EA010836B1 - Способ ферментации плазмидной днк - Google Patents
Способ ферментации плазмидной днк Download PDFInfo
- Publication number
- EA010836B1 EA010836B1 EA200700416A EA200700416A EA010836B1 EA 010836 B1 EA010836 B1 EA 010836B1 EA 200700416 A EA200700416 A EA 200700416A EA 200700416 A EA200700416 A EA 200700416A EA 010836 B1 EA010836 B1 EA 010836B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- plasmid
- fermentation
- dna
- batch
- growth
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 292
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 152
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 152
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 100
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 72
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 69
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 23
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims description 38
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 37
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 25
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 15
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 abstract description 5
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 abstract description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 85
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 85
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 31
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 27
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 25
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 16
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 15
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 14
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 11
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 10
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 10
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 9
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 9
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 7
- 108091006090 chromatin-associated proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 6
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 6
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 5
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 4
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 101150114042 tsgA gene Proteins 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710141836 DNA-binding protein HU homolog Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710174628 Modulating protein YmoA Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000015925 Proto-oncogene Mas Human genes 0.000 description 2
- 108050004181 Proto-oncogene Mas Proteins 0.000 description 2
- 101100453673 Rattus norvegicus Kdm3a gene Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101100273253 Rhizopus niveus RNAP gene Proteins 0.000 description 2
- 101100298775 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP11 gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 101000727826 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase RYK Proteins 0.000 description 1
- 101150100969 KOR gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031819 Kappa-type opioid receptor Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 241000036848 Porzana carolina Species 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100112127 Staphylococcus aureus capK gene Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102100029759 Tyrosine-protein kinase RYK Human genes 0.000 description 1
- 240000003864 Ulex europaeus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 102000022628 chromatin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091013410 chromatin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021321 essential mineral Nutrition 0.000 description 1
- 101150032670 est gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000021616 negative regulation of cell division Effects 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 229940068107 nitrogen 100 % Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000006180 nutrition needs Nutrition 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 108010083127 phage repressor proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical class [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000020712 soy bean extract Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Для обеспечения экономической осуществимости будущих ДНК вакцин и ДНК терапий необходимы улучшенные технологии продуцирования плазмидной ДНК. Описаны общие способы, при помощи которых можно значительно увеличить эффективность продуцирования плазмидной ДНК в ферментаторе. Эти способы представляют стратегии периодической ферментации с подпиткой, скомбинированные с новыми температурными сдвигами в фазе роста и индукции.
Description
Настоящее изобретение относится к продуцированию ковалентно замкнутых кольцевых (кзк) рекомбинантных молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), таких как плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), бактериофаги, вирусные векторы и их гибриды, и конкретнее представляет собой способ продуцирования указанных молекул ДНК с высокими уровнями в ферментационной культуре.
Предшествующий уровень техники
Настоящее изобретение относится к продуцированию ковалентно замкнутых кольцевых рекомбинантных молекул ДНК. Такие молекулы полезны в биотехнологии, трансгенных организмах, генной терапии, терапевтической вакцинации, сельскохозяйственных и ДНК-вакцинах.
В свете изобретения было проведено исследование предшествующего уровня техники. Плазмиды Е.сой в течение длительного времени представляли собой единственный наиболее важный источник рекомбинантных молекул ДНК, используемых исследователями и в промышленности. В настоящее время плазмидная ДНК становится все более важной в качестве следующего поколения биотехнологических продуктов (генные лекарственные средства и ДНК-вакцины), занимающих свое место в клинических испытаниях и в конечном счете на фармацевтическом рынке. Плазмидные ДНК-вакцины могут найти применение в качестве профилактических вакцин при вирусных, бактериальных заболеваниях или заболеваниях, вызванных паразитами; в качестве иммунизирующих агентов для приготовления гипериммунных глобулиновых продуктов; в качестве терапевтических вакцин для инфекционных заболеваний или в качестве противораковых вакцин. Плазмиды также используют в генной терапии или генных заместительных приложениях, при которых желаемый генный продукт экспрессируется из плазмиды после введения пациенту.
В настоящее время стандарты Управления по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (ΕΌΑ) не определены, за исключением предварительной формы (см. ΕΌΑ Рош1к 1о Сопббсг оп Р1акш1б ΌΝΑ Уассшек Гог РгсуспЦус 1иГесйоик Б^еаке ΙηάίοαΙίοηδ. 1996). Тем не менее, в будущем международные стандарты чистоты плазмидной ДНК, вероятно, будут такими же, как стандарты, используемые для рекомбинантных белковых продуктов, аналогично продуцируемых путем ферментации Е.еой, или очень схожими с ними, и такие стандарты превосходят чистоту, которую в настоящее время достигают путем применения общепризнанных способов. Наиболее приближенно, приемлемый стандарт меньше 100 пг геномной ДНК хозяина на дозу (см. ЕБА Рош1к 1о еогМбсг ίη 1йе сйатас1спх;Шоп оГ се11 1шек икеб 1о ртобисе Ью1од1ек, 1993) значительно ниже уровней, которые в настоящее время могут быть достигнуты для очищенных плазмидных препаратов (100 пг на дозу 1 мг эквивалентны одной части на 10 млн).
Хорошо известны основные способы получения плазмид (путем бактериальной ферментации) и их очистки (например, при помощи способа щелочного лизиса (В1тЬо1ш, Н.С., Бо1у 1. 1979, М.1с1е1с Ас1бк Кек. 7: 1513-1523)). Исходно, пасту ферментированных бактериальных клеток ресуспендируют и лизируют (с использованием комбинации гидроксида натрия и додецилсульфата натрия), после чего раствор нейтрализуют путем добавления кислой соли (например, ацетата калия), осаждающей бактериальную ДНК и большую часть клеточного дебриса. Основное количество сверхспирализованной плазмидной ДНК остается в растворе наряду с примесями бактериальной РНК, ДНК и белков, а также эндотоксином Е.сой (липополисахаридом или ЛПС). Растворимую фракцию затем отделяют путем фильтрования и подвергают множеству стадий очистки, которые могут включать расщепление РНКазой; хроматографию (ионообменную гель-фильтрацию, гидроксиапатитную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, обращенно-фазовую хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и т.д.); диафильтрацию; органическую экстракцию, избирательное осаждение и т.д.
Очевидно, что увеличение чистоты исходного материала и достижение более хорошей последующей очистки представляют собой существенно важные задачи при производстве ДНК клинической чистоты в промышленном масштабе.
Рассмотрение ферментационных сред.
Разработка сбалансированной среды основана на энергетических потребностях клетки и элементном составе. Как правило, пищевые потребности удовлетворяются при помощи минимальных сред или сред полуопределенного состава.
Среды полуопределенного состава содержат комплекс компонентов, таких как дрожжевой экстракт, казаминовые кислоты и пептоны. Добавление сложных соединений обеспечивает факторами роста, аминокислотами, пуринами и пиримидинами и часто поддерживает более высокие плотности клеток.
Углерод составляет половину состава клеток. Соответственно, углерод включен в наибольших количествах. Источник углерода обеспечивает энергией и биомассой и обычно его используют в качестве лимитирующего питательного вещества. Глюкоза представляет собой обычный источник углерода. Она очень эффективно метаболизируется и поэтому обеспечивает более высокий клеточный выход. Однако
- 1 010836 высокие концентрации глюкозы вызывают нежелательную продукцию ацетата вследствие метаболического избытка (известного как эффект Крабтри (СгаЬ1гее)). Также используют глицерин, и зачастую он представляет собой предпочтительный источник углерода в периодических культурах. Хотя клеточные выходы при применении глицерина несколько меньше по сравнению с глюкозой, глицерин не вызывает столь высоких уровней продукции ацетата и может быть использован в более высоких концентрациях, не оказывая ингибирующего действия. Глицерин также поддерживает уменьшенные максимальные удельные скорости роста.
Потребность в азоте может быть удовлетворена при помощи неорганических или органических источников азота. Аммиак и соли аммония (например, ИН4С1, (ΝΗ4)28Ο4) используют в минимальных средах. Среды полуопределенного состава обеспечивают азотом частично или полностью из комплексных компонентов, включающих дрожжевой экстракт, пептоны и казаминовые кислоты.
Для роста, метаболизма и ферментативных реакций требуются неорганические вещества. Магний, фосфор, калий и серу, как правило, добавляют в виде отдельных компонентов сред. Ди- и монокалийортофосфаты обеспечивают калием и фосфором и в определенных пропорциях действуют в качестве буферных агентов. Гептагидрат сульфата магния часто используют в качестве источника магния и серы. Другие необходимые минеральные вещества включают кальций, медь, кобальт, железо, марганец, молибден и цинк. Они требуются в меньших количествах и часто обеспечиваются путем добавления раствора микроэлементов, хотя они обычно присутствуют в виде примесей к основным ингредиентам. Осмолярность доводят с помощью хлорида натрия.
Применение продуктов животного происхождения, и в частности бычьих продуктов, при получении плазмиды неприемлемо ввиду риска заражения прионами или вирусами. Все компоненты сред должны быть аттестованы на отсутствие животного продукта. Для множества компонентов, имеющих животное происхождение, существуют полученные из растений заменители (например, растительный глицерин, соевый пептон).
Рассмотрения способа ферментации плазмиды.
Скорость роста.
Обеспечение пониженной скорости роста представляет собой объединяющий принцип высококачественной ферментации с высоким выходом плазмиды. Высокие скорости роста ассоциированы с продукцией ацетата, нестабильностью плазмиды и меньшим процентным содержанием сверхспирализованной плазмиды. Пониженная скорость роста позволяет исключить зависимую от скорости роста нестабильность плазмиды путем обеспечения времени для репликации плазмиды, синхронизируемой с клеточным делением.
Условия роста.
Ферментация дает возможность контролировать и следить за множеством параметров, влияющих на качество и выход плазмиды. Известно, что на сверхспирализацию влияет содержание кислорода и температура (Иогтал С.1. е! а1. 1988, 1. Вас1егю1 179: 2816-2826, Оо1Й81еш Е., ИгЕса К. 1984 Ргос. Ναΐΐ. Асай. 8с1. И8А. 81: 4046-4050). Показано, что кислород играет роль в стабильности плазмиды. В одном из исследований (Норкшк Ό.Ι., Ве1епЬаидк М.1., 0Ииг|а11 Р. 1987 Вю1ескпо1 Вюепд. 29: 85-91) обнаружено, что одна капля с растворенной концентрацией кислорода до 5% насыщения воздуха приводит к быстрой утрате стабильности плазмиды. В другом исследовании (№тйет Р.К., ΐπνίπ Ν., Тйотркоп В.О., Огау М.Р. 1993, Вю1ес1то1. Вюепд. 41: 666-670) показано, что колебания в поступлении кислорода приводят к нестабильности плазмиды. Кроме того, на образование плазмид с одноцепочечными разрывами и мультимеров может влиять множество параметров, включающих температуру, рН, растворенный кислород, концентрацию питательных веществ и скорость роста (Ииг1апй Р.Н., Еайтап Е.М. 1998, Αάν. Эгид. Ие11уег Ре\'. 30: 33-48). Оптимальная температура для роста Е.сой составляет 37°С. Однако для снижения максимальной удельной скорости роста при периодической ферментации могут быть использованы более низкие температуры (30-37°С). Более высокие температуры (36-45°С) также могут быть использованы для индукции избирательной амплификации плазмид с определенными ориджинами репликации, например рИС и рММ1 (\Уопд Е.М., Миеапд М.А., Ро1щку, В. 1982, Ргос. №11. Асай. 8ск И8А. 79: 35703574, Ьш-Скао 8., Скеп ν.Έ, \Уопд Т.Т. 1992, Мо1. МюгоЬю. 6: 3385-3393), и неконтролируемый репликон Р плазмид. Натапп е!. а1., 2000 (Натапп С.\У.. №екеп 1., БадеШет Е. 2000, международная заявка на патент XVО 0028048) сообщают о способе продуцирования Р плазмид, при котором продуцирование плазмид поддерживают на низком уровне (путем применения низкой температуры) для того, чтобы избежать замедления роста вследствие синтеза плазмидной ДНК; как только клеточная популяция становится высокой, индуцируют продуцирование плазмиды путем сдвига температуры.
