CN107208106A

CN107208106A - 通过降低rnpA基因表达制备重组蛋白的方法

Info

Publication number: CN107208106A
Application number: CN201580072797.9A
Authority: CN
Inventors: 李相烨; 郑汉娜
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Medicus Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2017-09-26
Also published as: US10351890B2; US20170342454A1; KR101765255B1; KR20160070028A; US20180327801A1

Abstract

本发明涉及一种改进重组微生物中难表达重组蛋白产量的方法，且更具体地涉及一种通过使用重组微生物改进难表达重组蛋白产量的方法，所述重组微生物中导入编码靶蛋白的基因与针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA。根据本发明，大重组蛋白、难表达蛋白和有用蛋白的表达可通过降低rnpA基因的表达而显著增加。

Description

通过降低rnpA基因表达制备重组蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种改进重组微生物中重组蛋白产量的方法，且更具体地涉及一种通过使用重组微生物改进重组蛋白产量的方法，所述重组微生物中导入编码靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA。

背景技术

基因操作技术的发展已经使得许多研究集中于使用细菌和多种动植物制备大量有用蛋白。现有用于制备大量有用蛋白的宿主细胞，包括诸如大肠杆菌(E.coli)的细菌，和诸如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的酵母菌。在这些宿主细胞中，大肠杆菌使用最为广泛，对其进行的研究最为多(Choi等，Chem.Eng.Sci.,66:876,2006；Lee,Trends Biotechnol.,14:98,1996)。

然而，如果待制备的有用蛋白大小比天然存在的蛋白质大或难以表达，则会出现许多问题。如果一种蛋白质的大小较大，由于缺乏信使RNA(mRNA)，该蛋白质的翻译困难，由此所需长度的蛋白质的表达困难。另外，由于蛋白水解和RNA酶诱导的mRNA降解，非天然存在于大肠杆菌中的重组蛋白难以表达(GoBringer等，J Bacteriol.,188:6816,2006；Olson等，PLoS Pathog.,7(2):e1001287,2011；Jung等，Biochem Biophys Res Commun.,186(3):1463,1992；Altman等，Phil Trans R Soc.,366,2011；Turrini等，PLos One.,7(3):e32456,2012)。

因此，本发明的发明人已经进行了广泛的努力来开发增加难表达外源蛋白产量的蛋白表达系统，结果是，发现在通过导入编码外源蛋白的基因表达外源蛋白过程中降低rnpA基因(是核糖核酸酶P的组分)的表达，难表达外源蛋白的表达增加，从而实现了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的一个主要目的是提供一种重组微生物，所述重组微生物中导入编码靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA以增加难表达外源蛋白的产量。

本发明的另一个目的是提供一种通过培养上述重组微生物制备靶蛋白的方法。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供一种用于表达靶蛋白的重组载体和一种重组微生物，所述重组载体包含编码靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA，所述重组微生物中导入所述重组载体。

本发明还提供了一种重组微生物，所述重组微生物中导入编码靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA。

本发明还提供了一种用于制备靶蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：(a)通过培养上述重组微生物和诱导所述重组微生物中靶蛋白表达而制备所述靶蛋白；(b)回收所制备的靶蛋白。

本发明还提供一种用于制备靶蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：通过培养其中导入编码所述靶蛋白的基因的重组微生物来表达和制备所述靶蛋白；回收所制备的靶蛋白，其中，降低核糖核酸酶P的表达以增加所述靶蛋白的表达。

附图说明

图1是质粒pTetly2glyAN-rnpA(sRNA)的基因图谱。

图2显示了通过SDS-PAGE分析由16个重复序列组成的丝蛋白和由32个重复序列组成的丝蛋白的表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2和3：在0.4的OD₆₀₀使用质粒pSH16转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道4和5：在0.4的OD₆₀₀使用质粒pSH16和pACYC184-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道6和7：在0.4的OD₆₀₀使用质粒pSH32转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道8和9：在0.4的OD₆₀₀使用质粒pSH32和pACYC184-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)

图3显示了通过SDS-PAGE分析由64个重复序列组成的丝蛋白的表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2：在0.4的OD₆₀₀使用质粒pSH64转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道3：在0.4的OD₆₀₀使用质粒pSH64和pACYC184-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)

图4a显示了通过SDS-PAGE分析由96个重复序列组成的丝蛋白的表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2：在0.4的OD₆₀₀使用质粒pSH96转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道3：在0.4的OD₆₀₀使用质粒pSH96和pACYC184-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)

图4b显示了通过分别使用质粒pSH96和质粒pSH96加pTetgly2glyAN-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达所获得的结果，其中，通过SDS-PAGE分析蛋白表达水平，使用光密度计对蛋白表达水平进行定量，然后对蛋白表达水平进行平均。

图5显示了通过SDS-PAGE分析由128个重复序列组成的丝蛋白的表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2：在0.4的OD₆₀₀使用质粒pSH128转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道3：在0.4的OD₆₀₀使用质粒pSH128和pACYC184-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)

