JP7618656B2 - 高収量生産のための巨大ベクターおよび方法 - Google Patents

Description

本発明は、ベクターおよび巨大ベクターの高収率生産のための方法に関する。

遺伝子治療およびＤＮＡワクチンは、癌や後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等の疾患の予防、処置および治療のための有望なツールである。遺伝子治療およびＤＮＡワクチンは、構造形態およびＤＮＡ配列が均質でなければならない大量の高度に精製されたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を必要とする。さらに、遺伝子治療、および複雑な病原体に対するＤＮＡワクチン等のＤＮＡワクチンは、大きなゲノムＤＮＡ挿入に許容することができるプラスミドを必要とする。バイオ医薬の用途では、収量と品質とがプラスミドの製造プロセスのための主要な原動力である。収量の増大を求めて、高いコピー数をもたらすプラスミドが開発されており、これは、細胞当たりプラスミドの複数のコピーをもたらすことを意味する（細胞当たり＞５００コピー、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９ベクター）。そのような細胞当たりのプラスミドの高いコピー数は、小さなプラスミド（＜１０ｋｂ）で達成することができる。しかしながら、プラスミドが大きいほど、細菌細胞の代謝負荷が大きくなるため、複製が遅くなる。細菌細胞は、プラスミドに突然変異を導入することによって代謝負荷に応答する。その結果、プラスミドＤＮＡの品質が低下する。これは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）等の低コピー数ベクターを用いることにより最適化することができ、ＢＡＣは、１００世代以上の連続的な細菌増殖の後であっても、宿主細胞内で単一コピー（ＳＣ）ベクター内の個々のＤＮＡフラグメントを安定して維持できるため、大きなゲノムＤＮＡフラグメントを維持するための好ましいプラスミドである。

最近の進歩は、ＢＡＣのコピー数の最適化に関連するものである。例えば、ＷＯ２０１４１７４０７８には、細菌細胞当たり１０コピーを超えるまでＢＡＣを増幅するための誘導性細菌複製起点（ｏｒｉ）配列を含むＢＡＣが記載されている。しかしながら、これらのＢＡＣでは、商業的に実施可能な高いＢＡＣの収量を得ることができない。その結果、かなりの量のＢＡＣを得るために非常に大規模な培養が必要になる。

高品質のプラスミドを高収量で得るための新しいベクターおよびプロトコルを開発することが不可欠である。

細菌における誘導性細菌複製起点（ｏｒｉ）配列を含むベクターの条件付き増幅が当技術分野で記載されている。増幅の誘導は、通常、細菌の初期指数増殖期、より具体的には、細菌増殖曲線の初期対数（算術）期（すなわち、低ＯＤ）で行われる（Wild et al. 2002, Genome Research 12:1434-1444）。

本発明者らは、最適な発酵条件に達するまで細胞当たりのプラスミド数を低く維持し、次いで系を高コピー状態に切り替える誘導系を用いることにより、細菌細胞の高代謝負荷への曝露が最小限に抑制されることを見出した。その結果、巨大プラスミドをより高い収量で得ることができ、巨大プラスミドは高い品質を有する。

本発明の第１の態様によれば、誘導性複製起点を含み、それにより細菌細胞が少なくとも２０のＯＤに達したときに誘導が行われるベクターを用いて、細菌細胞からの少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを製造する方法が提供される。特定の実施形態によれば、細菌細胞から少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを製造するための方法であって、連続した、
ａ）誘導性複製起点を含む、少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを含む細菌細胞を得る工程、
ｂ）ベクターを含む細菌細胞を培地に接種する工程、
ｃ）６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が少なくとも２０に達するまで培地で細菌細胞を培養する工程、
ｄ）誘導性複製起点の１種以上の誘導物質を培地に添加する工程、
ｅ）任意に細菌細胞を培地から分離する工程、および
ｆ）細菌細胞からプラスミドを回収する工程
を含む方法が提供される。

プラスミドの製造を可能にするために、工程（ｄ）の後に細胞の培養が継続されることが理解されよう。

より具体的には、本発明は、培地で細菌細胞を培養し、細菌培養物の６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が少なくとも２０に達したときに、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質を培地に添加し、その後、細菌細胞を培地でさらに培養することを含む。その後、任意に細菌細胞を培地から分離し、プラスミドを細菌細胞から回収する。

特定の実施形態において、この方法は、工程ｄ）の後かつ工程ｅ）の前等の、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質が添加された後において、細菌タンパク質合成の阻害剤を培地に添加することをさらに含む。

特定の実施形態において、培地で細菌細胞を培養する間に、グルコースおよび／または酵母抽出物が培地に添加される。

特定の実施形態において、グルコースを含む培地は、１種以上のプラスミド複製の誘導物質を培地に添加する少なくとも３０分前に、０．５０～２．０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含む培地と交換される。

特定の実施形態において、培地で細菌細胞を培養する工程ｃ）は約３０℃の温度で行われ、温度を、１種以上のプラスミド複製の誘導物質を培地に添加する少なくとも２時間前に、約３０℃から３６．０～３８．０℃の温度に上昇させる。

特定の実施形態において、誘導性複製起点は少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターを含み、誘導性複製起点の誘導物質はイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および／またはアルファ－Ｄ－ラクトースである。

特定の実施形態において、細菌タンパク質合成の阻害剤はクロラムフェニコールまたはスペクチノマイシン、好ましくはクロラムフェニコールである。

特定の実施形態において、細菌タンパク質合成の阻害剤は、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質の添加の少なくとも１時間後に培地に添加される。

特定の実施形態において、細菌細胞は、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質の添加の最大６時間後に培地から分離される。

さらなる実施形態によれば、誘導性複製起点を含む少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターが提供される。

特定の実施形態において、誘導性複製起点は：
－ＲＮＡＩプロモーターの機能が無効となるかまたは大幅に低下するようにＲＮＡＩプロモーターが欠失または変異して、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーが形成されており、かつ
－ＲＮＡＩの機能が無効となるかまたは大幅に低下するようにＲＮＡＩをコードする核酸配列が欠失または変異して、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーが形成されており、かつ
－少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターが切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列の上流に導入され、少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターが切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列に作動可能に連結されている
ｐＭＢ１複製起点を含む。

特定の実施形態において、ｐＭＢ１複製起点の内因性ＲＮＡＩＩプロモーターは、ｐＭＢ１複製起点のＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターではないプロモーターによって置換されており、ｐＭＢ１複製起点のＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターでないプロモーターは、少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターに作動可能に連結されている。

特定の実施形態において、ｐＭＢ１複製起点の内因性ＲＮＡＩＩプロモーターは、ＲＮＡＩのプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーターおよびＴ７プロモーターからなる群から選択されるプロモーター、好ましくはｌａｃプロモーター、より好ましくはＬ８／ＵＶ５ ｌａｃプロモーターによって置換されている。

さらなる態様によれば、
－ＲＮＡＩプロモーターの機能が無効となるかまたは大幅に低下するようにＲＮＡＩプロモーターが欠失または変異して、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーが形成されており、かつ
－ＲＮＡＩの機能が無効となるかまたは大幅に低下するようにＲＮＡＩをコードする核酸配列が欠失または変異して、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーが形成されており、かつ
－少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターが切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列の上流に導入され、少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターが切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列に作動可能に連結されており、かつ
－野生型ｐＭＢ１複製起点の３２２位の核酸に対応する核酸がＡからＧに変異しており、かつ／または野生型ｐＭＢ１複製起点の５４３位の核酸に対応する核酸がＣからＴに変異している
ｐＭＢ１複製起点を含む、誘導性複製起点が提供される。

特定の実施形態において、誘導性複製起点は、配列番号９に示される核酸配列と少なくとも９５％、好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

特定の実施形態において、この方法は、細菌細胞から少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを製造するために用いられる。さらなる実施形態において、少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターは、本明細書に示されれるベクターである。

図１は、ｐＶｉｒｏＶｅｔ－４－ＹＦＶ１７ＤプラスミドおよびｉＯｒｉの概略図を示す。ｏｒｉＳ：Ｆ因子のｏｒｉ２レプリコン；ｉＯｒｉ：誘導性複製起点；ｒｅｐＥ：複製イニシエーター遺伝子；ｐａｒＢ：分割タンパク質Ｂ遺伝子；ｐａｒＣ：分割タンパク質Ｃ遺伝子；ＫａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子；ＨＤｒｚ：肝炎ウイルスδリボザイム；ＵＴＲ：非翻訳領域；ＹＦＶ１７Ｄ：黄熱病ウイルスクローン１７Ｄ；Ｌａｃ－Ｌ８－ＵＶ：Ｌ８－ＵＶ５改変を伴うｌａｃプロモーター；ＬａｃＯ１：ｌａｃオペレーター；ｐＭＢ１ｏｒｉ：改変されたｐＭＢ１（ＣｏｌＥ１）の複製起点。 図２は、ＲＮＡＩＩ配列中に２つの点突然変異を含む、完全なｐＭＢ１（ＣｏｌＥ１）Ｏｒｉおよび完全なｉＯｒｉの核酸配列を示す。 図３（Ａ）ｐＭＢ１（ＣｏｌＥ１）Ｏｒｉでは、ＲＮＡＩＩ ＤＮＡはその同族の上流プロモーターＲＮＡＩＩｐから転写され、ＲＮＡＩＩ転写産物を生成する。ＲＮＡＩＩは、プラスミドＤＮＡのＯｒｉ＋１開始点におけるＤＮＡ合成を開始するためのプライマーとして機能する。ＲＮＡＩＩの発現は、相補的なアンチセンスＲＮＡＩの結合によって転写後に調節される。ＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩ遺伝子内で逆方向に存在するＲＮＡＩ遺伝子から、そのＲＮＡＩｐプロモーターから発現される。プラスミドにコードされたＲＯＰタンパク質はＲＮＡＩ－ＲＮＡＩＩ二本鎖を安定化し、これによりプラスミドＤＮＡの複製がさらに制限される。（Ｂ）ｉＯｒｉでは、５’末端切断型ＲＮＡＩＩ^＊の発現は、異種ＬａｃＵＶｐプロモーターから開始される。ＲＮＡＩ遺伝子全体が欠失し、ＲＮＡＩは発現しない。５’末端切断型ＲＮＡＩＩ^＊（すなわち切断型ＲＮＡＩＩプレプライマー）の発現は、異種プロモーターと元の野生型ＲＮＡＩＩ^＊配列との間に挿入されたＬａｃＯ１リプレッサー結合配列へのＬＡＣＩタンパク質の結合によって転写レベルで調節される。ｉＯｒｉでは、ＬａｃＯ１ ＤＮＡ配列とＲＮＡＩＩ ＤＮＡ配列との転写融合であるＲＮＡＩＩ^＊が、プラスミドＤＮＡ合成を開始するためのプライマーとして機能する。Ｏｒｉ＋１はＤＮＡ複製起点；遺伝子を通常の文字、転写産物を斜体、タンパク質を太字の大文字；負の調節因子を影付き文字；転写産物を相対的な方向を示す波線矢印で示す。 図４は、本明細書に示すプラスミドのＩＰＴＧおよびα－Ｄ－ラクトースの両方による誘導性を示す。 図５は、野生型ｉＯｒｉと比較した変異型ｉＯｒｉのベクター産生に対する有益な効果を示す。ｐＶＶ４^＊は、図１に示すｐＶｉｒｏＶｅｔ－４－ＹＦＶ１７Ｄプラスミドの第１のクローンを意味し、ｐＶＶ４は、図１に示すｐＶｉｒｏＶｅｔ－４－ＹＦＶ１７Ｄプラスミドの第２のクローンを意味し、ｐＶＶ－ｗｔ ｉＯｒｉは、変異型ｉＯｒｉが野生型（すなわち変異していない）ｉＯｒｉで置換されていないｐＶｉｒｏＶｅｔ－４－ＹＦＶ１７Ｄプラスミドを意味し、ＮＩは誘導されていないことを意味し；Ｉは誘導されていることを意味する。 図６は、供給物（feed）への補助剤（supplement）としてグルコースまたはグリセロールを添加することによるベクター製造への有益な効果を示す。 図７は、１リットルの発酵槽でのプラスミド製造に対するクロラムフェニコールの効果を示す。操作（ａ）は細菌細胞の接種；操作（ｂ）はグリセロールの供給の開始；操作（ｃ）はＩＰＴＧによる細菌細胞の誘導；操作（ｄ）は培地へのクロラムフェニコールの添加；および操作（ｅ）は細菌細胞の回収である。 図８は、１リットルの発酵槽でのプラスミド製造に対する温度シフトの影響を示す。操作（ａ）は細菌細胞の接種；操作（ｂ）はグルコースの供給の開始；操作（ｃ）は３７℃への温度上昇およびグルコース供給からグリセロール供給への変更；操作（ｄ）はＩＰＴＧによる細菌細胞の誘導；（ｅ）は培地へのクロラムフェニコールの添加；および操作（ｆ）は細菌細胞の回収である。 図９は、配列番号によって示される核酸配列を示す。