Периодическая ферментация.
Периодическая ферментация имеет основное преимущество, заключающееся в простоте. Все питательные вещества, которые используют для клеточного роста и продуцирования плазмиды в течение периода культивирования, присутствуют в момент инокуляции. Периодическая ферментация имеет лаг-фазу, фазу экспоненциального роста и стационарную фазу. Применение подходящего инокулюма (1-5% объема культуры) сокращает длительность лаг-фазы. Во время экспоненциальной фазы все пита
- 2 010836 тельные вещества находятся в избытке, поэтому удельная скорость роста, по существу, представляет собой максимальную удельную скорость роста, цмакс, предсказываемую в соответствии с кинетикой Монода (Мопоб). Как обсуждалось ранее, для продуцирования плазмиды желательны пониженные скорости роста. При периодической ферментации скорость роста может быть уменьшена только путем уменьшения цмакс. Этого достигают путем выращивания при более низких температурах и путем использования глицерина вместо глюкозы. Периодическая ферментация при 30°С с использованием глицерина, как правило, приводит в результате к цмакс не больше 0,3 ч-1, которая достаточна для предотвращения вредной аккумуляции ацетата и ассоциированной со скоростью роста нестабильности плазмиды (ТНа(сНег Ό.Κ., НбсНсоск А., Напак 1.А.1., Уаг1еу Э.Ь. 2003, патент США № 6503738). Глицерин также может быть использован в гораздо более высоких концентрациях по сравнению с глюкозой при отсутствии ингибирования, приводя к более высоким выходам биомассы. Как правило, при периодической ферментации могут быть получены выходы биомассы до 60 г/л (масса клеток в граммах).
Периодическая ферментация с подпиткой.
Периодическая ферментация с подпиткой особенно полезна для продуцирования плазмид. Контролируемое добавление лимитирующего питательного вещества дает возможность для контроля скорости при скоростях меньших цмакс. Кроме того, периодическая ферментация с подпиткой приводит в результате к более высоким выходам. Ключевым для периодической ферментации с подпиткой является поступление субстрата с такой скоростью, чтобы он полностью потреблялся. В результате остаточная концентрация субстрата приблизительно равна нулю, и достигается максимальная конверсия субстрата. Избегают метаболического избытка вследствие избытка субстрата, уменьшая образование ингибирующего ацетата.
Периодическая ферментация с подпиткой начинается с периодической фазы. Клетки инокулируют в исходный объем среды, содержащей все нелимитирующие питательные вещества и исходную концентрацию лимитирующего субстрата. Контролируемая подпитка лимитирующим питательным веществом начинается, как только клетки потребят исходное количество субстрата.
Одна из наиболее простых и наиболее эффективных стратегий подпитки представляет собой экспоненциальную подпитку. Этот способ дает возможность для выращивания культуры с определенной скоростью меньше чем цмакс без необходимости контроля процесса конечным продуктом. Ферментация начинается с периодического режима, содержащего неингибирующую концентрацию субстрата. Клетки выращивают при ц,,,|кс до истощения субстрата, в этот момент начинается подпитка питательным веществом.
Способы РК-стат. и рН-стат. достаточно легко осуществлять, поскольку большинство стандартных ферментационных систем включает контроль за содержанием растворенного кислорода и рН. Тенденции в содержании растворенного кислорода (РК) и рН могут указывать на то, доступен ли субстрат для клеток. Истощение субстрата вызывает уменьшенное поглощение кислорода, и концентрация РК в среде увеличивается. рН также увеличивается вследствие потребления метаболических кислот. Подпитка запускается тогда, когда содержание РК или рН увеличивается выше установленного порога. Скорость роста можно регулировать путем изменения порогового значения содержания РК или рН.
Примеры способов ферментации плазмиды.
Оценка достигаемых в настоящее время выходов свидетельствует о том, что типичная лабораторная культура во встряхиваемой колбе продуцирует от 1 до 5 мг плазмидной ДНК/л культуры, тогда как ферментатор, управляемый компьютером, может производить, как правило, 10-250 мг/л.
ЬаЬуаш е! а1. (ЪаЬцаш В., Ни11еу С., 8опапо С., Ногп Ν.Α., Мащие! М. 1996 Нишап Сепе ТЬегару 7: 1971-1980) сообщали об использовании плазмиды, полученной из рВВ322, с температурочувствительной одноточечной мутацией (ориджин рИС) в ферментационной среде с экспоненциальной подпиткой и сдвигом температуры с 37 до 42-45°С. Они достигли выхода плазмиды 220 мг/л в ферментаторе объемом 10 л. Та же самая плазмида без мутации при периодической ферментации (ориджин получен из рВВ322) при 30°С позволила получать только 3 мг/л плазмиды. РпеНк е! а1. (Епекк К., Е1акске1 Е., 8с111ееГ М., 8с1шиб1 Т., 2003, патент США № 6664078) описывают периодический способ с подпиткой с использованием среды на основе дрожжевого экстракта с глицерином и с подпиткой, с контролем процесса конечным продуктом по типу РК-стат. Ферментацию начинали с исходного объема партии 7,5 л. Перемешивание увеличивали для поддержания РК выше 30%. Подпитывающую среду закачивали тогда, когда РК достигал установленного порогового значения 45%. Культура достигала стационарной фазы через 41 ч с получением 60 г/л ЭСТУ (масса клеток в граммах) и 230 мг/л плазмиды. С1еп (С1еп, У., 1999, патент США № 5955323) использовал периодический способ с подпиткой в среде полуопределенного состава с комбинацией контроля процесса конечным продуктом по типу РК-стат. и рН-стат. Пороговые заданные величины РК и рН составляли соответственно 50% и 7,2. Когда содержание РК падало ниже 30% ввиду высокой метаболической активности, скорость перемешивания увеличивали на определенный процент от предшествующей скорости. В ферментаторе объемом 7 л эта стратегия обеспечивала удельную скорость роста 0,13 ч-1 и выходы плазмиды 82-98 мг/л. Эиг1апб апб Еак1шап, выше, 1998, сообщают о периодической ферментации при 37°С в запатентованной среде. Их способ, как правило, обеспечивает выход
- 3 010836
130 мг/л с максимальным выходом 250 мг/л.
Даже с учетом предшествующего уровня техники сохраняется необходимость в экономичном способе продуцирования плазмидной ДНК высокой чистоты. Описанные выше ферментационные среды и способы включают среды и способы, известные в настоящее время в области техники для улучшения плазмидной продуктивности, такие как пониженная скорость роста и индукция копийности плазмиды при помощи высокой температуры. Эти способы выходят на плато при 200-250 мг плазмидной ДНК/л. Этот низкий выход накладывает бремя расходов и чистоты на коммерческое применение способов продуцирования плазмидной ДНК. Хотя экономия в силу увеличения масштабов производства в будущем значительно уменьшит стоимость ДНК, для достижения желаемой стоимости необходимо гораздо более экономичное решение этой проблемы. Кроме того, международные стандарты чистоты плазмидной ДНК, вероятно, будут такими же, как стандарты, используемые для рекомбинантных белковых продуктов, аналогично продуцируемых в результате ферментации Ε.οοίί. или очень сходными с ними, и такие стандарты превосходят существующую в настоящее время чистоту, которая достижима при помощи общепринятых способов. Увеличение выхода (1 мг ДНК/г клеточной пасты) ферментации уменьшит стоимость и увеличит чистоту ДНК (поскольку уменьшит количество перерабатываемого материала).
Описание изобретения
Изобретение представляет собой способ продуцирования репликонов ДНК с использованием улучшенных периодических способов и периодических способов с подпиткой для продуцирования плазмиды. Конкретно, раскрыт способ периодической ферментации с подпиткой, при котором содержащие плазмиду клетки Ε.οοίί выращивают при пониженной температуре в течение периодической фазы с подпиткой, в течение которой скорость роста ограничена, с последующим сдвигом температуры в сторону повышения и продолжающимся выращиванием при повышенной температуре для накопления плазмиды, при этом ограничение скорости роста за счет сдвига температуры увеличивает выход и чистоту плазмиды. В предпочтительном воплощении пониженную скорость роста определяют для поддержания выхода плазмиды меньше приблизительно 2 мг/л/РК. В еще одном предпочтительном воплощении пониженная температура составляет приблизительно 30°С. В еще одном предпочтительном воплощении температуру увеличивают приблизительно до 36-45°С. В еще одном предпочтительном воплощении плазмида содержит ориджин репликации, полученный из Со1Е1. В еще одном предпочтительном воплощении плазмида содержит ориджин репликации рМВ1, содержащий мутацию рИС из О в А. В еще одном предпочтительном воплощении плазмида получена на основе УК.1012. В одном из особенно предпочтительных воплощений ферментационные среды, по существу, представляют собой среды полуопределенного состава с глицерином. В еще одном окончательном предпочтительном воплощении плазмиду, полученную из рВК.322, выращивают в Ε.οοίί в процессе периодической ферментации с подпиткой, в течение которой скорость роста ограничивают в течение периодической фазы с подпиткой, и рост продолжают для накопления плазмидного продукта. С учетом вышеизложенного эти способы демонстрируют стратегии выращивания с высокой плотностью клеток, комбинированные с новым ростом и сдвигами температуры на стадии индукции. При получении ДНК репликонов, содержащих ориджин, полученный из рВК.322, периодическую ферментацию с подпиткой осуществляют при ограниченной скорости клеточного роста. При продуцировании индуцируемых температурой ДНК репликонов (например, плазмид, содержащих ориджин рИС или рММ1) периодическую ферментацию с подпиткой осуществляют при ограниченной скорости клеточного роста и пониженной температуре в течение фазы роста; продуцирование плазмиды затем индуцируют путем повышения температуры. Эти способы значительно увеличивают выход плазмидной ДНК при ферментации, в то же время сохраняя или улучшая целостность плазмиды по сравнению со способами, описанными в области техники.
Краткое изложение сущности изобретения
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способы ферментации для продуцирования плазмидной ДНК. В задачу изобретения также входило повышение выхода продуцирования плазмидной ДНК в ферментационной культуре, а также улучшение качества плазмидной ДНК в ферментационной культуре. Задача изобретения также включала уменьшение количества примесей в очищенной плазмидной ДНК, а также создание улучшенных способов ферментации, которые по сравнению со способами, определенными в уровне техники, улучшены путем увеличения выхода плазмиды посредством индукции уровней плазмиды после продуцирования биомассы;
улучшенного выхода и целостности для токсичных или нестабильных плазмид путем поддержания низких уровней плазмиды в ходе продуцирования биомассы;
улучшенного качества плазмиды за счет уменьшенных уровней никированных (открытое кольцо) или линеаризованных вариантов плазмиды;
увеличенного качества плазмиды путем увеличения процентного содержания мономера плазмиды;
упрощенной продукции с использованием надежных автоматических контрольных параметров и подпиток;
упрощенного масштабирования вследствие контроля за ростом и уменьшенного потребления ки
- 4 010836 слорода, требующегося в течение роста;
уменьшенных уровней примесей после очистки плазмиды вследствие обогащенных уровней плазмиды в подпитывающем потоке для последующей обработки и улучшенного соответствия регламентирующим правилам путем устранения всех компонентов, полученных из животных продуктов.
