KR20180055217A

KR20180055217A - 목적단백질 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 균주 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20180055217A
Application number: KR1020160152794A
Authority: KR
Inventors: 정기준; 최재웅; 임성순
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2016-11-16
Publication date: 2018-05-25

Abstract

본 발명은 목적단백질의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 균주에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 게놈상에 존재하는 IS 요소 (element)를 제거하여 개량시킨 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 관한 것이다. 본 발명에 따른 특이적인 IS 요소가 제거된 코리네박테리움 글루타미쿰은 기존의 야생형 균주에 비해 현저히 우수한 재조합 단백질 생산능, 대사물질 생산능 및 형질전환 효율을 나타내므로, 산업적으로 매우 유용하다.

Description

목적단백질 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 균주 및 이의 제조방법 {Corynebacterium sp. Having Improved Target Protein Producing Ability and Method for Preparing the same}

본 발명은 목적단백질의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 균주에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 게놈상에 존재하는 IS 요소 (element)를 제거하여 개량시킨 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 관한 것이다.

코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 산업적으로 아미노산 생산에 가장 많이 사용되며, 핵산 및 비타민 생산에도 사용되고 있다. 또한 단백질을 세포 분비를 통해 생산을 할 수 있기 때문에 다양한 분야에서 활발히 연구되고 있다. 산업적인 측면에서 가장 많이 이용되는 분야는 아미노산 생산으로, 1950년 중반에 글루탐산을 고효율로 생산할 수 있는 균주로 보고되었으며, 이를 산업화하여 글루탐산, 페닐알라닌, 스레오닌, 글루타민, 루이신, 이소루신, 히스티딘 등 다양한 아미노산 생산에 적용하고 있다.

현재 코리네박테리움 글루타미쿰은 기존 대장균 시스템과는 다른 장점들이 많이 존재하기 때문에, 재조합 단백질 생산에 대한 산업화 가능성이 높다. 특히 균주의 안전성이 높아 (GRAS) 생산된 단백질의 안전성 문제가 적다. 또한, 세포 내에 존재하는 단백질 분해 효소의 활성이 낮기 때문에 최종 산물인 단백질이 잘 분해되지 않으며, 이에 따른 최종 산물의 양도 증가될 수 있다. 아울러, 코리네박테리움은 단백질을 분비하여 생산하기 때문에 다양한 이점을 가지고 있다. 기존 시스템에서는 단백질을 세포 내부에서 생산하기 때문에 세포의 파쇄 및 복잡한 분리정제 과정을 거쳐야 하며, 단백질의 접힘 현상도 세포 내부의 영향을 많이 받는다. 하지만 단백질을 분비생산하게 되면 이러한 단점들을 쉽게 해결할 수 있다. 즉, 세포 밖에 생산 단백질이 존재하기 때문에 정제 및 분리 과정이 다른 균주에 비해 쉽고, 생산된 단백질 역시 세포 내에서 번역 후 과정의 영향을 받지 않기 때문에 완성된 단백질의 안정성이 높다.

이에, 본 발명자들은 산업적으로 재조합 단백질 또는 다양한 대사산물의 생산량을 향상시킬 수 있는 코리네박테리움 속 균주를 개발하고자 예의 노력한 결과, 게놈에 존재하는 불안전한 유전자 요소 중 하나인 IS 요소(IS element)를 제거하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 재조합 단백질 생산 능력이 증가한 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 게놈 상에 IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 게놈 상에 IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 균주 및 이를 이용한 목적단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 게놈 상에 IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주를 배양하여 대사산물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 게놈 상에 서열번호 1 또는 서열번호 1과 99% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 표시되는 ISCg1; 또는 서열번호 2 또는 서열번호 2와 92% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 표시되는 ISCg2의 IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주를 제공한다.

본 발명은 또한, 코리네박테리움 속 균주의 게놈 상에서 서열번호 1 또는 서열번호 1과 99% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 표시되는 ISCg1; 또는 서열번호 2 또는 서열번호 2와 92% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 표시되는 ISCg2의 IS 요소 (element)를 결실시키는 것을 특징으로 하는 목적단백질 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 균주의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 균주를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 균주를 배양하여 목적단백질을 발현시키는 단계; 및 (b) 상기 발현된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주를 배양하여 대사산물을 생성시키는 단계를 포함하는 대사산물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주를 목적유전자의 형질전환용 숙주세포로 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 특이적인 IS 요소가 제거된 코리네박테리움 글루타미쿰은 기존의 야생형 균주에 비해 현저히 우수한 재조합 단백질 생산능, 대사물질 생성능 및 형질전환 효율을 나타내므로, 산업적으로 매우 유용하다.

