DE69916892T2

DE69916892T2 - Verfahren zur isolierung von ccc plasmid dna

Info

Publication number: DE69916892T2
Application number: DE69916892T
Authority: DE
Inventors: Torsten Schmidt; Karl Friehs; Erwin Flaschel; Martin Schleef
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 1998-05-25
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2019-05-22
Also published as: JP2002516113A; WO1999061633A3; CA2329246A1; EP1144656B1; PT1144656E; ES2217763T3; AU753138B2; ATE265539T1; AU4365899A; EP1144656A2; WO1999061633A2; DE69916892D1; DK1144656T3; US6664078B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Biomasse zur Isolierung von ccc-Plasmid-DNA, umfassend das Züchten einer bakteriellen Transformante in einem Bioreaktor, der ein antibiotikumfreies „Batch"-Medium enthält, unter „Batch"-Bedingungen und am Ende der „Batch"-Phase das Füttern unter Rückkopplungsbedingungen nach Erhöhung der DO über einen kritischen Punkt mit einem Teil eines Nährmediums. Das Nährmedium umfasst neben einer Kohlenstoff- und einer Stickstoffquelle ein Magnesiumsalz, bevorzugt in Konzentrationen über 20 mM. Bevorzugt wird die bakterielle Transformante am Ende der Kultur geerntet und eingefroren oder gefriergetrocknet. Auch bevorzugt ist, dass die ccc-Plasmid-DNA, gegebenenfalls direkt, nach dem Ernten der Bakterien isoliert wird.
Mehrere Dokumente werden im Text dieser Beschreibung zitiert. Jedes der hier zitierten Dokumente (einschliesslich jeder Beschreibung, Anleitung etc. von Herstellern) ist hier durch Bezugnahme eingeschlossen; es gibt jedoch kein Zugeständnis, dass irgendein zitiertes Dokument tatsächlich der Stand der Technik der vorliegenden Erfindung ist.
Mit der Einführung und dem Fortschritt der rekombinanten DNA-Technologie in die verschiedensten Gebiete wie Nahrungsmittelherstellung und medizinische Behandlung ist das Verlangen nach gossen Mengen an sehr reiner DNA ständig gestiegen. Herkömmliche Verfahren der Reinigung von genomischer oder Plasmid-DNA (vgl. z. B. Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", CSH Press, 2. Auflage, 1989, Cold Spring Harbor New York) erfordern gewöhnlich raffinierte Verfahren, wenn die DNA frei von RNA und anderen verunreinigenden organischen Verbindungen sein muss. Insbesondere leiden Verfahren zum Erhalt von ccc-Plasmid-DNA in reiner Form regelmässig unter dem Nachteil, dass andere Plasmid-Topologien, die auch entstehen, vom gewünschten Produkt getrennt werden müssen. Zum Beispiel haben Lahijani et al., Human Gene Therapy 7 (1996), 1971–1980, berichtet, dass grosse Ausbeuten von pBR322 abgeleiteten Plasmiden, die für die menschliche Gentherapie verwendet werden sollen, erhalten werden können, wenn Plasmide verwendet werden, die eine temperatursensitive Einzel-Punktmutation umfassen, die die negative Regulation der Replikation des ColE1-Ursprungs der Replikation beeinflusst. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde eine Ausbeute von 2.2 g Plasmid-DNA aus einer 10 Liter „Batch"-Fermentation berichtet. Die bakteriellen Transformanten wurden jedoch in Anwesenheit des Antibiotikums Kanamycin wachsen gelassen, was sie für die Registrierung und anschliessende Verwendung in Menschen ungeeignet macht. Andere Ansätze versuchten, die Verwendung der Antibiotika zu vermeiden; vgl. z. B. Chen et al., J. Industrial Microbiology and Biotechnology 18 (1997), 43–48. In diesem Bericht wird eine automatisierte „Batch"-Fütterungsfermentation mit Rückkopplungskontrollen auf der Grundlage von gelöstem Sauerstoff und dem pH-Wert zur Herstellung von Supercoil-Plasmid-DNA offenbart. Es scheint, dass diese DNA für DNA-Impfstoffe brauchbar ist. Jedoch unterstützen die berichteten Ergebnisse, zum Beispiel in 4, die anscheinende Brauchbarkeit der Plasmid-DNA für Impfstoffzwecke nicht. Das resultiert aus der Tatsache, dass neben ccc-Plasmid-DNA eine Vielfalt anderer Plasmidformen unter diesen Bedingungen hergestellt wird. Weiter führt dieses Verfahren zu gossen Verunreinigungen mit genomischer DNA, und im Vergleich dazu können nur kleine Plasmidmengen erhalten werden.
Entsprechend ist ccc-Plasmid-DNA, hergestellt mit Verfahren nach dem Stand der Technik, aufgrund der Heterogenität des erhaltenen Produkts und/oder der Verwendung von Antibiotika im Herstellungsprozess für eine Vielfalt von Anwendungen wie medizinische Anwendungen ungeeignet. Das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde lag, bestand daher darin, ein Verfahren zu liefern, das die Schwierigkeiten des Stands der Technik bewältigt und die Herstellung von ccc-Plasmid-DNA ohne die begleitende Herstellung anderer Plasmidformen ermöglicht und das darüber hinaus für medizinische Zwecke geeignet ist. Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen beschriebenen Ausführungsformen erreicht.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Biomasse zur Isolierung von ccc-Plasmid-DNA, umfassend

(a) Züchten einer bakteriellen Transformante in einem Bioreaktor, der ein antibiotikumfreies „Batch"-Medium enthält, umfassend
(aa) eine Kohlenstoffquelle;
(ab) eine anorganische Salzmischung;
(ac) eine Stickstoffquelle; unter „Batch"-Kultivierungsbedingungen;
(b) Füttern der Kultur von (a) am Ende der „Batch"-Phase unter Rückkopplungsbedingungen nach Erhöhung der DO über einen kritischen Punkt mit einem Teil eines Nährmediums, das
(ba) eine Kohlenstoffquelle; und
(bb) ein Magnesiumsalz umfasst; und
(c) Zulassen, dass die bakterielle Transformante das Nährmedium metabolisiert.

