KR102488022B1 - 재조합 실크 단백질 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 고분자량 재조합 실크 단백질의 생산 방법 - Google Patents
재조합 실크 단백질 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 고분자량 재조합 실크 단백질의 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 재조합 실크 단백질 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 고분자량 재조합 실크 단백질의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 재조합 실크 단백질 생산능을 가지는 숙주세포에서, eno 유전자의 발현을 억제하는 합성 sRNA를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 벡터가 도입되어 거미 실크 단백질 생산능력이 향상된 재조합 미생물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 균주 유래 재조합 실크 단백질은 거미로부터 생산되는 드래그라인 실크 단백질과 유사한 고분자량을 가지고 있으면서, 대량생산이 가능하여 섬유로 제조시 천연 실크 단백질과 유사하거나 더 우수한 물성을 가지므로, 거미줄 섬유의 적용이 기대되는 생물공학적 분야 및/또는 의약 분야 등과 같은 다양한 산업적 분야에 사용될 수 있어 매우 유용하다.
Description
본 발명은 재조합 실크 단백질 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 고분자량 재조합 실크 단백질의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 재조합 실크 단백질 생산능을 가지는 숙주세포에서, eno 유전자 발현이 억제되어 거미 실크 단백질 생산능력이 향상된 재조합 미생물에 관한 것이다.
천연 실크 단백질 소재는 오랜 기간 대표적인 의류용 소재로 사용되어져 왔으며, 최근에는 천연 실크 단백질의 우수한 생체적합성, 뛰어난 신축성과 물리적 강도, 및 분말, 막, 다공질체, 겔과 같은 다양한 형태로의 성형이 가능하다는 점, 천연 단백질로서 화학적 개질이 가능하다는 점 등의 특성으로 인해 차세대 고기능성 산업용 소재로서 활용될 가능성이 매우 높다.
현재까지 실크 단백질은 주로 누에와 거미에서 생산된다고 알려져 있다.
누에 실크 단백질의 경우, 누에가 양식이 가능하고 300㎡의 면적과 약 150만 마리의 누에에서 5㎏의 양까지 생산이 가능하여 전통적으로 직물 제조에 널리 이용되어 왔다. 또한, 천연 누에 실크 단백질은 면역반응이나 알레르기 반응이 없어 인체 친화적인 소재로서, 화장품 소재, 효소 고정화 담체, 세포배양용 소재, 인공피부 등의 산업용 소재로 이용될 가능성이 제시되고 있다. 하지만, 누에 실크 단백질은 견고성, 즉 강도 측면에서 물성이 다소 부족하여 아직까지 산업용 소재로 이용하기에는 다소 제약이 따르고 있어, 현재 누에 실크 단백질의 물성을 개선하기 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를 들면, 누에 실크 단백질의 주 구성성분인 견피브로인의 분자량별 분리 및 기능성에 관한 연구, 누에 실크 단백질의 미세분체의 제조 및 피부친화성에 관한 연구, 누에 실크 단백질과 화학적 합성 고분자의 블랜딩을 통한 물성 향상 연구, 누에 실크 단백질과 천연 당 기반 고분자 화합물과의 혼합 연구 등이 있다.
거미 실크 단백질의 경우, 최근 자연에서 얻어진 거미 실크 단백질의 물성이 견고성과 신축성 측면에서 매우 뛰어나다는 사실이 밝혀진 이후, 산업 소재로 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 하지만, 거미는 서로 잡아먹는 특성 때문에 양식이 불가능하고, 거미에서 생산하는 실크 단백질 양이 매우 적어서 누에 실크 단백질처럼 천연 단백질을 분리 및 생산하여 사용하기에는 현실적으로 불가능한 것으로 알려져 있다. 따라서, 거미 실크 단백질 관련 연구는 거미 실크 단백질 유전자를 다양한 단백질 발현 시스템에 도입하여 재조합 단백질을 생산하고자 하는 연구가 주를 이루고 있으며, 대장균, 효모, 식물세포, 동물세포, 유전자 이식 동물 등에서 거미 실크 단백질을 대량생산하고자 하는 다양한 시도가 진행되고 있다. 전반적으로 거미 실크 단백질에 관련된 연구는, 주로 2000년대 이후 집중적인 연구 및 투자로 인하여 어느 정도의 뛰어난 연구 성과가 최근 보고되고 있지만, 거미 실크 단백질의 유전자의 반복적인 DNA 서열과 글리신, 알라닌, 세린과 같은 특정 아미노산 서열의 반복과 같은 독특한 특성은 자연에서 존재하는 실크 단백질 소재를 재조합하여 생산하는데 한계로 작용하고 있다.
거미의 생명줄로 쓰이며 방사형 거미줄 형태를 만들 때에 사용하는 드래그라인 거미줄은 그 강도와 탄성도가 크다. 거미줄은 강철보다 단위 질량당 5배의 강도를 가지며, 인간이 만든 고품질의 케플러 섬유보다 3배 단단하다 (Gosline, J. M. et al., J. Exp. Biol., 202:3295, 1999; Vollrath, F. & Knight, D. P., Nature 410: 541, 2001). 뿐만 아니라, 생분해성 성질을 가지고 있어 봉합사, scaffold 등, 생의학 분야에 적용이 가능하고, 항염증 기능이 있어 항균성 소재로 적용가능하며, 보습력이 뛰어나 다양한 화장품 소재로서도 활용될 수 있다. 따라서, 드래그라인 거미줄은 다양한 산업적 응용성을 지닌 재료로서 많은 관심을 받아왔다.
그러나 불행히도, 거미는 영역 보호본능이 강하고 공격적이기 때문에, 자연적인 드래그라인 거미줄은 거미 배양 등으로 쉽게 얻어질 수 없다. 따라서 재조합 드래그라인 실크 단백질을 생산하기 위한 수많은 노력이 있었다 (Lazaris, A. et al., Science, 295:472, 2002; Teule, F. et al., Nat. Protoc., 4: 341, 2009; Arcidiacono, S. et al., Macromolecules, 35: 1262, 2002; Brooks, A. E. et al. Biomacromolecules, 9: 1506, 2008; Heim, M., Keerl, D. & Scheibel, T., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 48: 3584, 2009; Fahnestock, S. R. et al., Rev. Mol. Biotechnol., 74: 105, 2000; Scheller, J. et al., Nat. Biotechnol., 19: 573, 2001; Widmaier, D. M. et al. Mol. Syst. Biol., 5: 309, 2009).