発明の詳細な説明

「約」という用語は、数値に関連して用いられる場合、関連する技術において一般的に理解される意味を有する。特定の実施形態において、「約」という用語は省略されてもよく、または数値＋１０％；または＋５％；または＋２％；または＋１％を意味すると解釈されてもよい。

本明細書でパーセンテージに関して用いられる場合は常に、ｗ／ｗは重量／重量を意味し、ｗ／ｖは重量／体積を意味する。

本明細書で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、単数および複数の指示対象の両方を含む。

本明細書で用いられる「含む（comprising）」、「含む（comprises）」および「含まれる（comprised of）」という用語は、「含む（including）」、「含む（includes）」または「含む（containing）」、「含む（contains）」と同義であり、包括的（inclusive）または制約的（open-ended）であり、追加の、記載されていない成員（member）、要素または方法の工程を排除するものではない。記載された成員、要素または方法の工程を意味する場合の「含む（comprising）」、「含む（comprises）」および「含まれる（comprised of）」という用語は、記載された成員、要素または方法の工程「からなる（consist of）」実施形態も含む。

また、明細書および特許請求の範囲における第１、第２、第３等の用語は、特に明記しない限り、類似の要素または工程を区別するために用いられ、必ずしも連続的または時系列の順序を説明するために用いられるわけではない。そのように用いられる用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載の実施形態は、本明細書に記載または図示されている以外の順序で運用できることを理解されたい。

本明細書全体を通して「一つの実施形態」または「実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴（feature）、構造または特性（characteristic）が、本明細書で想定される少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な部分における「一つの実施形態において」または「実施形態において」という表現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を意味するとは限らず、そうである場合もある。また、特定の特徴、構造または特性は、１つ以上の実施形態において、本開示から当業者に明らかであるように、任意の適切な方法で組み合わせることができる。また、本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴であって他の特徴ではない特徴を含むが、異なる実施形態の特徴の組み合わせは本発明の範囲内にあり、当業者によって理解されるように異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、以下の特許請求の範囲では、請求項に記載の実施形態のいずれかを任意の組み合わせで用いることができる。

本明細書で引用される参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

細菌において巨大ベクター（例えば、プラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ））の収量を増大させる場合、複製系の活性が大幅に増大することによるベクターＤＮＡの変異頻度の増大するというもっともな懸念があある。したがって、巨大ベクターの製造には、高収量のベクターが得られるが、耐えられないほどの突然変異の導入なしにベクターの複製が起こる製造プロセスが必要である。

本発明者らは、巨大ベクターの高収量生産を確実にするためのツールおよび方法を特定した。これは、例えば、巨大な挿入が必要とされることが多いワクチン接種において用いられるベクトルの生成において重要である。本発明者らは、ベクターを含む宿主細胞の培養中に誘導性複製起点（ｏｒｉ）を戦略的に利用することによって、これが確実になり得ることを特定した。より具体的には、誘導性ｏｒｉを含む少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを含む細菌細胞を、高い培養密度（例えば、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が少なくとも２０）に達するまで培養し、次いで、誘導性ｏｒｉの１種以上の誘導物質を培地に添加することにより複製を誘導することによって、大量の上記ベクターが得られることを見出した。より具体的には、本発明者らは、増殖期中の細胞単位当たりのベクターのコピー数を制限し（例えば、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）で２０未満）、高バイオマス（例えば、ＯＤ_６００で少なくとも２０）で複製を誘導することによって、例えばＤＮＡベースのワクチンで用いるための、高品質の医薬品グレードの（すなわち、変異頻度が低い）ベクターを高収率（例えば、少なくとも５５ｍｇ／Ｌのベクター）で得ることができることを見出した。本明細書に示される少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを製造するための方法は拡張性がある（例えば、少なくとも１０００Ｌ、少なくとも１５００Ｌまたは少なくとも２０００Ｌまで）。また、本発明者らは、誘導性プロモーターと、ＣｏｌＥ１型ｏｒｉの切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列とを含む誘導性ｏｒｉを含み、ＣｏｌＥ１型ｏｒｉの切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列が誘導性プロモーターに作動可能に連結されている少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターが、そのような高収量のベクターを得るのに特に有利であることを見出した。本発明者らは、（ｉ）誘導前に約３０℃から３６～３８℃への温度シフトを導入すること；（ｉｉ）誘導後に細菌タンパク質合成の阻害剤を添加すること；および／または（ｉｉｉ）グルコースおよび／または酵母抽出物、または補助剤としてのグリセロールを培地に添加することによって、収量がさらに（例えば、少なくとも１２０ｍｇ／ベクターＬまで）増大し得ることを見出した。

したがって、第１の態様によれば、細菌細胞から少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを製造するための方法であって、連続した、
ａ）誘導性ｏｒｉを含む、少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを含む細菌細胞を得る工程、
ｂ）ベクターを含む細菌細胞を培地に接種する工程、
ｃ）６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が少なくとも２０に達するまで培地で細菌細胞を培養する工程、
ｄ）誘導性ｏｒｉの１種以上の誘導物質を培地に添加する工程、
ｅ）任意に細菌細胞を培地から分離する工程、および
ｆ）細菌細胞からベクターを回収する工程
を含む方法が提供される。

プラスミドの製造を可能にするために、工程（ｄ）の後に細胞の培養が継続されることが理解されよう。

したがって、細菌細胞から少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを製造するための方法はまた、連続した、
－誘導性ｏｒｉを含む、少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを含む細菌細胞を得る工程、
－ベクターを含む細菌細胞を培地に接種する工程、
－培地で細菌細胞を培養する工程、
－細菌培養物の６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が少なくとも２０に達したときに、誘導性ｏｒｉの１種以上の誘導物質を培地に添加する工程、
－培地で細菌細胞をさらに培養する工程、
－任意に細菌細胞を培地から分離する工程、および
－細菌細胞からベクターを回収する工程
を含むものとしても説明することができる。

特定の実施形態において、これらの工程は連続した順序で行われる。

本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、核酸フラグメント、好ましくは本明細書で定義される組換え核酸分子が挿入およびクローン化され得る、すなわち増殖され得る環状の二本鎖ＤＮＡ分子を意味する。したがって、ベクターは、典型的には１つ以上の固有の制限部位を含み、クローン化された配列が再生産可能であるようような定義された細胞または媒体生物において自律複製が可能である。本発明の場合、ベクターは、細菌細胞において複製することができるベクターであることを当業者は理解するであろう。ベクターはまた、ベクターを含むレシピエント細胞の選択を可能にするために、例えば、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを含んでいてもよい。ベクターとしては、必要に応じて、プラスミド、コスミド、ファージミド、バクテリオファージ由来ベクター、ＰＡＣ、ＢＡＣ等が挙げられるが、これらに限定されない。プラスミドは、とりわけレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターの構築を目的としたプラスミドであり得る。発現ベクターは、一般に、所望の発現系、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞、器官および／または生物において、核酸またはそれに導入されたオープンリーディングフレームの発現を可能にし、かつ／またはもたらすように構成される。例えば、発現ベクターは、適切な調節配列を有利に含み得る。

特定の実施形態において、ベクターは、少なくとも１６ｋｂ、少なくとも１７ｋｂ、少なくとも１８ｋｂ、少なくとも１９ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２１ｋｂまたは少なくとも２２ｋｂ、好ましくは少なくとも１６ｋｂのサイズのベクター等の巨大ベクターである。本明細書において用いられる「ｋｂ」、「ｋｂｐ」または「キロ塩基対」とは、１０００塩基対（ｂｐ）のＤＮＡを意味する。

「細菌細胞」または「細菌」という用語は、ベクターの宿主細胞として適切な細菌を意味する。バクテリア中でベクターを製造することの利点は、とりわけバクテリア細胞の比較的安全で簡単な取り扱いと微生物の迅速な複製サイクルでにある。

特定の実施形態において、例えば、誘導性ｏｒｉがＬａｃ Ｏ１オペレーターを含む場合、細菌細胞は、Ｌａｃリプレッサー（ＬａｃＩ）を含む細菌細胞である。より具体的な実施形態において、細菌細胞は、十分な量のＬａｃリプレッサー（ＬａｃＩ）を有する細胞である。十分な量のＬａｃリプレッサーは、誘導性ｏｒｉの１つ以上の誘導物質がない場合に細菌細胞内でのベクターの漏出複製を防ぐ量のＬａｃリプレッサーである。好ましくは、十分な量のＬａｃリプレッサーは、誘導性ｏｒｉの１つ以上の誘導物質が存在しない場合において０．５～４ｍｇ／Ｌ、０．５～３ｍｇ／Ｌ、０．５～２ｍｇ／Ｌまたは０．５～１ｍｇ／Ｌのベクターの複製を抑制することができる量のＬａｃリプレッサーである。

特定の実施形態において、細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、好ましくはＢＬ２１コンピテントＥ．Ｃｏｌｉ、またはWilliam Studier and Barbara A. Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol. 1986 May 5;189(1):113-30により記載されているＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントＥ．ｃｏｌｉおよびＤＨ５－α細胞等の誘導体である。

少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを含む細菌細胞は、当技術分野で公知の細菌の形質転換、例えば熱ショックにより得ることができる。

