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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung bakterieller
Biomasse, die superspiralisierte Nukleinsäuren enthält. Die Kultivierung der transformierten
Bakterienzellen zu hohen Zelldichten wird im Satzverfahren in einem
definierten, synthetischen wäßrigen Medium
durchgeführt,
welches keine komplexen Bestandteile und/oder Bestandteile enthält, die
aus Tieren gewonnen werden. Die aus den Bakterienzellen isolierten und
gereinigten Nukleinsäuren
sind zur Verwendung in nicht-viraler Gentherapie, Zelltherapie oder
genetischer Impfung geeignet.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Produktion von Nukleinsäuren
hat durch die Verwendung dieser Biomoleküle als Transportsysteme (Vektoren)
für therapeutische
Gene in modernen Therapieformen wie Zelltherapie, Gentherapie oder
genetische Impfung (DNA-Vakzinierung) große Bedeutung erlangt. Zahlreiche
Nukleinsäure-Vakzine
und Gentherapeutika werden derzeit in klinischen Studien getestet.
Bei diesen Therapieformen werden Nukleinsäuren als nicht-virale Vektoren eingesetzt.
Der Gentransfer kann durch direkte Injektion der Nukleinsäuren in
Gewebe bzw. Zellen oder mit Hilfe einer Gene Gun erfolgen. Die DNA
kann dabei als „nackte” Nukleinsäure vorliegen
oder in Formulierung mit anderen Substanzen (z. B. Liposomen), die
den Gentransfer bzw. die Effizienz erhöhen.
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Mikroorganismen
besitzen die Eigenschaft, extra-chromosomale, zirkuläre Nukleinsäuren, wie beispielsweise
Plasmide oder Cosmide replizieren zu können. Diese Eigenschaft kann
zur Herstellung der Nukleinsäuren
in großen
Mengen genutzt werden.
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Plasmide
sind extrachromosomale, meist zirkuläre, doppelsträngige DNA
Moleküle.
Sie haben eine Größe zwischen
ca. 200 und 100.000 Basenpaaren (Bp), existieren in den Zellen neben
dem bakteriellen Chromosom und werden autonom von diesem repliziert.
Plasmide liegen oft in mehreren Kopien pro Zelle vor. Ihre Anzahl
variiert zwischen 2 bis 20 Kopien pro Zelle (low-copy Plasmide)
oder mehreren hundert Kopien pro Zelle (high-copy Plasmide).
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Die
zusätzliche
genetische Information durch die Plasmide verleiht dem Wirtsorganismus
einen Selektionsvorteil gegenüber
plasmidfreien Zellen, wie z. B. die Resistenz gegen ein Antibiotikum.
In der Biotechnologie finden Plasmide zahlreiche Anwendungen als
Klonierungs- und Expressionsvektoren. Sie besitzen ein Replikationssystem,
ein oder mehrere Selektionsmarkergene und einen Klonierungsabschnitt
zur Aufnahme fremder Genabschnitte.
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Die
Produktion großer
Mengen dieser Nukleinsäuren
in hoher Qualität
erlangt durch die zunehmende Verwendung der Nukleinsäuren in
prä-klinischen,
klinischen oder veterinärmedizinischen
Anwendungen der Zell- und Gentherapie bzw. DNA-Vakzinierung ein
besonderes Interesse.
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Verfahren
zur Herstellung von Plasmid DNA durch Bakterienkultur und nachfolgende
Isolierung der DNA sind aus dem Stand der Technik bekannt, und werden
zum Beispiel in Hecker et al. (
DD 239 222 A1 ) und Schmidt et al. (
WO 99/6163 A2 )
beschrieben.
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Zur
Produktion von bakterieller Biomasse zur Herstellung von Nukleinsäuren von
pharmazeutischer Qualität
werden die Bakterienzellen auf Nährmedien
zu hohen Zelldichten bei gleichzeitiger hoher Produktkonzentration
in den Zellen und hoher Qualität
des Produktes herangezogen. Die hierbei verwendeten Medien bestehen
aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, sowie einer Mineralsalzmischung.
In Verfahren aus dem Stand der Technik werden Nährmedien verwendet, deren Kohlenstoff-
und/oder Stickstoffquellen ein oder mehrere nicht-definierte komplexe
Bestandteile sind, wie Extrakte oder Hydrolysate von Naturprodukten
(siehe beispielsweise Wan et al.,
US005487986 A (1996) oder Rainikainen et al.,
Biotechnol. Bioeng. 33 (1989), 386–393, O'Kennedy et al., J. Biotechnol. 76 (2000),
175–183). Im
Stand der Technik werden auch Nährmedien
verwendet die Komponenten aus tierischen Quellen enthalten. Auch
andere mögliche
toxische Substanzen können
durch die nicht-definierten, komplexen Komponenten in das Nährmedium
und damit in Kontakt mit dem Nukleinsäureprodukt gelangen. Außerdem variiert
die Bildung von Biomasse und Produkt stark mit der Zusammensetzung
und Qualität
der verwendeten komplexen Komponente, die von Charge zu Charge verschieden
sein können.
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Während der
Kultivierung werden durch die Verstoffwechselung der Medienkomponenten
Biomasse, das Produkt als Teil der Zellmasse und zusätzlich Stoffwechselenergie
erzeugt. Bei Verfahren aus dem Stand der Technik werden auch hohe
Substratkonzentrationen zu Beginn der Kultivierung vorgelegt, um
hohe Biomasse- und Produktkonzentrationen zu erzeugen. Es werden
aber stattdessen wachstums- und produktbildungsinhibierende Stoffwechselkomponenten,
wie Acetat gebildet (siehe Kleman et al., Appl. Environ. Microbiol.
60 (1994), 3952–3958).