도 1은 게놈상에 존재하는 이동 유전자가 목적단백질을 저해하는 모식도이다.
도 2는 형광 활성 세포 분류기를 통한 유전자 저해요소를 스크리닝하는 과정을 나타낸 것이다. A: 외래 유전자가 없는 플라스미드 pCES208가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰, B: 형광단백질을 발현하는 pCES-H36-GFP 플라스미드가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰, C: 1차 스크리닝 진행한 세포, D: 2차 스크리닝 진행한 세포. (막대는 세포를 스크리닝한 영역)
도 3A는 발굴한 균주들의 플라스미드를 분석한 것이다. M: 마커, 1: pCES-H36-GFP 플라스미드가 도입된 세포로부터 얻은 플라스미드, 2: 1차 스크리닝 진행한 세포에서 정제한 플라스미드, 3: 2차 스크리닝 진행한 세포에서 정제한 플라스미드. (점선 화살표: 6.6 kB의 pCES-H36-GFP, 굵은 화살표: 크기가 증가된 플라스미드). 도 3B는 목적단백질을 만들지 못하는 세포로부터 얻은 플라스미드의 서열을 분석한 것으로, 목적단백질인 GFP를 코딩하고 있는 핵산 위치에 IS 요소 (ISCg1 및 ISCg2)가 삽입되어 있다.
도 4A는 IS 요소가 삽입되었을 때 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장곡선을 나타낸 것이다 (○: pCES-H36-porBss-Amy, ●: pCES-H36-porBss-IS-Amy, pCES-H36-porBss-IS-Amy를 가진 세포와 pCES-H36-porBss-Amy를 가진 세포의 비율이 각각 1:10³(▲), 1:10⁴(■), 1:10⁵(◆)인 배양조건). 도 4B는 세포 배양 후 아밀레이즈의 활성정도를 측정한 결과이다 (1: pCES-H36-porBss-Amy를 가진 세포, 2,3,4는 각각 pCES-H36-porBss-IS-Amy를 가진 세포와 pCES-H36-porBss-Amy를 가진 세포의 비율이 1:10³, 1:10⁴,1:10⁵인 배양 조건).
도 5는 야생형과 IS 요소를 제거한 코리네박테리움 글루타미쿰에 pCES-H36-GFP를 형질전환하여 신호단백질인 형광단백질의 발현양을 확인한 결과이다. A: 시간에 따른 형광정도 (▲: 야생형, ■: WJ004, ●: WJ008), B: 단백질 발현양 (1: 야생형, 2: WJ004, 3: WJ008, T: 총 단백질, S: 수용성 단백질).
도 6은 야생형과 IS 요소를 제거한 코리네박테리움 글루타미쿰에서 대사물질의 생산양을 측정한 결과이다. A: poly(3-hydroxybutyrate) (P(3HB)), B: gamma-aminobutyric acid (GABA).
도 7는 야생형과 IS요소를 제거한 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환 효율을 비교한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 목적단백질의 발현을 저해하는 요소가 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈상에 존재하는 IS 요소 중 ISCg1과 ISCg2 임을 스크리닝을 통해 확인한 후, 모체 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈로부터 ISCg1과 ISCg2를 제거하여 유전적으로 안정된 균주로 개량시켜, 재조합 단백질의 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제조하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 게놈 상에 서열번호 1 또는 서열번호 1과 99% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 표시되는 ISCg1; 또는 서열번호 2 또는 서열번호 2와 92% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 표시되는 ISCg2의 IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 코리네박테리움 속 균주의 게놈 상에서 서열번호 1 또는 서열번호 1과 99% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 표시되는 ISCg1; 또는 서열번호 2 또는 서열번호 2와 92% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 표시되는 ISCg2의 IS 요소 (element)를 결실시키는 것을 특징으로 하는 목적단백질 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 균주의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, ISCg1 또는 ISCg2의 서열은 구체적으로 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 분자일수 있으며, 상기 서열들과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열일 수 있다.

본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 모체 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032인 것 또는 그것에 실질적으로 동일한 게놈서열을 가지는 균주를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 코리네박테리움 속 균주 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 완전히 알려져 있다 (Kalinowski, Jorn, et al. "The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of L-aspartate-derived amino acids and vitamins." Journal of biotechnology 104.1 (2003): 5-25).