현재까지 연구된 모든 거미는 250~320 kDa의 고분자량을 가지는 드래그라인 실크 단백질을 자연적으로 생산해 왔다. 대장균에서 합성된 드래그라인 실크 단백질은 분자량이 163kDa(Fahnestock S.R. & Irwin S.L., Appl. Microbiol. Biotechnol., 47:23, 1997), 284.9kDa(KR 10-1317420호, Xia, Xiao-Xia, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, Vo.107(32), pp. 14059-44063, 2010), rpnA 유전자 발현 저해를 이용한 386.8kDa(KR 10-101765255호 및 split intein mediated ligation을 이용한 556kDa(Christopher H. Bowen et al., Biomacromolecules, Vol. 19, 9, pp. 3853-3860, 2018) 크기의 단백질 생산 등이 보고 되었으나, 상업적 이용에 충분한 단백질 수율 및 양질의 실-어셈블리 모두를 달성하지 못한 문제점이 있다.
따라서, 고분자자량의 재조합 실크 단백질을 높은 순도로 대량생산할 수 있는 균주가 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고, 높은 순도를 가지는 고분자량의 재조합 실크 단백질을 대량생산할 수 있는 균주를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, MOMA simulation 결과 확인된 타겟 유전자들의 발현을 sRNA를 이용하여 억제할 경우, 높은 순도를 가지는 고분자량의 재조합 실크 단백질을 대량생산 할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 고분자량의 재조합 실크 단백질을 생산할 수 있는 재조합 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 높은 순도의 고분자량 재조합 실크 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 실크 단백질 생산능을 가지는 숙주세포에서, eno 유전자 발현이 억제되어 거미 실크 단백질 생산능력이 향상된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 재조합 실크 단백질을 생성하는 단계; 및 (b) 생성된 재조합 실크 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 실크 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 균주 유래 재조합 실크 단백질은 거미로부터 생산되는 드래그라인 실크 단백질과 유사한 고분자량을 가지고 있으면서, 대량생산이 가능하여 섬유로 제조시 천연 실크 단백질과 유사하거나 더 우수한 물성을 가지므로, 거미줄 섬유의 적용이 기대되는 생물공학적 분야 및/또는 의약 분야 등과 같은 다양한 산업적 분야에 사용될 수 있어 매우 유용하다.
도 1은 본 발명의 합성 sRNA의 작용기작을 설명한 개념도이다.
도 2의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자의 sRNA 카세트를 나타내는 개념도이며, (B)는 상기 카세트를 포함하는 벡터맵이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 추가로 선별한 유전자의 sRNA 카세트를 포함하는 벡터맵이다.
도 4의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자의 타겟 결합 사이트 길이에 따른 발현량을 확인한 결과이고, (B)는 결합 에너지를 계산한 결과이며, (C)는 결합에너지와 발현량 사이의 관계를 계산한 그래프이다.
도 5의 (A) 및 (B)는 기존의 공지된 균주에서의 재조합 실크 단백질의 발현량을 분석한 결과이며, (C)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자의 발현억제에 따른 재조합 실크 단백질의 발현량을 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 추가 후보 유전자의 발현량을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 추가 후보 유전자의 발현량을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 추가 후보 유전자의 발현량을 확인한 결과이다.
도 9의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 추가 후보 유전자 중, 1차 선별한 유전자의 발현량을 확인한 결과이며, (B)는 상기 결과를 정량화한 그래프이다.
도 10의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 ychM 유전자의 타겟 결합 사이트 길이에 따른 발현량을 확인한 결과이고, (B)는 결합 에너지를 계산한 결과이며, (C)는 결합에너지와 발현량 사이의 관계를 계산한 그래프이다.
도 11의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 변형된 대사 경로를 예측한 모식도이고, (B)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 재조합 실크 단백질 발현량을 상기 균주를 유가식 배양(Fed-batch fermentation)으로, 30℃ 에서 OD600 이 100이 되는 시점에서 1mM IPTG인덕션 이후, 6시간째 발현량을 측정하여 확인한 결과이며, (C)는 eno 유전자 발현이 저해된 균주에서, 후보 유전자의 발현을 추가로 저해했을 때, 생산되는 재조합 실크 단백질의 발현량을 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 RNA-seq 분석 결과를 나타낸 것으로 왼쪽 패널은 가장 많이 up-regulation된 유전자의 리스트이며, 오른쪽 패널은 가장 많이 down regulation된 유전자의 리스트이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 RNA-seq을 이용한 DEG 리스트에 대한 heatmap으로서, 기존 재조합 실크 단백질 균주에 비해 다양한 유전자형이 변화된 것을 나타낸 것이다.
도 14의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 글라이신, 알라닌 및 세린 관련 유전자 발현 변화를 확인한 결과이고, (B)는 전사와 번역 관련 유전자의 발현 변화를 확인한 결과이며, (C)는 글라이신, 알라닌 및 세린 tRNA 증폭결과를 확인한 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 분리정제를 위한 염석방법에 있어서, ammonium persulfate의 농도를 최적화한 결과를 나타낸 것이다.
도 16의 왼쪽 패널은 microfiltration을 진행하기 전 분리정제한 재조합 실크 단백질의 순도를 확인한 결과이며, 오른쪽 패널은 microfiltration을 진행한 후 순도를 확인한 결과이다.
도 17의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 30L 발효 결과를 나타낸 것이며, (B)는 300L 발효 결과를 나타낸 것이다.
도 18의 왼쪽 패널은 본 발명의 일 실시예에 따른 균주의 30L 발효후, 분리정제한 재조합 단백질의 8% SDS-PAGE 결과이며, 오른쪽 패널은 상기 분리정제한 재조합 단백질의 15% SDS-PAGE 결과이다.
도 2의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자의 sRNA 카세트를 나타내는 개념도이며, (B)는 상기 카세트를 포함하는 벡터맵이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 추가로 선별한 유전자의 sRNA 카세트를 포함하는 벡터맵이다.
도 4의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자의 타겟 결합 사이트 길이에 따른 발현량을 확인한 결과이고, (B)는 결합 에너지를 계산한 결과이며, (C)는 결합에너지와 발현량 사이의 관계를 계산한 그래프이다.
도 5의 (A) 및 (B)는 기존의 공지된 균주에서의 재조합 실크 단백질의 발현량을 분석한 결과이며, (C)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자의 발현억제에 따른 재조합 실크 단백질의 발현량을 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 추가 후보 유전자의 발현량을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 추가 후보 유전자의 발현량을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 추가 후보 유전자의 발현량을 확인한 결과이다.
도 9의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 추가 후보 유전자 중, 1차 선별한 유전자의 발현량을 확인한 결과이며, (B)는 상기 결과를 정량화한 그래프이다.
도 10의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 ychM 유전자의 타겟 결합 사이트 길이에 따른 발현량을 확인한 결과이고, (B)는 결합 에너지를 계산한 결과이며, (C)는 결합에너지와 발현량 사이의 관계를 계산한 그래프이다.
