JP2020527951A - 望ましい遺伝子発現を促進するためのプラスミドアディクションシステム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年7月13日に出願された、PLASMID ADDICTION SYSTEM TO DRIVE DESIRED GENE EXPRESSIONと題される米国仮特許出願第62/697531号、および2018年7月21日に出願された、PLASMID ADDICTION SYSTEM TO DRIVE DESIRED GENE EXPRESSIONと題される米国仮特許出願第62/535596号の優先権を主張し、両方の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる
目的のタンパク質の発現を促進するこのような手法の力を考えると、細胞内のプラスミドの安定した維持を確保するためにさまざまなアプローチが開発されたことは驚くことではない(Nordstrom and Austin,1989)。これには以下の、(i)高コピープラスミドシステムのプラスミド維持システムとして機能する部位特異的組換えシステム(Grindley et al,2006)、(ii)アクティブパーティションシステム(Funnell and Slavcev,2004)、および上記のような、(iii)プラスミドアディクションシステム(PAS)であって、本明細書で提供される発明のように、目的のプラスミドの遺伝子を含有せず、発現しない細胞の継続的な生存/複製を防ぐシステム(Gerdes et al,2005)、が含まれる。
部位特異的組換えは、少なくともある程度の配列相同性を有するセグメント間でDNA鎖交換が起こる遺伝子組換えの一種である。このシステムでは、部位特異的リコンビナーゼ(複数可)(SSR)が短いDNA配列(部位)を認識して結合することによりDNAセグメントの再配列を実行し、そこでDNA骨格を切断し、関与する2つのDNAヘリックスを交換しその後DNAストランドを再結合する。(Datsenko and Wanner,2000)。一部の部位特異的組換えシステムでは、これらのすべての反応を実行するのに単一のリコンビナーゼ酵素と対応する組換え部位だけで十分であるが、他のシステムでは多くのアクセサリータンパク質および/またはアクセサリー部位も必要であり−それぞれの追加により複雑さが増し、それにより、このシステムの信頼性と汎用性の両方が低下する。(Baba et al,2006)。さらに、必要なリコンビナーゼの恒常的発現は、望ましくない遺伝子型変異を引き起こす可能性があり、その初期開発の観点からシステムを使用することは、リコンビナーゼ遺伝子の子孫への導入の観点から難しくなり得る。
上記のように、微生物は、プラスミド自体の維持とそこに含有される遺伝子の発現の両方の進行中の代謝負荷のために、プラスミドを排除するか、細胞内のプラスミドの複製を制限する傾向がある。(Rosano et al,2014)。さらに、問題のプラスミドが、発現すると細胞内またはその細胞の直接の環境で毒性産物を産生する遺伝子を含有する場合、細胞はプラスミドの複製と発現を好まない可能性がある。もちろん、そのような微生物系を利用する人々にとっての関心は、操作された遺伝子変化の維持と、挿入された遺伝子の結果的な発現である。この意味で、プラスミドと宿主の安定した遺伝には一般的に:(1)プラスミドは各世代に1回複製しなければならない、(2)コピー数の偏差は、細胞分裂の前に迅速に修正しなければならない、(3)細胞分裂の際に、プラスミド複製の産物を両方の娘細胞に信頼性の高い一貫性のある方法で分配しなければならない、ことが必要である。(Balbas et al,1986)。
目的のプラスミドを安定して維持するように設計されたシステムがある。特に一般的なシステムの1つは、選択ツールとしての抗生物質の使用である。そのようなシステムでは、目的のプラスミドの抗生物質耐性遺伝子は、それを保有する細胞を保護すると同時に、対応する抗生物質が豊富な培地で細菌細胞を増殖させると、細胞を効果的に「強制」維持する。(Cranenburgh,R.M.et al,2001)。ただし、この方法には多くの困難と懸念がある。抗生物質耐性のアプローチは高価であり、高価な抗生物質の使用を必要とし、工業的生産方法で使用される場合、ヒトおよび/または動物集団に悪影響を与える可能性のある細菌抗生物質耐性の発達を加速および/または広める方法である可能性があるため、培養方法として好ましくないと感じる人もいる。さらに、大規模生産用途では、抗生物質の使用が他の制限を強いる可能性もある。市販のバイオリアクターに関して、抗生物質耐性メカニズムは抗生物質自体を分解し、プラスミドのない細胞のかなりの集団を培養で持続させることができる。そのようなプラスミドのない細胞は非生産的であり、バイオリアクターの全体的な生産量を減少させ、それによりコストが増加し、効率が低下する。(Balbas 2001、Baba 2006)。
安定した低コピー数プラスミドは、通常、娘細胞間でプラスミドコピーを積極的に分配する分配機能を使用する。分配メカニズムの例には、pSClOl、F因子、PIプロファージ、およびIncFII薬物耐性プラスミドが含まれる。そのような機能は、複製中にプラスミドを物理的に分離するように作用する。機能性の点では、多くの小さなプラスミドは、細胞全体に分布する高いコピー数に依存しており、分裂時に各娘細胞によって少なくとも1つのコピーが維持されることを保証する。一方、多くの大きな低コピー数プラスミドは、確率的損失を回避するために活発な分離システムをエンコードする。さまざまなパーティショニングシステムが存在するが、ほとんどは3つの構成要素である、セントロメアDNA領域、細胞動原性(cytomotive)フィラメント、および2つをリンクするアダプタータンパク質、に依存している。タイプII分離では、細菌のアクチン様タンパク質(ALP)フィラメントがプラスミド分離を推進する。(Balbas et al,2001;Balbas 1986;Schumacher 2014)。
自然に発生するPSKプラスミド維持機能は、通常、2成分毒素−抗毒素システムを使用し、一般に次のように動作する。このプラスミドは毒素と抗毒素の両方をコードする。抗毒素は毒素よりも安定性が低く、毒素は非常に安定している傾向がある。プラスミドのない娘細胞では、毒素と抗毒素はもはや産生されていないが、安定性の低い抗毒素はすぐに分解し、それによって毒素が放出され、抗毒素が存在することなく周囲の細胞を殺滅する。(Gerdes 1990)。
