JP2002516113A

JP2002516113A - ｃｃｃプラスミドＤＮＡ単離のための新しい方法

Info

Publication number: JP2002516113A
Application number: JP2000551016A
Authority: JP
Inventors: トルステンシュミット; カールフリース; エルヴィンフラッシェル; マルティンシュリーフ
Original assignee: キアゲンゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1998-05-25
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2002-06-04
Also published as: ATE265539T1; EP1144656B1; ES2217763T3; AU4365899A; WO1999061633A3; CA2329246A1; DE69916892T2; US6664078B1; AU753138B2; EP1144656A2; DE69916892D1; WO1999061633A2; DK1144656T3; PT1144656E

Abstract

(57)【要約】本発明は、バッチ条件下で抗生物質を含まないバッチ培地を含むバイオリアクター中での細菌形質転換体を培養し、バッチ段階の終了時に、ＤＯの閾値設定点を越える上昇の後、フィードバック条件下でフィードバック培地の一部を供給することを特徴とするｃｃｃプラスミドＤＮＡの単離のためのバイオマスの生産に関する。前記フィードバック培地は炭素源以外に、好ましくは約２０ｍＭ以上の濃度でマグネシウム塩を含んでいる。また好ましくは、細菌形質転換体を培養終了後に回収し、凍結又は凍結乾燥する。細菌を回収した後に、ｃｃｃプラスミドＤＮＡを任意に直接単離する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、バッチ条件下で、抗生物質を含まないバッチ培地を含むバイオリア
クター中で、細菌形質転換体を培養すること、及び閾値設定点を超えてＤＯが上
昇した後、バッチ段階の最後にフィードバック条件下で流加培地(feed medium)
の一部を供給することを含むｃｃｃプラスミドＤＮＡ単離のためのバイオマスの
生産に関する。前記流加培地は、炭素及び窒素源以外に、マグネシウム塩を好ま
しくは約２０ｍＭ以上の濃度で含む。好ましくは、細菌形質転換体は培養の終了
後に回収され、そして凍結又は凍結乾燥される。また好ましくは、ｃｃｃプラス
ミドＤＮＡは、細菌の回収後に任意に直接単離される。

【０００２】いくつかの文書が、この明細書の本文を通して引用されている。ここで引用さ
れた各文書（いずれかの製造元の明細書、説明書等をも含む）が本明細書に参照
として組み込まれる。しかし引用されたどの文書も、本発明の従来技術そのもの
であると認められてはいない。

【０００３】食品材料生産や医学的治療のような種々の分野への組換えＤＮＡ技術の到来と
進歩によって、大量の高純度ＤＮＡに対する要望が絶えず挙がっている。ゲノム
又はプラスミドＤＮＡを精製する伝統的な方法（例えばサムブロック（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ）ら、“分子クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、
ラボラトリー・マニュアル（ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）” Ｃ
ＳＨプレス（ＣＳＨＰｒｅｓｓ）、第２版、１９８９、コールド・スプリング
・ハーバー・ニューヨーク（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｅｒＨａｒｂｏｒＮｅ
ｗＹｏｒｋ）を参照）は、ＤＮＡがＲＮＡや他の混入した(contaminating)有
機化合物を含まないべきであるならば、通例複雑な方法を必要とする。特に、ｃ
ｃｃプラスミドＤＮＡを純粋な形で得る方法は、同様に生成された他のプラスミ
ドトポロジーを所望の生成物から分離しななければならないという欠点を常に有
する。例えば、ラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）ら、ヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａ
ｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）７（１９９６），１９７１−１９８０におい
て、ＣｏｌＥ１の複製開始点からの複製の負の制御に影響をおよぼす温度感受性
単一点突然変異(temperature sensitive single-point mutation)を含むプラス
ミドを用いる場合に、ヒトの遺伝子治療を目的とするｐＢＲ３２２−由来プラス
ミドを高収率で得ることができることが報告されている。この方法を用いること
によって、プラスミドDNAが１０リッターの流加培地醗酵から２．２ｇの収量で
得られることが報告されている。しかし、登録(registration)及びその後のヒト
での使用を不適切にするであろう抗生物質カナマイシンの存在下で細菌の形質転
換体が成育された。抗生物質の使用を避けるために、他のアプローチが試みられ
た；例えば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｊ．インダストリアル・ミクロバイオロジ
ー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ．ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１８（１９９７），４３
−４８を参照。この報告において、スーパーコイルプラスミドＤＮＡの生産のた
めの溶解酸素及びｐＨに基づく、フィードバック制御を伴う自動流加醗酵が開示
されている。このＤＮＡはＤＮＡワクチンのために有用であると提案されている
。しかしながら、例えば図４において報告された結果は、このプラスミドＤＮＡ
がワクチンの目的には適さないことを示唆する。これは、これらの条件下でｃｃ
ｃプラスミドＤＮＡ以外に、様々な他のプラスミド形態が生産されるという事実
に起因している。さらに、この方法ではゲノムＤＮＡが多量に混入し、それに対
してプラスミドは少量しか得ることが出来きない。

【０００４】従って、従来技術の方法によって製造されるｃｃｃプラスミドＤＮＡは、得ら
れた生成物の不均質性及び／又は生成工程中の抗生物質の使用により、医学的目
的のような種々の目的には適当でない。それ故に、本発明が有する技術的課題は
、これらの従来技術の困難を克服し、かつ他のプラスミド形が同時に生成するこ
となくｃｃｃＤＮＡを製造することを可能にし、さらには医学的目的に適当な方
法を提供することであった。前記技術的課題に対する解決は、請求項において特
徴づけられる態様を提供することによって達成される。

【０００５】このように本発明は、（ａ）バッチ培養条件下で（ａａ）炭素源、（ａｂ）無機塩混合物、（ａｃ）窒素源を含む抗生物質を含まないバッチ培地を含むバイオリアクター中で細菌形質転換
体を培養し；（ｂ）閾値設定点を超えてＤＯが上昇した後、バッチ段階の最後にフィードバ
ック条件下で、（ｂａ）炭素源及び（ｂｂ）マグネシウム塩を含む流加培地の一部を（ａ）の前記培養液に供給し；（ｃ）細菌形質転換体に前記流加培地を代謝させることを含むｃｃｃプラスミドＤＮＡの単離のためのバイオマス製造方法に関するものである
。

