KR20220034576A - 비-항생제 내성 선별 마커를 포함하는 선별 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항생제 내성 마커를 사용하지 않고 형질전환 균주를 선별하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 선별 방법을 제공한다. 본 발명의 형질전환 균주 선별은 수크로스 대사를 이용하며, cscA 유전자를 포함하는 벡터를 이용한다. cscB 및 cscK 유전자를 함께 발현시킴으로써 cscA 유전자를 단독 도입할 때에 비해 선별에 소요되는 시간을 단축할 수 있다.
Description
본 발명은 항생제 압력 없이 형질전환 생물체의 선별용 조성물과 이를 포함하는 선별용 키트, 및 상기 조성물을 사용하여 형질전환 생물체를 선별하는 방법에 관한 것이다.
1970년대 이후 유전공학이 학문의 하나로 자리잡으면서 유전자 조작 기술을 이용하여 세포에 외래 핵산 등을 삽입하여 숙주에서 유전 물질을 생성하는 기술이 활발히 연구되고 있다.
유전 공학에서 원하는 형질을 갖는 변이주를 선별하는 방법으로는 종래 항생제와 같은 독성 물질에 대한 내성을 갖는 유전자를 선별 마커로 활용하는 직접 선별 방법과, 생장에 필수적인 성장 인자를 활용하는 간접 선별 방식이 있으며, 이 중 항생제 내성 유전자를 사용하는 방식이 널리 활용되고 있다.
그러나 배양 공정에서 항생제 사용시 고가의 항생제 사용으로 인해 생산비용이 상승하고, 최종 산물에 항생제가 잔류하여 추가적인 분리 정제 공정이 필요하며, 항생제 저항성 유전자 마커를 함유하는 균주의 경우 사용 및 허가 취득이 어려운 문제가 있다. 이는 항생제 유출로 인한 환경오염 가능성, 자연계에서 항생제 저항성 돌연변이 생물체가 발생할 위험에 대한 우려에 기인한다.
또한 항생제 마커를 사용하는 경우에는 2차 산물 등을 생산하기 위한 장기간 발효시 마커 유전자에 의한 불안정성 등에 의해 발생하는 항생제의 분해 및 변형으로 인해 항생제 저항성 유전자를 선택 마커로 갖고 있는 플라스미드의 소실이 발생하고, 배양 후반기에는 생산성이 급격히 감소하게 되는 심각한 문제점을 초래한다.
이러한 배경에서 생물공정 산업계에서는 항생제 마커 비의존적(antibiotic marker-free) 생물체의 개발의 수요가 증가하고 있으나, 산업계에서 안정적으로 유용하게 사용할 수 있는 항생제 마커 비의존적 시스템은 없거나 극히 제한적인 실정이다.
본 발명의 목적은 항생제 저항성 마커를 대체할 수 있는 형질전환 생물체 선별용 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항생제 및 항생제 저항성 마커를 대체할 수 있는 형질전환 생물체 선별용 마커 조성물을 사용하여 형질전환 생물체를 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 cscA 유전자를 선별 마커로 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 형질 전환 균주의 선별용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 cscB 및/또는 cscK 유전자를 포함하는 대상 균주에 cscA 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환하는 단계; 및 수크로스를 탄소원으로 갖는 배지에서 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 형질전환 균주의 선별 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 명세서에서 "유전체 DNA"는 원핵세포 내 존재하는 모든 핵산 분자 중 플라스미드 DNA를 제외한 DNA로서, 좁은 의미로는 염색체 DNA를 의미한다.
본 명세서에서 "대상 균주"는 형질 전환의 대상이 되는 균주를 의미하며, 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 증식할 수 없는 균주라면 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 균주는 원핵세포 및 진핵세포로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물일 수 있다. 일 구현예에서 상기 균주는 대장균(Escherichia coli) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 균주는 cscB 및/또는 cscK 유전자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 cscB 및/또는 cscK 유전자는 유전체 DNA 및/또는 플라스미드 DNA에 포함된 것일 수 있다. 상기 균주는 cscA 유전자를 포함하지 않는 것일 수 있으며, 당업계에 알려진 방법으로 cscA 유전자가 인공적으로 결실(deletion)된 균주, 또는 cscA 유전자에서 발현되는 수크로스-6-인산 가수분해효소(sucrose-6-phophate hydrolase)의 활성이 야생형에 비해 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이사, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 1% 이하, 또는 0.1% 이하로 저하된 변이 단백질을 암호화하는 cscA 유전자를 포함하는 균주를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지"는 수크로스 외의 탄소원을 포함하지 않는 배지를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 별도의 언급이 없는 한 핵산 서열은 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 기재되었으며, 아미노산 서열은 N 말단에서 C 말단 방향으로 기재되었다.
