JP2023543154A - 筋特異的ハイブリッドプロモーター - Google Patents

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Abstract

【要約】本開示は、筋組織又は筋細胞における高度でかつ持続的な発現を達成するのに有用な筋特異的エンハンサー及びプロモーターの新規組み合わせを提供する。筋特異的プロモーターエレメントは、デスミンプロモーターに由来する。筋特異的エンハンサーエレメントは、デスミンプロモーター及び筋クレアチンキナーゼエンハンサーに由来する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０２０年９月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／０７７，３３９号に対する優先権を主張する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０２１年９月１０日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、８５５３５－３２８４０８＿ＳＬ．ｔｘｔという名前が付けられ、サイズは４８，９２０バイトである。
ＣＭＶ、ＥＦ１、又はＣＡＧなどのユビキタスプロモーターは、遺伝子産物の標的発現を可能にしない。これは、非標的組織における発現と関連した有害な副作用をもたらす可能性がある。例えば、抗原提示細胞における発現は、導入遺伝子に対して不都合な免疫応答をもたらし得る（Ｗｅｅｒａｔｎａ ＲＤ，Ｗｕ Ｔ，Ｅｆｌｅｒ ＳＭ，Ｚｈａｎｇｅ Ｌ，Ｄａｖｉｓ ＨＬ，２００１ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１８７２）。
筋組織では、筋特異的発現ベクターの使用によってオフターゲット発現問題を回避することができるが、筋特異的プロモーターを含有するベクターからの導入遺伝子発現レベルが低いことで、これらのベクターの細胞及び遺伝子治療の適用が制限される。
したがって、細胞及び遺伝子治療のための筋特異的発現ベクターに組み込まれ得る筋特異的プロモーター及びエンハンサーエレメントが必要とされる。
本開示は、筋特異的調節核酸配列を使用する、筋細胞における導入遺伝子の発現のための組成物及び方法を提供する。
本発明の主な目的は、筋細胞及び筋組織における高レベルの導入遺伝子発現のために最適化された発現ベクターを提供することである。
本発明の主な目的は、筋細胞及び筋組織における持続的な導入遺伝子発現のために最適化された発現ベクターを提供することである。
本発明の主な目的は、非筋組織における低い導入遺伝子発現のために最適化された発現ベクターを提供することである。
本発明の主な目的は、低いＣｐＧ対ＧｐＧジヌクレオチド比のために最適化された発現ベクターを提供することである。
本発明の別の目的は、多種多様な非ウイルス及びウイルス発現ベクター型を使用して、筋細胞及び筋組織における高レベルでかつ持続的な発現レベルを指示し得るエンハンサー／プロモーターの組み合わせを提供することである。
これらの目的は、デスミン筋特異的プロモーター及びデスミン筋特異的エンハンサー並びにＭＣＫ筋特異的エンハンサーを組み合わせて、筋細胞及び筋組織における導入遺伝子発現を駆動するハイブリッドプロモーターを提供することによって達成される。得られるハイブリッドプロモーターは、筋細胞及び遺伝子療法に有用である。本発明の様々な筋特異的ハイブリッドプロモーターは、限定としてではなく例として、エピソーム又は組み込みプラスミド、ナノプラスミド、ミニサークル、Ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ、ＭＩＤＧＥ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、及びレンチウイルスベクターからの、培養細胞又は組織における筋特異的導入遺伝子発現のために使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、作動可能に連結されている、哺乳類デスミンプロモーター、哺乳類デスミンエンハンサー、及び１つ以上の哺乳類筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）エンハンサーを含む、筋特異的調節核酸配列が提供される。
いくつかの実施形態では、本開示の筋特異的調節核酸配列を含むベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、本開示のベクターを含む宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、真核細胞において導入遺伝子を発現させるための方法は、真核細胞を本開示のベクターでトランスフェクトする工程を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のベクターを複製するための方法であって、宿主細胞を本開示のベクターで形質転換し、ベクターを複製するのに十分な条件下で細胞をインキュベートする工程を含む、方法が提供される。
本発明及びその利点のより完全な理解のために、以下の説明を添付の図面と併せて参照する。
ＮＴＣ８６８５－ＥＧＦＰナノプラスミドのベクターマップを示す。 ＮＴＣ８６８５－３ｘＭＣＫｅｎｈ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰナノプラスミドのベクターマップを示す。 ＮＴＣ８６８５－３ｘＭＣＫｅｎｈ－ＭＣＡＴ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰナノプラスミドのベクターマップを示す。 ＮＴＣ８６８５－Ｃ５－Ｃ１２－ＥＧＦＰナノプラスミドのベクターマップを示す。 ＮＴＣ８６８５－３ｘＭＣＫｅｎｈ－Ｃ５－Ｃ１２－ＥＧＦＰナノプラスミドのベクターマップを示す。 ＮＴＣ８６８５－３ｘＭＣＫｅｎｈ－ＭＣＡＴ－Ｃ５－Ｃ１２－ＥＧＦＰナノプラスミドのベクターマップを示す。 ＮＴＣ８６８５－３ｘＭＣＫｅｎｈ－ＭＣＫ－ＥＧＦＰナノプラスミドのベクターマップを示す。 ＮＴＣ８６８５－３ｘＭＣＫｅｎｈ－ＭＣＡＴ－ＭＣＫ－ＥＧＦＰナノプラスミドのベクターマップを示す。 ＮＴＣ８６８５－デスミン－ＥＧＦＰナノプラスミドのベクターマップを示す。 ｐＶＡＸ１－ＥＧＦＰナノプラスミドのベクターマップを示す。 ＨＥＫ２９３細胞におけるＥＧＦＰ発現結果を示す。 Ｃ５－Ｃ１２筋管におけるＥＧＦＰ発現結果を示す。 筋特異的調節核酸配列が配列番号３５を有し、ナノプラスミド骨格が配列番号２７を有するベクターマップを示す。 筋特異的調節核酸配列が配列番号３６を有し、ナノプラスミド骨格が配列番号２７を有するベクターマップを示す。 筋特異的調節核酸配列が配列番号３５を有し、ナノプラスミド骨格が配列番号２８を有するベクターマップを示す。 筋特異的調節核酸配列が配列番号３６を有し、ナノプラスミド骨格が配列番号２８を有するベクターマップを示す。 筋特異的調節核酸配列が配列番号３５を有し、ナノプラスミド骨格が配列番号２８を有するベクターマップを示す。 筋特異的調節核酸配列が配列番号３５を有し、ナノプラスミド骨格が配列番号２８を有するベクターマップを示す。 筋特異的調節核酸配列が配列番号３６を有し、ナノプラスミド骨格が配列番号２８を有するベクターマップを示す。 重鎖について第１の筋特異的調節核酸配列が配列番号３５を有し、軽鎖について第２の筋特異的調節核酸配列が配列番号３６を有し、ナノプラスミド骨格が配列番号２８を有する、二重プロモーターベクターマップを示す。 筋特異的調節核酸配列が配列番号５６を有し、ナノプラスミド骨格が配列番号２７を有するベクターマップを示す。 筋特異的調節核酸配列が配列番号５６を有し、ナノプラスミド骨格が配列番号２８を有するベクターマップを示す。 筋特異的調節核酸配列が配列番号５７を有し、ナノプラスミド骨格が配列番号２８を有するベクターマップを示す。 重鎖について筋特異的調節核酸配列が配列番号５６を有し、軽鎖について筋特異的調節核酸配列が配列番号５８を有し、ナノプラスミド骨格が配列番号２７を有する、二重プロモーターベクターマップを示す。 ルシフェラーゼ発現によって決定されるトランスフェクション効率を示す。骨格筋におけるＮａｎｏｔａｘｉ（登録商標）ルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ投与は、高いルシフェラーゼ発現をもたらす。スイスマウスに、Ｎａｎｏｔａｘｉ（登録商標）で製剤化された異なるプラスミドＤＮＡ１０μｇをＤ０で筋肉内注射した。７日目に、注射した筋肉を採取し、それらのルシフェラーゼ発現について分析した。記号は、注射した個々の筋肉を表し、水平棒は、両側に注射した５匹のマウス群の平均及びＳＥＭを表す。
本開示は、筋特異的調節核酸配列を使用する、筋細胞における導入遺伝子の発現のための組成物及び方法と、当該筋特異的調節核酸配列を含有するベクターを複製するための方法と、を提供する。
定義
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明白に別途指示されない限り、複数の指示対象を含む。
特許請求の範囲及び本開示における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すよう明示的に示されない限り、又は代替物が互いに排他的である場合を除き、「及び／又は」を意味するように使用される。
「約」という用語の使用は、数値とともに使用される場合、＋／－１０％を含むことが意図される。限定としてではなく例として、ヌクレオチドの数が約２００と特定される場合、これは、１８０～２２０（プラス又はマイナス１０％）を含む。
本明細書で使用される場合、「ｃｍｖ」又は「ＣＭＶ」は、サイトメガロウイルスを指す。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルスベクター」は、分裂細胞及び非分裂細胞に感染し得る組み込みウイルスベクターを指す。レンチウイルストランスファープラスミドとも呼ばれる。プラスミドは、レンチウイルスＬＴＲ隣接発現ユニットをコードする。トランスファープラスミドは、ウイルス粒子を作製するために必要なレンチウイルスエンベロープ及びパッケージングプラスミドとともに、産生細胞にトランスフェクトされる。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルスエンベロープベクター」は、エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルスパッケージングベクター」は、レンチウイルストランスファーベクターをパッケージングするのに必要なｇａｇ、ｐｏｌ、及びＲｅｖ遺伝子機能を発現させる１つ又は２つのプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「ミニサークル」は、インビボ又はインビトロ部位特異的組換え又はインビトロ制限消化／ライゲーションによって細菌領域が親プラスミドから除去された共有結合閉環状プラスミド誘導体を指す。ミニサークルベクターは、細菌細胞では複製能力がない。