본 발명의 용어 IS 요소는 삽입서열(Insertional Sequence) 요소 또는 트랜스포존(Transposon)이라고도 하는데, 염색체나 플라스미드 상에서 움직일 수 있는 염기서열을 의미한다. 현재까지 다양한 박테리아에서 수백개의 트랜스포존이 알려져 있다 (TRANSPOSON-BASED STRATEGIES FOR MICROBIAL FUNCTIONAL GENOMICS AND PROTEOMICS (2003) Annual Review of Genetics 37:3-29 Finbarr Hayes).

코리네박테리움 속 미생물은 많은 수와 종류의 트랜스포존을 가지고 있다. 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰(corynebacterium glutamicum) ATCC13032의 경우에는 24개의 트랜스포존을 가지고 있으며, 이러한 트랜스포존은 9개의 그룹으로 분류할 수 있다 (The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of aspartate-derived amino acids and vitamins (2003) Journal of Biotechnology 104, 5-25 Jorn Kalinowski et al). 그 중에서 ISCg1와 ISCg2 그룹은 각각 4개, 5개의 카피수를 가지고 있으며 각각의 카피는 99% 이상의 상동성을 가지고 있다.

바람직하게는, 본 발명의 IS 요소 (element)는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 IS 요소 (GenBank assession number : NC_003450 및 NC_006958.1) 중 ISCg1 그룹(서열번호 1) 및 ISCg2 그룹(서열번호 2)에 속하며, 특히 바람직하게는 표 1에 기재되어 있는 IS 요소 (element) 중 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 일 양태에서 ISCg1와 ISCg2 그룹은 각각 4개의 카피수를 가지며, ISCg2에 ISCg2e는 존재하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 IS 요소가 제거된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 표 1 또는 그와 실질적으로 동일한 서열의 하나 이상의 핵산영역이 결여될 수 있다. 또한, IS 요소가 제거된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 표 2의 WJ001, WJ002, WJ003, WJ004, WJ005, WJ006, WJ007, WJ008 또는 그와 실질적으로 동일한 게놈을 가지는 균주일 수도 있다.

본 발명의 코리네박테리움 속 균주의 게놈 상에서 제거된 IS 요소인 ISCg1 및 ISCg2은 각각 서열번호 1 및 2로 표시할 수 있다.

[서열번호 1]

TAATAAGCGTGAAGCGAAGAAGAAAATGCGGACCATTATTGATCAGCTTCGGGTGTTGAAGGGGCCGAATAAGGAACTCGCGCAGTTGGGTCGTAGTTTGTTTAAACGACTTGGTGATGTGTTGGCGTATTTCGATGTTGGTGTCTCCAACGGTCCGGTCGAAGCGATCAACGGACGGTTGGAGCATTTGCGTGGGATTGCTCTAGGTTTCCGTAATTTGAACCACTACATTCTGCGGTGCCTTATCCATTCAGGGCAGTTGGTCCATAAGATCAATGCACTCTAA

[서열번호 2]

TGATCGTGCTGTGCCTGGGCACTGGGAGGGCGATTTAGTAATTGGTGGTGAAAACCAAGCGACAGCGTTGGTGACGTTGGTGGAGCGCACGAGCCGGTTGACGTTGATTAAGCGGTTGGGGGTTAATCATGAGGCGTCGACTGTGACGGATGCGTTGGTGGAGATGATGGGTGATTTGCCGCAGGCGTTGCGTCGGAGTTTGACGTGGGATCAGGGTGTGGAGATGGCAGAGCATGCGCGGTTTAGCGTGGTGACCAAGTGTCCGGTGTTTTTCTGTGATCCTCATTCGCCGTGGCAGCGTGGGTCGAATGAGAATACGAATGGATTGGTCAGGGATTTTTTCCCGAAGGGCACTAATTTTGCTAAAGTAAGTGACGAAGAAGTTCAGCGGGCACAGGATCTGCTGAATTACCGGCCGCGGAAAATGCATGGTTTTAAAAGCGCGACGCAGGTATATGAAAAAATCGTAGTTGGTGCATCCACCGATTGA

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 형질전환된 재조합 균주에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 균주를 배양하여 목적단백질을 발현시키는 단계; 및 (b) 상기 발현된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "목적 단백질" 또는 "목적 산물"은 미생물로부터 분비 발현시키거나, 미생물을 이용하여 대량으로 생산하고자 하는 단백질 또는 산물을 의미한다. 구체적으로, 코리네박테리움 속 미생물로부터 분비 발현되거나 이를 이용하여 생산될 수 있는 단백질 또는 산물이라면 제한 없이 포함할 수 있다.