본 명세서에서 별도의 언급이 없는 한 온도는 모두 섭씨 온도를 기준으로 한다.
본 발명은 cscA 유전자를 포함하는, 재조합 벡터(cscA 벡터)를 포함하는, 형질전환 균주의 선별용 조성물 및/또는 키트를 제공한다. 상기 cscA 벡터는 외래 유전자를 세포 내에 형질전환하기 위한 목적 범위에서 자유롭게 설계될 수 있다. 일 예에서 상기 cscA 벡터는 복제 원점, 전사개시부위 (promoter), 및/또는 클로닝 부위(cloning site)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 클로닝 부위는 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 cscA 벡터는 cscA 유전자를 선별 마커(selection marker)로 포함하며, 항생제 내성 유전자(마커)를 포함하지 않을 수 있으나, 필요에 따라 항생제 내성 유전자(마커)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 cscA 유전자는 수크로스-6-인산 가수분해효소(sucrose-6-phosphate hydrolase)를 암호화하는 유전자라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 대장균(E. coli)의 W strain에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예에서 상기 cscA 유전자는 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명이 제공하는 형질전환 균주의 선별용 조성물 및/또는 키트는 cscB 유전자 및/또는 cscK 유전자를 포함하는 핵산 분자를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서 상기 조성물 및/또는 키트는 cscB 유전자; 또는 cscB 유전자 및 cscK 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 cscB 유전자 및/또는 cscK 유전자를 포함하는 핵산 분자는 선형 또는 원형일 수 있다. 상기 cscB 유전자 및 cscK 유전자는 하나의 핵산 분자에 포함되거나, 별개의 핵산 분자에 각각 포함되는 것일 수 있다.
상기 cscB 유전자는 수크로스 퍼미아제(sucrose permease)를 암호화하는 유전자라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 대장균(E. coli)의 W strain에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예에서 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 cscK 유전자는 수크로스 프럭토키나아제(sucrose fructokinase)를 암호화하는 유전자라면 제한 없이 사용될 수 있으며 , 대장균(E. coli)의 W strain에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예에서 서열번호 3의 핵산 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서 상기 cscB 유전자 및/또는 cscK 유전자를 포함하는 핵산 분자는 핵산 분자의 5' 말단 및 3' 말단에 형질전환 대상 균주의 염색체 내에 cscB 유전자 및/또는 cscK 유전자를 삽입하기 위한 상동성 서열을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서 상기 cscB 및/또는 cscK 유전자를 포함하는 핵산 분자는 유전체 DNA 내에 cscB 및/또는 cscK 유전자를 포함하지 않는 균주에 도입되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 cscB 유전자 및/또는 cscK 유전자가 삽입된 세포는 cscB 유전자 및/또는 cscK 유전자를 포함하지 않는 세포에 비해 형질전환 균주의 선별에 소요되는 시간을 단축할 수 있다. 일 예에서, 상기 cscB 유전자 및/또는 cscK 유전자가 삽입된 세포는 cscB 유전자 및/또는 cscK 유전자가 삽입되지 않은 세포에서 형질전환 균주를 선별하는 데 걸리는 시간의 0.9배 이하, 0.8배 이하, 0.7배 이하, 0.6배 이하, 0.1 내지 0.9배, 0.1 내지 0.8배, 0.1 내지 0.7배, 0.1 내지 0.6배, 0.3 내지 0.9배, 0.3 내지 0.8배, 0.3 내지 0.7배 또는 0.3 내지 0.6배일 수 있다.
본 발명이 제공하는 형질전환 균주의 선별용 키트는 상기 cscA 벡터 및/또는 cscB 유전자 및 cscK 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 핵산 분자를 대상 세포 내에 도입하는 데에 필요한 시약, 및/또는 기구를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명이 제공하는 형질전환 균주의 선별용 키트는 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지 및/또는 이의 원료를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명이 제공하는 형질전환 균주의 선별용 키트는 하기 중 하나 이상의 대상 균주를 추가로 포함할 수 있다:
(1) cscA, cscB 및 cscK 유전자를 포함하지 않는 균주에 cscB 유전자를 도입하여 제조된 균주;
(2) cscA, cscB 및 cscK 유전자를 포함하지 않는 균주에 cscB 유전자 및 cscK 유전자를 도입하여 제조된 균주;
(3) cscB 유전자를 포함하고, cscA, cscK 유전자를 포함하지 않는 균주;
(4) cscB 유전자를 포함하고, cscA, cscK 유전자를 포함하지 않는 균주에 cscK 유전자를 도입하여 제조된 균주;
(5) cscA, cscB 유전자를 포함하지 않고, cscK 유전자를 포함하는 균주에 cscB 유전자를 도입하여 제조된 균주;
(6) cscA, cscB 유전자와 cscK 유전자를 포함하는 균주에서 cscA 유전자를 결실시켜 제조된 균주; 및
(7) cscA, cscB 유전자와 cscK 유전자를 포함하는 균주에서 cscA 유전자 및 cscK 유전자를 결실시켜 제조된 균주.