Дополнительные преимущества изобретения станут понятны из рассмотрения графических материалов и следующего описания.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 демонстрирует периодическую ферментацию с подпиткой плазмиды, полученной из рВК.322, в Е.сой в среде ЫТС3019.
Фиг. 2 демонстрирует периодическую ферментацию плазмиды рИС в Е.сой в среде ЫТС3018.
Фиг. 3 демонстрирует периодическую ферментацию с подпиткой плазмиды §\νίζ СЕР в Е.сой в среде ЫТС3019.
Фиг. 4 демонстрирует индуцируемую периодическую ферментацию §\νίζ СЕР с подпиткой в Е.сой в среде ЫТС3019 (индукция 37 или 42°С).
Фиг. 5 иллюстрирует способ индуцируемой периодической ферментации с подпиткой.
Подробное описание изобретения
Фиг. 1 демонстрирует периодическую ферментацию с подпиткой плазмиды, полученной из рВК.322, в Е.сой в среде ЫТС3019, показывая:
(а) типичный рост и профиль продуктивности плазмиды, полученной из рВК.322, в Е.сой в течение периодической ферментации с подпиткой в среде ЫТС3019 и (б) что плазмидная ДНК, продуцируемая посредством способа периодической ферментации с подпиткой в среде ЫТС3019, в значительной степени сверхспирализована и лишена изоформ с одноцепочечными разрывами (никированных) и открытых кольцевых изоформ.
На фиг. 2 представлен рост плазмиды и профиль продуктивности при периодической ферментации плазмиды рИС (р^2.0) в Е.сой в среде ЫТС3018. Периодическая ферментация плазмиды р^2.0 обеспечивает плотность клеток 57 Οϋ600 и обеспечивает выход 230 мг плазмиды/л.
На фиг. 3 представлена периодическая ферментация плазмиды §\νίζ СЕР с подпиткой в Е.сой в среде ЫТС3019:
(а) профиль роста и контрольного параметра (растворенный кислород, температура, перемешивание) при периодической ферментации §\νίζ СЕР с подпиткой;
(б) флуоресцентная микроскопия клеток, окрашенных 8УВР Сгееп I, демонстрирует филаментацию на плато (слева), тогда как после снижения температуры до 33 °С рост возобновляется и филаментация уменьшается (справа).
На фиг. 4 представлена индуцируемая периодическая ферментация §\νίζ СЕР с подпиткой в Е.сой в среде ЫТС3019 (индукция при 37 или 42°С):
(а) выявлен профиль роста и продуктивности ферментации плазмиды дV^ζ-СЕР/Е.сой ΌΗ5α со сдвигом температуры 30^37°С в течение 35 ч, выход плазмиды достигает 670 мг/л и (б) продемонстрирован профиль роста и продуктивности ферментации плазмиды дV^ζ-СЕР/Е.сой ΌΗ5α со сдвигом температуры 30^42°С в течение 35 ч. Выход плазмиды достигает 1100 мг/л.
На фиг. 5 проиллюстрирован способ индуцируемой периодической ферментации с подпиткой. Определения.
В описании приняты следующие определения:
кзк: ковалентно замкнутое кольцо;
ориджин, полученный из Со1Е1: ориджин репликации, полученный из плазмиды типа Со1Е1 (например, рМВ1, Со1Е1) путем делеции (например, ориджин, полученный из рВК.322) и/или замены оснований (например, рИС из рМВ1, рММ1, рММ5 из Со1Е1 и т.д.);
ДНК репликон: плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), бактериофаги, вирусные векторы и их гибриды;
ферментационная среда ЫТС3018: среда полуопределенного состава с глицерином для периодической ферментации;
ферментационная среда ЫТС3019: среда полуопределенного состава с глицерином для периодической ферментации с подпиткой;
пДНК: плазмидная ДНК;
ориджин, полученный из рВР322: ориджин рМВ1 из рВР322. из которого делетирован ген гор (репрессор праймера);
плазмида: плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), бактериофаги, вирусные векторы и их гибриды;
ориджин рИС: ориджин, полученный из рВК.322, с транзицией С в А, увеличивающей копийность при повышенной температуре;
среда полуопределенного состава с глицерином: ферментационная среда, которая содержит слож
- 5 010836 ный источник азота (например, дрожжевой экстракт, соевый экстракт) и глицерин в качестве источника углерода.
Изобретение относится к способам продуцирования ковалентно замкнутых кольцевых (кзк) рекомбинантных молекул ДНК, таких как плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), бактериофаги, вирусные векторы и их гибриды (здесь вместе названные плазмидами) в бактериальном хозяине-продуценте, с использованием механического ферментационного сосуда.
Способы ферментации, описанные в уровне техники, не являются оптимальными и характеризуются субоптимальным выходом плазмиды, качеством (например, образование в плазмиде одноцепочечных разрывов или линеаризация плазмиды), плохой масштабируемостью (например, вследствие избыточных потребностей в поступлении кислорода), и ограниченным применением (например, невозможность использования плазмид, содержащих нестабильные или токсичные последовательности). Изобретение представляет собой способ улучшения выхода и чистоты плазмидной ДНК во время ферментации культуры. Разработан экономичный подход для ферментации с высоким выходом, в котором используют способ индуцируемой периодической ферментации с подпиткой для улучшения выхода и чистоты плазмиды.
Предпочтительные воплощения способа продуцирования плазмиды и сред.
В одном из предпочтительных воплощений для продуцирования плазмид, полученных из рВК.322, периодическую ферментацию с подпиткой осуществляют при ограниченной скорости клеточного роста. Этот способ значительно улучшает выход плазмидной ДНК в результате ферментации, в то же время сохраняя или улучшая целостность плазмиды по сравнению со способами, описанными в области техники.
Используя этот способ для плазмид с умеренной копийностью (например, ориджин репликации рВК322 с делецией гена КОР, здесь именуемый как плазмиды, полученные из рВК322) при автоматическом периодическом процессе ферментации с подпиткой при 37°С, контролируемом для поддержания удельной скорости роста 0,12 ч-1, был достигнут выход 250-450 мг/л и плотности клеток 120 ОЭ600. Это 100-кратное улучшение по сравнению с известными выходами (ЬаЬуап с1 а1., выше, 1996). Молекулярная основа этого нового значительного улучшения не известна. Независимо от механизма, применение изобретения для продуцирования других плазмид увеличит продуктивность ферментации без потери качества плазмид.
В одном из предпочтительных воплощений для продуцирования индуцируемых температурой ДНК репликонов (например, плазмид, содержащих ориджин рИС или рММ1) осуществляют периодическую ферментацию с подпиткой с ограниченной скоростью клеточного роста и пониженной температурой в течение фазы роста; затем продуцирование плазмиды индуцируют путем повышения температуры. Этот способ значительно улучшает выход ферментации плазмидной ДНК, в то же время поддерживая или улучшая целостность плазмиды по сравнению со способами, описанными в уровне техники.
Эта новая раскрытая здесь стратегия продуцирования плазмид с высококопийным ориджином (например, ориджин рИС) с высоким выходом приводит в результате к неожиданно высокой эффективности продуцирования плазмид и их качеству. Кроме того, во время периодической фазы с подпиткой скорость роста снижена. Способ изображен на фиг. 5. Эту новую комбинацию элементов не применяли для продуцирования плазмид с ориджином, полученным из Со1Е1, и при тестировании эта новая комбинация обеспечивала новый и неожиданный результат, заключающийся в повышенной продуктивности. Таким образом, авторы изобретения указывают на новое применение (повышенную продуктивность) комбинации пониженной скорости роста с 1) пониженной температурой для роста и продуцирования биомассы и 2) повышенной температурой для индукции продуцирования плазмиды.
Обнаружение того, что комбинация исходной фазы роста при пониженной температуре с более поздней фазой продуцирования при высокой температуре приводит в результате к улучшенному общему росту, биомассе и выходу плазмиды, является новым и неожиданным и не упоминается в уровне техники. Нашали с1 а1., выше, 2000, использовали индуцируемую температурой ферментацию специфически для уменьшения метаболической нагрузки, ассоциированной с К плазмидами, во время роста. Эту стратегию использовали для продуцирования К плазмид, и она не предлагалась для плазмид, содержащих ориджин Со1Е1. Кроме того, Натапп с1 а1,. выше, 2000, не предполагают улучшения общей продуктивности при использовании этой стратегии. Таким образом, эта комбинация элементов не была предложена в уровне техники для улучшения выхода. Существует синергизм в данной комбинации, который превышает сумму для ее частей, что было установлено по повышенной продуктивности. Кроме того, ферментации с высоким выходом удовлетворяют существующую в течение длительного времени потребность, поскольку с использованием многочисленных предшествующих способов, описанных в области техники в течение последних 10 лет, не удалось продемонстрировать ферментацию с высоким выходом. Таким образом, авторы изобретения предлагают новую комбинацию элементов для продуцирования плазмид, содержащих ориджин Со1Е1, включающую медленный рост в сочетании с температурной индукцией, которая демонстрирует неожиданное и удивительное повышение эффективности продуцирования плазмид.
Применение индуцируемого способа периодической ферментации с подпиткой для продуцирования высококопийных плазмид приводило в результате к выходам 1100 мг/л плазмидной ДНК и величине
- 6 010836
ОЭ600, равной 100. Это пятикратное улучшение по сравнению с выходами, получаемыми при использовании способов ферментации, известных из уровня техники. ДНК, полученная в результате всех этих способов, имеет высокую чистоту, будучи, по существу, на 100% сверхспирализованной. Авторы изобретения предлагают применение описанных здесь периодических способов ферментации и периодических способов ферментации с подпиткой для повышения эффективности продуцирования плазмид.
При описанном здесь индуцируемом периодическом способе с подпиткой в течение фазы продуцирования биомассы поддерживались низкие уровни плазмид (меньше 2 мг/л/ОЭ600 для векторов, полученных из УК1012), а после продуцирования биомассы обеспечивал неожиданную и беспрецедентно сверхвысокую продукцию плазмиды (больше 6 мг/л/ОЭ600 для векторов, полученных из ΥΚ.1012). Высокие выходы продукта очень желательны, поскольку увеличенный выход плазмиды на 1 г бактерий приводит непосредственно к более высокой чистоте конечного продукта. Авторы изобретения предлагают применение сдвига температуры по изобретению для поддержания низких уровней плазмиды (меньше 2 мг/л/ОЭ600 для векторов, полученных из ΥΚ.1012) в течение роста, индукцию продуцирования плазмиды до высоких уровней (больше 3 мг/л/ОЭ600 для векторов, полученных из УК.1012) после продукции биомассы. Эти уровни представляют собой общую величину для продуцирования векторов, полученных из ΥΚ.1012. Другие плазмиды могут выдерживать более высокие или низкие уровни по сравнению с 2 мг/л/ОЭ600 во время фазы роста. Максимальный уровень плазмиды во время фазы роста, который поддерживает приемлемую метаболическую нагрузку, стабильность плазмиды и повышенную продуктивность после сдвига температуры, может быть определен экспериментально для каждой новой плазмиды специалистом в области техники.
Альтернативные воплощения ферментационных сред.
При практической реализации изобретения могут быть использованы в качестве примеров такие препараты ферментационных сред, не содержащих животные продукты, как ΝΤΟ3018 (для периодической ферментации), ΝΤΟ3019 (для периодической ферментации с подпиткой). Эти среды представляют собой оптимизированные полусинтетические среды для роста, содержащие глицерин в качестве источника углерода, дрожжевой экстракт в качестве источника азота, и металлические микроэлементы, соли и буферы. Ожидают, что замена этих сред на описанные в области техники также приведет в результате к улучшенной продуктивности плазмиды при использовании описанных здесь способов ферментации.