平衡致死システム(PSK機能)では、必須の構造タンパク質または酵素をコードする染色体遺伝子を細菌の染色体から欠失させるか、遺伝子が機能しなくなるように変異される(Fu.,2000)。除去されたまたは損傷した遺伝子は、完全に機能する遺伝子を含むプラスミドに置き換えられる。プラスミドが失われると、必須タンパク質が不足し、プラスミドのない細胞が死滅する。触媒酵素産生に基づいた平衡致死システムには、多くの欠陥がある。特に、染色体遺伝子欠失の相補性には単一の遺伝子コピーのみを必要とするため、発現プラスミドのコピーを数個以上維持することは本質的に困難である。プラスミドを含まない宿主株は、既存の代謝欠損を化学的に補完するために特別な培地で増殖させなければならない。(Fu 2000)。
生物工学的産生プロセスは、それぞれEscherichia coliやSaccharomyces cerevisiaeなどの定評のある原核生物および真核生物の宿主におけるプラスミドベースの発現システムでしばしば動作する。遺伝子組換え生物は、重要な化学物質、生体高分子、バイオ燃料、インスリンなどの高価値タンパク質を産生する。これらのバイオプロセスでは、組換え宿主のプラスミドは生産性に重要な影響を及ぼす。(Kroll J.,2010)。プラスミドを含まない細胞は、生成物全体の回収に損失をもたらし、プロセス全体の収益性を低下させる(表1)。多くの場合、工業的発酵における抗生物質の使用は、プラスミドの安定性を維持するための利用可能な選択肢または望ましい選択肢ではない。特に医薬品またはGMPベースの発酵プロセスでは、配置された抗生物質を不活性化して除去する必要がある。上記のように、それらも費用がかかる。いくつかのプラスミドアディクションシステム(PAS)が文献に記載されており、上記で参照されている。本PASは、抗生物質を含まず、細胞複製および恒常性が絶対に必要なままであり、培養中に複数の遺伝子を保有するプラスミドなどを効率的に維持できる新しい方法を提供する。
細胞系は、異所性タンパク質の発現を提供する任意の細胞である。細菌、酵母、植物細胞、動物細胞が含まれていた。原核細胞と真核細胞の両方が含まれる。また、リボソームなどの細胞成分に基づいたタンパク質のインビトロ発現も含まれる。
TCA−トリカルボン酸
DAP−ジアミノピメリン酸
PAS−プラスミドアディクションシステム
TB−テリフィックブロス(Terrific Broth)
LB−ルリアブロス(Luria Broth)
Y(E)PD−酵母エキスペプトンデキストロース(培地)
sueA−2−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素のE1成分をコードするE.coli遺伝子
sucB−2−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素のE2成分をコードするE.coli遺伝子
sucC−スクシニルCoAシンテターゼ酵素のβサブユニットをコードするE.coli遺伝子
sucD−スクシニルCoAシンテターゼ酵素のaサブユニットをコードするE.coli遺伝子
本発明実施例の1つ以上の遺伝子に対しマーカー遺伝子が必要な場合には、以下が含まれる:制限ヌクレアーゼ(例えば、CviAII、クロレラウイルスPBCV−1由来の制限エンドヌクレアーゼ、Zhang et al,1992)、EcoRI(Torres et al,2000)をコードする遺伝子、Szafransky et al,1997、Kaplan et al,1999、Sano et al,1995に記載されているようなタンパク質と相互作用する毒素をコードする遺伝子であって、タンパク質が例えば、ビオチンの欠乏により細胞増殖に不可欠なタンパク質として作用する、ストレプトアビジンまたはstvl3(切断された、易溶性のストレプトアビジン変異体)であるもの、膜を損傷するタンパク質をコードする遺伝子(E遺伝子タンパク質のφX174(Ronchel et al,1998;Haidinger et al,2002)、gef(Jensen et al,1993;Klemm et al,1995)、relF(Knudsen et al,1995)、他の細菌毒素をコードする遺伝子、例えば、Bacillus subtilis(Gay et al,1983)のDNAジャイレースまたはsacBを捕捉するFプラスミドからの強力な細胞殺滅タンパク質をコードするccdb遺伝子(Bernard and Couturier,1992)、または細菌宿主に有毒な真核生物毒素をコードする遺伝子(例えば、FUS;Crozat et al,1993)。毒性遺伝子を使用する場合、それらの発現は誘導性プロモーターによって調節できることが不可欠である。このプロモーターは、誘導因子なしでは活性であるべきではないが、誘導時に細胞増殖を阻害するのに十分な、発現を提供する。
BW251 13およびAsucA::KanRおよびAsucD::KanRの欠失は、E.coli Genetic Stock Center(CGSC)から入手した。通常、細胞をルリアブロス(LB)で増殖させたが、実験はTB、YPD、YEPD、コーンスティープリカーを含む普通ブイヨン、およびその他の富栄養培地でも行った(Miller,1972)。AsucAD二重欠失は合成致死性であるため、スクリーニングを支援するために、ジアミノピメリン酸(Sigma D1377)を120μMで使用した(Mattozzi et al,2013;Yu et al,2006)。
Plvir形質導入(Miller,1972)を使用して、E.coli BW251 13のカナマイシン耐性二重ノックアウト株を作成し、LBカナマイシンプレート上120μMのDAPでスクリーニングした。これらを、コロニーPCRを介してAsucAおよびAsucDの欠失についてスクリーニングした。このKanRドナー株は、E.coli株BL21、BL21(DE3)、MG1655、MG1655(DE3)AlacY、およびW3110の二重ノックアウトを作成するためにも使用された。プラスミドpCP20を使用して、そのFLP/FRTベースのリコンビナーゼを使用してカナマイシン耐性マーカーを除去した(Baba et al,2006、Datsenko and Wanner,2000)。sucAとsucDはわずか6kbしか離れていないため、四重欠失AsucABCDを示すKan感受性細胞は、通常pCP20 FLPリコンビナーゼステップの後に単離された(Datsenko and Wanner,2000)。