본 발명은 cscB 및/또는 cscK 유전자를 포함하는 대상 균주에 cscA 유전자를 포함하는 벡터(cscA)로 형질전환하는 단계; 및 수크로스를 탄소원으로 갖는 배지에서 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 형질전환 균주의 선별 방법을 제공한다.
상기 cscA, cscB 및 cscK 유전자, cscA 벡터, 및 대상 균주는 상술한 바와 같다.
일 예에서 상기 대상 균주는 하기 중 하나의 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
(1) cscA, cscB 및 cscK 유전자를 포함하지 않는 균주에 cscB 유전자를 도입하여 제조된 균주;
(2) cscA, cscB 및 cscK 유전자를 포함하지 않는 균주에 cscB 유전자 및 cscK 유전자를 도입하여 제조된 균주;
(3) cscB 유전자를 포함하고, cscA, cscK 유전자를 포함하지 않는 균주;
(4) cscB 유전자를 포함하고, cscA, cscK 유전자를 포함하지 않는 균주에 cscK 유전자를 도입하여 제조된 균주;
(5) cscA, cscB 유전자를 포함하지 않고, cscK 유전자를 포함하는 균주에 cscB 유전자를 도입하여 제조된 균주;
(6) cscA, cscB 유전자와 cscK 유전자를 포함하는 균주에서 cscA 유전자를 결실시켜 제조된 균주; 및
(7) cscA, cscB 유전자와 cscK 유전자를 포함하는 균주에서 cscA 유전자 및 cscK 유전자를 결실시켜 제조된 균주.
본 발명이 제공하는 형질 전환 균주의 선별 방법은, cscB 및/또는 cscK 유전자를 포함하는 균주를 사용함으로써 선별에 소요되는 시간을 단축할 수 있다. 일 예에서, 상기 방법의 소요 시간은 cscB 및/또는 cscK유전자를 포함하지 않는 대상 균주에 cscA 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환하는 단계; 및 수크로스를 탄소원으로 갖는 배지에서 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 선별 방법의 소요시간의 0.9배 이하, 0.8배 이하, 0.7배 이하, 0.6배 이하, 0.1 내지 0.9배, 0.1 내지 0.8배, 0.1 내지 0.7배, 0.1 내지 0.6배, 0.3 내지 0.9배, 0.3 내지 0.8배, 0.3 내지 0.7배, 또는 0.3 내지 0.6배일 수 있다.
본 발명이 제공하는 형질 전환 균주의 선별 방법에 있어서, 상기 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지는 수크로스를 단독 탄소원으로 사용하는 것일 수 있다. 따라서 상기 수크로스 외의 탄소원을 포함하지 않는 것일 수 있다. 일 예에서 상기 배지는 합성 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명이 제공하는 형질 전환 균주의 선별 방법에 있어서, 상기 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지에서의 배양 온도는, 대상 균주의 종류에 따라 당업자가 적절히 변경할 수 있으며, 예를 들어 섭씨(이하 동일) 10 내지 39도, 10 내지 18도, 10 내지 37도, 15 내지 39도, 15 내지 28도, 15 내지 37도, 20 내지 39도, 20 내지 38도, 20 내지 37도, 25 내지 39도, 25 내지 38도, 25 내지 37도, 30 내지 39도, 30 내지 38도, 30 내지 37도, 35 내지 39도, 35 내지 38도 또는 35 내지 37도에서 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명이 제공하는 형질 전환 균주의 선별 방법에 있어서, 상기 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지에서의 배양 시간은 균주의 종류에 따라 적절한 수의 콜로니를 확인하기 위한 목적 범위에서 당업자가 적절히 변경할 수 있으며, 예를 들어 12 내지 70시간, 12 내지 60시간, 12 내지 54시간, 12 내지 48시간, 18 내지 70시간, 18 내지 60시간, 18 내지 54시간, 또는 18 내지 48시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명이 제공하하는 형질 전환 균주의 선별 방법은 상기 형질전환체를 배양하는 단계 이후 성장이 확인된 균주를 형질 전환된 균주로 분류하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, cscA 유전자를 포함하지 않는 대상 균주가 cscB 및/또는 cscK 유전자를 포함하는 경우, cscA 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환하고, 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 상기 형질전환체를 배양하여 상기 벡터가 도입된 균주를 선별할 수 있다. 상기 벡터가 도입된 균주는 세포 증식이 일어나지 않으나, 벡터가 도입된 균주는 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 성장할 수 있다.