图6是显示检测细胞内mRNA水平是否通过降低rnpA基因表达而增加的结果的图。

图7是显示通过分批补料培养制备的由96个重复序列组成的丝蛋白的量的图(图7a)，并显示蛋白的电泳结果(图7b)。

图8显示了使用本发明的降低rnpA基因表达的系统进行的电泳结果，以证实除了丝蛋白外的难表达蛋白表达增加。具体地，图8a显示了通过SDS-PAGE分析苹果酸酶(SfcA)表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2：在非转化BL21(DE3)中诱导蛋白表达的结果；泳道3和4：在0.4的OD₆₀₀使用SfcA转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道5和6：在0.4的OD₆₀₀使用SfcA和rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)图8b显示了通过SDS-PAGE分析Cat2表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2和3：在0.4的OD₆₀₀使用Cat2转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道4和5：在0.4的OD₆₀₀使用Cat2-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)图8c显示了通过SDS-PAGE分析SrtA表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2和3：在0.4的OD₆₀₀使用SrtA转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道4和5：在0.4的OD₆₀₀使用srtA-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)图8d显示了通过SDS-PAGE分析CYP73A5表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2和3：在0.4的OD₆₀₀使用CYP73A5转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道4和5：在0.4的OD₆₀₀使用CYP73A5-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)图8e显示了通过SDS-PAGE分析CYP98A3表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2和3：在0.4的OD₆₀₀使用CYP98A3转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道4和5：在0.4的OD₆₀₀使用CYP98A3-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)

本发明最佳实施方式

本发明已经开发了一种在重组微生物中通过降低核糖核酸酶P的表达以增加细胞中有用蛋白mRNA水平来改进现有技术中不易制备的难表达重组蛋白的表达的方法。

在本发明中，使用包含sRNA的sRNA系统降低作为核糖核酸酶P组分的rnpA基因的表达，结果是，显示作为难表达蛋白的高分子量丝蛋白的表达显著增加。

本发明所使用的术语“难表达蛋白”是指具有50kDa或更大分子量的蛋白质。

因此，一方面，本发明涉及一种用于表达靶蛋白的重组载体，所述重组载体包含编码所述靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA，并涉及一种使用所述重组载体转化的重组微生物。

在本发明中，所述靶蛋白可以是选自难表达蛋白、丝蛋白、抗体、酶、细胞色素和转肽酶A的蛋白质，但不限于此。

在本发明中，所述sRNA可以是针对rnpA基因的sRNA，可具有SEQ ID NO:1至3任一者所示的核苷酸序列，但不限于此，只要其降低rnpA基因的表达。

在本发明中，可使用的用于制备蛋白质的微生物的实例可包括埃希氏菌属(Escherichia)、假单孢菌属(Pseudomonas)、酵母菌属(Saccharomyces)等，优选埃希氏菌属微生物，最优选大肠杆菌。具体地，有利的是，由于其基因信息和工业上广泛使用的培养条件为人熟知，大肠杆菌可容易地工业化。

在本发明的一个实施例中，通过使用修饰获自金丝蜘蛛(Nephila clavipes)的牵引丝蛋白产生的编码丝蛋白的基因、编码甘氨酸tRNA的核苷酸序列和降低作为核糖核酸酶P组分的RnpA表达的sRNA转化来构建重组大肠杆菌菌株。培养所构建的重组大肠杆菌菌株。结果是，可以看到所述丝蛋白的蛋白质增加3倍或更多。另外，显示通过降低作为核糖核酸酶P组分的rnpA基因由16、32、48、64、80、96、112和128个特定氨基酸序列(SGRGGLGGTGAGMAAAAAMGGAGQGGYGGLGSQG)的重复序列组成的丝蛋白的表达显著增加。进一步地，显示通过降低作为核糖核酸酶P组分的rnpA基因的表达，eGFP、SfcA和全长IgG抗体的表达也显著增加。

鉴于结果表明通过降低作为核糖核酸酶P组分的rnpA基因的表达增加长重组蛋白或难表达蛋白的产量，对于本领域技术人员来说显而易见的是，降解信使RNA(mRNA)对于蛋白表达具有很大影响，且可通过降低信使RNA(mRNA)降解相关的基因的表达而有效实现靶蛋白的过度表达。

在本发明的另一个实施例中，使用降低本发明的rnpA基因的表达的系统检测编码苹果酸酶的基因(sfcA)、编码转肽酶A的基因(srtA)、编码4-羟基丁酸辅酶A转移酶的基因(Cat2)、细胞色素P450基因(CYP73A5；肉桂酸4-羟化酶和CYP98A3)的表达。结果是，显示表达针对rnpA基因的sRNA连同编码各蛋白的基因的菌株相对于不表达sRNA的菌株表现出较高的蛋白表达水平(图8)。

另一方面，本发明涉及一种重组微生物，所述重组微生物中导入编码靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA。

在本发明中，编码靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA可存在于各自载体中或可并入微生物染色体中。

又一方面，本发明涉及一种用于制备难表达靶蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：(a)通过培养重组微生物和诱导所述重组微生物中靶蛋白表达而制备所述靶蛋白；(b)回收所制备的靶蛋白。

在本发明的一个实施例中，通过使用编码丝蛋白的基因、编码甘氨酸tRNA的核苷酸序列和降低作为核糖核酸酶P组分的rnpA基因的表达的sRNA转化来构建重组大肠杆菌菌株。培养所构建的重组大肠杆菌。结果是，可以看到丝蛋白的蛋白质增加3倍或更多。

在本发明的另一个实施例中，显示当编码eGFP蛋白的基因、编码sfcA蛋白的基因和编码全长IgG抗体蛋白的基因和针对rnpA基因的sRNA共表达时，这些蛋白质的表达增加。

在本发明中，优选地，作为难表达蛋白，靶蛋白可以是具有50kDa或更大分子量的大蛋白。例如，靶蛋白可以是选自丝蛋白、抗体、酶、细胞色素和转肽酶A组成的组的蛋白质，但不限于此。

在还一方面，本发明涉及一种用于制备靶蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：通过培养其中导入编码所述靶蛋白的基因的重组微生物来表达和制备所述靶蛋白；以及回收所制备的靶蛋白，其中，降低所述重组微生物中核糖核酸酶P的表达以增加所述靶蛋白的表达。