Предполагаются альтернативные источники азота неживотного происхождения для применения в средах ΝΤΟ3018 и ΝΤΟ3019. В качестве компонента сложных сред, дрожжевой экстракт обеспечивает азотом, аминокислотами, витаминами и углеродом. Возможные компоненты сложных сред (например, дрожжевых или соевых экстрактов), являющиеся ключевыми для клеточного метаболизма во время продуцирования плазмиды, включают аминокислоты, витамины, микроэлементы и альтернативные источники углерода. В качестве примера авторы изобретения рассматривают применение альтернативных препаратов дрожжевого экстракта, препарата сои (например, соевого пептона (8оу1опе) или рйуЮпс пептона от ΒΌ Вю5С1епсе5) или других растительных препаратов (например, реа Г1о\\'ег пептонов от Охо1б) в средах ΝΤΟ3018 и ΝΤΟ3019.
Также предлагаются вариации определенных элементов в средах. Например, предлагается увеличенное содержание фосфата или магния в виде увеличения содержания компонента в средах для циклической ферментации или в качестве добавок к подпитке при периодической ферментации с подпиткой. Дополнительная оптимизация сред путем систематической оценки компонентов может быть осуществлена специалистом в области ферментации.
Предусматриваются добавки к средам при использовании некоторых ауксотрофных клеточных линий. Например, таким клеточным линиям, как 81Ь12 (1пУйтодеп Согр.), содержащим делецию ргоАВ, для достижения максимального роста может потребоваться добавка аминокислот или альтернативного источника азота, обогащенного пролином. Такие модификации могут быть определены специалистом в области ферментации.
Авторы изобретения также предлагают применение описанных здесь периодических способов ферментации и периодических способов ферментации с подпиткой с использованием сред для ферментации плазмид, описанных в области техники. Они включают среды определенного состава, такие как раскрытые 8оиЬт1ег (8оиЬпег Р. 2004 заявка на патент США 2004/0142452). Предпочтительные среды для применения со способами периодической ферментации с подпиткой по изобретению представляют собой препараты сред с глицерином с полуопределенными подпитками, таких как ΝΤί.'3019. и сред, раскрытых в Ьайцаш е! а1., выше, 1996, Рпе115 е! а1., выше, 2003, Сйеп, выше, 1999 и ипйа1ег е! а1 (ИйМет 1., Рошап Ν., Аксйет С., \Уое11гег Н. 2005, заявка на патент США 2005/0026177).
Альтернативные воплощения способа ферментации.
Здесь раскрыты улучшенные периодические способы с подпиткой и периодические способы продуцирования плазмид. Они отображают стратегии экспоненциальной подпитки, скомбинированные с новыми температурными сдвигами в фазе роста и индукции.
При практическом применении периодических способов с подпиткой по изобретению авторы изобретения рассматривают различные стратегии подпитки для уменьшения скорости роста, включающие регуляцию конечным продуктом, по механизму прямой связи и предварительно заданную регуляцию
- 7 010836 подпитки питательными веществами. Например, подпитка питательной средой может быть добавлена в соответствии со стратегией экспоненциальной подпитки с ограничением по углероду. Авторы изобретения предлагают вариацию этой стратегии подпитки для регуляции скорости роста в приемлемых диапазонах. Предпочтительные диапазоны скорости роста μ составляют от 0,05 до 0,3 ч-1. Предпочтительная целевая скорость роста μ составляет 0,12 ч-1. Приемлемые диапазоны скорости роста являются специфическими для плазмиды и могут быть определены экспериментально специалистом в данной области техники.
При практическом применении периодических способов с подпиткой по изобретению авторы изобретения предлагают различные периодические стратегии для уменьшения времени продуцирования. Содержание полуопределенного питательного вещества, включенного в периодическую фазу, может быть отрегулировано таким образом, чтобы дать возможность периодической фазе протекать до достижения более высоких концентраций биомассы. В случае более высокой концентрации биомассы общее время ферментации уменьшается, поскольку рост осуществляется быстрее в периодической фазе по сравнению с периодической фазой с подпиткой. Авторы изобретения предлагают вариацию этой периодической стратегии для контроля за началом периодической фазы способа с подпиткой. Предпочтительные диапазоны ΟΌ600 для запуска периодической фазы с подпиткой составляют от 1 до 60. Приемлемые диапазоны ΟΌ600 для запуска периодического способа с подпиткой могут быть специфическими для плазмиды и экспериментально могут быть определены специалистом в данной области техники.
При практическом применении индуцируемого периодического способа с подпиткой и периодического способа по изобретению авторы изобретения предлагают различные стратегии сдвига температуры с фазы роста до фазы индукции. Фаза роста может быть осуществлена при температурах от 25 до 37°С, предпочтительно при 30-37°С. Для высококопийных плазмид фазу роста наиболее предпочтительно осуществляют при 30-32°С. Фаза индукции может быть осуществлена при температурах от 33 до 45°С и предпочтительно 37-42°С.
При практическом применении индуцируемых способов со стратегиями сдвига температуры авторы изобретения предлагают использование концентрации питательных веществ, концентрации биомассы или оптической плотности в качестве показателя того, когда необходимо переключаться с фазы роста на фазу индукции. Регулярный пробоотбор из ферментационной культуры может обеспечить материал для измерений биомассы или оптической плотности, и сдвиг температуры может быть осуществлен при определенной концентрации биомассы. Для обеспечения непрерывного контроля за концентрацией биомассы также могут быть использованы интерактивные датчики, а ферментатор может быть установлен на автоматическое осуществление температурного сдвига при определенной концентрации биомассы. При практическом осуществлении индуцируемого периодического способа с подпиткой со стратегиями сдвига температуры авторы изобретения также предлагают осуществление сдвига температуры сразу, как только будет добавлено определенное количество питательного вещества.
При практическом применении индуцируемых способов со стратегиями сдвига температуры авторы изобретения предусматривают использование более высоких температур в течение фазы роста для минимизации времени продуцирования. При описанном здесь периодическом способе с подпиткой поддерживаются низкие (меньше 2 мг/л/ОЭб00) уровни плазмиды в течение фазы роста способа. Максимальная температура, которая может быть использована в течение фазы роста, поддерживающая приемлемую метаболическую нагрузку, стабильность плазмиды и увеличенную продуктивность после сдвига температуры, специфична для плазмиды и варьирует для различных плазмидных цепей. Например, некоторые плазмиды могут быть устойчивы при гораздо более высоких уровнях, чем 2 мг/л/ОЭб00. Кроме того, продуктивность плазмиды может варьировать при низкой температуре, так что некоторые плазмиды могут не продуцироваться как высокие уровни плазмиды. В этих случаях авторы изобретения предлагают применение более высоких температур в течение фазы роста. Кроме того, повышенные максимальные температуры можно допускать в течение исходной циклической фазы вследствие неограниченного роста и соответствующей меньшей копийности плазмиды (фиг. 5). Максимальная температура, которая может быть использована в течение фазы роста (периодический компонент и периодический компонент с подпиткой), поддерживающая приемлемую метаболическую нагрузку, стабильность плазмиды и повышенную продуктивность после сдвига температуры, может быть определена экспериментально специалистом в данной области техники
Плазмиды и штаммы-хозяева.
Авторы изобретения предлагают применение изобретения в продуцировании плазмид с разными ориджинами репликации, которые обладают высокой копийностью, низкой копийностью и умеренной копийностью и индуцируются или не индуцируются температурой. Некоторые предпочтительные ориджины репликации и несущие их плазмиды приведены в табл. 1. В области техники известны модификации этих ориджинов, которые также предложены для применения.
- 8 010836
Ориджины репликации
Таблица 1
| Исходный ориджин | Регуляция | Высококопийная девиация | Число копий | Терапевтические плазмиды |
| рМВ1 | Антисмысловая РНК! связывается с РНК II Вспомогательный белок КОР стабилизирует взаимодействие | Ориджин рис (деления Нор и мутация ло второму сайту изменяющая взаимодействие ΡΗΚΙ/ΙΙ при 37 и 42 но не ЗО°С) ___ Ориджин риС с энхансером по второму сайту увеличивает число копий на 1450% Делеция Нор | 50 при 37°С, 175 при 42°С (логарифмическая фаза) | Множественные (ροϋΝΑ3, ρΫΑΧ, УК1012итд) |
| Не определено | рОИАУАССиИга | |||
| 30 при 37°С и 42°С (логарифмическая фаза) | рСМ'7Кт2 | |||
| Мутация 6 в Т (удлиняет ΡΗΚΙ, аттенуируя репрессор, не условная) Плазмида составляет 65% тотальной _ДНК _ рММ1 рММ7 (делеция Пор и мутация по второму сайту изменяющая взаимодействие | 1000 (фаза не указана) | Не описаны | ||
| Со!Е1 | Такая же как для рМВ1 | 2000 в стационарной фазе (рММ7) | рУС0396т |
| РЙК1/РНКП при 37 и 42. но не 30°С). рММ7 составляет больше 50% тотальной ДНК в стационарной фазе | |||||
| К6К (он а, | Белок π гер | Штамм-хозяин | 200 | рСрб, рВооз( | |
| оп β, оп у) | связывается с | мутантный ρΐΓ-116 | 250 | рСОЯ | |
| итероном, | (мутация по | ||||
| зависимая от | увеличению | ||||
| числа копий | копийности белка | ||||
| активация (при | π гер в домене | ||||
| низком) или | олигомеризации | ||||
| репрессия (при | удалена из | ||||
| высоком) | плазмиды и обеспечивается в | ||||
| транс-лоложении из хромосомы) | |||||
| К1 | Белок | Индуцируемое | 2000 (мутант) | Не описаны | |
| инициатор НерА | температурой | ||||
| связывается с | число копий с | ||||
| неповторяющей' | использованием | ||||
| ся мишенью | двойного мутанта | ||||
| Антисмысловой | ориджина | ||||
| репрессор СорА | (плазмида | ||||
| связывается с | составляет 75% | ||||
| лидером НерА | тотальной ДНК) | ||||
| (СорТ). | КерА, контроли- | 1000 | рС'А/Н24-6 | ||
| Вспомогатель- | руемый индуциру- | (контролируемый | |||
| иый белок СорВ | емым температу- | Ря) | |||
| репрессирует | рой промотором | ||||
| экспрессию | лямбда Рв и | ||||
| КерА | температурочувствительным лямбда репрессором (плазмида составляет 50% тотальной ДНК) | ||||
| рКЬ1 | Белок | Сверхэкспрессия | больше 2500 | Не описаны | |
| инициатор КерА | белка инициатора | ||||
| репрессирует | КерА на | ||||
| транскрипцию | отдельной | ||||
| герА в виде | плазмиде или на | ||||
| гексамера | хромосоме |
+ рУС0396 представляет собой оптимизированный векторный остов для встраивания эукариотических экспрессионных кассет.
- 9 010836
Предполагаются альтернативные штаммы-хозяева. Штамм Е.сой ΌΗ5α представляет собой широко используемого хозяина для продуцирования плазмид. Его ключевые характеристики включают мутацию гесА, минимизирующую неспецифическую рекомбинацию клонированной ДНК, и мутацию епбА1, устраняющую неспецифическое расщепление плазмиды эндонуклеазой I. В дополнение к ΌΗ5α для продуцирования плазмид подходит множество других штаммов; не ограничивающий объем изобретения перечень примеров штаммов-хозяев Е.со11 представлен в табл. 2.
