CN101437547A - 用于遗传免疫的载体和方法 - Google Patents
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Abstract
公开了改良的DNA疫苗质粒。所述改良的质粒清除了所有的外源序列，并具有优良的真核表达、细菌生产过程中提高的产率和稳定性，促进抗原灵活靶向各个细胞内目的地，和新的基于RNA的功能性。这些载体被用于新的免疫方法，其中使抗原靶向各个细胞内目的地的免疫刺激DNA疫苗质粒的组合用以引发提高的免疫反应。
Description
关于联邦发起的研究或开发的声明
不适用。
本申请要求2005年1月20日提交的序号为60/645078的临时专利申请的利益。
发明领域
本发明涉及真核表达质粒家族和免疫策略，用于获得改良的遗传免疫，并且更特别地，用于定制和提高对质粒编码的抗原的免疫反应。
发明背景
本发明为用于遗传免疫的真核表达质粒家族和免疫策略。供使用的这种分子和方法用于生物技术、基因治疗、癌症和农业。
着眼于本发明，进行了现有技术的研究。DNA疫苗(遗传疫苗)是潜在的突破性技术，其提供了使用完全基于基因并由生物自身细胞表达的物质来免疫人(或动物)的新方法的希望，制成了理想的细胞内抗原模拟物。
本领域描述了提高对DNA疫苗质粒免疫反应的方法。例如，通过：与共刺激质粒(例如IL12)共免疫来调节反应类型(TH1与TH2偏移)；细胞死亡抑制剂或增强剂；或者递送的最优化(例如，电穿孔与基因枪)，可以根据系统或黏膜免疫或者根据癌、变态反应、细菌、细胞内寄生物或病毒的目标来进一步提高或调节DNA疫苗的效力。一些这类方法和分子描述于Lemieux，P.2002 Expert Rev.Vaccines 1：85-93，Toka FN，Pack CD，Rouse BT.2004 Immunological reviews 199：100-112，和Gurunathan S，Klinman DM，Seder RA.2000 Anna.Rev.Immunol.18：927-974，并通过引用结合入本文。DNA接种还可能涉及在初次免疫和加强免疫(in the primeand the boost)中使用不同的递送系统(如Buchan S，Gronevik E.MaTHlesen I，King C，Stevenson FK，Rice J.2005Immunol.174：6292-6298所教导的)或不同的注射部位(如Pavlakis GN，Gragerov A，Felber BK.2004美国专利申请2004/0241140所教导的)。
DNA接种将显著提高DNA疫苗快速部署应用，因为DNA疫苗的开发时间显著短于那些用于蛋白质或病毒载体系统的疫苗。
目前的阻碍
仅使用DNA接种已经在人类和其他灵长类中广泛获得了保护性免疫。使用与异源蛋白、灭活的生物或病毒载体加强相结合的DNA疫苗，已经获得了灵长类效力。当混合并共注射质粒DNA和经纯化的蛋白(相应于质粒中编码的蛋白质)(Dalemans W.，Van Mechelen MV，Brack C，FriedeM.2003美国专利6,500,432；Carrera SD，Grillo JM，de Leon LALP，LasaAM，Feyt RP，Rodriguez AV，Obregon JCA，Rivero NA Donato GM200420040234543；和Imoto J，Konishi E.2005 Viral Immunol.18：205-212)或灭活病毒(Rangarajan PN，Srinivasan VA，Biswas L，Reddy GS.2004美国专利申请2004/0096462)时，已经报道了提高的免疫反应。
然而，使用在疫苗中与灭活生物、蛋白质或病毒载体相结合的质粒(或者作为混合物，或者以初次-加强连续地)，消除了DNA接种的大部分益处，包括提高的安全性、降低的成本和快速部署。
可以通过下述方法逐步改良DNA疫苗：
抗原表达：本领域教导了DNA接种的一个局限性是抗原表达通常很低。提高抗原表达的载体修饰(例如，基因的密码子优化、内含子的加入、强的组成型CMV或CAGG启动子的使用(相对于较弱的或细胞系特异性启动子))与提高的免疫反应(综述于Manoj S，Babiuk LA，Drunen SV，enHurk LV.2004 Critical Rev Clin Lab Sci 41：1-39)高度相关。具有5倍至10倍提高的表达的杂交CMV启动子(CMV/R)提高了小鼠和非人灵长类中针对HIV的DNA疫苗的细胞免疫反应(Barouch DH，Yang ZY，Kong WP，Korioth-Schmitz B，Sumida SM，Truitt DM，Kishko MG，Arthur JC，Miura A，Mascola JR，Lervin NL，Nabel GJ.2005 J Virol.79：8828-8834)。含有土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(600bp元件，其增加了稳定性和核外转运(导致用于翻译的mRNA的水平升高))的质粒增强了小鼠中的抗原表达和针对HA的保护性免疫(Garg S，Oran AE，Hon H，Jacob J.2002 J Immunol.173：550-558)。这些研究教导了表达的提高(超越目前基于CMV的载体)通常可以提高人类的免疫原性。
本领域教导了质粒进入细胞核是获得抗原表达的限制因素。通过加入NFκB结合位点或SV40增强子来提高质粒的核定位，提高了抗原在体外和体内的表达；推测这归因于NFκB的结合，其然后肩负(piggybacks)质粒至细胞核(Dean DA，Dean BS，Muller S，Smith LC.1999 ExperimentalCell Research 253：713-722)。然而，NFκB一般集中于细胞质，而向细胞核的转移是既是有限的又是组织特异性的，并且依赖于刺激信号。这限制了NFκB核寻靶以改良DNA接种的应用。
TH1或TH2偏移：本领域教导将针对DNA疫苗表达病毒或其他抗原的免疫反应从TH2转至TH1是期望的，以提高体液和细胞反应；对于其他应用，例如变态反应，认为偏于TH2的反应是最佳的。例如，CpG序列(其促进TH1反应)提高了抗体和CTL对流感血凝素(HA)的反应，和CIL对IM注射的流感核蛋白DNA疫苗的反应(Lee和Sung，1998)。与IL12或IL15的TH1佐剂的共免疫提高了T细胞对HA的反应(ChattergoonMA，Saulino V，Shames JP，Stein J，Montaner LJ，Weiner DB.2004 Vaccine22：1744-1750；Rutzler MA，Robinson TM，Chattergoon MA，Choo DK，Choo AY，Choe PY，Ramamathan MP，Parkinson R，Kudchodkar S，Tamura Y，Sidhu M，Roopchand V，Kim JJ，Pavlakis GN，Felber BK，Waldmann TA，Boyer JD，Weiner DB.2005 J Immunol 175：112-123)和抗体介导的保护(Operschall E，Pavlovic J，Nawrath M，Moiling K.2000 Intervirol 43：322-330)。
免疫刺激佐剂：已经鉴定了许多通过Toll样受体(TLR)结合而激活先天免疫的微生物特异性基序，例如，三酰基脂肽(TLR-1/TLR2)肽聚糖(TLR-2)、dsRNA(TLR3)、细菌HSP60或脂多糖(LPS；TLR-4)、鞭毛蛋白(TLR5)、二酰基脂肽(TLR-6)ssRNA(TLR-7，TLR-8)未甲基化的CpGDNA(TLR-9)。已经鉴定了诱导干扰素反应的富含U或富含U/G的ssRNATLR7/8激动剂(Heil F，Hemmi H，Hochrein H，Ampenberger F，Kirschning C，Akira S，Lipford G，Wagner H，Bauer S.2004 Science 303：1526-1529；Diebold SS，Kaisho T，Hemmi H，Akira S，e Sousa CR.2004 Science 303：1529-1531；Barchet W，Krug A，Cella M，Newby C，Fischer JAA，Dzionek A，Pekosz A，Colonna M.2005 Eur.J.Immunol.35：236-242)以及通过TLR-7诱导来自人类和小鼠浆细胞样树突细胞的干扰素生成的序列特异性siRNA(Hornung V，Guenthner-Biller M，Bourquin C，Ablasser A，Schlee M，Uematsu S，Noronha A，Manoharan M，Akira S，de Fougerolles A，Endres S，Hartmann G.2005 Nat.Med.11：263-270)。已经鉴定了新类别的免疫刺激核酸，即不需要TLR-3、7、8或9的单链CpG RNA(Sugiyama T7 Gursel M，Takeshita F，Coban C，Conover J，Kaisho T，Akira S，Klinman DM，Ishii KJ.2005 J Immunol.174：2273-2279)。
这些分子可用作佐剂以改进DNA接种。然而，外源性应用的佐剂增加了费用，使管理批准复杂(疫苗中增加的附加考察实体)，并因佐剂不是定向的而需要高剂量(即，影响除了含有DNA疫苗的细胞以外的多种细胞)；非定向的佐剂的高剂量还代表特别的安全性关注(例如，自身免疫、脓毒血症)。
未甲基化的CpG存在于微生物生成的质粒的载体骨架中，并且放大(富含CpG的质粒)可用以通过TLR-9刺激TH1反应性先天免疫信号。不幸的是，这些作用仅在使用高剂量时发现，并且如TH2偏移的反应所反映的，使用经济低量的抗原的高级递送方法(例如基因枪)的CpG作用是最小的。而且，人类中针对DNA疫苗的总体差的免疫反应已经部分归因于人类比小鼠显著降低的TLR-9表达。
载体编码的蛋白质TLR激动剂将可能在低剂量下诱导先天免疫系统，因为来自这些元件的信号从载体被“放大”(不同于固定的载体组分，例如CpG)。鞭毛蛋白生成基因掺入载体骨架激活了先天免疫反应并使TH1偏移和针对基因枪递送的抗原的细胞免疫反应成为可能。这证明了使用可放大的TLR激动剂以使低剂量DNA接种成为可能的潜力(ApplequistSE，Rollman E，Wareing MD，Liden M，Rozell B，Hinkula J，Ljunggren HG.2005 J.Immunol.175：3882-3891)。然而，对于在DNA疫苗载体骨架中加入先天免疫诱导物，应该没有相关的获得性免疫反应，因为这将限制重复使用并在群体中产生可变结果(归因于具有在先暴露(预存免疫)的个体中的衰减反应)。例如甲病毒属复制子载体(其生成dsRNA佐剂)或上述鞭毛蛋白生成载体含有一种或多种能够诱导针对载体组分的获得性免疫的蛋白质，并不适合重复使用。
总之，本领域没有教导如何获得放大的TLR激动剂的免疫刺激作用，且不需要载体骨架中导致获得性免疫反应的异源蛋白。
细胞死亡：本领域教导了细胞死亡可以增强对抗原的免疫反应。流感HA和NP DNA疫苗的肌肉注射共传递了促进缓慢细胞死亡增强的T细胞反应和细胞免疫的突变体半胱天冬蛋白酶(caspase)(Sasaki S，Amara RR，Oran AE，Smith JM，Robinson HL.2001 Nat Biotechnol 19：543-547)。使用诱导程序性细胞死亡的塞姆利基森林(Semliki forest)甲病毒属复制子(自杀)疫苗还显著增强了(与DNA疫苗相比较)对HA和NP的免疫反应(Berglund P，Smerdou C，Fleeton MN，Tubulekas I，Liljestrom P.1998 NatureBiotech 16：562-565)；细胞死亡对于提高的免疫反应是关键的。复制子载体含有多个病毒复制蛋白；针对这些蛋白的免疫反应可以限制重复使用。已经通过共施用Fas或突变半胱天冬蛋白酶2或3实现了程序性细胞死亡，其增强了CTL对肌肉注射的DNA疫苗的反应。通过基因枪共施用的半胱天冬蛋白酶还提高了针对流感HA DNA疫苗的免疫反应(Sasaki等，同前2001)。最佳条件可以选择性杀伤为树突或朗格汉司细胞抗原来源的肌肉或角质化细胞(但非免疫细胞)(综述于Leitner WW，Restifo NP.2003J Clin invest 112：22-24)。使用组成型细胞死亡促进剂是不可能的。程序性细胞死亡的抑制也可以提高免疫反应，其中共施用抗细胞凋亡的Bcl-XL在基因枪施用后强力提高了T细胞反应。这可以反映延长树突细胞寿命的益处。然而，细胞死亡抑制剂的使用可以使细胞易于转化(在整合质粒的情况下)并增加癌症风险。
细胞质dsRNA激活PKR和RIG-1，其诱导干扰素生成，抑制蛋白合成，从而减少抗原生成，最终导致程序性细胞死亡(综述于Wang Q，Carmichael GG.2004 Microb.Molec.Biol.Rev.68：432-452)。细胞死亡释放了dsRNA，然后其可以由细胞吸收，并通过结合和刺激内吞集中的TLR-3来进一步诱导先天免疫反应(综述于Schroder M，Bowie AG.2005 TrendsImmunol.26：462-468)。本领域教导了该类型的dsRNA刺激随甲病毒属复制子疫苗而发生。甲病毒属复制子(自杀)疫苗诱导了增强的免疫反应，且抗原比标准DNA疫苗(通过肌肉注射)少100倍至1000倍。这些载体诱导程序性细胞死亡，推测是通过刺激抗病毒途径并最终导致程序性细胞死亡的dsRNA的生成(Leitner WW，Ying H，Driver DA，Dubensky TW，Restifo NP.2000Cancer Research 60：51-55)。细胞死亡是提高的疫苗效力所需要的并由细胞质复制子dsRNA所介导；细胞凋亡元件中的dsRNA可能被APC吞噬，并通过内体TLR-3dsRNA识别途径诱导先天免疫。尽管增加了抗原生成，但抗细胞凋亡基因(Bcl-XL)的共递送减少了保护(Leitner WW，Hwang LN，Bergmann-Leitner ES，Finkelstein SE，Frank S，Restifo NP.2004 Vaccine 22：1537-1544；Leitner WW，Hwang LN，DeVeerMJ，Zhou A，Silverman RH，Williams BRG，Dubensky TW，Ying H，RestifoNP.2003 Nature Med 9：33-39；Matsumoto S，Miyagishi M，Akashi H，NagaiR，Taira K.2005 J Biol Chem 280：25687-25696)。然而，细胞死亡信号和抗原的最佳生成之间需要递送依赖平衡，因为自杀DNA疫苗使用基因枪递送(其靶向树突细胞)是无效的，除非包括抗程序性细胞死亡基因(Kim TW，Hung CF，Juang J，He L，Hardwick JM，Wu TC.2004 Gene Ther 11：336-342)。