Der Begriff „Biomasse", wie im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich auf jedes biologische Material, das aus Zellen oder Organismen, die sich vermehren können, kommt oder von diesen stammt.
Der Begriff „ccc-Plasmid-DNA" bezieht sich auf eine Plasmid-Isoform, die ein zirkuläres Plasmid ist, das typischerweise, aber nicht notwendigerweise, unterdreht ist im Vergleich zu einem entspannten Molekül. Das resultiert in einer kompakteren gleichförmigen Struktur des Moleküls, die als ein kovalent geschlossener Supercoil-Ring (supercoiled covalently closed circle) der Plasmid-DNA beschrieben wird. In E. coli-Zellen regulieren zwei Enzyme das Supercoiling der DNA. Die Gyrase führt negative superhelikale Umdrehungen in das Molekül ein, während die Topoisomerase I die DNA durch Einführen von Einzelstrangbrüchen entspannt. In Übereinstimmung mit dem Verfahren der Erfindung wird es am meisten bevorzugt, dass ccc-Plasmid-DNA in monomerer Form hergestellt wird. Tatsächlich stellt das Verfahren der Erfindung diese besonders gewünschte Art von Plasmid bereit, gewöhnlich in einer Menge von mehr als 90% der gesamten Plasmidherstellung. Auch nützlich, obwohl weniger bevorzugt, ist die Herstellung von dimerer ccc-Plasmid-DNA.
Der Begriff „Batch-Medium" bezieht sich auf das Medium, das in der „Batch"-Kultivierung verwendet wird, z. B. in diskontinuierlicher Kultivierung von bakteriellen Transformanten oder anderen Mikroorganismen. Diese diskontinuierliche Kultivierung wird durch eine einzelne Animpfung in frischem Medium („Batch"-Medium) am Beginn der Kultivierung, bis Nährstoffe und Substrate erschöpft sind, gekennzeichnet.
Der Begriff „Rückkopplungsbedingungen" bezieht sich auf die Ergänzung des Mediumkonzentrats während der „Batch"-Fütterungskultivierung, abhängig von (einem) Kultivierungsparameter(n) wie z. B. DO, pH-Wert etc., die mit dem Wachstum des Mikroorganismus korrelieren.
Der Begriff „kritischer Punkt" im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung beabsichtigt, einen definierten Wert für einen Parameter zu bezeichnen, der während der „Batch"-Fütterungskultivierung kontrolliert wird. Im Fall des Überschreitens oder Unterschreitens dieses Werts beginnt ein Kontrollsignal die Antwort in der Regulation der Kultivierung. Der Fachmann ist in der Lage, solche definierten Werte auf der Basis seines allgemeinen Wissens und den Lehren dieser Erfindung zu bestimmen; vgl. zum Beispiel Beispiel 1.
Der Begriff „DO" (Konzentration an gelöstem Sauerstoff) bezieht sich hiermit auf die Menge an Sauerstoff in einer Flüssigkeit in Prozent der Sättigungskonzentration.
Unter den vorstehend definierten „Batch"-Fütterungsbedingungen steigt die Konzentration an gelöstem Sauerstoff (DO) während der Kultivierung von bakteriellen Transformanten nach dem Verbrauch von Nährstoffen, wie denen im Nährmedium enthaltenen. Daher bezieht sich die Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform auf ein Verfahren, in dem die Fütterung einer bakteriellen Transformantenkultur wiederholte Fütterungszyklen nach jeder Erhöhung des DO über einen kritischen Punkt umfasst. Es ist dem Fachmann wohl bekannt, dass die Fütterung über andere Kontrollparameter wie pH-Wert des Mediums, spezifische Wachstumsrate bakterieller Transformanten, Atmungskoeffizienten oder andere kontrolliert und/oder gemessen werden kann. Trotzdem sind all diese Parameter mit der DO verknüpft oder dafür indikativ. Daher wird so eine direkte (oder indirekte) Schlussfolgerung auf den DO-Wert ermöglicht, unabhängig davon, welcher Parameter tatsächlich als Registrierungseinrichtung verwendet wird. Entsprechend wird die Messung jedes der Parameter von der Erfindung abgedeckt, solange er eine Schlussfolgerung in Bezug auf die Erhöhung der DO über einen kritischen Punkt erlaubt.
Der Begriff „Zulassen, dass die bakterielle Transformante das Nährmedium metabolisiert" bezieht sich auf die teilweise oder vollständige Metabolisierung des Nährmediums und bevorzugt auf die im Wesentlichen vollständige Metabolisierung des Nährmediums.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass das hier offenbarte Verfahren zur Herstellung hoher Plasmidkonzentrationen und zu Plasmiden mit einer DNA-Homogenität von typischerweise mehr als 90% ccc-Monomeren führt. Das Ergebnis ist umso überraschender, da ccc-Monomere der angezeigten hohen Homogenität in Abwesenheit eines Selektionsdrucks durch Antibiotika erhalten werden. Der Fachmann kann das hier offenbarte Verfahren zur Herstellung von ccc-DNA über einen weiten Bereich von Typen oder Grössen von Plasmiden verwenden. Das Verfahren der Erfindung erlaubt zusätzlich die Isolierung einer grösseren Menge an gewünschtem Plasmid aus bakteriellen Kulturen als mit früheren Verfahren möglich war. Das führt auch zu einer signifikanten Kostenreduktion der Fermentationsprozesse, da kleinere Fermentatoren verwendet werden können, verglichen mit früheren Verfahren, wenn die gleiche Menge an Plasmid hergestellt werden soll.