Die Bildung dieser unerwünschten Stoffwechselnebenprodukte
wird beim Stand der Technik durch die Anwendung sogenannter Zulaufkultivierungsverfahren
umgangen. Hierbei werden die Substrate zu Beginn der Kultivierung
in geringeren Konzentrationen vorgelegt. Nach dem Verbrauch dieser
Substrate erfolgt ein Zulauf von frischem, konzentrierten Nährmedium,
der kontinuierlich oder geregelt erfolgen kann (siehe beispielsweise
Chen et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 18 (1997), 43–48; Lahijani
et al., Hum. Gen. Ther. 7 (1996), 1971–1980; Schmidt et al.
WO 99/61633 A2 (1999)).
Der entscheidende Nachteil dieser Zulaufverfahren besteht in der
aufwendigen, technischen Umsetzung der Steuerungs- und Regelungsverfahren
für den
Zulauf von Medium. Außerdem
wird durch den Wechsel zwischen Substratüberschuß und Substratmangel ein physiologischer
Stress auf die Bakterienzellen ausgeübt, der sich negativ auf den
Produktbildungsprozess auswirken kann.
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Es
war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren
zur Herstellung von Nukleinsäuren,
insbesondere superspiralisierten Nukleinsäuren, von pharmazeutischer
Qualität
bereitzustellen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gelöst wird
die Aufgabe durch das erfindungsgemäße Verfahren, das bei der Herstellung von
Nukleinsäuren
auf komplexe Nährmedienbestandteile
vollständig
verzichtet. Das erfindungsgemäße Verfahren
zur Herstellung von Nukleinsäuren umfasst
die Kultivierung von die Nukleinsäure enthaltenen Bakterienzellen
in einem Medium ohne komplexe Bestandteile und die Isolierung der
Nukleinsäuren,
wobei das Medium ohne komplexe Bestandteile die folgenden synthetischen
Bestandteil umfasst:
- (aa) organische Kohlenstoffquelle,
- (ab) anorganische Stickstoffquelle
- (ac) Mineralsalzmischung und
- (ad) eine zusätzliche,
definierte stickstoff-haltige Komponente, die den Produktstoffwechsel
der Bakterienzellen verstärkt,
wobei die zusätzliche, definierte
stickstoff-haltige Komponente vorzugsweise ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus: Aspartat, Glutamat, Glutamin, Glycin,
Adenosin, Cytosin, Guanin, Thymin, oder Harnstoff bzw. die Phosphate
dieser Verbindungen, wobei die Konzentration der zusätzlichen,
definierten, stickstoff-haltigen Komponente im Medium 25-1000 mM
ist.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
läßt sich besonders
vorteilhaft im Satzverfahren durchführen und führt bei hohen Nährstoffkonzentrationen
zu großen
Produktmengen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
die Herstellung von Nukleinsäuren,
insbesondere superspiralisierten Nukleinsäuren in großen Mengen und gewährleistet
Nukleinsäuren
in hoher Qualität,
die in prä-klinischen,
klinischen oder veterinärmedizinischen
Anwendungen der Zell- und Gentherapie bzw. DNA-Vakzinierung eingesetzt
werden können.
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Vorzugsweise
liegen superspiralisierte Nukleinsäuren zu mindestens 70–90%, insbesondere
zu mehr als 90% in der superspiralisierten ccc-Form vor. Bei der
ccc-Form (covalently closed circular) handelt es sich um eine kompakte,
kovalent-geschlossene zirkuläre
Nukleinsäurestruktur,
die in Mikroorganismen durch Topoisomerasen erzeugt wird.
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Insbesondere
werden durch das erfindungsgemäße Verfahren
Kontaminationen durch unerwünschte
Substanzen, die schwer nachzuweisen sind und damit in das Nährmedium
gelangen, vermieden, was z. B. im Zuge der BSE-Problematik von elementarer
Bedeutung ist.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
verzichtet ganz auf den Einsatz komplexer Bestandteile.
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Die
Konzentrationen der Bestandteile im Medium betragen für die organische
Kohlenstoffquelle 1 bis 500 g/L, vorzugsweise 10 bis 300 g/L und
insbesondere 50 bis 100 g/L, für
die anorganische Stickstoffquelle 10 bis 200 mM, vorzugsweise 20
bis 80 mM und insbesondere 40 mM und für die zusätzliche, definierte stickstoff-haltige
Komponente 25 bis 1000 mM, vorzugsweise 50 bis 250 mM.
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Die
zusätzliche,
definierte stickstoff-haltige Komponente, die den Produktstoffwechsel
verstärkt, ist
eine Vorstufe in der Biosynthese der Nukleotidbasen der Nukleinsäuren.
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Auch
bei der zusätzlichen
stickstoff-haltige Komponente handelt es sich um eine nicht komplexen
Bestandteil.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt daher ein Verfahren zur Herstellung
von Nukleinsäuren. Dabei
wird die Kultivierung der transformierten Bakterienzellen in einem Medium,
vorzugsweise im Satzverfahren (= Satzkultivierungsverfahren) durchgeführt, welches
keine komplexen Bestandteile enthält.
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Ein
Satzkultivierungsverfahren ist ein diskontinuierliches Kultivierungsverfahren
bei dem alle Komponenten des Nährmediums
vor dem Zufügen der
Mikroorganismen im Kulturgefäß vorliegen.
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Komplexe
Bestandteile von Nährmedien sind
nicht definierte Naturprodukte bzw. aus diesen gewonnenen Extrakte
zur Kultivierung von Mikroorganismen, wie zum Beispiel Hefeautolysat,
Hefeextrakt, Peptone, Malz- oder Fleischextrakte.
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Die
Kultivierung der transformierten Bakterienzellen erfolgt in einem
Medium, welches die definierten, synthetischen Bestandteile organische
Kohlenstoffquelle, anorganische Stickstoffquelle, Mineralsalzmischung
und eine zusätzliche,
definierte stickstoff-haltige Komponente enthält, die den Produktstoffwechsel
verstärkt.
Während
der Kultivierung produzieren die transformierten Bakterienzellen
Nukleinsäuren.