일 구현예에서, cscA 유전자를 포함하지 않는 대상 균주가 cscB 유전자만을 포함하는 경우, cscA 유전자를 포함하는 벡터를 도입하는 단계 외에 cscK 유전자를 포함하는 핵산 분자를 상기 대상 균주에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서 상기 cscK 유전자는 플라스미드 형태로 도입될 수 있으며, 또 다른 일 예에서 상기 cscK 유전자는 상기 대상 균주의 유전체 내로 삽입되는 것일 수 있다. 유전체 내 유전자의 삽입 방법은 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 사용하여 수행될 수 있다. cscA 유전자를 포함하는 벡터 및 cscBK 유전자(cscB 유전자 및 cscK 유전자)가 모두 대상 균주에 도입된 후 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 상기 형질전환체를 배양하여 상기 벡터가 도입된 균주를 선별할 수 있다. 상기 벡터가 도입된 균주는 세포 증식이 일어나지 않으나, 벡터가 도입된 균주는 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 성장할 수 있다.
일 구현예에서, cscA 유전자를 포함하지 않는 대상 균주가 cscB 유전자 및 cscK 유전자를 모두 포함하지 않는 경우, cscA 유전자를 포함하는 벡터를 도입하는 단계 외에 cscB 유전자; 또는 cscB 유전자 및 cscK 유전자(cscBK 유전자)를 포함하는 핵산 분자를 상기 대상 균주에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. cscA 유전자를 포함하는 벡터 및 cscBK 유전자(cscB 유전자 및 cscK 유전자)가 모두 대상 균주에 도입된 후 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 상기 형질전환체를 배양하여 상기 벡터가 도입된 균주를 선별할 수 있다. 상기 벡터가 도입된 균주는 세포 증식이 일어나지 않으나, 벡터가 도입된 균주는 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 성장할 수 있다.
일 구현예에서, 대상 균주가 cscA 유전자를 포함하는 경우, cscA 벡터로 형질전환하는 단계 이전에 cscA 유전자를 결실시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명이 제공하는 형질전환 생물체 선별 방법은 항생제 저항성 마커 없이 수크로스 영양요구성을 이용해 형질전환 생물체를 선별할 수 있으며, 종래의 수크로스 영양요구성을 이용한 선별 방법에 비해 신속하게 형질전환 생물체를 선별할 수 있어 시간, 노동력, 비용을 절감할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따라 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 E. coli W 균주의 대조군(-cscA)과 재조합 균주(+cscA)를 각각 2일간 배양한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따라 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 E. coli W3110 균주의 대조군(-cscA)과 재조합 균주(+cscA)를 각각 2일간 배양한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따라 E. coli W3110 균주의 대조군(cscBK)과 재조합 균주(pCDF-cscA)를 각가 2일간 배양한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따라 수크로스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 E. coli W3110 균주의 대조군(-cscA)과 재조합 균주(+cscA)를 각각 2일간 배양한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따라 E. coli W3110 균주의 대조군(cscBK)과 재조합 균주(pCDF-cscA)를 각가 2일간 배양한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 제한되지 아니한다.
실시예 1. 재조합 벡터의 제작
항생제 저항성 유전자를 포함하지 않으면서 형질 도입을 수행하기 위해, cscA를 포함하는 플라스미드를 제조하였다. cscA 유전자(서열번호 1)는 대장균 W 균주의 유전체로부터, 서열번호 4 및 서열번호 5의 핵산 서열로 이루어지는 프라이머쌍을 사용하여 증폭되었다. 상기 준비된 cscA 유전자를 PacI 제한효소로 잘려진 pCDFDUET-1 (Novagen, #71340) 플라스미드에와 In-Fusion 반응하여 재조합 벡터 pCDF-cscA를 제조하였다.
- 서열번호 4: TACTAGCGCAGCTTATGAGTTACGCATAGTGATAAACC
- 서열번호 5: CAGCAGCCTAGGTTATTAACCCAGTAGCCAGAGTGC
실시예 2. 수크로스 대사가 가능한 균주에서의 재조합균주 제조
수크로스 대사가 가능한 대장균(E. coli) W 균주에 대해서는 재조합 벡터 도입 이전에 유전체에서 cscA 유전자를 결실(deletion)시켜 E.coli W ΔcscA 균주를 제조하여 이후 실험에 이용하였다. 위 cscA 유전자의 결실은 template인 FRT-KM-FRT (GeneBridges, #K004)와 서열번호 6 및 서열번호 7의 핵산 서열로 이루어지는프라이머쌍을 사용하여 증폭된 DNA로 형질전환하여 획득하였다.