Таблица 2
Штаммы-хозяева
| Штамм | Генотип | Источник |
| ϋΗΐ | гесА1 елбА1 йзс(В17(гк-, тк+) рйоА зирЕ44 λ- ΪΛ/-1 дгугАЭб ге/А1 | 1пуйгодеп |
| ϋΗ5α | Р Ф80б/ас/ДМ15 Д(/асгУА-агдГ) 1И69 гесА1 елс/А1 /?з<Я17(гк-, тк+) р/?оА злрЕ44 λ- 7/7/-1 ругАЭб ге/А1 | 1т/Пгодеп |
| онюв | Р тсгА Л(тгг-5пбЕ?М8-тгсВС), Ф80б/асгдМ15 Д1ас274, беоВ, гесА1, епбА1, агаО139, Л(ага-1еи)7697, да!и, да1К, λ-, грз1_, пирс | ΙηνίΕορβη |
| 6М109 | елсМУ, гесА1 дугА96, Мй, 11зс!Р17(гк-, тк+) ге!А1, зирЕ44 А(1ас-РгоАВ) [Р(гаО36, ргоАВ 1асР£ЛМ15] | 81га1адепе |
| ΧΗ-ΒΙιιθ | гесА1 епс/А1 дугАЭб (Ы-1 ЬздР17 зирЕ44 ге/А1 /ас [Р‘ ргоАВ ΙβοΡΖΔΜ15 ТпЮ (Те/1)] | 81га1адепе |
| ТорЮ | Р тсгА Л(тгг-Ьзс1РМЗ-тгсВС) Φ80ΙθοΖΛΜ15 А/асХ74 гесА1 агаО139 Л(ага-/еи)7697 да/ϋ да/К гр$1_ (8(/1) епс/А1 пирО | 1гм(годеп |
| МасЬ1 | ДгесА1398 елбА1 ίοηΑ Φ806/θοΖλΜ15 МасХ74 /1зд(гк' тк +) | 1пу|1годеп |
| ОТ116 | Р тсгА Д(тгг-|18бВМ8-тгсВС) Ф801асгдМ15 Д1асХ74 гесА1 епбА1 Абст ДзЬсС-еЬсО | Ιηνϊνοςβη |
| ЕСО8Ю1 | Ρ (Ф80 Δ/θσΖ лМ15)Л(/ас7УА-агдР)Ы69 Л5С/В17(гк., тк4.) гесА1 епс/А1 ге/А1 с/еоР λ- | Уеа8(егп |
| ЕС100 | Р тсгА Л(тгг-/1зс/РМЗ-тгсВЗ) (Ф80 Мас! ΔΜ15) А/асХ74 гесА1 елс/А1 агай139 (ага-/еи)7697, да/и, да/К, λ- грз/_ пир<3 | Ерюепйе |
| 8 иге | е14- (МсгА-) Л (тсгСВ-ЬздЗМР-тгг)171 епдА1 зирЕ44 /Ы-1 дугА96 ге/А1 /ас гесВ гесЗ зЬсС итиС::Тп5 (Кап1) υν/С [Р'ргоАВ ΐ3ΰΡΖΔΜ15 ТпЮ (Те!1)] | 81га1адепе |
| 8(Ы2 | Р тсгА &(тсгВС-/)зс/РМЗ-тп) гесА1 елс/А1 1оп дугАОВ /Ы зирЕ44 ге/А/ λ' Л(/ас-РгоАВ) | 1т/йгодеп |
| 81Ы4 | тсгА А(тсгВС-Ьзс/РМЗ-тгг) гесА1 елдА1 дугА96 даС (/ιί-1 зирЕ44 λ' ге/А1 Л(1ас-РгоАВ)/РргоАВ' /ас1чИДМ15 ΤηϊΟΤβί* | 1пуИгодеп |
ΌΗ5α, ХШ-В1ие. ΌΗ10Β, 1М109 и Тор 10 общеизвестны в качестве штаммов, продуцирующих плазмиды. Мас111 и ЕСО8101 разработаны недавно и могут представлять собой желаемых хозяев для продуцирования плазмид. Клетки 81Ы2, СТ116 и 8иге используют для продуцирования нестабильных ДНК-содержащих плазмид. Нестабильная ДНК содержит такие структуры, как прямые (например, ретровирусные длинные концевые повторы) или инвертированные повторы (например, палиндромы короткошпилечных РНК (δΙιΡΝΑ)), Ζ ДНК и т.д. Делеция гена Ест в 6Т116 устраняет метилирование бат, которое является иммуностимулирующим. Таким образом, продуцирование в СТ116 уменьшает иммуногенность плазмидной ДНК. Подобные уменьшения иммуногенности наблюдают при использовании штаммов, экспрессирующих СрС метилазу.
Продуцирование нестабильных плазмид.
Авторы изобретения также предлагают применение изобретения в продуцировании плазмид, содержащих нестабильные последовательности.
Палиндромные последовательности, прямые или инвертированные повторы и последовательности, образующие Ζ ДНК, являются нестабильными и подвергаются делеции или перестановке в хозяевах Е.сой. В некоторых случаях плазмиды для терапевтического применения должны содержать нестабильные последовательности (инвертированные или прямые повторы для вирусных векторов, такие как ААУ и Ηΐν, сегменты, образующие Ζ ДНК или триплетные повторы для некоторых терапевтических генов). Используемые в настоящее время стратегии поддержания плазмид, содержащих нестабильные последовательности, заключаются в применении клеточных линий хозяев, несущих стабилизирующие мутации. Некоторые хозяева имеются в продаже для размножения этих плазмид, например клетки 8иге (81та1адеие), 6Т115 (ΐηνίνο^η) или 8(Ы2 и 8(Ы4 (1пуйгодеп). Клеточные линии 8(Ы2 и 8ΐΜ4 используют нераскрытую мутацию, увеличивающую стабильность векторов, содержащих прямой повтор, таких как
- 10 010836 ретровирусные векторы; этот эффект усиливается при пониженной температуре, предположительно вследствие уменьшенного числа копий. Специфические комбинации репарационных мутаций могут стабилизировать размножение плазмиды, в особенности при низкой температуре. Клеточные линии 8иге и 8иге2 используют одну из таких комбинаций с дефектом гомологичной рекомбинации (гесВ, геб) в сочетании с дефектом УФ репарации (иугС) и репарации 808 (ишиС) (для стабилизации длинных концевых повторов (ЬТЯ)), и 8ЬсС (и гес1) для стабилизации Ζ ДНК. Клеточная линия СТ116 использует 8ЬсС и 8ЬсЭ для стабилизации палиндромных последовательностей. Эти штаммы функционируют, стабилизируя плазмиды только при низкой температуре (т.е. 30°С), предположительно вследствие уменьшенного числа копий плазмид. Эта стратегия, очевидно, увеличивает стоимость продукции. Применение описанного здесь индуцируемого способа ферментации может дать возможность для размножения при 30°С нестабильных плазмид в стабилизирующих клеточных линиях перед увеличением числа копий только в течение короткого периода перед сбором. Это должно максимизировать выход и стабильность (т.е. качество) нестабильных плазмид.
Продуцирование ДНК и плазмид.
Механизм, лежащий в основе наблюдаемого увеличенного выхода плазмидной ДНК (больше 6 мг/л/ОЭ600) в индуцируемом периодическом способе с подпиткой, не известен. Это возможно может происходить вследствие индукции агентов, компактизующих ДНК (например, гистоноподобный белок или другие белки, связывающиеся с хроматином, такие как продукт гена брк), во время продуцирования биомассы при медленном росте и пониженной температуре.
Изменение конденсации ДНК во время фазы индукции может увеличивать выход плазмиды путем увеличения допустимых уровней или числа копий плазмиды. Степень компактизации ДНК определяется двумя противоположными факторами; конденсацией белков хроматина и деконденсацией транскрипционных комплексов. На компактизацию плазмиды может оказывать влияние уровень транскрипции с плазмидных промоторов. Меньшая транскрипция может ассоциироваться с более высокой компактизацией и потенциально более высокой несущей способностью.
В Е.сой идентифицировано множество белков хроматина, которые вовлечены в компактизацию ДНК. Эти генные продукты связываются с плазмидной и геномной ДНК. В случае геномной ДНК они компактизируют ДНК в нуклеоид (обзор в КоЬшоте С., КеНеиЬегдег Е. 1994, М1сгоЬю1 Ве\зе\\·. 58: 211232). Основные компоненты нуклеоида представляют собой гистоноподобные белки НИ, ΙΗΡ и ΗΝ-8, 8ΐρΆ (относящийся к ΗΝ-8 экспрессируется приблизительно на уровне 1/10) и Орк, которые однородно распределены в нуклеоиде, тогда как другие белки, такие как 8ецА, СЬрА, СЬрВ, Ρίκ и ША, находятся в меньшем количестве, демонстрируют неоднородное распределение в нуклеоиде и могут обладать регуляторными функциями. Выделенный белковый комплекс Я плазмиды содержал три основных белка: 23% ΗΝ-8, 23% РНК-полимеразы и 5% НИ. Он может предположительно меняться в зависимости от фазы роста, поскольку генные продукты, ассоциирующиеся с хроматином, по-разному регулируются в различных средах, при различных плотностях клеток и во время фазы роста и стационарной фазы. Ρίκ, НИ, НР-1, как правило, сильнее экспрессируются в логарифмической фазе, тогда как ΙΗΡ и Орк имеют более высокие уровни в стационарной фазе. Эрк конденсирует ДНК в жидкие биокристаллические комплексы в стационарной фазе для улучшения стрессоустойчивости. Сверхэкспрессия ΗΝ-8 в течение фазы роста приводит к конденсации ДНК и утрате жизнеспособности. Клетки могут иметь более высокую плазмидную емкость когда ДНК высококомпактизирована. В способе ферментации, индуцируемом ноурзеотрицином (ХГС), клетки, находящиеся в фазе роста, обладают меньшей общей емкостью в отношении плазмидной ДНК по сравнению с клетками, находящимися в фазе индукции. Это может являться следствием различий в комбинациях белков хроматина, представленных в фазе индукции, что может обеспечить более высокие уровни, допустимые для плазмиды, по сравнению с плазмидой в фазе роста. Изменения соотношения белков хроматина в течение фазы индукции может увеличить компактизацию плазмиды и несущую емкость.
Изменения соотношения белков хроматина в течение фазы индукции также могут увеличить скорости репликации плазмиды. Например, экспрессия с промотора РНК11 ориджина р15А, но не с промотора рМВ1 (рВЯ322) ΡΗΚΙΙ, подавляется ΙΗΡ; транскрипция с РНК11 р15А увеличивается у мутантов по ΙΗΡ. Эрк и НИ представляют собой белки, не специфически связывающиеся с ДНК, ΗΝ-8, СЬрА и СЬрВ связываются с изогнутой ДНК. 81рА относится к ΗΝ-8, с высокой аффинностью связывается с ДНК и также связывается с изогнутой ДНК. Ρίκ, ΙΗΡ, !с1А и кес.|А специфичны в отношении последовательности. ΗΝ-8 подавляет транскрипцию со множества промоторов, содержащих изогнутую ДНК. Промотор РНКП ρМВI (риС и рВЯ322) содержит ро1уА и ро1уТ цепи; эти последовательности образуют изогнутую ДНК. Уменьшенные уровни белков хроматина, связывающихся с изогнутой ДНК, подавляющих транскрипцию (например, ΗΝ-8) в стационарной фазе, могут быть ассоциированы с увеличенной степенью транскрипции РНКП к РНК! и документально подтвержденным увеличением в стационарной фазе числа копий плазмид. Изменения состава белков хроматина (например, дополнительное уменьшение ΗΝ-8), присутствующих во время фазы продуцирования способа ферментации ΝΤΟ могут приводить к увеличенному числу копий плазмид рМВ1, таких как рИС. Гетерологичные агенты, компактизирующие ДНК, например
- 11 010836 кислоторастворимые споровые белки видов ВасШик. экспрессирующиеся в Ε.οοίί. также могут представлять собой полезные агенты. компактизирующие ДНК. для увеличения выхода плазмиды. Например. экспрессия небольшого кислоторастворимого белка В.киЫШк в Ε.οοίί вызывает ДНК (8е11оте В.. Наиб А.В.. 8е11оте Ρ.. 1. Вас1егю1. 173: 1642-1653).