sucA、sucB、sucC、およびsucDをコードするコドン最適化配列を合成した(Quintara Bioworks,Emeryville CA)。CIDAR £.coli Modular Cloning(Iverson et al、2016)を使用して、sucABCDナチュラルオペロンとsucAD合成オペロンのバージョンを生成した。どちらのバージョンもE.coli MG1655ネイティブ配列に基づいていたが、タンパク質配列に影響を与えないように、フレーム内で不正な(illegal)BsalおよびBpil部位が置換された。組換えの影響を最小限に抑えるために、追加のコドン最適化が行われた。オペロンsucABCDとsucADは同一であったが、sucBの開始コドンとsucCの停止コドンの間の配列は欠失させた。(Yu et al,2005)。
プラスミドを担持するE.coli株は、24ウェルプレートおよびBioLectorフラワープレート(Funke et al,2009)に追加の補充なしでLBにて増殖させた。
異種DNAの維持は、産業システムにおいて大きな課題である。多くのシステムがすでに存在するが、それぞれに欠点がある。遺伝子のゲノムへの組み込みは時間がかかり、広範なスクリーニングが必要であり、細胞ごとに1つのコピーに制限される。コスミドや細菌人工染色体(BAC)のような大きなDNAループは、染色体DNAや細胞片のペレットから分離するのが難しく、この場合もやはりコピー数によって制限される。ファージは、目的の細胞タイプにとどまるのが難しい場合がある。それらは予期せず溶菌性になり、工場規模で劇的な結果を引き起こす可能性がある。したがって、E.coliや他の細菌培養に異種DNAを導入して維持する最も一般的な方法は、目的の遺伝子(複数可)が、複製起点と、典型的には抗生物質耐性マーカーとを含む配列を含有するDNAの小さなループ上で維持される、プラスミドを介することである。このマーカーには問題があり、培地中の抗生物質は高価であり、同様の化学的性質を持つ最終的な低分子産生物を汚染する可能性がある。同様に、これらのマーカーをコードする遺伝子はバイオセーフティの問題を提起し、発酵で使用される抗生物質は臨床現場で使用されるものと同じか類似のものである。通常、実験室での封じ込めは良好であるが、抗生物質耐性遺伝子の大規模な使用は、メチシリン耐性Staphylococcus aureus(MRSA)などの危険な耐性菌の拡散を促進する可能性がある。
本発明の実施形態では、以下の構成要素が有用である:
それらの複製は宿主機構に依存するため、多くのプラスミドは狭い宿主範囲を持つプラスミドである。多くの場合、複製はE.coliおよびSalmonella菌やKlebsiella菌などの関連細菌に限定される(Kues and Stahl,1989)。しかしながら、本発明によれば、真核生物系を含む非常に多様な機能的宿主が利用可能である。他の適切な宿主には、Corynebacterium属、Bacillus属、Pseudomonas属、Vibrio属、Bulkholderia属、および異種プラスミドを安定して維持でき、ペプチドグリカン細胞壁を有する他のあらゆる細菌が含まれる。
sucA−2−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素のE1成分をコードするE.coli遺伝子
sucB−2−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ酵素のE2成分をコードするE.coli遺伝子
sucC−スクシニルCoAシンテターゼ酵素のβサブユニットをコードするE.coli遺伝子
sucD−スクシニルCoAシンテターゼ酵素のaサブユニットをコードするE.coli遺伝子。
宿主細胞を操作するのに適した構築物の原理を図2に示す:宿主株はPI形質導入(上記)を介して生成され、プラスミドはギブソンアセンブリ、クローニング、ゴールデンゲートおよび/またはモジュラークローニングを介して生成された。
プラスミドは、宿主株で特異的に欠失させた遺伝子を発現するために必要である。本実施例では、E.coliのsucADおよびsucABCDのコドン最適化バージョンがプラスミド上に発現され、それぞれBW251 13 AsucADおよびAsucABCDに加えられた欠失を補完する。
BW251 13およびAsucA::KanRおよびAsucD::KanRの欠失は、エール大学のE.coli Genetic Stock Center(CGSC)から入手した。通常、細胞はルリアブロス(LB)で増殖させたが、実験はTB、YPD、YEPD、コーンスティープリカーを含む普通ブイヨン、およびその他の富栄養培地でも行った(Miller,1972)。AsucA(B)Asuc(C)D二重欠失は合成致死性であるため、スクリーニングを支援するために、ジアミノピメリン酸(Sigma D1377)を120μMで使用した(Mattozzi et al,2013;Yu et al,2006)。
Plvir形質導入(Miller,1972)を使用して、E.coli BW25113のカナマイシン耐性二重ノックアウト株を作成し、LBカナマイシンプレート上120μMのDAPでスクリーニングした。これらを、コロニーPCRを介してAsucAおよびAsucDの欠失についてスクリーニングした。このKanRドナー株は、E.coli株BL21、BL21(DE3)、BL21*(DE3)、MG1655、MG1655(DE3)AlacY、C41、およびW3110の二重ノックアウトを作成するためにも使用された。プラスミドpCP20を使用して、そのFLP/FRTベースのリコンビナーゼを使用してカナマイシン耐性マーカーを除去した(Baba et al,2006、Datsenko and Wanner,2000)。sucAとsucDはわずか6kbしか離れていないため、四重欠失AsucABCDを示すKan感受性細胞は、通常pCP20 FLPリコンビナーゼステップの後に単離された(Datsenko and Wanner,2000)。
ゴールデンゲートベースのテクノロジーであるCIDAR £.coli Modular Cloning(Iverson et al、2016)を使用して、sucABCDナチュラルオペロンとsucAD合成オペロンのバージョンを生成した。どちらのバージョンもE.coli MG1655ネイティブ配列に基づいていたが、タンパク質配列に影響を与えないように、フレーム内で不正なBsalおよびBpil部位が置換された。オペロンsucABCDとsucADは同一であったが、sucBの開始コドンとsucCの停止コドンの間の配列を欠失させた。プラスミドをエレクトロポレーションによりsucADおよびsucABCD株に形質転換し、追加の補充なしでLBプレート上で選択したが、親株は、DAPの補充なしでは増殖できない。クローンはシーケンスによって確認された。