本明細書で用いられる「誘導性複製起点」、「誘導性ｏｒｉ」、「ｉｏｒｉ」、「条件付き複製起点」または「条件付きｏｒｉ」という用語は、細菌宿主細胞で機能し、該宿主細胞（すなわち、細菌細胞）にとって外来である誘導性複製起点の１種以上の誘導物質に応答するベクターｏｒｉ配列を意味する。好ましくは、誘導性ｏｒｉの複製機能は、該誘導性複製起点の１つ以上の誘導物質が存在しない場合、著しく抑制されるかまたは存在しない。特定の実施形態において、誘導性ｏｒｉは、誘導性複製起点の１つ以上の誘導物質の存在下で、ベクターを高コピー数まで、好ましくは細胞当たり少なくとも２０コピー、少なくとも３０コピー、少なくとも４０コピー、少なくとも５０コピー、少なくとも６０コピー、少なくとも７０コピー、少なくとも８０コピー、少なくとも９０コピー、少なくとも１００コピー、少なくとも１１０コピー、少なくとも１２０コピー、少なくとも１３０コピー、少なくとも１４０コピー、少なくとも１５０コピー、少なくとも２００コピーまたは少なくとも３００コピー、より好ましくは細胞当たり５０コピー超、より一層好ましくは細胞当たり１００コピー超まで増殖させる。好ましくは、誘導性ｏｒｉは、誘導性複製起点の１種の誘導物質に応答する。

「誘導性複製起点の誘導物質」、「ベクター複製の誘導物質」または「複製開始剤」という用語は、リプレッサーを（例えば、除去によって）不活性化することができる薬剤を意味する。リプレッサーは、通常、ＤＮＡのオペレーター配列に結合することにより、１種以上の転写産物の発現を阻害または減少させる。リプレッサーのオペレーターへの結合は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターへの結合を妨げ、それによって転写を阻害する。誘導性複製起点の誘導物質は、リプレッサーのオペレーターへの結合を妨げることができ、それによって転写が可能になる。

当業者であれば、誘導性ｏｒｉが、ベクター複製の既知の誘導物質との適合性、選択された宿主細胞におけるベクター複製の適合性誘導物質の非存在下でのその通常の厳密なダウンレギュレーション、およびそのベクター複製の誘導物質の存在下でのその強力な誘導操作性で選択されることを理解するであろう。誘導性ｏｒｉの非限定的な例としては、Ｌ－アラビノースの添加によって誘導され得るＬ－アラビノース誘導性パラプロモーター（ａｒａＣ－ＰＢＡＤ）によって厳密に調節されるｏｒｉＶ／ＴｒｆＡ増幅システム、例えば、Wild J. et al., Conditionally amplifiable BACs: switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones. Genome Res. 2002.12(9):1434-1444に記載されているようなシャトルＢＡＣベクターの増幅が挙げられる。さらなる例において、ｏｒｉＶ／ＴｒｆＡは、Wild J. et al., Copy-control tightly regulated expression vectors based on pBAC/oriV. 2004.267:155-167に記載されているようなラムノース誘導性Ｐｒｈａプロモーター（ｒｈａＳ－Ｐｒｈａ）によって厳密に調節され得る。

ＣｏｌＥｌ型プラスミドは当技術分野において公知であり、天然に存在するプラスミド（ｐＭＢ１、ｐｌ５Ａ、ｐＪＨＣＭＷ１等）、および一般的に用いられる多くのクローニング媒体（ｐＢＲ３２２および関連ベクター、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミドならびにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター等）が挙げられる。これらのプラスミドの複製の開始および調節は、当技術分野においてよく知られている。より具体的には、ＣｏｌＥｌ型プラスミドは、複製の調節に関与する２種のＲＮＡ分子（すなわち、ＲＮＡＩおよびＲＮＡＩＩ）の合成、一方におけるそれらのＲＮＡ分子の相互作用、および他方におけるテンプレートプラスミドＤＮＡとの相互作用を含む共通のメカニズムを用いてＤＮＡを複製する。ＣｏｌＥｌ領域には、ＲＮＡＩ用とＲＮＡＩＩ用の２種のプロモーターが含まれる。ＣｏｌＥｌ型プラスミドからの複製は、宿主のＲＮＡポリメラーゼによる、複製起点の５５５ｂｐ上流に位置するプレプライマーＲＮＡＩＩの転写から開始される。伸長中、ＲＮＡＩＩは特定のヘアピン構造に折りたたまれ、約５５０ヌクレオチドの重合後、テンプレートＤＮＡとのハイブリッドを形成し始める。続いて、ＲＮＡＩＩプレプライマーはＲＮａｓｅ Ｈによって切断され、ＤＮＡポリメラーゼＩがアクセスできる遊離の３’ＯＨ末端を有する活性ＲＮＡＩＩプライマーを形成する。ＣｏｌＥｌ型の起点鎖の反対側において、ＲＮＡＩ、アンチセンスＲＮＡＩＩの５’末端に相補的な１０８ヌクレオチドのＲＮＡが転写される。ＲＮＡＩの転写は、複製起点から４４５ｂｐ上流で開始され、ＲＮＡＩＩ転写のほぼ開始点まで継続される。ＲＮＡＩは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが形成される前に、伸長するＲＮＡＩＩ分子に結合することにより、プライマーの形成を阻害し、したがって複製を阻害する。ＲＮＡＩ／ＲＮＡＩＩの相互作用とは別に、ＣｏｌＥｌのｒｏｍ／ｒｏｐ転写産物は、ＲＮＡＩＩとＲＮＡＩとの間の複合体形成の速度を上げることにより、プラスミドのコピー数の調節に寄与する。

ｒｏｍ／ｒｏｐを欠失させたＣｏｌＥｌ型プラスミドの誘導体が開発されている。そのような誘導体はコピー数が増大している。そのような誘導体の例としては、ｐＢＲ３２２の誘導体、例えばｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９が挙げられる。ｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９プラスミドは、ＲＮＡＩＩにおける単一の点突然変異、より具体的には、ＲＮＡＩを説明する領域（region commentary to）に直接隣接するセグメントにおけるＲＮＡＩＩの転写産物の第１１２ヌクレオチドにおけるＧＡ点突然変異をさらに含み、プラスミド複製開始能を増強する。

宿主細胞内でのプラスミドの増殖には、宿主の複製機構によるプラスミドの複製が必要である。複製起点（ｏｒｉ）は、宿主細胞にプラスミド複製を開始するように指示するする、プラスミドに担持されたＤＮＡ配列であり、そのためプラスミドの増殖に不可欠である。これは、ｏｒｉを構成する配列に結合する様々なタンパク質（イニシエーターとリプレッサー）によって達成される。

ｐＭＢ１（ＣｏｌＥ１）ｏｒｉには、上述したように、ＲＮＡＩおよびＲＮＡＩＩの合成を促進する領域が含まれる。プラスミドの複製は、通常、ｏｒｉの５５０ヌクレオチド（ｎｔ）上流のプラスミドから転写され、プラスミドに強くハイブリダイズするＲＮＡＩＩによって開始される。起点におけるこのハイブリッドの形成は、プラスミド複製の重要な前提条件である。このハイブリッドのＲＮＡ部分は、ＲＮＡＩＩを消化してするＲＮａｓｅＨの基質になり、プラスミド全体の複製を開始するためのＤＮＡポリメラーゼＩのプライマーとして用いられ得る５５０ｎｔの分子を生成する。

当業者は、本明細書で教示または記載される少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターが、誘導性ｏｒｉに加えて、誘導性ｏｒｉとは異なる複製機構を利用するｏｒｉを含み得、２種のｏｒｉが同じ構造をめぐって競合するため、不安定で予測不可能な環境が創出されることを理解するであろう。例えば、誘導性ｏｒｉがＣｏｌＥ１型ｏｒｉまたはそれに由来するｏｒｉに由来する場合、第２のｏｒｉはＦ１またはＰ１ｏｒｉまたはそれに由来するｏｒｉであり得る。したがって、特定の実施形態において、ベクターは、ＣｏｌＥ１型ｏｒｉまたはそれに由来するｏｒｉ（好ましくは、ｐＭＢ１ ｏｒｉまたはそれに由来するｏｒｉ）とは異なるｏｒｉによって複製されるベクターであって、本明細書に記載されるように、その中にＣｏｌＥ－１型ｏｒｉ（好ましくは、ｐＭＢ１ ｏｒｉに由来する）に由来する誘導性ｏｒｉが導入されるベクターである。ＣｏｌＥ－１型ｏｒｉ（好ましくは、ｐＭＢ１ ｏｒｉに由来する）とは異なるｏｒｉによって複製されるベクターの非限定的な例としては、Ｆ１またはＰ１ ｏｒｉまたはそれらから誘導されるｏｒｉによって複製されたベクター、またはそれらから誘導される当技術分野で公知のベクターが挙げられる。より具体的な実施形態において、本明細書に記載される誘導性ｏｒｉが導入されるベクターは、ＣｏｌＥ１型プラスミドではなく、好ましくは、本明細書に記載される誘導性ｏｒｉが導入されるベクターは、ｐＢＲ３２２ベクターまたはｐＵＣベクターではない。

ベクターを含む細菌細胞の培地への接種は、培養培地に細菌細胞を接種するための当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、ベクターを含む細菌細胞の単一コロニーは、滅菌ピペットチップまたはつまようじを用いて寒天プレートから選択することができ、その後、該チップまたはつまようじを液体培地に投入し、該チップまたはつまようじを含む液体培地を回転させる。あるいは、培地に、ベクターを含む細菌細胞のグリセロールストックを接種することができる。

培地は、細菌細胞を培養するための当技術分野で公知の任意の培養培地であり得る。非限定的な例としては、Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉブロス培地（ＬＢ）（ＡＴＣＣ培地製剤１０６５）、またはＭ９最小培地等の最小培地が挙げられる。当業者は、最小培地が用いられる場合、アミノ酸、塩および／または栄養素の補充が必要となる可能性があることを理解するであろう。最小培地を用いることにより、細菌細胞に供給される栄養素を厳密に調節できるという利点がある。

特定の実施形態において、培地は、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも７０ｍＭ、少なくとも８０ｍＭまたは少なくとも９０ｍＭのリン酸塩が添加されたＬＢ培地である。例えば、培地は、９０ｍＭのリン酸塩が添加されたＬＢ培地である。

特定の実施形態において、培養培地は液体（ブロス）培地である。

細菌によるグルコース等の炭水化物の生物学的酸化によって、化学エネルギー源としてのＡＴＰの合成がもたらされ、生合成または同化反応のために細菌が必要とするよりも単純な有機化合物が生成される。

したがって、特定の実施形態において、グリセロール、グルコースおよび／または酵母抽出物は、培地に接種する工程（工程ｂ）の後、かつ培地で細菌細胞を培養する工程（工程ｃ）の前に、培地に添加される。より具体的な実施形態において、グリセロール、グルコースおよび／または酵母抽出物は、培地で細菌細胞を培養する工程（工程ｃ）の間に培養培地に添加される。

特定の実施形態において、グリセロール、グルコースおよび酵母抽出物の１種以上（例えば、グリセロール；グルコース；酵母抽出物；グリセロールおよびグルコース；グリセロールおよび酵母抽出物；グルコースおよび酵母抽出物；またはグリセロール、グルコースおよび酵母抽出物）が、総濃度０．５０～１．０％（ｗ／ｖまたはグリセロールについてはｖ／ｖ）、０．５０～５．０％（ｗ／ｖまたはグリセロールについてはｖ／ｖ）、１．０～５．０％（ｗ／ｖまたはグリセロールについてはｖ／ｖ）、１．０～４．０％（ｗ／ｖまたはグリセロールについてはｖ／ｖ）、１．０～３．０％（ｗ／ｖまたはグリセロールについてはｖ／ｖ）、１．０～２．０％（ｗ／ｖまたはグリセロールについてはｖ／ｖ）、好ましくは０．５０～２．０％（ｗ／ｖまたはグリセロールについてはｖ／ｖ）で培地に添加される。例えば、グリセロール、グルコースおよび酵母抽出物の１種以上が１．０％（ｗ／ｖまたはグリセロールについてはｖ／ｖ）培地に添加される。