在本发明中，靶蛋白可以是难表达蛋白或具有50kDa或更大分子量的蛋白，可添加抑制核糖核酸酶P的表达的物质。

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。通常，本文所使用的命名和下文描述的实验方法为本领域公知和常用。

本发明具体实施方式中所使用的主要术语的定义如下。

本发明所使用的术语“sRNA(小RNA)”是指通常长度为200个或更少核苷酸的短长度RNA，其不被翻译成蛋白质，且通过互补结合有效抑制特定mRNA的翻译。

本发明所使用的术语“核糖体结合位点”是指其中核糖体结合mRNA用于对mRNA进行转录的位点。

本发明所使用的术语“基因”意欲具有最广泛的含义，基因可编码结构蛋白或调控蛋白。在本文中，调控蛋白包括转录因子、热休克蛋白或参与DNA/RNA复制、转录和/或翻译的蛋白质。另外，其表达待抑制的靶基因可作为染色体外元件存在。

本发明所使用的术语“载体”是指包含操作性连接合适的控制序列的DNA序列的DNA构建体，所述调控序列能够影响合适宿主中所述DNA的表达。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅潜在的基因组插入序列。一旦导入合适的宿主中，载体可独立于宿主基因组复制和发挥作用，或者在一些情况下整合至基因组自身。在本文中，由于“质粒”是最常用的载体形式，“质粒”和“载体”有时候互换使用。出于本发明的目的，优选使用质粒载体。可用于此目的的典型质粒载体包含：(a)复制起点，高效发生复制使得每一宿主细胞产生数百个质粒载体；(b)抗生素抗性基因，通过此基因可筛选使用质粒载体转化的宿主细胞；和(c)限制性酶切位点，其中可插入外源DNA片段。即使载体中不存在合适的限制性酶切位点，使用常规合成寡核苷酸适配体或接头使得载体和外源DNA片段之间容易连接。在连接之后，应将载体转化至合适的宿主细胞中。可通过氯化钙方法或电穿孔容易地实现转化(Neumann等，EMBOJ.,1:841,1982)。本领域公知的表达载体可用作表达本发明的sRNA的载体。

当将核酸序列配置成与其他核酸序列具有功能关系时，此核酸序列被操作性连接。核苷酸序列可以是基因和所连接的控制序列，当合适的分子(例如，转录激活蛋白)结合控制序列时能够表达所述基因。例如，前序列或分泌性前导序列的DNA作为参与多肽分泌的前蛋白表达时，与编码多肽的DNA操作性连接；启动子或增强子影响序列的转录时与编码序列操作性连接；或者核糖体结合位点影响序列转录时与编码序列操作性连接，或配置成有利于翻译时与编码序列操作性连接。通常，术语“操作性连接”是指DNA连接序列是邻接的，在分泌性前导序列的情况下，DNA连接序列是邻接的并存在于阅读框中。然而，增强子不一定是邻接的。这些序列之间的连接通过在方便的限制性酶位点连接而进行。然而，当此位点不存在时，根据常规方法使用合成的寡核苷酸适配体或接头。

另外，本发明涉及一种重组微生物，所述重组微生物中导入包含编码sRNA的核酸的表达载体。本发明所使用的术语“转化”是指DNA可作为染色体外的因子被复制或者作为宿主通过导入DNA借助于完成整个染色体而被复制。

当然，应理解，并非所有载体和表达控制序列都发挥相同的表达本发明的DNA序列的作用。相似地，并非所有宿主都针对相同的表达系统发挥相同的作用。然而，在不脱离本发明范围或者不承担额外实验负担的情况下，本领域技术人员可适当地从多种载体、表达控制序列和宿主中作出选择。例如，必须考虑宿主选择载体，这是因为载体必须在宿主中复制。具体地，还应该考虑载体的拷贝数量、调控拷贝数量的能力和相应载体编码的其他蛋白的表达(例如，抗生素标记物的表达)。

实施例

在下文中，参照实施例进一步详细地描述本发明。对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅用于示例目的，不能解释为限制本发明的范围。

实施例1：重组质粒pTetgly2glyAN-rnpA(sRNA)的构建

所有基因操作程序均遵照标准方法(Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular cloning:a laboratory manual)，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,New York,1989)。

为了将sRNA系统导入pTetlgy2glyAN载体(韩国专利第1147860号)，进行基因操作，为了获得参与rnpA基因翻译的核糖体结合位点，使用SEQ ID NO:4和5的引物进行反向PCR，由此获得rnpA sRNA(SEQ ID NO:1)。

SEQ ID NO:4:5'-cctgggaaatgcgagcttaaccactttctgttgggccattgcattg-3'

SEQ ID NO:5:5'-GCAACCATTATCACCGCCA-3

在下列条件下使用Pfu聚合酶(SolGent，Korea)进行PCR反应：在95℃预变性5分钟，然后28个循环，每一循环由在95℃变性30秒、在57℃退火180秒和在72℃延伸60秒组成，然后是在72℃最后延伸5分钟。

在琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳，以获得纯化的5000-bp PCR产物。将纯化的PCR产物和限制性酶DpnI(New England Biolabs，USA)一起温育1小时，然后通过T4DNA连接酶(Roche，Germany)与pTetlgy2glyAN连接，将所得载体转化至大肠杆菌dH5α中(FhuA2lac(del)U169phoA glnV44Φ80'lacZ(del)M15gyrA96recA1relA1endA1thi-1hsdR17,Invitrogen)。

在含有34mg/L氯霉素的LB琼脂固体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L和琼脂15g/L)上筛选转化的菌株，由此获得重组质粒pTetgly2glyAN-rnpA(sRNA)(图1)。通过使用限制性酶裂解和DNA测序来证实所构建的重组质粒。