システム内の複数のプラスミドの維持を試験するために、同様の実験が行われた。BW25113 AsucABCDの細胞は、sucABとsucCDの少なくとも2つの遺伝子がプラスミド上で発現されない限り、DAPの補充なしではLBで増殖できない。プラスミドpDVK−sucADおよびpDVK−sucBCが構築された。これらのプラスミドはいずれも、DAP補充なしでBW251 13 AsucABCDの増殖を可能にするのに十分な遺伝子セットを持たないが、それらは組み合わされる。DAPを補充しなくても、細胞はカナマイシン耐性を保持しているため、両方のプラスミドを維持する能力がある(表2、3)。
プラスミドを担持するE.coli株は、24ウェルプレートおよびBioLectorフラワープレート(Funke et al,2009)に追加補充せずにLBで増殖させた。
前述の説明から明らかなように、本開示の特定の態様は、本明細書に示される例示の特定の詳細によって限定されず、したがって、他の修正および適用、またはそれらの等価物が当業者に思い浮かぶと考えられる。したがって、特許請求の範囲は、本開示の精神および範囲から逸脱しないすべてのそのような修正および適用を網羅するものとする。
本開示は、食品成分、香料、医薬、製薬の商業生産に適用可能である。本開示は、一般に、選択された微生物株を介した所望の最終産物の、増強され、より正確に制御された生合成生産のための方法に関する。
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目的の配列:
配列番号1 SEオペロンおよびゲノムコンテキスト配列
ccggtcaggcactgactgtgaatgagaaaggcgaagatgtggttgttccgggactgtttgccgttggtgaaatcgcttgtgtatcggtacacggcgctaaccgtctgggcggcaactcgctgctggacctggtggtctttggtcgcgcggcaggtctgcatctgcaagagtctatcgccgagcagggcgcactgcgcgatgccagcgagtctgatgttgaagcgtctctggatcgcctgaaccgctggaacaataatcgtaacggtgaagatccggtggcgatccgtaaagcgctgcaagaatgtatgcagcataacttctcggtcttccgtgaaggtgatgcgatggcgaaagggcttgagcagttgaaagtgatccgcgagcgtctgaaaaatgcccgtctggatgacacttccagcgagttcaacacccagcgcgttgagtgcctggaactggataacctgatggaaacggcgtatgcaacggctgtttctgccaacttccgtaccgaaagccgtggcgcgcatagccgcttcgacttcccggatcgtgatgatgaaaactggctgtgccactccctgtatctgccagagtcggaatccatgacgcgccgaagcgtcaacatggaaccgaaactgcgcccggcattcccgccgaagattcgtacttactaatgcggagacaggaaaatgagactcgagttttcaatttatcgctataacccggatgttgatgatgctccgcgtatgcaggattacaccctggaagcggatgaaggtcgcgacatgatgctgctggatgcgcttatccagctaaaagagaaagatcccagcctgtcgttccgccgctcctgccgtgaaggtgtgtgcggttccgacggtctgaacatgaacggcaagaatggtctggcctgtattaccccgatttcggcactcaaccagccgggcaagaagattgtgattcgcccgctgccaggtttaccggtgatccgcgatttggtggtagacatgggacaattctatgcgcaatatgagaaaattaagccttacctgttgaataatggacaaaatccgccagctcgcgagcatttacagatgccagagcagcgcgaaaaactcgacgggctgtatgaatgtattctctgcgcatgttgttcaacctcttgtccgtctttctggtggaatcccgataagtttatcggcccggcaggcttgttagcggcatatcgtttcctgattgatagccgtgataccgagactgacagccgcctcgacggtttgagtgatgcattcagcgtattccgctgtcacagcatcatgaactgcgtcagtgtatgtccgaaggggctgaacccgacgcgcgccatcggccatatcaagtcgatgttgttgcaacgtaatgcgtaaaccgtaggcctgataagacgcgcaagcgtcgcatcaggcaaccagtgccggatgcggcgtgaacgccttatccggcctacaagtcattacccgtaggcctgataagcgcagcgcatcaggcgtaacaaagaaatgcaggaaatctttaaaaactgcccctgacactaagacagtttttaaaggttccttcgcgagccactacgtagacaagagctcgcaagtgaaccccggcacgcacatcactgtgcgtggtagtatccacggcgaagtaagcataaaaaagatgcttaagggatcacgatgcagaacagcgctttgaaagcctggttggactcttcttacctctctggcgcaaaccagagctggatagaacagctctatgaagacttcttaaccgatcctgactcggttgacgctaactggcgttcgacgttccagcagttacctggtacgggagtcaaaccggatcaattccactctcaaacgcgtgaatatttccgccgcctggcgaaagacgcttcacgttactcttcaacgatctccgaccctgacaccaatgtgaagcaggttaaagtcctgcagctcattaacgcataccgcttccgtggtcaccagcatgcgaatctcgatccgctgggactgtggcagcaagataaagtggccgatctggatccgtctttccacgatctgaccgaagcagacttccaggagaccttcaacgtcggttcatttgccagcggcaaagaaaccatgaaactcggcgagctgctggaagccctcaagcaaacctactgcggcccgattggtgccgagtatatgcacattaccagcaccgaagaaaaacgctggatccaacagcgtatcgagtctggtcgcgcgactttcaatagcgaagagaaaaaacgcttcttaagcgaactgaccgccgctgaaggtcttgaacgttacctcggcgcaaaattccctggcgcaaaacgcttctcgctggaaggcggtgacgcgttaatcccgatgcttaaagagatgatccgccacgctggcaacagcggcacccgcgaagtggttctcgggatggcgcaccgtggtcgtctgaacgtgctggtgaacgtgctgggtaaaaaaccgcaagacttgttcgacgagttcgccggtaaacataaagaacacctcggcacgggtgacgtgaaataccacatgggcttctcgtctgacttccagaccgatggcggcctggtgcacctggcgctggcgtttaacccgtctcaccttgagattgtaagcccggtagttatcggttctgttcgtgcccgtctggacagacttgatgagccgagcagcaacaaagtgctgccaatcaccatccacggtgacgccgcagtgaccgggcagggcgtggttcaggaaaccctgaacatgtcgaaagcgcgtggttatgaagttggcggtacggtacgtatcgttatcaacaaccaggttggtttcaccacctctaatccgctggatgcccgttctacgccgtactgtactgatatcggtaagatggttcaggccccgattttccacgttaacgcggacgatccggaagccgttgcctttgtgacccgtctggcgctcgatttccgtaacacctttaaacgtgatgtcttcatcgacctggtgtgctaccgccgtcacggccacaacgaagccgacgagccgagcgcaacccagccgctgatgtatcagaaaatcaaaaaacatccgacaccgcgcaaaatctacgctgacaagctggagcaggaaaaagtggcgacgctggaagatgccaccgagatggttaacctgtaccgcgatgcgctggatgctggcgattgcgtagtggcagagtggcgtccgatgaacatgcactctttcacctggtcgccgtacctcaaccacgaatgggacgaagagtacccgaacaaagttgagatgaagcgcctgcaggagctggcgaaacgcatcagcacggtgccggaagcagttgaaatgcagtctcgcgttgccaagatttatggcgatcgccaggcgatggctgccggtgagaaactgttcgactggggcggtgcggaaaacctcgcttacgccacgctggttgatgaaggcattccggttcgcctgtcgggtgaagactccggtcgcggtaccttcttccaccgccacgcggtgatccacaaccagtctaacggttccacttacacgccgctgcaacatatccataacgggcagggcgcgttccgtgtctgggactccgtactgtctgaagaagcagtgctggcgtttgaatatggttatgccaccgcagaaccacgcactctgaccatctgggaagcgcagttcggtgacttcgccaacggtgcgcaggtggttatcgaccagttcatctcctctggcgaacagaaatggggccggatgtgtggtctggtgatgttgctgccgcacggttacgaagggcaggggccggagcactcctccgcgcgtctggaacgttatctgcaactttgtgctgagcaaaacatgcaggtttgcgtaccgtctaccccggcacaggtttaccacatgctgcgtcgtcaggcgctgcgcgggatgcgtcgtccgctggtcgtgatgtcgccgaaatccctgctgcgtcatccgctggcggtttccagcctcgaagaactggcgaacggcaccttcctgccagccatcggtgaaatcgacgagcttgatccgaagggcgtgaagcgcgtagtgatgtgttctggtaaggtttattacgacctgctggaacagcgtcgtaagaacaatcaacacgatgtcgccattgtgcgtatcgagcaactctacccgttcccgcataaagcgatgcaggaagtgttgcagcagtttgctcacgtcaaggattttgtctggtgccaggaagagccgctcaaccagggcgcatggtactgcagccagcatcatttccgtgaagtgattccgtttggggcttctctgcgttatgcaggccgcccggcctccgcctctccggcggtagggtatatgtccgttcaccagaaacagcaacaagatctggttaatgacgcgctgaacgtcgaataaataaaggatacacaatgagtagcgtagatattctggtccctgacctgcctgaatccgtagccgatgccaccgtcgcaacctggcataaaaaacccggcgacgcagtcgtacgtgatgaagtgctggtagaaatcgaaactgacaaagtggtactggaagtaccggcatcagcagacggcattctggatgcggttctggaagatgaaggtacaacggtaacgtctcgtcagatccttggtcgcctgcgtgaaggcaacagcgccggtaaagaaaccagcgccaaatctgaagagaaagcgtccactccggcgcaacgccagcaggcgtctctggaagagcaaaacaacgatgcgttaagcccggcgatccgtcgcctgctggctgaacacaatctcgacgccagcgccattaaaggcaccggtgtgggtggtcgtctgactcgtgaagatgtggaaaaacatctggcgaaagccccggcgaaagagtctgctc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配列番号2.ゲノムコンテキストの配列E.coli BW251 13 AsucAD。