- 서열번호 6:
TATTTTTATAAAAGTTAACGTTAACAATTCACCAAATTTGCTTAACCAGGAATTAACCCTCACTAAAGGGCGGCC
- 서열번호 7:
GACGCGGATCCCTTGCCCGCTGTTGATCCGTTGTTCCACCTGATATTATGTAATACGACTCACTATAGGGCTCG
상기 E.coli W ΔcscA 균주에 상기 실시예 1에서 제조된 재조합 벡터를 삽입하여 형질전환하고, 탄소원으로 수크로스를 포함하는 최소배지 (탄소원을 수크로스로 변경한 M9 배지)에 도말하여 섭씨 37도에서 배양하였다. 대조군으로는 재조합 벡터가 도입되지 않은 E.coli W ΔcscA를 사용하였다.
도 1에 배양 2일 후 대조군(E.coli W ΔcscA; -cscA)과 실험군(재조합 균주)의 배양 결과를 나타내었다. 재조합 플라스미드를 포함하지 않는 대조군에서는 2일간의 배양 후에도 세포 증식이 일어나지 않아 콜로니가 형성되지 않았으나, 재조합벡터를 통해 cscA 유전자가 다시 도입된 재조합 균주에서는 수크로스 대사가 정상적으로 수행되어 세포 증식이 활발하게 일어남을 육안으로 확인하였다.
실시예 3. 수크로스 대사가 불가능한 균주에서의 재조합균주 제조
수크로스 대사가 불가능한 대장균(E. coli) W3110 균주(이하 "W3110")에 대해서는 재조합 벡터 도입 이전에 cscB 유전자(서열번호 2) 및 cscK 유전자(서열번호 3)를 W3110 균주의 유전체에 도입하였다.
구체적으로, 대장균 W 균주의 유전체로부터 서열번호 8 및 서열번호 9의 핵산 서열로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 cscB 및 cscK 유전자를 증폭한 DNA #1과, FRT-KM-FRT (GeneBridges, #K004)를 템플릿으로 하여 서열번호 10 및 서열번호 11의 핵산 서열로 이루어지는 프라이머쌍을 사용하여 증폭된 DNA #2를 제작하였다. 상기 제작된 DNA #1 및 #2를 주형으로 서열번호 12 및 서열번호 13의 핵산 서열로 이루어지는 프라이머쌍을 사용해 증폭된 DNA #3를 제작하였다. 대장균 W3110 균주에 상기 제작된 DNA #3를 도입하고 상동성 재조합을 통해 mgsA 위치에 cscB 및 cscK 유전자를 도입하여 W3110 cscBK 균주를 제조하였다.
하기 표 1에 사용된 상기 서열번호 7 내지 서열번호 13의 프라이머 정보를 나타내었다.
| 서열번호 | 이름 | 핵산 서열 (5'>3') |
| 8 | cscB-cscK primer F | CGATAAGTGCTTACAGTAATCTGTAGGAAAGTTAACTACGGATGTACATTAAGCAAATTTGGTGAATTGTTAACG |
| 9 | cscB-cscK primer R | TAGTGAGGGTTAATTACGACAATGTCCTGGAAATCAGC |
| 10 | FRT-KM-FRT primer F | CCAGGACATTGTCGTAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG |
| 11 | FRT-KM-FRT primer R | GGTGGCGAGAAAACCGTAAGAAACAGGTGGCGTTTGCCACCTGTGCAATATAATACGACTCACTATAGGGCTCG |
| 12 | DNA3 primer F | CGATAAGTGCTTACAGTAATCTGTAGGAAAGTTAACTACGGATGTACATTAAGCAAATTTGGTGAATTGTTAACG |
| 13 | DNA3 primer R | GGTGGCGAGAAAACCGTAAGAAACAGGTGGCGTTTGCCACCTGTGCAATATAATACGACTCACTATAGGGCTCG |
상기 W3110 cscBK 균주에 상기 실시예 1에서 제조된 재조합벡터를 삽입하여 형질전환하고, 상기 실시예 2의 재조합 균주와 실질적으로 동일한 조건에서 배양하였다.
도 2에 배양 2일후 대조군(-cscA)과 실험군(재조합 균주; +cscA)에서의 배양 결과를 나타내었다. 재조합 플라스미드를 포함하지 않는 대조군에서는 2일간의 배양 후에도 세포 증식이 일어나지 않은 반면, cscA가 도입된 균주에서는 세포 증식이 확인되었다.
실시예 4. 항생제 저항성 유전자 제거
실제로 항생제 저항성 유전자를 포함하지 않고 수크로스를 선택압으로 형질 도입 여부를 확인할 수 있는지 확인하기 위해, 항생제 저항성 유전자를 제거한 플라스미드를 제조하였다.