Изменения способа также могут улучшать выход посредством воздействия на конденсацию ДНК. Όρκ регулируется концентрацией магния (Мд44); присутствие Όρκ не приводит в результате к конденсации ДНК; плотноупакованные комплексы кристаллическая ДНК:Эрк образуются. когда концентрация Мд44 падает ниже порогового уровня (обзор в Егепк1е1-Кп8рт Ό.. Ьеущ-2а1бтап 8.. 8Ытош Ε.. Αοίί 8.6.. \\ас1пе1 Ε.Ι.. Агаб Т.. Етке1 8.Ε.. КоИег В.. Мшкку А.. 2001. ЕМВО. 1. 20: 1184-1191). Морфологически комплекс напоминает комплекс. индуцируемый путем добавления хлорамфеникола во время стационарной фазы. Добавление в растущие культуры 0.2 мМ спермидина ускоряет конденсацию ДНК в отсутствие Όρκ. Истощение фосфата оказывает такое же действие. возможно посредством усиленной деградации треонина и аргинина до спермидина (ЕгепМекКпкрт е1 а1.. выше. 2001). Изменения состава ферментационной среды или условий ферментации во время фазы индукции для изменения уровней двухвалентных катионов (например. Мд44 посредством экзогенного добавления или истощения). или изменение уровня положительно заряженных полиаминов (например. спермидина посредством экзогенного добавления или контроля бактериального синтеза) могут увеличивать выход плазмиды и рассматриваются как изменения среды.
Авторы изобретения считают. что дополнительное увеличение выхода может быть достигнуто путем дополнительной компактизации плазмидной ДНК. Это может быть достигнуто путем добавления в подпитку во время процесса ферментации агентов. компактизирующих ДНК (например. полиэтиленимина. спермидина. спермина). или модификаций штамма. увеличивающих продуцирование агентов. компактизирующих ДНК штамма-хозяина. например продуцирование спермина или продуцирование белка брк. Такие модификации штамма могут представлять собой изменения. которые дают возможность для индукции соответствующих генных продуктов во время процесса ферментации.
При практической реализации индуцируемых способов авторы изобретения предполагают использование альтернативных стратегий для поддержания числа копий плазмид в течение фазы роста на низком уровне. Например. в дополнение к выращиванию при низкой температуре существуют другие механизмы уменьшения числа копий. которые могут быть включены в фазу роста. Например. показано. что уменьшение содержания растворенного кислорода во время ферментации уменьшает число копий плазмид (Сагпек ΑΕ. 2005 ВюРгосекк 1п1егпабопа1 3:9. в печати).
Улучшение чистоты конечного продукта.
Авторы изобретения предлагают применение обогащенных плазмидой питающих потоков из описанной ферментационной культуры в способах очистки плазмиды. приведенных в качестве примера. Такие способы хорошо известны в уровне техники. Комбинация ферментации с высоким выходом и приведенного в качестве примера способа очистки может обеспечить рентабельные способы дополнительного уменьшения геномной ДНК до уровней. приемлемых для генной терапии и ДНК-вакцинации.
Примеры
Способ по изобретению дополнительно проиллюстрирован следующими примерами. Эти примеры приведены лишь для иллюстрации и не предполагается. что они каким-либо образом ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Ферментационные среды ЫТС3018 и ЫТС3019.
Следующие критерии установлены для оценки оптимизированного способа ферментации для получения плазмидной ДНК:
1) высокий удельный выход плазмиды (1 мг плазмидной ДНК на г клеточной массы);
2) высокий выход биомассы;
3) сохранение высокого уровня сверхспирализованной плазмиды;
4) минимальные проблемы при последующей обработке;
5) соответствие регламентирующим требованиям и
6) сохранение структуры плазмиды (например. отсутствие делеций или других перестановок).
Культуральные среды готовили таким образом. чтобы поддерживать высокий удельный выход плазмиды. высокий выход биомассы и высокое качество плазмиды. Среду для периодической ферментации подбирали для уменьшения удельной скорости роста. Пониженная скорость роста ассоциировалась с более высоким числом копий плазмиды и лучшей стабильностью плазмиды. В ходе периодических ферментации с подпиткой скорость роста поддерживали на уровне 0.12 ч-1 путем подпитки лимитирующим питательным веществом. Штамм-хозяин ΌΗ5α несет мутации епбА1. гесА и ге1А. которые являются существенными для продуцирования плазмиды. Кроме того. все компоненты. использованные в средах. были должным образом охарактеризованы и сертифицированы в отношении отсутствия в них животного продукта.
Среды ЫТС3018 (для периодической ферментации) и ЫТС3019 (для периодической ферментации с подпиткой) оптимизированы в отношении множества компонентов для периодического способа и периодического способа с подпиткой. Например. для уменьшения скорости роста в качестве источника угле
- 12 010836 рода используют глицерин, а не глюкозу. Дрожжевой экстракт используют в качестве источника азота. Концентрации металлических микроэлементов и Мд§04 оптимизировали, основываясь на определенных потребностях продуцирующих штаммов Е.сой.
Пример 2. Культура циклической ферментации с подпиткой с плазмидами, полученными из рВК.322, в среде N163019.
Периодические ферментации с подпиткой осуществляли в ферментаторе Вгип5\\'1ск ВюИо 110 при 37°С. рН контролировали путем автоматического добавления 30% гидроксида аммония или 10% ортофосфорной кислоты. Датчик растворенного кислорода калибровали на 0% путем барботирования газообразного азота и на100% путем насыщения воздухом. Сосуд аэрировали при 1 АМ (объем воздуха/объем ферментатора в минуту) и поддерживали содержание растворенного кислорода на уровне 30% путем пропорционально-интегрального контроля перемешивания. При клеточных плотностях выше приблизительно 20 ΟΌ600 также требовалось снабжение О2 для поддержания 30% насыщения.
Посевные культуры получали из единичных выделенных колоний, инокулированных в среду Луриа-Бертани (ЬВ) с 50 мкг/мл канамицина, и выращивали при 37°С. Посевные культуры в середине экспоненциальной фазы (0,5-1,5 ΟΌ600) использовали для приготовления 1%-ных инокулюмов для ферментатора.
В ходе периодического культивирования с подпиткой добавляли питательное вещество с полуопределенным составом в соответствии со стратегией экспоненциальной подпитки с лимитированием по углероду. Кратко, исходное количество углеродного субстрата потребляется во время периодической фазы с удельной скоростью роста цмакс. После истощения углеродного субстрата начинается периодическая фаза с подпиткой, и автоматически добавляется питательное вещество со скоростью, определяемой следующим уравнением (Сагпек, выше, 2005):
где μ = желаемая удельная скорость роста в течение периодической фазы с подпиткой;
Хв = концентрация биомассы в конце периодической фазы, г ЭСА/л;
УВ = исходный объем жидкой культуры, л;
= концентрация лимитирующего субстрата в подпитывающей среде, г/л;
У,.:/, = коэффициент выхода биомассы из субстрата, г/г;
= время с начала периодической фазы с подпиткой.
Как правило, при периодической ферментации с подпиткой в средах N163019 с несколькими независимыми устойчивыми к канамицину плазмидами, полученными из рВК322, достигают клеточной плотности 100-120 ΟΌ600 или 55-65 г сухой клеточной массы на 1 л (фиг. 1). Выходы плазмид в среднем составляют 260 мг/л и достигают 430 мг/л. Для сравнения, опубликованные выходы ферментации с плазмидами, полученными из рВК322, имеют порядок 3-4 мг/л (БаЫ)ап1 е1 а1., выше, 1996).
Важно, что очень высоки удельные выходы плазмид, как правило от 2,5 до 3,8 мг/л/ОЭ600. что превышает уровни, обнаруженные для других ферментационных сред/способов с использованием плазмид с гораздо более высококопийным ориджином рИС (табл. 3). Выходы экспрессирующих плазмид в показателях удельных выходов мг/л/ОЭ600 указывают на количество плазмиды относительно общей клеточной массы. Высокие удельные выходы очень желательны, поскольку увеличенный выход плазмиды на 1 г бактерий приводит непосредственно к более высокой чистоте конечного продукта.
- 13 010836
Таблица 3
Сравнение удельных выходов плазмид с известными из публикаций способами ферментации с высоким выходом
| Способ ферментации | Удельный выход плазмиды, мг/л/ОЭбоо |
| ΕΓίβίΐδ βί а1., выше, 2003 (периодический с подпиткой) | 1,3-2,1 |
| БаЬуап) е! а/., выше, 1996 (периодический с подпиткой) | 2,8 |
| ΝΤΟ3019, ориджин, полученный из рВА322, периодический с подпиткой (Пример 2) | 2,5-3,8 |
| ΝΤΟ3018, р11С ориджин, периодический (Пример 3) | 2,9-5,3 |
| ΝΤΟ3019, рис ориджин, периодический с подпиткой (Пример 4) | 2,7 |
| ΝΤΟ3019, рис ориджин, индуцибельный периодический с подпиткой (Пример 5) | 6,5-11 |
Данные свидетельствуют о том, что ферментационные среды ЫТС3019 значительно увеличивают ферментационные выходы плазмид с умеренным числом копий (например, рВК.322 с делецией гор) по сравнению со средами и способами, описанными в уровне техники. Этот эффект не является специфичным для плазмид.
ДНК, очищенная в результате этих способов, имеет высокое качество, по существу, являясь на 100% сверхспирализованной при отсутствии обнаруживаемой делеции или другой перестановки. Кроме того, с использованием клеток из этого способа осуществляли очистку ДНК в масштабе 1 г, что свидетельствует о том, что ферментации, осуществляемые в средах ЫТС3019 при периодическом процессе с подпиткой, пригодны для последующей крупномасштабной обработки.
Пример 3. Периодическая ферментация в среде ЫТС3018 с высококопийной плазмидой для генной терапии.
Осуществляли периодическое культивирование в среде ЫТС3018 с плазмидами с ориджином рИС. Использовали следующие плазмиды, содержащие ориджин рИС:
1) р\У2.0. представляющая собой производное рИС19, имеющее измененную полилинкерную последовательность;
2) рМахСЕР;
3) рЕОРР-С1.
Периодические ферментации осуществляли в ферментаторе Νο\ν Βπ.ιπ5\νίο1< ΒίοΕΙο 110 при 37°С. рН регулировали путем автоматического добавления 30% гидроксида аммония или 10% ортофосфорной кислоты. Датчик растворенного кислорода калибровали на 0% путем барботирования газообразного азота и на 100% путем насыщения воздухом. Сосуд аэрировали при 1 \УМ (объем воздуха/объем ферментатора в минуту) и поддерживали содержание растворенного кислорода на уровне 30% путем пропорционально-интегрального контроля перемешивания. При клеточных плотностях выше приблизительно 20 ОЭ600 также требовалось снабжение О2 для поддержания 30% насыщения.
Посевные культуры получали из единичных выделенных колоний, инокулированных в среду Луриа-Бертани (ЬВ) с 50 мкг/мл канамицина или 100 мкг/мл ампициллина, и выращивали при 37°С. Посевные культуры в середине экспоненциальной фазы (0,5-1,5 ОЭ600) использовали для приготовления 1%-ных инокулюмов для ферментатора.