抗原靶向：通过使用靶向融合标记改变细胞内定位已经部分解决了差的免疫原性。本领域已经确定了改变抗原细胞内定位(例如，从细胞质到被分泌)的融合蛋白或者其他改变所发生的免疫反应的靶抗原呈递途径(综述于Gurunathan等，同前2000)。可用以改变融合蛋白细胞内运输或抗原呈递的分子是本领域已知的。几种细胞内靶向序列描述于Williams WV，Madaio M，Weiner DB.2001美国专利6248565B1，并通过引用结合入本文。几种抗原呈递途径靶向分子描述于Leifert JA，Rodriguez-Carreno MP，Rodriguez F，Whitton JL 2004 Immunological reviews 199：40-53和Lemieux，同前2002，并通过引用结合入本文。其中一些总结于表3。
例如，已经证明，导向异源蛋白至各个细胞内目的地改变或增强了免疫反应，所述细胞内目的地包括但不限于：被分泌(例如TPA；ZhongmingL，Howard A，Kelley C，Delogu G，Collins F，Morris S.1999 Infect Immun.61：4780-4786)、膜锚定(例如人类碱性磷酸酶(PLAP；Gerber L，Kodukula K，Udenfriend S.1992 J Biol Chem 267：12168-12173)、内体(例如人类Lampl；Wu，T，Guarnieri FG，Staveley-O′Carroll KF，Viscidi RP，Levitsky HI，HedrickL，Cho KR，August JT，Pardoll DM.1995 Proc.Natl.Acad.Sci 92：11671-11675)、蛋白体(例如小鼠泛素A76；Delogu G，Howard A，Collins FM，andMorris SL.2000 Infect.Immun.68：3097-3102)或内质网(Xu W，Chu Y，Zhang R，Xu H，Wang Y.Xiong S 2005 Virology 334：255-263)。内体靶向促进了II类MHC反应，而去稳定泛素分子(相对于天然泛素G76的泛素A76)用以增强进入蛋白体降解途径和I类MHC呈递。
本领域公知的是细胞内靶向的效果是抗原特异性的，并且需要为各抗原经验确定为生成期望免疫反应的最佳的细胞内目的地。
尽管通过抗原至这类靶向序列的融合获得免疫原性的提高，但已经使用修饰抗原在人类或其他灵长类获得了效力。
进一步的增加的提高是使用DNA疫苗质粒的混合物免疫，所述质粒各自编码不同形式的抗原。Pavlakis GN，Gragerov A和Felber BK.2004美国专利申请2004/0241140提出在不同部位和以不同次数使用的抗原制品可以增加保护性免疫，并且表明顺序或结合但在不同部位使用不同形式的DNA可再现使用其他初次-加强疫苗组合获得的提高的免疫原性。其教导了与相同部位注射的DNA载体混合物相比较，特别是在同一小鼠的不同部位注射时，表达不同形式抗原的载体组合显示了提高的免疫原性。作者推测，DNA初次免疫的异源加强的效率可以归因于异源载体或纯化蛋白提供的不同抗原呈递。作者使用了分泌、细胞质和蛋白体降解的抗原形式，并且未教导使用其他靶向序列或使用载体家族或原理策略来帮助确定最佳免疫鸡尾酒。
其他考察者已经报道了当靶向抗原至细胞内不同目的地的两种质粒结合免疫时提高的反应。使用分泌和细胞质定向抗原(Piechocki MP，PilonSA，Wei WZ.2001 J Immunol.167：3367-3374)或者细胞质和泛素结合形式的乳头瘤病毒衣壳基因(Liu WJ，Zhao KN，Gao FG，Leggatt GR，FernandoGJP，Frazer IH.2001 Vaccine 20：862-869；Frazer IH.2004美国专利申请2004/0241177])或者可溶的或膜锚定形式的HSV-2糖蛋白D(Flo J 2003Vaccine 21：1239-1245)的组合的DNA疫苗免疫增强了免疫反应。这些作者没有教导使用其他靶向序列或者使用载体家族来确定最佳免疫鸡尾酒。
其他考察者已经报道了当靶向抗原至细胞内不同目的地的两种质粒结合免疫时没有提高反应。例如，细胞质和内体定向的p55Gag的结合没有发现免疫反应的提高(Marques ETA，ChifchlikarP，de Arruda LB，Leao IC，Lu Y，Wong J，Chen JS，Byrne B，August JT 2003 J Biol.Chem 278：37926-37936)。然而，当在初次-加强研究中使用靶向人类免疫缺陷病毒-1gag至细胞质或内体目的地的DNA疫苗质粒时，内体初次免疫、细胞质加强所产生的免疫反应类似于或甚至强于内体初次免疫和加强(并且比细胞质初次免疫和加强要强的多)。作者(Barros De Arruda L，Chickhlikar PR，August JT，and Marques ETA.2004 Immunol.112：126-33)没有提出或以其他方式教导使用具有相同抗原的不同靶向的2种质粒初次-加强免疫的潜在益处。
这些研究教导了为最佳免疫保护的最佳质粒组合是抗原和递送方法特异性的，并且将需要根据各个抗原来确定。预期最佳呈递也是抗原和递送特异性的。EP靶向肌细胞并可能通过至APC的交叉呈递来递送抗原用于免疫呈递。这可能最佳需要在供体细胞中分泌和/或稳定的蛋白质连同细胞死亡以吸引和刺激APC。对于靶向树突细胞的基因枪，直接初次免疫可以是优势抗原呈递模式，并且分别用于增强的MHC I或MHC II呈递的蛋白体和/或内体定向抗原可能是最佳的。为各模式最优化的质粒组合可能最终提供更好的保护。例如，表达天然的、树突状和蛋白体定向SIV抗原的载体组合在猕猴中提供了更好的保护(Rosati M，von GegerfeltA，Roth P，ALi cea C，Valentin A，Robert-Guroff M，Venzon D，Montefiori DC，Markham P，Felber BK，Pavlakis GN.2005 J Virol.79：8480-8492)；使用编码细胞质和泛素结合的乳头瘤病毒衣壳基因的混合质粒观察到了相似的增强(Liu等同前，2001)。本领域没有教导确定最佳呈递的合理方法。
而且，本领域教导了现有混合质粒免疫结果的解释是不确定的，由于这些实例中使用的载体骨架之间的差异。没有最佳设计允许靶抗原融合至不同细胞内靶向序列的靶向载体(例如上述使用的那些，或者Williams等，同前，2001，和Bucht G，Sjolander KB，Eriksson S，Lindgren L，Lundkvist A，Elgh F.2001 Vaccine 19：3820-3829中描述的那些)以确定针对被靶向至各种细胞内目的地的抗原的免疫反应。首先，这些载体使用标准II型限制酶克隆位点用于导入所述抗原基因。本领域教导载体骨架之间的小序列变化可以改变表达水平(Hartikka J，Sawdey M，Comefert-Jensen F，Margalith M，Barnhart K，Nolasco M，Vahlsing HL，MeekJ，Marquet M，Hobart P，Norman J，Manthorpe M.1996 Hum Gene Ther.7：1205-1217)；已经显示了不同的表达水平影响生成的免疫反应(ZinckgrafJW，Silbart LK 2003 Vaccine 21：1640-1649)。而且，即使是当这些序列不含导向标记时，从克隆位点或肽标记添加小肽至重组蛋白可以改变蛋白质亚细胞定位(Ramanathan MP，Ayyavoo V，Weiner DB.2001 DNA Cell Biol20：101-105)。
还使用标准II型限制酶克隆构建了Williams等，同前，2001或Bucht等，同前，2001的靶向载体以及其他目前的DNA疫苗质粒(例如VR1012)。该策略利用最近侧翼有效限制位点来将片段移入载体，保证了最终的载体含有大量外源序列。这些载体不符合目前WHO和FDA关于外源物质含量和清除的指导原则。例如，VR1012包括潜在有害的序列，例如作为克隆卡那霉素抗性基因的人工产物的潜在重组基因转座子末端。已经显示质粒中的寡嘧啶或寡嘌呤序列增加了pUC质粒中二聚体的形成，推测是通过罕见DNA结构(例如三股螺旋)的形成(Kato M.1993MolBiolRep.18：183-187)。VR1012含有的序列例如用以结合两个片段的polyG polyC尾。总之，已经显示来自原核质粒的细菌衍生序列中的许多元件负向影响真核细胞中的基因表达(Leite JP，Cousin C，Heysen A，D′Halluin JC.1989 Gene.82：351-356；Peterson DO，Beifuss KK，Morley KL.1987 Molec Cell Biol 7：1563-1567)或者结合真核转录因子(Tully DB，Cidlowski JA.1987 Biochem Biophys Res Commun.144：1-10；Ghersa P，Whelan J，Pescini R，DeLamarter JF，Hooft van Huijsduvjnen R.1994 Gene151：331-332；Kushner PJ，Baxter JD，Duncan KG，Lopez GN，Schaufele F，Uht RM，Webb P，West BL.1994 Mol Endocrinol.8：405-407)，最终降低了载体的性能。已经显示质粒中chi位点的存在促进二聚体形成(Zaman MM，Boles TC.1996 J Bacteriol.178：3840-3845)。质粒切割可能与“呼吸”并对内源性单链核酸酶敏感的AT富集区相关联。因为是同向或反向重复序列和经大肠杆菌宿主缺失或重排的Z DNA形成序列，回文序列是不稳定的。罕见的二级结构DNA包括：连续的潜在Z DNA形成交替嘧啶/嘌呤序列(例如CpG序列；Bichara M，Schumacher S，and Fuchs RP.1995 Genetics140：897-907)；可以形成四联结构的富含G的序列；和可以形成三联DNA的寡嘧啶或寡嘌呤序列。
外源DNA的缺失是减少这种假结合位点的加入变化所必需的。然而，当缺失了DNA时，其他问题可以产生。例如，真核复制易于在细胞巨化病毒(CMV)启动子中终止。当起点的定向接近或平行于CMV启动子时，终止被增强。干扰可能归因于二级结构或细菌蛋白的意外结合。新的最小化DNA疫苗载体(例如pVAX1)含有CMV启动子和因为尺寸减小而紧密接近的复制起点；该载体生成复制中间体，从而降低了细菌宿主中生成的质粒的质量(Levy J.2003美国专利申请US2003180949)。
IIS类限制酶提供了消化限制内切酶识别位点外面的DNA分子的方法，使引入位点(通过PCR)并消化其成为可能，生成了在任何点具有特异性地址标记的悬垂末端。通过将该特征与基因扩增技术相结合，PCR引物中的IIS类位点可以在任何位点消化DNA，提供了独特的、非回文的悬垂末端或特异性地址标记(Lebedenko EN，Birikh KR，Plutalov OV，Berlin YuA.1991 Nucleic Acids Res 19：6757-61)。基因自组装过程使用IIS类限制酶来生成独特的非回文的悬垂末端，其可以连接至复合混合物中的仅一个其他末端，从而保证各片段以正确方向连接至其正确的配体，且无例外。Nature Technology Lincoln NE已经开发了基因自组装载体pWizBang，其可用以在一系列DNA分子(例如平末端限制片段或PCR扩增子)上生成独特的非回文的地址标记，允许许多片段(达32)即时连接入单个复合构建体。该步骤允许模块载体构建，并清除了相继的亚克隆。该技术的一个优点是它是无缝的，即可以在任何碱基加入片段，且不需要在这些位置上的限制位点(Hodgson，C，Zink，MA，Xu，G.，美国专利6,410,220)，缺失了所有的外源序列。然而，IIS类载体开发方法还未应用于生成优化的DNA疫苗质粒。
即使考虑现有技术，其依然需要改良的载体，该载体被最小化以缺失外源DNA，被生物化以保证高质量细菌质粒产率和提高的体内表达、提高的先天和获得性免疫反应诱导，并被设计以促进快速并合理评价混合质粒免疫，以便该技术能够用以满足具有广泛靶抗原的人类和其他哺乳动物、鸟或鱼中的效力阈。
发明公开
本发明涉及用于获得提高的遗传免疫的真核表达质粒家族和免疫策略。
公开了改良的DNA疫苗载体家族，具有相同的骨架以限制变异性和无缝的细胞内靶向克隆盒，其已经表明了比现有技术载体提高的表达。关键是，这些载体允许抗原被靶向于多个细胞内目的地，且不改变侧翼载体或基因序列。通过使用基因自组装技术同时加入6个片段构建了载体，所述技术消除了对载体组装中使用的片段之间连接处的其他序列的需要。已经优化和最小化了所有的质粒元件，以符合FDA关于外源物质的含量和清除的指导原则。所生成的载体比现有载体例如VR1012(5kb，与3-3.5kb的pDNAVACCUltra载体相比较)要小的多，并促进较高水平的靶基因表达。优化的kanR基因-pUC起始方向的加入以及新的合理设计的RNAII复制起始突变导致了2倍的提高的质粒产率。这些载体被设计以促进高通量克隆应用，并允许同时克隆入多个载体，所述载体特征为蛋白产物不同的细胞内靶向目的地。所述克隆不需要载体中存在额外碱基，例如限制酶位点。因此，消除了传统克隆需要的其他碱基所赋予的载体之间的变异性。
而且，所述载体可用于新免疫策略，例如“混合呈递免疫”，其中通过质粒鸡尾酒免疫来提高针对靶抗原的免疫反应，所述质粒鸡尾酒结合了2种或多种质粒，各质粒靶向抗原至不同的细胞内目的地。
而且，除了优化的蛋白质抗原表达元件以外，所述载体编码表达的RNA序列(RNA元件)。这些表达的RNA序列为载体增加了其他的功能性，以定制和增强免疫反应。例如，RNA元件可以是免疫刺激的，促进或抑制程序性细胞死亡，将细胞死亡导向坏死途径，增强质粒核定位和启动子表达，或者以其他方式改变细胞表达。RNA元件可以编码单链RNA、双链RNA、发夹RNA、微RNA、RNA适体或核酶或其组合。由于RNA表达元件的小尺寸(100-500bp)，单个质粒中可以包括多个元件。由于RNA不诱导针对自身的获得性免疫反应，对含有RNA的载体的反应不依赖于患者的在先暴露，并因此能够重复使用，且不诱导针对载体骨架的免疫反应。
而且，所述载体可用于新的免疫算法RapidVACC，以快速筛选可能的呈递途径，其提供了优化的免疫刺激序列混合物、呈递模式和适用保护的抗原。使用免疫刺激DNA疫苗质粒的定向抗原呈递用以提供提高的免疫反应，所述疫苗质粒为单独使用或以最优化用于MHC I和MHC II呈递的质粒组合(混合的呈递免疫)使用。最佳的呈递将是抗原和递送途径特异性的。最优化用于各模式的质粒组合可最终提供更好的保护。
发明概述