도 11의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 변형된 대사 경로를 예측한 모식도이고, (B)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 재조합 실크 단백질 발현량을 상기 균주를 유가식 배양(Fed-batch fermentation)으로, 30℃ 에서 OD600 이 100이 되는 시점에서 1mM IPTG인덕션 이후, 6시간째 발현량을 측정하여 확인한 결과이며, (C)는 eno 유전자 발현이 저해된 균주에서, 후보 유전자의 발현을 추가로 저해했을 때, 생산되는 재조합 실크 단백질의 발현량을 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 RNA-seq 분석 결과를 나타낸 것으로 왼쪽 패널은 가장 많이 up-regulation된 유전자의 리스트이며, 오른쪽 패널은 가장 많이 down regulation된 유전자의 리스트이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 RNA-seq을 이용한 DEG 리스트에 대한 heatmap으로서, 기존 재조합 실크 단백질 균주에 비해 다양한 유전자형이 변화된 것을 나타낸 것이다.
도 14의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 글라이신, 알라닌 및 세린 관련 유전자 발현 변화를 확인한 결과이고, (B)는 전사와 번역 관련 유전자의 발현 변화를 확인한 결과이며, (C)는 글라이신, 알라닌 및 세린 tRNA 증폭결과를 확인한 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 분리정제를 위한 염석방법에 있어서, ammonium persulfate의 농도를 최적화한 결과를 나타낸 것이다.
도 16의 왼쪽 패널은 microfiltration을 진행하기 전 분리정제한 재조합 실크 단백질의 순도를 확인한 결과이며, 오른쪽 패널은 microfiltration을 진행한 후 순도를 확인한 결과이다.
도 17의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 30L 발효 결과를 나타낸 것이며, (B)는 300L 발효 결과를 나타낸 것이다.
도 18의 왼쪽 패널은 본 발명의 일 실시예에 따른 균주의 30L 발효후, 분리정제한 재조합 단백질의 8% SDS-PAGE 결과이며, 오른쪽 패널은 상기 분리정제한 재조합 단백질의 15% SDS-PAGE 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "실크 단백질"이란, 천연 실크 단백질과 분자상 및 구조상 프로파일이 거의 근사한 합성 실크단백질로서 재조합 단백질 생산방법에 의해 생합성되는 단백질을 의미하며, 예시적으로 드레그라인 실크 (dragline silk), 실크 피브로인(silk fibroin), 및 편모상 실크(flagelliform silk) 등을 들 수 있다. 아울러, 본원에서 "실크 유사 단백질"이란 실크 단백질과 유사하게 글리신 함량이 10% 이상인 펩타이드를 반복단위로 포함하는, 재조합 단백질 생산방법 등에 의해 생합성되는 단백질로서, 예시적으로 엘라스틴(elastin), 비서스(byssus), 및 콜라겐(collagen) 등을 들 수 있다.
본원에서 "거미줄 섬유"란 합성된 재조합 실크 단백질을 이용하여 제조된, 천연 거미줄 섬유와 거의 유사한 섬유를 의미하며, "거미줄 유사 섬유"란 합성된 재조합 실크 유사 단백질을 이용하여 제조된, 거미줄 섬유와 유사한 물성을 갖는 섬유를 의미한다.
본원에서 "재조합 단백질"이란, 벡터, 즉 자가복제할 수 있는 플라스미드나 바이러스 등으로 삽입되거나, 또는 숙주 (host cell)의 게놈 DNA 내로 삽입되거나, 또는 숙주 내에서 별개의 분자의 형태로 존재하도록 삽입된 핵산 서열에 의하여 코딩되는 단백질로서, 상기 핵산서열이 발현(expression)된 단백질을 의미한다.
본원에서, "숙주세포 (host cell)"란, 다른 세포 또는 기관에서 유래된 기능성 유전자 및/또는 유전자 산물을 발현할 수 있는 임의의 세포를 의미한다.
본원에서 "sRNA (small RNA)"란, 단백질로 번역되지 않으며 상보적 결합을 통해 특정 mRNA의 번역을 효과적으로 억제하는, 보통 염기 서열의 길이가 200개 이하의 짧은 길이의 RNA이다.
본원에서 "리보좀 결합 부위(ribosome binding site)"란, mRNA의 전사를 위하여 리보좀이 mRNA상에 결합하는 부위를 말한다.
본원에서 "유전자"란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 표적유전자는 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다.
본 발명에서는, 기존의 고분자량 재조합 실크 단백질 생산 균주에서 대사경로를 조작하여 고분자량의 재조합 실크 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 균주를 개발하기 위해, 각각의 유전자의 발현을 저해할 수 있는 sRNA library를 이용하여 후보 유전자군을 선별한 다음, 이들의 재조합 실크 단백질의 생산량을 비교하여 최적의 유전자 조합을 선별할 경우, 높은 순도의 고분자량 재조합 실크 단백질을 생산할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 기존의 재조합 실크 단백질 생산균주(KR 10-1317420호)에, 대장균의 모든 유전자 각각 knock down할 수 있는 sRNA library를 도입한 다음, 두 가지 이상의 유전자 knock down regulation에 따른 물질 대사경로 시뮬레이션을 통해 재조합 실크 단백질의 생산량의 증가할 것으로 예상되는 후보 유전자군을 선별하고, 이를 sRNA를 이용하여 발현을 억제할 경우, 재조합 실크 단백질의 생산량이 증가하는 것을 확인하였다(도 2, 도 4 및 도 5).
추가로, 다른 후보 유전자군을 같은 방식으로 테스트하여, 상기 단계에서 선별한 유전자에 추가 유전자의 발현을 억제할 경우, 재조합 실크 단백질의 생산량이 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 11).