Ein weiterer signifikanter Vorteil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Biomasse zur Isolierung von ccc-Plasmid-DNA bezieht sich auf die Tatsache, dass die Medien keine Antibiotika enthalten. Die erhaltene ccc-DNA ist folglich definitiv antibiotikumfrei und kann ohne zeitaufwändige und teure weitere aufwendige Reinigungspläne zur medizinischen Therapie verwendet werden, bei der Antibiotikaverunreinigungen vermieden werden sollen.
Es wird am meisten bevorzugt im Verfahren der vorliegenden Erfindung, „Batch"- oder Fütterungsmedien ohne Hefeextrakt oder andere komplexe Aminosäurequellen, die aus natürlichen Quellen stammen, zu verwenden. Das liegt daran, dass die Kultivierung in solchen vollständig synthetischen Medien nicht die Gefahr der Kontaminierung aus der Quelle beinhaltet und den Vorteil einer höheren Reproduzierbarkeit besitzt. Eine andere bevorzugte Alternative wäre, semi-synthetische Medien zu verwenden, umfassend zum Beispiel Hefeextrakte, Pflanzenextrakte, Peptonergänzungen und andere. Diese synthetischen oder semi-synthetischen Medien können in einem oder mehreren Schritten der Kultivierung der Transformanten verwendet werden. Das schliesst auch den nachstehend angesprochenen Vorkulturschritt ein. Es wird auch von der vorliegenden Erfindung vorgesehen, in verschiedenen Arten von Medien bei verschiedenen Kultivierungsschritten zu kultivieren bzw. mit diesen zu füttern. Verschiedene Medien können auch gefüttert werden, wenn wiederholte Fütterungszyklen verwendet werden, wie hier nachstehend diskutiert. Es wird am meisten bevorzugt, dass diese Medien autoklavierbar sind. Magnesiumsalze sollten getrennt autoklaviert werden.
Wie vorstehend ausgeführt wurde, umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung Schritt (b) wiederholte Fütterungszyklen nach jeder Erhöhung der DO über einen kritischen Punkt. Diese Ausführungsform der Erfindung ist besonders vorteilhaft, da sie die Herstellung hoher Ausbeuten an Biomasse erlaubt, was die Isolierung hoher Mengen an ccc-Plasmid-DNA ermöglicht.
Die bakterielle Transformante, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann entweder ein Gram-negatives oder ein Gram-positives Bakterium sein. Beispiele von Gram-positiven Bakterien sind Bakterien der Gattung Bacillus, zum Beispiel Bacillus subtilis. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die bakterielle Transformante eine E. coli-Zelle.
Während sich der Fachmann eine geeignete Kohlenstoffquelle ausdenken oder diese herstellen kann, wird Glycerin bevorzugt als eine Kohlenstoffquelle im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet.
Eine Vielfalt gut bekannter und etablierter Stickstoffquellen kann im Verfahren der Erfindung verwendet werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die verwendete Stickstoffquelle NH₃.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist die Kohlenstoffquelle im „Batch"-Medium in einer (anfänglichen End-) Konzentration von ≤ 100 g/l.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist die Kohlenstoffquelle im Nährmedium in einer (anfänglichen End-) Konzentration von ≤ 1000 g/l.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist die Stickstoffquelle in einer (anfänglichen End-) Konzentration von ≤ 30%.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung umfasst die anorganische Salzmischung Na₂HPO₄ ≤ 6 g/l, KH₂PO₄ ≤ 3 g/l, NaCl ≤ 0,5 g/l und Zitronensäure·H₂O ≤ 1,5 g/l. Das bezieht sich auf die anfängliche Endkonzentration im Medium, d. h. die Endkonzentration, die im Medium zu Beginn der Fermentation vorhanden ist.
Am meisten bevorzugt umfasst die anorganische Salzmischung auch ein Magnesiumsalz, bevorzugt MgSO₄, zum Beispiel komplexiert mit Wasser. In diesem Fall wird eine anfängliche Konzentration kleiner als oder von etwa 0,3 g/l bevorzugt. Es wird auch gewünscht, dass das Magnesiumsalz getrennt autoklaviert wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung in Schritt (b) liegt die Magnesiumsalzkonzentration in einem Bereich von 5–100 mM. Das bezieht sich wieder auf die anfängliche Endkonzentration im Medium.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung in Schritt (b) beträgt die Magnesiumsalzkonzentration 80 mM. In Übereinstimmung mit der Erfindung wurde überraschend gefunden, dass vor allem ziemlich hohe Magnesiumsalzkonzentrationen wie 80 mM, bevorzugt MgSO₄, hervorragende Ergebnisse in Bezug auf die Homogenität der ccc-Plasmid-Monomere liefern.
Magnesiumsalze, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen MgCl₂, Mg(NO₃)₂, MgSO₄ oder andere. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist das Magnesiumsalz MgSO₄.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Lösung von Spurenelementen in den Schritten (a) und/oder (b) zugegeben. Zugabe der Spurenelemente kann die Plasmidausbeute weiter erhöhen.
In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung umfasst die Lösung an Spurenelementen jede der folgenden Verbindungen
FeCl₃·6H₂O in einer Endkonzentration von bevorzugt ≤ 54.0 mg/l
ZnSO₄·7H₂O in einer Endkonzentration von bevorzugt ≤ 13.8 mg/l
MnSO₄·H₂O in einer Endkonzentration von bevorzugt ≤ 18.5 mg/l
CoSO₄·7H₂O in einer Endkonzentration von bevorzugt ≤ 5.6 mg/l
CuCl₂ in einer Endkonzentration von bevorzugt ≤ 1.7 mg/l
H₃BO₃ in einer Endkonzentration von bevorzugt ≤ 10 mg/l
Na₂MoO₄·2H₂O in einer Endkonzentration von bevorzugt ≤ 25 mg/l; und
Zitronensäure in einer Endkonzentration von bevorzugt 550 mg/l.