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Die
besondere Zusammensetzung des voll-synthetischen Mediums ermöglicht die
Kultivierung im Satzprozess zu hohen Zelldichten bzw. Biomassekonzentrationen
(optische Dichte (600 nm) ≥ 75)
in Verbindung mit hohen Produktausbeuten (Plasmidkonzentration ≥ 65 mg/L),
die bisher nur im Rahmen von technisch aufwendigeren Zulaufprozessen
in meist komplexen Medien erreicht wurden. Durch die Verwendung
rein synthetischer Bestandteile und den Verzicht auf komplexe und
tierische Komponenten ist das Medium optimal für die Herstellung von Nukleinsäuren in
pharmazeutischer Qualität
für zum
Beispiel Zell- und Gentherapie oder genetische Impfung geeignet.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von
Nukleinsäuren
insbesondere superspiralisierten Nukleinsäuren, wobei die Kultivierung
der Bakterienzellen vorzugsweise im Satzverfahren erfolgt. Im Satzverfahren
werden von Beginn der Kultivierung an alle Nährstoffquellen den Bakterienzellen
im Medium bereitgestellt. Der Einsatz hoher Substratkonzentrationen
führt jedoch
bei Verfahren, die dem Stand der Technik entsprechen, nicht gleichzeitig
im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung zu hohen Zelldichten und
Produktmengen, weil Stoffwechselprodukte, wie beispielsweise Acetat gebildet
werden, die weiteres Zellwachstum inhibieren (siehe zum Beispiel
Kleman et al., Appl. Environ. Microbiol. 60 (1994), 3952–3958).
Deshalb können zur
Vermeidung von Substratinhibierung bei Kultivierungen zu hohen Zelldichten
sogenannte Zulaufverfahren eingesetzt werden, bei denen den Bakterienzellen
am Anfang der Kultivierung nur geringe Mengen an Nährstoffen
zur Verfügung
stehen und bei Verbrauch dieser Nährstoffe frisches Medium zuläuft. Diese
Zulaufverfahren sind bekannt und entsprechen dem Stand der Technik
(siehe zum Beispiel Chen et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol.
18 (1997), 43–48, Lahijani
et al., Hum. Gen. Ther. 7 (1996), 1971–1980, Schmidt et al.
WO 99/61633 A2 )
(1999)). Nachteile dieser Verfahren sind die aufwendige, technische Umsetzung
der Steuerung bzw. Regelung des Zulaufes von frischen Medium, der
physiologische Stress den die Bakterienzellen durch abwechselnde
Substratüberschuss-
und Substratmangelbedingungen ausgesetzt sind, die Verwendung komplexer,
nicht definierter Mediumsbestandteile oder die geringen Plasmidmengen
innerhalb der Bakterienzellen (Plasmidmassenanteil). Die ausgewogene
Zusammensetzung des Nährmediums
der vorliegenden Erfindung ermöglicht
die Kultivierung im Satzverfahren zu hohen Zelldichten mit gleichzeitig
hoher Produktkonzentration bzw. hohen Plasmidmassenanteil ohne das
wachstums-inhibierende Stoffwechselnebenprodukte gebildet werden.
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Ein
besonderer Vorteil der Erfindung ist, dass das Medium zur Kultivierung
der Bakterienzellen keine komplexen, nicht definierten Bestandteile
enthält wie
beispielsweise Hefeextrakte, Peptone oder Tierhydrolysate bzw. andere
Bestandteile, die aus Tieren gewonnen werden, die bei Verfahren
gemäß dem Stand
der Technik verwendet werden (siehe zum Beispiel Wan et al.,
US005487986 A (1996),
O'Kennedy et al.,
J. Biotechnol. 76 (2000), 175–183).
Komplexe Medienbestandteile können
mit unerwünschten
Substanzen verunreinigt sein, die schwer nachzuweisen sind und damit
in das Nährmedium
gelangen. Im Zuge der BSE-Problematik ist der vollkommene Verzicht
auf tierische Komponenten bei der Produktion von Pharmazeutika sehr
vorteilhaft.
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Ein
anderer Nachteil bei der Verwendung komplexer Medienbestandteile
betrifft die unterschiedliche Qualität des Ausgangsmaterials. Von Charge
zu Charge können
große
Unterschiede in der Zusammensetzung auftreten, so dass die Kultivierung
nicht reproduzierbar durchgeführt
werden kann. Deshalb ist ein das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung
von plasmidhaltiger Biomasse in einem synthetischen Medium dem Stand
der Technik überlegen.
Die definierten Bestandteile, die synthetisch hergestellt werden,
können
in höchster
Reinheit ohne Verunreinigung mit unerwünschten Substanzen eingesetzt
werden und variieren auch nicht in ihrer Zusammensetzung.
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Die
ausgewogene Zusammensetzung des definierten, synthetischen Mediums
aus organischer Kohlenstoffquelle, anorganischer Stickstoffquelle, Mineralsalzmischung
und einer zusätzlichen,
definierten stickstoff-haltigen Komponente, die den Produktstoffwechsel
verstärkt,
ist ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens und erlaubt
es den transformierten Bakterienzellen, die Substrate zu verstoffwechseln
und Nukleinsäuren
in großen
Mengen zu produzieren, ohne das wachstums-inhibierende Nebenprodukte
gebildet werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden die Bakterienzellen aus dem Kultivierungsmedium
isoliert. Dieses kann durch Filtration, Zentrifugation oder anderen
Methoden geschehen, die dem Stand der Technik entsprechen. Nach
der Isolierung können
die Bakterienzellen zusätzlich
noch mit einer Flüssigkeit
gewaschen werden, die die Zellen nicht verändert, um Reste des Kultivierungsmedium
zu entfernen.
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Die
Nukleinsäuren
werden innerhalb der Bakterienzellen produziert. Deshalb werden
in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die
Nukleinsäuren
aus den Bakterienzellen isoliert und von den Zellen und anderen
Zellinhaltsstoffen gereinigt. Die Zelllyse und die Reinigung kann
dabei durch im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, wie alkalische
Lyse mit anschließendem Chromatographie-Schritt
erfolgen (sieh zum Beispiel Marquet et al., Biopharm 8 (1995), 26–37) oder
Colpan et al.,
US 5990301
A1 , 1999 oder Ferreira et al., J. Mol. Recogn. 11 (1998),
250–251
oder Green et al., Biopharm 10 (1997), 52–62)). Mit Hilfe dieser Verfahren
können
die Nukleinsäuren
in pharmazeutischer Qualität
isoliert werden, so dass sie als Wirkstoff in Zell- bzw. Gentherapie
und genetischer Impfung verwendet werden können.