特定の実施形態において、グリセロールは、０．５０～５．０％（ｖ／ｖ）、１．０～５．０％（ｖ／ｖ）、１．０～４．０％（ｖ／ｖ）、１．０～３．０％（ｖ／ｖ）または１．０～２．０％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．５～２．０％（ｖ／ｖ）の濃度で培地に添加される。例えば、グリセロールは、１．０％（ｖ／ｖ）の濃度で培地に添加される。

特定の実施形態において、グルコースは、０．５０～５．０％（ｗ／ｖ）、１．０～５．０％（ｗ／ｖ）、１．０～４．０％（ｗ／ｖ）、１．０～３．０％（ｗ／ｖ）、１．０～２．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５～２．０％（ｗ／ｖ）の濃度で培地に添加される。例えば、グルコースは、１．０％（ｗ／ｖ）の濃度で培地に添加される。

特定の実施形態において、酵母抽出物は、０．５０～１０．０％（ｗ／ｖ）、０．５０～５．０％（ｗ／ｖ）、１．０～５．０％（ｗ／ｖ）、１．０～４．０％（ｗ／ｖ）、１．０～３．０％（ｗ／ｖ）または１．０～２．０％（ｗ／ｖ）の濃度で培地に添加される。

グリセロール、グルコースおよび／または酵母抽出物の消費は、細菌細胞の代謝状態に依存する。短時間の間に細菌細胞を高濃度のグリセロール、グルコースおよび／または酵母抽出物に曝露すると、細菌細胞の浸透圧溶解につながる可能性がある。

したがって、特定の実施形態において、グルコースおよび／または酵母抽出物は、培地で細菌細胞を培養する間、例えば流加培養によって培地に連続的に添加される。

特定の実施形態において、グリセロールは、１時間当たり最大０．７５０％（ｖ／ｖ）、１時間当たり最大０．７０％（ｖ／ｖ）、１時間当たり最大０．６５０％（ｖ／ｖ）、１時間当たり最大０．６０％（ｖ／ｖ）、１時間当たり最大０．５５０％（ｖ／ｖ）、１時間当たり最大０．５０％（ｖ／ｖ）、１時間当たり最大０．４０％（ｖ／ｖ）、１時間当たり最大０．３０％（ｖ／ｖ）、１時間当たり最大０．２０％（ｖ／ｖ）または１時間当たり最大０．１０％（ｖ／ｖ）の供給速度で培養培地に連続的に添加される。特定の実施形態において、グルコースは、１時間当たり最大０．６０％（ｗ／ｖ）、１時間当たり最大０．５０％（ｗ／ｖ）、１時間当たり最大０．４０％（ｗ／ｖ）、１時間当たり最大０．３０％（ｗ／ｖ）、１時間当たり最大０．２０％（ｗ／ｖ）または１時間当たり最大０．１０％（ｗ／ｖ）の供給速度で培地に添加される。

特定の実施形態において、酵母抽出物は、１時間当たり最大０．３０％（ｗ／ｖ）、１時間当たり最大０．２０％（ｗ／ｖ）、１時間当たり最大０．１０％（ｗ／ｖ）または１時間当たり最大０．０５０％（ｗ／ｖ）の供給速度で培地に添加される。

細菌細胞は、特に増殖期の間にエネルギー源を必要とする。したがって、特定の実施形態において、グリセロール、グルコースおよび酵母抽出物の１種以上が、細菌細胞の増殖期中に培地に添加される。

細菌細胞の増殖期は、細菌細胞を含む培地の光学密度によって決定することができる。培地中の細菌の濃度が高いほど、測定時の培養物の光学密度が高くなる。有機材料は、６００ｎｍの波長の光で高い光学密度を示すため、６００ｎｍの波長で分光光度計を用いて培養密度を測定することができる。６００ｎｍでの培地サンプルの光学密度は「ＯＤ_６００」とも呼ばれる。好ましくは、培地サンプルは希釈されない。したがって、特定の実施形態において、グルコースおよび／または酵母抽出物は、培地中の細菌細胞を、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が０～２０、０～２１、０～２２、０～２３、０～２４、０～２５、０～３０、５～２０、５～２５、５～３０、１０～２０、１０～２５または１０～３０、好ましくは０～３０で培養しながら培地に添加される。

培地での細菌細胞の培養は、培地で細菌細胞を培養するための当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、細菌細胞を含む液体培地は、３０℃の振とうインキュベーター内に静置することができる。

特定の実施形態において、細菌細胞は、少なくとも５００ｍｌ、少なくとも６００ｍｌ、少なくとも７００ｍｌ、少なくとも８００ｍｌ、少なくとも９００ｍｌ、少なくとも１０００ｍｌ、少なくとも１２５０ｍｌ、少なくとも１５００ｍｌ、少なくとも１７５０ｍｌ、少なくとも２０００ｍｌまたは少なくとも２５００ｍｌ、好ましくは少なくとも８００ｍｌの培地で培養される。より具体的な実施形態において、細菌細胞は、５００～２５００ｍｌ、５００～２０００ｍｌ、５００～１５００ｍｌまたは５００～１０００ｍｌ、好ましくは５００～２５００ｍｌで培養される。典型的には、培地は、細菌細胞が培養される発酵槽の最大８５％、好ましくは最大８０％の容積である。したがって、特定の実施形態において、細菌細胞は、４００～２０００ｍｌ、４００～１６００ｍｌ、４００～１２００ｍｌまたは４００～８００ｍｌの容量を有する容器内で培養される。

好ましくは、細菌培養は、低い培養密度で開始される。細菌の増殖および培養密度は、細菌を含む培地の光学密度を測定することによって決定することができる。

特定の実施形態において、培地で細菌細胞を培養する工程は、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が、最大３、最大２、最大１、最大０．５、最大０．４、最大０．３、最大０．２、最大０．１、好ましくは最大０．１で開始される。

特定の実施形態において、培地で細菌細胞を培養する工程は、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が、０．１０～３．０、０．１０～２．０、０．４０～３．０、０．４０～２．０または０．５０～２．０で開始される。例えば、細菌細胞は、開始ＯＤ_６００が０．１、０．４または２となるように希釈することができる。

細菌細胞の培養物が高い培養密度（例えば、少なくともＯＤ_６００が２０）に達したとき、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質が培地に添加される。

細菌の増殖は、通常、誘導期、対数期、静止期および死滅期の４つの異なる増殖期に分けることができる。これらの期の経過は、細菌の増殖曲線にまとめられるデータを提供する。

一般に、細菌細胞の培養は、細菌の増殖曲線の指数期または対数（算術）期の後期に高い培養密度に達する。したがって、特定の実施形態において、細菌細胞の数が該細菌細胞の培養について決定された細菌の増殖曲線の対数期の推定最大細菌細胞数の７０～９５％、７５～９５％、８０～９５％、８５～９５％または８５～９０％、好ましくは８５～９０％であるときに、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質が培地に添加される。

当業者は、細菌の細菌増殖曲線を決定する方法を理解するであろう。例えば、細菌の増殖曲線は、Ｔｏｄａｒの細菌学のオンライン教科書http://textbookofbacteriology.net/growth_3.htmlで説明されているように決定することができる。

同様に、特定の実施形態において、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質は、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）（または細菌培養物または細菌細胞を含む培養培地の達するＯＤ_６００）が、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９または少なくとも４０、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３０で培地に添加される。

特定の実施形態において、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質は、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）（または細菌培養物または細菌細胞を含む培養培地の達するＯＤ_６００）が、２０～１００、２０～９０、２０～８０、２０～７０、２０～６０、２０～５０、２０～４５、２０～４０、２５～３５または３０～４０、好ましくは３０～４０、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８または３９で培地に添加される。例えば、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質は、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が３０で培地に添加することができる。

当業者は、本発明の方法において、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が少なくとも２０で誘導性複製起点の１種以上の誘導物質を培地に添加する工程（工程ｄ）の前に、誘導性複製起点の誘導物質が培地中に存在しないか、または培地に添加されないことを理解するであろう。

同様に、特定の実施形態において、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質は、ベクターを含む細菌細胞を培地に接種する工程（工程ｂ）の２０～３０時間後、２０～２７時間後、２３～２７時間後または２５～２７時間後、例えば２５時間後、２６時間後または２７時間後に培地に添加される。

特定の実施形態において、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質は、該誘導性複製起点の１種以上の誘導物質を培地に添加した後、細菌細胞とともに少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間または少なくとも５時間、好ましくは少なくとも２時間インキュベートされる。

特定の実施形態において、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質は、該誘導性複製起点の１種以上の誘導物質を培地に添加した後、細菌細胞とともに１～７時間、２～６時間、２～５時間、２～４時間、３～６時間または３～５時間、好ましくは２～６時間インキュベートされる。

誘導性複製起点の１種以上の誘導物質は、当技術分野で公知の方法によって培地に添加することができる。例えば、誘導性複製起点の誘導物質が化学物質である場合、その化学物質を培地に直接添加することができる。別の例において、ベクター複製の誘導物質がポリヌクレオチドによってコードされる場合、そのポリヌクレオチドはプロモーターの転写調節下の発現カセットに提供され得る。

グルコースは、プラスミド複製の１種以上の誘導物質を妨げ得る。したがって、プラスミド複製の１種以上の誘導物質を細菌培養物に添加する前に、グルコースを培地から除去し、かつ／または細菌細胞によって完全に消費することが好ましい。

特定の実施形態において、細菌細胞が培養される培地にグルコースが補充される場合、培地に存在する実質的にすべて（例えば、少なくとも９９．０％、好ましくは少なくとも９９．９０％）、またはすべてのグルコースが細菌細胞によって消費されるときに、プラスミド複製の１種以上の誘導物質が培地に添加される。

特定の実施形態において、細菌細胞が培養される培地にグルコースが補充される場合、培地は、プラスミド複製の１種以上の誘導物質を培地に添加する前に、培地に存在する実質的にすべて（例えば、少なくとも９９．０％、好ましくは少なくとも９９．９０％）、またはすべてのグルコースが細菌細胞によって消費されるときに、０．５０～２．０％（ｖ／ｖ）、０．５０～１．５０％（ｖ／ｖ）または０．５０～１．０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、好ましくは０．５０～１．０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含み、かつ最大０．０１０％（ｖ／ｗ）、好ましくは最大０．００１０を含む％（ｖ／ｗ）のグルコースを含む培地と交換または置換される。培地中のグルコースの量は、当技術分野で知られているように、例えば、培地サンプルの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはＧｌｕｃＣｅｌｌ（登録商標） Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｓｃｏ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて決定することができる。

特定の細菌培養物については、グルコースを補充した培地を、グリセロールを含むがグルコースを含まない（例えば、最大０．０１０％（ｖ／ｗ）、好ましくは最大０．００１０％（ｖ／ｗ）グルコース）培地と交換または置換した後、細菌細胞が、細菌細胞に残っているグルコースを消費するのに少なくとも３０分かかる場合がある。