本明細書で使用される場合、「ナノプラスミド（商標）ベクター」又は「ナノプラスミド」は、ＲＮＡ選択可能マーカーをＲ６Ｋ、ＣｏｌＥ２、又はＣｏｌＥ２－関連複製起点などの細菌複製起点と組み合わせるベクターを指す。例えば、ナノプラスミドベクターは、限定としてではなく例として、ＮＴＣ９３８５Ｃ、ＮＴＣ９６８５Ｃ、ＮＴＣ９３８５Ｒ、ＮＴＣ９６８５Ｒベクター、及びＷＯ２０１４／０３５４５７に記載の改変型を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ＮＴＣ８シリーズ」は、ｋａｎＲなどの抗生物質耐性マーカーの代わりに短いＲＮＡ（ＲＮＡ－ＯＵＴ）選択可能マーカーを含有する、抗生物質フリーのｐＵＣ起点ベクターである、ＮＴＣ８３８５、ＮＴＣ８４８５及びＮＴＣ８６８５プラスミドなどのベクターを指す。これらのＲＮＡ－ＯＵＴベースの抗生物質フリーベクターの作成及び適用は、ＷＯ２００８／１５３７３３に記載されている。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルスベクター」は、分裂細胞に感染し得る組み込みウイルスベクターを指す。トランスファープラスミドとも呼ばれる。プラスミドは、レトロウイルスＬＴＲ隣接発現ユニットをコードする。トランスファープラスミドは、ウイルス粒子を作製するために必要なエンベロープ及びパッケージングプラスミドとともに、産生細胞にトランスフェクトされる。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルスエンベロープベクター」は、エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルスパッケージングベクター」は、レトロウイルストランスファーベクターをパッケージングするために必要なレトロウイルスｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子をコードするプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」又は「形質転換」は、当該技術分野において既知であり、参照により本明細書に含まれるように、核酸を細胞に送達するための方法［例えば、ポリ（ラクチド－コグリコライド）（ＰＬＧＡ）、ＩＳＣＯＭ、リポソーム、ニオソーム、ビロソーム、ブロックコポリマー、プルロニック(登録商標)ブロックコポリマー、キトサン、及び他の生分解性ポリマー、マイクロ粒子、マイクロスフィア、リン酸カルシウムナノ粒子、ナノ粒子、ナノカプセル、ナノスフィア、ポロキサミンナノスフィア、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、圧電透過化、ソノポレーション、イオントフォレシス、超音波、ＳＱＺ高速細胞変形媒介膜破壊、コロナプラズマ、プラズマ促進送達、組織耐性プラズマ、レーザーマイクロポレーション、衝撃波エネルギー、磁場、非接触磁気透過化、遺伝子銃、マイクロニードル、マイクロダーマブレイジョン、流体力学的送達、高圧尾静脈注射など］を指す。
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」は、標的生物における発現のためにベクター内にクローニングされる目的の遺伝子を指す。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ウイルス（例えば、アルファウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルスなど）及び非ウイルス（例えば、プラスミド、ＭＩＤＧＥ、転写活性ＰＣＲ断片、ミニサークル、バクテリオファージ、ナノプラスミド（商標）など）ベクターを含む、遺伝子送達ビヒクルを指す。これらは、当該技術分野において周知であり、参照により本明細書に含まれる。
本明細書で言及される「Ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ」は、酵素的に産生されたキャップされた線形ベクターである、最小限の閉鎖線形ＤＮＡ構築物である。
本明細書で言及される「ＭＩＤＧＥ」は、小さい線形の共有結合的に閉鎖されたダンベル形状の分子である、最小限の、免疫学的に定義された遺伝子発現ベクターである。
配列同一性パーセントを決定するために、本開示において理解されるように、クエリー配列（例えば、核酸配列）は、当該技術分野において周知である任意の好適な配列アラインメントプログラム、例えば、核酸配列のアラインメントがそれらの全長にわたって行われることを可能にするコンピュータプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（バージョン１．８３、デフォルトパラメータ）を使用して、１つ以上のサブジェクト配列にアラインメントされる（グローバルアラインメント）。Ｃｈｅｍａ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１：３４９７－５００。好ましい方法では、配列アラインメントプログラム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ）は、クエリー配列と１つ以上のサブジェクト配列との間の最良の一致を計算し、同一性、類似性、及び差異を決定することができるようにそれらをアラインメントする。１つ以上のヌクレオチドのギャップは、配列アラインメントを最大化するために、クエリー配列、サブジェクト配列、又はその両方に挿入することができる。
筋特異的調節核酸配列
いくつかの実施形態では、作動可能に連結されている、哺乳類デスミンプロモーター、哺乳類デスミンエンハンサー、及び１つ以上の哺乳類筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）エンハンサーを含む、筋特異的調節核酸配列が提供される。
前述の実施形態のいずれかでは、哺乳類デスミンプロモーター、哺乳類デスミンエンハンサー、及び１つ以上のＭＣＫエンハンサーは、ヒト又はマウスであり得る。哺乳類デスミンプロモーター、哺乳類デスミンエンハンサー、及び１つ以上のＭＣＫエンハンサーは、これらの核酸配列が既知の方法及び検索ツールを使用して決定され得るように、任意の哺乳類種に由来し得ることを理解されたい。限定としてではなく例として、哺乳類デスミンプロモーター、哺乳類デスミンエンハンサー、及び１つ以上のＭＣＫエンハンサーは、ヒト、マウス、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、又は霊長類源に由来し得る。哺乳類デスミンプロモーター、哺乳類デスミンエンハンサー、及び１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーの各々の起点が、異なるか又は同じであり得ることを更に理解されたい。デスミンエンハンサー又は複数の哺乳類ＭＣＫエンハンサーが筋特異的調節核酸配列に含まれる場合、複数のエレメントの各々が、同じ又は異なる起点からであり得ることを更に理解されたい。限定としてではなく例として、筋特異的調節核酸配列は、全てがヒト若しくはマウスであるか、又はヒトデスミンプロモーター、ヒトデスミンエンハンサー、及び１つ以上のマウスＭＣＫエンハンサーなどのヒト及びマウスエレメントの任意の組み合わせである、哺乳類デスミンプロモーター、哺乳類デスミンエンハンサー、及び１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーを含み得る。好ましい実施形態では、筋特異的調節核酸配列は、マウスデスミンエンハンサー及びマウスデスミンプロモーターと組み合わせた１つ以上のマウスＭＣＫエンハンサー、又はヒトデスミンエンハンサー及びヒトデスミンプロモーターと組み合わせた１つ以上のマウスＭＣＫエンハンサーを含み得、より好ましくは、ヒトデスミンエンハンサー及びヒトデスミンプロモーターと組み合わせたマウスＭＣＫエンハンサーの３つのコピーを含み得る。哺乳類デスミンプロモーター、哺乳類デスミンエンハンサー、及び１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーは、全長であり得るか、又は切断され得るが、但し、切断がエレメントの機能の少なくとも一部分を維持し、例えば切断された哺乳類デスミンプロモーターが、下流導入遺伝子の発現によってアッセイされるときにプロモーター活性を依然として有することを更に理解されたい。
前述の実施形態のいずれかでは、哺乳類デスミンプロモーターがヒトである場合、哺乳類デスミンプロモーターは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０のいずれかと８０％以上の同一性を有する核酸配列を含み得る。限定としてではなく例として、哺乳類デスミンプロモーターは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、哺乳類デスミンプロモーターは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０のいずれかの配列を含む。
前述の実施形態のいずれかでは、哺乳類デスミンプロモーターがマウスである場合、哺乳類デスミンプロモーターは、配列番号４及び配列番号５のいずれかと８０％以上の同一性を有する核酸配列を含み得る。限定としてではなく例として、哺乳類デスミンプロモーターは、配列番号４及び配列番号５のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、哺乳類デスミンプロモーターは、配列番号４又は配列番号５の配列を含む。
前述の実施形態のいずれかでは、哺乳類デスミンプロモーターは、ＩＮＲ配列を含み得る。限定としてではなく例として、イニシエーターエレメントを含むＩＮＲ配列は、配列番号５９の核酸配列であり得る。限定としてではなく更なる例として、ＩＮＲ配列は、介在配列によって分離された核酸配列ｔａｔａａａａ及び核酸配列ｙｙａｎｗｙｙを含み得、任意選択的に、ｙｙａｎｗｙｙの下流にある下流配列を含み得る。イニシエーターエレメントが、例として、ｔｃａｇｔｃｃであり得るｙｙａｎｗｙｙのコンセンサス配列を含み得ることを理解されたい。限定としてではなくまた更なる例として、介在配列は、長さが約２０～約２５ヌクレオチド、例えば、約２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチドであり得る。限定としてではなくまた更なる例として、下流配列は、任意の好適な長さを有し得る。
前述の実施形態のいずれかでは、筋特異的調節核酸配列は、２つ以上の哺乳類デスミンエンハンサーを含み得る。例として、筋特異的調節核酸配列は、１、２、３、４、５つ以上の哺乳類デスミンエンハンサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、筋特異的調節核酸配列は、１つの哺乳類デスミンエンハンサーのみを含み、すなわち、筋特異的調節核酸配列は、２つ以上の哺乳類デスミンエンハンサーを含まない。
