KR20210119416A - 폐쇄-말단 dna (cedna), 및 유전자 또는 핵산 치료 관련 면역 반응을 감소시키는 방법에서의 이의 용도 - Google Patents

폐쇄-말단 dna (cedna), 및 유전자 또는 핵산 치료 관련 면역 반응을 감소시키는 방법에서의 이의 용도 Download PDF

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더글라스 앤써니 케르
필립 사마요아
로버트 엠. 코틴
매튜 지. 스탄톤
오잔 알칸
매튜 치오코
라지 라젠드란
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제너레이션 바이오 컴퍼니
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Abstract

ceDNA 벡터의 반복 투여에 의한 전이유전자의 전달에 의해 얻은 세포에 원하는 전이 유전자를 투여할 때, 면역반응, 특히 선천성 면역반응의 억제제를 사용하여 면역 반응을 최소화하는 것과 관련된 방법 및 제작물이 본원에 제공된다.

Description

폐쇄-말단 DNA (CEDNA), 및 유전자 또는 핵산 치료 관련 면역 반응을 감소시키는 방법에서의 이의 용도
관련 출원
본 출원은 2019년 1월 24일자 제출된 미국 임시출원 제62/796,417호, 2019년 2월 1일자 제출된 미국 임시출원 제62/800,303호, 2019년 1월 24일자 제출된 미국 임시출원 제62/796,450호, 2019년 2월 1일자 제출된 미국 임시출원 제62/800,285호, 2019년 3월 6일자 제출된 미국 임시출원 제62/814,414호, 2019년 3월 6일자 제출된 미국 임시출원 제62/814,424호, 및 2019년 6월 5일자 제출된 미국 임시출원 제62/857,542호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 문헌 각각은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하여, 이는 본원에 전체가 참조로서 인용된다. 2020년 1월 24일자 생성된 상기 ASCII카피는 131698-03320- Sequence_Listing-FINAL.txt로 명명되고, 크기는 117,124 바이트이다.
기술분야
본 발명의 구현예는 표적 세포, 조직, 기관 또는 유기체에 외인성 DNA 서열을 전달하는 것을 포함하는 유전자 치료와, 이에 대한 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)을 억제하기 위한 변형 및 방법의 분야에 관한 것이다.
유전자 치료는 유전자 발현 프로파일의 이상으로 인한 유전자 돌연변이 또는 후천성 질환을 앓고 있는 환자의 임상 결과를 개선시키는 것을 목표로 한다. 유전자 치료는 장애, 질환, 악성종양 등을 초래할 수 있는, 결함이 있는 유전자, 또는 비정상적인 조절 또는 발현, 예를 들어 과소발현(underexpression) 또는 과발현으로 인한 의학적 병태의 치료 또는 예방을 포함한다. 예를 들어, 결함있는 유전자에 의해 유발된 질병 또는 장애는, 교정(corrective) 유전 물질을 환자에게 전달함으로써 치료, 예방 또는 개선될 수 있거나, 또는 예를 들어 결함있는 유전자를 환자에 대한 교정 유전 물질로 변화시키거나 침묵시켜, 그 유전 물질을 환자 내에서 치료적으로 발현시킴으로써 치료, 예방 또는 개선될 수 있어서, 킬 수 있다.
유전자 치료의 기반은, 예를 들어, 양성 기능 획득(gain-of-function) 효과, 음성 기능 상실(loss-of-function) 효과, 또는 또 다른 결과를 발생시킬 수 있는 활성 유전자 산물(때때로, 전달유전자라고 지칭됨)을 갖는 전사 카세트를 제공하는 것이다. 이러한 결과는 활성화 항체 또는 융합 단백질 또는 억제성 (중화) 항체 또는 융합 단백질의 발현에 기인할 수 있다. 유전자 치료는 또한 다른 요인으로 인한 질환 또는 악성종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 인간 단일유전 장애는 정상 유전자를 표적세포에 전달하여 발현시키는 방식으로 치료될 수 있다. 교정 유전자를 환자의 표적세포에 전달하여 발현시키는 것은 조작된 바이러스 및 바이러스성 유전자 전달 벡터의 사용을 포함하는 다양한 방법을 통해 수행될 수 있다. 다수의 이용 가능한 바이러스 유래 벡터(예를 들어, 재조합 레트로바이러스, 재조합 렌티바이러스, 재조합 아데노바이러스 등) 중에서, 재조합 아데노관련바이러스(rAAV: recombinant adeno-associated virus)는 유전자 치료에서 다목적 벡터로서 인기를 얻고 있다.
아데노관련바이러스(AAV: adeno-associated virus)는 파보바이러스과에 속하며, 더욱 구체적으로는 데펜도파보바이러스(dependoparvovirus) 속을 구성한다. AAV로부터 유래한 벡터(즉, 재조합 AAV (rAVV) 또는 AAV 벡터)는, 유전 물질을 전달하는데 매력적인데, 그 이유는 (i) 이들이 근세포와 뉴런을 포함하는 매우 다양한 비-분열 세포 타입과 분열 세포 타입에 감염(형질도입)될 수 있고; (ii) 이들이 바이러스 구조 유전자가 결핍되어, 바이러스 감염에 대한 숙주 세포의 반응, 예를 들어, 인터페론-매개 반응을 약화시키며; (iii) 야생형 바이러스는 인간에서 비-병원성인 것으로 간주되며; (iv) 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있는 야생형 AAV와는 반대로, 복제-결핍성 AAV 벡터는 rep 유전자가 결핍되며, 일반적으로 에피좀(episome)으로 지속되어, 삽입성 돌연변이유발 또는 유전 독성(genotoxicity)의 위험성을 제한하며; (v) 다른 벡터 시스템에 비해, AAV 벡터는 일반적으로 비교적 약한(poor) 면역원으로 간주되므로, 유의한 면역 반응을 일으키지 않고((ii)를 참고한다), 따라서 벡터 DNA의 지속성 및 잠재적으로, 치료성 전이유전자의 장기 발현을 얻기 때문이다.
하지만, 유전자 전달 벡터로서 AAV 입자를 사용하는 데에는 몇 가지 주요 결함이 있다. rAAV 와 관련된 하나의 주요한 결점은, 이의 바이러스 패키징 용량이 약 4.5 kb의 이종 DNA에 제한되어, (Dong et al., 1996; Athanasopoulos et al., 2004; Lai et al., 2010), 그 결과 AAV 벡터의 사용이 150,000 Da 미만의 단백질 코딩 용량으로 제한된다는 점이다. 두 번째 단점은, 집단에서 야생형 AAV 감염의 유병률로 인해, rAAV 유전자 치료의 후보가 환자에서 벡터를 제거하는 중화 항체의 존재에 대해 스크리닝되어야 한다는 점이다. 세 번째 단점은, 초기 치료에서 제외되지 않았던 환자에 대한 재투여를 막는 캡시드 면역원성과 관련이 있다. 환자의 면역계는 향후 치료를 방해하는 높은 역가의 항-AAV 항체를 생성하는 면역계를 자극하기 위해 “부스터(booster)” 주사로서 효과적으로 작용하는 벡터에 반응할 수 있다. 일부 최근 보고서는, 고용량 조건에서 면역원성에 대한 우려를 나타낸다. 또 다른 주목할 만한 단점은, 단일가닥 AAV DNA가 이종 유전자 발현 전 이중가닥 DNA로 전환되어야 한다는 점을 고려할 때, AAV 매개 유전자 발현의 개시가 상대적으로 느리다는 점이다.
또한, 캡시드를 갖는 통상적인 AAV 비리온은 AAV 게놈, rep 유전자 및 cap 유전자를 함유하는 플라스미드 또는 플라스미드들의 도입을 통해 생성된다(Grimm 등의 문헌(1998)). 그러나, 이러한 캡슐화 AAV 바이러스 벡터는 특정 세포 및 조직 타입의 형질도입에 효과적이지 못하고, 캡시드는 또한 면역 반응을 유도하는 것으로도 발견되었다. 따라서, 유전자 치료에 대한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터의 사용은, (환자의 면역 반응으로 인한) 환자로의 단일 투여, 최소한의 바이러스 패키징 용량(약 4.5 kb)에 기인한 AAV 벡터에서 전달되기 적합한 전달유전자 유전 물질의 범위 제한, 및 느린 AAV-매개 유전자 발현 때문에 제한된다.
