，按照荧光强度高低将其分三组。荧光强度大于8000a.u.为高表达启动子，荧光强度在3000～6000a.u.的为中强度启动子，荧光强度小于2000a.u.为低强度启动子。在三个不同强度启动子组中分别随机挑选10个进行进一步分析。

将30个启动子接种于含有氯霉素的LBHIS培养基中，摇瓶培养16h。然后利用多功能酶标仪进行荧光强度检测，检测时激发波长为488nm，发射波长为530nm(图6)。然后将菌体收集。用PBS缓冲液洗涤三次并重悬，并将OD₆₀₀稀释至10。然后用超声破碎仪对菌体进行破碎，破碎条件为功率100W，超声1s间隙2s，超声20min。然后12000rpm离心20min。收集上清，取10μL上清进行1％SDS-PAGE凝胶电泳分析(图7)

实施例4人工启动子元件调控谷氨酸棒杆菌内基因的表达

本实施案例中选择大肠杆菌基因β-半乳糖苷酶基因lacZ为报告基因，选择L2，L9，L10，M1，M2，M9，M10，H1，H2，H9，H10共11个人工调控元件，研究调控元件对β-半乳糖苷酶酶活的调控作用。

通过PCR的方法，以大肠杆菌基因组为模板，扩增含有lacZ基因的核苷酸片段Ⅲ。引物序列为：

lacZ F：CACCAGGTCTCAAGAAATGACCATGATTACGGATTCACTG

lacZ R：CACCAGGTCTCACCTTTTATTTTTGACACCAGACCAACTG

扩增体系为：Thermo Fisher scientific Phusion 5×buffer 10μL，10mM dNTP4μL，核苷酸模板20ng，10μM引物2.5μL，Phusion High-Fidelity核苷酸Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，ddH2O 2.5μL，总体积为50μL。扩增条件为98℃预变性30s(1个循环)；98℃变性10s，60℃退火10s；72℃延伸1min(35个循环)；72℃延伸5min(一个循环)。

通过PCR的方法，以含有人工启动子调控元件的质粒为模板，扩增不同的启动子序列，获得含有人工启动子元件的核苷酸片段。引物序列为：

promoter-F：

CACCAGGTCTCACCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGG

promoter-R：CACCAGGTCTCATTCTTCTCCTTTACTCATCGCCTT

PCR扩增体系为：Thermo Fisher scientific Phusion 5xbuffer 10μL，10mMdNTP 4μL，核苷酸模板20ng，10μM引物2.5μL，Phusion High-Fidelity核苷酸Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，ddH₂O 2.5μL，总体积为50μL。PCR扩增条件为98℃预变性30s(1个循环)；98℃变性10s，60℃退火10s；72℃延伸1min(35个循环)；72℃延伸5min(一个循环)。

随后通过PCR的方法，以质粒pXMJ19为模板，扩增质粒骨架，获得核苷酸片段。引物序列为：

pXMJ19-F：CACACCAGGTCTCAAGGGCTGTTTTGGCGGATGAGAG

pXMJ20-R：CACCAGGTCTCATGGGGCAAACCACGTGGACCGC

随后将获得的含有基因lacZ的核苷酸片段和含有不同人工启动子调控元件的核苷酸片段通过Golden Gate的克隆方法分别连接起来。连接体系为：Thermo Fisherscientific T4ligase 10×buffer 1.5μL，0.1mg/mL牛血清蛋白(BSA)1.5μL，ThermoFisher scientific T4ligase 1μL，Thermo Fisher scientific BsaⅠ1μL，lacZ核苷酸片段4μL，含有人工启动子调控元件的核苷酸片段6μL。反应程序为：37℃3min，22℃4min(30个循环)，22℃20min(一个循环)，50℃5min(一个循环)，80℃(一个循环)，25℃5min(一个循环)。然后将反应液通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌DH5α中。转化过程为：将100μL感受态细胞置于冰上，加入10μL Golden Gate反应液冰浴30min，42℃热击90s，加入1mL LB培养基孵育1h。取200μL菌液涂布含有氯霉素的LB平板上。37℃过夜培养。

将上述获得的重组质粒电转至谷氨酸棒杆菌RES167。电转化条件为：将100μL感受态细胞置于冰上，加入200ng重组质粒，冰上放置30min，转移至0.1cm的Bio-Rad电击杯中。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪。电击参数为电压1.8kv。电击后迅速用1mLLBHIS培养基转移至电击杯中，吹打5～10次后转移至EP管中，46℃热击6min，然后32℃孵育2h。将菌液涂布在含有氯霉素的LBHIS平板上。