【０００６】本発明の文脈中で用いられる場合の「バイオマス」という用語は、再生が可能
である細胞又は有機体からの、又はそれから発生するいずれの生物学的材料にも
関する。「ｃｃｃプラスミドＤＮＡ」という用語は、典型的に、しかし必ずしもそうで
はないが、リラックス型分子(relaxed molecule)に対して下方に巻き込まれる(u
nderwound)環状プラスミドであるイソ型プラスミド(plasmid isoform)を指して
いる。これにより共有結合で閉環したスーパーコイルプラスミドＤＮＡとして記載さ
れるさらに凝集した構造(compact conformity)が結果的に得られる。大腸菌細胞
において、２種類の酵素がＤＮＡの高次らせん化(supercoiling)を調節している
。ギラーゼは負の高次らせん回転をその分子中に導入し、一方トポイソメラーゼ
Ｉは一本鎖の開裂を導入することによってそのＤＮＡを緩める。単量体の形態の
ｃｃｃプラスミドＤＮＡが製造されることが本発明の方法に従い最も好ましい。
事実、本発明の方法は、通常全体のプラスミド生産の９０％を超える量で、この
とりわけ望まれるタイプのプラスミドを提供する。あまり好ましくないが、二量
体ｃｃｃプラスミドＤＮＡの生産もまた有用である。「バッチ培地」という用語は、バッチ培養において、すなわち細菌形質転換体
又は他の微生物の不連続培養において用いられる培地を指している。この不連続
培養は、栄養素と基質が使い尽くされるまで行われる培養の開始時における新鮮
な培地（バッチ培地）への単一接種によって特徴づけられる。「フィードバック条件」という用語は、微生物の増殖と関連する、例えばＤＯ
、ｐＨ等のような培養パラメーターに依存する流加培養(fed-batch medium)中の
培地濃度の補充に関する。本発明の文脈中の「閾値設定点」という用語は、流加培養中にモニターされる
パラメーターに対する限定値を意味するよう意図されている。その値を超える場
合又は達しない場合は、モニターシグナルが培養の制御における反応を開始する
。当業者は、通常の知識及び本発明の教示に基づき、そのような限定値を決定す
ることができる；例えば、実施例１を参照。「ＤＯ」（溶解酸素濃度）という用語は、これにより飽和濃度パーセントで表
した溶液中の酸素量を指している。上記で規定された流加培養条件下で、流加培地中に含まれるような栄養素が消
費された後、細菌形質転換体の培養中に、溶解酸素濃度（ＤＯ）が上昇する。そ
れ故、本発明は、好ましい態様において、細菌形質転換体培養液の供給が、ＤＯ
が閾値設定点を超えて上昇する後毎に繰り返される供給サイクルを含む方法に関
する。培地のｐＨ、細菌形質転換体の特異的増殖速度、呼吸係数又はその他のも
ののような他の制御パラメーターによって供給を制御及び / 又は測定できるこ
とは、当業者に周知である。と言うものの、これらのパラメーター全ては相互に
関係し、ＤＯの指標である。それ故、どのパラメーターが実際に読み出し系とし
て使われているかと関係なく、それはＤＯの値について直接的（又は間接的）結
論を出すことを可能にする。従って、ＤＯが閾値設定点を超えて上昇することに
関連して結論づけられる限りにおいて、前記パラメーターのいずれの測定もが本
発明によって包含される。「細菌形質転換体に前記流加培地を代謝させる」という用語は、前記流加培地
の部分的又は完全な代謝、好ましくは前記流加培地の本質的に完全な代謝に関す
る。

【０００７】本発明により、ここで開示された方法によって高濃度プラスミドの生成及び、
典型的には９０％を超えるｃｃｃモノマーのＤＮＡ均質性を持つプラスミドがも
たらされることが見出された。示された高い均質性を有するｃｃｃモノマーが抗
生物質による選択圧(selection pressure)の存在なしに得られるため、その結果
はさらに驚くべきものである。当業者は、ここで開示されたｃｃｃＤＮＡの製造
方法を、幅広いタイプ又はサイズのプラスミドに対して使用することができる。
さらに本発明の方法は細菌培養液から、従来技術によって可能であるよりもさら
に大量の所望のプラスミドの単離を可能にする。もし同じ量のプラスミドが生成
されなければならないならば、従来技術の方法と比較して、より小さい醗酵槽を
採用することが出来るので、これにより醗酵方法の重要なコスト削減もまたもた
らされる。

【０００８】ｃｃｃプラスミドＤＮＡの単離のためのバイオマスの生産のための、本発明の
方法のさらに重要な利点は、培地から抗生物質が除いてあるという事実に関する
ものである。このように、得られたｃｃｃＤＮＡには抗生物質が明らかに存在せ
ず、そして時間がかかり、かつ経費的にもさらに労力のかかる精製スケジュール
なしに、抗生物質の混入を避けなければならない医学的治療に用いることができ
ることである。

【０００９】イースト抽出液又は天然源由来の他の複合アミノ酸源が除かれたバッチ又は流
加培地を用いることが、本発明の方法において最も好ましい。これは、このよう
な完全合成培地における培養は、起源に関連する不純物の混入の危険性を受けず
、かつより高い再生率の利点を持つからである。他の好ましい選択(option)は、
例えば、イースト抽出液、植物抽出液、ペプトンの補足及びその他を含む半合成
培地を使用することであろう。これらの合成又は半合成培地は、形質転換体の培
養の一つ又はそれ以上の段階において用いることが出来る。これはまた後述する
前培養段階を包含する。様々な培養段階において、様々なタイプの培地中で／様
々なタイプの培地を供給することもまた、本発明によって企図されたものである
。以下ここで考察するように、繰り返し供給サイクルが使用される場合、様々な
培地を供給することも出来る。これらの培地は、オートクレーブにかけ得ること
(autoclavable)が最も好ましい。マグネシウム塩は別にオートクレーブにかける
べきである。

【００１０】上で概略を述べたように、本発明の方法の好ましい態様において、段階（ｂ）
は閾値設定点を超えるＤＯの各上昇の後の繰り返し供給サイクルを含む。本発明
のこの態様は、大量のｃｃｃプラスミドＤＮＡの単離を可能にするバイオマスの
高収量の生産を可能にするために、とりわけ有用である。