게다가, 포유류의 면역계는 바이러스 벡터 또는 핵산의 대상체로의 투여가 있다면 제거될 수 있는, 침투한 병원체와 비정상적인 세포 활성 및 과정을 탐지하여 이를 제거하는 다수의 메커니즘을 포함한다. 예를 들어, 패턴 인식 수용체(PRR)는 보존된 병원체-관련 분자, 예컨대 외부 핵산, 예를 들어, 바이러스 DNA와 바이러스 RNA의 탐지를 위한 센서로 작용하고, 선천적 면역 반응을 유발하도록 진화된 부류의 분자이다. Toll-유사 수용체(TLR)는 엔도좀의 맥락에서 핵산을 탐지하는 PRR의 그룹인데, TLR9(dsDNA, 우선적으로 비메틸화 CpG 반복부를 탐지함), TLR3(dsRNA를 탐지함), 및 TLR7(ssRNA를 탐지함)를 포함한다. PRR의 제2 시스템은 감염된 세포 내에서 외부 핵산, 특히 이중-가닥 RNA을 탐지하기 위해 사이토졸 내에 위치한다.1 “RIG-I-유사 수용체”라고 불리는 이들 PRR 또는 RLR은, RIG-I 및 MDA5를 포함한다. 이들 PRR은 RNA의 구조적인 특징, 예컨대 5’ 삼포스페이트와 이포스페이트, RNA 복제 중간 물질, 및/또는 전사 산물을 탐지하고, 타입 I 인터페론 반응의 활성화를 개시하는 헬리카제(helicase)이다.1, 2 PRR의 세번째 부류는 사이토졸 DNA에 의해 유발되는데, 주요 세포내 DNA 센서는 cGAS(사이클릭 GMP-AMP 합성효소)이며, 이는 DNA에 결합하고, 인터페론 유전자의 ER-행 자극제(STING)를 활성화하여, 타입 I 인터페론 반응을 활성화시키고, 일부 경우, AIM2(Absent in Melanoma), IFN-γ-유도성 단백질 16(IFI16), 인터페론-유도성 단백질 X(IFIX), LRRFIP1, DHX9, DHX36, DDX41, Ku70, DNA-PKcs, MRN 복합체(MRE11, Rad50 및 Nbs1 포함)2,7 및 RNA 중합효소 III10을 포함하는 다른 제안된 사이토졸 DNA 센서1,4,5를 활성화시킨다. AIM2, IFI16, 및 IFIX는 피린(pyrin) 및 HIN200 도메인 단백질(PYHIN) 단백질이다.2,6 또한, 인간 면역결핍성 바이러스 타입 1(HIV-1)로부터 유래된 단일-가닥 DNA(ssDNA)의 스템-루프 구조로서의, 짧은 염기-쌍의 DNA 스트레치에 측접하는(flanking) 짝짓지 않은 DNA 뉴클레오티드가 타입 I 인터페론-유도 DNA 센서 cGAS를 서열-의존적 방식으로 활성화하는 것으로 나타났다.8,9 짧은(12- 내지 20-bp) dsDNA(Y-형 DNA)에 측접하는 짝짓지 않은 구아노신을 함유하는 DNA 구조는, 매우 자극적이고, 특히 cGAS의 효소 활성을 개선시켰다.8,9
보다 최근에는, NOD-유사 수용체(NLR)를 포함하는 다른 세포내 미생물 센서도 확인되었다. NLR 중 일부는 또한 비미생물성 위험 신호를 감지하여, 인플라마좀(inflammasome)이라고 부르는 거대한 세포질 단백질 복합체를 형성하는데, 이는 선천성 면역과 염증의 중심 조절자이다(Martinon et al., Annu. Rev. Immunol. 2009 27: 229-65).
인플라마좀은 NLR 또는 AIM2 패밀리 수용체와 프로카스파제-1으로 구성된다. 카스파제 소환 도메인을 포함하는 어팝토시스-관련 스펙(speck)-유사 단백질(ASC)은 어뎁터 단백질이며, NLR 패밀리 일원을 프로카스파제-1에 연결시킨다. NLR 패밀리의 일원은 인플라마좀 복합체를 ASC와 함께 조립시키고, 그 다음에 카스파제-1를 소환하여, 이를 활성화시킨다. 패밀리 단백질의 몇몇 일원은, NLR 패밀리 피린 도메인-함유 3 (NLRP3; 또한 크리오피린(cyropyrin) 또는 NALP3로도 알려짐), NLR 패밀리 CARD 도메인-함유 4(NLRC4; 또한 IPAF로도 알려짐), 및 NLRP1을 포함하는 분명한 인플라마좀의 형성에 참여한다. 상이한 인플라마좀들은 다양한 자극원에 의해 활성화된다. 예를 들어, NLRP1은 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)에 의해 생성된 치명적인 독소에 의해 활성화되나, NLRC4는 살모넬라(Salmonella), 레지오넬라(Legionella) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 종에 의해 감염된 세포에서 사이토졸 플라겔린(flagellin)에 반응한다. NLRP3 인플라마좀은 미생물 산물과 내인성 신호, 예컨대 요산염 결정, 실리카, 아밀로이드 피브릴(fibril) 및 ATP를 포함하는 매우 다양한 자극원에 의해 활성화된다.
NOD-유사 수용체 (NLR) 센서 요소(즉, 크리오피린 (NLRP3 또는 NALP3))은, 조직 부상 또는 스트레스(예를 들어, 세포외 ATP, 요산염 결정, β-아밀로이드, 세포 찌꺼기) 동안 방출된 위험 신호, 예컨대 손상 관련 분자 패턴 분자(DAMP)와 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)을 인식한다. 인플라마좀은 이들 병원체 감염 또는 “위험” 신호에 반응하여 조립되며, 크리오피린의 피린 도메인과 어뎁터 요소 ASC의 상호 작용을 필요로 하며, 카스파제-1의 소환과 (프로-카스파제-1로부터) 카스파제-1의 활성화를 유발하며, 이후 인터루킨-1β (IL-1β), IL-18, 및 IL-33)을 포함하는 몇몇 전염증성 사이토카인의 성숙과 방출로 이어진다.
NLR 외에, AIM2 패밀리 일원은 인플라마좀을 활성화시킬 수 있다. AIM2는 피린 도메인과 DNA-결합 HIN 도메인의 존재를 특징으로 하며, 사이토졸 DNA를 탐지함으로써 카스파제-1을 활성화시킨다(Fernandes-Alnemri T, et al. 2009. Nature 458:509-513). 인플라마좀의 조립은 TLR를 통한 선행 프라이밍 신호가 필요하며, 제2 신호가 인플라마좀 복합체 형성을 개시할 수 있기 전에, 인플라마좀 수용체와 기질 전-IL-1β의 발현을 상향 조절할 것을 요구한다 (Bauernfeind FG, et al. 2009.J. Immunol. 183:787-791).
비록 개념상 멋지기는 해도, 인간 질병을 치료하기 위한 핵산 분자 사용의 전망은 불확실하다. 이러한 불확실성의 주요 원인은, 핵산 치료제에 대한 숙주의 선천적 면역 반응과 관련된 명백한 유해 효과, 및 따라서, 이 물질들이 면역 반응의 맥락에서 이들의 의도된 표적의 발현을 조절시키는 방식이다. 임상적 응용에 맞게 채택될 수 있는 핵산 분자의 생성, 기능, 거동 및 최적화를 둘러싼 당업계의 현재의 상태는, 이하에 특히 중점을 둔다: (1) 번역과 유전자 발현을 직접 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이중체 RNA; (2) 장기적인 후생학적 변형을 발생시키는 전자 유전자 침묵 RNA; (3) 유전자 스플라이싱 패턴과 상호작용하여, 이를 변화시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드; (4) 자연 발생하는 AAV 또는 렌티바이러스 게놈의 생리적 기능을 모방하는 합성 또는 바이러스 벡터의 생성; 및 (5) 치료 올리고뉴클레오티드의 생체 내 전달. 그러나, 비록 최근 명백히 임상적 성취를 이룬 핵산 치료제의 개발로 인해 진보되기는 했지만, 유전자 치료의 분야는, 아직도 치료 핵산 그 자체가 수여자에게 유발하는 원치 않는 유해 효과에 때문에 심각하게 제한되어 있다.
따라서, 매우 다양한 질병의 치료를 위해 세포, 조직 또는 대상체에서 치료 단백질을 발현시키는, 벡터 또는 핵산을 대상체에 투여시 면역 반응을 억제하는(예를 들어, 감소, 개선, 완화, 예방하는) 새로운 기술의 분야에 대한 필요성이 있다.
본 개시 내용은 유전 질환으로 고통받고, 유전자 또는 핵산 치료 (“핵산 치료제” 또는 “치료 핵산” (TNA))를 받은 대상체에서, 면역 반응을 저해하는(즉, 감소 또는 억제하는) 방법 및 약학적 조성물을 제공한다. 공유적으로-폐쇄된 말단 (ceDNA 벡터)을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터, 및 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)을 억제하기 위한 억제제도 본원에 제공된다. 일부 구현예에 의하면, 약학적 조성물 및 제형은 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 하나 이상의 억제제, 예컨대 라파마이신(rapamycin) 및 이의 라파마이신 유사체, TLR 길항제 (예를 들어, TLR9 길항제), cGAS 길항제 및 인플라마좀 길항제 (예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나 이상)를 포함할 수 있다.
일부 양태에 의하면, 본 개시 내용은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 캡시드-불포함 (예를 들어, 비-바이러스성) DNA 벡터(본원에서, “폐쇄-말단 DNA 벡터” 또는 “ceDNA 벡터”라고 지칭됨)로부터의 선천적 면역 반응의 억제제를 발현시키기 위해, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA 벡터)를 사용하여, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)을 저해하는(즉, 감소시키거나, 억제시키는) 조성물 및 방법을 제공하는데, 상기 ceDNA 벡터는 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 핵산 서열 또는 이의 코돈 최적화된 버전을 포함한다.
일부 양태에 의하면, 본 개시 내용은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 캡시드-불포함(예를 들어, 비-바이러스) DNA 벡터(본원에서, “폐쇄-말단 DNA 벡터” 또는 “ceDNA 벡터”라고 함)로부터 라파마이신 및 이의 라파마이신 유사체를 발현시키기 위해, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA 벡터)를 사용하여, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)을 저해하는(즉, 감소시키거나, 억제하는) 조성물 및 방법을 제공하는데, 상기 ceDNA 벡터는 라파마이신 및 이의 라파마이신 유사체의 핵산 서열 또는 이의 코돈 최적화된 버전을 포함한다. 따라서, 이들 ceDNA 벡터는 면역계(예를 들어, 선천성 면역계)를 억제하기 위해 라파마이신 및 이의 라파마이신 유사체를 생성하는데 사용될 수 있다.
일부 양태에 의하면, 본 개시 내용은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 캡시드-불포함(예를 들어, 비-바이러스) DNA 벡터(본원에서, “폐쇄-말단 DNA 벡터” 또는 “ceDNA 벡터”라고 함)로부터 TLR 길항제를 발현하기 위해, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA 벡터)를 사용하는, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)을 저해하는(즉, 감소시키거나, 억제하는) 조성물 및 방법을 제공하는데, 상기 ceDNA 벡터는 TLR 길항제의 핵산 서열 또는 이의 코돈 최적화된 버전을 포함한다. 따라서, 이들 ceDNA 벡터는 면역계(예를 들어, 선천성 면역계)를 억제하기 위해 TLR 길항제를 생성하는데 사용될 수 있다.