前述の実施形態のいずれかでは、哺乳類デスミンエンハンサーは、配列番号３又は配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含み得る。限定としてではなく例として、哺乳類デスミンエンハンサーは、配列番号３又は配列番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、哺乳類デスミンエンハンサーは、配列番号３の配列を含む。いくつかの実施形態では、哺乳類デスミンエンハンサーは、配列番号６の配列を含む。
前述の実施形態のいずれかでは、筋特異的調節核酸配列は、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーを含み得る。限定としてではなく例として、筋特異的調節核酸配列は、２つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサー、１～３つの哺乳類ＭＣＫエンハンサー、１、２、３、４、５つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーを含み得る。１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーが、連結配列によって分離され得るか、又は例えば、デスミンエンハンサー若しくはデスミンプロモーターによって、又は導入遺伝子によって、２つ以上存在する場合にその間に他のエレメントを有し得ることを理解されたい。限定としてではなく例として、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーは、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０ヌクレオチドによって分離され得る。１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーが、哺乳類デスミンプロモーター又は哺乳類デスミンエンハンサーによって分離され得ることを更に理解されたい。
前述の実施形態のいずれかでは、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーの各々は、配列番号１１（マウスＭＣＫエンハンサー）又は配列番号１２（ヒトＭＣＫエンハンサー）と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含み得る。限定としてではなく例として、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーは、配列番号１１又は配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーは各々、配列番号１１又は配列番号１２の配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーの各々は、限定としてではなく例として、配列番号１のＭＣＫ ＣＫ７エンハンサーなどのＭＣＫ ＣＫ７エンハンサーであり得る。限定としてではなく更なる例として、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有し得る。
前述の実施形態のいずれかでは、筋特異的調節核酸配列は、１つ以上の追加のエンハンサーを更に含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加のエンハンサーは各々、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６のいずれかと８０％以上の同一性を有する核酸配列を含む。限定としてではなく例として、１つ以上の追加のエンハンサーの各々は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加のエンハンサーは各々、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６のいずれかの配列を含む。
いくつかの実施形態では、筋特異的調節核酸配列は、その唯一のエンハンサーとして、哺乳類デスミンエンハンサー及び１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、筋特異的調節核酸配列は、１つ以上の追加のエンハンサーを含まない。いくつかの実施形態では、筋特異的調節核酸配列は、脊椎動物トロポニンＩ ＩＲＥ（ＦＩＲＥ）エンハンサーを含まない。
前述の実施形態のいずれかでは、筋特異的調節核酸配列は、イントロンを更に含み得る。前述の実施形態のいずれかでは、イントロンは、哺乳類デスミンプロモーターに対して３’に位置付けられ得る。任意の好適なイントロンを使用することができる。前述の実施形態のいずれかでは、イントロンは、配列番号１７又は配列番号１８と８０％以上の同一性を有する核酸配列を含み得る。限定としてではなく例として、イントロンは、配列番号１７又は配列番号１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、イントロンは、配列番号１７又は配列番号１８の配列を含む。前述の実施形態のいずれかでは、イントロンは、約１００～約１０，０００ヌクレオチドのサイズを有し得る。限定としてではなく例として、イントロンは、約１００～約１０，０００ヌクレオチド、約１００～約９，０００ヌクレオチド、約１００～約８，０００ヌクレオチド、約１００～約７，０００ヌクレオチド、約１００～約６，０００ヌクレオチド、約１００～約５，０００ヌクレオチド、約１００～約４，０００ヌクレオチド、約１００～約３，０００ヌクレオチド、約１００～約２，０００ヌクレオチド、約１００～約１，０００ヌクレオチド、約１００～約５００ヌクレオチド、約１００～約４００ヌクレオチド、約１００～約３００ヌクレオチド、約１００～約２００ヌクレオチド、約２００～約１０，０００ヌクレオチド、約２００～約９，０００ヌクレオチド、約２００～約８，０００ヌクレオチド、約２００～約７，０００ヌクレオチド、約２００～約６，０００ヌクレオチド、約２００～約５，０００ヌクレオチド、約２００～約４，０００ヌクレオチド、約２００～約３，０００ヌクレオチド、約２００～約２，０００ヌクレオチド、約２００～約１，０００ヌクレオチド、約２００～約５００ヌクレオチド、約２００～約４００ヌクレオチド、約２００～約３００ヌクレオチド、約３００～約１０，０００ヌクレオチド、約３００～約９，０００ヌクレオチド、約３００～約８，０００ヌクレオチド、約３００～約７，０００ヌクレオチド、約３００～約６，０００ヌクレオチド、約３００～約５，０００ヌクレオチド、約３００～約４，０００ヌクレオチド、約３００～約３，０００ヌクレオチド、約３００～約２，０００ヌクレオチド、約３００～約１，０００ヌクレオチド、約３００～約５００ヌクレオチド、約３００～約４００ヌクレオチド、約４００～約１０，０００ヌクレオチド、約４００～約９，０００ヌクレオチド、約４００～約８，０００ヌクレオチド、約４００～約７，０００ヌクレオチド、約４００～約６，０００ヌクレオチド、約４００～約５，０００ヌクレオチド、約４００～約４，０００ヌクレオチド、約４００～約３，０００ヌクレオチド、約４００～約２，０００ヌクレオチド、約４００～約１，０００ヌクレオチド、約４００～約５００ヌクレオチド、約５００～約１０，０００ヌクレオチド、約５００～約９，０００ヌクレオチド、約５００～約８，０００ヌクレオチド、約５００～約７，０００ヌクレオチド、約５００～約６，０００ヌクレオチド、約５００～約５，０００ヌクレオチド、約５００～約４，０００ヌクレオチド、約５００～約３，０００ヌクレオチド、約５００～約２，０００ヌクレオチド、約５００～約１，０００ヌクレオチド、約１，０００～約１０，０００ヌクレオチド、約１，０００～約９，０００ヌクレオチド、約１，０００～約８，０００ヌクレオチド、約１，０００～約７，０００ヌクレオチド、約１，０００～約６，０００ヌクレオチド、約１，０００～約５，０００ヌクレオチド、約１，０００～約４，０００ヌクレオチド、約１，０００～約３，０００ヌクレオチド、約１，０００～約２，０００ヌクレオチド、約２，０００～約１０，０００ヌクレオチド、約２，０００～約９，０００ヌクレオチド、約２，０００～約８，０００ヌクレオチド、約２，０００～約７，０００ヌクレオチド、約２，０００～約６，０００ヌクレオチド、約２，０００～約５，０００ヌクレオチド、約２，０００～約４，０００ヌクレオチド、約２，０００～約３，０００ヌクレオチド、約３，０００～約１０，０００ヌクレオチド、約３，０００～約９，０００ヌクレオチド、約３，０００～約８，０００ヌクレオチド、約３，０００～約７，０００ヌクレオチド、約３，０００～約６，０００ヌクレオチド、約３，０００～約５，０００ヌクレオチド、約３，０００～約４，０００ヌクレオチド、約４，０００～約１０，０００ヌクレオチド、約４，０００～約９，０００ヌクレオチド、約４，０００～約８，０００ヌクレオチド、約４，０００～約７，０００ヌクレオチド、約４，０００～約６，０００ヌクレオチド、約４，０００～約５，０００ヌクレオチド、約５，０００～約１０，０００ヌクレオチド、約５，０００～約９，０００ヌクレオチド、約５，０００～約８，０００ヌクレオチド、約５，０００～約７，０００ヌクレオチド、約５，０００～約６，０００ヌクレオチド、約６，０００～約１０，０００ヌクレオチド、約６，０００～約９，０００ヌクレオチド、約６，０００～約８，０００ヌクレオチド、約６，０００～約７，０００ヌクレオチド、約７，０００～約１０，０００ヌクレオチド、約７，０００～約９，０００ヌクレオチド、約７，０００～約８，０００ヌクレオチド、約８，０００～約１０，０００ヌクレオチド、約８，０００～約９，０００ヌクレオチド、約９，０００～約１０，０００ヌクレオチド、又は約１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、若しくは１０，０００ヌクレオチドのサイズを有し得る。
前述の実施形態のいずれかでは、筋特異的調節核酸配列は、導入遺伝子を更に含み得る。前述の実施形態のいずれかでは、導入遺伝子は、哺乳類デスミンプロモーターに対して３’に位置付けられ得る。導入遺伝子は、哺乳類デスミンプロモーターの制御下にあり得る。導入遺伝子は、任意の好適な導入遺伝子であり得、例えば、導入遺伝子は、ＶＥＧＦなどの治療導入遺伝子、ＩＸ因子などの遺伝子治療置換遺伝子、糖尿病用インスリンなどの逆ワクチン抗原、又はアバスチンなどの治療抗体であり得る。前述の実施形態のいずれかでは、哺乳類デスミンプロモーターは、哺乳類デスミンプロモーターと導入遺伝子との間の任意のイントロンを含まない約５００以下のヌクレオチドによって導入遺伝子から分離され得る。限定としてではなく例として、哺乳類デスミンプロモーターは、約０～約１０００ヌクレオチド、約１～約１０００ヌクレオチド、約１～約９００ヌクレオチド、約１～約８００ヌクレオチド、約１～約７００ヌクレオチド、約１～約６００ヌクレオチド、約１～約５００ヌクレオチド、約１～約４００ヌクレオチド、約１～約３００ヌクレオチド、約１～約２００ヌクレオチド、約１～約１００ヌクレオチド、約１～約９０ヌクレオチド、約１～約８０ヌクレオチド、約１～約７０ヌクレオチド、約１～約６０ヌクレオチド、約１～約５０ヌクレオチド、約１～約４０ヌクレオチド、約１～約３０ヌクレオチド、約１～約２０ヌクレオチド、約１～約１０ヌクレオチド、約１０～約１０００ヌクレオチド、約１０～約９００ヌクレオチド、約１０～約８００ヌクレオチド、約１０～約７００ヌクレオチド、約１０～約６００ヌクレオチド、約１０～約５００ヌクレオチド、約１０～約４００ヌクレオチド、約１０～約３００ヌクレオチド、約１０～約２００ヌクレオチド、約１０～約１００ヌクレオチド、約１００～約１０００ヌクレオチド、約１００～約５００ヌクレオチド、約２００～約１０００ヌクレオチド、約２００～約５００ヌクレオチド、約５００～約１０００ヌクレオチド、又は約１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、若しくは０ヌクレオチドによって導入遺伝子から分離され得る。