본 발명에서 목적단백질을 코딩하는 유전자는 크로모좀 (chromosome) 형태로 숙주세포에 삽입될 수 있으며, 벡터 형태로 숙주세포에 도입될 수도 있다.

본원 명세서에 사용된 용어 형질전환은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하거나 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포의 염색체에 통합 완성시켜 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

발현 조절 서열 (expression control sequence)이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다.

본 발명에서 용어 벡터 (vector)는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 플라스미드 (plasmid) 및 벡터 (vector)는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터를 포함할 수 있으며, 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 일양태로, (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있는 것이 바람직하다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터들은 여러 개의 제한효소 절단부위를 모아놓은 멀티클로닝사이트(MCS)를 포함하고 있는데 이들은 lacZ 유전자 내에 위치한다. MCS는 lacZ 유전자의 리딩 프레임(reading frame)을 파괴하지 않으므로 적당한 숙주세포에서는 lacZ의 발현이 이루어져 생물학적 활성을 지닌 베타-갈락토시다제 효소를 합성해낸다. 이 숙주세포를 무색 화학물질인 X-gal을 포함하는 배지에서 배양하면 이 효소에 의해서 X-gal이 분해되어 불용성의 청색물질을 만들게 된다. 그러므로 MCS에 외래 DNA의 삽입이 이루어지지 않은 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포 콜로니는 청색을 띈다. 반대로 MCS에 외래 DNA가 삽입되면 플라스미드 벡터의 lacZ 리딩 프레임이 깨지면서 베타-갈락토시다제가 만들어지지 않고 그 결과 무색의 숙주세포 콜로니가 형성된다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에서, 바람직한 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli 균주 DH5a, E. coli 균주 JM101, E. coli K12 균주 294, E. coli 균주 W3110, E. coli 균주 X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene) 및 E. coli B, 코리레박테리움 속 균주 등을 포함하며, 본 발명의 프로모터의 발현량 확인하고 목적단백질을 생산하는데 사용되는 가장 바람직한 숙주세포는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.

원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982))이 또한 이러한 세포들을 형질전환하는데 사용될 수 있다.

게놈상에서 특정 핵산위치를 제거하기 위해서 다양한 방법을 사용할 수 있지만 본 발명에서는 pK19mobSacB를 이용하여 결실 위치에서 다른 변이를 발생시키지 않고 핵산 서열들을 게놈에서 제거하는 방법을 사용하였다(Jaeger et al., Journal of Bacteriology 174:5462-5 465 (1992)).

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주를 배양하여 대사산물을 생성시키는 단계를 포함하는 대사산물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 대사산물은 폴리(3-히드록시뷰틸레이트) (poly(3-hydroxybutyrate) 또는 감마-아미노뷰틸산 (gamma-aminobytyric acid)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주를 목적유전자의 형질전환용 숙주세포로 사용하는 방법에 관한 것이다.

균주 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981).

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 형광 유세포 분리기를 통한 신호단백질 난발현 세포의 스크리닝

게놈 상에 존재하는 여러 이동유전자들 중에 목적단백질의 발현을 저해하는 요소를 찾아내기 위해서 형광 유세포 분리기를 이용하여 분석 및 스크리닝을 진행하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰 KTCC13032에 pCES208-H36-GFP를 도입하여, GFP를 가지고 있는 코리네박테리움 글루타미쿰을 BHI (Brain heart infusion) 배지에 접종하여 17시간 동안 30℃, 200rpm에서 배양한 뒤, 신선한 BHI 배지에 1/100의 부피만큼 옮겨서 동일 조건으로 배양하였다. 배양한 세포는 6000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 수득한 후, PBS (phosphate buffered saline)에 현탁하여, 녹색 형광단백질의 발현을 확인하였다 (도 2). 이 중에서 형광을 나타내지 못하는 세포를 발굴하여 새로운 BHI 배지에 배양 후, 이 과정을 한 번 더 반복하였다. 2번의 스크리닝을 통해 대부분의 세포들이 형광을 보이지 않았다. 그 다음 세포가 가진 플라스미드를 수득하여 플라스미드 크기 및 녹색 형광단백질의 핵산서열을 분석하였다.

실시예 2: 발굴한 세포의 플라스미드 서열 분석

실시예 1에서 발굴한 플라스미드를 제한 효소 BamHI으로 1시간 처리 후, 아가로즈 젤 전기영동을 통해 그 크기를 분석하였다.