일부 양태에 의하면, 본 개시 내용은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 캡시드-불포함(예를 들어, 비-바이러스) DNA 벡터(본원에서, “폐쇄-말단 DNA 벡터” 또는 “ceDNA 벡터”라고 함)로부터 cGAS 길항제를 발현시키기 위해, 공유적으로-폐쇄된 말단(ceDNA 벡터)을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터를 사용하여, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)을 저해하는(즉, 감소시키거나, 억제하는) 조성물 및 방법을 제공하는데, 상기 ceDNA 벡터는 cGAS 길항제의 핵산 서열 또는 이의 코돈 최적화된 버전을 포함한다. 따라서, 이들 ceDNA 벡터는 면역계(예를 들어, 선천성 면역계)를 억제하기 위해 cGAS 길항제를 생성하는데 사용될 수 있다.
일부 양태에 의하면, 본 개시 내용은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 캡시드-불포함(예를 들어, 비-바이러스) DNA 벡터(본원에서, “폐쇄-말단 DNA 벡터” 또는 “ceDNA 벡터”라고 함)로부터 NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합을 발현시키기 위해, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA 벡터)를 사용하여, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)을 저해하는(즉, 감소시키거나, 억제하는) 조성물 및 방법을 제공하는데, 상기 ceDNA 벡터는 NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합의 핵산 서열 또는 이의 코돈 최적화된 버전을 포함한다. 따라서, 이들 ceDNA 벡터는 면역계(예를 들어, 선천성 면역계)를 억제하기 위해, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합을 생성하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에 의하면, 약학적 조성물 및 제형은 다양한 타입의 치료 핵산(TNA) 및 담체(예를 들어, 지질 나노 입자)와 함께, 본원에 기재된 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 의하면, 조성물은 추가로 부형제 또는 담체를 포함한다. 일부 구현예에 의하면, 약학적 조성물은 지질 나노 입자(LNP)를 포함한다. 구현예에서, LNP는 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에 의하면, LNP는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 일부 구현예에 의하면, LNP는 콜레스테롤을 포함한다.
본원에 기재된 방법은 일반적으로 전이유전자(예를 들어, 치료 핵산 (TNA))의 투여와 관련된 면역 반응을 예방, 감소, 완화 또는 심지어 제거하기 위한 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제(예를 들어, 라파마이신 및 이의 유사체, TLR 길항제, cGAS 길항제)의 사용을 포함한다. 이의 투여 단계를 포함하는 방법도, 본원에서 설명된다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 RNA 분자, 또는 이의 유도체이다. 일 구현예에서, RNA 분자는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA이다. 일 구현예에서, RNA는 간섭 RNA(RNAi) 이다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 mRNA 분자이다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 DNA 분자, 또는 이의 유도체이다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 DNA 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일 구현예에서, DNA 안티센스 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 기반의 핵산이다. 일 구현예에서, 모르폴리노 기반의 핵산은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO) 이다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 폐쇄-말단 DNA(ceDNA) 이다. 일 구현예에서, ceDNA는 프로모터 서열과 전이유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 일 구현예에서, ceDNA는 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 일 구현예에서, ceDNA는 발현 카세트의 5’ 말단 또는 3’ 말단 중 어느 하나에 측접하는 적어도 하나의 역위 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 일 구현예에서, 발현 카세트는 2개의 ITR에 의해 측접되며, 여기에서 2개의 ITR은 하나의 5’ ITR과 하나의 3’ ITR을 포함한다. 일 구현예에서, 발현 카세트는 3’ 말단에서 ITR에 연결된다(3’ ITR). 일 구현예에서, 발현 카세트는 5’ 말단에서 ITR에 연결된다(5’ ITR). 일 구현예에서, ceDNA는 5’ ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, ceDNA는 3’ ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 스페이서 서열은 적어도 5개 염기 쌍의 길이이다. 일 구현예에서, 스페이서 서열은 5 내지 200개 염기쌍의 길이이다. 일 구현예에서, 스페이서 서열은 5 내지 500개 염기쌍의 길이이다.
일 구현예에서, ITR은 AAV 혈청형에서 유래한 ITR이다. 일 구현예에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, ITR은 거위 바이러스의 ITR에서 유래한다. 일 구현예에서, ITR은 B19 바이러스 ITR에서 유래한다. 일 구현예에서, ITR은 파보바이러스 유래의 야생형 ITR이다. 일 구현예에서, ITR은 돌연변이 ITR이다. 일 구현예에서, ceDNA는 발현 카세트의 5’ 말단과 3’ 말단 둘 다에 2개의 돌연변이 ITR을 포함한다.
일 구현예에서, ceDNA는 닉(nick) 또는 갭(gap)을 갖는다.
일 구현예에서, ceDNA는 무세포 환경에서 합성에 의해 생산된다.
일 구현예에서, ceDNA는 세포 내에서 생산된다. 일 구현예에서, ceDNA는 곤충 세포 내에서 생산된다. 일 구현예에서, 곤충 세포는 Sf9이다. 일 구현예에서, ceDNA는 포유류 세포 내에서 생산된다. 일 구현예에서, 포유류 세포는 인간 세포주이다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 발현 카세트의 5’ 말단과 3’ 말단에 적어도 하나의 프로텔로머라제(protelomerase) 표적 서열을 포함하는 폐쇄-말단 DNA이다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 발현 카세트의 5’ 말단과 3’ 말단에 2개의 헤어핀 구조의 ITR을 포함하는, 덤벨 형태의 선형 이중체 폐쇄-말단 DNA이다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 DNA-계 미니서클(minicircle) 또는 MIDGE이다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 선형의 공유적으로 폐쇄된-말단 DNA 벡터이다. 일 구현예에서, 선형의 공유적으로 폐쇄된-말단 DNA 벡터는 미니스트링(ministring) DNA이다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 doggybone(dbDNA™) DNA이다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 미니유전자(minigene)이다.
일 구현예에서, 치료 핵산은 플라스미드이다.
따라서, 일부 양태에서, 세포에서 전이유전자가 발현될 때, 면역 반응을 저해 또는 억제하기 위한 방법이 본원에 제공되는데, 이는: (1) 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA 벡터)를 포함하는 조성물과, (2) 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 세포에 공동-투여하는 단계를 포함한다. ceDNA 벡터는 2개의 상이한 AAV 역위 말단 반복 서열들(ITR) 사이에 작용 가능하게 위치한 전이유전자를 인코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하고, ITR 중 하나는 기능성 AAV 말단 분해 부위와 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 하나의 ITR에 비해 결실, 삽입, 또는 치환을 포함하여, 상기 ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 절단될 경우, 비-변성 겔에서 분석할 때, 선형의 불연속 DNA 대조군에 비해 선형의 연속 DNA의 특징적인 밴드가 존재한다. 일부 구현예에서, 본원에서 나타나는 바와 같이, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 WO 2016/073799에서 설명된 바와 같이 합성 나노담체를 사용하여 공동-투여되며, 상기 문헌의 내용은 본원에 전체가 참조로서 인용된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 또한 나노담체 내에 있다. 일부 구현예에 의하면, 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 라파마이신 및 이의 라파마이신 유사체, TLR 길항제(예를 들어, TLR9 길항제), cGAS 길항제 및 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나 이상)로부터 선택된다. 일부 구현예에 의하면, TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드는 ITR 중 적어도 하나에 있다. 일부 구현예에 의하면, cGAS의 억제제는 ceDNA에 의해 인코딩화되고, 프로모터, 예컨대 유도성 프로모터에 작용 가능하게 연결된다. 다른 구현예에서, cGAS의 억제제는 ceDNA에 의해 인코딩되지 않는다.
추가로, 일 양태에서, (i) 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA 벡터)(여기에서, ceDNA 벡터는 2개의 상이한 AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)들 사이에 작용 가능하게 위치한 전이유전자를 인코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하는데, ITRS 중 하나는 기능성 AAV 말단 분해 부위와 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 비해 결실, 삽입 또는 치환을 포함하며, 여기에서 ceDNA 벡터는, ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 절단될 경우, 비-변성 겔에서 분석될 때, 선형의 불연속 DNA 대조군에 비해 선형의 연속 DNA의 특징적인 밴드가 존재한다), 및 (ii) 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응) 의 억제제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 나타난 바와 같이, 일부 구현예에서, 조성물의 성분은 별도의 합성 나노담체 내에 제제화된다. 일 구현예에서, 조성물의 성분은 동일한 합성 나노담체 중에 제제화된다. 일부 구현예에 의하면, 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 라파마이신 및 이의 라파마이신 유사체, TLR 길항제(예를 들어, TLR9 길항제), cGAS 길항제 및 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나 이상)로부터 선택된다.
본원에 기재된 비-바이러스성 캡시드 불포함 DNA 벡터는, 발현 제작물(construct)(예를 들어, 플라스미드, 박미드, 바큘로바이러스, 또는 통합된 세포주)(예를 들어, 2018년 9월 7일자 제출된 국제 특허 출원 PCT/US18/49996에 개시된 실시예 참고)로부터 생산되거나, 합성 생산을 사용하여(예를 들어, 2018년 12월 6일자 제출된 국제 특허 출원 PCT/US19/14122에 개시된 실시예 참고) 수용성(permissive) 숙주 세포로부터 생산될 수 있고, 상기 문헌은 각각 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 유용한 ceDNA 벡터는, 이종 핵산, 예를 들어 2개의 역위 말단 반복부(ITR) 서열들 사이에 위치한 전이유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, ITR들 중 적어도 하나는 야생형 ITR 서열(예를 들어 AAV ITR)에 비해 결실, 삽입, 및/또는 치환에 의해 변형되며; ITR들 중 적어도 하나는 기능성 말단 분해 부위(TRS)와 Rep 결합 부위를 포함한다.