【００１１】本発明の方法において用いられる細菌形質転換体は、グラム陰性菌またはグラ
ム陽性菌のどちらでも可能である。グラム陽性菌の例はバシラス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属の細菌、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）である
。好ましい態様においては細菌形質転換体は大腸菌細胞である。

【００１２】当業者は適した炭素源を考案又は調製出来るが故に、本発明の方法においては
、グリセロールが炭素源として好ましくは使用されている。

【００１３】本発明の方法では、種々の周知かつ確立された窒素源を使用することが出来る
。本発明のさらに好ましい態様において使用される窒素源はＮＨ₃である。

【００１４】本発明の方法のさらに好ましい態様においては、バッチ培地中の炭素源の（初
期最終）濃度は１００ｇ／ｌ以下である。

【００１５】本発明の方法の他の好ましい態様においては、流加培地中の炭素源の（初期最
終）濃度は１０００ｇ/ｌ以下である。

【００１６】本発明の方法のさらに他の好ましい態様においては、窒素源の（初期最終）濃
度は３０％以下である。

【００１７】本発明の方法のさらに好ましい態様においては、無機塩混合物はＮａ₂ＨＰＯ₄ を６ｇ/ｌ以下、ＫＨ₂ＰＯ₄を３ｇ/ｌ以下、ＮａＣｌを０．５ｇ/ｌ以下及びク
エン酸・Ｈ₂Ｏを１．５ｇ/ｌ以下含んでいる。これは培地中の初期最終濃度、即
ち醗酵開始時に培地中に存在した最終濃度を指している。

【００１８】最も好ましくは、前記無機塩混合物は、例えば水と錯形成したマグネシウム塩
、好ましくはＭｇＳＯ₄をも含んでいる。この場合、約０．３ｇ/ｌ又はそれ以下
の初期濃度が好ましい。マグネシウム塩は別にオートクレーブにかけられること
も望ましい。

【００１９】本発明の方法の他の好ましい態様においては、ステップ（ｂ）においてマグネ
シウム塩濃度は５−１００ｍＭの範囲内にある。これはまた培地中の初期最終濃
度を指している。

【００２０】本発明の方法の特に好ましい態様において、ステップ（ｂ）におけるマグネシ
ウム塩濃度は８０ｍＭである。本発明によれば、マグネシウム塩、好ましくはＭ
ｇＳＯ₄の濃度が、例えば８０ｍＭのようにやや高い場合に、ｃｃｃプラスミド
モノマーの均質性に関して優れた結果がもたらされることが、驚くべきことに明
らかになった。

【００２１】本発明によって使用できるマグネシウム塩はＭｇＣｌ₂、Ｍｇ（ＮＯ₃）₂、Ｍ
ｇＳＯ₄等を含む。本発明の好ましい態様において、マグネシウム塩はＭｇＳＯ₄ である。

【００２２】本発明の他の好ましい態様においては、微量元素の溶液がステップ（ａ）及び
/又は（ｂ）において加えられる。微量元素の添加はプラスミドの収量をさらに
高めることができる。

【００２３】本発明の方法の他の態様においては、微量元素の溶液は以下の各化合物を含む
：最終濃度が好ましくは５４．０ｍｇ／ｌ以下のＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ最終濃度が好ましくは１３．８ｍｇ／ｌ以下のＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ最終濃度が好ましくは１８．５ｍｇ／ｌ以下のＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ最終濃度が好ましくは５．６ｍｇ／ｌ以下のＣｏＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ最終濃度が好ましくは１．７ｍｇ／ｌ以下のＣｕＣｌ₂ 最終濃度が好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下のＨ₃ＢＯ₃ 最終濃度が好ましくは２５ｍｇ／ｌ以下のＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、及び最終濃度が５０ｍｇ／ｌ以下のクエン酸

【００２４】細菌又は原核生物増殖培地は、アミノ酸源を有利に補充することが出来る。そ
れ故に、本発明の方法のさらに好ましい態様において、バッチ培地はアミノ酸源
を含んでいる。

【００２５】本発明の方法の他の好ましい態様において、流加培地はアミノ酸源を含んでい
る。アミノ酸源は当業者に周知であり、イースト抽出液、植物抽出液、ペプトン
補充物等を含むことが出来る（サムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ｌｏｃ．
Ｃｉｔ．を参照）

【００２６】本発明の方法のさらなる態様において、細菌形質転換体の培養は３０℃から４
２℃の温度範囲で実施される。

【００２７】本発明の方法の特に好ましい態様において、その温度範囲は３５℃から３８℃
である。

【００２８】細菌形質転換体の栄養要求(auxotrophic requirements)を補うために、本発明
の方法ではバッチ培地は細菌宿主株に特異的な補足成分(bacterial host strain
specific supplement)を含んでいることが望ましい。異なった細菌宿主株のた
めの種々の特異的補足成分が記載されており、例えば、チアミン欠乏性細菌形質
転換体に対するチアミンのように、従来技術において周知である。

【００２９】本発明の方法のさらに好ましい態様においては、宿主細胞はステップ（ｃ）の
後に、前記培養物から回収される。細菌形質転換体の回収は、醗酵及び分子生物
学的技術における通常の方法の一つである。形質転換体の回収は、従来技術にお
いて周知である、濾過、遠心分離又は同様な方法を含むことが出来る。

【００３０】本発明の方法のさらに他の好ましい態様においては、宿主細胞はステップ（ｃ
）の後、回収の前後に洗浄ステップを通る。これらの洗浄ステップは、その細胞
の完全性に影響を与えず、その細胞から培養化合物を取り除く溶液中で行われる
ことが出来る。

【００３１】本発明の方法の他の好ましい態様においては、さらなるステップは、ステップ
（ｃ）の後又はさらに好ましい態様のいずれかの中で示されたステップの後のそ
の形質転換体の凍結又は凍結乾燥を含む。ｃｃｃプラスミドをすぐに単離する必
要がない場合、この実施形態は特に有用である。凍結又は凍結乾燥した細胞は、
その後都合よく出荷又は使用するまで貯蔵出来る。