前述の実施形態のいずれかでは、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーは、哺乳類デスミンエンハンサーに対して５’に位置付けられ得、哺乳類デスミンエンハンサーは、哺乳類デスミンプロモーターに対して５’に位置付けられ得る。前述の実施形態のいずれかでは、１つ以上のＭＣＫエンハンサーに関して既に説明されているように、エレメントが作動可能に連結されている限り、筋特異的調節核酸配列のエレメント間に連結配列が存在し得ることを理解されたい。限定としてではなく例として、筋特異的調節核酸配列の１つ又はエレメントである、哺乳類デスミンプロモーター、哺乳類デスミンエンハンサー、及び１つ以上のＭＣＫエンハンサーは、約０～約１０００ヌクレオチド、約１～約１０００ヌクレオチド、約１～約９００ヌクレオチド、約１～約８００ヌクレオチド、約１～約７００ヌクレオチド、約１～約６００ヌクレオチド、約１～約５００ヌクレオチド、約１～約４００ヌクレオチド、約１～約３００ヌクレオチド、約１～約２００ヌクレオチド、約１～約１００ヌクレオチド、約１～約９０ヌクレオチド、約１～約８０ヌクレオチド、約１～約７０ヌクレオチド、約１～約６０ヌクレオチド、約１～約５０ヌクレオチド、約１～約４０ヌクレオチド、約１～約３０ヌクレオチド、約１～約２０ヌクレオチド、約１～約１０ヌクレオチド、約１０～約１０００ヌクレオチド、約１０～約９００ヌクレオチド、約１０～約８００ヌクレオチド、約１０～約７００ヌクレオチド、約１０～約６００ヌクレオチド、約１０～約５００ヌクレオチド、約１０～約４００ヌクレオチド、約１０～約３００ヌクレオチド、約１０～約２００ヌクレオチド、約１０～約１００ヌクレオチド、約１００～約１０００ヌクレオチド、約１００～約５００ヌクレオチド、約２００～約１０００ヌクレオチド、約２００～約５００ヌクレオチド、約５００～約１０００ヌクレオチド、又は約１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、若しくは０ヌクレオチドによって分離され得る。
筋特異的調節核酸配列の好ましい配列は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８を含み得る。限定としてではなく例として、筋特異的調節核酸配列は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有する核酸配列を含み得る。
これらの好ましい配列の詳細を以下に提供する。
ＭＣＫ ＣＫ７エンハンサー、ｈデスミンエンハンサー、ｈデスミンプロモーター、ＭＶＭイントロン（配列番号３１）。
ＭＣＫＣＫ７エンハンサー、ｈデスミンエンハンサー、ｈデスミンＩＮＲプロモーター、ＭＶＭイントロン（配列番号３２）。
ＭＣＫ ＣＫ７エンハンサー、ｈデスミンエンハンサー、ｈデスミンＳプロモーター、ＭＶＭイントロン（配列番号３３）。
ＭＣＫ ＣＫ７エンハンサー、ｈデスミンエンハンサー、ｈデスミンＳ ＩＮＲプロモーター、ＭＶＭイントロン（配列番号３４）。
ＭＣＫ ＣＫ７エンハンサー、ｈデスミンエンハンサー、ｈデスミンＩＮＲプロモーター、ｐＣＩイントロン（図３Ａ、図３Ｃ、図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｄ、配列番号３５）
ＭＣＫ ＣＫ７エンハンサー、ｈデスミンエンハンサー、ｈデスミンＳ ＩＮＲプロモーター、ｐＣＩイントロン（図３Ｂ、図３Ｄ、図４Ｃ、及び図４Ｄ、配列番号３６）。
ＭＣＫ ＣＫ７エンハンサー、ｍデスミンエンハンサー、ｍデスミンプロモーター、ＭＶＭイントロン（配列番号５５）。
ＭＣＫ ＣＫ７エンハンサー、ｍデスミンエンハンサー、ｍデスミンＩＮＲプロモーター、ＭＶＭイントロン（図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｄ、配列番号５６）。
ＭＣＫ ＣＫ７エンハンサー、ｍデスミンエンハンサー、ｍデスミンＩＮＲプロモーター、ｐＣＩイントロン（図５Ｃ、（配列番号５７）。
ＭＣＫ ＣＫ７エンハンサー、ｍデスミンエンハンサー、ｍデスミンプロモーター、ｐＣＩイントロン（図５Ｄ、配列番号５８）。
好ましい構成は、限定としてではなく例として、以下を含み得る。
５’－１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサー、哺乳類デスミンエンハンサー、哺乳類デスミンプロモーター－３’。
筋特異的調節核酸配列の他の構成は、限定としてではなく例として、以下を含み得る。
１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサー、哺乳類デスミンエンハンサー、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサー、哺乳類デスミンプロモーター。
哺乳類デスミンエンハンサー、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサー、哺乳類デスミンプロモーター。
哺乳類デスミンプロモーター、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサー、哺乳類デスミンエンハンサー。
哺乳類デスミンプロモーター、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサー、哺乳類デスミンエンハンサー、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサー。
哺乳類デスミンプロモーター、哺乳類デスミンエンハンサー、１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサー。
前述の他の構成のいずれかでは、イントロンは、筋特異的調節核酸配列に挿入され得る。同様に、前述の構成のいずれかでは、導入遺伝子は、哺乳類デスミンプロモーターから下流に、場合により、追加のエレメントの間に、又はデスミンプロモーターと追加のエレメントとの間に位置付けられ得る。また、複数の哺乳類デスミンエンハンサーが存在し得ること、並びに哺乳類デスミンエンハンサー及び１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーの任意の組み合わせが、エレメントの順序に関して作製され得ることを理解されたい。
ベクター
いくつかの実施形態では、前述の実施形態のいずれかの筋特異的調節核酸配列を含むベクターが提供される。
ベクターは、細胞を筋特異的調節核酸配列でトランスフェクトするための任意の好適なベクターであり得る。限定としてではなく例として、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、Ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ、ＭＩＤＧＥ、ナノプラスミド、又はウイルスベクターであり得る。限定としてではなく更なる例として、ベクターは、エピソーム非複製発現ベクター、エピソーム複製発現ベクター、トランスポゾン組み込みベクター、ウイルス組み込みベクター、又は相同組換え修復ベクターであり得る。
いくつかの実施形態では、ベクターがウイルスベクターである場合、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、又はレトロウイルスであり得る。
いくつかの実施形態では、ベクターは、２つ以上の筋特異的調節核酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、ベクターは、二重プロモーターベクターであり得る。
ベクターがナノプラスミドである場合、ナノプラスミドが、５’及び３’末端を有する筋特異的調節核酸配列及び導入遺伝子を含み得る真核生物領域と、真核生物領域の５’及び３’末端を連結する５００未満の塩基対のスペーサー領域とを含み、限定としてではなく例として、Ｒ６Ｋ又はＣｏｌＥ２などの細菌複製起点及びＲＮＡ選択可能マーカーを含むことを理解されたい。非限定的な例示的なＲ６Ｋ起点は、配列番号１９～２３に提供され、例示的なＲＮＡ選択可能マーカーは、配列番号２４及び２６に提供される。細菌複製起点が配列番号１９～２３のいずれか１つのＲ６Ｋ起点である場合、細菌複製起点は、それぞれ、配列番号１９～２３のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有し得ることを理解されたい。ＲＮＡ選択可能マーカーが配列番号２４又は配列番号２６のうちの１つである場合、ＲＮＡ選択可能マーカーは、それぞれ、配列番号２４又は２６のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有し得ることを更に理解されたい。ナノプラスミドベクターはまた、国際特許出願公開第２０１４／０７７８６６号及び米国特許出願第２０１０／０１８４１５８号にも記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ベクターがナノプラスミドである場合、ベクターは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０のいずれかの配列を含み得る。配列番号２７及び２９は、ＮＴＣ９３８５Ｒ骨格の６つ及び７つのＲ６Ｋ起点イテロンバージョンであり、配列番号２８及び３０は、ＮＴＣ９３８５Ｒ（３ｘＣｐＧ）骨格の６つ及び７つのＲ６Ｋ起点イテロンバージョンである。
例として導入遺伝子（ＥＧＦＰ）を含むこれらの好ましい配列を使用するナノプラスミドベクターマップが、図３Ａ～図３Ｄ及び図５Ａ～図５Ｄに示される。例としてモノクローナル抗体軽鎖（ｍＡＢ ＬＣ）又は重鎖（ｍＡＢ ＨＣ）又はＬＣ及びＨＣ導入遺伝子の両方を含むこれらの好ましい配列を使用するナノプラスミドベクターマップが、図４Ａ～図４Ｄ及び図５Ａ～図５Ｄに示される。これらのベクターは、受動免疫療法、例えば、ウイルス中和抗体のインビボ発現のために使用することができる（Ｂａｋｋｅｒ ＪＭ，Ｂｌｅｅｋｅｒ ＷＫ，Ｐａｒｒｅｎ ＰＷＨＩ．２００４．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １０：１５２５；Ｔｊｅｌｌｅ ＴＥ，Ｃｏｒｔｈａｙ Ａ，Ｌｕｎｄｅ Ｅ，Ｓａｎｄｌｉｅ Ｉ，Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎ ＴＥ，Ｍａｔｈｉｅｓｅｎ Ｉ，Ｂｏｇｅｎ Ｂ．２００４．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ９：３２８；Ｈｏｌｌｅｖｏｅｔ Ｋ，Ｄｅｃｌｅｒｃｋ ＰＪ．２０１７．Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １５：１３１）。抗体軽鎖及び重鎖は、異なるベクターで発現されてもよく、又は両方が二重プロモーターベクターで発現されてもよい。単一のベクターにおける好ましい筋プロモーターからのＬＣ及びＨＣ導入遺伝子の両方を発現させる例としての二重プロモーターベクターが、図４Ｄ及び図５Ｄに示される。