为了测定人工启动子调控元件对谷氨酸棒杆菌的调控作用。对1L个含有不同人工启动子调控元件的重组菌株中的β-半乳糖苷酶活性进行检测。分别挑选重组菌株接种于含有氯霉素的LBHIS培养基中，32℃培养18h。取1mL菌液。12000rpm离心1min，用Z-buffer缓冲液洗涤3次并重悬。使用分光光度计调整菌体浓度为OD₆₀₀＝1。然后用超声破碎仪对菌体进行破碎，破碎条件为功率100W，超声1s间隙2s，超声20min。然后12000rpm离心20min。去破碎后的细胞菌液100μL，加入900μL Z-buffer，置于28℃的水浴中预热2min。将上述体系中加入200μL的ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)，混匀后置于水浴，开始计时，直到反应体系中出现可以检测到的黄色，加入500μL碳酸钠(1M)终止反应并停止计时。将体系中加入1.3mL纯水后，离心将菌体除去。在420nm条件下测定吸光值。酶活计算条件为OD₄₂₀×3mL/(0.0045×75×0.001×T)，T为反应时间。

谷氨酸棒杆菌中不同人工启动子调控元件能有效调节β-半乳糖苷酶基因的表达。不同人工启动子元件L2，L9，L10，M1，M2，M9，M10，H1，H2，H9，H10对应的β-半乳糖苷酶的酶活性为458.45U/mg protein，1198.47U/mg protein，1189.64U/mg protein，3127.77U/mgprotein，3342.32U/mg protein，4107.8U/mg protein，4025.21U/mg protein，6542.51U/mg protein，6235.47U/mg protein，8312.47U/mg protein，8978.56U/mg protein(图8)。因此，利用人工启动子调控元件能有效调节谷氨酸棒杆菌中基因的表达。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种谷氨酸棒杆菌人工启动子文库

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctcttgagt ctcgtacttg cttgcgccgg ctatatatgc ttatactggg ctaaattaga 60

gccttagcga aaggatgggc 80

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtctcgact tactgtgcct ggtattctgt cgaggaatac tgtatactat ttaaaattca 60

ttggatagca aaggacggat 80

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatggtata catattagtt ttcagggcga cattctggta aggtacgatc ctagagtctt 60

aagagaacga aaggaattgc 80

<210> 4

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggcactggc atgtataatg ttcgtcatgc cgcttctgtg gtagtctcat atataatttg 60

cacttagaaa aaggagtgat 80

<210> 5

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttccccgatt acacgtagcg tactgagtga caaccagtta tactgtgacg gtacaatcgt 60

aagcggaaga aaggaacacg 80

<210> 6

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccggcgctac atatatttcg acctttctga cggaattgga atgtgttata ctatacttga 60

ctgtatcgta aaggaaggag 80

<210> 7

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagtgatcta ttgattctgc gctcaggtgt cttgtactat gtgggtgtaa ataaactcta 60

ttgatctgga aaggaagata 80

<210> 8

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtctgacttg ctggaccgtc accgttttgt ctgctactgt tttttttaag gtataattcg 60

gtacgcagaa aaggaggtat 80

<210> 9

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccatggtata catattagtt ttcagggcga cattctggta aggtacgatc ctagagtctt 60

aagagaacga aaggaattgc 80

<210> 10

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aacccttacc ggtcggctct aagccggcgg cgtatggtaa gctctgttat gtatagtccg 60

agcacggcga aaggatactc 80

<210> 11

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgtcgacata atctggatct cgctcggtga ccctttctga taatcttggg ataaactgtt 60

gtcacctgga aaggaatctt 80

<210> 12

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attttcttac aagcttttcc tttggggcgt ctatattacg ttaaagtgga ttatacttaa 60

cttgtagaaa aaggatgttc 80

<210> 13

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggggtatggt tatcaacggc tctggaaagg ccgacttcgc taaagattcg atataatttg 60

ttctaaagga aaggatttgc 80

<210> 14

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgtgtttcat ggtactctgg gggggtaggt cactggtatc ccagcgtata gtaaactcaa 60

accctttcga aaggacgtgt 80

<210> 15

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tggtataatc tatctcgggc gctaaagggg ccatgtcagg tttacagacc gtacattacg 60

caaagaccga aaggagtata 80

<210> 16

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cctcccttga ctcttttcca ttcttgtgtt atactcagta ttaagtagag ttggatgcta 60