【００３２】本発明の方法のさらに他の好ましい態様においては、さらなるステップはｃｃ
ｃＤＮＡの単離を含む。

【００３３】ｃｃｃＤＮＡを単離する様々な方法は、当業者に周知である。これらはＣｓＣ
ｌ勾配遠心分離及びクロマトグラフィー精製法を包含する（例えば、サムブロッ
ク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、“分子クローニング、ラボラトリー・マニュアル
（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ）”、ＣＳＨプレス（ＣＳＨＰｒｅｓｓ）第２版、１９８９、コールド・
スプリング・ハーバー・ニューヨーク（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｅｒＨａｒｂ
ｏｒＮｅｗＹｏｒｋ）を参照）。

【００３４】上で述べられているように、９０％を超えるｃｃｃモノマーから成る単離され
たプラスミドＤＮＡを得ることが出来る。本発明の教示を用いる場合、当業者は
、遺伝子治療及び核酸ワクチンアプローチのためのプラスミドＤＮＡの品質基準
を満たす大量のｃｃｃＤＮＡを、例えば抗生物質を取り除くための次の労力のか
かる精製ステップなしに得ることが出来る（スコール（Ｓｃｈｏｒｒ）ら、ＤＮ
Ａワクチン（ＤＮＡＶａｃｃｉｎｅｓ）、７７２（１９９５）、２７１−２７
３を参照）。このように、本発明の得られたｃｃｃＤＮＡを、従来技術、例えば
ダビス（Ｄａｖｉｓ）ら、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）１２（１９９４）、１
５０３−１５０９に記載されているような核酸ワクチンに、又はカオ（Ｃａｏ）
ら、ヒト遺伝子治療（ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）６（１９９５
）、１４９７−１５０１で開示されているような遺伝子治療戦略のために使用す
ることが可能である。

【００３５】さらに、他の好ましい態様においては、本発明は抗生物質を含まない培地中で
細菌形質転換体を前培養するステップ（ａ’）をさらに含む方法に関する。

【００３６】本発明の方法の特に好ましい態様において、前記前培養の終了後、細菌形質転
換体は指数増殖期(exponential growth phase)にある。指数増殖期は従来技術に
よって、例えば培養液の光学的濃度を測定することによって評価することが出来
る。

【００３７】図は下記を示している図１：ＤＯフィードバック制御流加培養時のバイオリアクター中でモニタ
ーした場合の溶解酸素、攪拌速度及び流加培地の時間経過。３０Ｌ−バイオリア
クター中での大腸菌ＤＨ５αのプラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβの培養を示す。３
０％の閾値設定点を超えると、ＤＯは攪拌速度を増加させることによって制御さ
れる。４５％閾値設定点を下回ると、ＤＯはバイオリアクター中への栄養溶液の
供給によって制御される。図２：半限定（ｓｅｍｉ−ｄｅｆｉｎｅｄ）グリセロール・イースト抽出
培地中での大腸菌ＤＨ５αのｐＵＫ２１ＣＭＶβの流加培養時の乾燥細胞重量（
ＤＣＷ）及びプラスミド濃度。細菌形質転換体は３０Ｌ−バイオリアクター中で
培養された。図３：３０リッター培養した場合の様々な培養時間（１０−４０ｈ）での
プラスミドＤＮＡ（約２５０ｎｇずつ）の０．８％アガロースゲル電気泳動。プ
ラスミドＤＮＡは、キアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮＭｉｎｉｐｒｅｐ
）キットを用いて、限定（ｄｅｆｉｎｅｄ）培養液より単離された。図４：合成グリセロール培地を用いたｐＵＫ２１ＣＭＶβを含む大腸菌Ｄ
Ｈ５αの流加培養時の乾燥細胞重量及びプラスミド濃度。醗酵は５Ｌ−バイオリ
アクター中で実施された。図５：７リッター培養した場合の様々な培養時間（１０−４４ｈ）でのプ
ラスミドＤＮＡ（約２５０ｎｇずつ）の０．８％アガロースゲル電気泳動。プラ
スミドＤＮＡは、キアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮＭｉｎｉｐｒｅｐ）
キットを用いて、限定（ｄｅｆｉｎｅｄ）培養液より単離された。図６：細胞が回収された場合の、４１時間培養したときのｐＵＴ６４５
プラスミドＤＮＡサンプル（２００ｎｇ/４個の別の単離物）の０．８％アガロ
ースゲル電気泳動。プラスミドＤＮＡはキアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ
Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット（Ｔｉｐ−１００）を用いて別々に単離された。図７：イースト抽出（ＹＥ）培地中のいくつかの培養条件の最終バイオマ
ス。実施例１に記載のように、又はチェン（Ｃｈｅｎ）らによるＪ．インダスト
リアル・ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
１８（１９９７）、４３−４８若しくはラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らに
よるヒト遺伝子治療（ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）７（１９９６
）、１９７１−１９８０において記載されているように培養を実施した。図８：イースト抽出（ＹＥ）培地中でのいくつかの培養の最終プラスミド
濃度。実施例１に記載されているように培養を実施し、そしてチェン（Ｃｈｅｎ
）らによるＪ．インダストリアル・ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノ
ロジー（Ｊ．ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１８（１９９７）、４３−４８又はラヒジャニ（Ｌ
ａｈｉｊａｎｉ）らによるヒト遺伝子治療（ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐ
ｙ）７（１９９６）、１９７１−１９８０において記載されているような培養
と比較した。図９：細胞回収時のイースト抽出（ＹＥ）培地中でのいくつかの培養のバ
イオマスあたりのプラスミド収量。実施例１に記載されているように培養を実施
し、そしてチェン（Ｃｈｅｎ）らによるＪ．インダストリアル・ミクロバイオロ
ジー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ．ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１８（１９９７）、４
３−４８又はラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らによるヒト遺伝子治療（Ｈｕｍ
ａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）７（１９９６）、１９７１−１９８０にお
いて記載されているような培養と比較した。図１０：プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβの制限マップ図１１〜１６：プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）
のＤＮＡ配列図１７：プラスミドｐＵＴ６４９の制限マップ図１８〜２１：プラスミドｐＵＴ６４９の（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）のＤ
ＮＡ配列