그 결과, pCES208-H36-GFP 플라스미드 크기와 비교하여 형광을 나타내지 않는 세포에서 얻은 플라스미드들은 약 2 kbp 이상 크기가 더 큰 것을 확인하였다 (도 3A). 이를 통하여 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈상에 존재하는 특정 유전자가 플라스미드에 삽입되었다는 것을 알 수 있었다. 이에, 어떤 요소가 들어가 있는지 확인하기 위해 GFP 서열 분석을 진행하였다.

서열 분석 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰에 존재하는 다양한 IS 요소 중 ISCg1과 ISCg2가 삽입되어 있다는 것을 확인하였다 (도 3B). 또한 삽입된 위치는 한 곳이 아니라 형광단백질의 코딩 서열 여러 곳에 존재하였다. 이를 통해 ISCg1과 ISCg2가 중요한 문제요소인 것을 확인하였다.

따라서, 이들 요소를 제거하여 안정된 게놈을 가진 코리네박테리움 글루타미쿰을 제작하고, 이러한 IS 요소가 재조합 단백질의 발현에 있어서 생산량 감소를 야기할 수 있음을 확인하고자 하였다.

실시예 3: IS 요소에 의한 재조합 단백질 생산의 악영향 확인

신호단백질인 형광단백질뿐만 아니라 실제 산업 공정에서 이러한 문제가 있음을 확인하기 위해, 아밀라아제 생산에 대한 IS 요소의 악영향을 분석하였다.

코리네박테리움에서 아밀라아제 생산할 수 있는 플라스미드인 pCES-H36-porBss-Amy와 pCES-H36-porBss-IS-Amy을 PCR과 유전자 클로닝 방법을 이용하여 제작하였다. 아밀라아제 유전자는 Streptococcus bovis의 게놈상에 존재하는 유전자를 증폭하였으며 증폭된 결과물과 pCES-H36-porBss를 SfiI으로 처리하여 라이게이션 이후 형질전환을 하였다 (Choi, Jae Woong, et al., Microbial cell factories 14:207, 2015). 배양을 위한 배지는 최소한의 영양분이 들어가 있는 배지를 사용하였으며 30℃에서 200rpm 조건으로 배양하였다. pCES-H36-porBss-Amy은 아밀레이즈를 생산할 수 있는 플라스미드이며, pCES-H36-porBss-IS-Amy의 경우 IS 요소가 플라스미드에 들어가 있는 형태로 제작되어 아밀레이즈를 생산할 수 없는 플라스미드이다. 재조합 단백질을 생산하는 pCES-H36-porBss-Amy를 가진 코리네박테리움 세포와 pCES-H36-porBss-IS-Amy를 가진 코리네박테리움 세포를 각각 따로 키워 성장 곡선과 아밀레이즈 활성도를 비교하였다 (도 4). 또한 적은 양의 IS 요소가 들어가 있는 균주와 아밀레이즈 생산균주를 같이 배양했을 때의 조건도 확인하였다.

그 결과, 아밀레이즈를 생산하는 균주는 그렇지 않은 균주보다 성장 속도가 느렸다. 이러한 원인으로, IS 요소를 가지고 있는 균주는 처음에 적은 양의 세포가 존재할지라도 성장 속도가 빠르기 때문에, 최종 OD에 도달했을 때 대부분의 세포들이 pCES-H36-porBss-IS-Amy를 지닌 세포였다.

또한, 아밀레이즈의 활성도에 대해서도 IS 요소를 가지고 있는 균주에서 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 재조합 단백질의 생산량이 감소한다는 것을 나타낸다.

실시예 4: 특이적인 IS 요소 제거를 통한 균주 개량

4-1: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 IS 요소 제거

스크리닝을 통해 확인한 IS 요소인 ISCg1과 ISCg2를 게놈상에서 제거하여 유전적으로 안정된 코리네박테리움 균주로 개량하였다.

ISCg1과 ISCg2은 게놈상에서 여러 카피 수로 존재하기 때문에 이들을 제거하기 위해서는 각 종류에 따라서 같은 유전자를 여러 번 결실시켜야 한다. 이에, 표 1에서 보여지는 영역들을 포함하는 모체 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum ) ATCC13032로부터 핵산 서열들의 일련의 누적적 결실들을 만들어 일련의 환원형의 균주들(WJ001-WJ008)을 제작하였다.

IS family	Copy number	IS element	Position
ISCg1	4	ISCg1a	1115955...1117265
		ISCg1b	2595722...2597032
		ISCg1d	2481196...2482506
		ISCg1e	613777...615087
ISCg2 ^b	4	ISCg2b	3005658...3007172
		ISCg2c	2716287...2717801
		ISCg2d	2317958...2319472
		ISCg2f	192954...194468

GenBank Accession numbers NC_003450 and NC_006958.1

IS 요소의 결실은 더블 크로스오버 방법 (Schafer A et al., Gene 145:69-73, 1994)에 따라 수행하였다. IS 요소를 제거하기 위하여 제작된 플라스미드를 이용하여 순차적으로 IS 요소가 결실된 균주들을 제작하였다 (표 2).