구체적으로 실시예 1에서 제작한 pCDF-cscA로부터 항생제 저항성 유전자를 제외한 부분을 서열번호 14 및 서열번호 15의 핵산 서열로 이루어지는 프라이머쌍을 이용해 증폭하고 In-Fusion 반응하여 재조합 벡터 pCDF-cscA (wo SM)를 제조하였다.
- 서열번호 14: acactgcttccggtatagctagctcactcggtcgctacgc
- 서열번호 15: ccgagtgagctagctataccggaagcagtgtgaccgtgtgc
상기 W3110 cscBK 균주에 상기 실시예 4에서 제조된 재조합벡터를 삽입하여 형질전환하고, 상기 실시예 2의 재조합 균주와 실질적으로 동일한 조건에서 배양하였다.
도 3에 배양 2일후 대조군(W3110 WT + cscA wo SM)과 실험군(재조합 균주; +cscA wo SM)에서의 배양 결과를 나타내었다. cscA가 도입된 W3110 cscBK 균주에서는 세포 증식이 확인된 반면, cscBK가 포함되지 않는 대조군에서는 cscA가 도입됐 음에도 불구하고 2일간의 배양 후에도 세포 증식이 일어나지 않아, 수크로스를 선택압으로 사용하여 형질도입 여부를 확인하기 위해서는 cscA 유전자 외에도 cscBK 유전자가 필요함을 확인하였다.
<110> LG CHEM, LTD.
<120> Selection system containing non-antibiotic resistance selection
marker
<130> DPP20201642KR
<160> 15
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1629
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cscA region_insert
<400> 1
tgagttacgc atagtgataa acctcttttt cgcaaaatcg tcatggattt actaaaacat 60
gcatattcga tcacaaaacg tcatagttaa cgttaacatt tgtgatattc atcgcattta 120
tgaaagtaag ggactttatt tttataaaag ttaacgttaa caattcacca aatttgctta 180
accaggatga ttaaaatgac gcaatctcga ttgcatgcgg cgcaaaacgc cctagcaaaa 240
cttcatgagc accggggtaa cactttctat ccccattttc acctcgcgcc tcctgccggg 300
tggatgaacg atccaaacgg cctgatctgg tttaacgatc gttatcacgc gttttatcaa 360
catcatccga tgagcgaaca ctgggggcca atgcactggg gacatgccac cagcgacgat 420
atgatccact ggcagcatga gcctattgcg ctagcgccag gagacgataa tgacaaagac 480
gggtgttttt caggtagtgc tgtcgatgac aatggtgtcc tctcacttat ctacaccgga 540
cacgtctggc tcgatggtgc aggtaatgac gatgcaattc gcgaagtaca atgtctggct 600
accagtcggg atggtattca tttcgagaaa cagggtgtga tcctcactcc accagaagga 660
atcatgcact tccgcgatcc taaagtgtgg cgtgaagccg acacatggtg gatggtagtc 720
ggggcgaaag atccaggcaa cacggggcag atcctgcttt atcgcggcag ttcgttgcgt 780
gaatggacct tcgatcgcgt actggcccac gctgatgcgg gtgaaagcta tatgtgggaa 840
tgtccggact ttttcagcct tggcgatcag cattatctga tgttttcccc gcagggaatg 900
aatgccgagg gatacagtta ccgaaatcgc tttcaaagtg gcgtaatacc cggaatgtgg 960
tcgccaggac gactttttgc acaatccggg cattttactg aacttgataa cgggcatgac 1020
ttttatgcac cacaaagctt tttagcgaag gatggtcggc gtattgttat cggctggatg 1080
gatatgtggg aatcgccaat gccctcaaaa cgtgaaggat gggcaggctg catgacgctg 1140
gcgcgcgagc tatcagagag caatggcaaa cttctacaac gcccggtaca cgaagctgag 1200
tcgttacgcc agcagcatca atctgtctct ccccgcacaa tcagcaataa atatgttttg 1260
caggaaaacg cgcaagcagt tgagattcag ttgcagtggg cgctgaagaa cagtgatgcc 1320
gaacattacg gattacagct cggcactgga atgcggctgt atattgataa ccaatctgag 1380
cgacttgttt tgtggcggta ttacccacac gagaatttag acggctaccg tagtattccc 1440
ctcccgcagc gtgacacgct cgccctaagg atatttatcg atacatcatc cgtggaagta 1500
tttattaacg acggggaagc ggtgatgagt agtcgaatct atccgcagcc agaagaacgg 1560
gaactgtcgc tttatgcctc ccacggagtg gctgtgctgc aacatggagc actctggcta 1620
ctgggttaa 1629
<210> 2
<211> 1319
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cscB region_insert
<400> 2
tgagaagtaa acggcgaagt cgctcttatc tctaaatagg acgtgaattt tttaacgaca 60
ggcaggtaat tatggcactg aatattccat tcagaaatgc gtactatcgt tttgcatcca 120
gttactcatt tctctttttt atttcctggt cgctgtggtg gtcgttatac gctatttggc 180
tgaaaggaca tctagggttg acagggacgg aattaggtac actttattcg gtcaaccagt 240
ttaccagcat tctatttatg atgttctacg gcatcgttca ggataaactc ggtctgaaga 300
aaccgctcat ctggtgtatg agtttcatcc tggtcttgac cggaccgttt atgatttacg 360
tttatgaacc gttactgcaa agcaattttt ctgtaggtct aattctgggg gcgctatttt 420