【００３８】

【実施例】

下記実施例により本発明を説明する。実施例１：グリセロール／イースト培地中で７．６ｋｂｐｃｃｃプラスミドの
高品質かつ高生産量の生産ｃｃｃプラスミドＤＮＡ単離のためのバイオマスの生産方法は、２３リッター
の作業容量を持つ３０Ｌ−バイオリアクター（ＬＡＢ３０Ｌ、ＭＢＲ、スイス
）中で、プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（７６１２ｂｐ）（図１０〜１６）を
含む大腸菌ＤＨ５αのフィードバック制御流加培養によって実施された。半限定（ｓｅｍｉ−ｄｅｆｉｎｅｄ）バッチ培地（１５リッター）はグリセロ
ール１０ｇ/ｌ、イースト抽出液５．０ｇ/ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄６．０ｇ/ｌ、ＫＨ ₂ ＨＰＯ₄３．０ｇ/ｌ、ＮａＣｌ０．５ｇ/ｌ、クエン酸１．５ｇ/ｌ、ＭｇＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂００．３ｇ/ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ/ｌ及び微量元素溶液１０ｍ
ｌ/ｌから成るものであった。チアミン塩酸塩溶液及び微量元素の保存液（Ｆｅ
Ｃｌ₃・Ｈ₂Ｏ５．４０ｇ/ｌ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１．３８ｇ/ｌ、ＭｎＳＯ ₄ ・Ｈ₂Ｏ１．８５ｇ/ｌ、ＣｏＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．５６ｇ/ｌ、ＣｕＣｌ₂０
．１７ｇ/ｌ、Ｈ₃ＢＯ₃１．０ｇ/ｌ、Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ２．５ｇ/ｌ、
及びクエン酸５．０ｇ/ｌ）を別々に滅菌した。バイオリアクターの滅菌（２５
分間、１２１℃）の前に、ＮａＯＨを用いて培地のｐＨを６．７に調整した。培養は３７℃、０．５ｂａｒで実施した。通気は３０ｌ/分の速度に維持し
、ｐＨは１０％Ｈ₃ＰＯ₄及び／又は２５％ＮＨ₄ＯＨによって制御した。消泡剤
として（プルロニック）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ＰＥ−８１００（ＢＡＳ
Ｆ）を用いた。最小攪拌速度は１００ｒｐｍであった。ｐＵＫ２１ＣＭＶβを含む大腸菌ＤＨ５αの凍結グリセロール株を用いて、１
０００ｍｌ振騰フラスコ中の２００ｍｌのルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅ
ｒｔａｎｉ（ＬＢ））種培地に接種した。培養液を１８０ｒｐｍのオービタル(o
rbital)振騰機上で３７℃で８時間培養した。ＯＤ₆₀₀０．３−０．５の細胞密度
に達した後、この前培養液の５０ｍｌ分量をバイオリアクターに移した。培養中は、溶解酸素濃度が３０％の閾値設定点より低くなったときは、攪拌速
度を前より１％増加させることによって、溶解酸素（ＤＯ）を３０％空気飽和状
態に自動的に維持した。ＤＯ濃度が３０％を超えたときは、攪拌速度を一定にし
た。ＤＯが４５％空気飽和の閾値設定点に達したときは、栄養(nutrient)ポンプ
を自動的に作動させ、グリセロール６００ｇ/ｌ、イースト抽出液９０ｇ/ｌ及び
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２０ｇ/ｌの濃縮溶液を培養液に供給した。栄養ポンプの
最大流速は５０ｍｌ/分であった。ＤＯが４５％より低くなったときは、供給を
中断した。２時間毎に、６００ｎｍにおける光学的密度及び乾燥細胞重量を測定して、細
胞の増殖を調べた。製造元の説明書に従ってキアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧ
ＥＮＭｉｎｉｐｒｅｐ）キット（Ｔｉｐ−２０）を用いて、限定（ｄｅｆｉｎ
ｅｄ）ペレット状培養物からプラスミドＤＮＡを単離した後に、プラスミド濃度
を測定した。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩによる消化の後、シュミット（
Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、Ｊ．バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
）４９（１９９６）、２１９−２２９により記載されているようなキャピラリー
ゲル電気泳動によって、これらのＤＮＡサンプルの定量を実施した。プラスミド
の形状分布の分析のため、及び品質管理として、全ての未消化サンプルの電気泳
動を０．８％アガロースゲル上で実施した。

【００３９】図１は、ＤＯフィードバック制御流加培養時の、バイオリアクター中でモニタ
ーされた場合のＤＯレベル、攪拌速度及び培地溶液値を示している。栄養が失わ
れた１４時間後、ＤＯ濃度は劇的に増加し、供給ループ(feeding loop)が開始す
る。この流加段階の間は、ＤＯ濃度は供給閾値設定点（４５％）と攪拌速度増加
閾値設定点（３０％）の間をゆれ動いた(oscillated)。

【００４０】図２は培養中のバイオマス（乾燥細胞重量）及びプラスミドＤＮＡの形成を示
している。培養開始から３６時間経過するまで細胞の増殖が起こった。乾燥細胞
重量（ＯＤ₆₀₀＝１４０）で４８ｇ/ｌの最終バイオマスが得られた。この反応槽
で生産されたプラスミド濃度は４．６ｇのプラスミドＤＮＡに相当する約２００
ｍｇ/ｌであった。細胞重量あたりのプラスミドの量は約４．２ｍｇ/ｇであった
。選択のための抗生物質を使用しないにもかかわらず、全培養期間中プラスミド
濃度は増加した。

【００４１】アガロースゲル電気泳動は、培養時間全体に渡る高品質のプラスミド生成を示
した（図３）。単離されたプラスミドＤＮＡは９０％を超えるｃｃｃ分子から成
り、かつ遺伝子治療及び核酸ワクチンのアプローチのためのプラスミドＤＮＡの
品質基準を満たしていた（スコール（Ｓｃｈｏｒｒ）ら、ＤＮＡワクチン（ＤＮ
ＡＶａｃｃｉｎｅｓ）７７２（１９９５）、２７１−２７３）。