实施例2：包含高分子量编码丝蛋白的基因的重组质粒的构建

为了构建包含32个基因重复序列的重组质粒，所述基因编码由修饰源于金丝蜘蛛的牵引丝蛋白(具有大尺寸的难表达蛋白)而产生的丝蛋白，使用限制性酶SpeI和NheI消化由16个编码丝蛋白的基因重复序列组成的质粒pSH16a(Lee等，Theories andApplications of Chem.Eng.,8:3969,2002)，以获得1.7kb的片段。将该片段与使用限制性酶SpeI消化的质粒pSH16a连接，由此获得重组质粒pSH32。通过使用限制性酶SpeI和NheI(New England Biolabs，USA)消化来确定所连接的插入序列的方向。

相似地，使用限制性酶SpeI和NheI消化质粒pSH16a，以获得1.7kb的片段，然后将该片段与使用限制性酶SpeI消化的质粒pSH32连接，从而构建重组质粒pSH48。使用限制性酶SpeI和NheI消化质粒pSH32，以获得3.4kb的片段，然后将该片段与使用限制性酶SpeI消化的质粒pSH64连接，从而构建重组质粒pSH64。使用限制性酶SpeI和NheI消化质粒pSH48，以获得5.1kb的片段，然后将该片段与使用限制性酶SpeI消化的质粒pSH32连接，从而构建重组质粒pSH80。使用限制性酶SpeI和NheI消化质粒pSH16，以获得1.74kb的片段，然后将该片段与使用限制性酶SpeI消化的质粒pSH80连接，从而构建重组质粒pSH96。使用限制性酶SpeI和NheI消化质粒pSH32，以获得3.4kb的片段，然后将该片段与使用限制性酶SpeI消化的质粒pSH80连接，从而构建重组质粒pSH112。使用限制性酶SpeI和NheI消化质粒pSH64，以获得7.8kb的片段，然后将该片段与使用限制性酶SpeI消化的质粒pSH64连接，从而构建重组质粒pSH128。通过使用限制性酶SpeI和NheI确定各经连接的插入物的方向。

实施例3：通过sRNA系统降低rnpA基因表达导致丝蛋白表达增加的检查

为了检查在丝蛋白制备中甘氨酸tRNA基因共同过表达和通过使用sRNA系统降低核糖核酸酶P(rnpA)基因的表达的作用，分别使用实施例1中所获得的质粒pTetgly2glyAN-rnpA(sRNA)和包含16、32、48、64、80、96和112个编码丝蛋白的基因重复序列的各质粒pSH16、pSH32、pSH48、pSH64、pSH80、pSH96和pSH112转化大肠杆菌BL21(DE3)(F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)，一种携带T7RNA聚合酶基因的前噬菌体)(New England Biolabs，USA)。

使用质粒pACYC184和pSH16、pSH32、pSH64、pSH96和pSH128中的各质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)作为对照。将各转化的菌株接种至10ml的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L)(含有34mg/L的氯霉素，25mg/L的卡那霉素和1％阿拉伯糖)，在25℃和220rpm振荡培养。接下来，在上述培养基条件下于37℃和220rpm振荡培养各菌株。当培养物达到0.4的OD₆₀₀时，将1mM IPTG添加至培养基中以诱导丝蛋白基因表达。在诱导表达4小时之后，对培养物取样，在4℃和10,000g离心10分钟，在TE缓冲液和5×Laemmli样品缓冲液中溶解所获得的细胞沉淀。使用10％SDS-PAGE凝胶分离相同量(0.024mg)的样品，之后使用考马斯亮蓝R250(Bio-Rad，USA)溶液染色，使用GS-710校准成像光密度计(Bio-Rad，USA)进行定量(图2至4)。

另外，在0.4的OD₆₀₀诱导使用质粒pSH96和pTetgly2glyAN-rnpA(sRNA)转化的菌株的表达，之后通过SDS-PAGE分析蛋白表达，使用光密度计进行定量并进行平均。结果示于图4b。另外，使用质粒pSH128进行表达的结果示于图5。

结果是，可以看出，由于核糖核酸酶P(RnpA)表达降低，由16个重复序列组成的丝蛋白的表达相对于对照增加约150％，且由32个重复序列组成的丝蛋白的表达相对于对照增加约300％。另外，由48个重复序列组成的丝蛋白的表达增加约300％，且由64个重复序列组成的丝蛋白的表达增加约300％。另外，由80个重复序列组成的丝蛋白的表达增加约300％，由112个重复序列组成的丝蛋白的表达增加约200％，且由128个重复序列组成的丝蛋白的表达增加约150％。

实施例4：通过sRNA系统降低rnpA基因表达导致mRNA水平增加的检查

在该实施例中，为了在重组蛋白、难表达蛋白和有用蛋白的制备中防止信使RNA降解，通过导入sRNA系统降低作为核糖核酸酶P组分的rnpA基因的表达。另外，检查通过降低rnpA基因的表达细胞内mRNA水平是否会增加。

具体地，使用实施例1中所获得的质粒pTetgly2glyAN-rnpA(sRNA)和pSH32转化大肠杆菌BL21(DE3)(F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)，一种携带T7RNA聚合酶基因的噬菌体)(New England Biolabs，USA)。