다른 양태에 의하면, 본 개시 내용은 대상체에서 유전 질환을 치료하기 위한 방법을 특징으로 하는데, 상기 방법은 대상체에게 본원에 개시된 유효량의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 도 2의 개략도에 설명된 공정에서 ceDNA 벡터의 생산에 유용한 바큘로-감염된 곤충 세포(BIIC)를 제조하기 위한 업스트림(upstream) 공정의 일 구현예를 나타내는 개략도이다. i) 미경험(Naive) 곤충 세포의 두 집단에 Rep 단백질 플라스미드 또는 DNA 벡터 생성 플라스미드 중 하나를 형질감염시키고; ii) 바이러스 상청액을 모아서, 두 개의 새로운 미경험 곤충 세포의 집단에 감염시켜, DNA 벡터 제작물인 BIICS-1 및 BIICS-2(REP)를 생성한다. BIICS는 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포로 지칭된다. 선택적으로, 단계 ii)는 재조합 바큘로바이러스를 더 많은 양으로 생산하기 위해 1회 또는 다수 회 반복될 수 있다.
도 2는 본원에 기재된 ceDNA 벡터의 생산을 위한 하나의 구현예를 예시하는 개략도이다.
도 3은 본원에 기재된 DNA 벡터의 특성화를 위한 일 구현예를 나타내는 개략도이다(다운스트림(downstream) 공정).
도 4a 내지 도 4d는 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 제조하는데 유용한 예시적인 플라스미드와 상기 플라스미드의 요소를 나타내는 개략적인 다이어그램이다. 도 4a는 예시적인 Rep 플라스미드를 나타내고, 도 4b는 ceDNA 벡터 템플레이트(template)를 함유하는 예시적인 플라스미드 TTX 벡터 플라스미드를 나타낸다. 도 4c 및 도 4d는 본원에 제공된 ceDNA 벡터를 제조하는데 유용한 DNA 벡터 템플레이트의 예시적인 기능성 요소들의 개략도이다. 관심대상 핵산(예를 들어, 리포터(reporter) 핵산, 예컨대 루시퍼라제(luciferase), 또는 예를 들어, 치료 핵산)라고도 불리는 전이유전자는, 2개의 상이한 ITR 사이에 위치한다. 변형된 ITR은 템플레이트에서 좌측 방향(도 4c) 또는 우측 방향(도 4d)으로 배향될 수 있다. 또한, 관심대상인 핵산은 프로모터, 인핸서 및 종결 요소에 작용 가능하게 연결될 수 있다. 대안적 구현예에서, 좌측 ITR(5’ITR) 또는 우측 ITR(3’ ITR)은 임의의 타입일 수 있다. 예시적인 목적으로, 도 4c 및 도 4d와 본원의 실시예에서 ceDNA 제작물 내의 ITR은, 변형된 ITR (ΔITR)와 WT ITR (ITR)를 나타내고, 비대칭성 ITR 쌍의 예이다. 그러나, 임의의 2개의 역위 말단 반복부(ITR) 서열들 사이에 위치한 이종 핵산 서열(예를 들어, 전이유전자)을 함유한 ceDNA 벡터도 포괄하며, 여기에서 ITR 서열은 이들 용어가 본원에 정의된 바와 같이, 비대칭적 ITR 쌍, 또는 대칭적 ITR 쌍 또는 실질적으로 대칭적 ITR 쌍일 수 있다. 본원에 개시된 NLP를 포함하는 ceDNA 벡터는, 이하의 것들 중 어느 것으로부터 선택된 ITR 서열을 포함할 수 있고: (i) 적어도 하나 WT ITR와 적어도 하나의 변형된 AAV 역위 말단 반복부(변형-ITR)(예를 들어, 비대칭적인 변형된 ITR); (ii) 변형-ITR 쌍이 서로에 대해 상이한 3-차원 공간 구성을 갖는2개의 변형된 ITR(예를 들어, 비대칭적인 변형된 ITR), 또는 (iii) 각각의 WT-ITR이 동일한 3-차원 공간 구성을 갖는 대칭적인 또는 실질적으로 대칭적인 WT-WT ITR 쌍, 또는 (iv) 각각의 변형-ITR이 동일한 3-차원 공간 구성을 갖는, 대칭적인 또는 실질적으로 대칭적인 변형 ITR 쌍, 여기에서 본 개시 내용의 방법은 전달 시스템, 예컨대 리포좀 나노입자 전달 시스템을 추가로 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
도 5a 및 도 5b는 본원에 기재된 DNA 벡터의 존재를 확인하기 위한 일 구현예를 예시하는 도면이다. 도 5a는 불-연속 구조를 갖는 DNA(비-폐쇄된 DNA, 예를 들어 개방 말단을 갖는 템플레이트 TTX 벡터로부터 단리된 대조군 카세트 DNA), 및 상기 불연속 DNA 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의해 절단될 때 생성된 예시적인 특징적인 밴드, 예를 들어 변성 조건 하에서 관찰되는 상이한 예상 크기(예를 들어, 1 kb 및 2 kb)의 2개의 DNA 절편을 나타낸다. 도 5b는 폐쇄-말단 선형의 연속 구조를 갖는 DNA, 및 상기 선형 이중체 연속 DNA 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 때 생성되는 예시적인 특징적인 밴드를 나타내며, 예를 들어 변성 조건 하에서 상이한 크기(예를 들어, 2 kb 및 4 kb)의 2개의 DNA 절편이 관찰되었고, 이들은 DNA가 불연속될 때 기대되는 것보다 2배 더 크다. 비록 DNA가 변성되었지만, 상보성 가닥들은 공유적으로 결합되며, 생성된 변성 산물은 상응하는 불-연속 산물의 길이의 2배를 갖는 단일-가닥 DNA이다.
도 6은 매우 안정한 DNA 벡터의 존재와, 매우 안정한 폐쇄-말단 DNA(ceDNA 벡터)의 존재를 확인하는 특징적인 밴드를 나타내는 예시적인 비-변성 겔이다.
도 7은 본원에 개시된 공정에 의해 생산된 DNA 물질을 평가하기 위한 겔 및 정량화 표준 곡선이다.
도 8은 다양한 제작물을 함유하는 HEK293 세포로부터 발현되고, 인자 IX 항체를 사용하여 시각화된 FIX 단백질의 웨스턴 블롯 분석이다.
도 9는 실시예 24의 결과에 대한 그래프 묘사를 제공한다. 수역학적으로 투여된 샘플은, 3일간의 연구 기간 동안 비- 수역학적으로 투여된 샘플에 비해, 총 자속밀도(예를 들어, 루시퍼라제 발현)에서 유의한 상승을 나타내었다.
도 10a 및 10b는 실시예에 기재된 THP-1 배양된 세포 실험으로부터 얻은 데이터를 제공하며, ceDNA 벡터와 면역 억제제가 처리된 세포에서의 인터페론 반응을 평가한다. 도 10a는 무손상 cGAS/STING 및 TLR9 경로를 갖는 THP-1 세포에서의 ceDNA에 반응한 인터페론 경로 활성화를 나타내지만, 어느 한 경로가 손상된 동일한 세포에서는 활성화가 없었다. 별도로, 억제제 A151 또는 BX795 중 하나를 포함하면, 이러한 인터페론 경로 활성화를 유사하게 감소시킨다. 도 10b는 A151 및 AS1411에 의한 인터페론 유도 억제의 용량-의존성을 나타내는 유사한 실험이다. 각 그룹의 막대에서, 2.5 μM 용량은 좌측이고, 1.25 μM 용량은 중앙이고, 0.625 μM 용량은 우측이다.
도 11a 및 11b는 실시예 26에서 얻은 데이터의 그래프를 제공한다. 도 11a는 세포로 투여되기 전에 ceDNA에 존재하는 CpG가 메틸화될 때, ceDNA 투여시 NF-κB 유도의 감소를 나타낸다. 도 11b는 면역 억제제 A151를 포함하면, 본 검정법에서의 CpG 메틸화와 동일한 정도로 ceDNA-자극된 NF-κB 유도가 감소된다는 사실을 추가로 나타낸다.
도 12a 내지 도 12c는 실시예 26에 기재된 실험의 결과를 제공한다. 도 12a 및 도 12b는 ceDNA 벡터-처리된 마우스 또는 LNP-폴리 C 대조군-처리된 마우스로부터 채취한 혈액 샘플에서 실시된 각각의 사이토카인 유도 검정법으로부터 얻은 데이터의 그래프이며, 조사 대상인 특정 사이토카인은 각 그래프의 상부에 반영되어 있다. 도 12c는 처리된 마우스에서 ceDNA-구동 루시퍼라제 발현 검정법으로부터 얻은 데이터를 제공하는데, 이는 연구의 지속 기간 동안 각 그룹의 마우스에서의 총 자속밀도를 나타낸다. 비메틸화 CpG 수준이 높을수록, 마우스에서 더 낮은 총 자속밀도(total flux)가 관찰되는 것과 관련된다.
도 13은 새로 태어난 8일차 마우스에서의, 실시예 27에 기재된 시험으로부터 얻은 총 자속밀도 데이터를 제공한다. 연구 기간 동안, ceDNA-높은 CpG는 검정법의 기간 동안 총 자속밀도가 감소하는 반면, 비메틸화 CpG가 감소되거나, 없는 ceDNA의 경우 루시퍼라제 발현을 유지한다. 단일 재투여는 CpG-최소화 또는 CpG-없는 샘플에서 관찰된 발현 수준을 완만히 증가시켰으나, 높은 CpG 샘플 그룹에서는 재투여시 이러한 지속된 증가가 관찰되지 않았다.
도 14a 내지 도 14c는 실시예 28에 기재된 실험의 결과를 제공한다. 도 14a 및 도 14b는 돌연변이 STING 유전적 배경을 갖는 ceDNA 벡터-처리된 마우스로부터 채취한 혈액 샘플, 또는 폴리C 대조군-처리된 샘플에서 실시된 각각의 사이토카인 유도 검정법으로부터 얻은 데이터의 그래프이며, 조사 대상인 특정 사이토카인은 각 그래프의 상부에 반영되어 있다. IL-18을 제외하고, 사이토카인의 유도가 저 및 비-메틸화 CpG ceDNA의 맥락에서 유의하게 더 낮게 관찰되었다. 도 14c는 처리된 돌연변이 STING 마우스의 ceDNA-구동 루시퍼라제 발현 검정법으로부터의 데이터를 제공하는데, 연구 지속 기간 동안 각 그룹의 마우스에서의 총 자속밀도를 나타낸다. 상기 발견은 ceDNA에서의 높은 수준의 비메틸화 CpG와 관찰된 낮은 총 자속밀도 사이의 관련성을 다시 한번 나타내었다.