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In
einer anderen bevorzugten Verkörperung der
Methode der Erfindung werden die Zellen nach der Kultivierung eingefroren
oder gefriergetrocknet. Dieses ist sehr nützlich, wenn eine sofortige
Isolierung und Reinigung der Nukleinsäuren nicht gewünscht ist
und die Bakterienzellen längere
Zeit gelagert werden sollen.
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Die
Bakterienzellen können
gram-positiv oder gram-negativ sein. In einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung sind die transformierten Bakterienzellen
Escherichia coli-Zellen. Insbesondere wird ein E. coli K12-Stamm
mit Gentyp recA– oder recA1 verwendet.
Diese Bakterienstämme produzieren
sehr homogene Nukleinsäuren.
Deshalb ist ein großer
Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahren,
dass die Nukleinsäuren
in den Zellen superspiralsiert sind, insbesondere zu mehr als 90%
in der ccc-Form vorliegen. Ein weiterer, entscheidender Vorteil
der Erfindung ist, dass die gereinigten Nukleinsäuren in pharmazeutischer Qualität als Wirkstoff
in Zell- bzw. Gentherapie und genetischer Impfung eingesetzt werden
können.
Es werden bei der Herstellung keine unerwünschten bzw. toxische Substanzen benutzt,
die die Verwendung als Pharmazeutikum in der Klinik ausschließen.
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Ein
entscheidender Vorteil des Verfahrens der Erfindung betrifft die
Tatsache, dass eine Vielzahl von zirkulären Nukleinsäuren, wie
Plasmide, Cosmide oder noch größere Nukleinsäuremoleküle damit hergestellt
werden können.
Die Größe der Moleküle hat dabei
keinen Einfluss auf die Ausbeute oder Qualität der Produkte.
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Die
definierte, organische Kohlenstoffquelle ist vorzugsweise aus der
Gruppe der Monosaccharide, Disaccharide, Polysaccharide oder Polyole,
insbesondere wird Glucose, Maltose, Raffinose, Galactose, Trehalose,
Sucrose, Fructose, Mannose, Sorbose, Fucose, Rhamnose, Arabinose,
Xylose, Ribose, Manitol, Sorbitol oder Glycerin als organische Kohlenstoffquelle
verwendet. In einer bevorzugten Form des erfindungsgemäßen Verfahren
wird die Kohlenstoffquelle im Medium in einer Konzentration im von
1 bis 500 g/L, vorzugsweise 10 bis 300 g/L und insbesondere 50 bis
100 g/L eingesetzt. Die Kohlenstoffquellen können in höchsten Reinheitsstufen chemisch
synthetisiert werden und sind deshalb nicht mit unerwünschten
Substanzen bzw. tierischen Bestandteilen verunreinigt.
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Im
erfindungsgemäßen Verfahren
werden vorzugsweise Ammoniumsalze, wie zum Beispiel Ammoniumchlorid,
Ammoniumphosphate, Ammoniumsulfat oder Ammoniumnitrat bzw. Ammoniak selbst
als anorganische Stickstoffquelle verwendet. Ammoniumionen bilden
in höheren
Konzentrationen zusammen mit Phosphat- und Magnesiumionen, die ebenfalls
in einem definierten, synthetischen Medium enthalten sein können, schwerlösliches
Magnesiumammoniumphosphat. Um während
der Zubereitung des Mediums oder während der Kultivierung die
Bildung dieser Salzausfällung
zu vermeiden, werden die Ammoniumsalze vorzugsweise in einer Konzentration
von 10 bis 200 mM, vorzugsweise 20 bis 80 mM und insbesondere 40
mM eingesetzt.
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Mineralsalze
sind ein wichtiger Bestandteil bakterieller Nährmedien. Im erfindungsgemäßen Verfahren
werden mindestens wasserlösliche
anorganische Phosphaten, Chloride, Natriumsalzen, Kaliumsalze und
Magnesiumsalze, vorzugsweise Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat,
Natriumchlorid und Magnesiumsulfat als Mineralsalzmischung eingesetzt.
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Insbesondere
werden die Salze in den Konzentrationen Kaliumdihydrogenphosphat
1 bis 50 g/L, vorzugsweise 1,5 bis 10 g/L, Dikaliumhydrogenphosphat
1 bis 75 g/L, vorzugsweise 2,3 bis 15 g/L, Natriumchlorid 1 bis
20 g/L, vorzugsweise 2,5 bis 10 g/L und Magnesiumsulfat 0,1 bis
20 g/L, vorzugsweise 0,3 bis 10 g/L.
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In
einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung wird der Mineralsalzmischung zusätzlich noch eine Spurenelement-Lösung bestehend
aus Eisen(III)chlorid, Zinksulfat, Mangansulfat, Kobaltsulfat, Kupferchlorid,
Borsäure,
Natriummolybdat und Zitronensäure
zugesetzt, insbesondere Eisen(III)chlorid in einer Konzentration
von 20 mM, Zinksulfat in einer Konzentration von 5 mM, Mangansulfat
in einer Konzentration von 11 mM, Kobaltsulfat in einer Konzentration
von 2 mM, Kupferchlorid in einer Konzentration von 1 mM, Borsäure in einer
Konzentration von 16 mM, Natriummolybdat in einer Konzentration
von 11 mM und Zitronensäure
in einer Konzentration von 24 mM.