いくつかの好ましい実施形態では、ベクターは、０．７未満のＣｐＧ対ＧｐＧ比を有し得る。限定としてではなく例として、ベクターは、０．７、０．６５、０．６、０．５５、０．５、０．４５、０．４、０．３５、又は０．３未満のＣｐＧ対ＧｐＧ比を有し得る。限定としてではなく更なる例として、ベクターは、約０．３～約０．７、約０．３～約０．６、約０．４～約０．５、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、約０．５、約０．５５、又は約０．６のＣｐＧ対ＧｐＧ比を有し得る。
前述の実施形態のいずれかでは、ベクターは、前述の実施形態のいずれかによる２つ以上の筋特異的調節核酸配列を含み得る。限定としてではなく例として、ベクターは、第１の導入遺伝子が第１の筋特異的調節核酸配列の哺乳類デスミンプロモーターの制御下にある第１の筋特異的調節核酸配列と、第２の導入遺伝子が第２の筋特異的調節核酸配列の哺乳類デスミンプロモーターの制御下にある第２の筋特異的調節核酸配列と、を含み得る。そのような実施形態では、第１及び第２の導入遺伝子は、同じ産物又は異なる産物をコードし得る。限定としてではなく更なる例として、第１の導入遺伝子は、抗体重鎖をコードし得、第２の導入遺伝子は、抗体軽鎖をコードし得る。
前述の実施形態のいずれかでは、筋特異的調節核酸配列が、導入遺伝子の５’又は３’に位置付けられ得ることを理解されたい。限定としてではなく例として、ナノプラスミドにおいて、筋特異的調節核酸配列は、真核生物領域の５’末端又は真核生物領域の３’末端、例えば、それぞれ、導入遺伝子の５’又は３’に存在し得、これは、導入遺伝子が、スペーサー領域全体で依然として哺乳類デスミンプロモーターの制御下にあり得るからである。
同様に、本開示の哺乳類ＭＣＫエンハンサー及びデスミンエンハンサーが、導入遺伝子の下流に位置付けられ得ることを理解されたい。
宿主細胞
いくつかの実施形態では、本開示のベクターを含む、形質転換された宿主細胞が提供される。宿主細胞は、ＤＨ５αなどの任意の好適な細菌細胞であり得る。いくつかの実施形態では、本開示のベクターを含む、トランスフェクトされた真核細胞が提供される。限定としてではなく例として、真核細胞は、ヒト筋細胞、筋管、又は筋芽細胞であり得る。ヒト筋細胞が、限定としてではなく例として、骨格筋細胞、心筋細胞、及び横隔膜筋細胞であり得ることを理解されたい。
本開示のベクターを産生するための方法
いくつかの実施形態では、筋特異的発現ベクターを調製するための方法は、非筋特異的プロモーター又は非デスミンプロモーターを含むベクターを提供することと、非筋特異的プロモーター又は非デスミンプロモーターが本開示の筋特異的調節核酸配列によって置き換えられるようにベクターを改変することと、を含み得る。ベクター及び筋特異的調節核酸配列は、本開示の前述の実施形態のいずれかに記載されるようなものであり得る。
複製又は発現のための方法
いくつかの実施形態では、導入遺伝子を真核細胞において発現させるための方法は、真核細胞を本開示のベクターでトランスフェクトする工程を含む。トランスフェクションが、ベクターが導入遺伝子を真核細胞において発現させるのに十分な条件下で実行することができることを理解されたい。いくつかの実施形態では、真核細胞は、筋細胞である。ヒト筋細胞が、限定としてではなく例として、骨格筋細胞、心筋細胞、又は横隔膜筋細胞であり得ることを理解されたい。限定としてではなく例として、宿主細胞を本開示のベクターで形質転換する方法は、対象に本開示のベクターを投与することを含み得る。限定としてではなく更なる例として、対象は、ヒトであり得る。
いくつかの実施形態では、本開示のベクターを複製するための方法であって、宿主細胞を本開示のベクターで形質転換し、ベクターを複製するのに十分な条件下で細胞をインキュベートする工程を含む、方法が提供される。宿主細胞をトランスフェクトするための方法、及びベクターを複製するのに十分な条件下で宿主細胞をインキュベートするための条件は、当業者に既知である。
以下の実施例では、本明細書に記載の様々な導入遺伝子、筋プロモーター、５’ＵＴＲイントロンなどを含有するベクターを作成するためのクローニングを、標準的な制限断片ライゲーション媒介クローニングを使用して構築した。全ての構築物は、制限消化及び配列決定によって正しいことが検証された。
以下の実施例では、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ２０１９ ＶＩＲＡＬ ＡＮＤ ＮＯＮ－ＶＩＲＡＬ ＮＡＮＯＰＬＡＳＭＩＤ ＶＥＣＴＯＲＳ ＷＩＴＨ ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ国際特許出願公開第２０１９／１８３２４８号（参照により本明細書に組み込まれる）において作成及び開示されたＲ６Ｋ起点の「コピーカッター」宿主細胞株ＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦ及びＮＴＣ１０５０８１１－ＨＦｄｃｍにおいて、ナノプラスミドベクターをクローニング及び増殖させた。ｐＶＡＸ１ベクターを、ＤＨ５α細胞において増殖させた。
以下の実施例では、振盪フラスコ産生用に独自のプラスミド＋振盪培養培地を使用した。種培養をグリセロールストック又はコロニーから開始し、５０μｇ／ｍＬの抗生物質（ｋａｎＲ選択ｐＶＡＸ１プラスミド）又は６％のスクロース（ＲＮＡ－ＯＵＴ選択ＮＴＣ８プラスミド及びＮＴＣ９ナノプラスミド）を含有するＬＢ培地寒天プレートに画線した。プレートを３０～３２℃で増殖させ、細胞を培地中に再懸濁し、約２．５ＯＤ６００の接種材料を、５００ｍＬのプラスミド＋振盪フラスコに提供するために使用し、このフラスコには、ｋａｎＲ選択ｐＶＡＸ１プラスミドのための５０μｇ／ｍＬの抗生物質、又はＲＮＡ－ＯＵＴプラスミド及びナノプラスミドについての選択のための０．５％のスクロースを含有していた。フラスコを、示されるように増殖温度で飽和するように振盪しながら増殖させた。低エンドトキシンナノプラスミドＤＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＡＸ２，０００又はＡＸ１０，０００カラムを使用して精製した（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
表１は、当該技術分野において説明される様々な筋特異的プロモーターを要約する。ヒト若しくはマウスデスミン、又はマウス筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）などの天然筋プロモーターは、ＣＭＶと比較して比較的低い発現レベルを有する。異なる筋特異的制御エレメントからのエンハンサー及びプロモーターを組み合わせる多くのハイブリッド筋プロモーターもまた、ＣＭＶと比較して比較的低い発現である。例えば、Ｓｏｕｚａ及びＡｒｍｅｎｔａｎｏのＷＯ２００２／０９５００６は、ＭＣＫエンハンサーをｈデスミンプロモーターと組み合わせることによって、比較的弱いプロモーターを得た（表１；ＤＣ３１０及びＤＣ３１１）。これは、ＭＣＫエンハンサー及びｈデスミンプロモーターを組み合わせることによって強力な筋プロモーターを得ることの阻害要因になることを教示している。ｔＭＣＫ及びＳｋ－ＣＲＭ４－Ｄｅｓなどの他のプロモーター－エンハンサーの組み合わせは、ＣＭＶプロモーターを超える活性を有するハイブリッド筋プロモーターを作成することが示された（表１）。
［実施例１：様々なプロモーター－エンハンサー構築物におけるＥＧＦＰレポーター発現］
ＮＴＣ８６８５ベクター（ｐＵＣ起点及び無抗生物質ＲＮＡ－ＯＵＴスクロース選択カセットを含有する）の様々な天然及びハイブリッド筋プロモーターバージョン（Ｌｕｋｅ，ＪＭ，Ｖｉｎｃｅｎｔ ＪＭ，Ｄｕ，ＳＸ，Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ Ｕ，Ｌｅｅｎ ＡＭ，Ｗｈａｌｅｎ ＲＧ，Ｈｏｄｇｓｏｎ ＣＰ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＡ．２０１１．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １８：３３４）を構築し、Ｃ２Ｃ１２筋管、Ａ５４９、及びＨＥＫ２９３細胞において発現レベルを決定した。
試験した構築物のベクターマップを図１Ａ～図１Ｈに提供する。ベクターの特定のエレメントの個々の配列を、以下の表２に列挙し、説明する。
付着性ＨＥＫ２９３（ヒト胚性腎臓）、Ａ５４９（ヒト肺がん）、及びＣ２Ｃ１２（ハツカネズミ、マウス筋）の細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手した。細胞株を、１０％ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２中で繁殖させ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）試薬及び従来の方法を使用して分割した（０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ）。
トランスフェクションのために、細胞を２４ウェルの組織培養皿上にプレーティングした。プラスミド及びナノプラスミドを、製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して細胞株にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３及びＡ５４９細胞については、ウェル当たり０．１ｕｇの試験プラスミドをトランスフェクションに使用し、トランスフェクションの２～３日後に発現を測定した。Ｃ２Ｃ１２については、ウェル当たり０．４ｕｇの試験プラスミドをトランスフェクションに使用し、その後、ＤＭＥＭ Ｆ１２＋２％ウマ血清（分化培地）を添加することによって、細胞を筋管に分化させた。分化した筋管構造における発現を、Ｔ＝６～７日で測定した。
ＥＧＦＰ決定のための全細胞溶解物を、細胞溶解緩衝液（ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｍ，Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）中に細胞を再懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートし、続いて－８０℃での凍結融解サイクルによって細胞を溶解させることによって調製した。溶解した細胞を遠心分離によって清澄化し、上清をＦＬＸ８００マイクロプレート蛍光リーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）によってＥＧＦＰについてアッセイした。