따라서, 본 발명은 일 관점에서,
재조합 실크 단백질 생산능을 가지는 숙주세포에서, eno 유전자 발현이 억제되어 거미 실크 단백질 생산능력이 향상된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 eno 유전자 발현의 억제는 통상의 기술자에게 공지된 모든 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 상기 유전자의 발현을 억제하는 합성 sRNA를 암호화하는 서열이 도입되는 방법, 프로모터를 변경하는 방법, antisense RNA를 도입하는 방법 및 siRNA를 도입하는 방법으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 gnd, ybcF, araC, purT, tdcD, ackA, pta, fsaA, fsaB, ptsH, ptsI, dhal, dhaK, pyrD, guaA, prsA, tesB, aas, acpP, ychM, cysZ, asnA, asnB, acpP, plsB, fadB, sucC, fldA, fade, sucA, sucB 및 pykA로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 발현이 추가로 억제되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자는 pstI, asnA, ychM, tesB, dhaK, guaA, pck, 또는 purT인 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 ychM 또는 pstI인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 gnd, ybcF, araC, purT, tdcD, ackA, pta, fsaA, fsaB, ptsH, ptsI, dhal, dhaK, pyrD, guaA, prsA, tesB, aas, acpP, ychM, cysZ, asnA, asnB, acpP, plsB, fadB, sucC, fldA, fade, sucA, sucB 또는 pykA 유전자 발현의 억제는 통상의 기술자에게 공지된 모든 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 상기 유전자의 발현을 억제하는 합성 sRNA를 암호화하는 서열이 도입되는 방법, 프로모터를 변경하는 방법, antisense RNA를 도입하는 방법 및 siRNA를 도입하는 방법으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 실크 단백질 생산능을 가지는 숙주세포는 서열번호 1의 아미노산을 가지는 펩타이드가 1회 내지 160회, 바람직하게는 8회 내지 160회, 더욱 바람직하게는 16회 내지 160회 반복되어 있는 재조합 실크 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 tRNA를 코딩하는 염기서열을 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 tRNA를 코딩하는 염기서열은 글리신 tRNA를 코딩하는 염기서열인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 드레그라인 실크(dragline silk) 단백질을 구성하는 반복단위 펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 실크단백질 또는 실크 유사단백질을 구성하는 글리신 함량이 10% 이상인 펩타이드는 드레그라인 실크 (dragline silk), 엘라스틴(elastin), 실크 피브로인(silk fibroin), 비서스(byssus), 편모상 실크(flagelliform silk) 및 콜라겐(collagen)로 구성된 군에서 선택된 단백질을 구성하는 반복단위 펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열은 드래그라인 실크단백질의 반복단위 펩타이드이며, 서열번호 5 내지 7의 아미노산 서열은 엘라스틴의 반복단위 펩타이드이며, 서열번호 8의 아미노산 서열은 실크 피브로인의 반복단위 펩타이드이며, 서열번호 9의 아미노산 서열은 비서스의 반복단위 펩타이드이고, 서열번호 10의 아미노산 서열은 편모상 실크의 반복단위 펩타이드이고, 서열번호 11 및 12는 콜라겐의 반복단위 펩타이드이다.
서열번호 1: NH2-SGRGGLGGQGAGMAAAAAMGGAGQGGYGGLGSQGT-COOH
서열번호 2: NH2-GPGQQ-COOH
서열번호 3: NH2-GPGGY-COOH
서열번호 4: NH2-GGYGPGS-COOH
서열번호 5: NH2-GVGVP-COOH
서열번호 6: NH2-VPGG-COOH
서열번호 7: NH2-APGVGV-COOH
서열번호 8: NH2-GAGAGS-COOH
서열번호 9: NH2-GPGGG-COOH
서열번호 10: NH2-GPGGX-COOH
서열번호 11: NH2-GAPGAPGSQGAPGLQ-COOH
서열번호 12: NH2-GAPGTPGPQGLPGSP-COOH
본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 반복단위로 하여 48회 포함하도록 제조된 재조합 실크 단백질 (이하, "48mer"라 합니다)이 약 147 kDa의 분자량을 가지고, 기존의 재조합 실크 단백질 균주의 생산량 대비 월등히 뛰어난 생산량을 나타내는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 반복단위로 하여 96회 포함하도록 제조된 재조합 실크 단백질 (이하, "96mer"라 합니다)의 경우, 그 분자량이 284.9kDa에 달하여, 거미로부터 수득한 천연 실크 단백질의 분자량(250~320kDa)과 거의 유사한 고분자량을 가지는 재조합 실크 단백질 역시 기존 균주 대비 생산량과 순도면에서 획기적으로 향상된 것을 확인하였다.
다만, 상기 펩타이드 서열을 160회 이상 반복단위로 포함할 경우에는 대장균이 가지는 단백질의 합성범위를 벗어나는바, 본 발명에 따른 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질은 펩타이드가 16~160회 반복되어 있는 구조를 가지는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 48~160회, 더욱 바람직하게는 96~160회 반복되어 있는 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 반복단위로서 사용되는 아미노산 서열은 상기 서열번호 1 내지 12의 정확한 서열에 제한되지 않는다. 또한, 여기서 아미노산 서열은 변이체들을 포함한다. 따라서, 본 발명의 단백질의 아미노산 서열은 또한, 삽입, 결실 및 치환에 의하여 달라지는 모든 서열을 포함한다.
바람직하게는, 아미노산 "치환"은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체한 결과, 다시 말해 보존성 아미노산 대치(conservative amino acid replacement)이다. 아미노산 치환은 연관된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성(amphipathic) 본성의 유사성에 기초하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함하고; 극성이 중성인 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하며; 양으로 대전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하며; 음으로 대전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.
상기 반복단위 내 "삽입" 또는 "결실"은 전형적으로 약 1 내지 5 아미노산의 범위이며, 바람직하게는 약 1, 2 또는 3 아미노산이다. 이때, 반복단위내 삽입되는 아미노산의 부가로 인하여 증가되는 아미노산의 부가는 전형적으로 100 미만이며, 바람직하게는 80 미만이며, 더욱 바람직하게는 50 미만이며, 가장 바람직하게는 20 아미노산 미만인데, 본 발명의 반복단위내로 삽입되어 단백질 내로 삽입 및/또는 단백질에 부가된다. 본 발명에서는 본 명세서에 기재된 단백질의 요구되는 특성에 부정적인 영향을 미치지 않는, 그러한 부가만을 고려하고 있음을 유념할 필요가 있다.
허용되는 변형은 재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질에 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환을 체계적으로 실행하고 얻어지는 재조합 변형체의 활동성을 분석함으로서 실험적으로 결정될 수 있다. 이는 당업자로 하여금 통상적인 실험 이상의 것을 요구하는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1과 적어도 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노선 서열을 반복단위로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서, "적어도 90% 이상"의 상동성을 가짐은, 서열번호 1의 서열과 91, 91.5, 92, 92.5, 93, 93.5, 94, 94.5, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99, 99.5%의 일치를 보임을 의미하며, "상동성"이란, 두 아미노산 서열 간의 유사성의 정도를 의미한다. 상동성이 있다는 것은, 서열 및 기능성 유사한 것을 의미한다. 상동성 비교는 육안으로 수행될 수 있으나, 통상적으로는 쉽게 접근가능한 서열 비교 프로그램을 이용하여 2 이상의 서열간 상동성 퍼센트를 계산할 수 있다 (Wilbur, W. J. & Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sd. USA., 80:726, 1983).
본 발명에 있어서, 상기 합성 sRNA는 MicC, SgrS 및 MicF 중 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합 부위(Hfq binding site); 및 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 eno 유전자의 발현을 억제하는 합성 sRNA를 암호화하는 서열은 서열번호 16의 염기서열로 표시될 수 있다.