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In
einer weiteren Verkörperung
der Erfindung werden dem Medium wirtsstamm-spezifische Supplementierungen,
z. B. Vitamine oder andere Komponenten, die der verwendete Wirtsstamm
nicht selbst synthetisieren kann, zugesetzt. Zahlreiche Bakterienstämme besitzen
beispielsweise eine Thiamin-Auxotrophie, wie zum Beispiel E. coli
DH1 oder E. coli DH5α,
weshalb bei der Verwendung dieser Wirtsstämme das Vitamin dem Medium
zugesetzt wird.
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Mit
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können in einem definierten synthetischen
Medium im Satzbetrieb große
Mengen Biomasse und Nukleinsäureprodukt
gewonnen werden. Mit Satzkultivierungsverfahren aus dem Stand der
Technik (siehe beispielsweise Wan et al.,
US005487986 A (1996) oder
Rainikainen et al., Biotechnol. Bioeng. 33 (19989), 386–393, O'Kennedy et al., J.
Biotechnol. 76 (2000), 175–183)
werden mit komplexen Nährmedien
deutlich geringere Biomasse- und Nukleinsäureproduktmengen erhalten,
weil die eingesetzten Nährquellen
auch in Stoffwechselprodukte umgewandelt werden, die Bakterienwachstum
und Produktbildung inhibieren können.
Deshalb ist ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
der Einsatz einer zusätzlichen,
definierten stickstoff-haltigen Komponente, die den Produktstoffwechsel
verstärkt.
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Die
zusätzliche,
definierte stickstoff-haltige Komponente ist idealerweise eine Vorstufe
in der Biosynthese der Nukleotidbasen der Nukleinsäuren und
trägt damit
zum Aufbau der Purin- und Pyrimidinbasen im Stoffwechsel der Bakterienzellen
bei.
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Die
zusätzliche
definierte Komponente ist ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus: Aspartat, Glutamat, Glutamin, Glycin,
Adenosin, Cytosin, Guanin, Thymin, oder Harnstoff bzw. die Phosphate dieser
Verbindungen. Die Verwendung dieser Verbindungen ist vorteilhaft,
weil diese chemisch synthetisiert hergestellt werden können. Die
Konzentration der zusätzlichen,
definierten stickstoff-haltigen Komponente im Medium ist 25 bis
1000 mM, vorzugsweise 50 bis 250 mM.
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Ein
besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache,
dass zur Kultivierung der transformierten Bakterienzellen keine
Antibiotika zur Erhöhung
der Plasmidstabilität
dem Medium zugesetzt werden müssen.
Vor allem für
eine Verwendung der gereinigten Nukleinsäuren als Wirkstoff in Zell- und
Gentherapie oder genetischer Impfung ist dieses vorteilhaft.
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In
einer bevorzugten Ausführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
können
die Kohlenstoff- und/oder
die Stickstoffquelle vollständig
verstoffwechselt werden. Die Bakterienzellen können auch vorher vom Medium
getrennt werden, vorteilhafter ist aber eine Trennung nach vollständiger Verstoffwechslung
der Nährquellen,
weil in diesem Fall Biomasse- und Produktkonzentration am höchsten sind.
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Eine
besondere Verkörperung
des Verfahren der Erfindung ist die Durchführung der Kultivierung in einem
temperierbaren Bioreaktor. Dabei wird die Kultivierung in einem
Temperaturbereich von 25–42°C, vorzugsweise
im Bereich von 36–38°C durchgeführt. In
einer besonderen Ausführung
werden die Bakterienzellen während
der Kultivierung durch das Einblasen von Luft in das Medium mit
Sauerstoff versorgt.
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Im
erfindungsgemäßen Verfahren
erfolgt die Kultivierung in einem pH-Bereich von 6,0–8,0, vorzugsweise
im Bereich von 6,5 bis 7,5. Insbesondere wird während der Kultivierung das
pH durch Zugabe einer Säure
und/oder Base geregelt. Außerdem
kann während
der Kultivierung gegebenenfalls Antischaummittel zugegeben werden,
um ein Überschäumen zu
vermeiden.
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Ein
weiterer entscheidender Vorteil des beschriebenen Verfahrens betrifft
die Tatsache, dass schon die Vorkultivierung in einem definierten,
synthetischen Medium erfolgen kann. Damit ist ein Kontakt der Bakterienzellen
mit komplexen Mediumsbestandteilen völlig ausgeschlossen.
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Die
Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Abbildungen erläutert:
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Abbildungen
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Die
Abbildungen zeigen
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1 Gelöstsauerstoffkonzentration
(pO2), Rührerfrequenz
und Kohlendioxidgehalt der Reaktorabluft bei der Kultivierung von
pUK21CMVβ in
E. coli DH5α in
einem definerten, synthetischen Medium mit 2 gL–1 Ammoniumchlorid
im 7 L-Bioreaktor.
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2 Plasmidmassenanteil,
Biotrockenmasse- und Plasmidkonzentration während der Kultivierung von
pUK21CMVβ in
E. coli DH5α in
dem synthetischen Medium im 7 L-Bioreaktor.
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3 Verlauf
der Glutamat-, Glycerin,- Ammonium- und Acetatkonzentration der
Kultivierung von pUK21CMVβ in
E. coli DH5α in
dem synthetischen Medium im 7 L-Bioreaktor.
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4 0,8%iges
Agarosegel der pUK21CMVβ Proben
aus der Kultivierung in dem synthetischen Medium im 7 L-Bioreaktor
(M: λ-DNA, BStE
II geschnitten, R: pUK21CMVβ-Referenz).
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5 Wichtige
Betriebsvariablen bei der Kultivierung von pUT649 in E. coli DH5α in dem synthetischen
Medium mit 2 gL–1 Ammoniumchlorid im 30
L-Bioreaktor.
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6 0,8%iges
Agarosegel der pUT649 Proben der Kultivierung in dem definierten,
synthetischem Medium mit 2 gL–1 Ammoniumchlorid im
30 L-Bioreaktor nach 19 und 22 h (M: λ-DNA, BStE II geschnitten).
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7 Qualitätsanalyse
des Plasmids pUT649 der Kultivierung im 30 L Bioreaktor mittels Kapillargelelektrophorese.