C. glutamicum
ATCC 13032	모체가 되는 균주
WJ001	ATCC 13032 with in frame deletion of ISCg1 family (ISCg1a)
WJ002	ATCC 13032 with in frame deletion of ISCg1 family (ISCg1a, ISCg1b)
WJ003	ATCC 13032 with in frame deletion of ISCg1 family (ISCg1a, ISCg1b, ISCg1c)
WJ004	ATCC 13032 with in frame deletion of ISCg1 family (ISCg1a, ISCg1b, ISCg1c, ISCg1e)
WJ005	ATCC 13032 with in frame deletion of ISCg2 family (ISCg2b)
WJ006	ATCC 13032 with in frame deletion of ISCg2 family (ISCg2b, ISCg2c)
WJ007	ATCC 13032 with in frame deletion of ISCg2 family (ISCg2b, ISCg2c, ISCg2e)
WJ008	ATCC 13032 with in frame deletion of ISCg2 family (ISCg2b, ISCg2c, ISCg2e, ISCg2f)

먼저 플라스미드를 세포 안에 형질전환으로 넣어 더블 크로스오버를 시도하였다. 카나마이신에 생존하는 콜로니를 획득하고 카나마이신에 내성이 존재하는 균주를 Brain heart infusion 배지에 키우고 10% sucrose 농도의 고체배지에 도말하였다 (Choi, Jae Woong, et al., Microbial cell factories 14:207, 2015). 그 다음 PCR을 통해 IS 요소가 제거된 DNA 크기를 확인하였다.

4-2: 다양한 코리네박테리움 속 균주의 IS 요소 제거

실시예 4-1에서 확인한 서열번호 1의 ISCg1 및 서열번호 2의 ISCg2 IS 요소를 여러 다양한 코리네박테리움 속 균주에서 서열 상동성을 확인하였다.

그 결과, ISCg1은 코리네박테리움 속 균주에서 99% 이상 서열 상동성을 나타냈으며 (표 3), ISCg2는 코리네박테리움 속 균주에서 92% 이상 서열 상동성을 나타냈다 (표 4).

따라서, 서열번호 1과 99% 이상의 상동성을 가지는 ISCg1 또는 서열번호 2와 92% 이상의 상동성을 가지는 ISCg2의 IS 요소를 코리네박테리움 속 균주 게놈상에서 제거하여 특이적인 IS 요소가 제거된 균주로 개량할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5: IS 요소가 제거된 균주를 통한 형광 단백질 생산

실시예 4에서 제작한 WJ004와 WJ008 균주의 우수성을 알아보기 위해 먼저 형광단백질의 발현을 확인하였다.

배양 조건과 형광 및 단백질 발현 확인은 Choi, Jae Woong, et al., Microbial cell factories 14:207, 2015. 및 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. WJ004와 WJ008 균주를 BHI (Brain heart infusion) 배지에 접종하여 17시간 동안 30℃, 200rpm에서 배양한 뒤, 신선한 BHI 배지에 1/100의 부피만큼 옮겨서 동일 조건으로 배양하였다. 배양한 세포는 6000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 수득한 후, PBS (phosphate buffered saline)에 현탁하여, 녹색 형광단백질의 발현을 유세포 분리기를 이용하여 확인하였다.

형광 분석 결과, WJ008 균주가 야생형 대비 30% 증가된 것을 보여주었다 (도 5A). 또한, 웨스턴 블롯팅 결과 야생형 대비 더 많은 양의 단백질이 발현되었음을 확인할 수 있었다 (도 5B). 이를 통해, WJ008 균주가 야생형 균주에 비해 재조합 단백질 생산량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: IS 요소가 제거된 균주를 통한 poly (3- hydroxybutyrate ) 및 gamma-aminobytyric acid 생산

IS 요소가 제거된 WJ004와 WJ008 균주에서 재조합 단백질뿐만 아니라 다른 대사물질도 과생산 할 수 있는지를 확인하기 위해, 폴리(3-히드록시뷰틸레이트) (poly(3-hydroxybutyrate; P(3HB))와 감마-아미노 뷰틸산 (gamma-aminobytyric acid; GABA)를 Agilent 6890N GC system (Agilent Technologies, PA, CA, USA)을 이용한 가스 크로마토그래피로 분석하였다 (도 6).