서열번호 16 (eno): ATGTCCAAAATCGTAAAA
본 발명에서, 상기 pstI, asnA, ychM, tesB, dhaK, guaA, pck, 또는 purT 유전자의 발현을 억제하는 합성 sRNA를 암호화하는 서열은 서열번호 17 내지 24의 염기서열로 표시될 수 있다.
서열번호 17 (pstI): ATGATTTCAGGCATTTTAGCATCC
서열번호 18 (asnA): ATGAAAACCGCTTACATTGCCAAA
서열번호 19 (ychM): GTGAACAAAATATTTTCCTC
서열번호 20 (tesB): ATGAGTCAGGCGCTAAAAAATTTA
서열번호 21 (dhaK): ATGAAAAAATTGATCAATGATGTG
서열번호 22 (guaA): ATGACGGAAAACATTCATAAGCAT
서열번호 23 (pck): ATGCGCGTTAACAATGGTTTGACC
서열번호 24 (purT): ATGACGTTATTAGGCACTGCGCTG
본 발명에서, 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 합성 sRNA를 암호화하는 서열을 숙주세포에 도입하는 방법은 통상의 기술자에게 공지된 모든 방법을 이용할 수 있고, 바람직하게는 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 합성 sRNA를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하거나, 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 합성 sRNA를 암호화하는 서열을 숙주세포의 염색체에 직접 주입하는 방법을 이용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 표적 유전자의 발현을 억제하는 합성 sRNA를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용하는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 표적 유전자의 발현을 억제하는 합성 sRNA를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 벡터는 프로모터; MicC, SgrS 및 MicF 중 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합 부위(Hfq binding site); 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역; 및 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 프로모터는 sRNA의 발현을 유도할 수 있는 모든 종류의 프로모터가 이용가능하며, 바람직하게는 tac, trc, T7, BAD, λ및 앤더슨 합성 프로모터로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 서열번호 13의 염기서열로 표시될 수 있다.
서열번호 13: 5'- taacaccgtgcgtgttgactattttacctctggcggtgataatggttgc-3'
본 발명에서, 상기 Hfq 결합부위는 바람직하게는 MicC 유래 일 수 있으며, 서열번호 14의 염기서열로 표시될 수 있다.
서열번호 14:
5'-tttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggcttttttt-3'
본 발명에서, 상기 터미네이터는 sRNA의 전사를 종료할 수 있는 모든 종류의 터미네이터가 이용가능하며, 바람직하게는 T1/TE 터미네이터일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 15의 염기서열로 표시될 수 있다.
서열번호 15:
5'- ccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttata-3'
본원에서 "상보적 결합"이란, 핵산서열간 서로 염기짝짓기(basepairing)하는 것을 의미하며, 표적유전자의 mRNA의 일부 영역과 표적 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역의 서열이 약 70-80% 이상, 바람직하게는 약 80-90% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95-99% 이상 서로 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
본원에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 원점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단 부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al. EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 sRNA의 발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.
본 발명에서 염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 균주를 이용하여 재조합 실크 단백질을 생산한 다음, 염석방법을 이용하여 분리정제를 수행할 경우, 고순도의 재조합 실크 단백질을 수득할 수 있다는 것을 확인하였다(도 16).
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 재조합 실크 단백질을 생성하는 단계; 및 (b) 생성된 재조합 실크 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 실크 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 염석(salting out) 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는, 상기 재조합 실크 단백질을 수득하는 단계는 하기의 단계로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(a) 발효액을 Cell down (4000rpm/30min) 후 Buffer A(1mM Tris-HCl (pH8.0), 20mM NaH2PO4) 용액에 8M urea 와 2M thiourea를 첨가한 용액을 이용하여 cell resuspension 진행하는 단계;
(b) cell suspension을 25℃에서 6시간 동안 자석을 이용하여 섞는 단계;
(c) glacial acetic acid를 이용하여, pH를 4.0으로 조정하고, 25℃에서 2시간 동안 자석을 이용하여 섞는 단계;
(d) 10000rpm에서 20분간 원심분리하는 단계;
(e) 상등액을 수득하여 (NH4)2SO4 를 0.85M이 되도록 주입한 다음, 6시간 동안 섞어서, 침전시키는 단계;
(f) 100000rpm에서 20분간 원심분리하는 단계;
(g) 상등액을 수득하여 1.3M (NH4)2SO4 를 이용하여 침전시키는 단계;
(h) 침전물을 수득하여 버퍼 A와 8M Urea가 첨가된 용액을 이용하여 용해시키는 단계;
(i) 1.5M Urea와 버퍼 A가 섞인 용액을 이용하여 12시간 동안 dialysis 하는 단계;
(j) 버퍼 A를 이용하여 12시간 동안 dialysis 하는 단계; 및
(k) 원심분리하여 수득한 펠렛(pellet)을 냉동건조하는 단계.
본 발명에서, 상기 원심분리한 펠렛은 다양한 공지의 방법을 통해 농축한 다음, 냉동건조할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 재조합 실크 단백질 생산균주에 맞는 sRNA 제작 및 도입
공지의 재조합 실크 단백질 생산 균주(KR 10-1317420호)에 대장균 유전자 하나하나를 각각 knock down 할 수 있도록 구축된 sRNA (Na, Dokyun, et al. Nature biotechnology, 31.2, pp. 170-174, 2013) 시스템을 거미실크 단백질 생산 균주에 맞추어 새롭게 도입하였다. 거미실크 단백질 생산 벡터의 마커(Kanamycin, Km으로 표기)와 복제원점 ColE와 겹치지 않도록 Streptomycin(이하, Sm으로표기) 를 마커로 가지는 pColA-Sm 벡터와 Chloramphenicol(이하 Cm으로 표기)를 마커로 가지는 pACYC184-Cm 벡터를 이용하여 새롭게 sRNA 플렛폼을 제작하였다.
본 발명에서 사용된 합성조절 sRNA는 PR 프로모터를 기반으로 MicC scaffold와 T1/TE 터미네이터를 활용하였다. 상기 두 개의 합성조절 sRNA 플랫폼 플라스미드들을 sRNA 조각, 항생제 마커(항생제 내성 유전자) 조각 및 복제원점 조각으로 구성된 세 개의 DNA 조각을 깁슨 어셈블리(gibson assembly)를 통해 제작하였다(D.G.Gibson et al., Nature Methods (2009), 6(5), 343-345).
실시예 2. 타겟 유전자 선택
거미실크단백질의 증산을 위해 효과적인 유전자 결실 표적을 스크리닝 하기 위하여 MOMA(minimization of metabolic adjustment) 시뮬레이션을 도입하였다. MOMA 시뮬레이션 진행을 위해 유전자-단백질-생화학 반응관계를 이용한 거미실크단백질 생성 대사 네트워크 모델 구축을 위하여, 거미실크단백질 구조의 핵심을 이루는 glycine, serine 생성 pathway를 이용하여 미생물의 대사 네트워크 모델을 구축 하였고, 구축된 모델을 이용하여 대사흐름 등 대사특성을 분석하고, 대사흐름분석에 기반한 시뮬레이션을 이용하여 Knock down시 거미실크 단백질의 생성능을 향상시키는 결실 표적 쌍을 스크리닝하였다.