本发明的目的和/或目标是提供DNA疫苗质粒，用于通过DNA接种产生免疫反应。另一公开内容是改良的DNA疫苗质粒组合物，其与本领域中确定的质粒(VR1012、pVAX1、pVC0396、pCMVkm2或pCOR载体，或其衍生物)相比改良了：通过加入新的嵌合SV40增强子-CMV启动子而提高的靶抗原真核表达；通过最优化真核启动子上游元件而增加的真核表达；通过添加RNA输出信号而增加的真核表达；通过缺失所有外源序列而较小的尺寸，所述外源序列例如添加的其他载体中存在的真核起始点或抗生素抗性基因的侧翼序列。这些序列是作为使用最近的有效限制位点来生成载体的结果而存在于现有载体的。这包括去除存在于其他载体(例如VR1012)中的潜在重组基因转座子末端；较小尺寸是通过生成新的短前导内含子来取代大的CMV前导内含子1；较小尺寸是通过生成新的短真核转录终止子来取代大的牛生长激素终止子或兔β球蛋白终止子；细菌生产过程中提高的产率和完整性是通过在原核区侧翼加入转录终止子以对抗靶抗原表达；细菌生产过程中提高的完整性是通过去除其他序列，例如VR1012克隆片段中使用的polyG polyC尾，其可以促进细菌增殖过程中的二聚体或环状体(concatamer)形成；细菌生产过程中提高的产率和完整性是通过最优化卡那霉素抗性基因、复制方向的起始点；细菌生产过程中提高的产率是通过加入新的比pUC或pMM1起始点增强的复制起始点；没有外源序列的抗原的精确克隆和表达是通过使用IIS型酶而非传统的II型酶用于克隆；灵活定向抗原至各细胞内目的地且无侧翼载体或基因序列的干扰是通过使用IIS型酶用于克隆。VR1012、pVAX1、pVC0396、pCMVkm2或pCOR载体不允许抗原靶向。
本发明的另一目标和/或目的是提高DNA接种效力的新免疫方法。本发明的载体用以提高DNA疫苗的效力，通过：与本领域确定的DNA疫苗质粒相比较增加靶基因表达；和促进需要灵活靶向抗原至各细胞内目的地的新免疫方法，例如：确定用于DNA初次免疫的最佳抗原细胞内靶向；确定用于DNA加强的最佳抗原细胞内靶向；确定用于DNA初次免疫、DNA加强免疫的最佳抗原细胞内靶向；确定用于DNA初次免疫的抗原细胞内靶向质粒的最佳组合；确定用于DNA加强的抗原细胞内靶向质粒的最佳组合；确定用于DNA初次免疫、DNA加强免疫的抗原细胞内靶向质粒的最佳组合。
本发明的另一目标和/或目的是提高DNA接种效力的新表达RNA-含有DNA的疫苗载体骨架。除了优化的蛋白质抗原表达元件，本发明的载体骨架还编码表达的RNA序列。这些表达的RNA序列为所述载体增加了其他功能，例如：免疫刺激RNA；促进程序性细胞死亡的RNA；抑制程序性细胞死亡的RNA；促进坏死细胞死亡的RNA；促进质粒核定位的RNA；促进启动子表达的RNA；结合配体的RNA；钝化基因的短发夹RNA；促进抗原交叉呈递的RNA；或者改变细胞表达以定制和增强免疫反应的其他RNA。所述RNA元件可以编码单链RNA、双链RNA、发夹RNA、微RNA、RNA适体或核酶或其任意或所有组合。由于RNA表达元件的小尺寸(100-500bp)，单个质粒中可以包括多个元件；当多质粒免疫时，各质粒上可包括不同的RNA元件。由于RNA不包括针对自身的获得性免疫反应，对含有RNA的载体的反应不依赖于经免疫的个体的在先暴露，并因此能够重复使用，且不诱导针对载体骨架的免疫反应。
总结，所述载体结合了减小的尺寸和序列含量(其提高了调节顺应性和效价)与通过RNA元件提高的生产、转录、呈递靶向、产率、完整性、基因组重组倾向(安全性)和调节先天免疫反应的性能。
本发明进一步的目的和优点将参考附图和随后说明书而变得显而易见。
附图简述
图1显示了基因自组装载体pWiz-Bang 2.0。
图2显示了pDNAVACCultra质粒。
图3描述了用于定向扩增和克隆cDNA序列入pDNAVACC载体的方法。
图4显示了从pDNAVACC质粒的体内表达。
图5显示了用于载体的填充(stuffer)序列。
图6显示了掺入RNA元件的载体。
图7描述了免疫刺激DNA疫苗的应用。
图8描述了RapidVACC算法流程图。
图9描述了用于从序列化基因组中鉴定保护性抗原的RapidVACC算法流程图。
图10显示了可用以促进或抑制程序性细胞死亡的RNA元件的靶。
表1：pDNAVACC质粒中起始组合物和定向的最优化。
表2：嵌合启动子的成纤维细胞活性。
表3：抗原呈递途径靶向分子。
表4：复制起始点。
表5：RAW 264.7细胞系中免疫刺激的RNA元件诱导的TNFα生成(转染后36小时)。
表6：RAW 264.7细胞系中免疫刺激的RNA元件诱导的TNFα生成(转染后15小时)。
发明详述
现在参考附图，图1显示了基因自组装载体pWiz-Bang 2.0的应用。(a)设计引物以生成4bp重叠序列，扩增构件，克隆入线性载体，证实序列；和(b)使用AarI消化释放连接片段，通过单个步骤生成了最终的基因或构建体。
在图2中，显示了pDNAVACCultra质粒骨架，(a)pDNAVACCultra5-EGFP的图谱；(b)pDNAVACCultra2-SV40(NTC7142)的图谱；(c)含有pDNAVACCultra5-EGFP-mU6 RNA表达元件的质粒图谱；和(d)含有pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6 RNA表达元件的质粒图谱。
在图3中，描述了用于定向扩增并克隆cDNA序列进入pDNAVACC载体的方法，(a)含有两个独特地址标记的质粒，通过使用位于切口之间的IIS类酶消化生成；和(b)通常的引物，含有IIS类酶识别信号(SapI)、至少一个插入核苷酸和与独特的非回文序列重叠的区域(GGG，该实施例中的地址标记)。
在图4中，显示了从pDNAVACC质粒的体内表达。由pDNAVACCultra-SEAP载体、pDNAVACCultra-SV40-SEAP载体或gWIZ-SEAP驱动的SEAP体内表达。
在图5中，描述了下述的高通量细胞内靶向克隆位点：(a)pDNAVACCultra1(分泌-内体)；(b)pDNAVACCultra2(分泌)；(c)pDNAVACCultra3(分泌-膜锚定)；(d)pDNAVACCultra4(蛋白体)；(e)pDNAVACCultra5(天然)；(f)pDNAVACCultra6(膜锚定)；(g)pDNAVACCultra7(内体)；和(h)pDNAVACCultra8(分泌-交叉呈递)。
在图6中，显示了载体整合的RNA元件。
在图7中，描述了免疫刺激DNA疫苗的应用。
在图8中，显示了用于开发单抗原DNA疫苗的RapidVACC流程图。
在图9中，描述了用于从序列化基因组鉴定保护性抗原的RapidVACC流程图。
在图10中，显示了可用以促进或抑制程序性细胞死亡的RNA元件的靶。箭头指示富集于骨骼肌中的ARC和FLIP。
定义
佐剂：包括核酸佐剂(例如免疫刺激CpG序列，细胞因子、趋化因子或其他分子(例如细胞死亡启动子(例如疱疹胸腺嘧啶激酶))的表达载体)和化学佐剂，其是在与疫苗抗原一起施用时能够增强、延长或以其他方式调节抗原特异性免疫反应的化合物。这些是本领域公知的并通过引用结合入本文(例如参见Williams等，2001)。
APC：抗原呈递细胞，例如朗格汉司细胞和树突细胞。
BAC：细菌人工染色体。
ccc：共价闭合环状。
共刺激分子：本领域已知的共刺激质粒(例如IL12)或分子、细胞死亡抑制剂(例如抗细胞凋亡蛋白质)或增强剂，并通过引用结合入本文。
cmv：细胞巨化病毒。
递送方法：本领域已知的递送基因载体的方法(例如聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、ISCOM、脂质体、非离子表面活性剂泡囊(niosome)、病毒小体、壳聚糖和其他生物可降解的聚合物，电穿孔法，声致穿孔法(sonoporation)，超声波，基因枪，无针头生物注射器(needle freebiojector)，脂质体，微粒，微球，纳米颗粒，病毒小体，细菌外壳，细菌，减毒细菌等)，并通过引用结合入本文。
dsRNA：双链RNA。
基因自组装：基因自组装方法使用IIS类限制酶来生成独特的非回文的垂悬末端，其可以连接至复合混合物中仅一个其他末端，从而保证各片段以正确方向连接至其正确的配体而非其他。
GPI：糖基磷脂酰肌醇。
HA：血凝素。
免疫反应：抗原反应性细胞(例如，抗原反应性T细胞)或抗体(例如抗原反应性IgG)反应。
细胞内靶向：使用上述靶向序列(表3总结了非限制性名单)将靶抗原导向内或细胞内目的地，或者上述抗原呈递途径。
混合呈递免疫：使用质粒鸡尾酒或质粒-蛋白鸡尾酒免疫，其结合2个或多个质粒，各质粒使用上述靶向序列(表3总结了非限制性名单)将抗原导向内或细胞内目的地，具有或没有相应的蛋白质抗原。
NP：核蛋白。
PCR：聚合酶链式反应。
pDNA：质粒DNA。
质粒：质粒、黏粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、病毒载体及其杂合体。
pUC起始点：pBR322-衍生的起始点，且具有G至A的转变，其在升高的温度下增加拷贝数。
RapidVACC：疫苗开发方法，其涉及使用本文公开的靶向质粒免疫方法并结合本领域已知的鉴定方法确定最佳质粒骨架和/或保护性抗原的呈递。
RNA元件：含有表达的RNA序列的表达盒。启动子可以是PolI、PolII或PolIII启动子，并且表达的RNA可以是单链RNA、双链RNA、发夹RNA、微RNA、RNA适体或核酶。
shRNA：短发夹RNA。
siRNA：短抑制性RNA。
ssRNA：单链RNA。
靶抗原：可以导致免疫反应的免疫原性蛋白或肽表位，或蛋白质和肽的结合。靶抗原可能衍生于用于传染病应用的病原体，或者衍生于用于例如癌症、变态反应或自身免疫疾病应用的宿主生物。本领域中明确定义了靶抗原。一些实例公开于Williams等，2001，并通过引用结合入本文。
靶向分子：如上所述的细胞内靶向序列和抗原呈递途径靶向分子，非限制性名单总结于表3。
TH1：T辅助细胞1。
TH2：T辅助细胞2。
TLR：Toll样受体。
载体：基因递送载体，包括病毒(例如甲病毒属、痘病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒等)和非病毒(例如质粒、蠓(midge)、转录活性PCR片段、微环、噬菌体等)载体。这些是本领域公知的并通过引用结合入本文。
本发明涉及用于蛋白质表达和遗传免疫的组合物和方法。本发明实施为在真核细胞中表达基因产物，用于遗传免疫、基因治疗、重组蛋白质生成或其他生物技术应用的目的。本发明用于ccc重组DNA分子的这种用途，所述ccc重组DNA分子例如质粒、黏粒、BAC、噬菌体、病毒载体及其杂合体(本文共同称为质粒)。
现有技术中描述的DNA疫苗质粒不是最佳的(具有次佳的表达、其他非必需DNA)，其也不促进高通量方案或灵活靶向抗原至各细胞内目的地。这些缺陷是关键的，因为载体中几个增加的改良导致表达水平免疫反应质量和最终保护性免疫中的巨大差异。
载体构建优选实施方案
在生成DNA疫苗质粒的一个优选实施方案中，使用IIS型限制酶进行克隆。这里，我们公开了先进的基因自组装载体pWizBang2.0的开发，该载体使用酶AarI来生成4-碱基垂悬末端(图1)。使用该方法可以清楚地加入达121个片段。我们已经证明了该载体通过生成模块DNA疫苗载体家族(图2)而用于复杂克隆方案的应用，所述疫苗载体被独特设计以缺失所有外源序列，促进高通量疫苗开发方案和靶抗原至细胞内靶向序列的无缝融合。
克隆成功率(>90％)表明，pWizBang2.0可普遍用于高度复杂的克隆方案。在基因构建之前测序输入片段的能力保证了最终构建体将不含经由错误寡核苷酸引物(常见)或PCR酶(罕见)引起的突变。该方法需要高度完整的寡核苷酸引物以及不增加多余碱基的高保真的聚合酶，例如PfuDNA聚合酶(如果使用基因扩增)。
靶基因克隆优选实施方案
在关于将抗原克隆入DNA疫苗质粒的一个优选实施方案中，使用IIS型限制酶进行克隆。当作例子，图2显示了pDNAVACCultra载体。该载体促进通过使用IIS型酶克隆方法在期望的细胞内靶向基因前导盒上游无缝克隆兴趣基因或表位。克隆位点被设计用于高通量克隆应用，并在多个载体间相容，实现了在一个步骤制成几种不同的细胞内定向基因构建体(图3)
DNA疫苗质粒优选实施方案
在关于免疫的一个优选实施方案中，使用pDNAVACCUltra载体进行免疫。当作例子，图2显示了pDNAVACCultra载体。原核区(复制起始点和卡那霉素抗性基因)的侧翼加上原核转录终止子，以提高广泛靶基因的稳定性和产率。在原核模块侧翼加上独特的限制位点，以允许方便地修饰(即，用抑制剂滴定盒取代KanR盒)。所有的质粒元件已经被最优化和最小化以符合目前WHO和FDA关于外源物质含量和缺失的指导原则。所生成的载体比现有载体例如VR1012(5kb，与3-3.5kb的pDNAVACCUltra载体相比较)要小的多。
通过使用pDNAVACC质粒或一系列质粒交换(用来自Vical VR1012DNA疫苗载体的相应元件取代各元件)转染的细胞系中瞬时表达水平的比较，已经验证了各元件的功能性。与现有DNA疫苗质粒相比较，质粒的原核部分的方向和组成的多方面优化意想不到地导致了细菌培养物中提高的生产率和稳定性，以及体外和体内表达的提高(表1，图4)。
表1：pDNAVACC质粒中起始点组成和方向的优化
*T＝转录终止子TT＝串联的双转录终止子NA＝未测定
ND＝未检测到
**相对于pDNAVACC-EGFP
***真核细胞系中EGFP的表达，从最低+至最高+++++
来自上述的最小化的和最优化的单个元件在载体交换实验中显示与来自VR1012载体的相应区等价。从CMV和NVL-3启动子的表达水平意想不到地受卡那霉素抗性基因方向的影响，且当卡那霉素基因启动子位于真核启动子远端时有显著较高的表达(表1和2)。意想不到地，pDNAVACCUltra载体中这些最小化的和最优化的元件的组合是协同的，导致了真核细胞中总体提高的质粒表达(表1和2)。
表2：嵌合启动子的成纤维细胞活性
启动子构型* 表达*
*表达从最低+至最高+++++**Ultra指最佳的kanR基因方向
在关于免疫的另一优选实施方案中，使用了掺入嵌合启动子的pDNAVACCUltra载体。公开了新的嵌合启动子，其结合进一步提高了靶抗原的表达(图4)。
意想不到地发现，新的嵌合启动子(其中SV40增强子在CMV启动子的上游融合)显著增加了体内表达(图4)。不知道提高的表达是否缘于所述质粒增加的转录活性和/或提高的核定位。后者是可能的，因为已经证明SV40增强子的区域促进DNA疫苗质粒在肌细胞中的核定位，且具有显著提高的靶蛋白表达(Dean等，同前，1999)，如Graessman M，Menne J，Liebler M，Graeber I，和Graessman A 1989 Nucleic Acids.Res.17：6603-6612所预测的。NFκB的结合位点(Mesika A，Grigoreva I，Zohar，M，Reich，Z.2001 Molecular Therapy 3：653-657)和平滑肌特异性转录因子SRF(Zohar M，Mesika A，Reich Z.2001 BioEssays 23：1176-1179)也调节该作用。然而，提高的表达必然比单独的核定位更复杂，因为当整合入DNA疫苗质粒时，NFκB-SV40-CMV增强子的构建不如单独SV40-CMV一样好进行。
细菌生产质粒DNA的优选实施方案