aagaaaggac agtt 74

<210> 17

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

actcagtcta tcgtgtacaa atggtcggga cgatagtaat gtatcataaa gtaaattcta 60

gataccggga aaggacttcg 80

<210> 18

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cacgcttgtc tttcttggac tttccgatgc ccatgtgtat ggtgtacaca gtatactcat 60

tttacaggga aaggatgctg 80

<210> 19

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctgttgaatt aagctacggt tagtcgttgt cctcgggggt tcatggtatc ctagagttgc 60

caatcgacga aaggagtatt 80

<210> 20

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aatgtgtggg acgtgtgaag cctaacccga cttatcatgg atatgataag ctatactatt 60

aacactagga aaggatactt 80

<210> 21

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cgttgctgac aattatttca ctactattga ctttacaata taaatgttgg atatacttcc 60

ctcgcgacaa aaggattcgt 80

<210> 22

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgacgtgctc cgactagctc caccgtctgg cgtgttccct tgctcgtttg gtagaattta 60

ttactccgga aaggaggtct 80

<210> 23

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccgcagtttg tcaactacgt gtgtcttagt cattttatac aattcctcaa ttagagttac 60

tttactttta aaggaccgca 80

<210> 24

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ggctcccttg tcatcctcgg gtataattgg cttgcctttc gtcctctgtc ttatattaca 60

atttcacaaa aaggatcttg 80

<210> 25

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ctacttaaag acctatggtg ttttgtgtga ccgacatatt cttacccctt gtaaaattca 60

gagaattcta aaggaccacc 80

<210> 26

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cctccgcccc aggcccatga caggtggggg ctaacctccc ctatgagttt ttacaatgag 60

acaattgcca aaggatcacg 80

<210> 27

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

atgccatttt gatagtgttg agttacggac gtcttaaaga gtaccgggtt tacatttatg 60

attgtatgaa aggactttt 79

<210> 28

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gcgttattta actttgcctt acacgcgtgc catagactcc ctaggatgct gtatattctt 60

tctattggca aaggattgtt 80

<210> 29

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gctcccgatc ggcttaggtt ctgagggcgg ctacgaatgg ttgttctggg gtacaatggt 60

tctggccaga aaggaggcag 80

<210> 30

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tccggtggag atacagacta tgaataaggg cgcctttttt tgaaagtgtt gtagactcgt 60

aataattaga aaggagagga 80

<210> 31

<211> 717

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 31

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gacgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactc tgacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaaacag 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc tttcaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagatca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaatag 717

Claims

1.一种谷氨酸棒杆菌人工启动子调控元件文库，其特征在于：

所述人工启动子调控元件为50～500个碱基的核苷酸序列，包括启动子的-35区、启动子的-10区、-35区和-10区之间的间隔区、核糖体结合位点区、-10区和核糖体结合位点区之间的随机序列区。

2.根据权利要求1的人工启动子调控元件文库，所述-35区核苷酸序列包含兼并序列NNGNCN；所述-10区核苷酸序列包含兼并序列NNTANANT；所述核糖体结合位点区核苷酸序列包含兼并序列AAAGGANNNNN；所述-10区域和-35区域之间的间隔区长度为10～25个碱基，优选为16～18个碱基，更优选为17个碱基；所述-10区和核糖体结合位点区之间的随机序列区长度为5～25个碱基，优选为8～15个碱基，更优选为12个碱基。

3.根据权利要求1或2所述中任一项的人工启动子调控元件文库，其特征在于，所述的人工启动子调控元件文库的核苷酸序列包括序列SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.30。

4.根据权利要求1～3所述中任一项的人工启动子调控元件文库，其特征在于可在谷氨酸棒杆菌中不同程度的调控基因的表达，所述待调控基因为β-半乳糖苷酶基因、天冬氨酸激酶基因、天门冬酰脱氢酶基因、高丝氨酸脱氢酶基因和苏氨酸合酶基因。

5.根据权利要求1～4所述中任一项的人工启动子调控元件文库构建方法，包括以下步骤：

1)通过PCR的方法扩增出一段核苷酸片段，其包含启动子调控元件、报告基因序列以及BsaⅠ酶切位点；将上述片段连接到质粒pXMJ19上，构建人工启动子调控元件文库质粒；

2)构建的人工启动子调控元件文库质粒转入谷氨酸棒杆菌RES167中，经高通量筛选方法获得具有不同表达强度的启动子元件文库。

所述人工启动子元件包括-35区核苷酸序列NNGNCN、-10区核苷酸序列NNTANANT、-10区域和-35区域之间的间隔区随机核苷酸序列、-10区和核糖体结合位点区之间的随机核苷酸序列和核糖体结合位点核苷酸序列AAAGGANNNNN。