Bakteriellen oder prokaryontischen Wachstumsmedien kann vorteilhafterweise eine Aminosäurequelle zugesetzt werden. Daher umfasst das „Batch"-Medium in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung eine Aminosäurequelle.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung umfasst das Nährmedium eine Aminosäurequelle. Aminosäurequellen sind dem Fachmann gut bekannt und können Hefeextrakte, Pflanzenextrakte, Peptonergänzungen und andere umfassen (vgl. Sambrook et al., loc. cit.).
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird die Kultivierung der bakteriellen Transformante in einem Temperaturbereich von 30°C bis 42°C durchgeführt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung liegt der Temperaturbereich bei etwa 35°C bis 38°C.
Um auxotrophe Bedürfnisse bakterieller Transformanten auszugleichen, wird es bevorzugt, dass im Verfahren der Erfindung das „Batch"-Medium eine für den bakteriellen Wirtsstamm spezifische Ergänzungssubstanz enthält. Eine Vielfalt spezifischer Ergänzungssubstanzen für verschiedene bakterielle Wirtsstämme ist beschrieben worden und ist im Fachgebiet gut bekannt, z. B. Thiamin für bakterielle Transformanten, die eine Thiamindefizienz besitzen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden die Wirtszellen nach Schritt (c) aus den Kulturen geerntet. Die Ernte bakterieller Transformanten ist eines der herkömmlichen Verfahren in der Fermentation und molekularbiologischen Techniken. Die Ernte von Transformanten kann das Filtern, die Zentrifugation oder ähnliche Verfahren umfassen, die im Fachgebiet gut bekannt sind.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden die Wirtszellen nach Schritt (c) einem Waschschritt vor oder nach der Ernte unterzogen. Diese Waschschritte können in einer Lösung ausgeführt werden, die die Integrität der Zellen nicht beeinträchtigt, aber Verbindungen der Kultur von der Zelle entfernt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung umfasst ein weiterer Schritt das Einfrieren oder die Gefriertrocknung der Transformanten nach Schritt (c) oder nach den Schritten, die hier vorstehend in jeder der weiteren bevorzugten Ausführungsformen identifiziert wurden. Die Ausführungsform ist besonders nützlich, wenn eine unmittelbare Isolierung von ccc-Plasmid nicht erwünscht ist. Gefrorene oder gefriergetrocknete Zellen können bequem verschifft oder bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung umfasst ein weiterer Schritt die Isolation von ccc-Plasmid-DNA.
Es gibt mehrere Wege, ccc-DNA zu isolieren, die dem Fachmann gut bekannt sind. Diese schliessen CsC1-Gradientenzentrifugation und Chromatographie-Reinigungsverfahren ein (vgl. z. B. Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", CSH Press, 2. Auflage, 1989, Cold Spring Harbor New York).
Wie hier vorstehend aufgeführt, kann isolierte Plasmid-DNA, bestehend aus mehr als 90% ccc-Monomeren, erhalten werden. Der Fachmann kann, wenn er die Anleitungen der vorliegenden Erfindung verwendet, ccc-DNA in grossen Mengen erhalten, die die Qualitätskriterien von Plasmid-DNA für Gentherapie- und Nucleinsäure-Impfungs-Ansätze erfüllt (vgl. Schorr et al., DNA Vaccines 772 (1995), 271–273), ohne folgende aufwändige Reinigungsschritte, um zum Beispiel Antibiotika abzutrennen. Folglich ist es möglich, die erhaltene ccc-DNA der Erfindung für Nucleinsäure-Impfungen, wie im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in Davis et al., Vaccine 12 (1994), 1503–1509, oder für gentherapeutische Strategien, wie in Cao et al., Human Gene Therapy 6 (1995), 1497–1501 offenbart, zu verwenden.
Weiter bezieht sich die Erfindung in einer anderen bevorzugten Ausführungsform auf ein Verfahren, das weiter den Schritt von (a') der Vorkultur der bakteriellen Transformante in einem antibiotikafreien Medium umfasst.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung befindet sich die bakterielle Transformante nach dem Ende der Vorkultur in der exponentiellen Wachstumsphase. Die exponentielle Wachstumsphase kann mittels herkömmlicher Technologie bestimmt werden, zum Beispiel durch Bestimmen der optischen Dichte des Kulturmediums.
Die Figuren zeigen
1: Zeitverlauf des gelösten Sauerstoffs, Schüttelgeschwindigkeit und Nährmedium, wie in einem Bioreaktor während einer DO-Rückkopplungs kontrollierten „Batch"-Fütterungskultivierung aufgezeichnet. Gezeigt ist die Kultivierung des Plasmids pUK21CMVβ in E. coli DH5α in einem 30 l-Bioreaktor. Über einem kritischen Punkt von 30% wurde die DO durch Erhöhen der Schüttelgeschwindigkeit kontrolliert. Unterhalb eines kritischen Punkts von 45% wurde die DO durch Hinzufüttern einer Nährlösung in den Bioreaktor kontrolliert.
2: Trockenzellgewicht (DCW) und Plasmidkonzentration während der „Batch"-Fütterungskultivierung von pUK21CMVβ in E. coli DH5α in semi-definiertem Glycerin-Hefeextraktmedium. Die bakterielle Transformante wurde in einem 30 l-Bioreaktor kultiviert.
3: 0.8% Agarosegelelektrophorese von Plasmid-DNA (jeweils etwa 250 ng) bei verschiedenen Kultivierungszeiten (10–40 h) einer 30 Liter-Kultur. Die Plasmid-DNA wurde aus definierten Kulturvolumina mit QIAGEN-Miniprep-Kits isoliert.
4: Trockenzellgewicht und Plasmidkonzentration während der „Batch"-Fütterungskultivierung von E. coli DH5α, enthaltend pUK21CMVβ, unter Verwendung eines synthetischen Glycerinmediums. Die Fermentation wurde in einem 5 l Bioreaktor durchgeführt.