ttggcttggg gtatctggcg ggatgcggtt tgcttgatag cttcaccgaa aaaatggcgc 480
gaaattttca tttcgaatat ggaacagcgc gcgcctgggg atcttttggc tatgctattg 540
gcgcgttctt tgccggcata ttttttagta tcagtcccca tatcaacttc tggttggtct 600
cgctatttgg cgctgtattt atgatgatca acatgcgttt taaagataag gatcaccagt 660
gcgtagcggc agatgcggga ggggtaaaaa aagaggattt tatcgcagtt ttcaaggatc 720
gaaacttctg ggttttcgtc atatttattg tggggacgtg gtctttctat aacatttttg 780
atcaacaact ttttcctgtc ttttattcag gtttattcga atcacacgat gtaggaacgc 840
gcctgtatgg ttatctcaac tcattccagg tggtactcga agcgctgtgc atggcgatta 900
ttcctttctt tgtgaatcgg gtagggccaa aaaatgcatt acttatcgga gttgtgatta 960
tggcgttgcg tatcctttcc tgcgcgctgt tcgttaaccc ctggattatt tcattagtga 1020
agttgttaca tgccattgag gttccacttt gtgtcatatc cgtcttcaaa tacagcgtgg 1080
caaactttga taagcgcctg tcgtcgacga tctttctgat tggttttcaa attgccagtt 1140
cgcttgggat tgtgctgctt tcaacgccga ctgggatact ctttgaccac gcaggctacc 1200
agacagtttt cttcgcaatt tcgggtattg tctgcctgat gttgctattt ggcattttct 1260
tcttgagtaa aaaacgcgag caaatagtta tggaaacgcc tgtaccttca gcaatatag 1319
<210> 3
<211> 1116
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cscK region_insert
<400> 3
ttaagcaaat ttggtgaatt gttaacgtta acttttataa aaataaagtc ccttactttc 60
ataaatgcga tgaatatcac aaatgttaac gttaactatg acgttttgtg atcgaatatg 120
catgttttag taaatccatg acgattttgc gaaaaagagg tttatcacta tgcgtaactc 180
agatgaattt aagggaaaaa aatgtcagcc aaagtatggg ttttagggga tgcggtcgta 240
gatctcttgc cagaatcaga cgggcgccta ctgccttgtc ctggcggcgc gccagctaac 300
gttgcggtgg gaatcgccag attaggcgga acaagtgggt ttataggtcg ggtgggggat 360
gatccttttg gtgcgttaat gcaaagaacg ctgctaactg agggagtcga tatcacgtat 420
ctgaagcaag atgaatggca ccggacatcc acggtgcttg tcgatctgaa cgatcaaggg 480
gaacgttcat ttacgtttat ggtccgcccc agtgccgatc tttttttaga gacgacagac 540
ttgccctgct ggcgacatgg cgaatggtta catctctgtt caattgcgtt gtctgccgag 600
ccttcgcgta ccagcgcatt tactgcgatg acggcgatcc ggcatgccgg aggttttgtc 660
agcttcgatc ctaatattcg tgaagatcta tggcaagacg agcatttgct ccgcttgtgt 720
ttgcggcagg cgctacaact ggcggatgtc gtcaagctct cggaagaaga atggcgactt 780
atcagtggaa aaacacagaa cgatcaggat atatgcgccc tggcaaaaga gtatgagatc 840
gccatgctgt tggtgactaa aggtgcagaa ggggtggtgg tctgttatcg aggacaagtt 900
caccattttg ctggaatgtc tgtgaattgt gtcgatagca cgggggcggg agatgcgttc 960
gttgccgggt tactcacagg tctgtcctct acgggattat ctacagatga gagagaaatg 1020
cgacgaatta tcgatctcgc tcaacgttgc ggagcgcttg cagtaacggc gaaaggggca 1080
atgacagcgc tgccatgtcg acaagaactg gaatag 1116
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cscA primer F
<400> 4
tactagcgca gcttatgagt tacgcatagt gataaacc 38
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cscA primer R
<400> 5
cagcagccta ggttattaac ccagtagcca gagtgc 36
<210> 6
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cscA_del primer F
<400> 6
tatttttata aaagttaacg ttaacaattc accaaatttg cttaaccagg aattaaccct 60
cactaaaggg cggcc 75
<210> 7
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cscA_del primer R
<400> 7
gacgcggatc ccttgcccgc tgttgatccg ttgttccacc tgatattatg taatacgact 60
cactataggg ctcg 74
<210> 8
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cscB-cscK primer F
<400> 8
cgataagtgc ttacagtaat ctgtaggaaa gttaactacg gatgtacatt aagcaaattt 60
ggtgaattgt taacg 75
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cscB-cscK primer R
<400> 9
tagtgagggt taattacgac aatgtcctgg aaatcagc 38
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FRT-KM-FRT primer F