同様に、特定の実施形態において、細菌細胞が培養される培地にグルコースが補充される場合、培地は、プラスミド複製の１種以上の誘導物質を培地に添加する少なくとも３０分前に、０．５０～２．０％（ｖ／ｖ）、０．５０％～１．５０％（ｖ／ｖ）または０．５０～１．０％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．５０～１．０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含む培地と交換または置換される。例えば、グルコースおよび酵母抽出物を含む培地は、プラスミド複製の１種以上の誘導物質を培地に添加する少なくとも３０分前に、１．０％（ｖ／ｖ）のグリセロールおよび酵母抽出物を含む培地と交換または交換される。例えば、培地中で細菌細胞を培養する間、グルコースおよび酵母抽出物が補充された培地が連続的に、例えば流加培養によって培地に添加される場合、培地の供給は、グルコースおよび酵母抽出物が補充された培地から、グリセロールおよび酵母抽出物が補充された培地に切り替えられる。

特定の実施形態において、グルコースを含む培地は、細菌細胞を含む培地（または細菌培養物）の６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が１３～２０、１４～２０、１５～２０、１６～２０、１７～２０、１８～２０、１９～２０、１３～１８、１３～～１８、好ましくは１３～１８であるときに、０．５０～２．０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含む培地と交換または置換される。例えば、グルコースを含む培地は、細菌細胞を含む培地（または細菌培養物）の６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が１５であるときに、０．５０～２．０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含む培地と交換または置換される。

特定の実施形態において、例えば、細菌細胞が培養される培地にグルコースが補充される場合、細菌細胞の培養は約３０℃の温度で行われ、グルコースが補充された培地を、グリセロールを含むがグルコースを含まない（例えば、最大０．０１０％（ｖ／ｗ）、好ましくは最大０．００１０％（ｖ／ｗ）グルコース）培地と交換する際に、温度を、約３０℃の温度から３６．０～３８．０℃の温度に上昇させる。

特定の実施形態において、細菌細胞の培養は約３０℃の温度で行われ、プラスミド複製の１種以上の誘導物質を培地に添加する少なくとも３時間前、少なくとも２時間前、少なくとも１．５時間前、少なくとも１時間前、少なくとも０．５時間前、好ましくは少なくとも２時間に、温度を、約３０℃の温度から３６．０～３８．０℃の温度に上昇させる。

特定の実施形態において、温度を、約３０℃の温度から３６．０～３８．０℃の温度、例えば、３６．０℃、３６．５０℃、３７．０℃、３７．５０℃または３８．０℃、好ましくは３７．０℃の温度まで上昇させる。

特定の実施形態において、温度を、プラスミド複製の１種以上の誘導物質を培地に添加する前に、ＯＤ_６００が、１５～３５、２０～３５、２５～３５または３０～３５で、約３０℃の温度から３６．０～３８．０℃の温度に上昇させる。

細菌の増殖率の低下は、プラスミドのコピー数の増加に関連している。したがって、本明細書で教示されるように、細菌タンパク質合成を阻害することにより、少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターの製造のための方法の収量をさらに高めることができる。

したがって、特定の実施形態において、この方法は、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質を培地に添加する工程（工程ｄ）の後、かつ任意の工程である培地から細菌細胞を分離する工程（工程ｅ）の前、かつ細菌細胞からプラスミドを回収する工程（工程ｆ）の前に、細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤を培地に添加することをさらに含む。

特定の実施形態において、この方法は、培地中での細菌細胞をさらに培養する間に、細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤を培地に添加することをさらに含む。

当業者は、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質を培地に添加する工程（工程ｄ）の前に、細菌タンパク質合成の阻害剤が培地に添加されないことを理解するであろう。

本明細書で用いられる「細菌タンパク質合成の阻害剤」または「細菌タンパク質合成阻害剤」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質の生成を直接的にもたらすプロセスを阻害することによって細菌細胞の成長または増殖を阻害または減速させる薬剤を意味する。細菌タンパク質合成の阻害剤は、細菌の内部機構を抑制し、細菌がプラスミド産生に完全に集中するようにする。さらに、細菌タンパク質合成の阻害剤は、細菌の酸素の必要性を安定化させる。

特定の実施形態において、細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤は、１～１０ｍＭ、１～９ｍＭ、１～８ｍＭ、１～７ｍＭ、１～６ｍＭ、１～５ｍＭ、１～４ｍＭ、１～３ｍＭまたは１～２ｍＭの濃度で培地に添加される。

特定の実施形態において、細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤は、細菌リボソームに結合する薬剤である。そのような阻害剤の非限定的な例としては、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、マクロライド、リンコサミドおよびオキサゾリジノンが挙げられる。

特定の実施形態において、細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤は、細菌リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ活性を阻害する薬剤である。好ましくは、細菌タンパク質合成の阻害剤は、細菌リボソームの５０Ｓまたは３０Ｓリボソームサブユニットに結合する薬剤である。より一層好ましくは、細菌タンパク質合成の阻害剤は、細菌リボソームの５０Ｓサブユニットの２３ＳｒＲＮＡの第２４５１番および第２４５２番のアミノ酸残基に結合する薬剤である。

特定の実施形態において、細菌タンパク質合成の阻害剤は、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、マクロライド、リンコサミドおよびオキサゾリジノンからなる群から選択される細菌タンパク質合成の阻害剤、好ましくはクロラムフェニコールまたはスペクチノマイシン、より好ましくはクロラムフェニコールである。

特定の実施形態において、細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤は、培地中の溶存酸素量が５％超、１０％超、１５％超、２０％超または２５％超、好ましくは５％超低下するときに培地に添加される。

より具体的な実施形態において、例えば、細菌培養物のＯＤ_６００が、誘導後に１０％超、１５％超、２０％超または２５％超増大する場合、培地中の溶存酸素量が４０％未満、３５％未満または３０％未満になる前、好ましくは培地中の溶存酸素量が３０％未満になる前に、細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤が培地に添加される。

より具体的な実施形態において、例えば、細菌培養物のＯＤ_６００が誘導後に１時間当たり１～１０％または１時間当たり５～１０％増大する場合、細菌細胞を回収する２時間前に細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤が培地に添加される。

より具体的な実施形態において、例えば、細菌培養物のＯＤ_６００が誘導後に１時間当たり１０～２５％増大する場合であって、培地中の溶存酸素が３５％超または３０％超である場合、細菌細胞を回収する２時間前に細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤が培地に添加される。

特定の実施形態において、細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤は、該細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤が培地に添加された後、少なくとも１時間、少なくとも２時間または少なくとも３時間、好ましくは少なくとも１時間の期間にわたり細菌細胞と共にインキュベートされる。

特定の実施形態において、細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤は、該細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤が培地に添加された後、１～５時間、１～４時間、１～３時間、２～３時間または１～２時間、好ましくは１～４時間にわたり細菌細胞と共にインキュベートされる。

特定の実施形態において、細菌タンパク質合成の１種以上の阻害剤は、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質の添加の少なくとも１時間後に培地に添加される。

当業者は、細菌からより質の低いベクターが産生されるのを防ぐために、細菌中のＲＮＡポリメラーゼが枯渇する前、および／または溶存酸素濃度が４０％未満、３５％未満または３０％未満、好ましくは３０％未満に達する前に細菌細胞を回収する必要があることを理解する。好ましくは、培地のｐＨは６．５～７．５、好ましくは６．９～７．１である。

したがって、特定の実施形態において、細菌細胞は、最大４時間、最大５時間、最大６時間、最大７時間、最大８時間、好ましくは最大６時間、例えば６時間、５時間、４時間、３時間、２時間または１時間さらに（工程ｅにおいて）培養される。特定の実施形態において、細菌細胞は、誘導性複製起点の１種以上の誘導物質を添加した後、最大４時間、最大５時間、最大６時間、最大７時間、最大８時間、好ましくは最大６時間、例えば６時間、５時間、４時間、３時間、２時間または１時間で培地から分離される。

特定の実施形態において、細菌細胞は、培地中の溶存酸素濃度が４０％未満、３５％未満または３０％未満、好ましくは３０％未満に達する前に培地から分離される。

特定の実施形態において、細菌細胞は、細菌培養物の６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が低下するとき、好ましくは細菌培養物のＯＤ_６００が１～２０％、１～１５％、１～１０％または５～１０％低下するときに培地から分離される。

細菌細胞は、培地から細胞を分離するための当技術分野で公知の任意の方法によって培地から分離することができる。例えば、細菌細胞を含む培地を遠心分離し、ペレットを回収することができる。

ベクターは、細菌からベクターを回収するための当技術分野で公知の任意の方法によって細菌細胞または細菌環境から回収することができる。例えば、最初に溶解緩衝液（例えば、アルカリを含む緩衝液）および／または超音波処理を用いることによって細菌細胞が溶解され、続いてエタノール沈殿、スピンカラムベースの核酸精製またはフェノール－クロロホルム抽出等によってベクターＤＮＡが精製される。細菌タンパク質が哺乳類細胞に毒性を示す可能性があることから、精製されたベクターＤＮＡをフェノール、クロロホルムおよびエーテルを用いて広範囲に抽出することにより、プラスミドＤＮＡ調製物中に細菌タンパク質が存在しないようにすることができる。

ベクター内に誘導性複製起点が存在することにより、細胞内での転写を誘導することが可能となり、したがって、細菌培養中の任意の時点において低コピー数から高コピー数への切り替えを調節することが可能となる。

誘導性複製起点およびそれらの適合性誘導物質は、当技術分野においてよく知られている。

複製起点は、誘導性プロモーター／リプレッサー系を複製起点に作動可能に連結することによって誘導可能にされる。

例えば、誘導性複製起点は、例えばWild J. et al., Conditionally amplifiable BACs: switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones. Genome Res. 2002.12(9):1434-1444においてシャトルＢＡＣの増幅について記載されているように、１－アラビノースの添加によって誘導することができる１－アラビノース誘導性パラプロモーター（ａｒａＣ－ＰＢＡＤ）によって厳密に調節されるｏｒｉＶ／ＴｒｆＡ増幅系である。さらなる例において、誘導性複製起点は、Wild J. et al., Copy-control tightly regulated expression vectors based on pBAC/oriV. 2004.267:155-167に記載されているラムノース誘導性Ｐｒｈａプロモーター（ｒｈａＳ－Ｐｒｈａ）によって厳密に調節される。

好ましい実施形態において、誘導性複製起点は、本明細書の他の箇所において説明されているように：
－誘導性プロモーター（すなわち、誘導性プロモーター／リプレッサー系）；好ましくは、誘導性プロモーターは、ｌａｃプロモーターおよび少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターは、ｌａｃプロモーターに作動可能に連結されている；および
－ＣｏｌＥ１型複製起点の切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列であって、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている；好ましくはＬａｃプロモーターおよびＬａｃＯ１オペレーターに作動可能に連結されているＣｏｌＥ１型複製起点の切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列
を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

特定の実施形態において、本明細書で教示される方法により、細菌細胞におけるベクターのコピー数を調節することが可能となる。

特定の実施形態において、本明細書で教示される方法により、得られるベクターにおける突然変異率および／または望ましくない突然変異の数が低減する。細菌集団における突然変異率は、Rosche et al., Determining mutation rates in bacterial populations, Methods, 2000, 20(1):4-17に記載されているような、当技術分野で公知の方法によって決定することができる。