Все ферментации осуществляли при 37°С. Для р\У2.0 копирование плазмиды индуцировали путем выращивания при 42 °С в поздней фазе ферментации. Периодические ферментации с плазмидами рИС позволяли достичь плотностей клеток лишь 16-57 ОЭ600. Тем не менее, показатели удельного выхода плазмид являются обнадеживающими. Окончательные показатели для рЕОЕР-С1 составляли клеточную плотность 56 ОЭ600 и выход 163 мг плазмиды/л (2,9 мг/л/ОЭ600), для рМахОЕР - клеточную плотность 16 ОЭ600 и выход 84 мг плазмиды/л (5,3 мг/л/ОЭ600) и для р\У2.0 - клеточную плотность 57 ОЭ600 и выход 230 мг плазмиды/л (4,0 мг/л/ОЭ600; фиг. 2).
- 14 010836
ДНК, очищенная в результате этих способов, имеет высокое качество, по существу, являясь на 100% сверхспирализованной при отсутствии обнаруживаемой делеции или другой перестановки. Кроме того, с использованием клеток из этого способа осуществляли очистку ДНК в масштабе 0,5 г, что свидетельствует о том, что ферментации, осуществляемые в среде ΝΤί.'3018 при периодическом процессе, пригодны для последующей крупномасштабной обработки.
Пример 4. Периодическая ферментация с подпиткой в средах ΝΤΟ3019 с высококопийными плазмидами для генной терапии.
Для оценки периодической ферментации с подпиткой была выбрана плазмида §\νίζ СЕР (Сеие Тйегару ЗукЧешк), представляющая собой производное вектора УЧса1 УК1 012, содержащее ген зеленого флуоресцентного белка (СЕР). Она представляет собой широко используемую плазмиду с устойчивостью к канамицину (капК) для ДНК вакцины, содержащую ориджин рИС, имеющую размер 5757 п.о. Плазмиду β\νίζ СЕР (Сепе Тйегару ЗукЧешк) трансформировали в Е.соБ ΌΗ5α. рМахСЕР также тестировали в периодических культурах с подпиткой; похожие результаты получены для обеих плазмид.
Столкнулись с двумя проблемами при использовании сред ΝΤΟ3019 для продуцирования этих плазмид. Первую проблему обнаружили, когда выращивали культуры плазмиды §\νίζ СЕР при 37°С, что было успешно осуществлено для плазмид, полученных из рВК322. При культивировании плазмид рИС клеточный рост останавливался приблизительно при 15 ΟΌ600. Флуоресцентная микроскопия продемонстрировала обширную филаментацию, указывающую на ингибирование клеточного деления. Это является летальным, поскольку филаменты в конечном итоге лизируются (АгепФ 8.1.К., Уе155. Ό.8. 2004, 1. ВасЧепо1. 186: 880-884). Например, фиг. 3А демонстрирует периодическую ферментацию с подпиткой с плазмидой §\νίζ СЕР. Клеточный рост замедлялся и, по-видимому, входил в стационарную фазу преждевременно при 15 ΟΌ600. Анализ выхода плазмиды указывал на увеличенный удельный выход плазмиды, составлявший 2,7 мг/л/ОЭ600, когда клеточный рост начинал останавливаться. Плазмиды рИС содержат температурочувствительную точечную мутацию, которая может демонстрировать 30-40-кратное увеличение числа копий при 42°С по сравнению с 30°С (Ьш-СБао еЧ а1., 1992). Температуру затем уменьшали до 33°С в попытках уменьшить число копий плазмиды и таким образом снизить метаболическую нагрузку в клетках, после чего уровень плазмиды уменьшался до 1,6 мг/л/ОЭ600, и клеточный рост возобновлялся. Интересно, что удельный выход плазмиды вновь постепенно увеличивался, и рост входил в стационарную фазу приблизительно при 60 ΟΌ600 вместо ожидавшегося роста до более чем 100 ΟΌ600, даже несмотря на то, что продолжали добавлять питательное вещество. Фиг. 3Б демонстрирует клеточную филаментацию, возникающую при 37°С. После уменьшения температуры до 33°С образец растущих клеток демонстрировал гораздо меньшую филаментацию.
Возможное объяснение заключалось в том, что клеточная популяция никогда полностью не восстанавливалась от филаментации и утрата жизнеспособности начиналась при 37°С. Для проверки этого предположения осуществляли две последовательные периодические ферментации с подпиткой с той же самой плазмидой полностью при 33 °С. При обеих ферментациях культура достигала максимума при клеточных плотностях менее 60 ΟΌ600.
Данные по выходу биомассы и ДНК для этих ферментаций указывают на снижение удельной скорости роста и резкое увеличение удельного выхода плазмиды перед ингибированием клеточного роста. Стремительное увеличение содержания плазмиды до такого высокого уровня было неожиданным и накладывало метаболическую нагрузку на клеточную популяцию, что могло являться причиной пониженной скорости роста. Однако также было продемонстрировано, что снижение скорости роста часто ведет к увеличению числа копий плазмиды (8аЧуада1 У.И., Адга^аЧ Р. 1989 ВюЧесБпо1. Вюепд. 33: 1135-1144), (8ео Ι.Η., Вайеу 1.Е. 1985, ВюЧесБпо1. Вюепд. 27: 1668-1674). Не ясно, вызывает ли неожиданно повышенный удельный выход плазмиды снижение скорости роста, или наоборот, или каждый из этих факторов вызывает другой комбинированно.
Пример 5. Индуцибельный периодический способ с подпиткой для продукции высококопийных плазмид в средах ΝΤί.'3019 с высоким выходом.
Основываясь на результатах ферментации при 33 и 37°С (пример 4), была разработана стратегия для преодоления неожиданного увеличения плазмиды, обнаруживаемого при периодическом режиме с подпиткой для плазмид, имеющих ориджин рИС. Плазмиду §\νίζ СЕР в ΌΗ5α использовали в индуцибельном периодическом способе с подпиткой. Периодическую ферментацию с подпиткой в среде ΝΤί.'3019 осуществляли в соответствии с изложенным в примере 4, за исключением того, что культуру выращивали при 30°С до 60 ΟΌ600, и в этот момент температуру увеличивали до 37°С. Неожиданные результаты представлены на фиг. 4А. Рост при 30°С вплоть до 60 ΟΌ600 устранял проблему остановки роста, и культура в конечном счете превосходила 100 ΟΌ600 с общим выходом плазмиды 670 мг/л. ДНК, очищенная из образцов, полученных этим способом, имеет высокое качество, по существу, являясь на 100% сверхспирализованной при отсутствии обнаруживаемой делеции или другой перестановки.
Выходы плазмиды перед повышением температуры остаются низкими в течение фазы роста, оставаясь ниже 2 мг/л/ΟΌ^η,. Это противоречит результатам ферментации при 33 или 37°С. Важно, что удельные выходы плазмиды после сдвига температуры являются очень высокими, вплоть до
- 15 010836
6,5 мг/л/ОЭб00. значительно превышая уровни, наблюдаемые для других сред/способов ферментации (табл. 3). Ферментация при 30°С в течение фазы роста и сдвиг до 42°С приводили в результате к продуктивным выходам 1,1 г/л (11 мг/л/ОЭ600) для §\νίζ СЕР (фиг. 4Б). Плато продуктивности не ассоциируется с обширной гибелью клеток, поскольку большая часть клеток остается живой.
Модификация сред ИТС3019 (четырехкратное увеличение по глицерину, дрожжевому экстракту и магнию в средах для периодической ферментации) для уменьшения длительности периодической фазы с подпиткой (путем продления периодической фазы до более высоких значений ОЭ600) также приводила к похожим высоким выходам плазмиды после индукции при 42°С, демонстрируя, что периодическая фаза с подпиткой может быть начата при более высоких значениях ОЭ600 без утраты индукции плазмиды.
Множество различных плазмид с различными цепями ориджина рИС, включающих различные гены устойчивости к антибиотикам и расположения прокариотических элементов, продуцировали с выходами больше чем 0,5 г/л в средах ИТС3019, используя индуцибельный способ от 30 до 42°С с ΌΗ5α. Эти результаты демонстрируют, что индуцибельный способ не является специфическим для конкретной плазмиды.
Плазмиду μΧνίζ-СЕР также продуцировали с выходами больше чем 500 мг/л в средах ИТС3019, используя индуцибельный способ от 30 до 42°С с клеточной линией ΌΗ1. Этот результат демонстрирует, что индуцибельный способ не специфичен для конкретного штамма Е.со11.
Кроме того, осуществляли очистку ДНК в масштабе 1 г, используя клетки из этого способа, что свидетельствует о том, что индуцибельные ферментации, осуществляемые в средах ИТС3019 при периодической ферментации с подпиткой, пригодны для крупномасштабной последующей обработки.
Выходы экспрессирующих плазмид в величинах удельных выходов (мг/л/ОИ600) указывают на количество плазмиды относительно общей клеточной массы. Описанный здесь индуцибельный периодический способ с подпиткой поддерживал низкие (меньше 2 мг/л/ОИ600) уровни плазмид в течение фазы роста способа и обеспечивал беспрецедентно сверхвысокую продукцию плазмид (6-11 мг/л/ОИ600) после продуцирования биомассы. Высокие удельные выходы очень желательны, поскольку увеличенный выход плазмиды на 1 г бактерий ведет непосредственно к более высокой чистоте конечного продукта.
Эти результаты демонстрируют общую полезность способов периодической ферментации с подпиткой и периодической ферментации по изобретению для улучшения продуктивности и качества плазмидной ДНК.
Таким образом, способы продуцирования по изобретению обеспечивают способы для улучшенного продуцирования плазмид.
Хотя вышеприведенное описание содержит много конкретного, его не следует рассматривать как ограничение изобретения, а скорее как пример одного из его предпочтительных воплощений. Возможно множество других вариантов. Например, индуцибельный периодический способ с подпиткой может быть интегрирован с периодическим способом таким образом, что ферментацию осуществляют в средах для периодической ферментации ИТС3018 до истощения питательных веществ, после чего одновременно инициируют среды для периодической ферментации с подпиткой ИТС3019 и индукцию. В этом воплощении с некоторыми плазмидами фаза роста может быть осуществлена при температуре вплоть до 37°С, поскольку число копий плазмиды будет уменьшаться при более высокой скорости роста. Оптимальная температура для того, чтобы дать возможность для клеточного деления в течение фазы роста и сохранения индуцируемости плазмиды в течение периодической фазы с подпиткой, может быть определена специалистом в данной области техники. Соответственно, объем изобретения должен быть определен не по проиллюстрированным воплощениям, а по формуле изобретения и ее законным эквивалентам.
Claims (10)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ продуцирования ковалентно замкнутой сверхспирализованной плазмидной ДНК путем периодической ферментации с подпиткой, включающий стадии:A) выращивания бактериальных клеток, содержащих плазмиду, космиду или бактериальный искусственный хромосомный репликон, при пониженной температуре в течение периодической фазы с подпиткой;Б) ограничения скорости роста в течение периодической фазы с подпиткой путем ограничения питания;B) индукции продуцирования плазмиды путем сдвига температуры в сторону повышения иГ) продолжения роста при повышенной температуре для накопления плазмидного продукта; посредством чего указанный способ увеличивает выход плазмиды.
- 2. Способ по п.1, где пониженная температура в течение периодической фазы с подпиткой представляет собой температуру, определенную для поддержания выхода плазмиды меньше приблизительно 2 мг/л/ОИ600.
- 3. Способ по п.1, где пониженная температура в течение периодической фазы с подпиткой составляет приблизительно 30°С.