<400> 10
ccaggacatt gtcgtaatta accctcacta aagggcgg 38
<210> 11
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FRT-KM-FRT primer R
<400> 11
ggtggcgaga aaaccgtaag aaacaggtgg cgtttgccac ctgtgcaata taatacgact 60
cactataggg ctcg 74
<210> 12
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA3 primer F
<400> 12
cgataagtgc ttacagtaat ctgtaggaaa gttaactacg gatgtacatt aagcaaattt 60
ggtgaattgt taacg 75
<210> 13
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA3 primer R
<400> 13
ggtggcgaga aaaccgtaag aaacaggtgg cgtttgccac ctgtgcaata taatacgact 60
cactataggg ctcg 74
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCDF-antibiotics_del primer F
<400> 14
acactgcttc cggtatagct agctcactcg gtcgctacgc 40
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCDF-antibiotics_del primer R
<400> 15
ccgagtgagc tagctatacc ggaagcagtg tgaccgtgtg c 41
Claims (10)
- cscA 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및
cscB 및 cscK로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 형질전환 균주의 선별용 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 항생제 내성 마커를 포함하지 않는 것인, 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는, 형질전환 균주의 선별용 키트.
- cscB 및 cscK 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 대상 균주에 cscA 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환하는 단계; 및
수크로스를 탄소원으로 갖는 배지에서 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 형질전환 균주의 선별 방법. - 제4항에 있어서, 상기 벡터는 항생제 내성 마커를 포함하지 않는 것인, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 대상 균주는 cscA 유전자를 포함하지 않는 것인, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 대상 균주의 cscB 및 cscK로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자는 대상 균주의 유전체 DNA에 포함된 것인, 방법.
- 제4항에 있어서 상기 대상 균주는 하기 중 하나의 균주인 것인, 방법:
(1) cscA, cscB 및 cscK 유전자를 포함하지 않는 균주에 cscB 유전자를 도입하여 제조된 균주;
(2) cscA, cscB 및 cscK 유전자를 포함하지 않는 균주에 cscB 유전자 및 cscK 유전자를 도입하여 제조된 균주;
(3) cscB 유전자를 포함하고, cscA, cscK 유전자를 포함하지 않는 균주;
(4) cscB 유전자를 포함하고, cscA, cscK 유전자를 포함하지 않는 균주에 cscK 유전자를 도입하여 제조된 균주;
(5) cscA, cscB 유전자를 포함하지 않고, cscK 유전자를 포함하는 균주에 cscB 유전자를 도입하여 제조된 균주;
(6) cscA, cscB 유전자와 cscK 유전자를 포함하는 균주에서 cscA 유전자를 결실시켜 제조된 균주; 및
(7) cscA, cscB 유전자와 cscK 유전자를 포함하는 균주에서 cscA 유전자 및 cscK 유전자를 결실시켜 제조된 균주. - 제4항에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 단계 이후, 상기 수크로스를 탄소원으로 하는 배지에서 증식한 세포를 형질전환된 세포로 분류하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 방법의 소요 시간은 cscB 및 cscK유전자를 포함하지 않는 대상 균주에 cscA 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환하는 단계; 및 수크로스를 탄소원으로 갖는 배지에서 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 선별 방법의 소요시간의 0.9배 이하인 것인, 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200117131A KR20220034576A (ko) | 2020-09-11 | 2020-09-11 | 비-항생제 내성 선별 마커를 포함하는 선별 시스템 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200117131A KR20220034576A (ko) | 2020-09-11 | 2020-09-11 | 비-항생제 내성 선별 마커를 포함하는 선별 시스템 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220034576A true KR20220034576A (ko) | 2022-03-18 |
Family
ID=80936593
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200117131A KR20220034576A (ko) | 2020-09-11 | 2020-09-11 | 비-항생제 내성 선별 마커를 포함하는 선별 시스템 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20220034576A (ko) |
-
2020
- 2020-09-11 KR KR1020200117131A patent/KR20220034576A/ko active Search and Examination
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| A201 | Request for examination |