ＨＥＫ２９３細胞及びＣ５－Ｃ１２筋芽細胞について得られたＥＧＦＰ発現レベルを図２Ａ～図２Ｂに示す。
図２Ａ～図２Ｂに示すように、Ｃ５－１２ランダムアセンブル合成プロモーター（Ｌｉ Ｘ，Ｅａｓｔｍａｎ ＥＭ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＲＪ，Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉ ＲＤ １９９９．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：２４１）は、最も強力な筋プロモーターであり、続いてｈデスミン、次いでｍＭＣＫ（ＣＫ７エンハンサー配列番号１の３つのコピーのマウスＭＣＫプロモーター－３５７－＋７配列番号４０との組み合わせ）であった。興味深いことに、ＣＭＶ、Ｃ５－１２、及びＭＣＫプロモーターを改変して、代わりに筋特異的エンハンサーエレメントを添加することによって活性が改善されたハイブリッドプロモーターを作成する試みで、プロモーターの強度が低減した。ＣＭＶ又はＣ５－１２プロモーターの上流の配列番号１のＣＫ７ ＭＣＫエンハンサーの３つコピーを添加することで、筋肉発現が劇的に低減した。同様に、配列番号１のＣＫ７ ＭＣＫエンハンサーとＣ５－１２及びＭＣＫプロモーターとの間で、Ｍ－ＣＡＴ（５’ＣＡＴＴＣＣＴ－３’ＴＥＦ－１結合部位を含有する筋肉－ＣＡＴモチーフ；Ｌｉ ｅｔ ａｌ、上記参照、１９９９）（配列番号４６）の２つのコピー（配列番号４７）を添加することで、筋特異的発現が更に低減した。これは、ＭＣＫエンハンサーをｈデスミンプロモーターと組み合わせることによって比較的弱いプロモーターを得たＳｏｕｚａ及びＡｒｍｅｎｔａｎｏ、ＷＯ２００２／０９５００６の教示と一致する。まとめると、これらの結果によって、異種プロモーターの上流でクローニングされたときに、ＣＫ７ ＭＣＫエンハンサー及びＭ－ＣＡＴモチーフが筋特異的発現を減少させることが示唆される。これと一致して、ＭＣＫエンハンサーを使用する表１の全ての強力なプロモーターは、ＭＣＫプロモーターの上流にそれらを組み込む。
ｔＭＣＫ（Ｗａｎｇ Ｂ，Ｌｉ Ｊ，Ｆｕ ＦＨ，Ｃｈｅｎ Ｃ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｚｈｏｕ Ｌ，Ｊｉａｎｇ Ｘ，Ｘｉａｏ Ｘ．２００８．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １５：１４８９）及びＳｋ－ＣＲＭ４－Ｄｅｓ（Ｓａｒｃａｒ Ｓ，Ｔｕａｌａｍｂａ Ｗ，ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｎａｔ Ｃｏｍｍ １０：４９２）などの他のプロモーター－エンハンサーの組み合わせは、ＣＭＶプロモーターを超える活性を有するハイブリッド筋プロモーターを作成することが示された（表１）。これらのプロモーターを、線形ＡＡＶベクターを使用して試験し、超らせんプラスミド又はナノプラスミドＤＮＡテンプレートにおいて同様に機能しない場合がある。これを試験するために、ｐＶＡＸ１（ｐＵＣ起点ｋａｎＲベクター；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＮＴＣ９３８５Ｒナノプラスミド骨格において、いくつかの筋プロモーター発現ベクターを作成した。これにより、１）筋プロモーター自体、及び２）ベクター骨格が筋細胞発現に及ぼす影響の評価が可能になった。発現結果を、表３に示す。全てのベクターは、同じウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナルを有する。
ベクター骨格は、発現に劇的な効果を有した。ｐＶＡＸ１発現は、ＣＭＶを有するＮＴＣ９３８５Ｒ、及びＳｋ－ＣＲＭ４－Ｄｅｓプロモーターよりも１０～２０倍低く、新しいハイブリッドであるＳｋ－ＣＲＭ４－ｔＭＣＫプロモーターでは３倍低かった。これは、ナノプラスミド骨格がｐＶＡＸ１と比較して、発現を劇的に改善することを教示している。
ｐＶＡＸ１ ＣＭＶをＣＭＶプロモーター発現の基準として使用すると、全ての筋特異的ナノプラスミドベクターは、ＣＭＶと比較して、筋細胞において発現が改善される。
しかしながら、ナノプラスミドＣＭＶを基準として比較すると、Ｓｋ－ＣＲＭ４－ＤｅｓプロモーターのみがＣＭＶと比較して改善される。
ｔＭＣＫプロモーター発現は、Ｓｋ－ＣＲＭ４－Ｄｅｓプロモーターよりもはるかに低かった。ＣＫ７ ＭＣＫエンハンサー及びＭ－ＣＡＴモチーフを用いた図２Ａ～図２Ｂに観察されるように、ｔＭＣＫプロモーターへの筋エンハンサーの添加（イントロンＭＣＫ ＳＩＥエンハンサー配列番号４１；Ｔａｉ ＰＷＬ，Ｆｉｓｈｅｒ－Ａｙｌｏｒ ＫＩ，Ｈｉｍｅｄａ ＣＬ，Ｓｍｉｔｈ ＣＬ，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ ＡＰ，Ｈｅｌｔｅｒｌｉｎｅ ＤＬ，Ａｇｎｅｌｌｏ ＪＣ，Ｗｅｌｉｋｓｏｎ ＲＥ＜Ｗｏｌｄ ＢＨ，Ｈａｕｓｃｈｋａ ＳＤ．２０１１．Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ１：２５）は、発現を減少させた（表３）。イントロンＭＣＫ ＳＩＥエンハンサーはまた、Ｓｋ－ＣＲＭ４－Ｄｅｓプロモーターからの発現を２倍低減させ、ｔＭＣＫＥ－ｍデスミンプロモーターからの発現をわずかに低減させた。
ｍＭＣＫ ２ＲＳ５エンハンサー配列番号３８（配列番号３７の３つのコピー；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ、上記参照、２００８）を、ｍデスミンエンハンサー及びプロモーター（ｔＭＣＫＥ－ｍデスミン）と組み合わせて試験し、ＭＣＫエンハンサーがＳｋ－ＣＲＭ４－ＤｅｓプロモーターにおいてＳｋ－ＣＲＭ４の代替となり得るか否かを決定した。しかしながら、ＮＴＣ９３８５Ｒ－ｔＭＣＫＥ－ｍデスミンは、ＮＴＣ９３８５ Ｒ－ＣＲＭ－ｍデスミンよりも筋細胞における活性が２倍低かった。
これらのデータをまとめると、ＭＣＫエンハンサーが、ＣＭＶ、Ｃ５－１２、及びデスミンプロモーターの上流でクローニングされたときに筋細胞における発現を改善しない場合があり、筋特異的プロモーターエレメントの大部分の組み合わせが、これらのプロモーターからの発現レベルに有益ではなく有害であることが示唆される。
［実施例２：ｐＶＡＸ１及びナノプラスミド骨格における新規ＭＣＫデスミン筋プロモーターの評価］
実施例１からの試験されたプロモーターのうち、Ｓｋ－ＣＲＭ４－Ｄｅｓプロモーターは、ナノプラスミドベクター骨格における発現が最も強力であった。驚くべきことに、上記の結果とは反対に、ＮＴＣ９３８５Ｒ－ＣＲＭ－ｍデスミンにおけるＳｋ－ＣＲＭ４－Ｄｅｓプロモーターを、ＭＣＫ ＣＫ７エンハンサー（配列番号１）の１つ又は３つのコピーで置き換えると、以下の表４に示されるように、Ｓｋ－ＣＲＭ４－Ｄｅｓプロモーターと同等の筋特異的発現を有する新規ＮＴＣ９３８５Ｒ－ＭＣＫ ＣＫ７ Ｅベクターが作成された。実施例１で使用したのと同じ方法を使用して、この追加のデータを生成した。全てのベクターは、同じウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナルを有する。
ＮＴＣ９３８５Ｒ－ＭＣＫ ＣＫ７ Ｅベクターは、
ａ）ｂ）に対して５’にあるＭＣＫ ＣＫ７エンハンサーの１～３つのコピー、
ｂ）ｃ）に対して５’にあるｍデスミンエンハンサー、
ｃ）ｄ）に対して５’にあるｍデスミンプロモーター（ＩＮＲの有無にかかわらず）、
ｄ）ＭＶＭイントロン、を含む、ハイブリッド筋プロモーターを有する。
ｍデスミンＩＮＲプロモーターは、Ｓａｌｖａ ｅｔ ａｌ ２００７．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５：３２０に開示されたＭＣＫ ＩＮＲと同様に構築された。ＩＮＲ（イニシエーター－コアプロモーターエレメント）の変化は、ＴＡＴＡボックスの活性を増加させて転写開始を増加させる。ＩＮＲ変化は、非筋細胞におけるプロモーター発現をわずかに増加させるが（表５；ＨＥＫ２９３及びＡ５４９細胞）、ＩＮＲ含有プロモーターは、筋細胞に対して非常に特異的であるままである。
様々な構築物のＥＧＦＰ発現レベルを、以下の表５に提供する。全てのベクターは、同じウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナルを有する。エンハンサー、プロモーター、及びイントロン配列は、表４に記載の通りである。
ＭＣＫ ＣＫ７エンハンサーの３つのコピーの、ＭＣＫ２Ｒエンハンサーの３つのコピーによる置換は、発現を２倍低減させた（表６： ＮＴＣ９３８５Ｒ－ＭＣＫ ３ｘ ＭＣＫ２Ｒ ｍデスミン－ｐＣＩ対ＮＴＣ９３８５Ｒ－ＭＣＫ ３ｘＣＫ７ Ｅ ｍデスミン－ｐＣＩ）。これにより、右Ｅボックスに一致するように左Ｅボックスを変化させる２Ｒ改変（Ｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ ２０００．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２： １６）が、この文脈において、デスミンプロモーターとの発現に有害であることが示唆される。
ＮＴＣ９３８５ＲナノプラスミドＭＣＫ－デスミンプロモーターベクターを構築し、マウスデスミンエンハンサープロモーターをヒトデスミンエンハンサープロモーターで置換した（ＩＮＲ並びに短及び長バージョンの有無にかかわらず、短いバージョンは、Ｌｉ，Ｚ ａｎｄ Ｐａｕｌｉｎ Ｄ．１９９１． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：－６５６２）に報告されたプロモーター内の負領域を除去する）。同様に、ＭＣＫ ｍデスミン及びＭＣＫ ｈデスミンプロモーターの両方のＭＶＭイントロン及びｐＣＩイントロンバージョンを構築し、筋細胞における発現について試験した。結果を、表６及び７に提供する。
データは、ＭＣＫ ｈデスミンが、ＭＣＫ ｍデスミンよりも、筋管における発現に優れていることを実証し、ＭＣＫ ｈデスミンＳ及びＭＣＫ ｈデスミンは、筋管において同様に高い発現を有し、ＩＮＲを含むことは、筋管における発現の改善を提供し、ｐＣＩイントロンは、筋管におけるＭＶＭイントロンよりも改善された発現を実証し、ナノプラスミドベクターは、筋管におけるｐＶＡＸ１ベクターよりも発現の有意な改善を示す。
本開示の筋特異的調節核酸配列及びベクターはまた、好ましくは低いＣｐＧ対ＧｐＧ比を有し得る（表８）。より低いＣｐＧ対ＧｐＧ比は、ＴＬＲ９結合のためのＣｐＧとのＧｐＧ競合によって仮説化された、導入遺伝子免疫原性の低減と相関する（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ Ｐ，Ｕｔｚ ＰＪ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｗ，Ｓｔｅｉｎｍａｎ Ｌ．２０１３．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９：２９７）。本発明の筋プロモーターを組み込んだナノプラスミドベクターも、特にｐＶＡＸ１などの既存のＣＭＶプロモーターベクターと比較して、好ましくは低いＣｐＧ対ＧｐＧ比を有する（表９）。これは、免疫応答が問題である遺伝子療法及び受動免疫療法用途に非常に有益であろう標的導入遺伝子に対する免疫応答の低減につながり得る（Ｗｅｅｒａｔｎａ ｅｔ ａｌ、上記参照、２００１；Ｈｏｌｌｅｖｏｅｔ ａｎｄ Ｄｅｃｌｅｒｃｋ、上記参照、２０１７）。