본 발명에 따른 결실 표적 스크리닝 방법은 기존의 선형적 방법과 달리, 이차계획법을 도입함으로써 구하였다(Segre et al. Proc. Nat.l Acad. Sci. 99: 15112-15117. 2002). 따라서 단일 표적이 아닌 다양한 표적의 knock down이 타겟 산물의 발현에 동시에 미치는 효과를 바탕으로 효율적으로 결실 표적들을 예측할 수 있다.
그 결과, 표 1에 기재된 바와 같이 가장 효과적인 타겟으로 예측되는 20여 쌍의 반응 쌍에서 30여쌍의 유전자 쌍을 선별 하였고, 해당하는 모든 30여개의 유전자 쌍에서 eno유전자가 공통적으로 선별되어 eno 유전자를 우선으로 knock-down하고 이를 최적화 하고자 하였다.
실시예 3. 1차 선별한
eno
유전자 knock down 효과 검증
pColA-Sm 벡터를 기반으로 pR 프로모터, MicC scaffold와 T1/TE 터미네이터를 활용하여 eno 유전자를 knock down 하기 위한 합성조절 sRNA를 제작하였다(표 3). eno 유전자의 경우 대장균의 생장에 필수적인 essential gene이기 때문에 완전히 knock out 되거나 높은 효율로 knock down 되는 경우 세포의 생장에 지장을 준다. 따라서 sRNA가 유전자와 결합하는 부위인 Target binding site의 길이를 15-nt 에서 24-nt까지 조절하여(표 2), 최적의 knock down 효과를 얻고자 하였다.
이때 binding energy를 계산하기 위해 뉴클레오타이드의 길이와 서열 정보에 따라 binding energy를 계산해주는 UNAFOLD(Unified Nucleic Acid Folding.) 프로그램을 이용하였다(Markham, Nicholas R., and Michael Zuker. Bioinformatics. Humana Press, 2008).
그 결과, 도 4에 기재된 바와 같이 binding site의 길이가 길어질수록 binding energy가 더욱 낮아지고 knock-down의 효과가 강해지는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 실험을 통해 15~16-nt의 binding site에서는 knock-down의 효과가 떨어지며, 22-nt 이상의 binding site를 이용하였을 때는 너무 높은 knock-down 효과로 세포의 성장이 매우 저해되는 현상을 확인 할 수 있었다. 최종적으로, binding site length에 따라서 반복서열이 48회 반복된 거미실크 단백질의 발현량을 SDS-PAGE와 Bradford assay (Biorad, USA)로 확인 한 결과 18-nt의 binding site length에서 발현이 가장 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
이를 이용하여 제작된 Eno knock down 균주의 거미실크 발현능을 기존 거미실크 증산균주인 glyA증폭균주와 RnpA 발현 저해균주와 비교해 보았다. 그 결과, 18-nt의 binding site length를 이용한 eno knock down 조절 군에서 기존 증산 균주에 비하여 비슷하거나 약간의 향상된 발현을 확인 할 수 있었다(도 5).
이를 통해 eno knock down을 기반으로한 추가적인 engineering을 통해 기존 시스템보다 더욱 유의미하게 증산된 균주를 얻고자 추가적인 target 에 대한 knock down실험을 진행 하였다.
| 서열번호 | 이름 | 서열 |
| 25 | Eno24 | ATGTCCAAAATCGTAAAAATCATC |
| 26 | Eno23 | ATGTCCAAAATCGTAAAAATCAT |
| 27 | Eno22 | ATGTCCAAAATCGTAAAAATCA |
| 28 | Eno21 | ATGTCCAAAATCGTAAAAATC |
| 29 | Eno20 | ATGTCCAAAATCGTAAAAAT |
| 30 | Eno19 | ATGTCCAAAATCGTAAAAA |
| 16 | Eno18 | ATGTCCAAAATCGTAAAA |
| 31 | Eno17 | ATGTCCAAAATCGTAAA |
| 32 | Eno16 | ATGTCCAAAATCGTAA |
| 33 | Eno15 | ATGTCCAAAATCGTA |
| 서열번호 | 이름 | 서열 |
| 34 | ColA_sRNA_Universal F | GCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAA |
| 35 | eno_24_R | GATGATTTTTACGATTTTGGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 36 | eno_23_R | ATGATTTTTACGATTTTGGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 37 | eno_22_R | TGATTTTTACGATTTTGGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 38 | eno_21_R | GATTTTTACGATTTTGGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 39 | eno_20_R | ATTTTTACGATTTTGGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 40 | eno_19_R | TTTTTACGATTTTGGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 41 | eno_18_R | TTTTACGATTTTGGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 42 | eno_17_R | TTTACGATTTTGGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 43 | eno_16_R | TTACGATTTTGGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 44 | eno_15_R | TTACGATTTTGGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
실시예 4. 추가 타겟 유전자 선택
pACYC184-Cm 벡터를 기반으로 pR 프로모터, micC scaffold와 T1/TE 터미네이터를 활용하여 추가 타겟 유전자를 knock down 하기 위한 합성조절 sRNA를 제작하였다(표 5). 추가 타겟 중에 essential gene이 있었기 때문에 20-nt의 binding site length를 기본으로 스크리닝 하고 발현이 가장 뛰어난 군에 대해서 Target binding site의 길이를 최적화 하고자 하였다.
MOMA simulation을 통해 선정된 20여 reaction 쌍에서, 30여쌍의 유전자쌍을 선정 하였으며, 48회 반복된 거미실크 단백질의 발현량을 SDS-PAGE와 Bradford assay (Biorad, USA)로 확인 한 결과, 1차 선별(n=3) 이후 8개의 유전자군 pstI, asnA, ychM, tesB, dhaK, guaA, pck, purT 기존과 비슷하거나 기존보다 더욱 향상된 발현이 확인 되었다(도 6 내지 도 8).
위의 8개의 유전자군에 대해 발현을 재확인하고 2차 선별을 진행 한 결과 ychM, pstI 군에서 기존보다 훨씬 향상된 단백질 발현을 확인 할 수 있었으며(도 9), 그 중에서도 ychM 군에서 가장 뛰어난 생장과 단백질 발현이 확인되어 최종 군으로 선정 되었으며 해당 군에 대해서 knock down efficiency 최적화를 진행하였다(표 4).