5: 0.8% Agarosegelektrophorese von Plasmid-DNA (jeweils etwa 250 ng) bei verschiedenen Kultivierungszeiten (10–44 h) einer 7 Liter-Kultur. Die Plasmid- DNA wurde aus definierten Kulturvolumina mit QIAGEN-Miniprep-Kits isoliert.
6: 0.8% Agarosegelektrophorese von pUT649-Plasmid-DNA-Proben (200 ng/4 verschiedene Isolate) bei 41 h Kultivierungszeit, als die Zellen geerntet wurden. Die Plasmid-DNA wurde unabhängig mit QIAGEN-Midiprep-Kits (Tip-100) isoliert.
7: Endgültige Biomasse verschiedener Kultivierungsbedingungen in Hefeextrakt (YE)-Medien. Die Kultivierungen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben oder von Chen et al., J. Industrial Microbiology and Biotechnology 18 (1997), 43–48, oder Lahijani et al., Human Gene Therapy 7 (1996), 1971–1980, beschrieben, durchgeführt.
8: Endplasmidkonzentration verschiedener Kultivierungen in Hefeextrakt (YE)-Medien. Die Kultivierung wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt und mit Kultivierungen, wie von Chen et al., J. Industrial Microbiology and Biotechnology 18 (1997), 43–48, oder Lahijani et al., Human Gene Therapy 7 (1996), 1971–1980, beschrieben, verglichen.
9: Plasmidausbeute pro Biomasse verschiedener Kultivierungen in Hefeextrakt (YE)-Medien bei Zellernte. Die Kultivierung wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt und mit Kultivierungen, wie von Chen et al., J. Industrial Microbiology and Biotechnology 18 (1997), 43–48, oder Lahijani et al., Human Gene Therapy 7 (1996), 1971–1980, beschrieben, verglichen.
10: Restriktionskarte des Plasmids pUK21CMVβ
11: DNA-Sequenz des Plasmids pUK21CMVβ (SEQ ID Nr.: 2)
12: Restriktionskarte des Plasmids pUT649.
13: DNA-Sequenz des Plasmids pUT649 (SEQ ID Nr.: 1).
Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1: Hochqualitative und hochquantitative Herstellung von 7.6 kb ccc-Plasmid in Glycerin/Hefemedien
Das Verfahren zur Herstellung von Biomasse zur Isolierung von ccc-Plasmid-DNA wurde mittels einer Rückkopplungs-kontrollierten „Batch"-Fütterungskultivierung von Escherichia coli DH5α, enthaltend das Plasmid pUK21CMVβ (7612 bp) (10, 11), in einem 30 l-Bioreaktor (LAB 30 L, MBR, Schweiz) mit einem Arbeitsvolumen von 23 l durchgeführt.
Das semi-definierte „Batch"-Medium (15 l) bestand aus 10 g/l Glycerin, 5.0 g/l Hefeextrakt, 6.0 g/l Na₂HPO₄, 3.0 g/l KH₂HPO₄, 0.5 g/l NaCl, 1.5 g/l Zitronensäure, 0.3 g/l MgSO₄·7H₂O, 5 mg/l Thiaminhydrochlorid und 10 ml/l Spurenelementlösung. Thiaminhydrochlorid und die Stammlösung von Spurenelementen (5.40 g/l FeCl₃·H₂O, 1.38 g/l ZnSO₄·7H₂O, 1.85 g/l MnSO₄·H₂O, 0.56 g/l CoSO₄·7H₂O, 0.17 g/l CuCl₂, 1.0 g/l H₃BO₃, 2.5 g/l Na₂MoO₄·2H₂O und 5.0 g/l Zitronensäure) wurden getrennt sterilisiert. Vor der Sterilisation des Bioreaktors (25 min bei 121°C) wurde der pH-Wert des Mediums auf 6.7 mit NaOH eingestellt.
Die Kultivierung wurde bei 37°C und 0.5 bar durchgeführt. Die Belüftung wurde bei 30 l/min gehalten, und der pH-Wert wurde mit 10% H₃PO₄ und/oder 25% NH₄OH kontrolliert. Als Antischaumreagens wurde Pluronic^® PE-8100 (BASF) verwendet. Die minimale Schüttelgeschwindigkeit war 100 UpM.
Eine gefrorene Glycerinstammlösung von E. coli DH5α, enthaltend pUK21CMVβ, wurde verwendet, um 200 ml Luria-Bertani (LB)-Animpfmedium in einem 1000 ml-Schüttelkolben anzuimpfen. Die Kultur wurde bei 37°C für 8 h auf einem Kreisschüttler bei 180 UpM inkubiert. Nach Erreichen einer Zelldichte von OD₆₀₀ 0.3–0.5 wurde ein 50 ml-Aliquot dieser Vorkultur in den Bioreaktor übertragen.
Während der Kultivierung wurde gelöster Sauerstoff (DO) automatisch bei 30% Luftsättigung durch Erhöhen der Schüttelgeschwindigkeit um 1% der vorherigen Schüttelgeschwindigkeit gehalten, wenn die gelöste Sauerstoffkonzentration unter einen kritischen Punkt von 30% fiel. Bei DO-Konzentrationen über 30% blieb die Schüttelgeschwindigkeit konstant. Wenn die DO einen kritischen Punkt von 45% Luftsättigung erreichte, wurde eine Nährlösungspumpe automatisch aktiviert, um eine konzentrierte Lösung von 600 g/l Glycerin, 90 g/l Hefeextrakt und 20 g/l MgSO₄*7H₂O zu der Kultur zuzufüttern. Die maximale Flussrate der Nährlösungspumpe war 50 ml/min. Die Fütterung wurde unterbrochen, wenn die DO unter 45% fiel.