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8 Plasmidkonzentration,
Plasmidmassenanteil und Biotrockenmassekonzentration bei der Kultivierung
von pUK21CMVβ in
E. coli DH5α in
dem synthetischen Medium im 7 L-Bioreaktor.
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9 Glutamat-,
Glycerin,- Ammoniumionen- und Acetatkonzentration im Verlauf der
Kultivierung von pUK21CMVβ in
E. coli DH5α in
dem synthetischen Glycerinmedium im 7 L-Bioreaktor.
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10 Plasmidmassenanteil,
Biotrockenmasse- und Plasmidkonzentration bei der Kultivierung von
E. coli DH5α mit
dem Plasmid pUK21CMVβ in
synthetischem Medium mit 4 gL–1 Ammoniumchlorid im
7 L Bioreaktor.
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11 Satzkultivierung
von E. coli DH5α pUK21CMVβ in M9-Minimalmedium
im 7 L Bioreaktor.
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12 Plasmid-,
Biotrockenmassekonzentration und Plasmidmassenanteil während der
Kultivierung von pUK21CMVβ in
E. coli DH5α im
halbsynthetischem Vollmedium mit Glutamat im 7 L Bioreaktor.
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Die
folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung und
sind nicht in beschränkender
Weise aufzufassen.
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Beispiele
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Beispiel 1: Herstellung des Plasmids pUK21CMVβ durch Bakterienzellen
in einem definierten synthetischem Medium im Satzverfahren in einem
7 L-Bioreaktor
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Zur
Herstellung des 7,6 kBp großen
Plasmids pUK21CMVβ wurde
der E. coli-Stamm DH5α (Clontech,
Heidelberg, Deutschland, Cat.-Nr. C2007-1) verwendet. Das Plasmid
pUK21CMVβ ist ein
pUC21-Abkömmling
mit Kanamycin-Resistenz (siehe Viera et al., Gene 100 (1991), 189–195) und enthält die β-Galactosidase
aus E. coli unter dem CMV(Cytomegalus)-Promotor. Die Kultivierung
wurde in einem 7 L-Bioeaktor (MBR, Wetzikon, Schweiz) in einem wäßrigen,
antibiotika-freien, definierten synthetischen Medium bestehend aus
60 gL–1 Glycerin (87%),
2 gL–1 Ammoniumchlorid,
30 gL–1 Natrium-L-Glutamat,
1,5 gL–1 KH2PO4, 2,3 gL–1 K2HPO4, 2,5 gL–1 NaCl,
5 gL–1 Zitronensäure × H2O, 1,0 gL–1 MgSO4 × 7H2O, 10 mgL–1 Thiaminhydrochlorid
und 2 mLL–1 Spurenelementekonzentrat
durchgeführt.
Das Spurenelementekonzentrat bestand aus 5,4 gL–1 FeCl3 × 6H2O, 1,38 gL–1 ZnSO4 × 7H2O, 1,85 gL–1 MnSO4 × H2O, 0,56 gL–1 CoSO4 × 7H2O, 0,17 gL–1 CuCl2, 1,0 gL–1 H3BO3, 2,5 gL–1 NaMoO4 × 2H2O und 5,0 gL–1 Citronensäure × H2O.
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Alle
Medienkomponenten mit Ausnahme von Magnesiumsulfat, Thiaminhydrochlorid
und der Spurenelementelösung
wurden im Bioreaktor hitzesterilisiert. Das Thiaminhydrochlorid
wurde in Wasser aufgenommen, sterilfiltriert und zur sterilen Spurenelementelösung gegeben.
Das Magnesiumsulfat wurde in Wasser gelöst, separat hitzesterilisiert
und dann ebenfalls zur sterilen Spurenelementelösung gegeben. Die so hergestellte
Mischung aus Spurenelementekonzentrat, Magnesiumsulfat und Thiaminhydrochlorid
wurde über
einen Animpfkolben zum sterilen Medium im Bioreaktor hinzugefügt.
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Zur
Herstellung der Inokulationskultur wurden 200 mL eines sterilen
Mediums mit einer Glycerinkultur von pUK21CMVβ in DH5α beimpft. Nach 8 Stunden Inkubation
auf einem Tischschüttler
bei n = 150 min–1 und einer Temperatur
von T = 37°C
wurden 5 L des sterilen, synthetischen Mediums im 7 L Bioreaktor
mit 50 mL der Inokulationskultur beimpft.
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Die
Kultivierung im Bioreaktor wurde bei 37°C und 0,2 bar Reaktorinnendruck
durchgeführt. Die
Luftzufuhr erfolgte mit 5 Lmin–1 und das pH wurde auf
7,0 durch automatische Zugabe von ortho-Phosphorsäure (10%)
und/oder Ammoniaklösung
(25%) geregelt. Die Drehzahl des Rührers wurde ausgehend von einer
Minimalfrequenz von 150 min–1 durch die Gelöstsauerstoffkonzentration
(pO2) geregelt. Die Probennahme zur Prozesskontrolle
erfolgte im Abstand von 2 Stunden. Dabei wurde die Biotrockenmassekonzentration
und die Plasmidkonzentration mittels Kapillarelektrophorese (siehe
Schmidt et al., J. Biotechnol. 49 (1996), 219–229) nach der Isolierung mit
einem handelsüblichen
Kit nach Vorschrift des Herstellers ermittelt. Weiterhin wurde die
Konzentration von Mediumsbestandteilen verfolgt.
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In 1 ist
der typische Verlauf der wichtigsten Kultivierungsparameter Rührerfrequenz,
Gelöstsauerstoffkonzentration
(pO2) und der Kohlendioxidkonzentration
in der Abluft dargestellt. 2 zeigt
den Verlauf der Biotrockenmasse-, der Plasmidkonzentration und des
Plasmidmassenanteils während
dieser Kultivierung. Die Biotrockenmassekonzentration nahm exponentiell
zu und erreichte einen maximalen Wert von X = 20 gL–1.
Die maximale Produktkonzentration betrug P = 50 mgL–1 bei
einem Plasmidmassenanteil von wp = 3 mgg–1.