도 15a 및 도 15b는 Padua FIX와, 본원에 개시된 매우 안정한 DNA 벡터로부터의 FIX 전이유전자의 발현을 나타낸다. 플라스미드 또는 벡터로부터 발현된 FIX 단백질 수준의 정량적 분석은, 또한 VisuLize 인자 IX ELISA 키트(Affinity Biologicals, #FIX-AG)를 사용하여, 판매 회사가 제공한 프로토콜에 따라 평가되었다.
도 16a 및 16b는 실시예 10에 기재된 Rag2 마우스에서의 ceDNA 지속성 및 재투여 연구의 결과를 나타낸다. 도 16a는 LNP-ceDNA-Luc-처리된 야생형 c57bl/6 마우스 또는 Rag2 마우스에서 관찰된, 시간의 경과에 따른 총 자속밀도의 그래프를 나타낸다. 도 16b는 Rag2 마우스에서 루시퍼라제 전이유전자의 발현 수준에 대한 재투여의 효과를 나타내는 그래프를 제공하며, 재투여 이후 안정된 발현의 증가가 관찰되었다(화살표는 재용량 투여의 시점을 나타낸다).
도 17은 실시예 29에 기재된, 처리된 마우스에서의 ceDNA 루시퍼라제 발현 연구로부터 얻은 데이터를 제공하는데, 연구의 지속 기간 동안 각 그룹의 마우스에서의 총 자속밀도를 나타낸다. 높은 수준의 비메틸화 CpG는 시간의 경과에 따라 마우스에서 관찰되는 더 낮은 총 자속밀도와 관련되는 반면, 간-특이적 프로모터의 사용은 ceDNA 벡터로부터의 전이유전자의 적어도 77일 동안의 지속적이고 안정된 발현과 관련된다.
도 18a 내지 18h는 ceDNA 벡터 투여 이후 사이토카인 수준을 나타내는데, NLRP3 억제제(MCC950) 또는 카스파제 1 억제제(VX765)에 의해 약리학적 대식세포가 고갈되었다. 도 18a는 IFN-α 수준을 나타내고, 도 18b는 IFN-γ 수준을 나타내는데, NLRP3 억제제 MCC950에 의해 IFN-γ이 유의하게 감소되고(화살표), 도 18c는 IL-β 수준을 나타내고, 도 18d는 IL-18 수준을 나타내는데, IFN-γ은 NLRP3 억제제 MCC950에 의해 유의하게 감소했으며(화살표 참고), 도 18e는 IL-6 수준을 나타내고, 도 18f는 IP-10 수준을 나타내고, 도 18g는 MCP-1 수준을 나타내고, 도 18h는 TNFα 수준을 나타낸다.
핵산 전달 벡터 및 치료제는 여러가지 응용, 예컨대 유전자 발현과 이의 조작을 위한 유망한 치료제이다. 바이러스 전달 벡터는 단백질 또는 핵산을 인코딩하는 전이유전자를 포함할 수 있다. 이러한 예는 AAV 벡터, 마이크로RNA(miRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 뿐만 아니라 메신저 RNA의 돌연변이 부위에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 작은 핵 RNA(snRNA))를 포함한다. 불행하게도, 바이러스 전달 벡터에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응에 크게 기인하여, 이들 치료제의 전망은 아직 실현되지 않았다. 이들 면역 반응은 항체, B 세포 및 T 세포 반응을 포함하며, 종종 바이러스 전달 벡터의 바이러스 항원, 예컨대 바이러스 캡시드 또는 코트 단백질 또는 이의 펩티드에 특이적이다.
최근, 많은 잠재적인 환자들은 바이러스 전달 벡터가 유래한 바이러스에 대해, 어느 정도의 기존의 면역성을 갖는다. 사실, 바이러스 핵산(DNA 및 RNA 둘 다) 또는 단백질에 대한 항체는, 인간 집단에서 매우 널리 퍼져 있다. 또한, 비록 예를 들어, 바이러스 전달 벡터의 낮은 면역원성 때문에 기존의 면역 수준이 낮더라도, 이러한 낮은 수준은 여전히 성공적인 형질도입을 방해할 수 있다(예를 들어, Jeune, et al., Human Gene Therapy Methods, 24:59-67 (2013)). 따라서, 심지어 낮은 수준의 기존의 면역성에 의해서도 환자에서 특정 바이러스 전달 벡터의 사용이 방해될 수 있고, 이로 인해 임상 의사가 효능이 없을 수도 있는 상이한 혈청형의 바이러스에 기초한 바이러스 전달 벡터를 선택해야 하거나, 다른 바이러스 전달 벡터 치료를 이용할 수 없는 경우 심지어 상이한 타입의 치료를 함께 선택해야 할 수도 있다.
추가적으로, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-관련 벡터는, 매우 면역원성이 높고, 특히 재-투여에 대한 효능을 약화시킬 수 있는 체액성 면역과 세포-매개 면역을 유발할 수 있다. 사실, 바이러스 전달 벡터에 대한 세포성 면역과 체액성 면역 반응은, 바이러스 전달 벡터의 단일 투여 이후 발달할 수 있다. 바이러스 전달 벡터 투여 이후, 중화 항체 역가는 증가하며, 수년간 높게 유지될 수 있고, 바이러스 전달 벡터의 재-투여의 효율을 감소시킬 수 있다. 정말로, 바이러스 전달 벡터의 반복 투여는 일반적으로 향상된 원치 않는 면역 반응을 일으킨다. 또한, 예를 들어, 바이러스 핵산 또는 캡시드 단백질과 같은 바이러스 항원에 재-노출될 때, 바이러스 전달 벡터-특이적인 CD8+ T 세포가 발생하여, 원하는 전이유전자 산물을 발현하는 형질도입된 세포를 제거할 수 있다. 예를 들어, AAV 핵산 또는 캡시드 항원이 AAV 바이러스 전달 벡터가 형질도입된 간세포에서 면역-매개성 파괴를 유발할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 많은 치료 응용을 위해, 바이러스 전달 벡터의 다수의 투여 라운드가 장기적인 이점을 위해 필요하다고 생각된다. 그러나, 이를 위한 능력은 특히 재-투여가 필요한 경우, 본원에 제공된 방법 및 조성물이 없이는 심각히 제한될 것이다.
상기 방법 및 조성물은 바이러스 또는 비-바이러스 (합성) 전달 벡터, 및 치료를 위한 다른 핵산 치료제를 포함한 다양한 핵산 치료제의 효과적인 사용에 대한 상기 언급된 장애물에 대한 해결책을 제공한다. 본 개시 내용은 표적 세포, 기관 또는 유기체에 대한 외인성 DNA 서열의 전달과, 이에 대한 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)을 저해하는(즉, 감소시키거나, 억제하는) 변형 및 방법에 관한 것이다. 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)을 저해하는(즉, 감소시키거나, 억제하는) 이러한 변형 및 방법은, 예를 들어, 전이유전자 발현의 지속성을 향상시키는데 사용될 수 있다.
예측하지 못하게도, DNA 전달 벡터에 대한 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)이, 본원에 제공된 방법 및 관련 조성물을 약화시킬 수 있다는 사실을 발견하였다. 이런 이유로, 상기 방법과 조성물은 바이러스 전달 벡터와 다른 치료 핵산 분자에 의한 치료의 효능을 잠재적으로 증가시키고, 심지어 바이러스 전달 벡터 또는 다른 핵산 치료제의 투여가 반복된 경우에도 장기적인 치료 이점을 제공할 수 있다.
I. 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 본 개시내용이 속하는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 본 발명이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 면역학과 분자생물학의 통상의 용어의 정의는, 문헌[The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19판, Merck Sharp & Dohme Corp. 출판, 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)]; 문헌[Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6판, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013) 출판, Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, Blackwell Science Ltd. 출판, 1999-2012 (ISBN 9783527600908)]; 및 문헌[Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 출판, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]; 문헌[Immunology by Werner Luttmann, Elsevier 출판, 2006]; 문헌[Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305)]; 문헌[Lewin's Genes XI, Jones & Bartlett Publishers 출판, 2014 (ISBN-1449659055)]; 문헌[Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)]; 문헌[Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)]; 문헌[Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005]; 및 문헌[Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737))]에서 찾아볼 수 있고, 상기 문헌들의 내용은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
본원에 사용된 “투여”, “투여하는”이라는 용어와 이의 변형어는, 조성물 또는 제제(예를 들어, 본원에 기재된 치료 핵산 또는 면역억제제)를 대상체에 도입시키는 것을 말하며, 하나 이상의 조성물 또는 제제의 동시 및 순차 투여를 포함한다. “투여”는, 예를 들어 치료, 약동학, 진단, 연구, 위약 및 실험 방법을 나타낼 수 있다. “투여”는 또한 시험관 내 및 생체 외 처리를 포함한다. 대상으로의 조성물 또는 작용제의 도입은, 경구, 폐, 비강, 비경구(정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하), 직장, 림프내, 종양내 또는 국소를 포함하는 임의의 적합한 경로로 이루어진다. 조성물 또는 제제의 대상체로의 도입은, 전기천공(electroporation)에 의한다. 투여는 자가 투여와 다른 이에 의한 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로로 수행될 수 있다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 작용제가 이의 의도된 기능을 수행하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물은 조성물 또는 작용제를 대상의 정맥에 도입하는 방식으로 투여된다.