［実施例３：ナノプラスミドベクター骨格における新規ＭＣＫデスミン筋プロモーターのインビボ評価］
ＭＣＫデスミン筋プロモーターナノプラスミドベクターは、ｐＶＡＸ１ ＣＭＶ対照と比較して、改善された発現についてインビボで評価することができる。例えば、ｐＶＡＸ１のルシフェラーゼ導入遺伝子バージョン並びに図３Ａ～図３ＤのナノプラスミドＭＣＫ－ｈデスミンベクター及び図５Ａ～図５ＤのナノプラスミドＭＣＫ－ｍデスミンベクターを作成し、精製ＤＮＡをインビボでマウス筋肉に送達する。送達は、エレクトロポレーションによるＩＭ送達、ＢＡＳＦ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＸ字形ポロキサミン＝Ｔｅｔｒｏｎｉｃ３０４、７０４、９０４、９０８などのブロックポリマーによるＩＭ送達、脂質によるＩＭ送達などである。ルシフェラーゼ発現は、注射した筋肉において様々な時点で決定される。ｐＶＡＸ１ ＣＭＶよりも１～２ログ優れた、ナノプラスミドＭＣＫデスミン筋プロモーター発現レベルが予想される。
例えば、図３ＣのＭＣＫ－ｈデスミンナノプラスミドのルシフェラーゼ導入遺伝子バージョン［ＮＴＣ９３８５Ｒ（３ｘＣｐＧ）－ＭＣＫ ｈデスミン－Ｌｕｃ ＣｐＧフリーＢＧＨ ｐＡ（４０９９ｂｐ）］及び図５ＢのＭＣＫ－ｍデスミンナノプラスミド［ＮＴＣ９３８５Ｒ（３ｘＣｐＧ）－ＭＣＫ ｍデスミン－Ｌｕｃ ＣｐＧフリーＢＧＨ ｐＡ（３９４８ｂｐ）］のインビボでのマウス筋肉へのブロックコポリマー送達は、以下に（図６）に記載されるように、ｐＶＡＸ１プラスミド［ｐＶＡＸ１－Ｌｕｃ（４６１３ｂｐ）］と比較して１ログ超の改善された発現を実証した。
両親媒性ブロックコポリマー（ＡＢＣ）（Ｎａｎｏｔａｘｉ；Ｉｎ－Ｃｅｌｌ－Ａｒｔ、Ｎａｎｔｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いた３つのＤＮＡ調製物の製剤は、等量のＡＢＣストック水溶液及びプラスミドＤＮＡ溶液を、所望の濃度で緩衝溶液中で混合することによって調製した。
動物実験は、施設及び国家の倫理ガイドラインに従って実行した。マウスをイソフルランにより麻酔してから、ＡＢＣ／ＤＮＡ溶液を注射した。マウスルシフェラーゼ遺伝子発現実験は、６週齢の雌スイスマウスの群を使用して実行した（Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ Ｓａｉｎｔ Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）。ＡＢＣ／ＤＮＡ製剤を、両方の剃毛された前脛骨筋に両側に筋肉内注射した。注射した筋肉を注射の７日後に採取し、液体窒素中で凍結し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイするまで－８０℃で貯蔵した。
注射した筋肉におけるルシフェラーゼ活性を、Ｐｉｔａｒｄ Ｂ，ｅｔ ａｌ．２００２．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１７６７－７５に記載されるように分析した。結果を図６に示す。
［実施例４：ナノプラスミドベクター骨格における新規ＭＣＫデスミン筋プロモーターの評価］
ＭＣＫ ＣＫ７エンハンスの１つ又は３つのコピーが、Ｓｋ－ＣＲＭ４－ＤｅｓプロモーターにおけるＳＫ－ＣＲＭ４の代替となり得る（表１： Ｓａｒｃａｒ ｅｔ ａｌ．上記参照２０１９）という本明細書で開示された驚くべき観察から拡張すると、Ｓｋ－ＣＲＭ４－Ｄｅｓプロモーターからの発現を改善したＣＲＥ０２（配列番号１５）及びＣＲＥ６４（配列番号１６）エンハンサーの組み込み（表１： Ｃｈｕａｈ及びＶａｎｄｅｒｄｒｉｅｓｓｃｈｅ ＷＯ２０１８／１７８０６７）も、本開示のＭＣＫ－デスミンプロモーターからの発現を改善することが予測される。本明細書に開示されるＭＣＫ－デスミンプロモーターの上流にＳｋ－ＣＲＭ４エンハンサー（配列番号１４）を添加することも、本開示のＭＣＫ－デスミンプロモーターからの発現を改善し得ることが更に企図される。本明細書に開示されるＭＣＫ－デスミンプロモーターの上流にαＭＨＣ Ｅエンハンサー（配列番号１３）を添加することも、ＭＨＣＫ７プロモーターにおけるＣＫ７エンハンサーの上流に位置付けられたときのＭＣＫプロモーターからの発現のその改善と同様に、本開示のＭＣＫ－デスミンプロモーターからの発現を改善し得ることが更に企図される（表１）。これらの企図されるプロモーターは、実施例１及び３に記載されるように試験され、
ａ）哺乳類デスミンプロモーターエレメントと、
ｂ）哺乳類デスミンエンハンサーエレメントと、
ｃ）哺乳類ＭＣＫエンハンサーと、
ｄ）配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される哺乳類エンハンサーエレメントと、の構成を有し、プロモーター及びエンハンサーエレメントは、作動可能に連結されている、構成となるであろう。
刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、参照により組み込まれることが個別に具体的に示され、その全体が本明細書に示されるのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
「含む」、「有する」、「含む」、及び「含有する」という用語は、別段の記載がない限り、オープンエンド用語（すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、単に、範囲内に含まれる各個別の値を個別に参照する簡略法として機能することのみを意図しており、各個別の値は、本明細書に個別に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行され得る。本明細書に提供される任意の及び全ての実施例、又は例示的な言語（例えば、「例えば（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本発明をより良く明らかにすることを意図しており、特に別段の請求がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる言語も、あらゆる特許請求されていない要素を本発明の実施に不可欠であると示すものとして解釈されるべきではない。
本発明を実施するための発明者らに知られている最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態を本明細書で説明する。これらの好ましい実施形態の変形は、前述の説明を読めば当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がかかる変形を適切に用いることを期待し、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載される以外の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用される法律によって許可されるように、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙された主題の全ての修正及び等価物を含む。更に、本明細書に別段に示さない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、それらの全ての可能な変形における上述の要素のあらゆる組み合わせは、本発明によって包含される。

Claims (61)

  1. 組換え筋特異的調節核酸配列であって、
    哺乳類デスミンプロモーターと、
    哺乳類デスミンエンハンサーと、
    １つ以上の哺乳類筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）エンハンサーと、を含み、
    前記哺乳類デスミンプロモーター、哺乳類デスミンエンハンサー、及び哺乳類ＭＣＫエンハンサーが、作動可能に連結されている、組換え筋特異的調節核酸配列。
  2. 前記哺乳類デスミンプロモーターが、ヒトデスミンプロモーターである、請求項１に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  3. 前記哺乳類デスミンプロモーターが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  4. 前記哺乳類デスミンプロモーターが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  5. 前記哺乳類デスミンプロモーターが、マウスデスミンプロモーターである、請求項１に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  6. 前記哺乳類デスミンプロモーターが、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  7. 前記哺乳類デスミンプロモーターが、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  8. 前記哺乳類デスミンエンハンサーが、ヒトデスミンエンハンサーである、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  9. 前記哺乳類デスミンエンハンサーが、配列番号６の核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  10. 前記哺乳類デスミンエンハンサーが、配列番号６の核酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  11. 前記哺乳類デスミンエンハンサーが、マウスデスミンエンハンサーである、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  12. 前記哺乳類デスミンエンハンサーが、配列番号３の核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  13. 前記哺乳類デスミンエンハンサーが、配列番号３の核酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  14. 前記１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーが各々、ＭＣＫ ＣＫ７エンハンサーである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  15. 前記１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーが各々、ヒトＭＣＫエンハンサーである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  16. 