【００４２】実施例２：合成グリセロール培地中でのｃｃｃプラスミドＤＮＡの高品質生産ｐＵＫ２１ＣＭＶβ（７６１２ｂｐ；ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含む大腸菌
ＤＨ５αのＤＯフィードバック制御流加培養を、５．５リッターの作業量を持つ
７Ｌ−バイオリアクター中（ＬＡＢ７Ｌ、ＭＢＲ、スイス）で実施した。合成
グリセロール培地をこの醗酵に用いた。限定（ｄｅｆｉｎｅｄ）バッチ培地（３．５ｌ）はグリセロール２０ｇ
/ｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄６．０ｇ/ｌ、ＫＨ₂ＨＰＯ₄３．０ｇ/ｌ、ＮａＣｌ０．
５ｇ/ｌ、クエン酸１．５ｇ/ｌ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．３ｇ/ｌ及び
、ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ５．４０ｇ/ｌ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１．３８ｇ/ｌ
、ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ１．８５ｇ/ｌ、ＣｏＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．５６ｇ/ｌ
、ＣｕＣｌ₂０．１７ｇ/ｌ、Ｈ₃ＢＯ₃１．０ｇ/ｌ、Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２
Ｈ₂Ｏ２．５ｇ/ｌ及びクエン酸５．０ｇ/ｌを含む微量元素溶液１０ｍｌ/ｌ
から成るものであった。チアミン塩酸塩５ｍｇ/ｌを濾過により別に滅菌し、バ
イオリアクターに移した。バイオリアクターを滅菌する（１２１⁰Cで２５分間）
前に、培地のｐＨを６．７に調整した。培養は３７⁰C、０．５ｂａｒで実施した。通気は１０ｌ/分に維持し、ｐＨ
は１０％Ｈ₃ＰＯ₄及び／又は２５％ＮＨ₄ＯＨで制御した。消泡剤はプルロニッ
ク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標）ＰＥ−８１００（ＢＡＳＦ）であった。最
小攪拌速度は１５０ｒｐｍであった。ｐＵＫ２１ＣＭＶβを含む大腸菌ＤＨ５αの凍結グリセロール株を用い、３０
０ｍｌ振騰フラスコ中の５５ｍｌＬＢ種培地に接種した。１８０ｒｐｍのオービ
タル振騰機上で、培養液を３７℃で８時間培養した。ＯＤ₆₀₀０．３−０．５の
細胞密度に達した後、この前培養液５０ｍｌをバイオリアクターに移した。培養中、溶解酸素（ＤＯ）濃度が３０％より低くなったときは、攪拌速度を前
より１％増加させることにより、溶解酸素を３０％空気飽和の状態に自動的に維
持した。ＤＯ濃度が３０％空気飽和を超えるときは、攪拌速度を一定にした。Ｄ
Ｏが４５％空気飽和を超えるときは、グリセロール１０００ｇ/ｌ及びＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂Ｏ２０ｇ/ｌの濃縮溶液が培養液に供給するために栄養ポンプを自動的
に動かした。栄養ポンプの最大流速は３０ｍｌ/分であった。ＤＯが４５％より
低くなった場合には供給を停止した。６００ｎｍにおける光学的密度及び乾燥細胞重量を測定することにより、２時
間毎の細胞の増殖を測定した。製造元の説明書に従ってキアゲン・ミニプレップ
（ＱＩＡＧＥＮＭｉｎｉｐｒｅｐ）キット（Ｔｉｐ−２０）を用いて、限定（
ｄｅｆｉｎｅｄ）ペレット状培養物からプラスミドＤＮＡを単離した後、プラス
ミド濃度を測定した。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化した後、シュミ
ット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、１９９６（シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、Ｊ．
バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）４９（１９９６），２１９
−２２９）によって記載されているようにキャピラリーゲル電気泳動によって、
これらのＤＮＡサンプルの定量を実施した。プラスミドの形状分布の解析のため
および品質管理として、全ての未消化サンプルの電気泳動を０．８％アガロース
ゲル上で実施した。図４は培養中のバイオマス及びプラスミドＤＮＡの形成を示す。培養開始から
４１時間経過するまで、細胞の増殖が起こった。合成培地を用いることによって
、乾燥細胞重量（ＯＤ₆₀₀＝１４５）で４８ｇ/ｌの最終バイオマスが得られた。
生成されたプラスミド濃度は約１００ｍｇ/ｌであり、これは５５０ｍｇのプラ
スミドＤＮＡに相当していた。細胞重量当りで得られたプラスミド量は約２．１
ｍｇ/ｇであった。アガロースゲル電気泳動によって明らかになったように、培養時間全体に渡り
プラスミド生成物が高い収量で得られた（図５）。単離されたプラスミドＤＮＡ
はｃｃｃモノマーとして得られた。コンカテマー(concatemers)として存在する
ｃｃｃダイマーが少量検出された。ＤＮＡサンプルは、遺伝子治療及び核酸ワク
チンアプローチのためのプラスミドＤＮＡの品質基準を満たしていた。

【００４３】実施例３：高塩濃度醗酵による遺伝子治療アプローチのためのプラスミ
ドの高品質生産ｐＵＴ６４９（図１２〜２１）（４６１８ｂｐ；配列番号（ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：）１）（ｐＵＴ６４９ベクターはユーロゲンテック−カタログ（Ｅｕｒｏｇ
ｅｎｔｅｃ−ｃａｔａｌｏｇｕｅ）１９９４（ユーロゲンテック、リージェ（
Ｅｕｒｏｇｅｎｔｉｅｃ，Ｌｉeｇｅ）ベルギー）の中のカタログ番号ＶＥ−１
１３４−ａの項に記載されている）を含む大腸菌ＤＨ５αのＤＯフィードバック
制御流加培養を、実施例１に記載されたものと同じグリセロールイースト抽出培
地（７．５リッターバッチ培地）を用いて実施した。実施例１に記載されたもの
と同様の培養条件が適用され、培養は１０リッターの作業容量を持つバイオリア
クター（ＢＲＡＵＮＢｉｏＥ）中で行われた。通気は１５ｌ/ 分であった。
バッチ段階では攪拌速度は８００ｒｐｍに設定した。流加段階では、ＤＯが３０
％の閾値設定点より低くなったときは、この速度を１００ｒｐｍ上昇させた。Ｄ
Ｏが４５％の閾値設定点に達した時、流加培地をバイオリアクター中にポンプで
送り込んだ（流速１０ｍｌ/分）。１リッター振騰フラスコ中でｐＵＴ６４９を含む大腸菌ＤＨ５αの５００μｌ
グリセロール株を１００ｍｌバッチ培地に接種した。培養はオービタル振騰機の
上で、３７℃で５時間行った。前培養液の１．５ｍｌ接種物をバイオリアクター
に移した。細菌形質転換体が定常段階に達した培養開始から４１時間後に、最終バイオマ
スは乾燥細胞重量で６０ｇ/ｌ及び２３０ｍｇ/ｌのプラスミドをもたらした、９
０％を超えるｃｃｃモノマープラスミドＤＮＡのプラスミドＤＮＡが単離できた
（図６）。