이때 binding energy를 계산하기 위해 뉴클레오타이드의 길이와 서열 정보에 따라 binding energy를 계산해주는 UNAFOLD(Unified Nucleic Acid Folding.) 프로그램을 이용하였다(Markham, Nicholas R., and Michael Zuker. Bioinformatics. Humana Press, 2008).
이를 통해 binding site의 길이가 길어질수록 binding energy가 더욱 낮아지고 knock-down의 효과가 강해지는 것을 확인 할 수 있었다. 최종적으로, binding site length에 따라서 반복서열이 48회 반복된 거미실크 단백질의 발현량을 SDS-PAGE와 Bradford assay (Biorad, USA)로 확인 한 결과 20-nt의 ychM binding site length에서 발현이 가장 뛰어난 것을 확인 할 수 있었다(도 10).
| 서열번호 | 이름 | 서열 |
| 45 | ychM24 | GTGAACAAAATATTTTCCTCACAT |
| 46 | ychM23 | GTGAACAAAATATTTTCCTCACA |
| 47 | ychM22 | GTGAACAAAATATTTTCCTCAC |
| 48 | ychM21 | GTGAACAAAATATTTTCCTCA |
| 19 | ychM20 | GTGAACAAAATATTTTCCTC |
| 49 | ychM19 | GTGAACAAAATATTTTCCT |
| 50 | ychM18 | GTGAACAAAATATTTTCC |
| 51 | ychM17 | GTGAACAAAATATTTTC |
| 52 | ychM16 | GTGAACAAAATATTTT |
| 53 | ychM15 | GTGAACAAAATATTT |
| 서열번호 | 이름 | 서열 |
| 54 | Universal_F | gcaaccattatcaccgccagaggtaaaa |
| 55 | asnB_R | ACGCCAAAAATTGAACACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 56 | asnA_R | GCAATGTAAGCGGTTTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 57 | pck_R | AAACCATTGTTAACGCGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 58 | ackA_R | AGTACTAACTTACTCGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 59 | pta_R | AGCATAATAATACGGGACACTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 60 | ptsl_R | GCTAAAATGCCTGAAATCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 61 | aas_R | CGAAAAAAGCTAAAAAGCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 62 | gnd_R | CCGATCTGTTGCTTGGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 63 | prsA_R | AAAAGCTTCATATCAGGCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 64 | tdcD_R | ACAACCGGAAATTCATTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 65 | tesB_R | TTTTTTAGCGCCTGACTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 66 | acpP_R | CGTTCTTCGATAGTGCTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 67 | araC_R | TCATTTTGCGCTTCAGCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 68 | dhaH_R | ACTATGACCAGGTTTACCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 69 | dhaK_R | TCATTGATCAATTTTTTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 70 | dhaL_R | TGAGTTCTGCTCAGTGACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 71 | dhaR_R | TTGTTAAAAGCGCCACTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 72 | fsaA_R | GTATCCAGATACAGTTCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 73 | fasB_R | GTGTCCAGATACAGTTCCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 74 | guaA_R | TTATGAATGTTTTCCGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 75 | ptsH_R | GTAACTTCTTGCTGGAACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 76 | purT_R | GCAGTGCCTAATAACGTCATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 77 | pyrD_R | CGAACGAAGGGGTAGTACATTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 78 | ychM_24_R | ATGTGAGGAAAATATTTTGTTCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 79 | ychM_23_R | TGTGAGGAAAATATTTTGTTCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 80 | ychM_22_R | GTGAGGAAAATATTTTGTTCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 81 | ychM_21_R | TGAGGAAAATATTTTGTTCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 82 | ychM_20_R | GAGGAAAATATTTTGTTCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 83 | ychM_19_R | AGGAAAATATTTTGTTCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 84 | ychM_18_R | GGAAAATATTTTGTTCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 85 | ychM_17_R | GAAAATATTTTGTTCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 86 | ychM_16_R | AAAATATTTTGTTCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
| 87 | ychM_15_R | AAATATTTTGTTCACTTTCTGTTGGGCCATTGCATT |
실시예 5. 최종 균주의 재조합 실크 단백질 생산량 확인
최종적으로 MOMA simulation에서 선정된 30 개의 target 쌍중에 eno와 ychM을 knock down한 군이 가장 뛰어난 발현을 보이는 군으로 선별되었다. 5L Fed-batch 발효를 통해 해당 균주의 증산결과를 확인 해 본 결과 30도씨 배양에서 OD600 120일때 1mM의 IPTG로 인덕션 이후 6시간??에 가장 높은 발현을 보였으며 이?? 48mer 고분자량 거미줄은 SDS-PAGE 결과 band intensity로 16 % 정도에 해당하는 높은 발현량을 보였고 이는 Bradford assay로 분석한 결과 약 10.5g/L정도에 해당하는 것을 확인하였다(도 11). 이는 기존 최고 titer (Xia, 2009, PNAS) 대비 약 10배정도 향상된 결과이다.
실시예 6. 최종 유전자 선별 및 개량 균주 분석
최종 유전자 선별 이후, 개량된 균주를 분석하기 위해 RNA Seq를 진행하였다. 이를 위하여 30도씨 50ml baffled flask culture 배양에서 OD600 이 0.4가 되는 시점에서 1mM IPTG인덕션 이후 6시간째 샘플링 한 거미실크 단백질 생산 균주와, eno 및 ychM유전자의 발현이 억제된 거미실크 단백질 생산 균주를 OD600 4로 normalize 하여 마크로젠을 통해 RNA Seq를 진행하였다. ,
선별된 eno 유전자 및 ychM 유전자의 발현이 억제된 균주의 RNA-seq을 이용한 DEG 리스트에 대한 heatmap을 확인한 결과, 기존 재조합 실크 단백질 균주에 비해 다양한 유전자형이 변화된 것을 확인 할수 있었으며(도 12, 도 13), 그중에서도 글라이신, 알라닌 및 세린 관련 유전자 발현 변화와, 전사와 번역 관련 유전자의 발현 변화 그리고 글라이신, 알라닌 및 세린 tRNA 증폭결과를 확인할 수 있었다(도 14).
또한 일반적인 wild type 균주의 대사 회로와 eno, ychM이 knock down 된 균주의 대사회로를 비교해 본 결과, eno, ychM이 knock down 된 균주에서 Glyceraldehyde 3-phosphate에서 pyruvate로 변환되는 과정이 억제되고, serine, glycine, alanine 등의 주요 구조를 형성하는 단백질의 생산 pathway가 더욱 활성되는 것을 확인 하였다. 또한 fumarate, succinate exporter의 작용이 억제되어 TCA회로의 진행이 억제되고 마찬가지로, serine, glycine, alanine 등의 주요 구조를 형성하는 단백질의 생산 pathway가 더욱 활성되는 것으로 예측된다(도 11, A).