Alle zwei Stunden wurde das Zellwachstum durch Messen der optischen Dichte bei 600 nm und des Zelltrockengewichts bestimmt. Die Plasmidkonzentration wurde nach Isolierung der Plasmid-DNA aus einem definierten pelletierten Kulturvolumen mittels QIAGEN-Miniprep-Kits (Tip-20) entsprechend den Anleitungen des Herstellers bestimmt. Nach Verdau mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI wurde die Quantifizierung dieser DNA-Proben mittels Kapillargelektrophorese, wie von Schmidt et al., J. Biotechnol. 49 (1996), 219–229, beschrieben, durchgeführt. Um die Plasmidformverteilung zu analysieren und als Qualitätskontrolle wurde die Elektrophorese aller ungespaltenen Proben auf 0.8% Agarosegelen durchgeführt.
1 beschreibt DO-Mengen, Schüttelgeschwindigkeit und Nährlösungswerte, wie im Bioreaktor während einer DO-Rückkopplungs-kontrollierten „Batch"-Fütterungskultivierung aufgezeichnet. Nach 14 h, wenn die Nährstoffe verbraucht waren, stieg die DO-Konzentration stark an, und die Fütterungsschleife begann. Während dieser „Batch"-Fütterungsphase schwankte die DO-Konzentration zwischen dem kritischen Punkt zur Fütterung (45%) und dem kritischen Punkt zur Erhöhung der Schüttelgeschwindigkeit (30%).
2 veranschaulicht die Bildung von Biomasse (Trockenzellgewicht) und der Plasmid-DNA während der Kultivierung. Das Zellwachstum trat bis zu 36 h Kultivierungszeit auf. Eine End-Biomasse von 48 g/l Trockenzellgewicht (OD₆₀₀ = 140) wurde erreicht. Die in diesem Reaktor hergestellte Plasmidkonzentration betrug etwa 200 mg/l, was 4,6 g Plasmid-DNA entspricht. Die Plasmidmasse pro Zellgewicht war etwa 4,2 mg/g. Obwohl keine Antibiotika zur Selektion verwendet wurden, stieg die Plasmidkonzentration während der ganzen Kultivierung an.
Agarosegelektrophorese zeigte ein Plasmid-Produkt hoher Qualität während der ganzen Kultivierung (3). Die isolierte Plasmid-DNA bestand aus mehr als 90% ccc-Molekülen und erfüllte die Qualitätskriterien von Plasmid-DNA für gentherapeutische und Nucleinsäure-Impfungs-Ansätze (Schorr et al., DNA Vaccines 772 (1995), 271–273).
Beispiel 2: Hochqualitative Herstellung von ccc-Plasmid-DNA in synthetischen Glycerinmedien
DO-Rückkopplungs-kontrollierte „Batch"-Fütterungskultivierung von E. coli DH5α, enthaltend pUK21CMVβ (7612 bp; SEQ ID Nr.: 2) wurde in einem 7 l-Bioreaktor (LAB 7 l, MBR, Schweiz) mit 5,5 l Arbeitsvolumen durchgeführt. Synthetische Glycerinmedien wurden in dieser Fermentation verwendet.
Das definierte „Batch"-Medium (3,5 l) bestand aus 20 g/l Glycerin, 6.0 g/l Na₂HPO₄, 3.0 g/l KH₂HPO₄, 0.5 g/l NaCl, 1.5 g/l Zitronensäure, 0.3 g/l MgSO₄·7H₂O und 10 ml/l Spurenelementlösung, enthaltend 5.40 g/l FeCl₃·H₂O, 1.38 g/l ZnSO₄·7H₂O, 1.85 g/l MnSO₄·H₂O, 0.56 g/l CoSO₄·7H₂O, 0.17 g/l CuCl₂, 1.0 g/l H₃BO₃, 2.5 g/l Na₂MoO₄·2H₂O und 5.0 g/l Zitronensäure. 5 mg/l Thiaminhydrochlorid wurde getrennt mittels Filtration sterilisiert und in den Bioreaktor transferiert. Vor der Sterilisation des Bioreaktors (25 min bei 121°C) wurde der pH-Wert des Mediums auf 6.7 eingestellt.
Die Kultivierung wurde bei 37°C und 0.5 bar durchgeführt. Die Belüftung wurde bei 10 l/min gehalten, und der pH-Wert wurde mit 10% H₃PO₄ und/oder 25% NH₄OH kontrolliert. Antischaumreagens war Pluronic^® PE-8100 (BASF). Die minimale Schüttelgeschwindigkeit war 150 UpM.
Eine gefrorene Glycerinstammlösung von E. coli DH5α, enthaltend pUK21CMVβ, wurde verwendet, um 55 ml LB-Animpfmedium in einem 300 ml-Schüttelkolben anzuimpfen. Die Kultur wurde bei 37°C für 8 h auf einem Kreisschüttler bei 180 UpM inkubiert. Nach Erreichen einer Zelldichte von OD₆₀₀ 0.3–0.5 wurden 50 ml dieser Vorkultur in den Bioreaktor transferiert.
Während der Kultivierung wurde der gelöste Sauerstoff (DO) automatisch bei 30% Luftsättigung durch Erhöhen der Schüttelgeschwindigkeit um 1% der vorhergehenden Schüttelgeschwindigkeit gehalten, wenn die gelöste Sauerstoffkonzentration unter 30% fiel. Bei DO-Konzentrationen über 30% Luftsättigung blieb die Schüttelgeschwindigkeit konstant. Wenn die DO über 45% Luftsättigung stieg, wurde eine Nährlösungspumpe automatisch aktiviert, um eine konzentrierte Lösung von 1000 g/l Glycerin und 20 g/l MgSO₄·7H₂O zu der Kultur zu füttern. Die maximale Flussrate der Nährlösungpumpe war 30 ml/min. Die Fütterung wurde unterbrochen, wenn die DO unter 45% fiel.