【００４４】実施例４：異なったバッチ及び流加培養条件の比較７Ｌ−バイオリアクター中でのルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎ
ｉ）−（ＬＢ）培地（サムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ｌｏｃ．ｃｉｔ．
）におけるバッチ培養、実施例１に記載されたような流加培養及び従来技術にお
いて開示されているような流加培養を比較した。チェン（Ｃｈｅｎ）ら、（Ｊ．
インダストリアル・ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ．Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ）１８（１９９７）、４３−４８）はバッチ段階でデキストロースイ
ースト抽出液培地を使用し、グルコースイースト抽出液流加培地を加えたが、ラ
ヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）ら（ヒト遺伝子治療（ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴ
ｈｅｒａｐｙ）７（１９９６），１９７１−１９８０）は、細菌形質転換体中
で温度制御可能な点変異（point mutation）を用いて、バッチ及び流加培養を抗
生物質を含むグルコースイースト抽出液培地中で実施した。

【００４５】図７は、細胞が定常増殖段階に達した時の最終バイオマスを示す。ＬＢ培地中
又はラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らにより記載されたバッチ培養におけるバ
イオマスの収量は低かった。チェン（Ｃｈｅｎ）らによって記載されているよう
に、又は本発明中で記載されているように、栄養液の供給はより高いバイオマス
収量をもたらした。

【００４６】図８において示されるように、ＬＢ培地中でのバッチ培養と比較して、ラヒジ
ャニ(Ｌａｈｉｊｉａｎｉ)らにより記載されたようなグルコースイースト抽出液
培地を用いた、又は本発明中で記載されたようなグリセロールイースト抽出液培
地を用いた流加醗酵においては、プラスミド濃度は３５−４０倍増加した。しか
しながら、チェン（Ｃｈｅｎ）らによって実施されたような流加培養はより低い
プラスミド濃度をもたらした。

【００４７】ラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らは培養中にカナマイシン抗生物質を用い、
抗生物質を含まないグリセロールイースト抽出液培地を用いる本発明の方法で得
られたものと同等のプラスミド濃度を得た。ラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）ら
は得られたバイオマスに関して、どのような数値も開示していないので、バイオ
マスの比較は出来なかった。図９に示されるように、ＬＢ培地中でのバッチ条件と比較して、グリセロール
イースト抽出液培地中での流加培養は、バイオマス当たりより高いプラスミドの
収量をもたらす。バイオマス当たりの最も高いプラスミド収量は、グルコースイ
ースト抽出液培地中でのバッチ培養によって得ることが出来たが、全体のプラス
ミド収量は少なかった。

【００４８】単離したプラスミドＤＮＡの均質性及び純度は、本発明に従って実施した培養
条件下で最良であった（図３、５、６）。ラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らは
、単離されたＤＮＡは大量のＲＮＡ及び鎖状(concatenated)ダイマーを含んでい
ると報告したが、一方でチェン（Ｃｈｅｎ）らは大量の混入ゲノムＤＮＡを得て
いた。それ故、そのような混入非ｃｃｃＤＮＡ、ＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの除去
には追加の操作段階を必要し、時間がかかり、かつ従来技術によって単離したＤ
ＮＡの収量をさらに減少させる。

【００４９】要約すれば、データの分析により、所望の生成物の純度に関して、任意に又は
好ましくは得られた所望の最終生成物の量と関連付けることにより、本発明の方
法が従来技術より優れていることをはっきりと結論付けることができる。本発明
の方法は他のプラスミドへ応用でき、また同様又は同様の有利な結果をもたらす
。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＤＯフィードバック制御流加培養時のバイオリアクター中でモニター
した場合の溶解酸素、攪拌速度及び流加培地の時間経過。３０Ｌ−バイオリアク
ター中での大腸菌ＤＨ５αのプラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβの培養を示す。３０
％の閾値設定点を超えると、ＤＯは攪拌速度を増加させることによって制御され
る。４５％閾値設定点を下回ると、ＤＯはバイオリアクター中への栄養溶液の供
給によって制御される。

【図２】半限定（ｓｅｍｉ−ｄｅｆｉｎｅｄ）グリセロール・イースト抽出培
地中での大腸菌ＤＨ５αのｐＵＫ２１ＣＭＶβの流加培養時の乾燥細胞重量（Ｄ
ＣＷ）及びプラスミド濃度。細菌形質転換体は３０Ｌ−バイオリアクター中で培
養された。

【図３】３０リッター培養した場合の様々な培養時間（１０−４０ｈ）でのプ
ラスミドＤＮＡ（約２５０ｎｇずつ）の０．８％アガロースゲル電気泳動。プラ
スミドＤＮＡは、キアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮＭｉｎｉｐｒｅｐ）
キットを用いて、限定（ｄｅｆｉｎｅｄ）培養液より単離された。

【図４】合成グリセロール培地を用いたｐＵＫ２１ＣＭＶβを含む大腸菌ＤＨ
５αの流加培養時の乾燥細胞重量及びプラスミド濃度。醗酵は５Ｌ−バイオリア
クター中で実施された。

【図５】７リッター培養した場合の様々な培養時間（１０−４４ｈ）でのプラ
スミドＤＮＡ（約２５０ｎｇずつ）の０．８％アガロースゲル電気泳動。プラス
ミドＤＮＡは、キアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮＭｉｎｉｐｒｅｐ）キ
ットを用いて、限定（ｄｅｆｉｎｅｄ）培養液より単離された。

【図６】細胞が回収された場合の、４１時間培養したときのｐＵＴ６４５プ
ラスミドＤＮＡサンプル（２００ｎｇ/４個の別の単離物）の０．８％アガロー
スゲル電気泳動。プラスミドＤＮＡはキアゲン・ミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ
Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット（Ｔｉｐ−１００）を用いて別々に単離された。

【図７】イースト抽出（ＹＥ）培地中のいくつかの培養条件の最終バイオマス
。実施例１に記載のように、又はチェン（Ｃｈｅｎ）らによるＪ．インダストリ
アル・ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒ
ｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
１８（１９９７）、４３−４８若しくはラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らによ
るヒト遺伝子治療（ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）７（１９９６）
、１９７１−１９８０において記載されているように培養を実施した。