前記１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーが各々、マウスＭＣＫエンハンサーである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  17. 前記１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーが各々、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  18. 前記１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーが各々、配列番号１１及び配列番号１２からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  19. 前記１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーが各々、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  20. 前記１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーが各々、配列番号１の核酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  21. 前記組換え筋特異的調節核酸配列の唯一のエンハンサーが、前記哺乳類デスミンエンハンサー及び前記１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサーである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  22. 前記組換え筋特異的調節核酸配列が、前記哺乳類デスミンエンハンサー及び前記１つ以上の哺乳類ＭＣＫエンハンサー以外のいかなる追加のエンハンサーも含まない、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  23. 前記組換え筋特異的核酸配列が、脊椎動物トロポニンＩ ＩＲＥ（ＦＩＲＥ）エンハンサーを含まない、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  24. １つ以上の追加のエンハンサーを更に含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  25. 配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む１つ以上の追加のエンハンサーを更に含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核配列。
  26. 配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される核酸配列を含む１つ以上の追加のエンハンサーを更に含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核配列。
  27. 前記筋特異的調節核酸配列が、２つ以上の前記哺乳類ＭＣＫエンハンサーを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  28. 前記筋特異的調節核酸配列が、１～３つの前記哺乳類ＭＣＫエンハンサーを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  29. イントロンの１つ以上のコピーを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  30. 前記イントロンの前記１つ以上のコピーが各々、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２９に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  31. 前記イントロンの前記１つ以上のコピーが各々、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項２９に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  32. 前記イントロンの前記１つ以上のコピーが、前記哺乳類デスミンプロモーターに対して３’に位置付けられる、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  33. 前記哺乳類デスミンエンハンサー及び前記哺乳類ＭＣＫエンハンサーが、前記哺乳類デスミンプロモーターに対して５’に位置付けられる、先行請求項のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  34. 前記哺乳類ＭＣＫエンハンサーが、前記哺乳類デスミンエンハンサーに対して５’に位置付けられる、請求項３３に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  35. 導入遺伝子を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  36. 前記導入遺伝子が、前記哺乳類デスミンプロモーターの制御下にある、請求項３５に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  37. 前記導入遺伝子が、前記哺乳類デスミンプロモーターの３’に位置付けられる、請求項３５に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  38. 前記筋特異的調節核酸配列が、１つの哺乳類デスミンエンハンサーのみを含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  39. 前記筋特異的調節核酸配列が、２つ以上の哺乳類デスミンエンハンサーを含まない、請求項１～３７のいずれか一項に記載の組換え筋特異的調節核酸配列。
  40. 配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、組換え筋特異的調節核酸配列。
  41. 配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８からなる群から選択される核酸配列を有する核酸配列を含む、組換え筋特異的調節核酸配列。
  42. 先行請求項のいずれか一項に記載の筋特異的調節核酸配列を含む、ベクター。
  43. 前記ベクターが、プラスミド、ミニサークル、Ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ、ＭＩＤＧＥ、ナノプラスミド、及びウイルスベクターからなる群から選択される、請求項４２に記載のベクター。
  44. 前記ベクターが、エピソーム非複製発現ベクター、エピソーム複製発現ベクター、トランスポゾン組み込みベクター、ウイルスベクター組み込みベクター、及び同一性指向修復組み込みベクターからなる群から選択される、請求項４２に記載のベクター。
  45. 前記ベクターが、ウイルスベクターであり、前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、並びにレンチウイルス及びレトロウイルスからなる群から選択される、請求項４２に記載のベクター。
  46. 前記ベクターが、ナノプラスミドであり、前記ナノプラスミドが、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項４２に記載のベクター。
  47. 請求項１～４１のいずれか一項に記載の筋特異的調節核酸配列又は請求項４２～４６のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  48. 真核筋細胞又は筋細胞において導入遺伝子を発現させるための方法であって、
    真核筋細胞又は筋細胞を、請求項４２～４６のいずれか一項に記載のベクターでトランスフェクトすること、を含む、方法。
  49. 細胞において導入遺伝子を含むベクターを複製するための方法であって、
    宿主細胞を、請求項４２～４６のいずれか一項に記載のベクターで形質転換することと、
    前記ベクターを複製するのに十分な条件下で前記細胞をインキュベートすることと、を含む、方法。
  50. ベクターであって、
    ｉ）５’及び３’末端を有する、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の筋特異的調節核酸配列を含む真核生物領域配列と、
    ｉｉ）前記真核生物領域配列の前記５’及び３’末端を連結し、細菌複製起点及びＲＮＡ選択可能マーカーを含む、５００未満の長さの塩基対を有するスペーサー領域と、を含む、ベクター。
  51. 前記筋特異的調節核酸配列が、１つの哺乳類デスミンエンハンサーのみを含む、請求項５０に記載のベクター。
  52. 前記筋特異的調節核酸配列が、２つ以上の哺乳類デスミンエンハンサーを含まない、請求項５０に記載のベクター。
  53. 前記筋特異的調節核酸配列が、３つの哺乳類ＭＣＫエンハンサーを含む、請求項５０～５２のいずれか一項に記載のベクター。
  54. 前記細菌複製起点が、Ｒ６Ｋ細菌複製起点である、請求項５０～５３のいずれか一項に記載のベクター。
  55. 前記細菌複製起点が、配列番号１９～２３のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項５４に記載のベクター。
  56. 前記ＲＮＡ選択可能マーカーが、配列番号２４又は配列番号２６と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項５０～５５のいずれか一項に記載のベクター。
  57. 筋特異的ベクターを産生するための方法であって、
    非筋特異的プロモーター又は非デスミンプロモーターを含むベクターを提供することと、
    前記ベクターを改変して、前記非筋特異的プロモーター又は非デスミンプロモーターを、請求項１～４１のいずれか一項に記載の筋特異的調節核酸配列で置き換えることと、を含む、方法。
  58. 前記ベクターが、ナノプラスミドである、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記細菌複製起点が、Ｒ６Ｋ細菌複製起点である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記細菌複製起点が、配列番号１９～２３のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記ＲＮＡ選択可能マーカーが、配列番号２４又は配列番号２６と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項５７～６０のいずれか一項に記載の方法。
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