실시예 7. 개량 균주를 이용한 재조합 실크 단백질의 대량생산 확인
거미실크 단백질을 산업적으로 이용하기 위하여 재조합 단백질 생산의 큰 숙제중 하나인 분리 정제과정을 최적화 하고자 하였다. 대량의 발효액에서 비교적 쉽고 높은 효율로 단백질을 분리하기 위해서 Salting out을 이용한 precipitation을 진행하였다. 보통 이러한 방식은 단백질의 농축에 많이 사용되지만 생산된 고분자량 거미실크의 경우 147kDa로 매우 큰 사이즈를 가지고 있고 E.coli에서 그이상의 사이즈를 가지는 단백질이 많지 않기 때문에 이러한 특성을 이용하여 precipitation 방법을 optimize한다면 원하는 타겟을 쉽고 높은 효율로 정제 할 수 있을것으로 기대하였다.
따라서 다양한 1차 2차 precipitation 농도에 따라 발효액을 분리 정제한 결과, 1차에서 1.0M 2차에서 1.3M의 ammonium persulfate를 첨가하였을 때, 약 75%의 purity로 가장 정제 효율이 좋은 것을 확인하였다(도 15).
또한 50kDa의 membrane filter를 이용하여 Mirofiltration을 진행 한 이후 정제된 샘플을 확인 한 결과(도 16), 사이즈가 매우 큰 거미실크 단백질을 제외한 다른 단백질들이 filter되어 약 80%이상에 해당하는 더욱 높은 purity를 얻을 수 있었다. 이는 30L의 대량발효 진행 후 똑 같은 조건에서 이루어진 대량의 분리 정제에서도 약 85% 정도의 purity로 같은 결과를 확인할 수 있었다(도 18).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> KAIST
<120> Recombinant Microorganism Having Enhanced Ability to Produce
Recombinant Silk Protein and Method for Producing High Molecular
Weight Recombinant Silk Protein Using The Same
<130> P20-B292
<160> 87
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 1
Ser Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Met Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Met Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser
20 25 30
Gln Gly Thr
35
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 2
Gly Pro Gly Gln Gln
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 3
Gly Pro Gly Gly Tyr
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 4
Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 5
Gly Val Gly Val Pro
1 5
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 6
Val Pro Gly Gly
1
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 7
Ala Pro Gly Val Gly Val
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 8
Gly Ala Gly Ala Gly Ser
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 9
Gly Pro Gly Gly Gly
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 10
Gly Pro Gly Gly Xaa
1 5
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 11
Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln
1 5 10 15
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 12
Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro
1 5 10 15
<210> 13
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 13
taacaccgtg cgtgttgact attttacctc tggcggtgat aatggttgc 49
<210> 14
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 14
tttctgttgg gccattgcat tgccactgat tttccaacat ataaaaagac aagcccgaac 60
agtcgtccgg gcttttttt 79
<210> 15
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 15
ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60
gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct 120
gcgtttata 129
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 16
atgtccaaaa tcgtaaaa 18
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 17
atgatttcag gcattttagc atcc 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 18
atgaaaaccg cttacattgc caaa 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 19
gtgaacaaaa tattttcctc 20
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 20
atgagtcagg cgctaaaaaa ttta 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 21
atgaaaaaat tgatcaatga tgtg 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 22
atgacggaaa acattcataa gcat 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 23
atgcgcgtta acaatggttt gacc 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 24
atgacgttat taggcactgc gctg 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 25
atgtccaaaa tcgtaaaaat catc 24
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 26
atgtccaaaa tcgtaaaaat cat 23
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 27
atgtccaaaa tcgtaaaaat ca 22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 28
atgtccaaaa tcgtaaaaat c 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 29
atgtccaaaa tcgtaaaaat 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 30
atgtccaaaa tcgtaaaaa 19
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 31
atgtccaaaa tcgtaaa 17
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 32
atgtccaaaa tcgtaa 16
<210> 33
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 33
atgtccaaaa tcgta 15
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 34
gcaaccatta tcaccgccag aggtaaaa 28
<210> 35
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 35
gatgattttt acgattttgg acattttctg ttgggccatt gcatt 45
<210> 36
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 36
atgattttta cgattttgga cattttctgt tgggccattg catt 44
<210> 37
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 37
tgatttttac gattttggac attttctgtt gggccattgc att 43
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 38
gatttttacg attttggaca ttttctgttg ggccattgca tt 42
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aaatattttg ttcactttct gttgggccat tgcatt 36
Claims (11)
- 재조합 실크 단백질 생산능을 가지는 숙주세포에서, 포스포피루베이트 하이드라타아제(phosphopyruvate hydratase)를 코딩하는 eno 유전자의 발현이 억제되어 거미 실크 단백질 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 eno 유전자 발현의 억제는 상기 유전자의 발현을 억제하는 합성 sRNA를 암호화하는 서열이 도입되는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 거미 실크 단백질 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 푸마레이트, 숙시네이드 엑스포트(fumarate succinate export)를 코딩하는 ychM 유전자의 발현이 추가로 억제되어 있는 것을 특징으로 하는 거미 실크 단백질 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
- 제3항에 있어서, 상기 유전자 발현의 억제는 상기 상기 유전자의 발현을 억제하는 합성 sRNA를 암호화하는 서열이 도입되는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 거미 실크 단백질 생산능력이 향상된 재조합 미생물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 실크 단백질 생산능을 가지는 숙주세포는 서열번호 1의 아미노산을 가지는 펩타이드가 1회 내지 160회 반복되어 있는 재조합 실크 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 tRNA를 코딩하는 염기서열을 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 합성 sRNA는 MicC, SgrS 및 MicF 중 어느 하나의 sRNA 유래의 Hfq 결합 부위(Hfq binding site); 및 eno 유전자 mRNA와 상보적 결합을 형성하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균, 리조비움(Rhizobium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 로도코커스 (Rhodococcus), 칸디다 (Candida), 에르위니아(Erwinia), 엔테로박터 (Enterobacter), 파스테렐라(Pasteurella), 맨하이미아 (Mannheimia), 액티노바실러스 (Actinobacillus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 잔토모나스(Xanthomonas), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아조토박터(Azotobacter), 애시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 바실러스(Bacillus), 스테필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 사이아노박테리움(cyanobacterium) 및 사이클로박테리움(Cyclobacterium)로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제6항에 있어서, 상기 펩타이드는 드레그라인 실크(dragline silk) 단백질을 구성하는 반복단위 펩타이드인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- (a) 제1항 또는 제3항의 재조합 미생물을 배양하여 재조합 실크 단백질을 생성하는 단계; 및 (b) 생성된 재조합 실크 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 실크 단백질의 제조방법.
- 제10항에 있어서, 상기 (b) 단계는 염석(salting out) 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는 재조합 실크 단백질의 제조방법.
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