在关于细菌生产质粒DNA的一个优选实施方案中，所述质粒的元件方向被最优化以保持细胞系的生存力。我们教导了新发现：必须在质粒优化过程中评价低温保藏生存力。使用整合有SV40增强子的质粒，意想不到地观察到甘油保藏中降低的生存力。这是质粒特异性的，而这里开发的pDNAVACCUltra载体具有高的甘油保藏生存力。我们发现，本领域中没有教导确定质粒内元件的最佳方向以保持细胞系生命力，而我们教导通过改变载体中元件方向并测试生存力来确定其。
在关于细菌生产质粒DNA的另一优选实施方案中，质粒中元件的方向被最优化以保持或提高质粒质量。DNA质量和产率受元件的组织以及所包括的特定元件(例如IRES、CMV启动子)所影响。我们这里证明了在治疗性质粒的开发过程中必须评价质粒质量。我们教导这种评价需要测定1)复制中间体2)二聚体形成和3)超螺旋对代数目的％，以便质粒在生产过程中可以增殖。这里开发的pDNAVACCUltra载体具有高度的稳定性和有关这些属性的质量。
复制中间体：复制将在内在核糖体进入位点(IRES)[例如脑炎心肌炎病毒(EMCV)ires]和真核增强子重复区[例如细胞巨化病毒(CMV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR]内终止。当起始点的方向接近和平行于CMV启动子时，终止被增强。干扰可能归因于二级结构或细菌蛋白的意外结合。该现象仅发现于高拷贝质粒；基于低拷贝质粒的相同排列没有形成可检测的中间体(Levy，同前，2003)。轻易观察到作为纯化质粒制品中额外的小谱带的复制中间体的存在。由于失败的复制循环，这些中间体降低质粒产率(拷贝数)、质粒纯度，并增加了去除该相关杂质所必需的纯化费用。未能除去复制中间体将降低最终质粒的纯度和效价。pDNAVACCultra质粒没有将复制起始点置于靠近CMV启动子，生成了高质量的超螺旋单体DNA，其没有生成可检测的复制中间体或环状体。如果卡那霉素抗性基因的方向逆转，则意想不到地观察到了复制中间体。SV40增强子的加入也意想不到地增加了所生成的复制中间体的数目。现有技术教导卡那霉素抗性基因在这些载体中的方向不应该影响复制中间体的生成，并且使用任一方向都不应该观察到复制中间体。有关复制中间体生成的卡那霉素基因新方向依赖性的基础是未知的。我们教导了，减少复制中间体的元件最佳方向在本领域中没有被教导，并且可以通过改变元件在载体中的方向并测试复制中间体而减少。
二聚体形成序列：多数质粒重组不依赖RecBCD，并通过RecF途径介导，其需要RecA以及其他基因功能。RecBCD是大肠杆菌中负责降解线性DNA的主要酶。RecBCD降解在Chi位点停止。RecBCD导向的RecA至chi位点的募集刺激同源重组。已经表明，质粒中chi位点的存在还促进在recA+sbcB+(野生型)细胞中通过RecBCD途径的不依赖RecF的重组(Zaman和Boles，同前1996)。质粒中的寡嘧啶和寡嘌呤序列已经表明增加pUC质粒中的二聚体形成，推测是通过罕见DNA结构(例如三联螺旋)的形成(Kato，同前1993)。pDNAVACCultra载体不含有这样的序列，并显示较低水平的二聚体形成。
对质粒质量有害的序列：某些序列提高了差的超螺旋含量(即总质粒的显著百分含量是开环的)。不幸的是，质粒中这种序列的存在需要经验确定。切割可能与“呼吸”并对内源性单链核酸酶敏感的AT富集区相关联。由于是同向或反向重复序列和经大肠杆菌宿主缺失或重排的Z DNA形成序列，所以回文序列是不稳定的。罕见的二级结构DNA包括：潜在Z DNA形成连续的交替嘧啶/嘌呤序列(例如CpG序列)；可以形成四链结构的富含G的序列；和可以形成三联DNA的寡嘧啶或寡嘌呤序列。pDNAVACCultra载体没有促进切割的序列。
在关于细菌生产质粒DNA的另一优选实施方案中，质粒中的元件方向被最优化以增加质粒拷贝数。我们教导同一载体骨架中原始起始点和kanR相对于彼此的方向意想不到并显著地改变质粒产率。通常，现有技术教导需要防止复制起始点从相邻基因通读转录，以防止质粒去稳定或减少的拷贝数(Eastman，EM，Durland RH.2000美国专利第6103470号；Engels P，Meyer P.1993 Biotechniques.14：324-325)。本文确定的最佳方向通过起始点和kanR基因的分支转录以及在kanR基因后面加入双转录终止子来防止起始点转录通读。
RNA生成的DNA疫苗的优选实施方案
在一个优选实施方案中，为提高免疫反应，使用含有RNA元件的DNA疫苗载体(图6)进行免疫。如下所述，我们预期使用含有表达的(可扩增的)ssRNA、shRNA和dsRNA序列的DNA疫苗载体来进一步提高表达和/或免疫反应。优选地，RNA序列是免疫刺激的，是选择性地前细胞凋亡或抗细胞凋亡的，或者作用以提高从质粒的表达。含有shRNA和dsRNA的载体骨架将不诱导获得性免疫反应(即不受在先免疫暴露影响的可重复使用的载体)；这是相对替代载体(例如甲病毒属复制子)疫苗而言显著的优点。该载体可以提供一系列的免疫刺激和细胞凋亡活性(图7)，理论上实现了使用RapidVACC选择最佳(图8)；对于不同的递送方法期望不同的最佳组合。这些载体形成RapidVACC疫苗开发平台的第一步的基础，其中细胞死亡和先天免疫刺激是最优化的。
RNA聚合酶I、II或III反应性启动子也可用以制备RNA。优选地，RNA元件使用RNA聚合酶III启动子用于表达。
现有技术没有教导将RNA元件整合入DNA疫苗质粒。RNA元件提供了对与DNA接种相关联的差免疫反应诱导的新的可能的解决方案，且不需要在质粒骨架中包括免疫原性蛋白以诱导细胞死亡或先天免疫反应(如生成甲病毒属复制子或鞭毛蛋白的质粒所具有的)。而且，RNA元件提供了对与疫苗异源的佐剂(例如免疫刺激RNA或细胞因子或趋化因子，或抑制合成siRNA的基因)的加入相关联的宿主、调节和安全性问题的解决方案，因为目前这些可通过含有DNA疫苗质粒(图7)的细胞中的质粒骨架严格地生成或诱导。RNA元件提供了空前的灵活性，因为载体可以含有多个RNA元件，可使用合理设计的算法(RapidVACC；图8)为各抗原/递送确定其最佳的组合。这些元件可结合使用以优化免疫反应。所述RNA元件可以是免疫刺激的，促进或抑制程序性细胞死亡，指导细胞死亡至坏死途径，增强质粒核定位和启动子表达，或者以其他方式改变细胞表达。RNA元件可以编码单链RNA、双链RNA、发夹RNA、微RNA、RNA适体或核酶或其组合。由于RNA表达元件的小尺寸(100-500bp)，单个质粒中可以包括多个元件。由于RNA不包括获得性免疫反应，所以对含有载体的RNA的反应不依赖于动物或人类患者的在先暴露，并因此能够重复使用，且不诱导针对载体骨架的免疫反应。
DNA疫苗骨架中加入RNA元件是针对差的抗原表达或免疫原性问题的新解决方案。虽然现有技术教导了各种免疫刺激RNA可诱导干扰素和其他获得性免疫反应并提高对DNA疫苗的反应，但未考虑在疫苗骨架中加入这种元件。而且，虽然通过加入载体表达的蛋白佐剂(例如鞭毛蛋白)、前细胞凋亡蛋白(甲病毒属复制子或突变半胱天冬蛋白酶)或抗细胞凋亡蛋白改良了DNA疫苗，但这些方法是限制性的，因为这时的载体骨架诱导针对所编码蛋白的获得性免疫反应，或者含有人类蛋白(安全性考虑)。而且，由于RNA元件的小尺寸，载体骨架中可以包括多个元件(功能性)，以提供免疫反应调节中空前的灵活性，这是现有技术中未考虑或教导的。这种新颖的、新的和未启示的元件组合(RNA元件与抗原表达)实现了成本有效的、安全的、多用途DNA疫苗的开发，所述DNA疫苗提高和定制免疫反应。以增强对DNA疫苗载体的免疫反应的shRNA表达载体的使用也是新的，并在现有技术中未考虑。虽然设计用于基因沉默的shRNA质粒已经显示诱导干扰素反应(Pebernard S.Iggo RD.2004Differentiation 72：103-111)，并使用siRNA质粒已经观察到了类似的免疫系统激活(Marques JT，Williams BRG.2005 Nature Biotech 23：1399-1405)，但该现有技术的教导远离本发明，因为考察者将针对siRNA或shRNA的先天免疫反应视为关于基因击倒(knockdown)载体商业化的问题。而且，显然，本领域技术人员将不会预期该新开发，因为来自高度牛源化的DNA疫苗和shRNA领域的广泛现有技术都没有教导使用RNA元件来改良DNA接种。一旦如本文公开的来构思，该先前未启示的对DNA疫苗骨架的修饰(RNA元件连接入DNA疫苗骨架)教导了许多新的意想不到的结果，这对本领域技术人员而言是清楚的。例如，本发明解决了长期渴望但未解决的需求，即提高针对DNA疫苗载体的免疫反应，且不包括人类蛋白，例如质粒诱导的细胞因子(其存在自身免疫安全性考虑)、异源佐剂(安全性、调节和成本考虑)，同时保持载体的多用途能力(鞭毛蛋白或甲病毒属复制子所限制的)。而且，该方法解决了在先仅DNA接种的不可操作性，因为在先技术教导在灵长类和人类中的DNA接种仅当与异源载体加强(例如腺病毒、蛋白质或灭活疫苗)或包括有效第二佐剂(例如IL12、IL15)或病毒蛋白(甲病毒属)的时候才是有效的。本领域技术人员将发现本发明现在将这些附加功能整合入了疫苗骨架。而且，现在，在单个载体中包括多个RNA元件的能力实现了将多个功能整合入疫苗的空前的意想不到的能力。而且，虽然有优化质粒元件以提高表达的广泛在先技术，但现有技术还没有考虑加入RNA元件来实现其。
DNA疫苗质粒中可以包括许多不同类型的RNA元件，以产生多种生物反应。下面公开了许多RNA功能和应用。其目的不是限制RNA元件应用于这些具体实施例，而是这些实施例的讨论是说明本发明的一般效用。
shRNA
基因表达的定向击倒实现了靶细胞蛋白组的定制化。这可用以诱导TH1或TH2免疫刺激细胞因子或趋化因子生成、干扰素生成，提高蛋白体加工，改变坏死或细胞凋亡反应，诱导质粒DNA核定位，增强质粒表达，或改变MHCI或MHCII决定子或其他细胞表面受体(例如Toll样受体)的表达。例如，可以通过干扰素调节因子4(IRF-4)的shRNA击倒来增强来自TLR的信号传导，所述干扰素调节因子4负向调节经由TLR的信号传导，其需要衔接蛋白MyD88。TLR信号传导途径受TLR可诱导分子的负调节，所述TLR可诱导分子例如IRAK-M(IL-1受体(IL-1R)相关激酶M)、SOCS1(细胞因子信号传导抑制剂1)、MyD88(MyD88短)、SIGIRR(单个免疫球蛋白IL-1R相关分子)和ST2。TLR的其他负调节子是P13K、TRIAD3A、Tollip、A20DAP12和RP105(TLR4抑制剂；综述于Liew FY，Xu D，Brint EK，O′Neill LAJ.2005 Nature Rev.Immun.5：446-458)。击倒可以增强细胞因子对TLR反应的强度。Cot可以是靶，因为其似乎作用为IL-12介导的TH1反应的负调节子。可以通过蛋白体的激活来增强MHCI上肽的展示。
shRNA生成元件(例如鼠U6启动子为300bp)的小尺寸允许多个盒整合入单个质粒，实现了理论上的靶细胞操纵。
下面讨论了该方法诱导定向程序性细胞死亡或质粒核定位的实例应用。
增强质粒表达的shRNA
考虑了改变蛋白质组以通过提高的质粒稳定性、核转运、mRNA转录、mRNA稳定性、mRNA加工和mRNA核输出和/或抗原翻译来提高抗原表达的shRNA。例如，质粒进入细胞核是获得抗原表达的限制性因素。通过加入NFκB结合位点或SV40增强子来提高质粒的核定位，提高了抗原在体外和体内的表达；推测这归因于NFκB的结合，其然后肩负质粒至细胞核(Dean等，同前，1999)。然而，NFκB一般定位于细胞质，而向细胞核的转移是既是有限、组织特异性的，也依赖于刺激信号。这限制了NFκB核寻靶的应用。
靶向NFκB核定位的短半衰期抑制剂(例如Iκβα、β和ε)的质粒编码shRNA将导致提高质粒核停留的NFκB5的核定位。而且，将从NFκB反应性启动子(CMV和SV40-CMV启动子)增强表达。预期该策略提高表达水平，并将在改良DNA疫苗以及用于治疗的质粒(例如生长激素释放因子质粒疗法)中具有应用。
诱导程序性细胞死亡的shRNA
通过程序性细胞死亡来提高对DNA疫苗的免疫反应。这已经通过同时施用Fas或突变的半胱天冬蛋白酶2或3(其提高了CTL对肌肉注射的DNA疫苗的反应)来完成。共施用的半胱天冬蛋白酶也提高了对通过基因枪给入的流感HA DNA疫苗的免疫反应(Sasaki等.同前，2001)。最佳条件可以选择性杀伤有关树突或朗格汉司细胞抗原来源的肌肉或角质化细胞(而非免疫细胞)(综述于Leitner和Restifo，同前，2003)。不可能使用组成型细胞死亡促进剂。程序性细胞死亡的抑制还可以提高免疫反应，其中共施用Bcl-XL强力提高了基因枪给入之后的T细胞反应。这可以反映延长树突细胞的益处。杀伤转染细胞由于减少了插入诱变的改变而具有额外的安全性。
树突细胞(特别是比成熟细胞更不耐受细胞死亡诱导物的不成熟树突细胞)可以对不同的抗程序性细胞死亡基因的靶向减少是不同地敏感的。可以被击倒的抗程序性细胞死亡基因的非限制性名单为BCL-2、BCL-XL、FLIP、XIAP以及Mcl-1、Bcl-W、Bfl-1、c-IAP1、C-IAP2、存活素、Livin和ARC。可以通过非免疫细胞在注射部位的靶向程序性细胞死亡来提高免疫反应。对于肌肉注射，其将是骨骼肌细胞，对于皮下免疫，其将是角质化细胞。有趣的是，骨骼肌细胞对内在途径的程序性细胞死亡表现耐受；这与降低的ApaF1水平(Burgess DH，Svensson M，Dandrea T，Gronlung K，Hammarquist F，Orrenius S，Cotgreave IA.1999 Cell DeathDiffer 6：256-261)和提高的XIAP水平(Reviewed in Primeau AJ，AdhihettyPJ，Hood DA.2002 Can.J.Appl Physiol.27：349-395)相关联。骨骼肌表达高水平的FLIP和ARC(具有CARD的程序性细胞死亡抑制剂)。ARC同时抑制外在和内在的程序性细胞死亡途径；通过siRNA处理的ARC缺失导致肌细胞的自发程序性细胞死亡(Nam YJ，Mani K，Ashton AW，Peng CF，Krishnamurthy B，HayakawaY，Lee P，Korsmeyer SJ，Kitsis RN.2004 Molec.Cell.15：901-912)。这表明载有shRNA以击倒ARC的DNA疫苗可以靶向骨骼细胞而非有关细胞死亡的树突细胞。类似地，FLIP水平在角质化细胞(并且中等水平的XIAP和Livin)中是高的；XIAP和Livin水平在细胞凋亡刺激后降低(Bowen AR，Hanks AN，Allen SM，Alexander A，Diedrich MJ，Grossman D.2003 J Invest Dermatol 120：48-55)。靶向一个或多个这些基因可以实现选择性的角质化细胞程序性细胞死亡，且不杀伤内在的朗格汉司细胞。关键是，程序性细胞死亡可以被延缓，并需要在免疫后生成诱导程序性细胞死亡的炎性信号(例如TNFα)。这将在细胞死亡之前提供高水平的抗原表达，超越例如使用甲病毒属载体所观察到的直接程序性细胞死亡的限制。
可以在体外(使用原代骨骼肌细胞、角质化细胞、朗格汉司细胞或树突细胞并监测细胞死亡、干扰素或细胞因子或趋化因子的分泌、通过RTPCR的基因表达，和/或通过标准方法学使用抗体的蛋白质表达)或体内(在遗传免疫后，通过监测TH1或TH2反应、抗体生成、细胞免疫反应和/或保护性免疫)确定有关选择性程序性细胞死亡和免疫刺激活性的shRNA最佳组合码。