ccggtcaggcactgactgtgaatgagaaaggcgaagatgtggttgttccgggactgtttgccgttggtgaaatcgcttgtgtatcggtacacggcgctaaccgtctgggcggcaactcgctgctggacctggtggtctttggtcgcgcggcaggtctgcatctgcaagagtctatcgccgagcagggcgcactgcgcgatgccagcgagtctgatgttgaagcgtctctggatcgcctgaaccgctggaacaataatcgtaacggtgaagatccggtggcgatccgtaaagcgctgcaagaatgtatgcagcataacttctcggtcttccgtgaaggtgatgcgatggcgaaagggcttgagcagttgaaagtgatccgcgagcgtctgaaaaatgcccgtctggatgacacttccagcgagttcaacacccagcgcgttgagtgcctggaactggataacctgatggaaacggcgtatgcaacggctgtttctgccaacttccgtaccgaaagccgtggcgcgcatagccgcttcgacttcccggatcgtgatgatgaaaactggctgtgccactccctgtatctgccagagtcggaatccatgacgcgccgaagcgtcaacatggaaccgaaactgcgcccggcattcccgccgaagattcgtacttactaatgcggagacaggaaaatgagactcgagttttcaatttatcgctataacccggatgttgatgatgctccgcgtatgcaggattacaccctggaagcggatgaaggtcgcgacatgatgctgctggatgcgcttatccagctaaaagagaaagatcccagcctgtcgttccgccgctcctgccgtgaaggtgtgtgcggttccgacggtctgaacatgaacggcaagaatggtctggcctgtattaccccgatttcggcactcaaccagccgggcaagaagattgtgattcgcccgctgccaggtttaccggtgatccgcgatttggtggtagacatgggacaattctatgcgcaatatgagaaaattaagccttacctgttgaataatggacaaaatccgccagctcgcgagcatttacagatgccagagcagcgcgaaaaactcgacgggctgtatgaatgtattctctgcgcatgttgttcaacctcttgtccgtctttctggtggaatcccgataagtttatcggcccggcaggcttgttagcggcatatcgtttcctgattgatagccgtgataccgagactgacagccgcctcgacggtttgagtgatgcattcagcgtattccgctgtcacagcatcatgaactgcgtcagtgtatgtccgaaggggctgaacccgacgcgcgccatcggccatatcaagtcgatgttgttgcaacgtaatgcgtaaaccgtaggcctgataagacgcgcaagcgtcgcatcaggcaaccagtgccggatgcggcgtgaacgccttatccggcctacaagtcattacccgtaggcctgataagcgcagcgcatcaggcgtaacaaagaaatgcaggaaatctttaaaaactgcccctgacactaagacagtttttaaaggttccttcgcgagccactacgtagacaagagctcgcaagtgaaccccggcacgcacatcactgtgcgtggtagtatccacggcgaagtaagcataaaaaagatgcttaagggatcacgagtgtaggctggagctgcttcgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaacttcaagatccccttattagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatgcgaaacgatcctcatcctgtctcttgatcagatcttgatcccctgcgccatcagatccttggcggcaagaaagccatccagtttactttgcagggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccggttcgcttgctgtccataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgctttctctttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatccggggtcagcaccgtttctgcggactggctttctacgtgttccgcttcctttagcagcccttgcgccctgagtgcttgcggcagcgtgagcttcaaaagcgctctgaagttcctatactttctagagaataggaacttcgaactgcaggtcgacggatccccggaattaattctcatgtttgacagaaaggatacacaatgagtagcgtagatattctggtccctgacctgcctgaatccgtagccgatgccaccgtcgcaacctggcataaaaaacccggcgacgcagtcgtacgtgatgaagtgctggtagaaatcgaaactgacaaagtggtactggaagtaccggcatcagcagacggcattctggatgcggttctggaagatgaaggtacaacggtaacgtctcgtcagatccttggtcgcctgcgtgaaggcaacagcgccggtaaagaaaccagcgccaaatctgaagagaaagcgtccactccggcgcaacgccagcaggcgtctctggaagagcaaaacaacgatgcgttaagcccggcgatccgtcgcctgctggctgaacacaatctcgacgccagcgccattaaaggcaccggtgtgggtggtcgtctgactcgtgaagatgtggaaaaacatctggcgaaagccccggcgaaagagtctgctccggcagcggctgctccggcggcgcaaccggctctggctgcacgtagtgaaaaacgtgtcccgatgactcgcctgcgtaagcgtgtggcagagcgtctgctggaagcgaaaaactccaccgccatgctgaccacgttcaacgaagtcaacatgaagccgattatggatctgcgtaagcagtacggtgaagcgtttgaaaaacgccacggcatccgtctgggctttatgtccttctacgtgaaagcggtggttgaagccctgaaacgttacccggaagtgaacgcttctatcgacggcgatgacgtggtttaccacaactatttcgacgtcagcatggcggtttctacgccgcgcggcctggtgacgccggttctgcgtgatgtcgataccctcggcatggcagacatcgagaagaaaatcaaagagctggcagtcaaaggccgtgacggcaagctgaccgttgaagatctgaccggtggtaacttcaccatcaccaacggtggtgtgttcggttccctgatgtctacgccgatcatcaacccgccgcagagcgcaattctgggtatgcacgctatcaaagatcgtccgatggcggtgaatggtcaggttgagatcctgccgatgatgtacctggcgctgtcctacgatcaccgtctgatcgatggtcgcgaatccgtgggcttcctggtaacgatcaaagagttgctggaagatccgacgcgtctgctgctggacgtgtagtagtttaagtttcacctgcactgtagaccggataaggcattatcgccttctccggcaattgaagcctgatgcgacgctgacgcgtcttatcaggcctacgggaccaccaatgtaggtcggataaggcgcaagcgccgcatccgacaagcgatgcctgatgtgacgtttaacgtgtcttatcaggcctacgggtgaccgacaatgcccggaagcgatacgaaatattcggtctacggtttaaaagataacgattactgaaggatggacagaacacatgaacttacatgaatatcaggcaaaacaactttttgcccgctatggcttaccagcaccggtgggttatgcctgtactactccgcgcgaagcagaagaagccgcttcaaaaatcggtgccggtccgtgggtagtgaaatgtcaggttcacgctggtggccgcggtaaagcgggcggtgtgaaagttgtaaacagcaaagaagacatccgtgcttttgcagaaaactggctgggcaagcgtctggtaacgtatcaaacagatgccaatggccaaccggttaaccagattctggttgaagcagcgaccgatatcgctaaagagctgtatctcggtgccgttgttgaccgtagttcccgtcgtgtggtctttatggcctccaccgaaggcggcgtggaaatcgaaaaagtggcggaagaaactccgcacctgatccataaagttgcgcttgatccgctgactggcccga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配列番号3.ゲノムコンテキストの配列E.coli BW251 13 AsucABCD
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配列番号4.非選択培地でのプラスミド保持の試験に使用された、プラスミドpDVK−SucADの配列
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配列番号5.非選択培地でのプラスミド保持の試験に使用された、プラスミドpDVK−SucABCDの配列
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配列番号6.モジュラークローニングシステムで簡単にクローニングできるように設計されたpDvSベクターの配列。抗生物質耐性マーカーの代わりに、sucAD遺伝子ペアを含有する。
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配列番号7.モジュラークローニングシステムで簡単にクローニングできるように設計されたpDvQベクターの配列。抗生物質耐性マーカーの代わりにネイティブ5 ’UTRを含むsucABCDオペロン全体を含有している。
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配列番号8.pDvSベクターにクローン化された緑色蛍光タンパク質をコードする配列を含有するプラスミドpDvS−GFPの配列
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配列番号9.pDvQベクターにクローン化された緑色蛍光タンパク質をコードする配列を含有するプラスミドpDvQ−GFPの配列
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配列番号10.非選択培地でのプラスミド保持の試験に使用された、プラスミドpDvK−SucBCの配列
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Claims (35)
- 形質転換された細菌宿主細胞であって、
i)少なくとも1つの目的のタンパク質をコードする染色体外DNA配列であって、その発現は調節され、少なくとも1つの染色体外要素と作動可能に関連している、染色体外DNA配列と、
ii)前記細菌宿主細胞から除去された少なくとも1つの必要なコハク酸経路遺伝子をコードするDNA配列と、を含有し、
iii)そのような配列がプラスミドに含有される目的のDNA配列に相補的であり、
iv)両方のDNA配列が前記DNA配列のリボソーム結合部位の上流または下流に配置されている、細菌宿主細胞。 - 前記DNA配列が前記細胞にとって外来性である、請求項1に記載の細菌細胞。
- 前記染色体外DNA配列が2つ以上の目的のポリペプチドをコードする、請求項1に記載の細菌細胞。
- 前記染色体外DNA配列が、各々が前記細胞の中央代謝に必須である2つ以上の必須コハク酸経路遺伝子をコードする、請求項1に記載の細菌細胞。
- 前記外来DNA配列がプロモーターの制御下にある、請求項1に記載の細菌細胞。
- 前記染色体外要素がプラスミドである、請求項1に記載の細菌細胞。
- 複製起点がpBR322、pMBl、ColEl、pSClOlまたはpl5Aに由来する、請求項6に記載のプラスミド。