- 4. Способ по п.1, где сдвиг температуры находится в диапазоне 36-45°С.- 16 010836
- 5. Способ по п.1, где плазмида содержит ориджин репликации, полученный из Со1Е1.
- 6. Способ по п.1, где плазмида содержит ориджин репликации рМВ1, содержащий мутацию рИС О в А.
- 7. Способ по п.1, где плазмида получена на основе УВ1012.
- 8. Способ по п.1, где ферментационная среда представляет собой, по существу, среду полуопределенного состава с глицерином.
- 9. Способ ферментационного продуцирования ковалентно замкнутой сверхспирализованной плазмидной ДНК, включающий стадии:A) выращивания бактериальных клеток, содержащих полученные из рВВ322 плазмиду, космиду или бактериальный искусственный хромосомный репликон, в среде для периодической ферментации с подпиткой;Б) ограничения скорости роста в течение периодической фазы с подпиткой путем ограничения питания иB) продолжения роста для накопления плазмидного продукта; посредством чего указанный способ увеличивает выход плазмиды.
- 10. Способ по п.9, где ферментационная среда представляет собой, по существу, среду полуопределенного состава с глицерином.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US60300004P | 2004-08-19 | 2004-08-19 | |
| PCT/US2005/029238 WO2006023546A2 (en) | 2004-08-19 | 2005-08-16 | Process for plasmid dna fermentation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200700416A1 EA200700416A1 (ru) | 2007-10-26 |
| EA010836B1 true EA010836B1 (ru) | 2008-12-30 |
Family
ID=35968127
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200700416A EA010836B1 (ru) | 2004-08-19 | 2005-08-16 | Способ ферментации плазмидной днк |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7943377B2 (ru) |
| EP (1) | EP1781800B1 (ru) |
| JP (1) | JP5112866B2 (ru) |
| KR (1) | KR20070053765A (ru) |
| CN (1) | CN101076597A (ru) |
| AU (1) | AU2005277510B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0515210A (ru) |
| CA (1) | CA2576939C (ru) |
| EA (1) | EA010836B1 (ru) |
| IL (1) | IL181410A (ru) |
| MX (1) | MX2007001889A (ru) |
| NZ (1) | NZ553945A (ru) |
| WO (1) | WO2006023546A2 (ru) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9017966B2 (en) | 2007-05-23 | 2015-04-28 | Nature Technology Corporation | E. coli plasmid DNA production |
| AU2008262478C1 (en) | 2007-05-29 | 2014-06-19 | Aldevron, L.L.C. | Vectors and methods for genetic immunization |
| US9045759B2 (en) | 2009-01-21 | 2015-06-02 | James Arthur Williams | DNA plasmids with improved copy number |
| IT1394311B1 (it) * | 2009-05-25 | 2012-06-06 | Altergon Sa | Produzione biotecnologica di condroitina |
| US20120258502A1 (en) * | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Vinod Pandiripally | Method of producing recombinant plasmid dna using substantially solid growth medium |
| US9550998B2 (en) | 2012-08-29 | 2017-01-24 | Nature Technology Corporation | DNA plasmids with improved expression |
| US20150322439A1 (en) | 2012-11-19 | 2015-11-12 | Nature Technology Corporation | Replicative minicircle vectors with improved expression |
| CN103396975B (zh) * | 2013-05-15 | 2016-01-27 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 基于载体pSVK的乙肝治疗性质粒DNA疫苗的发酵生产方法及其专用工程菌及高产发酵培养基 |
| US10729765B2 (en) | 2014-09-19 | 2020-08-04 | Statens Serum Institut | Alpha-tocopherol-based adjuvanted solvent for DNA vaccines |
| DE22195354T1 (de) | 2015-08-10 | 2023-05-25 | CureVac Manufacturing GmbH | Verfahren zur erhöhung der replikation eines zirkulären dna-moleküls |
| CN109971697B (zh) * | 2017-12-27 | 2020-12-08 | 江苏万邦医药科技有限公司 | 一种有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法 |
| JP7520719B2 (ja) | 2018-03-21 | 2024-07-23 | アルデブロン，エル．エル．シー． | 生成が改良されたウイルス及び非ウイルスのナノプラスミドベクター |
| WO2020201022A1 (en) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | Danmarks Tekniske Universitet | Automation-ready dna cloning by bacterial natural transformation |
| KR102286426B1 (ko) | 2019-05-10 | 2021-08-05 | 세종대학교산학협력단 | 자동유도 플라스미드 |
| CN110484552A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-11-22 | 上海药明生物技术有限公司 | 无动物源性质粒dna的制备方法 |
| KR20220128607A (ko) | 2019-09-18 | 2022-09-21 | 인터갈락틱 테라퓨틱스, 인크. | 합성 dna 벡터 및 사용 방법 |
| US20230183718A1 (en) * | 2019-09-25 | 2023-06-15 | Katholieke Universiteit Leuven | Large vectors and methods for high-yield production |
| CN111057800B (zh) * | 2019-12-27 | 2024-03-19 | 无锡生基医药科技有限公司 | 采用饥饿发酵工艺生产基因治疗质粒的方法及发酵培养基 |
| KR20220153606A (ko) * | 2020-03-11 | 2022-11-18 | 네이쳐 테크놀로지 코포레이션 | 박테리아 숙주 균주 |
| JP7607865B2 (ja) * | 2020-11-16 | 2025-01-06 | マイクロバイオファクトリー株式会社 | ヒドロキシチロソールの製造方法 |
| CN112725231A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-30 | 上海汉尼生物细胞技术有限公司 | 一种大肠杆菌大规模高效表达超螺旋质粒dna的发酵方法 |
| CN113667626A (zh) * | 2021-07-29 | 2021-11-19 | 华南农业大学 | 一种用于含有CpG基序重组质粒的工程菌的培养基及发酵方法 |
| CN115851795B (zh) * | 2022-07-19 | 2023-09-01 | 广州派真生物技术有限公司 | 一种高产质粒、其构建方法及其应用 |
| CN117025496B (zh) * | 2023-08-16 | 2024-06-14 | 浙江健新原力制药有限公司 | 一种重组质粒的大肠杆菌发酵方法、培养基体系及其应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996040905A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Vical Incorporated | Optimized high-yield production of plasmid dna |
| US7364894B2 (en) * | 1995-09-15 | 2008-04-29 | Centelion | Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy |
| US5981735A (en) * | 1996-02-12 | 1999-11-09 | Cobra Therapeutics Limited | Method of plasmid DNA production and purification |
| US5955323A (en) * | 1996-08-01 | 1999-09-21 | American Home Products Corporation | Automated high-yield fermentation of plasmid DNA in Escherichia coli |
| AU753138B2 (en) * | 1998-05-25 | 2002-10-10 | Qiagen Gmbh | Method for the isolation of ccc plasmid DNA |
| AU1031900A (en) | 1998-11-09 | 2000-05-29 | Genecare Development Aps | Novel plasmids for use in medicine and method of producing same |
| US8501402B2 (en) * | 2003-03-24 | 2013-08-06 | Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg | Methods and devices for producing biomolecules |
-
2005
- 2005-08-16 US US11/573,825 patent/US7943377B2/en active Active
- 2005-08-16 KR KR1020077006254A patent/KR20070053765A/ko not_active Ceased
- 2005-08-16 NZ NZ553945A patent/NZ553945A/en unknown
- 2005-08-16 JP JP2007527970A patent/JP5112866B2/ja active Active
- 2005-08-16 BR BRPI0515210-0A patent/BRPI0515210A/pt not_active Application Discontinuation
- 2005-08-16 EA EA200700416A patent/EA010836B1/ru active IP Right Revival
- 2005-08-16 CN CNA2005800349562A patent/CN101076597A/zh active Pending
- 2005-08-16 AU AU2005277510A patent/AU2005277510B2/en active Active
- 2005-08-16 EP EP05794286.4A patent/EP1781800B1/en active Active
- 2005-08-16 CA CA2576939A patent/CA2576939C/en active Active
- 2005-08-16 WO PCT/US2005/029238 patent/WO2006023546A2/en active Application Filing
- 2005-08-16 MX MX2007001889A patent/MX2007001889A/es active IP Right Grant
-
2007
- 2007-02-18 IL IL181410A patent/IL181410A/en active IP Right Grant
-
2011
- 2011-05-16 US US13/108,294 patent/US20110281304A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LAHIJANI. R. High Yield Production of pBR322-Derived Plasmids Intended for HUman Gene Therapy by Employing a Temperature-Controllable Point Mutation. 20 October, 1996, vol. 7, pages 1971-1980, see entire document * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5112866B2 (ja) | 2013-01-09 |
| US7943377B2 (en) | 2011-05-17 |
| IL181410A (en) | 2011-05-31 |
| WO2006023546A2 (en) | 2006-03-02 |
| AU2005277510B2 (en) | 2009-09-17 |
| JP2008510460A (ja) | 2008-04-10 |
| WO2006023546A3 (en) | 2006-05-26 |
| US20110281304A1 (en) | 2011-11-17 |
| MX2007001889A (es) | 2007-05-09 |
| KR20070053765A (ko) | 2007-05-25 |
| AU2005277510A1 (en) | 2006-03-02 |
| CA2576939A1 (en) | 2006-03-02 |
| IL181410A0 (en) | 2007-07-04 |
| BRPI0515210A (pt) | 2008-07-08 |
| US20070254342A1 (en) | 2007-11-01 |
| NZ553945A (en) | 2010-03-26 |
| AU2005277510A2 (en) | 2006-03-02 |
| EA200700416A1 (ru) | 2007-10-26 |
| EP1781800B1 (en) | 2013-06-19 |
| CN101076597A (zh) | 2007-11-21 |
| CA2576939C (en) | 2016-08-16 |
| EP1781800A4 (en) | 2009-01-07 |
| EP1781800A2 (en) | 2007-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA010836B1 (ru) | Способ ферментации плазмидной днк | |
| JP5980580B2 (ja) | アスパラギン酸由来アミノ酸および化学物質の改善された生産のための改変グリオキシル酸シャント | |
| EP2975114B1 (en) | Strain having enhanced l-valine productivity and l-valine production method using the same | |
| Carnes | Fermentation design for the manufacture of therapeutic plasmid DNA | |
| KR101215245B1 (ko) | 비-항생제 내성 선별 마커를 포함하는 선별 시스템 | |
| US20080318283A1 (en) | Fermentation Process for Continuous Plasmid Dna Production | |
| JP2024534612A (ja) | ポリ乳酸を生産する遺伝子工学菌株及びポリ乳酸を生産する方法 | |
| EP2611900B1 (en) | Alkaline feed | |
| CN114854659B (zh) | 一种麦角硫因生产工艺及其应用 | |
| CN1249244C (zh) | 去除抗生素耐药性和/或使质粒稳定的方法,该方法构建的载体和转化的宿主细胞及其应用 | |
| JP7618656B2 (ja) | 高収量生産のための巨大ベクターおよび方法 | |
| WO2022189976A1 (en) | Genetic alterations in microalgae organisms, and methods and compositions | |
| KR102157781B1 (ko) | 디카르복시산 생산을 위한 미생물 및 이를 이용한 디카르복시산 생산방법 | |
| RU2731897C1 (ru) | Способ управления метаболизмом клетки | |
| OA20743A (en) | Large vectors and methods for high-yield production. | |
| JP6412509B2 (ja) | ポリペプチドの組換え生産のためのアミノ酸栄養要求性除去原核生物株の使用 | |
| CN119875978A (zh) | 运动发酵单胞菌底盘细胞及其构建方法和应用 | |
| Vlahović | Improvement of plasmid stability in E. coli for industrial production |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): RU |