基因特异性shRNA被整合入疫苗载体中。由导入细胞的一个或数个拷贝的载体在接种过程中生成的shRNA的量应该足够用于靶向基因击倒，因为本领域教导了单拷贝的shRNA生成基因(与逆转录病毒载体生成的生成shRNA的整合细胞系一样)能够足够用于靶向基因沉默。对于基因靶向shRNA，如果利用靶向基因中的保守序列，则载体可以不需要被改造，因为所述载体从小鼠至雪貂至人类是逐级放大的。例如，已经为许多靶向基因(例如Bcl-2)开发了交叉反应性沉默RNA构建体(参见RNAi Codex网站http://codex.cshl.edu)。或者，shRNA可以是物种特异性的。对于农业应用，优选的RNA元件为靶向生物而合理设计，并在动物研究之前使用靶向组织原代细胞进行体外验证。
dsRNA
显著地，对于疫苗应用，dsRNA是与CpG DNA协同的，以提高免疫反应(Whitmore MM，De Veer MJ，Edling A，Oates RK，Simons B，LinderD，Williams BRG.2004 Cancer Research 64：5850-5860)。这可能是通过TLR3(dsRNA反应性；综述于Matsumoto M，Funami K，Oshiumi H，Seya T.2004 Microbiol Immunol 48：147-154)与TLR9(CpG反应性)(Mukhopadhyay S，Herre J，Brown GD，Gordon S.2004 Immunol 112：521-530)的相互作用与合作途径。TLR3和TLR4与TLR7、TLR8和TLR9激动剂协同作用，以在DC中诱导TH1反应；这可以是用于DC刺激的组合码(Napolitani G，Rinaldi A，Bertoni F，Sallusto F，Lanzavecchia A.2005Nat.Immunol.6：749-750)。整合了生成dsRNA(且不需要复制子基因)与CpG优化能力的质粒DNA疫苗的建立预期比甲病毒属载体(其不是优化的基因表达)更有效。更多模式的加入(例如靶向shRNA)使dsRNA反应得以定制；例如，可以合理设计坏死和程序性细胞死亡之间的平衡(综述于Kalai M，Loo GV，Berghe TV，Meeus A，Burm W，Saelens X，Vandenabeele P.2002 Cell Death Differ 9：981-994)来最大化免疫反应。
诱导程序性细胞死亡的dsRNA
细胞质dsRNA活化PKR、RIG1和MDA-5，其诱导干扰素生成，抑制蛋白质合成，从而减少抗原生成，最终导致程序性细胞死亡(综述于Wang和Carmichael，同前，2004)。细胞死亡释放dsRNA，其然后可以被细胞摄取，并通过结合和刺激内体定位的TLR-3来进一步诱导先天免疫反应(综述于Schroder和Bowie，同前，2005)。该类型的dsRNA刺激发生于甲病毒属复制子疫苗。与标准DNA疫苗相比较，甲病毒属复制子(自杀)疫苗使用少100-1000倍的抗原诱导了增强的免疫反应(通过肌肉注射)。这些载体诱导程序性细胞死亡，推测是通过dsRNA的生成，其激活抗病毒途径并最终导致程序性细胞死亡(Leitner等.同前，2000)。细胞死亡是提高的疫苗效力所需要的，并由细胞质复制子dsRNA介导，其通过TLR-3dsRNA识别途径诱导先天免疫。抗细胞凋亡基因(Bcl-XL)的共递送尽管增加了抗原生成，但降低了保护(Leitner等.同前，2003，2004；Matsumoto等.同前2005)。然而，细胞死亡信号和最佳抗原生成之间的递送依赖平衡是需要的，因为自杀DNA疫苗采用基因枪(其靶向树突细胞)递送是无效的，除非包括了抗程序性细胞死亡基因(Kim等.同前2004)。
Toll样受体激动剂
未甲基化的CpG存在于微生物生成的质粒的载体骨架中，并且增强(CpG富集质粒)可用以通过TLR-9刺激TH1反应性先天免疫信号。不幸的是，这些作用仅使用高剂量才观察的到，并且如TH2偏移反应所反映的，通过使用经济低量的抗原的高级递送方法(例如基因枪)的CpG作用是最小的。而且，在人类中对DNA疫苗的总体上差的免疫反应已经部分归因于人类中显著降低的(与小鼠相比)TLR-9表达。
蛋白质(例如鞭毛蛋白)和RNA TLR激动剂可能将以低剂量更有效诱导先天免疫反应，因为来自这些元件的信号从载体(不同于固定的载体组分，例如CpG)被“放大”。理想地，对于在DNA疫苗载体骨架中加入先天免疫诱导物，应该没有相关的获得性免疫反应，获得性免疫反应将由于在先暴露(预存免疫)的个体中的衰减反应而限制重复使用并在群体中产生可变结果。例如甲病毒属复制子载体(其生成dsRNA佐剂)或鞭毛蛋白生成载体含有一种或多种能够诱导针对载体组分的获得性免疫的蛋白质。
免疫刺激RNA
已经鉴定了诱导干扰素反应的富含U或富含U/G的ssRNA TLR7/8激动剂(Heil等，同前，2004；Diebold等，同前，2004；Barchet等，同前，2005)，和通过TLR-7诱导人和小鼠浆细胞样树突细胞生成干扰素的序列特异性siRNA(Hornung等.同前，2005)。已经鉴定了新类免疫刺激核酸，即不需要TLR-3、7、8或9的单链CpG RNA(Sugiyama等，同前)。已经鉴定了活化RNA激活蛋白激酶PKR的RNA适体(apatamer)(Zheng X，Bevilacqua PC.2004 RNA 10：1934-1945)。这些研究使用了外源应用的ssRNA和siRNA。
可以结合程序性细胞死亡诱导元件(其将释放用于活化TLR 3、7或8所必需的内体摄取的RNA；综述于Crozat K，Beutler B.2004 Proc.Natl.Acad.ScL 101：18：6835-6836)来评价诱导先天免疫反应的RNA。然而，在TLR3、7/8或9刺激DNA疫苗的设计和测试中需要考虑小鼠和人之间的TLR表达和免疫学差异(Mestas J.Hughes CCW.2004 J.Immunol.172：2731-2738)。与小鼠相比较，TLR在人类中被差异表达；在人类中，TLR-3强表达于脾CD11c(+)未成熟树突细胞，在成熟后下调，并不由LPS诱导。dsRNA诱导这些细胞生成干扰素α和IL-12。在小鼠中，TLR-3还表达于巨噬细胞，且表达由LPS刺激所诱导。还不知道小鼠和人之间受体表达模式、反应性和免疫学的差异(综述于Mestas和Hughes，同前，2004)将对疫苗在人类中的性能有什么影响。这可以由本发明的RNA元件通过组成表达的细胞质RNA反应元件(例如RIG1或Mda5)的刺激或者TLR途径中下游信号的活化来克服，以避免TLR物种特异性。
虽然dsRNA不是内在靶特异性的(像存在于哺乳动物基因组DNA中的CpG)，但聚I:C在体内诱导了与A：U不同的Th2型作用(Wang L，SmithD，Bot S，Dellamary L，Bloom A，Bot A.2002J Clinical Invest 110：1175-1184)。这表明可以通过筛选各种dsRNA表达元件来选择TH1与TH2偏移，以按需要定制免疫反应。
dsRNA(聚I:C)已经在许多临床实验中用作佐剂，并被认为对于人类使用是安全的(例如，参见Giantonio BJ，Hochster H，Blum R5 WiernikPH，Hudes GR，Kirkwood J，Trump D，Oken MM.2001 Invest.New Drugs19：89-92)。dsRNA负责对病毒感染的炎性反应(例如，见Zare F，BokarweaM，Nenonen M，Bergstrom T，Alexopoulou L，Flavell RA，Tarkowski A.2004JImmunol 172：5656-5663)，并且dsRNA和dsDNA结合蛋白是突出的自身抗原(Satoh M，Shaheen VM，Kao PN，Okano T，Shaw M5 Yoshida H5Richards HB，Reeves WH.1999 J Biol Chem 21 A：34598-34604)，其可以由导入细胞质的任何dsDNA或dsRNA所活化(Suzuki K5 Mori A，Ishii KJ，Saito J5 Singer DS，Klinman DM5 Krause PR5 Kohn LD.1999 Proc NatlAcad Sci 96：2285)。在许多研究中，质粒DNA和dsRNA生成病毒载体还没有诱导临床相关水平的自身抗体。质粒转染的细胞的量是小的，并且预期的dsRNA生成显著小于病毒感染过程中天然出现或使用病毒载体的生成量。因此，我们预期dsRNA生成质粒将显著比其他载体更安全。
RNA适体
已经鉴定了许多通过Toll样受体(TLR)结合活化先天免疫的微生物特异性基序，例如三酰基脂肽(TLR-1/TLR2)肽聚糖(TLR-2)、dsRNA(TLR3)、细菌HSP60或脂多糖(LPS；TLR-4)、鞭毛蛋白(TLR5)、二酰基脂肽(TLR-6)、ssRNA(TLR-7，TLR-80)、未甲基化的CpG DNA(TLR-9)。其他病原体模式识别受体包括NBS-LRR(Nod)家族的细胞内识别单元(例如Nod1、Nod2，其通过特异性肽聚糖基序检测细胞内细菌)和C型凝集素(例如dectin-1、DC-SIGN)。另外，一些先天免疫系统识别过程和分子也识别受损细胞和组织，如胶原凝集素(例如甘露糖结合蛋白、表面活性蛋白A和D、C1q)。而且，可以使用其他信号传导途径的活化剂；例如，TLR和IL-1受体(IL-1R)活化相似的信号传导途径。这些非RNA活化剂中，可以使用本领域已知的方法来选择结合并活化受体的RNA适体。然后，这些适体可作为有效的免疫刺激分子佐剂整合入DNA疫苗骨架，以进一步加强DNA接种。C型凝集素dectin-1与Toll样受体2协同作用，以诱导肿瘤坏死因子(TNF)和白介素12(IL-12)的生成。活化剂的组合码可用以活化多种受体，以累加或协同地增强免疫反应。
而且，双功能适体(两个结合位点)可用于抗原靶向。例如，抗原结合位点与树突细胞靶向位点的整合可用以靶向通过细胞坏死释放的抗原至APC。
DNA靶向优选实施方案
在确定最佳抗原呈递的一个优选实施方案中，使用了靶向pDNAVACCUltra载体进行免疫。本领域中已经确定：改变抗原细胞内定位(例如从细胞质至分泌)或以其他方式靶向抗原呈递途径的融合蛋白改变了所生成的免疫反应(综述于Gurunathan等，同前，2000)。可用以改变融合蛋白的细胞内运输或抗原呈递的优选分子是本领域已知的。几种细胞内靶向序列描述于Williams等，同前2001，并通过引用结合入本文。几种抗原呈递途径靶向分子描述于Leifert等，同前，2004和Lemieux，同前2002，并通过引用结合入本文。表3总结了这些分子中的一些。图5显示了整合有一些靶向分子的本发明的示例性载体。
表3：抗原呈递途径靶向分子
本领域还知道细胞内靶向的效果是抗原特异性，并且需要为每个抗原经验确定为生成期望免疫反应的最佳细胞内目的地。
现有技术中没与预期或教导使用靶向载体家族来确定靶向目的地的最佳组合。而且，现有载体(例如Williams等，同前，2001的那些载体)使用II型限制酶用于克隆，并没有实现靶抗原的精确表达，且没有增加外源序列。这些外源序列可以对表达和定位具有重要作用。
本文公开的pDNAVACCUltra载体实现了为抗原快速确定最佳的细胞内目的地。所述载体被设计以促进基因快速同时克隆入具有相同骨架的多个载体(图3)，特征为针对蛋白质产品的各种细胞内靶向目的地。本文公开的示例性靶向目的地，即i)分泌、ii)分泌膜锚定、iii)内体、iv)细胞质、v)蛋白体或vi)树突，不是穷尽性名单，用于靶向的信号也不是穷尽性的。例如，热休克蛋白(HSP)结构域可以替换pDNAVACCUltra4中的泛素信号，以生成HSP标签的克隆载体。或者，可以使用不同于图5中所列的信号，例如，酪氨酸酶信号序列可替代TPA序列。使用所公开的基因自组装技术或标准克隆方法，本领域技术人员可以想到在所述载体家族中加入和使用其他靶向序列(参见表3，示例靶向序列)。
因为使用标准的II型限制酶克隆位点，现有载体(例如Williams等，同前，2001和Bucht等，同前，2001的那些载体)没有被最佳设计以确定对靶向各种细胞内目的地的抗原的免疫反应。本领域教导载体骨架之间的小序列变化可以改变表达水平(Hartikka等，同前，1996)；已经显示了不同的表达水平影响生成的免疫反应(Zinckgraf和Silbart，同前，2003)。而且，，即使是当这些序列不含导向标记时，从克隆位点或肽标记添加小肽至重组蛋白可以改变蛋白质亚细胞定位(Ramanathan等，同前，2001)。相反，本文公开的载体解决了该问题，因为其是被控制的组，并因II型限制位点不用于克隆而不含有其他外源序列。
本文公开的载体实现了整合有本领域鉴定的任何和全部靶向分子的受控质粒的生成，且不需要经由II型酶克隆位点添加在所述抗原侧翼的其他序列。该载体家族通过确定最佳抗原呈递而具有提高DNA免疫的应用。
在用于提高DNA接种的另一优选实施方案中，通过使用pDNAVACCUltra载体增加基因表达。本文公开的pDNAVACCUltra载体与现有技术描述的载体相比实现了提高的基因表达(图4)。该载体能够用以提高靶基因表达，用于提高免疫反应或提高蛋白质表达的目的(例如用于治疗用途)。
DNA免疫优选实施方案
在用于提高DNA接种的另一优选实施方案中，使用靶向和/或含有RNA元件的载体的组合来提高免疫反应。我们在这里公开了pDNAVACCUltra靶向载体在疫苗开发中的各种用途(RapidVACC图8)。以下讨论的是RapidVACC有关评价靶向质粒组合的用途。各种RNA元件(即，结合提高程序性细胞死亡、免疫刺激等)的评价将使用相同的算法和方法。
本发明的一个目的是优化初次-加强方案中的DNA组分。如通过免疫所确定的，与使用其他载体可获得的免疫反应相比较，利用pDNAVACCUltra载体及其优良表达，结合靶抗原和/或RNA元件的最佳细胞内靶向，可以显著提高免疫反应。
本发明的另一目的是通过优化的DNA初次/DNA加强或仅DNA初次(单次激发)免疫来增强对遗传疫苗的免疫反应。这是长久渴望、长期存在并未解决的需要，因为使用异源载体或蛋白的结合DNA接种虽然有效，但消除了DNA接种的优点(即，成本、安全性、减少的开发时间、减少的工艺过程开发)。RapidVACC是使用本发明的细胞内靶向载体(具有或没有RNA元件)来确定保护性抗原的最佳呈递的疫苗开发过程，其使用本文公开的靶向质粒免疫方法，结合本领域已知的抗原鉴定方法、免疫方法(例如电穿孔、超声、微粒等)和免疫反应评价方法(例如通过干扰素-γ酶联免疫斑点法(ELISPOT)评价T细胞反应，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)和Western印迹法来评价抗体反应，和通过在相关动物激发模型中的生物免疫激发来评价保护性反应)。
本文讨论的RapidVACC的用途不是要限制于基于传统质粒的DNA疫苗载体；本文公开的策略和靶向标签可用于任何非病毒或病毒载体系统，包括但不限于：微环、蠓、噬菌体或单链DNA载体，或者甲病毒属、痘病毒、腺病毒或腺病毒相关的病毒载体。