使用质粒pACYC184和pSH32转化的大肠杆菌BL21(DE3)作为对照。将各转化的菌株接种至10ml的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L)(含有34mg/L的氯霉素，25mg/L的卡那霉素和1％阿拉伯糖)，在25℃和220rpm振荡培养。接下来，在上述培养基条件下于37℃和220rpm振荡培养各菌株。当培养物达到0.4的OD₆₀₀时，将1mM IPTG添加至培养基中以诱导丝蛋白基因表达。在诱导表达4小时之后，对培养物取样，在4℃和10,000g离心10分钟，以获得细胞沉淀，并从细胞沉淀中提取RNA。

对于RNA提取，将1ml Trizol添加至细胞沉淀，之后搅拌细胞沉淀溶液1分钟，使得在室温静置5分钟。接下来，将等于总量20％的量的氯仿添加至细胞沉淀溶液，然后搅拌15秒，在13,000rpm离心15分钟。将所制备的上清液转移至新试管中，将相同量的异丙醇添加至其中，小心搅拌。然后，在13,000rpm离心混合物30分钟，去除上清液。接下来，将1ml 70％乙醇添加至余下的物质中，然后在13,000rpm离心5分钟，再次重复上述程序。接下来，在室温干燥所得物质，溶解于30μl无RNA酶蒸馏水中。为了使用互补DNA(cDNA)替代所提取的RNA，使用Rocketstrip(Bioneer，Korea)进行qPCR。将所提取的RNA调整至500ng，并添加2μldN9引物至其中。然后，使用无RNA酶蒸馏水将反应混合物调整至总体积20μl。在下列条件下进行PCR反应：在30℃起始退火150秒，在60℃cDNA合成1小时，然后在95℃热灭活300秒。

为了使用制备的cDNA进行RT-PCR，使用含有8μl无RNA酶蒸馏水、10μl的SYBRGreen Mastermix(Enzynomics，Korea)、1μl的1/10稀释度cDNA和0.5μl各引物的总体积20μl的反应混合物。在下列条件下进行RT-PCR反应：在95℃起始激活10分钟，然后45个循环，每一循环由在95℃变性30秒、在60℃退火30秒和在72℃延伸30秒组成。为了确定解链曲线，从55℃至95℃按0.5℃升高温度，在各温度保持反应混合物5秒。

结果是，如图6所示，在其中降低核糖核酸酶P(RnpA)表达的细胞的情况下，mRNA的水平比对照的高24倍。这表明通过降低核糖核酸酶P(RnpA)表达阻止了mRNA的降解。

实施例5：通过分批补料发酵蜘蛛丝蛋白产量增加的检查

通过分批补料发酵培养实施例3中所构建的使用质粒pSH96和pACYC184-rnpA(sRNA)转化的菌株，检查菌株中蛋白产量的增加。

对于分批补料发酵，使用6.6L发酵罐(Bioflo 3000；New Brunswick ScientificCo.)，将1.6L R/2培养基，10g/L葡萄糖，0.7g/L MgSO₄·7H₂O，和抗生素(50μg/mL卡那霉素和/或35μg/mL氯霉素)添加至发酵罐中的菌株。为了调整溶解氧水平至40％，在将搅拌速度增加至1000rpm的同时调整空气饱和度。补料溶液由700g/L葡萄糖和20g/L MgSO₄·7H₂O组成，使用28％(v/v)氨溶液调节培养物的pH。当OD₆₀₀达到约70时，将1mM IPTG添加至培养物中以诱导蛋白表达。在诱导表达8小时之后，以2小时间隔对培养物进行取样。细胞增殖及所获得的蛋白浓度示于图7。如图7所示，可获得浓度为0.9g/L的蛋白质，比先前已知浓度高30％(0.7g/L)。

实施例6：通过降低rnpA基因表达增加其他蛋白表达的检查

使用本发明的降低rnpA基因表达的系统，分析编码苹果酸酶的基因(sfcA，SEQ IDNO:6)、编码转肽酶A的基因(srtA，SEQ ID NO:7)、编码4-羟基丁酸辅酶A转移酶的基因(Cat2，SEQ ID NO:8)和细胞色素P450基因(CYP73A5；肉桂酸4-羟化酶:SEQ ID NO:9和CYP98A3:SEQ ID NO:10)的表达。通过Bioneer(Korea)合成转肽酶A基因，使用下列引物通过PCR获得sfcA、cat2、CYP73A5和CYP98A3基因。

sfcA_F:5’-CCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGT-3’(SEQ ID NO:11)

sfcA_R:5’-TCTAGATTAGATGGAGGTACGGCGGTA-3’(SEQ ID NO:12)

Cat2_F:5’-GAATTCATGGAGTGGGAAGAGATATATA–3’(SEQ ID NO:13)

Cat2_R:5’-GGTACCCTAAAATCTCTTTTTAAATTCATT-3’(SEQ ID NO:14)

CYP73A5_F:5‘-GCGAAGCTTACAGTTCCTTGGTTTCATAA-3’(SEQ ID NO:15)

CYP73A5_R:5‘-GTACATATGATGGACCTCCTCTTGCTGG-3’(SEQ ID NO:16)

CYP98A3_F:5'-GGATCCATGTCGTGGTTTCTAATAGC–3'(SEQ ID NO:17)

CYP98A3_R:5'-GAATTCTTACATATCGTAAGGCACGC-3'(SEQ ID NO:18)

将RnpA sRNA(SEQ ID NO:1)和sfcA、srtA和cat2基因中的各基因分别插入pET30a(+)(Addgene，USA)和pTac15k(Addgene，USA)，以获得重组载体。将各载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株。将通过将sfcA、srtA和cat2基因中的各基因插入pET30a和pTac15k获得的载体转化的菌株用作对照。