그 결과, P(3HB)은 야생형, WJ004, WJ008 균주 각각 17.1±0.55 wt%, 19.1±0.44 wt%, 23.4±0.36 wt%을 생산하였으며, IS 요소 결실 균주가 야생형 대비 높은 생산량을 나타냈다. GABA 생산량 역시 야생형, WJ004, WJ008 균주가 각각 8.17±0.66g/L, 8.34±0.62, 9.43±0.52g/L을 나타냈다.

IS 요소 중 모든 ISCg2가 결실된 WJ008 균주에서 P(3HB)와 GABA의 생산량이 현저히 증가하였다.

실시예 7: IS 요소가 제거된 균주를 통한 형질전환율 확인

IS 요소가 형질전환에 악영향을 미친다고 알려져 있으므로, WJ004와 WJ008 균주에서 형질전환율을 확인하였다.

IS 요소가 제거된 균주를 BHI (Brain heart infusion) 배지에 접종하여 17시간 동안 30℃, 200rpm에서 배양한 뒤, 500 ng의 pCES-H36-GFP로 형질전환시켰다. RG (BHI 40 g, glucose 10 g, beef extract 10 g, sorbitol 30 g per 1 L) 아가 배지에서 30℃로 배양한 후, CFU (colony forming units)를 측정하였다.

그 결과, 야생형의 균주 (3.86 ± 0.18 × 10⁵ cfu/㎍) 대비 WJ004은 12.2 ± 0.94 × 10⁵ cfu/㎍, WJ008은 19.8 ± 1.2 × 10⁵ cfu/㎍로 4~6배 증가된 형질 전환율을 나타냈다 (도 7). 즉, IS 요소 결실을 통해 형질전환율이 개선된 것을 확인할 수 있었다.