Alle zwei Stunden wurde das Zellwachstum durch Messen der optischen Dichte bei 600 nm und des Trockenzellgewichts bestimmt. Die Plasmidkonzentration wurde nach Isolieren der Plasmid-DNA aus einem definierten pelletierten Kulturvolumen mittels QIAGEN-Miniprep-Kit (Tip-20) gemäss den Anleitungen des Herstellers bestimmt. Nach Spaltung mit der Restriktionsendonuklease EcoRI wurde die Quantifizierung dieser DNA-Proben mittels Kapillargelektrophorese, wie von Schmidt et al. 1996 beschrieben (Schmidt et al., J. Biotechnol. 49 (1996), 219–229), durchgeführt. Um die Plasmidformverteilung zu analysieren und als Qualitätskontrolle, wurde die Elektrophorese aller ungespaltener Proben auf 0.8% Agarosegelen durchgeführt.
4 beschreibt die Bildung der Biomasse und der Plasmid-DNA während der Kultivierung. Das Zellwachstum fand bis 40 h Kultivierungszeit statt. Eine endgültige Biomasse von 48 g/l Trockenzellgewicht (OD₆₀₀ = 145) wurde mit einem synthetischen Medium erreicht. Die hergestellte Plasmidkonzentration betrug etwa 100 mg/l, was 550 mg Plasmid-DNA entspricht. Die erhaltene Plasmidmasse pro Zellgewicht betrug etwa 2,1 mg/g. Wie mittels Agarosegelelektrophorese überprüft, wurde das Plasmidprodukt in einer hohen Quantität während der ganzen Kultivierungszeit erhalten (5). Die isolierte Plasmid-DNA wurde als ccc-Monomere erhalten. ccc-Dimere, die als Konkatemere vorkamen, wurden in kleinen Mengen gefunden. Die DNA-Proben erfüllten die Qualitätskriterien von Plasmid-DNA für gentherapeutische und Nucleinsäure-Impfungs-Ansätze.
Beispiel 3: Hochqualitative Herstellung eines Plasmids für gentherapeutische Ansätze durch Hochsalz-Dichtefermentation
Eine DO-Rückkopplungs-kontrollierte „Batch"-Fütterungskultivierung von E. coli DH5α, enthaltend pUT649 (12, 13) (4618 bp; SEQ ID Nr.: 1) (Der pUT649-Vektor ist im Eurogentec-Katalog 1994 (Eurogentec, Liège, Belgien) unter der Katalognummer VE-1134-a beschrieben worden.), wurde mit den gleichen Glycerin-Hefeextrakt-Medien (7.5 l „Batch"-Medium), wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Ähnliche Kultivierungsbedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden angewendet, und die Fermentation wurde in einem Bioreaktor mit 10 l Arbeitsvolumen (BRAUN BioE) durchgeführt. Die Belüftung war 15 l/min. In der „Batch"-Phase wurde die Schüttelgeschwindigkeit auf 800 UpM gesetzt. In der „Batch"-Fütterungsphase wurde diese Geschwindigkeit um 100 UpM erhöht, wenn die DO unter den kritischen Punkt von 30% fiel. Das Fütterungsmedium wurde in den Bioreaktor (Flussrate 10 ml/min) gepumpt, wenn die DO den kritischen Punkt von 45% erreichte.
In einem 1 l-Schüttelkolben wurden 100 ml „Batch"-Medium mit 500 μl Glycerinstammlösung von E. coli DH5α, enthaltend pUT649, angeimpft. Die Inkubation wurde für 5 h bei 37°C auf einem Kreisschüttler durchgeführt. Eine 1.5 ml-Animpfung dieser Vorkultur wurde in den Bioreaktor transferiert.
Nach 41 h Kultivierungszeit, wenn die bakteriellen Transformanten die stationäre Phase erreichten, ergab die endgültige Biomasse 60 g/l Trockenzellgewicht und 230 mg/l Plasmid. Die Plasmid-DNA von mehr als 90% ccc-Monomer-Plasmid-DNA konnte isoliert werden (6).
Beispiel 4: Vergleich zwischen verschiedenen „Batch" und Batch"-Fütterungs-Kultivierungsbedingungen
„Batch"-Kultivierung in Luria-Bertani-(LB)-Medium (Sambrook et al., loc. cit.) in einem 7 l-Bioreaktor, „Batch"-Fütterungskultivierung, wie in Beispiel 1 beschrieben, und „Batch"-Fütterungskultivierungen, wie im Stand der Technik offenbart, wurden verglichen. Während Chen et al. (J. Industrial Microbiology and Biotechnology 18 (1997), 43–48) ein Dextrose-Hefeextrakt-Medium in der „Batch"-Phase verwendeten und ein Glucose-Hefeextrakt-Fütterungsmedium fütterten, führten Lahijani et al. (Human Gene Therapy 7 (1996), 1971–1980) „Batch"- und „Batch"-Fütterungskultivierungen in Antibiotika-enthaltendem Glucose-Hefeextrakt-Medium durch, wobei sie eine Temperatur kontrollierte Punktmutation in der bakteriellen Transformante verwendeten.
7 zeigt die endgültige Biomasse, wenn die Zellen die stationäre Wachstumsphase erreichten. Die Biomasse-Ausbeute in „Batch"-Kultivierungen in LB-Medium oder von Lahijani et al. beschriebene waren niedrig. Fütterung von Nährlösungen, wie von Chen et al. oder in der vorliegenden Erfindung beschrieben, führten zu höheren Biomasse-Ausbeuten.
Wie in 8 gezeigt, waren die Plasmidkonzentrationen im Vergleich zu „Batch"-Kultivierungen in LB-Medium um den Faktor 35–40 in „Batch"-Fütterungsfermentationen mit Glucose-Hefeextrakt-Medien, wie in Lahijani et al. beschrieben, oder mit Glycerin-Hefeextrakt-Medien, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, erhöht. „Batch"-Fütterungskultivierungen, wie von Chen et al. durchgeführt, führten jedoch zu niedrigeren Plasmidkonzentrationen.