将各转化菌株接种至10ml LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和NaCl 5g/L)(含有34mg/L的氯霉素，25mg/L的卡那霉素和1％阿拉伯糖)，在25℃和220rpm振荡培养。接下来，在上述培养基条件下于37℃和220rpm振荡培养各菌株。当培养物达到0.4的OD₆₀₀时，将1mM IPTG添加至培养基中以诱导各蛋白表达。在诱导表达4小时之后，对培养物取样，在4℃和10,000g离心10分钟，以获得细胞沉淀。将细胞沉淀溶解于TE缓冲液和5×Laemmli样品缓冲液。在10％SDS-PAGE凝胶上分离相同量(0.024mg)的样品，之后使用考马斯亮蓝R250(Bio-Rad，USA)溶液染色。

结果是，如图8中所示，与RnpA sRNA一起表达的苹果酸酶、转肽酶A、4-羟基丁酸辅酶A转移酶(Cat2)、细胞色素P450(肉桂酸4-羟化酶和CYP98A3)的表达水平显著高于不存在RnpA sRNA的情况下的蛋白表达水平。

尽管已经参照具体特征详细描述了本发明，对于本领域技术人员显而易见的是，这些描述仅针对优选的实施方案，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围由所附权利要求及其等同物所限定。

工业实用性

根据本发明，可通过降低rnpA基因的表达而显著增加靶蛋白、尤其是具有高分子量的难表达蛋白的表达，以致本发明可用于增加蛋白质的产量。

序列表

<110> 韩国科学技术院

<120> 通过降低rnpA基因表达制备重组蛋白的方法

<130> PF-B1895-CN

<140> PCT/KR2015/013419

<141> 2015-12-09

<150> 10-2014-0175780

<151> 2014-12-09

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rnpA的sRNA

<400> 1

gtggttaagc tcgcatttcc cagg 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rnpA的sRNA