而且，所述策略可用于替代DNA疫苗载体或修饰的pDNAVACCUltra载体，所述替代DNA疫苗载体按需要被修饰以加入RNA元件和/或实现细胞内靶向(例如VR1012、pCMVKm2、pCpG、pCOR、pVC0396、pcDNA3、pVAX、pCWH24-6、pMAX、甲病毒属复制子载体等)。例如，pDNAVACCUltra载体中的一种或多种模块可以被改变，并且所述载体还可用于RapidVACC优化。不同的启动子(例如SV40、RSV、RSV-CMV、CMV-鸡B肌动蛋白CAG启动子等)前导物(例如CMV内含子1、RNA运出前导物、QB1 SP163翻译增强子、土拨鼠PRE)终止子(例如牛生长激素终止)、原核复制起始点(例如其他pMB1或Co1EI衍生的起始点、CpG减少的起始点、R6K起始点、R质粒起始点、pKL1起始点；参见表4示例的复制起始点，和使用这些复制起始点的载体)，可选的标记(例如可选的抗生素抗性标记(例如zeomycin或可选的卡那霉素抗性、tRNA、平衡致死系统、抑制剂滴定质粒)。而且，可以在RapidVACC优化中使用具有其他元件的质粒，例如Rev基因(以增加一些病毒RNA的核输出)、双顺反表达所需要的元件[第二转录单元、内在核糖体起始序列(IRES)]、免疫增强CpG序列、位点特异性重组系统(例如多聚体分辨系统或微环重组酶位点)或活性分配系统(例如质粒RK2的parA和parB)。图5的示例载体使用相应于靶抗原的起始和终止的ATG和TAA终止密码子，或者用于C末端延伸的GGC连接子密码子。这不是要限制本发明的用途为精确地从起始和种子密码子表达抗原。可以使用编码内在或新密码子的可选地址标记，以便靶抗原通过新的直接键合或通过连接肽而连接至靶向标签。可用以连接抗原至靶向标签的连接肽是本领域公知的。而且，可选的IIS型酶可用于克隆。例如，AarI可替代SapI使用。这将需要改变3b至4bp的地址标签。
表4：复制起始点
*pVC0396是优化载体骨架，用于插入真核表达盒
而且，靶向载体的应用不限于人类接种，其还可以用于动物、鸟类或鱼类疫苗开发。
本领域教导了用于最佳免疫保护的最佳质粒组合将是抗原和递送方法特异性的，并将需要根据每个抗原来确定。本领域没有教导确定最佳呈递的合理方法。
本领域进一步教导了现有混合质粒免疫结果的解释是不确定的，因为这些实例中使用的载体骨架之间的变异可以改变表达水平(Hartikka等，同前，1996)、免疫反应(Zinckgraf和Silbart，同前2003)和亚细胞定位(Rarnanathan等，同前，2001)。
Williams等，同前，2001教导了被设计以促进抗原细胞内靶向的载体的建立。这些载体是没有如本文提出的被用于或考虑用于初次-加强优化或混合的呈递免疫。而且，所述载体在载体骨架间含有变体，并因此不能用于抗原呈递的严格确定。
总之，本领域没有预期或教导使用靶向载体来确定靶向目的地的最佳组合。该新颖的免疫优化策略的应用描述如下。
新颖的DNA初次/DNA加强疫苗组合的确定：
可以通过使用具有一个靶向目的地的DNA疫苗初次免疫和另一疫苗的加强免疫来模仿使用异源载体加强免疫而提高的免疫反应。
最佳的DNA疫苗初次-加强组合可以由本领域技术人员经验确定。例如，使用本发明的具有5个不同靶向目的地的pDNAVACCUltra载体家族，一个DNA初次免疫和一个DNA加强免疫的所有组合可以使用25组来测试(即，分泌抗原可以使用分泌、分泌膜锚定、细胞质、蛋白质组或内体定向的抗原来加强，等等)。
在可获得小动物感染模型的情况下，本领域技术人员可以快速确定最佳免疫组合，因为在初次筛选中仅需要评价25个测试组。
图8中描绘了一个可能的方法，其利用本发明的载体来确定最佳RNA元件(DNA骨架)和初次-加强模式中的抗原呈递。最佳组合可以在初次和加强中使用相同或不同的靶向目的地，以优化免疫反应。
不是要将本申请的范围限制于图5中所示的靶向目的地；本领域技术人员可以使用其他靶向分子增加或更换靶向目的地。靶向分子的实例列于表3。
通过使用影响反应的性质和强度的RNA元件，例如通过控制细胞因子或趋化因子的诱导来改变TH1与TH2偏移(例如促进TH1的IL12、IL18，促进TH2的IL4)，可以针对系统免疫或黏膜免疫、细胞与体液反应、癌症、变态反应或耐受应用来进一步提高或定制疫苗的效力。将根据物种和递送方法(例如电穿孔与基因枪)所靶向的特定细胞类型来优化元件的必要组合。通过来自靶组织的原代细胞的质粒DNA的转染的初期体内评价可用作具有期望功能性的RNA元件的预筛选，以限制用于初期RapidVACC载体骨架筛选的质粒数目(图8)。
优选地，最佳DNA疫苗初次-加强组合可实现异源载体加强免疫的缺失。这将显著提高DNA疫苗的快速部署效能，因为DNA疫苗的开发时间显著短于蛋白质或病毒载体系统的开发时间。这可以包括在初次和加强中使用不同递送系统(如Buchan等，同前，2005所教导的)或者不同的注射部位(如Pavlakis等，同前，2004所教导的)。
DNA蛋白质免疫
已经报道了当质粒DNA与纯化蛋白(对应于所述质粒中编码的蛋白质)(Dalemans等，同前，2003、Carrera等，同前，2004以及Imoto和Konishi，同前，2005)或灭活病毒(Rangarajan等，同前2004)被混合注射时增强的免疫反应。我们推测使用纯化蛋白、灭活病毒或细胞或者细胞提取物结合本发明的一种或多种靶向质粒中编码的抗原的免疫可以进一步增强反应。
混合的呈递免疫
本发明的一个目的是使用“混合的呈递免疫”进一步增强免疫反应，其中通过使用质粒鸡尾酒(其结合2种或多种质粒，各质粒靶向所述抗原至不同的细胞内目的地)的免疫来增强对靶抗原的免疫反应。该两种或多种含有相同抗原(具有不同细胞目的地)的DNA疫苗质粒的新组合可以显著改善免疫反应的性质。使用本发明的载体测试质粒鸡尾酒(结合了2种或多种细胞内靶向目的地的组合)是可行的。
提供最佳免疫反应的呈递模式的组合可以是抗原特异性的。本发明的载体促进合理设计的快速部署疫苗算法，其中通过使用特定载体组合免疫的连续循环来确定最佳的新颖的呈递组合，其为各被选靶抗原提供了比单独靶向目的地更好的免疫反应。图8中描绘了一个可能的方法。
疫苗开发过程包括使用靶向质粒免疫(使用本领域已知的抗原)来鉴定靶向保护抗原。然后通过确定靶向目的地的最佳组合来提高疫苗中抗原的效力，所述确定是通过接种后使用从2种至200种的多种靶向质粒组合的单独或混合呈递免疫，最优选从5种至36种靶向质粒组合。例如，所公开的具有5个不同靶向目的地的pDNAVACCUltra载体系统，存在5种单个目的地质粒组合、10种2个目的地质粒组合、10种3个目的地质粒组合、5种4个目的地质粒组合和1种5个目的地质粒组合(总共36种组合)。载体家族中加入其他靶向目的地将增加组合数目，而目的地的消除将减少组合数目。一旦确定了最佳组合，则使用类似算法为初次和加强步骤确定单次或多次加强接种方案的最佳组合。其不是要限制用于评价不同质粒组合的选项，因为有多种方法可以被本领域普通技术人员使用。例如，在疫苗优化过程中，重要的是在初期评价之后，可以基于抗原对抗原特异性排除一些靶向目的地或目的地组合，以降低多种加强算法的复杂性。如果在初期筛选结果之后初次免疫抗体的数目减少至3，则仅有1-3个质粒的7种可能组合用于测试。或者，可以选择初期筛选中最高反应的组合用于随后的多次加强优化。相同的合理方法用于确定最佳载体骨架(RNA元件评价)。
在可获得小动物感染模型的情况下，本领域技术人员可以快速确定最佳疫苗组合，因为仅构建了5种质粒构建体(使用高通量克隆)，且在初期筛选中仅评价36个测试组。
在初次和加强中不同的靶向质粒组合可以鉴定为最佳。本领域教导了在DNA初次免疫后通过异源载体加强来获得比单独使用异源载体或DNA疫苗更好的免疫保护。这可能归因于不同的抗原呈递，其益处也可以通过混合的呈递免疫来获得。
不是要将本申请的范围限制于本文公开的5种靶向载体；本领域技术人员可以使用其他靶向分子增加或更换靶向目的地。靶向分子的实例列于表3。
本发明的一个目的是优化初次-加强方案中的DNA初次免疫。使用具有优良表达的pDNAVACCUltra载体，结合靶抗原的最佳细胞内靶向组合，可以显著提高免疫反应。
本发明的另一目的是消除对蛋白质或其他异源载体加强免疫以获得足够的免疫反应的需求。这可以包括在初次和加强中使用相同或不同的靶向目的地组合来取代异源载体加强免疫。这将显著提高效用，因为DNA疫苗的发展时间显著短于那些用于蛋白质或病毒载体系统的疫苗。这可以包括在初次和加强中使用不同的递送系统(如Buchan等，同前，2005所教导的)或不同的注射部位(如Pavlakis等，同前，2004所教导的)。
快速部署疫苗(Rapid VA CC)
本发明的一个目的是使用pDNAVACCUltra靶向基因家族来开发用于新病原体的基于DNA的快速部署疫苗(RapidVACC)。一旦基因组序列可以获得，则本发明的载体促进合理设计的快速部署疫苗算法。
在一个实施方案中，通过使用特定载体组合免疫的连续循环确定了为各选择靶抗原和抗原组合提供更高免疫反应的初次-加强免疫的最佳抗原呈递。在该模式中，相同或不同的单个靶向质粒被考虑用于初次和加强免疫。
在另一实施方案中，通过使用特定载体组合免疫的连续循环确定为各选择靶抗原和抗原组合提供了比单个靶向目的地更高免疫反应的最佳的新颖的呈递组合。在该模式中，考虑使用混合模式的免疫评价。
RapidVACC过程包括使用本文公开的靶向质粒免疫方法结合本领域已知的抗原鉴定方法来鉴定保护性抗原。
可以通过本领域公知的方法鉴定RapidVACC中使用的抗原。例如，存在基因组学、生物信息学、转录特征或蛋白组学技术，其实现了高通量筛选保护性表位。可使用生物信息学来鉴定测序基因组中推定的疫苗候选免疫促进T细胞表位。转录特征筛选(例如微阵列分析)被用以通过测定注射后在细胞内表达的所有蛋白来鉴定疫苗靶。转录活性PCR(TAP)产物(线性表达元件)的生成和筛选是产生DNA片段(其在转染入细胞或DNA免疫之后生成靶蛋白)生成的非常高通量的技术。该技术在体外测定(T细胞测定)和体内(即遗传免疫)高通量蛋白组筛选中具有应用(SykesKF，Johnston SA.1999 Nat Biotechnol；17：355-359)。该技术非常适于在全基因组中鉴定候选抗原(抗原效价)，用以进一步分析(即，如本文公开的使用DNA疫苗质粒的保护研究)。
来自细胞内病原体的分泌蛋白和膜结合蛋白可用作足够保护性T细胞表位的来源，以产生有效的多肽DNA疫苗。该假设在几种生物中(例如结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、军团杆菌属(Legionella)和李斯特菌属(Listeria))的研究之后建成模型，其中已经证明多种单个膜蛋白和分泌蛋白含有部分保护性表位，以及根据针对纯化的链球菌(Streptococcus)蛋白的保护性反应的基因组筛选(Wizemann TM，Heinrichs JH，Adamou JE，Erwin AL，Kunsch C，Choi GH，Barash SC，RosenCA，Masure HR，Tuomanen E，Gayle A，Brewah YA，Walsh W，Barren P，LaTH1gra R，Hanson M，Langermann S，Johnson S，Koenig S.2001 InfectImmun；69(3)：1593-1598)。
测序基因组中鉴定的基因中，被分泌或膜分离的亚型可以使用生物信息学来确定。生物信息学程序(例如信号-P)已经用于细菌基因组筛选，以鉴定分泌蛋白。该亚型将是全部基因的15-20％(如果20％，则为50-300个基因)。这是检测保护性表位的可控制的量。例如，已经在基因组水平上证明了有关脑膜炎萘瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的推定分泌蛋白的高通量克隆和表达及纯化，以及用于候选物鉴定的体外和体内测定。该所谓“逆向疫苗学”方法是时间和成本有效的方法，用于将基因组数据应用于疫苗开发(综述于Capecchi B，Serruto D，Adu-Bobie J，Rappuoli R，andPizza M.2004Curr Issues Mol Biol.6：17-27)。可以使用可选的基于蛋白组学的保护性表位鉴定，其利用DNA疫苗质粒而非纯化蛋白，使用高通量克隆外显子进入DNA疫苗载体，并通过表达文库免疫来筛选保护性抗原。鉴定了保护性抗原以后，这些方法中没有一个教导了在疫苗开发过程中优化抗原呈递。
图9中使用了示例RapidVACC保护性抗原优化方案，其利用了DNA疫苗质粒。在该实施例中，选择分泌蛋白用于中和筛选；其不是要限制本申请的技术于分泌抗原。理论上，可以使用该方案快速鉴定在初次和加强免疫中的有效单个蛋白质(图9)或多聚蛋白(未显示)疫苗以及最佳抗原呈递组合。
可以使用表达文库免疫(Barry MA，Lai WC，Johnston SA.1995Nature；377：632-635)方案测试推定抗原的中和作用，其中DNA疫苗免疫原混合物是低复杂性的，且细胞内运输被合理设计以显著增加敏感性。使用pDNAVACCultra高通量抗原运输DNA疫苗质粒的MHCI或MHCII呈递靶向抗原的表达可以比纯化蛋白免疫在检测部分保护性表位(使用该类病原体所预期的)上更有效。
使用pDNAVACCUltra载体筛选保护性蛋白将在单个高通量步骤中产生“金标准”高敏感性保护免疫结果。因此，该方法消除了费时的以排除非保护性T细胞反应性表位的二级筛选。该杂合基因组/蛋白组方法利用基因组学和生物信息学来将用于蛋白组筛选的靶的总数目减少至可控制的数目，以用于被设计以检测部分保护性表位的高敏感性保护筛选。
最终的疫苗制剂可以消除对以获得足够免疫反应的蛋白质或其他异源载体加强免疫的需求。这可以包括在初次和加强免疫中使用相同或不同的靶向目的地组合，以取代异源载体加强免疫。这将显著增强效用，因为DNA疫苗的开发时间显著短于那些用于蛋白质或病毒载体系统的疫苗。这可以包括在初次和加强免疫中使用不同的递送系统(如Buchan等，同前，2005所教导的)。
实施例
本发明方法在下述实施例中被进一步描述。这些实施例通过描述被提供，并不意图以任何方式限制本发明范围。
实施例1：pW2.0的建立
pWizBang2.0
为促进基因和载体的有序、定向组装，我们设计了为模块方法设计了新载体，其中每个DNA片段被指定两个独特的非回文的地址标记。该方法依赖于IIS类限制酶在距离酶切位点处消化的能力。钝化DNA片段(合成dsDNA；PCR扩增子；或平端限制片段)被克隆入新载体PWiz-Bang2.0，并使用IIS类酶AarI(七碱基切割酶，可商业获自Fermentas)或AarI同裂酶来切割DNA，留下4碱基5′-粘性末端。回收所述片段并在单个反应中连接，生成了期望的构建体(图1)。理论上，独特的、非回文的4-碱基末端的使用允许将达121个片段确定地结合在一起。
实施例2：使用基因自组装建立pDNAVACC载体
使用基因自组装技术，通过六个预克隆模块的一步组装建立了DNA疫苗质粒。各模块元件被指定循环阵列位置，提供了启动子、5-前导物/剪切位点、靶基因或高通量克隆位点、终止子和原核复制起始点/选择/位点。单个模块通过4bp的独特、非回文地址标记被指定位置和方向，并克隆入pWiz-Bang2.0。其他特征(例如原核终止子)通过在PCR引物上的5′延伸而被无缝整合入所述模块。
(基因自组装)模块由下述产品组成：