- 請求項1に記載の細菌細胞を含む形質転換された微生物宿主細胞において2つ以上のプラスミドを維持する方法であって、利用される各プラスミドが前記必要なコハク酸経路遺伝子のうちの少なくとも1つを含有し、前記形質転換された細菌細胞が、前記細胞が増殖するのを可能にするのに十分な条件の存在下にある場合、前記プラスミドのうちの少なくとも1つがタンパク質産物を発現することができる目的の遺伝子を集合的に含有する、方法。
- 形質転換された細菌宿主で目的の組換えタンパク質を産生するプロセスであって、
a)少なくとも1つの組換えプラスミドを前記細菌宿主細胞に導入することであって、前記組換えプラスミドは、前記宿主細胞の生存に不可欠である必須コハク酸経路遺伝子をコードし、タンパク質産物をコードする少なくとも1つの目的の遺伝子をもコードする遺伝子の全部または一部を含むクローン化DNA配列を含む、導入することと、
b)前記組換えプラスミドを含有する前記形質転換された宿主の生存コロニーを選択することと、
c)細菌コロニーを発酵させるために前記生存コロニーを使用して、前記タンパク質産物の発現を可能にすることと、を含む、プロセス。 - 前記組換えタンパク質産物が、精製、単離または標識付けを最適化するアミノ酸配列をさらに含む、請求項9に記載のタンパク質産物。
- 前記必須遺伝子が、目的のDNA配列を含有するプロモーターに作動可能に連結されている、請求項9に記載の細菌細胞。
- 前記必須遺伝子に連結された前記プロモーターが誘導性である、請求項11に記載の細菌細胞。
- 前記誘導性プロモーターが、外来DNA配列を制御するいずれの他の誘導性プロモーターからも独立している、請求項12に記載の細菌細胞。
- 前記DNA配列ii)が、前記DNA配列i)の前記リボソーム結合部位と開始コドンとの間に挿入される、請求項1に記載の細菌細胞。
- 前記DNA配列i)および前記DNA配列ii)が転写的に結合している、請求項1に記載の細菌細胞。
- 前記細胞が、Escherichia coli細胞、Corynebacterium種、Vibrio種、Escherichia種、Enterobacter種、Citrobacter種、Erwinia種、Bacillus種、Pseudomonas種、Cyanobacteria種、Salmonella種およびKlebsiella種を含む群から選択される、請求項15に記載の細菌細胞。
- 前記プラスミドが、タンパク質産物をコードする第2の目的の遺伝子をさらに含有する、請求項16に記載の宿主ベクターシステム。
- 前記DNA配列ii)が、前記i)のDNA配列の前記リボソーム結合部位の上流または下流、前記マーカー遺伝子の開始コドンの上流、およびプロモーターの下流に配置される、請求項1に記載の細菌細胞。
- 前記マーカー遺伝子が、前記細胞の中央代謝に必須のマーカー遺伝子である、請求項18に記載の細菌細胞。
- 微生物宿主細胞への導入時に、前記宿主細胞が、少なくとも1つの所望の外来ポリペプチドおよび前記細胞コハク酸経路に不可欠な少なくとも1つの遺伝子をコードするDNAの前記発現をもたらすことができるようにする二本鎖DNAプラスミドであって、下記の、
a)少なくとも1つの目的のプロモーターを含むDNAと、
b)少なくとも1つの目的のポリペプチドをコードする第1のDNA配列と、
c)前記細胞コハク酸経路の機能性に不可欠な少なくとも1つの遺伝子であって、前記微生物宿主細胞においてそのような遺伝子が除去または非機能化された細胞コハク酸経路の機能に不可欠な少なくとも1つの遺伝子をコードする第2のDNA配列と、
d)開始コドンと、を含む、二本鎖DNAプラスミド。 - 前記宿主細胞における自律複製が可能な細菌プラスミドからの複製起点を含むDNA配列と、前記プラスミドが前記微生物宿主細胞に存在する場合に発現される目的のタンパク質産物に関連する遺伝子を含有するDNA配列とをさらに含む、請求項20に記載の二本鎖DNAプラスミド。
- 前記第1のコード配列が目的のポリペプチドをコードする、請求項21に記載の組換え宿主細胞。
- 前記少なくとも1つの目的のポリペプチドの発現が、少なくとも1つの目的のタンパク質の産生をもたらす、請求項20に記載の組換え宿主細胞。
- 前記腸内細菌がBacillus細胞である、請求項16に記載の組換え宿主細胞。
- 前記腸内細菌がEscherichia coli細胞である、請求項16に記載の組換え宿主細胞。
- 前記腸内細菌がCorneybacterium細胞である、請求項16に記載の組換え宿主細胞。
- 前記組換え宿主細胞から除去された少なくとも1つの必要なコハク酸経路遺伝子をコードする前記DNA配列が、1つ以上のコハク酸経路遺伝子をコードする1つ以上の染色体遺伝子の活性を低下または排除する欠失、破壊または突然変異によって機能的に除去される、請求項1に記載の組換え宿主細胞。
- プロモーターに作動可能に連結された前記コハク酸経路の少なくとも1つの必要な遺伝子を含有する少なくとも1つのプラスミドをさらに含み、前記プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を欠き、ジアミノピメリン酸の存在下で増殖したとき、前記プラスミドは前記単離され形質転換された微生物宿主細胞において安定して維持される、請求項27に記載の組換え宿主細胞。
- 前記増殖条件が好気性または微好気性である、請求項28に記載の組換え宿主細胞。
- 前記増殖条件が嫌気性である、請求項28に記載の組換え宿主細胞。
- それぞれが前記細胞の前記生存に不可欠であり、それぞれがプロモーターに作動可能に連結された前記コハク酸経路の少なくとも1つの異なる遺伝子をそれぞれが含有する4つのプラスミドをさらに含み、それぞれの前記プラスミドが、抗生物質耐性遺伝子を欠き、前記プラスミドは安定して維持される、請求項27に記載の組換え宿主細胞。
- 四重のsucABCD欠失を有する細胞をさらに含み、前記除去された生来のコハク酸遺伝子のそれぞれが前記プラスミドのうちの少なくとも1つに含有される、請求項27に記載の組換え宿主。
- 前記第1のプラスミドがsucADの前記DNA配列をコードし、前記第2のプラスミドがsucBCの前記DNA配列をコードする、請求項32に記載の組換え宿主。
- 前記第1のプラスミドがsucACの前記DNA配列をコードし、前記第2のプラスミドが目的の前記ポリペプチドをコードし、sucBDの前記DNA配列を有する、請求項32に記載の組換え宿主。
- 目的のタンパク質をコードする前記DNA配列を含有する、2つの前記プラスミドのそれぞれをさらに含む、請求項33または34に記載の組換え宿主細胞。
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