본원에 사용된 “핵산 치료제”, “치료용 핵산” 및 “TNA”라는 구절은 상호교환적으로 사용되며, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료제의 활성 성분으로서 핵산을 사용하는 임의의 치료 양식을 나타낸다. 본원에 사용된 이러한 구절은 RNA 기반 치료제와 DNA 기반 치료제를 나타낸다. RNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA)가 포함된다. DNA 기반 치료제의 비제한적 예에는 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스 DNA(예를 들면, Lentiviral 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스 합성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중 DNA(ceDNA / CELiD), 플라스미드, 백미드, 도기본(dbDNA™) DNA 벡터, 최소 면역학적 정의 유전자 발현(MIDGE)-벡터, 비바이러스 미니스트링 DNA 벡터(선형 공유 폐쇄 DNA 벡터) 또는 아령 모양의 DNA 최소 벡터(“덤벨 DNA”)를 포함한다.
본원에 사용된 활성 제제 또는 치료제, 예컨대 면역억제제 및/또는 치료 핵산의 “유효량” 또는 “치료 유효량”이라는 용어는, 치료 핵산 및/또는 면역억제제의 부재 하에 탐지된 발현 수준에 비해, 원하는 효과, 예를 들어 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 정상화 또는 감소, 및 표적 서열의 발현 또는 발현 억제를 발생시키기에 충분한 양이다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현을 측정하는 데 적합한 검정에는, 예를 들어 도트 블롯(dot blot), 노던 블롯(northern blot), 제자리 혼성화, ELISA, 면역침강, 효소 기능과 같은 당업자에게 공지된 기술, 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 표현형 검정을 사용하는 단백질 또는 RNA 수준의 검사가 포함된다. 하지만, 투여량 수준은 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태, 병태의 중증도, 투여 경로, 및 이용되는 특정 활성제를 포함하는 다양한 인자를 기반으로 한다. 따라서, 투여 요법은 광범위하게 달라질 수 있으나, 의사가 표준 방법을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 또한, “치료량”, “치료적 유효량” 및 “약학적 유효량”이라는 용어는, 상기 기재된 발명의 조성물의 예방적 또는 예방용 양을 포함한다. 상기 기재된 발명의 예방적 또는 예방용 적용에서, 약학적 조성물 또는 약제는 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽거나 다르게는 이의 위험이 있는 환자에게, 질환, 장애 또는 병태, 이의 합병증, 및 질환, 장애 또는 병태의 발달 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상을 포함하는, 질환, 장애 또는 병태의 위험을 제거 또는 감소시키거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 또는 이의 발병을 지연시키는 데 충분한 양으로 투여된다. 최대 용량, 즉, 일부 의학적 판단에 따라 가장 안전한 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. “용량” 및 “투여량”이라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 “치료 효과”라는 용어는, 바람직하고 유익한 것으로 판단되는 치료 결과를 나타낸다. 치료 효과는, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다. 치료 효과는 또한, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현 진행의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 치료제의 경우, 치료적 유효량은 초기에 예비 시험관내 연구 및/또는 동물 모델에서 결정될 수 있다. 치료적 유효 용량은 또한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다. 적용되는 용량은 투여된 화합물의 상대적인 생체이용률 및 효능을 기반으로 조정될 수 있다. 상기 기재된 방법 및 다른 널리 공지된 방법을 기반으로 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은, 당업자의 능력에 속한다. 치료 효율을 결정하기 위한 일반적인 원칙은 이하에 요약되어 있는데, 이는 본원에 참조로서 인용된 문헌[Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics의 챕터 1, 10판, McGraw-Hill (New York) (2001)]에서도 찾아볼 수 있다.
약동학적 원리는, 허용 가능하지 않은 부작용을 최소화하면서 목적하는 정도의 치료 효능을 얻기 위해 투여 요법을 변경하는 기반을 제공한다. 약물의 혈장 농도가 측정되고, 치료 창과 관련되는 상황에서는, 투여 변형에 대한 추가적인 지침도 얻을 수 있다.
본원에 사용된 “이종 뉴클레오티드 서열” 및 “전이유전자”라는 용어는 상호교환적으로 사용되는데, 이는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에 혼입되고, 이에 의해 전달 및 발현될 수 있는 (캡시드 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 이외의) 관심 핵산을 나타낸다.
본원에 사용된 “발현 카세트” 및 “전사 카세트”라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 하나 이상의 프로모터, 또는 전이유전자의 전사를 지시하는 데 충분한 다른 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 전이유전자를 포함하지만, 캡시드 인코딩 서열, 다른 벡터 서열 또는 역말단반복 영역을 포함하지 않는 핵산의 선형 스트레치를 나타낸다. 발현 카세트는 하나 이상의 시스-작용 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 억제제), 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 전사 후 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 상호 교환적으로 사용된 “폴리뉴클레오티드” 및 “핵산”이라는 용어는, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 중 하나인, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 말한다. 따라서, 이 용어는 단일, 이중, 또는 다중-가닥의 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 중합체를 포함하는데, 여기에는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 자연적인 염기, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 비자연적인 염기, 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기가 포함된다. “올리고뉴클레오티드”는 약 5개 내지 약 100개의 일반적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA의 폴리뉴클레오티드를 말한다. 그러나, 본 개시 내용의 목적을 위해, 올리고뉴클레오티드의 길이에 대한 상한은 없다. 올리고뉴클레오티드는 또한 “올리고머” 또는 “올리고”라고도 알려져 있는데, 유전자로부터 단리되거나, 당업계에 알려진 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. “폴리뉴클레오티드” 및 “핵산”이라는 용어는, 기재된 구현예에 응용가능한 바와 같이, 단일 가닥(예컨대, 센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. DNA는, 예를 들어 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, DNA-DNA 이중체, 사전 축합된 DNA, PCR 산물, 벡터(P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 키메라 서열, 염색체 DNA, 또는 이러한 그룹의 유도체 및 조합의 형태일 수 있다. DNA는 미니서클, 플라스미드, 박미드, 미니유전자, 미니스트링 DNA (선형의 공유적으로 폐쇄된 DNA 벡터), 폐쇄-말단의 선형 이중체 DNA (CELiD 또는 ceDNA), doggybone(dbDNA ™) DNA, 덤벨형DNA, 최소한의 면역학적으로-정의된 유전자 발현(MIDGE)-벡터, 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터의 형태일 수 있다. RNA는 소형 간섭 RNA(siRNA), 다이서-기질(Dicer-substrate) dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, rRNA, tRNA, 바이러스성 RNA(vRNA) 및 이들의 조합의 형태일 수 있다. 핵산에는, 합성, 자연 발생 및 비자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는, 공지된 뉴클레오티드 유사체, 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산이 포함된다. 이러한 유사체 및/또는 변형된 잔기의 예에는, 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(모르폴리노), 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2’-O-메틸 리보뉴클레오티드, 잠금 핵산(LNA™) 및 펩타이드 핵산(PNA)이 포함된다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환), 대립유전자, 동원체(ortholog), SNP 및 상보적 서열뿐 아니라, 명백하게 제시된 서열을 암시적으로 포함한다.
“뉴클레오티드”는 당 데옥시리보스(DNA) 또는 리보스(RNA), 염기, 및 포스페이트 기를 함유한다. 뉴클레오티드는 포스페이트기를 통해 함께 연결된다.
“염기”는 퓨린과 피리미딘을 포함하는데, 이는 천연 화합물인 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신과, 퓨린 및 피리미딘의 천연 유사체와 합성 유도체를 추가로 포함하고, 상기 합성 유도체는, 아민, 알코올, 티올, 카르복실레이트 및 알킬할라이드를 포함하나 이에 제한되지 않는 새로운 반응기에 대한 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 “간섭 RNA” 또는 “RNAi” 또는 “간섭 RNA 서열”은, 간섭 RNA가 표적 유전자 또는 서열과 동일한 세포 내에 있을 때, (예를 들어, 간섭 RNA 서열에 상보적인 mRNA의 분해를 매개하거나, 번역을 억제함으로써) 표적 유전자 또는 서열의 발현을 감소시키거나 억제시킬 수 있는 단일-가닥 RNA (예를 들어, 성숙한 miRNA, ssRNAi 올리고뉴클레오티드, ssDNAi 올리고뉴클레오티드), 이중-가닥 RNA (즉, 이중체 RNA, 예컨대 siRNA, 다이서(Dicer)-기질 dsRNA, shRNA, aiRNA, 또는 사전-miRNA), DNA-RNA 혼성체(예를 들어, PCT 공보 WO 2004/078941 참고), 또는 DNA-DNA 혼성체 (예를 들어, PCT 공보 WO 2004/104199 참고)를 포함한다. 따라서, 간섭 RNA는 표적 mRNA 서열에 상보적인 단일-가닥 RNA를 말하거나, 2개의 상보적인 가닥 또는 단일의 자가-상보적인 가닥에 의해 형성된 이중-가닥 RNA를 말한다. 간섭 RNA는 표적 유전자 또는 서열과 실질적인 또는 완전한 동일성을 가질 수 있거나, 미스매치 부위(즉, 미스매치 모티프)를 포함할 수 있다. 간섭 RNA 분자의 서열은 전체 길이의 표적 유전자, 또는 이의 하위 서열에 상응할 수 있다. 바람직하게는, 간섭 RNA 분자는 화학적으로 합성된다. 상기 특허 문헌 각각의 내용은 모든 목적을 위해 본원에 전문이 참조로서 인용된다.