本発明者らは、本明細書で教示される方法によってベクターが産生される場合に、特に高いプラスミド産生をもたらす誘導性ｏｒｉを含む巨大ベクターを開発した。さらに、本発明者らは、野生型誘導性ｏｒｉを含む巨大ベクターよりもさらに高いプラスミド産生をもたらす改良された誘導性ｏｒｉを開発した。

したがって、さらなる態様によれば、誘導性複製起点を含む少なくとも１６ｋｂのベクターが提供される。

特定の実施形態において、誘導性ｏｒｉは、
－誘導性プロモーター（すなわち、プロモーター／リプレッサー系）；好ましくは、誘導性プロモーターは、ｌａｃプロモーターおよび少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターは、ｌａｃプロモーターに作動可能に連結されている；および
－ＣｏｌＥ１型ｏｒｉ切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列であって、誘導性プロモーター、好ましくはＬａｃＯ１オペレーターおよびＬａｃプロモーターに作動可能に連結されているＣｏｌＥ１型ｏｒｉ切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列
を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

「作動可能な結合」は、調節配列および転写または発現が求められる配列が、それらの転写または発現が可能であるような方法で接続されている結合である。例えば、プロモーターおよびＯＲＦ等の配列は、それらの配列間の結合の性質が：（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらすものでない場合、（２）プロモーターがＯＲＦの転写を指示する能力を阻害するものでない場合、（３）プロモーター配列から転写されるＯＲＦの能力を阻害するものでない場合、作動可能に結合されていると言うことができる。したがって、「作動可能に連結された」とは、プロモーター等の発現調節配列が目的の配列の転写／発現を効果的に調節するように、遺伝子構築物に組み込まれることを意味する。

本明細書で用いられる「野生型ＲＮＡＩＩプレプライマー」という用語は、一般に、ＲＮＡＩＩをコードする配列、アンチセンスＲＮＡＩプロモーター、およびＲＮＡＩをコードするアンチセンス配列を含む核酸配列を意味する。

本明細書で用いられる「切断型ＲＮＡＩＩプレプライマー」という用語は、一般に、機能的ＲＮＡＩをコードする配列が存在しないという事実、すなわち、ＲＮＡＩＩと相互作用することができる配列が存在せず、かつ／またはＲＮＡＩをコードする配列に作動可能に連結された機能的ＲＮＡＩプロモーターをコードする配列が存在しないという事実を意味する。ＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩの断片の逆転写産物である。典型的には、ＲＮＡＩをコードする配列および／またはＲＮＡＩプロモーターの欠失は、ＲＮＡＩＩプレプライマー配列が、ＲＮＡＩ配列および／またはＲＮＡＩプロモーターを含む野生型ＲＮＡＩＩプレプライマー配列よりも短いことを意味する。しかしながら、本明細書でさらに説明されるように、ＲＮＡＩをコードする配列の一部の欠失および／または該配列の突然変異も非機能的ＲＮＡＩ配列をもたらすことは、当業者には明らかであろう。同様に、ＲＮＡＩプロモーターの一部の欠失および／または該配列の突然変異も非機能的ＲＮＡＩプロモーターをもたらすことは、当業者には明らかであろう。例えば、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーは、配列番号６または７に示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。

したがって、特定の実施形態において、誘導性複製起点は、ＣｏｌＥ１型ｏｒｉの機能的（すなわち、ＲＮＡＩＩと相互作用することができる）ＲＮＡＩをコードする核酸配列を含まず、好ましくは、誘導性複製起点は、ｐＭＢ１（ＣｏｌＥ１）ｏｒｉの機能的（すなわちＲＮＡＩＩと相互作用することができる）ＲＮＡＩをコードする核酸配列を含まない。

より具体的な実施形態において、誘導性ｏｒｉは、配列番号１で示される核酸配列を含まない。

特定の実施形態において、誘導性ｏｒｉは、ＣｏｌＥ１型ｏｒｉの機能的ＲＮＡＩプロモーターを含まず、好ましくは、誘導性ｏｒｉは、ｐＭＢ１（ＣｏｌＥ１）ｏｒｉの機能的ＲＮＡＩプロモーターを含まない。より具体的な実施形態において、誘導性ｏｒｉは、配列番号２に示される核酸配列を含まない。

特定の実施形態において、誘導性ｏｒｉおよび／または誘導性プロモーターは、ＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターを含まない。より具体的な実施形態において、誘導性ｏｒｉおよび／または誘導性プロモーターは、ｐＭＢ１ ｏｒｉのＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターを含まない。より一層具体的な実施形態において、誘導性ｏｒｉおよび／または誘導性プロモーター／リプレッサー系は、配列番号３に示される核酸配列を含まない。

特定の実施形態において、ベクターは、ｒｏｐ遺伝子を含まないか、または不活性なｒｏｐをコードするｒｏｐ遺伝子を含む。

本明細書で用いられる場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写を可能にするＤＮＡ配列を意味する。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼによって認識され、ＲＮＡポリメラーゼにより転写が開始される。したがって、プロモーターには、ＲＮＡポリメラーゼに直接結合するか、ＲＮＡポリメラーゼの動員に関与するＤＮＡ配列が含まれる。プロモーター配列には、タンパク質（すなわち、トランス作用因子）と結合して遺伝子クラスター内の遺伝子の転写レベルを増大させることができる１つ以上のＤＮＡ領域である「エンハンサー領域」が含まれ得る。エンハンサーは、典型的にはコード領域の５’末端にあるが、プロモーター配列から分離することもでき、例えば、遺伝子のイントロン領域内または遺伝子のコード領域の３’に存在し得る。本明細書において「誘導性プロモーター」に言及する場合、誘導性プロモーター／リプレッサー系は、プロモーター領域、および１つ以上の調節タンパク質（リプレッサーおよび／またはアクチベーター）が結合することができるオペレーター領域（すなわち、オペレーター）を含むことが意図される。１種以上の調節タンパク質のオペレーター領域への結合によって、ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターの親和性を増大または低下させることができる。本明細書において「プロモーター」に言及する場合、プロモーター自体が意図され、すなわち、オペレーター領域を含まないことを意味する。

特定の実施形態において、誘導性プロモーターは、ＲＮＡＩのプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーターおよびＴ７プロモーターからなる群から選択されるプロモーター、好ましくはｌａｃプロモーターを含む。

特定の実施形態において、ｌａｃプロモーターは、野生型ｌａｃプロモーターまたは改変されたｌａｃプロモーターである。より具体的な実施形態において、ｌａｃプロモーターは、ｌａｃＵＶ５プロモーターまたはＬ８－ＵＶ５ ｌａｃプロモーターとしても知られているｌａｃＬ８プロモーターを含む。ｌａｃＬ８プロモーターは、野生型ｌａｃプロモーターと比較して、－１０六量体領域（-10 hexamer region）に２つの塩基対変異を含む。ｌａｃＬ８プロモーターは、これまでにMagasanik, The lactose operon, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1972に記載されている。

特定の実施形態において、ｌａｃプロモーターは、、配列番号４に示される核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％、好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。

当業者は、最終的な転写開始が、誘導性ｏｒｉに存在するプロモーターによって決定されることを理解するであろう。

特定の実施形態において、誘導性プロモーターは、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つまたは３つ）のＬａｃＯ１オペレーターを含む。切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列の上流の複数のＬａｃＯ１オペレーターを用いることにより、ベクターの複製をより厳密に調節し得る。

特定の実施形態において、ＬａｃＯ１オペレーターは、配列番号５に示される核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％、好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。

特定の実施形態において、ＣｏｌＥ１型複製起点の切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列は、ｐＭＢ１（ＣｏｌＥ１）複製起点の切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする。

当業者は、ＲＮＡＩがＲＮＡＩＩの断片に対する逆転写産物であるため、ＣｏｌＥ１型ｏｒｉのＲＮＡＩＩをコードする核酸配列が、ＣｏｌＥ１型ｏｒｉのＲＮＡＩをコードする逆転写産物を含まないように切断されることを理解するであろう。さらに、ＣｏｌＥ１型ｏｒｉのＲＮＡＩＩをコードする核酸配列は、ＣｏｌＥ１型ｏｒｉのアンチセンスＲＮＡＩプロモーターを含まないようにさらに切断することもできる。切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーは、負のＲＮＡＩ－ＲＮＡＩＩ二重化フィードバックループを無効にするか、少なくとも減少させる。

特定の実施形態において、ｐＭＢ１（ＣｏｌＥ１）複製起点の切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列は、配列番号６に示される核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくともの８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％、好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。好ましくは、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列は、配列番号６に示される核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸配列を有する。

本発明者らは、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマー内に２つの突然変異が存在することによって、野生型の切断型ｐＭＢ１複製起点と比較して、ベクター産生が増大することを見出した。

特定の実施形態において、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーは、完全な（すなわち、切断前の）ＲＮＡＩＩプレプライマー転写産物の第５４３番目の核酸に対応する位置の核酸におけるＣからＴへの点突然変異、および／または完全な（すなわち、切断前の）ＲＮＡＩＩプレプライマー転写産物の第３２２番目の核酸に対応する位置の核酸におけるＡからＧへの点突然変異を含む。特定の実施形態において、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーは、配列番号１０の第５４３番目の核酸に対応する位置の核酸におけるＣからＴへの点突然変異、および／または配列番号１０の第３２２番目の核酸に対応する位置の核酸におけるＡからＧへの点突然変異を含む。

特定の実施形態において、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーは、切断型ＲＮＡＩＩ転写産物の第３０６番目の核酸におけるＣ－Ｔ点突然変異、および／または切断型ＲＮＡＩＩ転写産物の第８５番目の核酸におけるＡ－Ｇ点突然変異を含む。

特定の実施形態において、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列は、配列番号７と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％、好ましくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。好ましくは、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列は、配列番号７で示される核酸配列を含むか、またはそれからなる核酸配列を有する。本明細書に開示される誘導性ｏｒｉは、
（ｉ）ｐＭＢ１ ｏｒｉからＲＮＡＩをコードする核酸配列を欠失させるか、またはｐＭＢ１ ｏｒｉ内のＲＮＡＩをコードする核酸配列を変異させてＲＮＡＩの機能を無効にするかもしくは大幅に低下させ；
（ｉｉ）ｐＭＢ１ ｏｒｉからＲＮＡＩプロモーターを欠失させるか、またはｐＭＢ１ ｏｒｉ内のＲＮＡＩプロモーターを変異させてＲＮＡＩプロモーターの機能を無効にするかもしくは大幅に低下させ；
（ｉｉｉ）任意に、ｐＭＢ１ ｏｒｉのＲＮＡＩＩプロモーターを、ｐＭＢ１ ｏｒｉのＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターではないプロモーターで置換し、好ましくは、ｐＭＢ１ ｏｒｉのＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターではないプロモーターが、ＲＮＡＩプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーターおよびＴ７プロモーターからなる群から選択されるプロモーターであり、より好ましくは、ｐＭＢ１ ｏｒｉのＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターではないプロモーターがｌａｃプロモーターであり；ｐＭＢ１ ｏｒｉのＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターではないプロモーターが、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列に作動可能に連結されている；かつ
（ｉｖ）切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列の上流（５’）に、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）のオペレーターであって、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列に作動可能に連結されており、内因性ＲＮＡＩＩプロモーターまたは内因性ＲＮＡＩＩプロモーターの任意の置換プロモーターと組み合わせて切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーの条件付き転写を可能にする少なくとも１つのオペレーターを導入することによって、
ｐＵＣ１８プラスミド等のｐＭＢ１（ＣｏｌＥ１型）ｏｒｉを含むプラスミドから誘導され得る。