【図８】イースト抽出（ＹＥ）培地中でのいくつかの培養の最終プラスミド濃
度。実施例１に記載されているように培養を実施し、そしてチェン（Ｃｈｅｎ）
らによるＪ．インダストリアル・ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロ
ジー（Ｊ．ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１８（１９９７）、４３−４８又はラヒジャニ（Ｌａ
ｈｉｊａｎｉ）らによるヒト遺伝子治療（ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐ
ｙ）７（１９９６）、１９７１−１９８０において記載されているような培養
と比較した。

【図９】細胞回収時のイースト抽出（ＹＥ）培地中でのいくつかの培養のバイ
オマスあたりのプラスミド収量。実施例１に記載されているように培養を実施し
、そしてチェン（Ｃｈｅｎ）らによるＪ．インダストリアル・ミクロバイオロジ
ー・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ．ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１８（１９９７）、４３
−４８又はラヒジャニ（Ｌａｈｉｊａｎｉ）らによるヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａ
ｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）７（１９９６）、１９７１−１９８０におい
て記載されているような培養と比較した。

【図１０】プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβの制限マップ

【図１１】プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）のＤＮ
Ａ配列

【図１２】プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）のＤＮ
Ａ配列

【図１３】プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）のＤＮ
Ａ配列

【図１４】プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）のＤＮ
Ａ配列

【図１５】プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）のＤＮ
Ａ配列

【図１６】プラスミドｐＵＫ２１ＣＭＶβ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）のＤＮ
Ａ配列

【図１７】プラスミドｐＵＴ６４９の制限マップ

【図１８】プラスミドｐＵＴ６４９の（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）のＤＮＡ配
列

【図１９】プラスミドｐＵＴ６４９の（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）のＤＮＡ配
列

【図２０】プラスミドｐＵＴ６４９の（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）のＤＮＡ配
列

【図２１】プラスミドｐＵＴ６４９の（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）のＤＮＡ配
列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者フラッシェルエルヴィンドイツ連邦国、ビーレフェルドＤ− 33619、テルグターシュトラーセ２ (72)発明者シュリーフマルティンドイツ連邦国、ビーレフェルドＤ− 33739、アムベルグシークＦターム(参考） 4B024 AA20 CA01 DA06 EA04 GA19 4B065 AA26X AB01 AC20 BB02 BB03 BB06 BB12 BC12 BC14 BD09 BD11 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）バッチ培養条件下で、（ａａ）炭素源；（ａｂ）無機塩混合物；（ａｃ）窒素源；を含む抗生物質を含まないバッチ培地を含有するバイオリアクター中で細菌形質
転換体を培養し；（ｂ）ＤＯが閾値設定点を越えて上昇した後、バッチ段階の最後に、（ａ）の
前記培養液にフィードバック条件下で、（ｂａ）炭素源；及び（ｂｂ）マグネシウム塩；を含む流加培地の一部を供給し；（ｃ）細菌形質転換体に前記流加培地を代謝させることを含むｃｃｃプラスミ
ドＤＮＡの単離のためのバイオマス製造方法。
【請求項２】ステップ（ｂ）は、閾値設定点を越えるＤＯの各上昇の後に繰り
返し供給サイクルを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】細菌形質転換体が大腸菌細胞である請求項１及び２に記載の方法
。
【請求項４】グリセロールが炭素源として使用される請求項１から３に記載の
方法。
【請求項５】ＮＨ₃が窒素源として使用される請求項１から４のいずれか１項
に記載の方法。
【請求項６】バッチ培地中の炭素源が１００ｇ/ｌ以下の濃度である請求項１
から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】流加培地中の炭素源が１０００ｇ/ｌ以下の濃度である請求項１
から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】窒素源が３０％以下の濃度である請求項１から７のいずれか１項
に記載の方法。
【請求項９】無機塩混合物がＮａ₂ＨＰＯ₄を６ｇ/ｌ以下、ＫＨ₂ＰＯ₄を３ｇ/
ｌ以下、ＮａＣｌを０．５ｇ/ｌ以下及びクエン酸・Ｈ₂Ｏを１．５ｇ/ｌ以下含
む請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】前記無機塩混合物もまたマグネシウム塩を含む請求項９に記載
の方法。
【請求項１１】前記マグネシウム塩が約０．３ｇ／の濃度のＭｇＳＯ₄である
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】ステップ（ｂ）においてマグネシウム塩濃度が５から１００ｍ
Ｍの範囲内にある請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】ステップ（ｂ）においてマグネシウム塩濃度が８０ｍＭである
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】マグネシウム塩がＭｇＳＯ₄である請求項１から１３のいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項１５】微量元素の溶液はステップ（ａ）及び／又は（ｂ）において添
加される請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】微量元素溶液はＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、Ｍ
ｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、ＣｏＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ＣｕＣｌ₂、Ｈ₃ＢＯ₃、Ｎａ₂ＭｏＯ₄・
２Ｈ₂Ｏ及びクエン酸を含む請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】バッチ培地がアミノ酸源を含む請求項１から１６のいずれかに
記載の方法。
【請求項１８】流加培地がアミノ酸源を含む請求項１から１７のいずれかに記
載の方法。
【請求項１９】細菌形質転換体の培養が３０℃から４２℃の温度範囲で実施さ
れる請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】温度範囲が３５℃から３８℃である請求項１から１９に記載の
方法。
【請求項２１】バッチ培地が細菌宿主株特異的補足物を含む請求項１から２０
のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】宿主細胞がステップ（ｃ）の後に前記培養液から回収される請
求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】ステップ（ｃ）の後、宿主細胞が回収の前後に洗浄ステップに
付される特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】ステップ（ｃ）の後のさらなるステップは宿主細胞の凍結又は
凍結乾燥を含む請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】ステップ（ｃ）の後、又は請求項２２から２４に記載のステッ
プの後のさらなるステップは、ｃｃｃＤＮＡの単離を含む請求項１から２４のい
ずれかに記載の方法。
【請求項２６】抗生物質を含まない培地中で細菌形質転換体の前培養のステッ
プ（ａ’）をさらに含む請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】前記前培養の終了後、細菌形質転換体が指数増殖期にある請求
項２６に記載の方法。
【請求項２８】バッチ培地、流加培地及び／又は前培養に使われた培地が、合
成又は半合成培地である請求項１から２７のいずれかに記載の方法。