Nach 34 Stunden Kultivierungsdauer waren die Substrate Ammoniumstickstoff,
Glutamat und Glycerin vollständig verbraucht
(siehe 3) und die Bakterienzellen erreichten die stationäre Phase,
d. h. es wurde keine weitere Zunahme der Biomasse erhalten. Auch
die maximale Produktkonzentration von P = 50 mgL–1 wurde
zu diesem Zeitpunkt erreicht. Das 0,8%ige Agarosegel der isolierten
Plasmid DNA zu verschiedenen Kultivierungszeitpunkten ist in 4 dargestellt.
Die Plasmid-DNA weist eine sehr hohe Homogenität auf und lag während des
gesamten Kultivierungszeitraums fast ausschließlich in der ccc-Monomerform
(ca. 94%). Aus 5 L Kulturlösung
konnten 250 mg DNA isoliert werden. Diese Produktausbeute ist deutlich
höher als
bisher mit synthetischen Medien im Satzverfahren erhalten wurden
(siehe Beispiel 4).
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Beispiel 2: Herstellung des Plasmids pUT649
durch Bakterienzellen in einem definierten synthetischem Medium
im Satzverfahren in einem 30 L-Bioreaktor
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Zur
Herstellung des 4,6 kBp großen
Plasmids pUT649 (Eurogentec, Liege, Belgien) im Grammmaßstab wurde
das antibiotika-freie, definierte, synthetische Medium, welches
in Beispiel 1 beschrieben ist, verwendet. Als Inokulationskultur
wurden 200 mL eines sterilen Mediums mit einer Glycerinkultur von
pUT649 in E. coli DH5α beimpft.
Nach 8 Stunden Inkubation auf einem Tischschüttler bei n = 150 min–1 und
einer Temperatur von T = 37°C
wurden 20 L des sterilen Mediums, dessen Zusammensetzung in Beispiel
1 beschrieben ist, im 30 L Bioreaktor (MBR, Wetzikon, Schweiz) mit
200 mL der Inokulationskultur beimpft. Die Kultivierung im Bioreaktor
wurde bei 37°C
und 0,2 bar Reaktorinnendruck durchgeführt. Die Luftzufuhr erfolgte
mit 30 Lmin–1 und
das pH wurde auf 7,0 durch automatische Zugabe von ortho-Phosphorsäure und/oder
Ammoniaklösung
geregelt. Die Rührerfrequenz
betrug zu Beginn der Kultivierung n0 = 150
min–1 und
wurde mit Hilfe der Gelöstsauerstoffkonzentration
auf einen Sollwert von 40% geregelt. In 5 sind die
typischen Kultivierungsparameter Rührerfrequenz, Gelöstsauerstoffkonzentration
und der Kohlendioxidgehalt der Reaktorabluft dargestellt. Nach Erreichen
der stationären
Wachstumsphase nach 22 Stunden Kultivierungszeit wurden X = 21,9
gL–1 Biotrockenmasse
und eine sehr hohe Plasmidkonzentration von P = 68 mgL–1 erreicht.
Dies entspricht einem Plasmidmassenanteil von wp =
3,1 mgg–1.
Die isolierte DNA wies eine sehr hohe Homogenität auf, was durch das Agarosegel
in 6 dargestellt ist. Die Qualitätsanalyse der DNA mittels Kapillargelelektrophorese
zeigt, dass mehr als 97% der DNA in der ccc-Monomerform vorliegen. Dieses
Beispiel zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren auf unterschiedliche
Plasmide anwendbar ist und auch einfach in einen größeren Prozessmaßstab übertragen
werden kann. In einem Kultivierungsmaßstab von 20 L können mit
Hilfe der Erfindung 1,3 g sehr homogener Plasmid DNA gewonnen werden.
Die erhaltene Produktkonzentration P = 68 mgL–1 ist
die bislang höchste,
die durch Satzkultivierungsverfahren auf synthetischen Medien erhalten wurde.
Im Stand der Technik werden vergleichbar hohe Produktausbeuten nur
mit Hilfe von Zulaufkultivierungsverfahren erhalten.
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Beispiel 3: Einfluss der Ammoniumkonzentration
bei der Herstellung eines Plasmids durch Bakterienzellen in einem
definierten, synthetischen Medium im Satzverfahren.
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Im
folgenden Beispiel wird der Einfluss der Konzentration der anorganischen
Stickstoffquelle bei der Satzkultivierung von E. coli DH5α mit dem
Plasmid pUK21CMVβ in
dem gleichen synthetischen Medium aus Beispiel 1 und 2 im 7 L-Bioreaktor
illustriert. Die Kultivierung wurde unter gleichen Bedingungen, wie
in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Lediglich die Ammoniumchloridkonzentration
im Medium wurde vor der Kultivierung geändert.
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8 zeigt
den Verlauf der Kultivierung ohne Zusatz von Ammoniumchlorid. Nur
durch die pH-Regulierung wurden geringe Mengen Ammonik dem Medium
zugeführt.
Die Biotrockenmassekonzentration erreichte nach 40 Stunden einen
maximalen Wert von X = 17,5 gL–1. Die Produktkonzentration erreichte
bereits nach 30 Stunden einen maximalen Wert von P = 20 mgL–1,
fiel aber im folgenden Verlauf der Kultivierung auf 15 mgL–1 ab.
Der Plasmidmassenanteil blieb nicht konstant, sondern stieg zunächst auf
einen maximalen Wert von wp = 2,7 mgg–1 an
und fiel nach 22 h Kultivierungszeit auf Werte unter wp =
1 mgg–1 stark
ab. 9 zeigt den Verbrauch von Ammoniumionen, Glycerin
und Glutamat, sowie die Bildung von Acetat. Nach 22 Stunden Kultivierungsdauer
konnte Ammoniumstickstoff im Medium nicht mehr nachgewiesen werden.
Parallel dazu stieg die Konzentration von Acetat von 0,3 gL–1 auf
1 gL–1 an.