간섭 RNA는 “작은-간섭 RNA” 또는 “siRNA”, 예를 들어, 약 15 내지 60개, 15 내지 50개, 또는 15 내지 40개 길이(이중체)의 뉴클레오티드, 더욱 전형적으로 약 15 내지 30개, 15 내지 25개, 또는 19 내지 25개 길이(이중체)의 뉴클레오티드의 간섭 RNA를 포함하고, 바람직하게는 약 20 내지 24개, 21 내지 22개, 또는 21 내지 23개 길이(이중체)의 뉴클레오티드이다(예를 들어, 이중-가닥 siRNA 각각의 상보 서열은 15 내지 60개, 15 내지 50개, 15 내지 40개, 15 내지 30개, 15 내지 25개, 또는 19 내지 25개 길이의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 20 내지 24개, 21 내지 22개, 또는 21 내지 23개 길이의 뉴클레오티드이고, 이중-가닥 siRNA는 약 15 내지 60개, 15 내지 50개, 15 내지 40개, 15 내지 30개, 15 내지 25개, 또는 19 내지 25개 염기쌍 길이, 바람직하게는 약 18 내지 22개, 19 내지 20개, 또는 19 내지 21개 염기쌍의 길이이다). siRNA 이중체는, 약 1개 내지 약 4개의 뉴클레오티드, 또는 약 2개 내지 약 3개의 뉴클레오티드의 3’ 돌출부(overhang), 및 5’ 포스페이트 말단을 포함할 수 있다. siRNA의 예는, 제한 없이, 2개의 분리된 가닥의 분자들로부터 조립된 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자(하나의 가닥은 센스 가닥이고, 다른 하나는 상보성 안티센스 가닥임); 단일 가닥 분자 분자로부터 조립된 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자(센스 및 안티센스 부위는 핵산-계 또는 비-핵산-계의 링커에 의해 연결됨); 자가-상보성 센스 및 안티센스 영역을 갖는 헤어핀 2차 구조를 갖는, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자; 및 2개 이상의 루프 구조와 자가-상보성 센스 및 안티센스 부위를 갖는 스템을 갖는, 환형 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 분자(환형 폴리뉴클레오티드는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 활성 이중-가닥 siRNA 분자를 생성할 수 있다)를 포함한다. 본원에 사용된 “siRNA”라는 용어는, RNA-RNA 이중체, 뿐만 아니라 DNA-RNA 혼성체도 포함한다(예를 들어, PCT 공보 WO 2004/078941 참고).
본원에 사용된 “핵산 제작물”이라는 용어는, 단일-가닥 또는 이중-가닥 중 하나의 핵산 분자를 지칭하는데, 이는 자연발생적인 유전자로부터 단리되거나, 달리 자연에서 존재하지 않는 또는 합성된 방식으로 핵산의 세그먼트를 포함하도록 변형된다. 핵산 제작물(construct)이라는 용어는, 핵산 제작물이 본 개시 내용의 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 포함할 때, “발현 카세트”라는 용어와 동의어이다. “발현 카세트”는 프로모터에 작용 가능하게 연결된 서열을 인코딩하는 DNA를 포함한다.
“혼성화가능한” 또는 “상보적인” 또는 “실질적으로 상보적인”은, 핵산(예를 들어, RNA)이 시험관내 및/또는 생체 내에서 적합한 온도 및 용액 이온 강도의 조건 하에, 서열-특이적인 비평형적인 방식으로(즉, 핵산은 상보적인 핵산에 특이적으로 결합함) 다른 핵산에 비-공유적으로 결합 가하게 만들고, 즉 왓슨 크릭 염기쌍 및/또는 G/U 염기쌍을 형성하게 하고, 다른 핵산에 “어닐링”하거나, “혼성화”가능하게 만드는 핵산의 서열을 포함하는 것을 의미한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 표준 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기-쌍은 이하의 것들을 포함한다: 티미딘(T)과 한 쌍을 이루는 아데닌(A), 우라실(U)과 한 쌍을 이루는 아데닌(A), 및 시토신(C)과 한 쌍을 이루는 구아닌(G). 추가로, 2개의 RNA 분자들(예를 들어, dsRNA) 간의 혼성화를 위해, 구아닌(G) 염기가 또한 우라실(U)과도 쌍을 이룬다고 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, G/U 염기-쌍은 부분적으로, mRNA의 코돈과 tRNA 안티-코돈의 염기-쌍의 맥락에서 축퇴성(degeneracy)(즉, 잉여성)과 관련된다. 본 개시 내용의 맥락에서, 대상 DNA-표적 RNA 분자의 단백질-결합 세그먼트(dsRNA 이중체)의 구아닌(G)은, 우라실(U)에 상보적으로 간주되고, 그 반대이기도 하다. 또한, G/U 염기-쌍이 소정의 뉴클레오티드 위치에서 대상 DNA-표적화 RNA 분자의 단백질-결합 세그먼트(dsRNA이중체)로 만들어질 수 있다면, 그 위치는 비-상보적으로 간주되는 것이 아니라, 상보적으로 간주된다.
“펩티드”, “폴리펩티드” 및 ”단백질”이라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용되는데, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 말하며, 코딩 및 비-코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형 또는 유도된 아미노산, 및 변형된 펩티드 골격을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
특정 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 조합 중 어느 하나 이상)를 “인코딩하는” DNA 서열은, 특정 RNA 및/또는 단백질로 전사되는 DNA 핵산 서열이다. DNA 폴리뉴클레오티드는 단백질로 번역되는 RNA(mRNA)를 인코딩할 수 있거나, DNA 폴리뉴클레오티드는 단백질로 번역되지 않는 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 또는 DNA-표적화 RNA; 또는 “비-코딩” RNA 또는 “ncRNA”라고도 불림)를 인코딩할 수 있다.
본원에 사용된 “융합 단백질”이라는 용어는, 적어도 2개의 상이한 단백질로부터의 단백질 도메인들을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들어, 융합 단백질은 (i) 하나의 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 이들의 조합 중 어느 하나 이상) 또는 이들의 절편, 및 (ii) 적어도 하나의 비- 관심 대상 유전자(GOI) 단백질, 또는 대안적으로 상이한 인플라마좀 길항제 단백질을 포함할 수 있다. 본원에 포함된 융합 단백질은, 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 조합 중 어느 하나)에 융합된 항체, 또는 항체의 Fc 또는 항원-결합 절편, 예를 들어, 수용체, 리간드, 효소 또는 펩티드의 세포외 도메인을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 이들의 조합 중 어느 하나 이상), 또는 융합 단백질의 일부인 이들의 절편은, 단일 특이적인 항체, 또는 이중 특이적이거나 다중특이적인 항체일 수 있다.
본원에 사용된 “안전한 게놈 하버 유전자(genomic safe harbor gene)” 또는 “안전한 하버 유전자(safe harbor gene)”라는 용어는, 서열이 내인성 유전자 활성에 대해 유의한 부정적인 결과 없이, 또는 암을 촉진시키지 않고, 예측가능한 방식으로(예를 들어, 관심 대상 단백질을 발현함) 통합되어 기능을 발휘할 수 있도록 핵산 서열이 삽입될 수 있는 유전자 또는 좌위(loci)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 안전한 하버 유전자는 효과적으로, 그리고 삽입된 핵산 서열이 비-안전한 하버 부위보다 더 높은 수준으로 발현할 수 있는 좌위 또는 유전자이다.
본원에 사용된 “유전자 전달”이라는 용어는, 유전자 치료의 응용을 위해 외부 DNA가 숙주 세포에 전달되는 과정을 의미한다.
본원에 사용된 “말단반복” 또는 “TR”이라는 용어는, 적어도 하나의 최소 필수 복제 기점과 회문 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는, 임의의 바이러스 말단반복 또는 합성 서열을 포함한다. Rep-결합 서열(“RBS”)(RBE(Rep-결합 요소)로도 지칭됨)과 말단 분해 부위(“TRS”)는 함께 “최소 필수 복제 기점”을 구성하기 때문에, TR은 적어도 하나의 RBS와 적어도 하나의 TRS를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열의 주어진 스트레치 내에서 서로 역 상보체인 TR은, 전형적으로 “역말단반복” 또는 “ITR”로 지칭된다. 바이러스의 맥락에서, ITR은 복제, 바이러스 패키징, 통합 및 프로바이러스 회수를 매개한다. 본원의 발명에서 예측하지 못하게 발견되는 바와 같이, 전체 길이에 걸쳐 역 상보체인 TR은 여전히 ITR의 전통적인 기능을 수행할 수 있고, 따라서 ITR이라는 용어는 ceDNA 게놈 또는 ceDNA에서 ceDNA 벡터의 복제를 매개할 수 있는 TR을 지칭하는데 사용된다. 당업계의 통상의 숙련자는 복합체 ceDNA 벡터 구조 내에, 둘 초과의 ITR 또는 비대칭적인 ITR 쌍이 존재할 수 있다고 이해할 것이다. ITR은 AAV ITR 또는 비(非)AAV ITR일 수 있거나, AAV ITR 또는 비AAV ITR에서 유도될 수 있다. 예를 들어, ITR은 파보바이러스 및 데펜도바이러스(예를 들어, 개 파보바이러스, 소 파보바이러스, 마우스 파보바이러스, 돼지 파보바이러스, 인간 파보바이러스 B-19)를 포함하는 파보바이러스과에서 유도될 수 있거나, 또는 SV40 복제 기점으로 작용하는 SV40 헤어핀(이는 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 의해 추가로 변형될 수 있음)이 ITR로서 사용될 수 있다. 파보바이러스과 바이러스는 척추동물을 감염시키는 파보바이러스아과(Parvovirinae)와 무척추동물을 감염시키는 덴소바이러스아과(Densovirinae)의 2개의 아과로 이루어진다. 데펜도파보바이러스에는, 비제한적으로, 인간, 영장류, 소, 개, 말 및 양 종을 포함하는 척추동물 숙주에서 복제 가능한 아데노관련바이러스(AAV)의 바이러스과가 포함된다. 본원에서 편의를 위해, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 업스트림) 5’에 위치한 ITR은 “5’ ITR” 또는 “좌측 ITR”로 지칭되고, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 다운스트림) 3’에 위치한 ITR은 “3’ ITR” 또는“우측 ITR”로 지칭된다.
“야생형 ITR” 또는 “WT-ITR”은, AAV, 또는 예를 들어 Rep 결합 활성 및 Rep 닉 생성 능력을 보유하는 다른 디펜도바이러스에서의 자연발생적인 ITR 서열의 서열을 지칭한다. 임의의 AAV 혈청형의 WT-ITR의 뉴클레오티드 서열은 유전자 코드 또는 드리프트의 축퇴로 인해 기본형 자연 발생 서열에서 약간 달라질 수 있기 때문에, 본원에의 사용을 위해 포함된 WT-ITR 서열은 생산 과정 동안 일어나는 자연적으로 발생하는 변화(예를 들어, 복제 오류)의 결과로서의 WT-ITR 서열을 포함한다.