上述したように、ＲＮＡＩはＲＮＡＩＩの断片の逆転写産物であるため、ｐＭＢ１ ｏｒｉからＲＮＡＩをコードする核酸配列を欠失させることにより、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列がもたらされる。

より具体的な実施形態において、本明細書に開示される誘導性複製起点は、参照により本明細書に組み込まれる欧州特許ＥＰ０１７９７８６Ｂ１、およびPanayotatos et al., DNA replication regulated by the priming promoter, Nucleic Acids Research, 1984, Volume 12(8):2641-2648に記載されているように、ｐＭＢ１ ｏｒｉを変更することによりｐＭＢ１ ｏｒｉから誘導され得る。

特定の実施形態において、誘導性複製起点は：
－ＲＮＡＩプロモーターの機能が無効になるかまたは大幅に低下するようにＲＮＡＩプロモーターが欠失または変異されており；これにより切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーを得ることができ；
－ＲＮＡＩ／ＲＮＡＩＩ相互作用の親和性を低下させるＲＮＡＩ／ＲＮＡＩＩ重複の核酸配列に変異が導入され；好ましくは、ＲＮＡＩの機能が無効になるかまたは大幅に低下するようにＲＮＡＩをコードする核酸配列が欠失または変異されており；これにより切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーを得ることができ；
－切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列の上流（５’）に少なくとも１つ（１つ、２つ、３つまたはそれ以上等）のオペレーターが導入され、少なくとも１つのオペレーターが、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列に作動可能に連結されており、少なくとも１つのオペレーターが、内因性ＲＮＡＩＩプロモーターまたは内因性ＲＮＡＩＩプロモーターの任意の置換プロモーターと組み合わせて切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーの条件付き転写を可能にすし；かつ／または
－任意にＲＮＡＩＩプロモーターがＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターではないプロモーターに置換されている、好ましくはＲＮＡＩＩプロモーターが、ＲＮＡＩプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーターまたはＴ７プロモーターからなる群から選択されるプロモーターに置換されており；ＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターではないプロモーターは、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列に作動可能に連結されている
ｐＭＢ１複製起点である。

ＲＮＡＩ／ＲＮＡＩＩ相互作用の親和性を低下させるＲＮＡＩ／ＲＮＡＩＩ重複の領域における突然変異は当技術分野でで公知であり、例えば、Camps et al., Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression. Recent Pat DNA Gene Seq. 2010, 4(1):58-73の表２に記載されている。

好ましい実施形態において、誘導性複製起点は、
－ＲＮＡＩ遺伝子およびＲＮＡＩプロモーターをコードする核酸配列が欠失されており；
－ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列の上流（５’）に少なくとも１つ（１つ、２つ、３つまたはそれ以上等）のＬａｃＯ１オペレーターが導入され、少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターが（切断型）ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列と作動可能に連結されており；かつ
－ＲＮＡＩＩプロモーターが、ＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターではないプロモーターで置換されており、好ましくは、ＲＮＡＩＩプロモーターが、ＲＮＡＩプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーターおよびＴ７プロモーターからなる群から選択されるプロモーターで置換されており；ＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターではないプロモーターが、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列に作動可能に連結されている
ｐＭＢ１複製起点である。

特定の実施形態において、誘導性複製起点は、配列番号８の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。

上述したように、本発明者らは、切断型ｐＭＢ１複製起点への１つまたは２つの突然変異の導入により、野生型の切断型ｐＭＢ１複製起点と比較してベクター産生が増大することを見出した。

したがって、特定の実施形態において、誘導性ｏｒｉは、配列番号８に示されるアミノ酸配列の第１７６番目の核酸位置におけるＡからＧへの突然変異、および／または配列番号８に示されるアミノの第３９７番目の核酸位置におけるＣからＴへの突然変異を含む。

好ましい実施形態において、誘導性複製起点は、配列番号９と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％、好ましくは１００％配列同一性を有するセットとしての配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。当業者は、配列番号９に示される配列が、これらに加えて、第１７６番目の核酸位置および／または第３９７番目の核酸位置における変異を含み得ることを理解するであろう。

特定の実施形態において、本明細書に記載の誘導性複製起点がｌａｃプロモーターに作動可能に連結されたＬａｃＯ１オペレーターを含む場合、誘導物質はイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および／またはα－Ｄ－ラクトースである。ＩＰＴＧは内因性リプレッサーＬａｃＩをＬａｃＯ１オペレーターから除去し、誘導性複製起点はプラスミド内に存在する他の複製起点を無効にする。

当業者は、本明細書で教示される少なくとも１６ｋｂのベクターが、
－プラスミド複製およびコピー数の調節のためのｒｅｐＥ、
－分裂中にＦプラスミドＤＮＡを娘細胞に分配し、かつ／またはベクターの安定した維持を確保するためのｐａｒＡおよびｐａｒＢ；および／または
－抗生物質耐性遺伝子または抗生物質非依存性選択マーカー（例えば、Ｃｃｄａ／ｃｃｄｂ 毒／抗毒システム（Ｓｔａｂｙ（登録商標） Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｄｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）または代謝依存性）等の選択マーカー
を含むがこれらに限定されない、ベクター複製、細胞分裂および／または選択に必要な他の因子をさらに含み得ることを理解するであろう。

特定の実施形態において、本明細書に記載の誘導性ｏｒｉがクローン化される空のバックボーンベクターは、ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターおよび／またはＢＡＣベクター、またはそれらの組み合わせである。例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ社製の製品番号＃１６４０２のｐＳｈｕｔｔｌｅベクターである。

本発明のベクターは、プラスミド放出（plasmid launched）弱毒化生ウイルス（ＰＰＬＡＶ）ワクチン等の次世代ワクチンプラットフォーム技術で用いることができる。したがって、特定の実施形態において、ベクターは、弱毒化（フラビ）生ウイルスワクチンのｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを含む。より具体的な実施形態において、ベクターは、異種ＤＮＡ配列が挿入されており、かつ／または天然のウイルス配列が欠失されている、弱毒化生黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）－１７ＤワクチンのｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを含む。

さらなる態様によれば、ワクチン接種、巨大なポリペプチドまたはタンパク質の製造、またはウイルスベクターの製造のための、本明細書で教示されるベクターの使用が提供される。以下の実施例は、本発明を説明することを意図するものであり、その範囲の限定として解釈されるべきではない。

実施例１：ｐＭＢ１（ＣｏｌＥ１）ＯｒｉとｉＯｒｉとの比較
ｐＭＢ１（ＣｏｌＥ１）Ｏｒｉ（配列番号１０を参照）において、ＲＮＡＩＩ ＤＮＡは、その同族の上流プロモーターＲＮＡＩＩｐから転写されて、ＲＮＡＩＩ転写産物を生じさせた。ＲＮＡＩＩは、プラスミドＤＮＡのＯｒｉ＋１開始点におけるＤＮＡ合成を開始するためのプライマーとして機能した。ＲＮＡＩＩの発現は、相補的なアンチセンスＲＮＡＩの結合によって転写後に調節された。ＲＮＡＩは、ＲＮＡＩＩ遺伝子内で逆方向に存在するＲＮＡＩ遺伝子から、そのＲＮＡＩｐプロモーターから発現された。プラスミドにコードされたＲＯＰタンパク質はＲＮＡＩ－ＲＮＡＩＩ二本鎖を安定化し、これによりプラスミドＤＮＡの複製がさらに制限された（図２～３）。

ｉＯｒｉでは、５’末端切断型ＲＮＡＩＩ^＊の発現は、異種ＬａｃＵＶｐプロモーターから開始された。ＲＮＡＩＩ配列はＲＮＡＩ遺伝子全体を欠失させることによって切断され、ＲＮＡＩは発現しなかった。ＲＮＡＩＩ^＊の発現は、異種プロモーターと元のＲＮＡＩＩ^＊配列との間に挿入されたＬａｃＯ１リプレッサー結合配列にＬＡＣＩタンパク質が結合することによって転写レベルで調節された。ｉＯｒｉでは、ＬａｃＯ１ ＤＮＡ配列とＲＮＡＩＩ ＤＮＡ配列との転写融合であるＲＮＡＩＩ^＊が、プラスミドＤＮＡ合成を開始するためのプライマーとして機能した。ＲＮＡＩＩ^＊は、２つの点突然変異、第３９７番目の核酸位置におけるＣ→Ｔ、および第１７６番目の核酸位置におけるＡ→Ｇを含んでいた（配列番号９を参照）（図２～３）。

実施例２：プラスミド産生に対するｉＯｒｉのＲＮＡＩＩ ^＊ の点突然変異の影響
図１に示される構造のプラスミド（変異したｉＯｒｉを有するｐＶｉｒｏＶｅｔ－４－ＹＦＶ１７Ｄ）、または変異したｉＯｒｉが野生型ｉＯｒｉ（すなわち、図２に示すように、第３９７番目の核酸位置におけるＣ→Ｔ、および第１７６番目の核酸位置におけるＡ→Ｇの点突然変異を含まないｉＯｒｉ）（変異していないｉＯｒｉ）に置換された図１に示される構造のプラスミドを用いてＢＬ２１細菌を形質転換した。

リン酸緩衝ＬＢ培地に、変異したｉＯｒｉを含むｐＶｉｒｏＶｅｔ－４－ＹＦＶ１７Ｄで形質転換した２種の異なる細菌クローン（ｐＶＶ^＊およびｐＶＶ４）、および変異していないｉＯｒｉを含むｐＶｉｒｏＶｅｔ－４－ＹＦＶ１７Ｄで形質転換した１種の細菌クローン（ｐＶＶ－ｗｔ ｉＯｒｉ））を接種し、シェーカーフラスコで一晩インキュベートした。

翌朝、細菌培養物のＯＤ_６００を測定し、発酵槽内で１％グリセロールを添加した新鮮な培地で細菌をＯＤ_６００が２となるように希釈した。細菌を３７℃で２時間増殖させた後、ＩＰＴＧで誘導した。誘導の２時間後、クロラムフェニコールを添加して、ａ）細菌の内部機構を抑制し、プラスミドの産生に完全に集中させ、ｂ）細菌の酸素必要量を安定させた。クロラムフェニコール添加の２時間後、細胞を回収し、収量を測定した。

図５は、細菌クローンｐＶＶ４^＊またはｐＶＶ４の誘導（Ｉ）によって、細菌クローンｐＶＶ－ｗｔ ｉＯｒｉの誘導と比較して、より高いプラスミド産生がもたらされたことを示す。したがって、ｉＯｒｉの第３９７番目の核酸位置における点突然変異Ｃ→Ｔ、およびｉＯｒｉの第１７６番目の核酸位置における点突然変異Ａ→Ｇの２つの突然変異が、プラスミド産生に有益な効果を有する。

実施例３：本明細書で教示されるベクターの収量に対する複製誘導時のバイオマスのレベルの影響
図１に示される構造（ｐＶｉｒｏＶｅｔ－４－ＹＦＶ１７Ｄ）を有し、ｉＯｒｉを含むプラスミドを用いてＢＬ２１細菌を形質転換し、例えば、https://international.neb.com/Protocols/0001/01/01/transformation-protocol-for-bl21-de3-competent-cells-c2527のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．のTransformation Protocol for BL21(DE3) competent cellsや、Ａｄｄｇｅｎｅ社のホームページhttps://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/に記載されているような最先端の技術を用いて、グリセロールストックを調製した。