<400> 2

gtggttaagc tcgcatttcc 20

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rnpA的sRNA

<400> 3

gtggttaagc tcgcat 16

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

cctgggaaat gcgagcttaa ccactttctg ttgggccatt gcattg 46

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

gcaaccatta tcaccgcca 19

<210> 6

<211> 1721

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sfcA

<400> 6

atattcaaaa aagagtgagt gacatggaac caaaaacaaa aaaacagcgt tcgctttata 60

tcccttacgc tggccctgta ctgctggaat ttccgttgtt gaataaaggc agtgccttca 120

gcatggaaga acgccgtaac ttcaacctgc tggggttact gccggaagtg gtcgaaacca 180

tcgaagaaca agcggaacga gcatggatcc agtatcaggg attcaaaacc gaaatcgaca 240

aacacatcta cctgcgtaac atccaggaca ctaacgaaac cctcttctac cgtctggtaa 300

acaatcatct tgatgagatg atgcctgtta tttatacccc aaccgtcggc gcagcctgtg 360

agcgtttttc tgagatctac cgccgttcac gcggcgtgtt tatctcttac cagaaccggc 420

acaatatgga cgatattctg caaaacgtgc cgaaccataa tattaaagtg attgtggtga 480

ctgacggtga acgcattctg gggcttggtg accagggcat cggcgggatg ggcattccga 540

tcggtaaact gtcgctctat accgcctgtg gcggcatcag cccggcgtat acccttccgg 600

tggtgctgga tgtcggaacg aacaaccaac agctgcttaa cgatccgctg tatatgggct 660

ggcgtaatcc gcgtatcact gacgacgaat actatgaatt cgttgatgaa tttatccagg 720

ctgtgaaaca acgctggcca gacgtgctgt tgcagtttga agactttgct caaaaaaatg 780

cgatgccgtt acttaaccgc tatcgcaatg aaatttgttc ttttaacgat gacattcagg 840

gcactgcggc ggtaacagtc ggcacactga tcgcagcaag ccgcgcggca ggtggtcagt 900

taagcgagaa aaaaatcgtc ttccttggcg caggttcagc gggatgcggc attgccgaaa 960

tgatcatctc ccagacccag cgcgaaggat taagcgagga agcggcgcgg cagaaagtct 1020

ttatggtcga tcgctttggc ttgctgactg acaagatgcc gaacctgctg cctttccaga 1080

ccaaactggt gcagaagcgc gaaaacctca gtgactggga taccgacagc gatgtgctgt 1140

cactgctgga tgtggtgcgc aatgtaaaac cagatattct gattggcgtc tcaggacaga 1200

ccgggctgtt tacggaagag atcatccgtg agatgcataa acactgtccg cgtccgatcg 1260

tgatgccgct gtctaacccg acgtcacgcg tggaagccac accgcaggac attatcgcct 1320

ggaccgaagg taacgcgctg gtcgccacgg gcagcccgtt taatccagtg gtatggaaag 1380

ataaaatcta ccctatcgcc cagtgtaaca acgcctttat tttcccgggc atcggcctgg 1440

gtgttattgc ttccggcgcg tcacgtatca ccgatgagat gctgatgtcg gcaagtgaaa 1500

cgctggcgca gtattcacca ttggtgctga acggcgaagg tatggtactg ccggaactga 1560

aagatattca gaaagtctcc cgcgcaattg cgtttgcggt tggcaaaatg gcgcagcagc 1620

aaggcgtggc ggtgaaaacc tctgccgaag ccctgcaaca ggccattgac gataatttct 1680

ggcaagccga ataccgcgac taccgccgta cctccatcta a 1721

<210> 7

<211> 618

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> srtA

<400> 7

atgaaaaaat ggaccaaccg cctgatgacc attgcgggcg tggtgctgat tctggtggcg 60

gcgtatctgt ttgcgaaacc gcatattgat aactatctgc atgataaaga taaagatgaa 120

aaaattgaac agtatgataa aaacgtgaaa gaacaggcga gcaaagataa aaaacagcag 180

gcgaaaccgc agattccgaa agataaaagc aaagtggcgg gctatattga aattccggat 240

gcggatatta aagaaccggt gtatccgggc ccggcgaccc cggaacagct gaaccgcggc 300

gtgagctttg cggaagaaaa cgaaagcctg gatgatcaga acattagcat tgcgggccat 360

acctttattg atcgcccgaa ctatcagttt accaacctga aagcggcgaa aaaaggcagc 420

atggtgtatt ttaaagtggg caacgaaacc cgcaaatata aaatgaccag cattcgcgat 480

gtgaaaccga ccgatgtggg cgtgctggat gaacagaaag gcaaagataa acagctgacc 540

ctgattacct gcgatgatta taacgaaaaa accggcgtgt gggaaaaacg caaaattttt 600

gtggcgaccg aagtgaaa 618

<210> 8

<211> 1290

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cat2

<400> 8

atggagtggg aagagatata taaagagaaa ctggtaactg cagaaaaagc tgtttcaaaa 60

atagaaaacc atagcagggt agtttttgca catgcagtag gagaacccgt agatttagta 120

aatgcactag ttaaaaataa ggataattat ataggactag aaatagttca catggtagct 180

atgggcaaag gtgaatatac aaaagagggt atgcaaagac attttagaca taatgcttta 240

tttgtaggcg gatgtactag agatgcagta aattcaggaa gagcagatta tacaccttgt 300

tttttctatg aagtgccaag tttgtttaaa gaaaaacgtt tgcctgtaga tgtagcactt 360

attcaggtaa gtgagccaga taaatatggc tactgcagtt ttggagtttc caatgactat 420

accaagccag cagcagaaag tgctaagctt gtaattgcag aagtgaataa aaacatgcca 480

agaactcttg gagattcttt tatacatgta tcagatattg attatatagt ggaagcttca 540

cacccattgt tagaattgca gcctcctaaa ttgggagatg tagaaaaagc cataggagaa 600

aactgtgcat ctttaattga agatggagct actcttcagc ttggaatagg tgctatacca 660

gatgcggtac ttttattctt aaagaacaaa aagaatttag gaatacattc tgagatgata 720

tcagatggtg tgatggaact ggtgaaggca ggggttatca ataacaagaa aaagaccctc 780

catccaggca aaatagttgt aacattttta atgggaacaa aaaaattata tgattttgta 840

aacaataatc caatggtaga aacttattct gtagattatg taaataatcc actggtaatt 900

atgaaaaatg acaatatggt ttcaataaat tcttgtgttc aagtagactt aatgggacaa 960

gtatgttctg aaagtatagg attgaaacag ataagtggag tgggaggcca ggtagatttt 1020

attagaggag ctaatctatc aaagggtgga aaggctatta tagctatacc ttccacagct 1080

ggaaaaggaa aagtttcaag aataactcca cttctagata ctggtgctgc agttacaact 1140

tctagaaatg aagtagatta tgtagttact gaatatggtg ttgctcatct taagggcaaa 1200

actttaagaa atagggcaag agctctaata aatatcgctc atccaaaatt cagagaatca 1260

ttaatgaatg aatttaaaaa gagattttag 1290

<210> 9

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP73A5

<400> 9

atggacctcc tcttgctgga gaagtcttta atcgccgtct tcgtggcggt gattctcgcc 60

acggtgattt caaagctccg cggcaagaaa ttgaagctac ctccaggtcc tataccaatt 120