이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Corynebacterium sp. Having Improved Target Protein Producing Ability and Method for Preparing the same <130> P16-B298 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1311 <212> DNA <213> Corynebacterium sp. <400> 1 atgaagtcta ccggcaacat catcgctgac accatctgcc gcactgcgga actaggactc 60 accatcaccg gcgcttccga tgcaggtgat tacaccctga tcgaagcaga cgcactcgac 120 tacacctcca cctgcccaga atgctcccaa cctggggtgt ttcgtcatca cacccaccgg 180 atgctcattg atttacccat cgtcgggttt cccaccaaac tgtttatccg tctacctcgc 240 taccgctgca ccaaccccac atgtaagcaa aagtatttcc aagcagaact aagctgcgct 300 gaccacggta aaaaggtcac ccaccgggtc acccgctgga ttttacaacg ccttgctatt 360 gaccggatga gtgttcacgc aaccgcgaaa gcacttgggc tagggtggga tttaacctgc 420 caactagccc tcgatatgtg ccgtgagctg gtctataacg atcctcacca tcttgatgga 480 gtgtatgtca ttggggtgga tgagcataag tggtcacata atagggctaa gcatggtgat 540 gggtttgtca ccgtgattgt cgatatgacc gggcatcggt atgactcacg gtgtcctgcc 600 cggttattag atgtcgtccc aggtcgtagt gctgatgctt tacggtcctg gcttggctcc 660 cgcggtgaac agttccgcaa tcagatacgg atcgtgtcca tggatggatt ccaaggctac 720 gccacagcaa gtaaagaact cattccttct gctcgtcgcg tgatggatcc attccatgtt 780 gtgcggcttg ctggtgacaa gctcaccgcc tgccggcaac gcctccagcg ggagaaatac 840 cagcgtcgtg gtttaagcca ggatccgttg tataaaaacc ggaagacctt gttgaccacg 900 cacaagtggt tgagtcctcg tcagcaagaa agcttggagc agttgtgggc gtatgacaaa 960 gactacgggg cgttaaagct tgcgtggctt gcgtatcagg cgattattga ttgttatcag 1020 atgggtaata agcgtgaagc gaagaagaaa atgcggacca ttattgatca gcttcgggtg 1080 ttgaaggggc cgaataagga actcgcgcag ttgggtcgta gtttgtttaa acgacttggt 1140 gatgtgttgg cgtatttcga tgttggtgtc tccaacggtc cggtcgaagc gatcaacgga 1200 cggttggagc atttgcgtgg gattgctcta ggtttccgta atttgaacca ctacattctg 1260 cggtgcctta tccattcagg gcagttggtc cataagatca atgcactcta a 1311 <210> 2 <211> 1515 <212> DNA <213> Corynebacterium sp. <400> 2 atgtcaggtc ttgctgcgtc tacagcggtc ggggtcagtg aattcaccgg gcgaaagtgg 60 gcgaaggccg ccggggtgaa actgacccgc ggcccgcgag gtggcaatgc ttttgacacc 120 gccgagaaac ttgagattgc agccagcatg ctagagaaag gatgcctacc ccgagaaatc 180 ggcgagtatg tcggcatgac tcgggccaat atatccctat ggcgcaaaca aggcccagac 240 aagcttcgcc aacgcgcagc caccttgcgc accggcaagc gagcagctga attcatccac 300 gccccggtga tgggccctta ttatgggcca cgcacactcc atcaagtgtt gcgtgaggac 360 tacacaacac tgtttgacga gttatctgcg ttggggttgc cagcacaggt gtgtggggcc 420 ttacttcatc ttgctccacc accatcatta cgcttttctt atatgtcgtg tgtagtgccg 480 ttatttgctg atgaaatcaa agtcgtagga caaggcacac gattatcgtt agaagagaaa 540 atgatgatcc aacgtttcca tgacaccggg gtcagtgcag cagaaatcgg tcgacgcctg 600 ggtcggtgtc ggcaaacaat ttccagggaa cttcgacgtg gtcaagatga tgatggacgt 660 tatcgtgcac gcgactccta tgaaggtgcg atcaggaaac tagcgcgtcc gaaaacaccg 720 aaacttgatg ccaatcgtag gcttcgggct gtggtggtcg aggcgttgaa taataaatta 780 tctccggagc agatttctgg tcttttagcc accgagcatg ctaacgatag ctctatgcag 840 attagtcatg aaactattta ccaggcgtta tatgttcaag gtaaaggggc gttgcgtgat 900 gaattgaagg tggagaaatt tcttcgtacc ggtcggaagg gacgtaaacc gcagtcgaag 960 ttgccatcga gaggtaagcc gtgggtggag ggtgcgttga ttagtcaacg cccagcagaa 1020 gttgctgatc gtgctgtgcc tgggcactgg gagggcgatt tagtaattgg tggtgaaaac 1080 caagcgacag cgttggtgac gttggtggag cgcacgagcc ggttgacgtt gattaagcgg 1140 ttgggggtta atcatgaggc gtcgactgtg acggatgcgt tggtggagat gatgggtgat 1200 ttgccgcagg cgttgcgtcg gagtttgacg tgggatcagg gtgtggagat ggcagagcat 1260 gcgcggttta gcgtggtgac caagtgtccg gtgtttttct gtgatcctca ttcgccgtgg 1320 cagcgtgggt cgaatgagaa tacgaatgga ttggtcaggg attttttccc gaagggcact 1380 aattttgcta aagtaagtga cgaagaagtt cagcgggcac aggatctgct gaattaccgg 1440 ccgcggaaaa tgcatggttt taaaagcgcg acgcaggtat atgaaaaaat cgtagttggt 1500 gcatccaccg attga 1515

Claims

게놈 상에 서열번호 1 또는 서열번호 1과 99% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 표시되는 ISCg1; 또는 서열번호 2 또는 서열번호 2와 92% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 표시되는 ISCg2의 IS 요소 (element)가 결실되어 있는 코리네박테리움 속 균주.
제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 균주.
제2항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032인 것을 특징으로 하는 균주.
제1항에 있어서, 목적유전자의 형질전환 효율 또는 대사산물의 생성능이 향상된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 균주.
코리네박테리움 속 균주의 게놈 상에서 서열번호 1 또는 서열번호 1과 99% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 표시되는 ISCg1; 또는 서열번호 2 또는 서열번호 2와 92% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 표시되는 ISCg2의 IS 요소 (element)를 결실시키는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 균주의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 균주의 제조방법.
제1항의 코리네박테리움 속 균주에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 균주.
제7항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
다음 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법:
(a) 제7항의 재조합 균주를 배양하여 목적단백질을 발현시키는 단계; 및
(b) 상기 발현된 목적단백질을 회수하는 단계.
제1항의 코리네박테리움 속 균주를 배양하여 대사산물을 생성시키는 단계를 포함하는 대사산물의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 대사산물은 폴리(3-히드록시뷰틸레이트) (poly(3-hydroxybutyrate) 또는 감마-아미노뷰틸산 (gamma-aminobytyric acid)인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 코리네박테리움 속 균주를 목적유전자의 형질전환용 숙주세포로 사용하는 방법.