Lahijani et al. verwendeten das Antibiotikum Kanamycin während der Kultur und erhielten eine ähnliche Plasmidkonzentration, wie sie mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung mit antibiotikafreien Glycerin-Hefeextrakt-Medien erhalten wurde. Ein Vergleich der Biomasse konnte nicht durchgeführt werden, da Lahijani et al. keine Figuren, die die erhaltene Biomasse betrafen, offenbarten.
Wie in 9 gezeigt, führte die „Batch"-Fütterungskultivierung in Glycerin-Hefeextrakt-Medium zu höheren Plasmidausbeuten pro Biomasse, verglichen mit „Batch"-Bedingungen in LB-Medium. Die höchsten Plasmidausbeuten pro Biomasse konnten durch „Batch"-Kultivierung in Glucose-Hefeextrakt-Medium erhalten werden, aber die Gesamt-Plasmid-Ausbeute war gering.
Die Homogenität und Reinheit der isolierten Plasmid-DNA war am besten unter Kultivierungsbedingungen entsprechend der vorliegenden Erfindung (3, 5, 6). Lahijani et al. berichteten, dass die isolierte DNA grosse Mengen an RNA und verketteten Dimeren enthielt, während Chen et al. grosse Mengen an verunreinigender genomischer DNA erhielten. Daher erfordert die Entfernung solcher verunreinigender nicht-ccc-DNA, RNA oder genomischer DNA zusätzliche Verarbeitungsschritte, ist zeitraubend und verringert weiter die Ausbeuten an DNA, die mittels Verfahren des Stand der Techniks isoliert wurde.
Zusammenfassend erlaubt die Analyse von Daten die eindeutige Schlussfolgerung, dass das Verfahren der Erfindung in Bezug auf die Reinheit des gewünschten Produkts, gegebenenfalls oder bevorzugt zusammen mit der Menge an erhaltenem gewünschtem Endprodukt, dem Stand der Technik überlegen ist. Das Verfahren der Erfindung kann für andere Plasmide angewendet werden und ergibt ähnliche oder die gleichen vorteilhaften Ergebnisse.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von Biomasse zur Isolierung von ccc-Plasmid-DNA, umfassend: (a) Züchten einer bakteriellen Transformante in einem Bioreaktor, der ein antibiotikumfreies „Batch"-Medium enthält, umfassend (aa) eine Kohlenstoffquelle; (ab) eine anorganische Salzmischung; (ac) eine Stickstoffquelle; unter „Batch"-Kultivierungsbedingungen; (b) Füttern der Kultur von (a) am Ende der „Batch"-Phase unter Rückkopplungsbedingungen nach Erhöhung des gelösten Sauerstoffs über einen kritischen Punkt mit einem Teil eines Nährmediums, das (ba) eine Kohlenstoffquelle; und (bb) ein Magnesiumsalz umfasst; und (c) Zulassen, dass die bakterielle Transformante das Nährmedium metabolisiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (b) nach jeder Erhöhung des gelösten Sauerstoffs über einen kritischen Punkt wiederholte Fütterungszyklen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die bakterielle Transformante eine E. coli-Zelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Glycerin als Kohlenstoffquelle verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei NH₃ als Stickstoffquelle verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Kohlenstoffquelle im „Batch"-Medium in einer Konzentration von ≤ 100 g/l vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Kohlenstoffquelle im Nährmedium in einer Konzentration von ≤ 1000 g/l vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Stickstoffquelle in einer Konzentration von ≤ 30% vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die anorganische Salzmischung Na₂HPO₄ ≤ 6 g/l, KH₂PO₄ ≤ 3 g/l, NaCl ≤ 0,5 g/l und Zitronensäure·H₂O ≤ 1,5 g/l umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die anorganische Salzmischung weiterhin ein Magnesiumsalz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Magnesiumsalz MgSO₄ in einer Konzentration von 0,3 g/l ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei in Schritt (b) die Magnesiumsalzkonzentration in einem Bereich von 5 bis 100 mM ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei in Schritt (b) die Magnesiumsalzkonzentration 80 mM ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Magnesiumsalz MgSO₄ ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei in Schritt (a) und/oder (b) eine Lösung mit Spurenelementen zugesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Lösung mit Spurenelementen FeCl₃·6H₂O, ZnSO₄·7H₂O, MnSO₄·H₂O, CoSO₄·7H₂O, CuCl₂, H₃BO₃, Na₂MoO₄·2H₂O und Zitronensäure umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das „Batch"-Medium eine Aminosäurequelle umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Nährmedium eine Aminosäurequelle umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das Züchten der bakteriellen Transformante in einem Temperaturbereich von 30°C bis 42°C ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei der Temperaturbereich etwa 35°C bis 38°C ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei das „Batch"-Medium einen Zusatz umfasst, der für den bakteriellen Wirtsstamm spezifisch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Wirtszellen nach Schritt (c) aus den Kulturen geerntet werden.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Wirtszellen nach Schritt (c) vor oder nach dem Ernten einem Waschschritt unterworfen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei ein weiterer Schritt nach Schritt (c) das Gefrieren oder Gefriertrocknen der Wirtszellen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei ein weiterer Schritt nach Schritt (c) oder nach den in den Ansprüchen 22 bis 24 spezifizierten Schritten, die Isolierung von ccc-Plasmid-DNA umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, weiterhin umfassend den Schritt (a') des Vorzüchtens der bakteriellen Transformante in einem antibiotikumfreien Medium.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei sich die bakterielle Transformante nach dem Ende des Vorzüchtens in einer exponentiellen Wachstumsphase befindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, wobei das „Batch"-Medium, das Nährmedium und/oder das zum Vorzüchten verwendete Medium ein synthetisches oder ein halbsynthetisches Medium ist.