表１は、本発明のプラスミドの収量に対する複製誘導時のバイオマスのレベルの影響を示す。

略語：ＯＮ：一晩

ＬＢ培地に、ｐＶｉｒｏＶｅｔ－４－ＹＦＶ１７Ｄで形質転換された細菌（図１）のグリセロールストックを接種し、シェーカーフラスコで一晩インキュベートした。翌朝、ＯＤ_６００値に反映されるバイオマスを測定し、細菌を開始時のＯＤ_６００が０．１、０．４および２となるように希釈した。１つの培養物にＯＤ_６００が０．２となった時に播種し、さらに一晩インキュベートして誘導時にＯＤ_６００を１０に到達させた。細菌密度が１、２、３．７８および１０に達した後、培養物に１ｍＭのＩＰＴＧを添加してプラスミド複製を誘導した。誘導の２時間後に細胞を回収して、プラスミド産生の収量（ｍｇ／ｌとして表される）を決定した。より具体的には、アルカリを添加して細胞を溶解させ、その後、混合物を中和し、細胞破片を接線流濾過（tangential flow）によって除去した。次いで、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過および接線流濾過（可能なバッファー交換のため）、それらに続くて最終精製カラムによりプラスミドを単離および精製した。

温度は常に３７℃に保たれた。

収量は、シェーカーフラスコの限界と比較してはるかに高いバイオマスを達成した発酵槽の作動を含む誘導時のバイオマスの増加とともに増加した（表１を参照）。細菌バイオマスが高いほど、プラスミド生産の収量が高くなると結論付けられた。

実施例４：ＩＰＴＧおよびα－Ｄ－ラクトースの両方による本明細書で教示されるｉＯｒｉを含むベクターの誘導
培地に、ｐＶｉｒｏＶｅｔ－４－ＹＦＶ１７Ｄで形質転換された細菌（図１）のグリセロールストックを接種し、シェーカーフラスコ内で一晩インキュベートした。翌朝、ＯＤ_６００を測定し、細菌をＯＤ_６００が２になるように希釈し、さらに２時間増殖させた。次いで、一方の細胞培養物をプラスミド誘導物質の非存在下で増殖させ（ＮＩ＝非誘導）、他方の培養物を１ｍＭのＩＰＴＧまたは増加量のα－Ｄ－ラクトース（すなわち、０．５％、１％、２％および５％）で誘導した。４時間後にすべての培養物を回収し、ＤＮＡを単離し、制限酵素で消化し、ゲルに適用して視覚化した。温度は常に３７℃に保たれた。

誘導されたすべての培養物はプラスミドの存在を示し、ＩＰＴＧと様々な濃度のα－Ｄ－ラクトースとの間に明らかな違いはなかった（図４）。プラスミドはＩＰＴＧおよびα－Ｄ－ラクトースの両方で誘導できると結論付けられた。

実施例５．培地へのグリセロールまたはグルコースの添加による細菌の増殖の増大
培地に、ｐＶｉｒｏＶｅｔ－４－ＹＦＶ１７Ｄで形質転換された細菌（図１）のグリセロールストックを接種し、シェーカーフラスコ内で一晩インキュベートした。翌朝、ＯＤ_６００を測定し、細菌をＯＤ_６００が０．１になるように、１％グリセロール、１％グルコースのいずれかを補充した、または補充していない新鮮な培地で希釈した。細胞を８時間増殖させ、ＯＤ_６００を１時間ごとに測定した。細胞は誘導されなかった。温度は常に３７℃に保たれた。

グリセロールまたはグルコースの添加により、細菌の増殖が２～２．５倍増加した（図６）。

実施例６．細菌タンパク質合成の阻害剤クロラムフェニコールの添加によるプラスミド産生への有益性
培地に、ｐＶｉｒｏＶｅｔ－４－ＹＦＶ１７Ｄで形質転換された細菌（図１）のグリセロールストックを接種し、３７℃のシェーカーフラスコで一晩インキュベートした。翌朝、ＯＤ_６００を測定し、発酵槽内でグルコースを補充した新鮮な培地で細菌をＯＤ_６００が０．１になるように希釈し、３７℃で一晩インキュベートした（図７、操作（ａ）：播種）。朝、供給物（feed）にグリセロールを補充した（図７、操作（ｂ））。

細菌をこれらの条件下で約１．５時間増殖させた後、ＩＰＴＧで誘導した（図７、操作（ｃ））。誘導後約２時間後、クロラムフェニコールを添加して、ｉ）細菌の内部機構を抑制し、プラスミドの生成に完全に集中させ、ｉｉ）細菌の酸素必要量を安定させた（図７、操作（ｄ））。クロラムフェニコールを添加してから約４時間後に細胞を回収し（図７、操作（ｅ））、収量を測定した。

クロラムフェニコールの添加後すぐに細菌の増殖はプラトーに達し、これは、内部の細菌機構の停止を示唆するものです（図７）。同時に、収量とＤＮＡ含有量とは指数関数的に増大し、これは、細菌が主にプラスミド産生に集中していることを示唆するものです（図７）。これにより、クロラムフェニコールの添加がプラスミド生産に有益であるという結論に至った。

実施例７．誘導性複製起点の誘導前の３０℃から３７℃への切り替えの製造プロセスへの有益性
培地に、ｐＶｉｒｏＶｅｔ－４－ＹＦＶ１７Ｄで形質転換された細菌（図１）のグリセロールストックを接種し、３７℃のシェーカーフラスコで一晩インキュベートした。翌朝、ＯＤ_６００を測定し、発酵槽内でグルコースを補充した新鮮な培地で細菌をＯＤ_６００が０．１になるように希釈し、３０℃で一晩インキュベートした（図８、操作（ａ）：播種および操作（ｂ））。

朝、誘導を阻害しないように、グルコースに代えてグリセロールを供給物（feed）に補充した。さらに、温度を３０℃から３７℃に切り替えて、プラスミドの生成に最適な環境を作り出した（図８、操作（ｃ））。

細菌をこれらの条件下で約１．５時間増殖させた後、ＩＰＴＧで誘導した（図５、操作（ｄ））。誘導後約２時間後、クロラムフェニコールを添加し（図５、操作（ｅ））、約４時間後、細胞を回収し（図５、操作（ｆ））、収量を測定した。

温度の切り替えにより、図７に示される実施と比較してさらに高い収量（２６ｍｇ／ｌ対４５ｍｇ／ｌ）が得られ、３０℃から３７℃への切り替えが製造方法に有益であるという結論に至った（図８）。

Claims (17)

1. 細菌細胞から少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを製造するための方法であって、連続した、
   ａ）誘導性複製起点を含む、少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを含む細菌細胞を得る工程、
   ｂ）前記ベクターを含む細菌細胞を培地に接種する工程、
   ｃ）前記培地で前記細菌細胞を培養して細菌培養物を得る工程、
   ｄ）前記細菌培養物の６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）が少なくとも２０に達したときに、前記誘導性複製起点の１種以上の誘導物質を培地に添加する工程、
   ｅ）前記培地で前記細菌細胞をさらに培養する工程、および
   ｇ）前記細菌細胞から少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターを回収する工程
   を含む、方法。
2. 工程ｆ）前記細菌細胞を前記培地から分離する工程をさらに含み、該工程ｆ）が工程ｅ）と工程ｇ）との間に行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記工程ｄ）の後かつ前記工程ｆ）の前に、細菌タンパク質合成の阻害剤を前記培地に添加することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記培地で前記細菌細胞を培養する間に、グルコースおよび／または酵母抽出物が培地に添加される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記グルコースおよび／または酵母抽出物を含む培地が、前記誘導性複製起点の１種以上の誘導物質を培地に添加する少なくとも３０分前に、０．５０～２．０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含む培地と交換される、請求項４に記載の方法。
6. 前記培地で前記細菌細胞を培養する前記工程ｃ）が３０℃の温度で行われ、前記温度を、前記誘導性複製起点の１種以上の誘導物質を培地に添加する少なくとも２時間前に、３０℃から３６．０～３８．０℃に上昇させる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記誘導性複製起点が少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターを含み、前記誘導性複製起点の誘導物質がイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および／またはα－Ｄ－ラクトースである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記細菌タンパク質合成の阻害剤がクロラムフェニコールまたはスペクチノマイシンである、請求項３に記載の方法。
9. 前記細菌タンパク質合成の阻害剤が、前記誘導性複製起点の１種以上の誘導物質の添加の少なくとも１時間後に培地に添加される、請求項３に記載の方法。
10. 前記細菌細胞が、前記誘導性複製起点の１種以上の誘導物質の添加の最大６時間後に前記培地から分離される、請求項３～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 誘導性複製起点を含む少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターであって、前記誘導性複製起点が：
    －ＲＮＡＩプロモーターの機能が無効となるかまたは低下するように前記ＲＮＡＩプロモーターが欠失または変異して、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーが形成されており、かつ
    －ＲＮＡＩの機能が無効となるかまたは低下するように前記ＲＮＡＩをコードする核酸配列が欠失または変異して、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーが形成されており、かつ
    －少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターが前記切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列の上流に導入され、前記少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターが前記切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列に作動可能に連結されているｐＭＢ１複製起点を含む、ベクター。
12. 前記ｐＭＢ１複製起点の内因性ＲＮＡＩＩプロモーターが、前記ｐＭＢ１複製起点のＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターではないプロモーターによって置換されており、前記ｐＭＢ１複製起点のＲＮＡＩＩプレプライマーの内因性プロモーターではないプロモーターが、前記少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターに作動可能に連結されている、請求項１１に記載のベクター。
13. 前記ｐＭＢ１複製起点の内因性ＲＮＡＩＩプロモーターが、ＲＮＡＩのプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーターおよびＴ７プロモーターからなる群から選択されるプロモーターによって置換されている、請求項１２に記載のベクター。
14. 前記ｐＭＢ１複製起点の内因性ＲＮＡＩＩプロモーターが、Ｌ８／ＵＶ５ ｌａｃプロモーターによって置換されている、請求項１３に記載のベクター。
15. －ＲＮＡＩプロモーターの機能が無効となるかまたは低下するように前記ＲＮＡＩプロモーターが欠失または変異して、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーが形成されており、かつ
    －ＲＮＡＩの機能が無効となるかまたは低下するように前記ＲＮＡＩをコードする核酸配列が欠失または変異して、切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーが形成されており、かつ
    －少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターが前記切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列の上流に導入され、前記少なくとも１つのＬａｃＯ１オペレーターが前記切断型ＲＮＡＩＩプレプライマーをコードする核酸配列に作動可能に連結されており、かつ
    －配列番号１０で示される野生型ｐＭＢ１複製起点の３２２位の核酸に対応する核酸がＡからＧに変異しており、かつ／または配列番号１０で示される野生型ｐＭＢ１複製起点の５４３位の核酸に対応する核酸がＣからＴに変異している
    ｐＭＢ１複製起点を含む、誘導性複製起点。
16. 前記誘導性複製起点が、配列番号９で示される核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１１～１４のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１５に記載の誘導性複製起点。
17. 前記少なくとも１６ｋｂのサイズのベクターが、請求項１１～１４のいずれか一項または請求項１６に記載のベクターである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

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