·细菌复制起始点：高拷贝数pUC衍生的复制起始点；
·原核可选择标记基因(卡那霉素；kanR)；
·真核增强子-启动子(CMV或VL30 NVL3；Adams SE，Rathjen PD，Stanway CA等1988 Mol Cell Biol 8：2989-2998)；
·前导物：合成的真核未翻译的前导物-内含子-翻译起始序列(Kozak序列)盒，衍生自兔β-球蛋白前导物和内含子；
·靶向盒：高通量无缝克隆位点靶向基因前导盒(图5)或者含有天然EGFP或TPA分泌的SEAP的对照模块；
·终止子：基于兔β-球蛋白的合成的真核转录终止子
使用Pfu DNA聚合酶(以避免增加额外碱基进入平端片段末端)进行了生成片段的PCR。片段被克隆入pWiz-Bang2.0的SmaI位点，插入片段被测序以在使用AarI释放所述片段、使用T4DNA连接酶结合和转化DH5α感受态细胞之前确认正确的末端。确认了代表性克隆的序列。
回收所述片段并在一个反应中连接，高频率(>90％)生成了期望的构建体。来自六个含有六个连接片段(使用从70bp至2kb的片段的上述模块的排列)的独立反应的15/16分离物生成了期望的构建体，表明了高保真连接的4-碱基悬垂末端。
可以通过使用编码其他靶向肽(参见表3示例)的新盒取代靶向盒来快速生成新的靶向载体。
实施例3：pDNAVACC元件的验证
使用来自gWiz-GFP(Gene Therapy Systems，San Diego CA，USA)(Vical VR1012载体的衍生物(Hartikka等，同前，1996))的相应区域取代pDNAVACC5-EGFP元件，以证实各pDNAVACC区的功能性。使用标准PCR和限制酶克隆方法进行模块和片段交换，并通过限制消化来确认。
i)侧翼区上游的增强子：使用XhoI-SpeI片段取代的XhoI(kanR内部位点)-SpeI(CMV增强子内部位点)片段
ii)启动子-前导物-内含子-Kozak：使用SpeI-SalI(填充的(filled)；恢复SalI位点，见下)取代的SpeI(CMV增强子内部位点)-NcoI(EGFP起始密码子)片段。
a.通过使用来自gWiz-GFP的SalI-BamHI片段取代SalI-BglII片段来用来自g-Wiz-GFP的kozak-GFP取代该克隆内的EGFP。
iii)终止子：使用BamHI-XmnI片段取代的Bglll-Stul片段。
iv)起始点-Kan盒：使用XmnI-XhoI取代的StuI-XhoI(内部kanR位点)片段。
各亲本和交换质粒的EGFP或GFP表达水平大约相等，验证了所述设计并表明外源序列的缺失没有降低表达。
实施例4：起始点的方向和组成显著影响拷贝数
通过缺失分析确定了产生高拷贝质粒生成的pUC起始点的最小尺寸。通过从Qiagen小质粒试剂盒制品获得的质粒的定量确定了质粒拷贝数。通过基因自组装生成了含有核心起始点的衍生物(图2：经由RNaseH切割位点的RNAII启动子)，并发现其具有显著减少的拷贝数。trpA终止子(NotI/StuI消化的，klenow填充并重连的)的去除没有改变拷贝数。至核心起始点的任一侧翼区的添加增加了拷贝数，但各自相对完整的1kb起始点具有减少的拷贝数。
质粒的产率意想不到和显著地改变了原始起始点和kanR基因在同一pDNAVACC载体骨架中的相对彼此的方向(表1)。通过侧翼独特限制位点的两个消化产物的连接反转了kanR和起始点基因的方向(StuI/FspI用于起始点反转，FspI/PmeI用于KanR反转)。
本文确定的最佳方向具有起始点和kanR基因的分支转录，以及在kanR基因后包括了双转录终止子。
实施例5：pDNAVACCUltra
已经通过自发突变或选择突变(在对极端水平的抗生素的温度敏感抗性筛选中)分离了ColEI和pMB1起始点的许多向上拷贝形式。与几种高拷贝数突变体有关的损伤集中于RNAI启动子，但不影响RNAI的转录。甚至，其似乎影响RNAII复制引物二级结构，这可以影响RNAI/RNAII相互作用或者RNAI抑制复制起始的能力(Lin-Chao S，Chen W，Wong T.1992 Mol Micro 6：3385-3393；Fitzwater T，Zhang X，Elble R，Polisky B.1988 EMBO J 7：3289-3297)。普遍使用的pMB1起始点(例如pUC19)或CoIE1起始点(pMM1、pMM7)的向上拷贝衍生物缺失了附属ROP(rom)蛋白，并具有去稳定RNAI/RNAII相互作用的其他改变。对于温度敏感性起始点(例如pUC、pMM1、pMM7)，培养物从30℃至42℃的转移导致了质粒拷贝数增加30至40倍，至每细胞300个拷贝。可能由于氨基酸饥饿状态下的无负荷tRNA结合的额外调控，许多这些衍生物被温度和进入稳定期而被最大地诱导(pMM1、pMM7、pUC)。pMM7被报道在早期对数期的每细胞具有119个拷贝，并在晚期稳定期经历拷贝数的进一步增加(21倍)。在稳定期，pMM7质粒DNA占细胞总DNA的>50％。
通过位点定向诱变在pDNA VACC-EGFP(以上述实施例4中确定的优化的kanR基因起始点方向)载体骨架中构建了一系列嵌合起始点。这些起始点位于pMB1起始点骨架中，其整合了1)pUC起始点突变，2)pMM1起始点突变，3)pMM1+pUC起始点突变，和4)pMM1、pMM7和pUC起始点突变。诱变处理的质粒经序列验证，并在处于中期对数期和稳定期的摇瓶培养物中确定了拷贝数。结果表明1)单独的pMM1比其他三种组合具有显著低的表达2)pMM1+pUC具有类似于处于对数期的pUC和三重组合的表达，但意想不到地在稳定期具有提高的产率。
pDNAVACCultra质粒具有优化的kanR基因-起始点方向(图2)，且具有pUC或pMM1+pUC RNAII突变。这比pDNAVACC(pUC起始点和非最佳kanR基因-起始点方向)增加了2倍的质粒拷贝数(表1)。
实施例6：嵌合启动子生成和评价
增强子-启动子上游的独特限制位点被整合入pDNAVACC载体，以实现嵌合增强子的构建。使用基因自组装构建了含有细胞内靶向EGFP的衍生pDNAVACC和pDNAVACCultra载体(由CMV或VL30启动子驱动)。通过PCR生成了嵌合增强子。PCR引物被设计为含有侧翼限制位点(KpnI和XbaI)。
产物经消化，被克隆入KpnI/XbaI消化的pDNA V ACC-EGFP，并经序列验证。
在使用lipofectamine(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)、Superfect(Qiagen，Valencia，CA，USA)或TROj ene(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL，USA)转染成纤维细胞系(或者人类HT am或鼠PA317)之后24-72小时，使用荧光显微镜检查确定了EGFP的体外表达。
通过异源SV40增强子重复序列(含有NFκB和其他转录因子的结合位点)或5NFκB结合位点的串联体区别增强了CMV和VL30启动子在成纤维细胞中的表达(表2)。使用具有任一启动子的pDNAVACCultra构型的总体表达是较高的。通常，尽管在ultra构型中使用CMV启动子没有观察到体外表达的提高，但SV40增强子的加入提高了表达。
使用pDNAVACCUltraCMV-EGFP或pDNAVACCUltraSV40-CMV-EGFP构建体的转染导致了使用近100％转染的最高表达水平。相对于对照gWIZ-EGFP质粒提高了表达效率。
实施例7：体内表达
在小鼠中测定了SEAP的体内表达。该研究使用了每组4只小鼠，且一个肌肉内剂量的质粒(5ug/20ul)通过电穿孔递送至一个CT(胫骨肌)肌肉。在第4天放血。
构建了pDNAVACCUltraCMV-SEAP和pDNAVACCUltraSV40-CMV-SEAP构建体，并测定了体内表达。结果(图4)表明pDNAVACCUltraCMV-SEAP的表达比gWIZ-SEAP提高了。SV40增强子的加入显著增强了使用5ug剂量的体内表达。
实施例8：质粒稳定性
相对于含有SV40-CMV、CMV、SV40-NVL3和NVL3启动子的pDNAVACC质粒，测定了pDNAVACCUltraCMV-GFP和pDNAVACCUltraSV40-CMV-GFP质粒的稳定性。通过从甘油保藏品质粒的连续培养测定了质粒的稳定性。简单说，从甘油保藏品的LB+卡那霉素中过夜饱和的质粒被认为是第0代(G0)，两个连续10-5稀释液被再次培养至饱和(分别为G20和G40)。在超过40代的研究中没有检测到不稳定性(超螺旋、复制中间体、二聚体形成％)。所有的质粒主要是超螺旋的，且在所有时间点具有非常低水平的缺口质粒或二聚体形成。使用所有pDNAVACC质粒(但非使用pDNAVACCultra质粒)检测到了低水平的复制中间体。
pDNAVACC质粒中SV40增强子的加入意想不到地导致了在甘油保藏中较低的生存力；相反，使用含有SV40的pDNAVACCUltra质粒没有观察到生存力损失。这证明甘油保藏生存力受质粒中元件方向的影响。
实施例9：细胞内靶向
生成了整合有靶向信号(靶向盒；TPA、泛素或LAMP肽前导物和C末端膜锚定标签，如果需要；参见图5)的高通量无缝克隆位点靶向基因前导盒，并使用基因自组装技术整合入pDNAVACCultra载体家族。
pDNAVACCultra1(分泌-内体)
pDNAVACCultra2(分泌)
pDNAVACCultra3(分泌-细胞膜-锚定)
pDNAVACCultra4(蛋白酶体)
pDNAVACCultra5(天然的)
pDNAVACCultra6(细胞膜锚定)
pDNAVACCultra7(内体)
pDNAVACCultra8(分泌-交叉呈递)
所有克隆位点被设计用于高通量克隆应用(图3)，并可在多种载体间相容，实现了在一个步骤中建成几种不同细胞内靶向基因构建体。所述载体家族含有CMV或嵌合SV40-CMV启动子(见下)。这些靶向序列是示例序列，并可以使用具有相似或不同靶向功能的其他靶向序列替代。例如，鼠G76A泛素衍生物被描述用于蛋白体靶向。该残基减少了切割，使融合物作为聚泛素化的靶。去稳定氨基酸(丙氨酸)紧随G76残基后被编码(以确保被切割的产物具有不稳定的N端(如通过N端法则所确定的)，并还被靶向至蛋白质组(Delogu等，同前，2000))。然而，其他物种或泛素衍生物可以被置换入所述载体。
实施例10：高通量克隆
图3描述了pDNAVACC载体的高通量应用实例。在使用SapI(NewEngland Biolabs，Beverly，MA，USA)消化之后，通过使用在末端整合有SapI位点以产生5′ATG和3′TAA或5′ATG和3′GGC的3bp粘性末端的引物从克隆或基因组DNA的扩增拷贝了基因。对于不具有C端延伸的成员(例如泛素，天然的和分泌的)，地址标记准确对应于基因的起始(ATG)和终止(TAA)密码子。对于膜或内体锚定的载体，GCC丙氨酸连接子替代TAA终止子使用，以促进运输(即，GPI或内体靶向)所需要的C端延伸。使用SapI的载体切割产生与被切割的PCR产物相容的粘性末端。因此，插入片段被定向并准确地克隆入所述载体。多数回收的克隆是重组的，因为SapI在亲本载体中产生的粘性末端不是相容的。所述载体和PCR产物的SapI位点被去除，并没有被整合入最终载体。SapI添加至连接反应，以清除未切割或单个切割的亲本载体，选择性地富集重组的转化菌落(该策略可仅用于没有内部SapI位点的插入片段)。靶基因内的SapI位点通常不是有害的，因为内部SapI位点与一个地址标记相匹配的机会仅有1/16。8-96孔(PCR[96-孔梯度封闭])格式可用于高通量应用(PCR、纯化、消化、连接至SapI消化的载体)。
该实施例不是要将克隆限制于SapI的IIS型克隆。还可以使用替代的IIS型酶，例如AarI，其为克隆产生4bp的粘性末端。
替代的克隆策略可用以克隆进入系列载体。例如，PCR引物可以加入修饰的碱基，其实现了所述引物末端碱基的缺失，以产生克隆需要的粘性末端。通过尿嘧啶N转葡萄糖基酶的dU切除(Smith C，Day PJ，WalkerMR.1993 PCR Methods Appl 2：328-32)、通过稀土金属离子的核苷酸切除(Chen GJ，QiuN，Page MP.2002 Biotechniqiies.32：516,518-20)已经用以生成粘性末端。或者，使用具有RNA序列(不能由某一热稳定DNA聚合酶拷贝)的嵌合PCR引物的RNA粘性末端克隆方法，以生成与所述引物的RNA组分序列相同的5′粘性末端(Coljee VW，Murray HL，Donahue WF，Jarrell KA.2000 Nat Biotechnol.18：789-91)。
这不是要成为完全的名单。生成粘性末端短区的各种策略对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
还可以构建并使用具有传统限制酶位点的载体。然而，这样的载体将含有限定所述限制位点的其他序列，并因为其增加了骨架间的可变性而因此是次优选的。
对于该类应用，IIS型克隆比不需要连接的克隆(LIC)更简单。使用IIS类克隆，单个引物对促进了克隆入三个载体，并且两个PCR产物实现了克隆入整个家族。这是因为单个3bp密码子的重叠区可以在所述载体家族中无缝复制。不需要连接的克隆需要载体和插入片段之间更长的互补区(最小10bp；Aslanidis C，de Jong PJ，Schmitz G.1994 PCR Methods Appl.4：172-177)；因此，无缝克隆将需要载体特异性引物的独特组合，以将基因克隆入各运输载体。然而，我预期LIC可用以实施本发明，因为LIC也可以是无缝的。
使用这些载体的高通量应用可以包括基因组的功能性基因组筛选保护性抗原，通过将cDNA或基因组片段高通量克隆入一个或多个载体，以及评价所述载体或载体池在体内的保护性免疫或免疫反应。
实施例11：使用生成免疫刺激RNA的DNA疫苗诱导先天免疫
免疫刺激RNA是本领域公知的。虽然免疫刺激反应可能是物种和细胞类型特异性的，但来自靶组织的原代细胞系的基质转染可用以为每个疫苗/递送组合选择最佳的RNA元件组合。
用于免疫刺激RNA元件的潜在靶是本领域已知的。细胞质dsRNA活化PKR和RIG-1和MDA-5，其诱导干扰素生成、抑制蛋白质合成，从而减少抗原生成，最终导致程序性细胞死亡。RIG-1和MDA-5刺激可以通过TNFα和IL12生成来诱导TH1偏移。
如下证明了RNA元件提高DNA疫苗免疫刺激活性的用途。通过将300bp的鼠U6 Pol III启动子盒连接入亲本载体的平端StuI位点，构建了pDNAVACCultra5-EGFP-mU6和pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6(图2)(分别为pDNAVACCultra5-EGFP和pDNAVACCultra5-EGFP-SV40的衍生物)。所得到的构建体经序列验证。该载体生成了60bp RNA，其包括载体编码的trpA终止子发夹结构。线性载体(NheI/HpaI消化的)经纯化。退火相容性寡核苷酸之后，在U6启动子控制下克隆了RNA元件。(5′平端-3′NheI相容)。5′端的第一碱基是嘌呤，并且是转录的RNA的第一碱基。以终止PolIII转录的一段4-6胸腺嘧啶残基位于NheI位点之前。本领域中描述的许多免疫刺激ssRNA、shRNA和dsRNA元件被克隆入所述载体。如生产商(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)所述，使用lipofectamine2000将浓度为0.4ug质粒/mL的质粒DNA(单独或结合)转染入小鼠巨噬细胞系RAW 267.4、肌肉细胞系C2C12和成纤维细胞系PA317。在培养4小时后除去转染介质，并在24、48和72小时通过荧光显微镜检查确定EGFP的表达。