Da zu diesem Zeitpunkt waren Glutamat und Glycerin noch ausreichend
vorhanden, so dass Ammonium als limitierendes Substrat identifiziert
wurde.
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Deshalb
wurde in einer weiteren Kultivierung die Ammoniummenge durch Einsatz
von 4 gL–1 Ammoniumchlorid
deutlich erhöht.
Die Biotrockenmassekonzentration nach 34 h Kultivierungsdauer betrug X
= 26,6 gL–1 (siehe 10).
Die Produktkonzentration stieg parallel zur Biotrockenmassekonzentration an
und erreichte nach 30 Stunden einen maximalen Wert von P = 41 mgL–1,
was einem Plasmidmassenanteil von wp = 1,5
mgg–1 entspricht.
Gegenüber
der Kultivierung mit 2 gL–1 Ammoniumchlorid (Beispiele
1 und 2) konnte keine weitere Erhöhung der Produktmenge erreicht
werden, so dass bei diesen kein limitierender Einfluss vorlag.
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Vergleichsbeispiel: Herstellung des Plasmids pUK21CMVβ durch Bakterienzellen
in synthetischem M9-Minimalmedium im Satzverfahren in einem 7 L-Bioreaktor
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Dieses
Vergleichsbeispiel zeigt eine Satzkultivierung in einem synthetischen
Medium, welches dem Stand der Technik entspricht. Dazu wurde wie
in Beispiel 1 und 3 das Plasmid pUK21CMVβ in E. coli DH5α wurde durch
Kultivierung im literaturbeschriebenen, synthetischen M9-Minimalmedium (Sambrock
et al., Molecular Cloning, CSH Press, 2nd edition,
1989, Cold Spring Harbor New York), bestehend aus 11 gL–1 Glucose × H2O, 1,0 gL–1 Na2HPO4 × 7H2O, 3,0 gL–1 KH2PO4, 0,5 gL–1 NaCl,
2,5 gL–1 (NH4)2SO4,
1,4 mgL–1 ZnSO4 × 7H2O, 5,4 mgL–1 FeCl2 × 6H2O, 1,6 mgL–1 MnSO4, 0,167 mgL–1 CuCl2, 0,56 gL–1 CoSO4 × 7H2O, 0,22 gL–1 MgCl2 × 7H2O und 14,7 mgL–1 CaCl2 im 7 L Bioreaktor produziert.
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Zur
Anfertigung einer Vorkultur wurden 200 mL steriles Medium mit einer
Glycerinkultur beimpft und bei 37°C
für 8 Stunden
unter Rühren
auf einem Tischschüttler
bei n = 150 min–1 inkubiert. Mit 50
mL dieser Vorkultur wurden 5 L steriles M9-Medium in einem 7 L Bioreaktor
inokuliert. Die Kultivierung im Bioreaktor wurde bei 37°C und 0,2
bar Reaktorinnendruck durchgeführt.
Die Luftzufuhr erfolgte mit 5 Lmin–1 und
das pH wurde auf 7,0 durch automatische Zugabe von ortho-Phosphorsäure und/oder
Ammoniaklösung
geregelt.
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Der
Verlauf der Prozessparameter Biotrockenmassekonzentration, Plasmidkonzentration
und Plasmidmassenanteil über
die gesamte Kultivierungsdauer von 46 Stunden ist in 11 dargestellt. Während einer
Kultivierungszeit von 44 h wurde eine Biomasse von X = 3,55 gL–1 erhalten.
Die Produktkonzentration auf P = 4,65 mgL–1 nach
44 Stunden beim Erreichen der stationären Phase an. Der Plasmidmassenanteil
war mit wp = 1,3 mgg–1 nach
44 Stunden deutlich geringer als mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
in den Beispielen 1 und 2. In diesen Beispielen wurde eine fünffach höhere Biomassemenge
und sogar eine zehnfach höhere
Plasmidkonzentration erhalten.
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Beispiel 5: Erhöhung der Produktausbeute
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Zur
Illustration der Erhöhung
der Produktausbeute durch Zugabe von Glutamat wurde das Plasmid
pUK21CMVβ in
E. coli DH5α in
einem 7 L Bioreaktor in einem reichen halbsynthetischen Vollmedium,
welches Glycerin, Sojapepton und Hefeextrakt enthielt, mit und ohne
Glutamat hergestellt.
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Zur
Herstellung einer Inokulationskultur wurden 200 mL Medium mit einer
Glycerinkultur beimpft und auf einem Tischschüttler bei n = 150 min–1 und 37°C für 10 Stunden
inkubiert. Im 7 L Bioreaktor wurden 5 L des sterilen Mediums mit
50 mL der Inokulationskultur beimpft. Die Kultivierung wurde bei
37°C und
0,2 bar Reaktorinnendruck durchgeführt. Die Luftzufuhr erfolgte
mit 5 Lmin–1 und
das pH wurde auf 7,0 durch automatische Zugabe von ortho-Phosphorsäure und/oder
Ammoniaklösung
einreguliert.
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Ohne
Glutamat-Zusatz wurde am Ende der Kultivierung nach 20 Stunden eine
Biotrockenmassekonzentration von X = 7,6 gL–1 und
eine Plasmidkonzentration von P = 26 mgL–1 erhalten.
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Durch
Zugabe von 30 gL–1 Glutamat zu dem halbsynthetischen
Vollmedium in einer weiteren Kultivierung konnte die Produktausbeute
deutlich erhöht werden
(siehe 12). Nach 20 Stunden Kultivierungsdauer
wurde eine maximale Biotrockenmassekonzentration von X = 23,9 gL–1 erhalten
und dabei die Produktkonzentration deutlich auf P = 45 mgL–1 erhöht. Dieses
Beispiel zeigt, dass selbst bei der Kultivierung in halb-synthetischen
Vollmedien die Produktmenge durch Glutamatzugabe noch deutlich gesteigert
werden kann. Glutamat ist ein wichtiger Medienbestandteil bei der
Produktion von Nukleinsäuren
und deshalb ein wichtiger Bestandteil im erfindungsgemäßen Verfahren.