ccgatcttcg gaaactggct tcaagtcgga gatgatctca accaccgtaa tctcgtcgat 180

tacgctaaga aattcggcga tctcttcctc ctccgtatgg gtcagcgaaa cctagtcgtc 240

gtctcctcac cggatctaac aaaggaagtg ctcctcactc aaggcgttga gtttggatcc 300

agaacgagaa acgtcgtgtt cgacattttc accgggaaag gtcaagatat ggtgttcact 360

gtttacggcg agcattggag gaagatgaga agaatcatga cggttccttt cttcaccaac 420

aaagttgttc aacagaatcg tgaaggttgg gagtttgaag cagctagtgt tgttgaagat 480

gttaagaaga atccagattc tgctacgaaa ggaatcgtgt tgaggaaacg tttgcaattg 540

atgatgtata acaatatgtt ccgtatcatg ttcgatagaa gatttgagag tgaggatgat 600

cctcttttcc ttaggcttaa ggctttgaat ggtgagagaa gtcgattagc tcagagcttt 660

gagtataact atggagattt cattcctatc cttagaccat tcctcagagg ctatttgaag 720

atttgtcaag atgtgaaaga tcgaagaatc gctcttttca agaagtactt tgttgatgag 780

aggaagcaaa ttgcgagttc taagcctaca ggtagtgaag gattgaaatg tgccattgat 840

cacatccttg aagctgagca gaagggagaa atcaacgagg acaatgttct ttacatcgtc 900

gagaacatca atgtcgccgc gattgagaca acattgtggt ctatcgagtg gggaattgca 960

gagctagtga accatcctga aatccagagt aagctaagga acgaactcga cacagttctt 1020

ggaccgggtg tgcaagtcac cgagcctgat cttcacaaac ttccatacct tcaagctgtg 1080

gttaaggaga ctcttcgtct gagaatggcg attcctctcc tcgtgcctca catgaacctc 1140

catgatgcga agctcgctgg ctacgatatc ccagcagaaa gcaaaatcct tgttaatgct 1200

tggtggctag caaacaaccc caacagctgg aagaagcctg aagagtttag accagagagg 1260

ttctttgaag aagaatcgca cgtggaagct aacggtaatg acttcaggta tgtgccattt 1320

ggtgttggac gtcgaagctg tcccgggatt atattggcat tgcctatttt ggggatcacc 1380

attggtagga tggtccagaa cttcgagctt cttcctcctc caggacagtc taaagtggat 1440

actagtgaga aaggtggaca attcagcttg cacatcctta accactccat aatcgttatg 1500

aaaccaagga actgttaa 1518

<210> 10

<211> 1527

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYP98A3

<400> 10

atgtcgtggt ttctaatagc ggtggcgaca atcgccgccg tcgtatccta caagctaatc 60

caacggctaa gatacaagtt cccaccaggc ccaagcccca agccgatcgt cggtaacctc 120

tacgacataa aaccggtccg gttcagatgt tactacgagt gggctcaatc ttatggacca 180

atcatatcgg tctggatcgg ttcaattcta aacgtggtcg tatctagcgc cgagctagca 240

aaagaagttc tgaaagaaca cgaccagaaa ctcgccgacc ggcaccggaa cagatcgacg 300

gaagcattta gccgcaacgg tcaggatctt atatgggccg attatgggcc tcattacgtg 360

aaggtgagaa aagtttgcac gcttgagctc ttcacaccga aacgactcga gtctctcaga 420

cctatccgtg aagatgaagt caccgccatg gttgaatccg tcttcagaga ctgtaacctt 480

cctgaaaaca gagcaaaagg tttacaactg aggaagtact taggagcggt tgcgttcaac 540

aacataacgc ggctagcctt tgggaagcgt tttatgaacg ctgaaggtgt tgtggacgag 600

caagggcttg agttcaaggc catagtatcc aacggtctga agctaggtgc ttcactgtca 660

atagctgaac acatcccgtg gctcaggtgg atgtttccgg ctgatgagaa ggcgtttgct 720

gagcacgggg ctcgtcgtga ccgcctcact cgagctatca tggaggagca tactttggcc 780

cgtcaaaagt ctagtggagc gaaacagcat ttcgttgatg cgttgctaac gttgaaggat 840

cagtatgatc ttagtgagga tactatcatt ggtcttctat gggatatgat cacggcaggg 900

atggacacga cagcgataac agcggaatgg gcgatggcgg aaatgatcaa gaatccaaga 960

gtgcaacaaa aagtgcaaga agagttcgac agagtggttg gacttgaccg gatcttaacc 1020

gaggcagatt tctcccgctt accttacttg caatgcgtgg tgaaagagtc attcaggctg 1080

catcctccaa cgcctctaat gctacctcac cgaagcaacg cagatgtcaa gatcggaggc 1140

tatgatattc ccaaaggatc aaacgttcat gtgaatgtgt gggctgtggc tagagacccg 1200

gctgtatgga aaaatccatt tgagtttaga ccagagagat tcttggaaga agatgttgac 1260

atgaagggtc atgattttag gctgcttccg tttggagctg gaagacgggt ttgtcccggt 1320

gcacaacttg gtatcaattt ggtaacttcg atgatgagtc atttgcttca ccattttgtt 1380

tggacacctc ctcaagggac taaaccggag gagattgaca tgtctgaaaa ccctggactc 1440

gttacttaca tgcgtacccc tgtgcaagcg gttgcaacgc ctcggttgcc ttcggatctg 1500

tacaaacgcg tgccttacga tatgtaa 1527

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

ccatggatat tcaaaaaaga gtgagt 26

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

tctagattag atggaggtac ggcggta 27

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

gaattcatgg agtgggaaga gatatata 28

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

ggtaccctaa aatctctttt taaattcatt 30

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

gcgaagctta cagttccttg gtttcataa 29

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

gtacatatga tggacctcct cttgctgg 28

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

ggatccatgt cgtggtttct aatagc 26

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

gaattcttac atatcgtaag gcacgc 26

Claims

1.一种用于表达靶蛋白的重组载体，所述重组载体包含编码所述靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA。

2.权利要求1的重组载体，其中所述靶蛋白是难表达蛋白。

3.权利要求1的重组载体，其中所述sRNA是针对rnpA基因的sRNA。

4.权利要求3的重组载体，其中所述sRNA具有SEQ ID NO:1至3任一者所示的核苷酸序列。

5.权利要求2的重组载体，其中所述靶蛋白选自丝蛋白、抗体、细胞色素、酶和转肽酶A组成的组。

6.一种重组微生物，所述重组微生物中导入权利要求1的重组载体。

7.一种重组微生物，所述重组微生物中导入编码靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA。

8.权利要求7的重组微生物，其中所述靶蛋白是难表达蛋白。

9.权利要求7的重组微生物，其中所述sRNA是针对rnpA基因的sRNA。

10.权利要求8的重组微生物，其中所述sRNA具有SEQ ID NO:1至3任一者所示的核苷酸序列。

11.一种用于制备靶蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)通过培养权利要求5或6的重组微生物而表达所述重组微生物中的所述靶蛋白；和

(b)回收所表达的靶蛋白。

12.权利要求11的方法，其中所述靶蛋白是难表达蛋白或具有50kDa或更大分子量的蛋白质。

13.一种用于制备靶蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：

通过培养其中导入编码所述靶蛋白的基因的重组微生物来制备所述靶蛋白；和

回收所制备的靶蛋白，

其中将降低核糖核酸酶P的表达的物质添加至培养物中以增加所述靶蛋白的表达。

14.权利要求13的方法，其中所述靶蛋白是难表达蛋白或具有50kDa或更大分子量的蛋白质。

15.权利要求13的方法，其中添加抑制核糖核酸酶P的表达的物质。