通过加入U6驱动的RNA元件，在所有转染中检测到了高水平的EGFP表达，并且与亲本载体相比没有减少。这说明了单个DNA疫苗质粒中抗原表达盒与RNA元件的相容性。如生产商(R&D Systems，Minneapolis，MN)所描述的，使用试剂盒在转染后36小时(表5)测定了来自RAW 267.4转染细胞的培养物上清液中的TNFα(预示TH1先天免疫诱导的炎性细胞因子)的水平。与亲本载体相比，RNA元件的加入显著增加了TNFα的表达。如预测的，某一免疫刺激RNA元件具有比基础载体(其转录载体编码的trpA终止子)更强的TNFα诱导。在这里使用0.8ug质粒/mL的RAW 267.4的重复转染中获得了类似的结果，在转染后15小时的测定表明了TNFα的显著诱导(表6)。这说明DNA疫苗载体骨架中免疫刺激RNA元件的加入可以提高载体介导的免疫刺激，且无抗原表达的损失。
表5：RAW264.7细胞系中免疫刺激RNA元件诱导的TNFα生成(转染后36小时)。
| 载体 | RNA元件 | 形式 | TNFα(pg/mL) |
| pDNAVACCultra5-EGFP | 无 | 61 | |
| pDNAVACCultra5-EGFP-SV40 | 无 | 226 | |
| pDNAVACCultra5-EGFP-mU6 | 有 | 载体trpA终止子 | 415 |
| pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6 | 有 | 载体trpA终止子 | 423 |
| pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6-dsRNA2 | 有 | dsRNA | 902 |
| pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6-ssRNA1-4 | 有 | ssRNA(4个质粒) | 908 |
| pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6-shRNA1 | 有 | 647 | |
| pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6-shRNA2 | 有 | 663 | |
| pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6-shRNA3 | 有 | 828 | |
| pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6-shRNA4 | 有 | 具有微RNA环的shRNA发夹结构 | 810 |
| Lipofectamine对照 | 无 | 62 | |
| 未转染的对照 | 无 | 64 |
表6：RAW 264.7细胞系中免疫刺激RNA元件诱导的TNFα生成(转染后15小时)。
| 载体 | RNA元件 | 形式 | TNFα(pg/mL) |
| pDNAVACCultra5-EGFP | 无 | 475 | |
| pDNAVACCultra5-EGFP-mU6 | 有 | 载体trpA终止子 | 3175 |
| pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6-dsRNA2 | 有 | dsRNA | 4386 |
| pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6-ssRNA1-4 | 有 | ssRNA(4个质粒) | 3662 |
| pDNAVACCultra5-EGFP-SV40-mU6-shRNA4 | 有 | 具有微RNA环的shRNA发夹结构 | 5338 |
| Lipofectamine对照 | 无 | 29 | |
| 未转染的对照 | 无 | 26 |
实施例12：使用生成shRNA的DNA疫苗诱导程序性细胞死亡
图10中显示了诱导程序性细胞死亡的shRNA的潜在靶。Arc和Flip高水平表达于骨骼肌中，同时Flip高水平表达于角质化细胞。通过RNA元件的单一基因或这些基因产物的组合的定向减少可用以使摄取了DNA疫苗质粒的细胞对细胞死亡信号变得敏感，以增加细胞死亡。虽然这可能是物种和细胞类型特异性的，但来自靶组织的原代细胞系的基质转染可用以为每个疫苗/递送组合选择最佳的RNA元件组合。
实施例13：使用生成shRNA的DNA疫苗诱导质粒表达
普遍存在的NFκB抑制蛋白(α、β或ε亚基)是NFκB核定位的短半衰期抑制剂。针对一个或多个这些靶的RNA元件生成抑制剂shRNA将导致NFκB活化和核定位，其将同时提高含有表达质粒(例如含有SV40的pDNAVACCUltra质粒)的NFκB位点的核定位和表达。虽然最佳的靶亚基可能是物种和细胞类型特异性的，但来自靶组织的原代细胞系的基质转染可用以为每个疫苗/递送组合选择最佳的RNA元件组合。
实施例14：RapidVACC疫苗开发算法
显示了用于生成和评价抗原特异性DNA疫苗的RapidVACC算法概述(图8)。从靶生物的相关组织预筛选原代细胞可用以筛选和选择包括在第一轮中的最佳RNA元件。第一轮是评价含有质粒的RNA元件的程序性细胞死亡、先天免疫刺激和最终提高的免疫反应。尽管这里显示了一论优化，但初期可进行两或多个循环以通过结合来自初期筛选的有希望的元件进一步优化RNA表达盒。一旦载体骨架被锁定(里程碑1)，则各附加循环的动物研究优化(例如呈递优化、混合呈递优化)可附加地或协同地提高疫苗性能，并且最终的疫苗性能不仅仅依赖于单一参数的成功。因为骨架和呈递是确定的，其开发时间将显著较短(2-3周来制备和生产疫苗)。一旦开发了平台，则显示了针对新抗原的标准开发时间线(使用现有的快速动物模型)，且没有加速(图8)。
最佳呈递预期是抗原和递送特异性的。电穿孔靶向肌细胞，并可能通过交叉呈递将用于免疫呈递的抗原递送至APC。这可能最好需要供体细胞中分泌的和/或稳定的蛋白，以及细胞死亡，以引起和刺激APC。对于靶向树突细胞的基因枪，直接初次免疫可能是主要的抗原呈递模式，并且蛋白体和/或内体定向抗原(分别对提高的MHCI或MHCII呈递)可能是最佳的。针对各模式而优化的质粒组合可以最终提供更好的保护。例如，表达天然、树突和蛋白体靶向的SIV抗原的载体的组合在猕猴中提供了更好的保护(Rosati等，同前，2005)；使用编码细胞质和泛素结合的乳头瘤病毒衣壳基因的混合质粒观察到了类似的提高(Liu等.同前，2001)。
归根结底，dsRNA、ssRNA和/或诱导程序性细胞死亡的shRNA的组合可以提供比这里评价的初始单一组分载体更好的先天免疫反应。由于pol III转录单元的小尺寸，多种组分可最终被整合入最终的疫苗。而且，由于考虑了超过一种质粒的组合疫苗(与流感一样，其中可以结合超过一种的抗原表达质粒)，各质粒上可以存在不同的组分。
本发明的结论、分支和范围
因此，读者将理解，本发明的遗传疫苗通过使用载体编码的靶向分子提供了合理的遗传免疫优化方法。
虽然以上描述含有许多特定性，但这些不应该解释为对本发明范围的限制，而应解释为其一个优选实施方案的举例说明。许多其他变化是可能。例如，MDA5、RIG-1和PKR激活免疫刺激RNA元件可以与编码shRNA以抑制LGP2(RIG-1和MDA5的sdRNA免疫刺激的抑制剂)的抑制RNA元件和/或PKR抑制剂相结合。这将最大化免疫刺激，同时预防PKR介导的抗原表达的抑制。其他抑制RNA元件可以被加入以在非免疫细胞中选择性诱导程序性细胞死亡，以提高抗原交叉呈递或影响TH1与TH2偏移。
因此，本发明的范围不应该由所述实施方案来确定，而是由所附权利要求及其法律等同替代所确定。
Claims (38)
1.一种用于调节个体对表达载体的反应的方法，该方法包括以下步骤：
a.将一个或多个编码蛋白质或肽的基因克隆入含有一个或多个RNA元件的表达载体，和
b.递送所述表达载体至真核细胞，和
c.评价载体递送后的基因表达或免疫反应或保护，
从而所述RNA元件的使用实现了提高的基因表达和/或提高的免疫反应。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述载体是非病毒载体。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述载体是质粒。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述载体是pDNAVACCUltra质粒。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA元件选自：免疫刺激RNA、促进程序性细胞死亡的RNA、抑制程序性细胞死亡的RNA、促进坏死细胞死亡的RNA、促进质粒核定位的RNA、促进启动子表达的RNA、结合配体的RNA、钝化基因的短发夹RNA、促进抗原交叉呈递的RNA、改变细胞表达以定制和增强蛋白质表达或免疫反应的其他RNA或其组合。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA元件用以避免生成至少一种获得性免疫反应。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA元件用以促进一种或多种先天免疫反应。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA元件用以预防插入诱变和/或避免恶性转化。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA元件与一种或多种转录物结合以改变超过一种细胞功能或途径。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA元件选自生成下述物质的那些RNA元件：单链RNA、双链RNA、发夹RNA、微RNA、RNA适体或核酶或其组合。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述个体是哺乳动物、鸟或鱼。
13.一种用于确定引发免疫反应的靶抗原组合物的方法，该方法包括以下步骤：
a.将靶抗原克隆入含有两种或多种表达载体的载体家族，所述表达载体各自为所述抗原指定了不同的细胞内靶向，和
b.使用1种或多种载体的混合物初次免疫，且
c.使用1种或多种载体的混合物加强免疫，其中各组在所述初次免疫中接受第一载体，并在所述加强免疫中接受相同或不同的载体，和
d.评价免疫后的免疫反应或保护，
从而所述载体家族的使用实现了引发免疫反应的抗原组合物的快速确定。
14.如权利要求13所述的方法，其中在初次免疫或加强免疫中使用了两种或多种载体的混合物。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述载体是非病毒载体。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述载体是质粒。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述载体家族靶向抗原至i)分泌的，ii)分泌-膜锚定的，iii)细胞内，iv)内体，v)增强的蛋白体加工或vi)交叉呈递的目的地。
19.如权利要求13所述的方法，其中所述分泌通过所述抗原的天然分泌信号、TPA或其他分泌信号所指定。
20.如权利要求13所述的方法，其中所述初次免疫和加强免疫使用不同的递送方法。
21.如权利要求13所述的方法，其中进行多次加强免疫。
22.如权利要求13所述的方法，其中所述个体是哺乳动物、鸟或鱼。
23.一种关于DNA疫苗质粒的组合物，该组合物包括：
a.pMB1或CoIE1衍生的可操作连接至卡那霉素抗性基因的复制起始点，
其中各单元的转录是分支的，从而与其他方向相比，提高了细菌培养物中的质粒产率。
24.一种关于DNA疫苗质粒的组合物，该组合物包括真核启动子-卡那霉素抗性基因方向，其中各单元的转录是分支的，从而与其他方向相比，增强了真核细胞中的靶基因表达。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述真核启动子选自NVL3和CMV。
26.一种关于DNA疫苗质粒的组合物，该组合物包括：
a.pMB1或CoIE1衍生的可操作连接至卡那霉素抗性基因的复制起始点，
b.真核启动子，
c.位于所述真核启动子上游的SV40增强子，
其中所述真核启动子-SV40增强子-卡那霉素抗性基因的方向是以便所述真核启动子和所述卡那霉素抗性基因的转录是分支的，从而与其他方向相比，提高了从真核启动子的表达、甘油保存的存活力和/或复制中间体的生成。
27.如权利要求26所述的DNA疫苗质粒组合物，其中所述真核启动子选自CMV和NVL3。
28.如权利要求26所述的组合物，其中其用以诱导免疫反应。
29.如权利要求26所述的组合物，其中其被调节以允许抗原细胞内靶向。
30.如权利要求26所述的组合物，其中其被调节以允许筛选或选择特定类型的抗原表达或呈递，包括下述组的任一个或全部：分泌、膜锚定的、内体的、蛋白体的、分泌的、细胞质的或交叉呈递的目的地、或上述的组合。
31.如权利要求26所述的组合物，其中其被调节以包括RNA元件。
32.一种减少不期望的质粒或细胞系性质的方法，该方法包括：改变1种或多种质粒元件的方向或组成，及比较不同方向或组成的效果。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述不期望的质粒或细胞系性质选自：低百分比的超螺旋、高百分比的二聚体形成、高复制中间体生成或低温保藏过程中的低存活。
34.一种将基因克隆入超过一种的真核表达载体的方法，各载体为抗原指定了不同的细胞内靶目的地，其通过：
a.使用与超过一种的载体相容的引物PCR扩增所述基因，和
b.将所述PCR产物克隆入超过一种的载体。
35.如权利要求34所述的方法，其中通过IIS型限制酶消化所述PCR产物和所述靶向载体来完成所述PCR产物克隆。
36.如权利要求34所述的方法，其中通过传统的II型限制酶消化所述PCR产物和所述靶向载体来完成所述PCR产物克隆。
37.如权利要求34所述的方法，其中通过不依赖连接的克隆来完成所述PCR产物克隆。
38.一种包含DNA复制起始点的物质的组合物，该组合物包括：
a.pMB1的复制起始点；含有
b.pUC突变；和
c.pMM1突变，
其中所述pUC和pMM1突变的组合用以诱导摇瓶培养物稳定期中较高拷贝数和较高生产率。
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