본원에 사용된 “실질적으로 대칭인 WT-ITR” 또는 “실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍”이라는 용어는, 둘 모두 이의 전체 길이에 걸쳐 역 상보체 서열을 갖는 야생형 ITR인, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 WT-ITR의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, ITR은, 기본형 자연 발생 서열에서 벗어난 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖더라도, 변화가 서열의 특성 및 전체 3차원 구조에 영향을 미치지 않는 한, 야생형 서열인 것으로 간주될 수 있다. 일부 양태에서, 벗어난 뉴클레오티드는 보존적 서열 변화를 나타낸다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 다른 WT-ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 3D 공간에 동일한 A, C-C’ 및 B-B’ 루프를 갖는다. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은, 이것이 적절한 Rep 단백질과 쌍을 이루는 작동 가능한 Rep 결합 부위(RBE 또는 RBE’)와 말단 분해 부위(TRS)를 가지고 있음을 결정하는 방식으로 WT로서 기능적으로 확인될 수 있다. 선택적으로, 허용 조건 하에서의 전이유전자 발현을 포함하는 다른 기능을 시험할 수 있다.
본원에 사용된 “변형된 ITR” 또는 “mod-ITR” 또는 “돌연변이 ITR”이라는 구절은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 동일한 혈청형의 WT-ITR과 비교하여 적어도 하나의 또는 그 이상의 뉴클레오티드에 돌연변이를 갖는 ITR을 나타낸다. 돌연변이는 ITR 내 A 영역, C 영역, C’ 영역, B 영역, B’ 영역 중 하나 이상을 변경시킬 수 있으며, 동일한 혈청형의 WT-ITR의 3D 공간 구성과 비교하여 3차원 공간 구성(즉, 기하학적 공간에서의 3D 구조)을 변경시킬 수 있다.
“비대칭적인 ITR 쌍”이라고도 지칭되는 본원에 사용된 “비대칭적인 ITR”이라는 용어는, 전체 길이에 걸쳐 역 상보체인, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 ITR의 쌍을 말한다. 하나의 비-제한적인 예로서, 비대칭적인 ITR 쌍은 이들의 동족 ITR에 대해 대칭적인 3-차원 공간 구성을 가지지 않아서, 이들의 3D 구조들은 기하학적 공간에서 서로 상이한 형태이다. 달리 말해, 비대칭적인 ITR 쌍은 전체적으로 상이한 기하학적 구조를 갖는데, 즉 이들은 3D 공간에서 이들의 A, C-C’ 및 B-B’ 루프가 상이한 구성을 갖는다(예를 들어, 하나의 ITR은 동족 ITR에 비해 짧은 C-C’ 아암 및/또는 짧은 B-B’ 아암을 가질 수 있다). 2개의 ITR 사이의 서열 차이는, 하나 이상의 뉴클레오티드 첨가, 결실, 절단 또는 점 돌연변이에 기인할 수 있다. 일 구현예에서, 비대칭적 ITR 쌍 중 하나의 ITR은 야생형 AAV ITR 서열일 수 있고, 다른 하나의 ITR은 본원에서 정의된 바와 같은 변형된 ITR(예를 들어, 비-야생형 또는 합성 ITR 서열)일 수 있다. 일부 구현예에서, 비대칭적인 ITR 쌍의 어느 ITR도 야생형AAV 서열이 아니며, 두 개의 ITR은 기하학적 공간에서 상이한 형태(즉, 상이한 전체 기하학적 구조)를 갖는 변형된 ITR이다. 일부 구현예에서, 비대칭적인 ITR 쌍 중 하나의 변형된-ITR은 짧은 C-C’ 아암을 가질 수 있고, 다른 하나의 ITR은 상이한 변형(예를 들어, 단일 아암, 또는 짧은 B-B’ 아암 등)을 가질 수 있어서, 이들은 동족 비대칭적인 변형된- ITR에 비해 상이한 3-차원 공간 구성을 갖는다.
본원에 사용된 “대칭 ITR”이라는 용어는, 야생형 데펜도바이러스 ITR 서열에 비해 돌연변이되거나 변형되고 전체 길이에 걸쳐 역 상보체인, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 ITR의 쌍을 나타낸다. ITR 중 어느 것도 야생형 ITR AAV2 서열이 아니며(즉, 이는 변형된 ITR이며, 돌연변이 ITR로도 지칭됨), 뉴클레오티드 부가, 결실, 치환, 절단 또는 점 돌연변이로 인해 야생형 ITR의 서열과 차이가 있을 수 있다. 본원에서 편의를 위해, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 업스트림) 5’에 위치한 ITR은 “5’ ITR” 또는 “좌측 ITR”로 지칭되고, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 다운스트림) 3’에 위치한 ITR은 “3’ ITR” 또는“우측 ITR”로 지칭된다.
본원에서 사용된 “실질적으로 대칭적인 변형-ITR” 또는 “실질적으로 대칭적인 변형-ITR 쌍”이라는 용어는, 둘 모두 전체 길이에 걸쳐 역 상보체 서열을 갖는, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 변형된-ITR의 쌍을 말한다. 예를 들어, 변형된 ITR은, 역 상보체 서열에서 벗어난 일부 뉴클레오티드 서열을 갖더라도, 변화가 특성 및 전체 형상에 영향을 미치지 않는 한, 실질적으로 대칭인 것으로 간주될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 동족 변형된 ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 달리 말하면, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은 3D 공간에 구성된 동일한 A, C-C’ 및 B-B’ 루프를 갖는다. 일부 구현예에서, mod-ITR 쌍으로부터의 ITR은 상이한 역 상보체 뉴클레오티드 서열을 갖지만, 여전히 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 가질 수 있으며, 즉, 두 개의 ITR은 동일한 전체 3D 형상을 생성하는 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, mod-ITR 쌍에서 하나의 ITR(예를 들어, 5’ ITR)은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 ITR(예를 들어, 3’ ITR)은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있지만, 두 가지 모두 동일한 상응하는 돌연변이를 가질 수 있으므로(예를 들어, 5’ ITR이 C 영역에 결실을 갖는 경우, 상이한 혈청형으로부터의 동족의 변형된 3’ ITR은 C’ 영역의 상응하는 위치에 결실을 가짐), 변형된 ITR 쌍은 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 이러한 구현예에서, 변형된 ITR 쌍의 각각의 ITR은 상이한 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12), 예컨대 AAV2와 AAV6의 조합에서 유래할 수 있으며, 여기서 하나의 ITR에서의 변형은 상이한 혈청형의 동족 ITR 내 상응하는 위치에 반영된다. 하나의 구현예에서, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은, ITR 사이의 뉴클레오티드 서열 차이가 특성 또는 전체 형상에 영향을 미치지 않고 이들이 3D 공간에서 실질적으로 동일한 형상을 갖는 한, 변형된 ITR(mod-ITR)의 쌍을 나타낸다. 비제한적인 예로서, mod-ITR은 기본 설정의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(BLASTN)와 같은 당업계에 널리 공지된 표준 수단에 의해 측정 시 기본형 mod-ITR과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C’ 및 B-B’ 루프를 가지며, 예를 들어 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C’ 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 mod-ITR은 C-C’ 루프의 상응하는 결실을 갖고, 또한 이의 동족 mod-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형상으로 나머지 A 및 B-B’ 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다. “측접하는(flanking)”이라는 용어는, 한 핵산 서열의 다른 핵산 서열에 대한 상대적 위치를 말한다. 일반적으로, 서열 ABC에서, B에는 A와 C가 측접하고 있다. 이는 배열 AxBxC에 대해서도 동일하게 적용된다. 따라서, 측접 서열은 측접된 서열의 앞에 있거나 뒤에 있지만, 측접된 서열에 인접하거나 바로 근접할 필요는 없다. 일 구현예에서, 측접이라는 용어는, 선형 이중체 ceDNA 벡터의 각 말단의 말단 반복부를 지칭한다. 본원에 사용된 “치료하다”, “치료하는” 및/또는 “치료”라는 용어는, 질환을 없애거나, 실질적으로 억제하거나, 질환의 진행을 늦추거나 반전시키거나, 질환의 증상을 실질적으로 개선시키거나, 질환의 임상적인 증상의 출현을 실질적으로 예방하여, 유익하거나 원하는 임상적 결과를 얻는 것을 포함한다. 치료는 나아가 다음 중 하나 이상을 달성하는 것을 나타낸다: (a) 장애의 중증도를 감소시키는 것; (b) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 발달을 제한하는 것; (c) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화를 제한하는 것; (d) 이전에 장애(들)를 앓았던 환자에서 장애(들)의 재발을 제한하는 것; 및 (e) 장애(들)에 대해 이전에 증상이 없었던 환자에서 증상의 재발을 제한하는 것. 약리학적 및/또는 생리학적 효과와 같은 유익하거나 목적하는 임상 결과에는, 비제한적으로, 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만, 질환의 증상을 아직 경험하지 않았거나 나타내지 않은 대상에서 질환, 장애 또는 병태의 발생을 예방하는 것(예방적 치료), 질환, 장애 또는 병태의 증상 경감, 질환, 장애 또는 병태의 정도 감소, 질환, 장애 또는 병태의 안정화(즉, 악화시키지 않음), 질환, 장애 또는 병태의 확산 예방, 질환, 장애 또는 병태 진행의 지연 또는 늦추기, 질환, 장애 또는 병태의 개선 또는 완화, 및 이들의 조합뿐 아니라, 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존기간에 비해 생존기간을 연장시키는 것.
본원에 사용된 “증가하다”, “향상시키다”, “상승시키다”라는 용어 (및 기타 용어)는, 일반적으로 농도, 수준, 기능, 활성, 또는 거동을 자연적인 값, 예측치 또는 평균치에 비해, 또는 대조 조건에 비해 직접 또는 간접적으로 증가시키는 행위를 지칭한다.
본원에 사용된 “억제하다”, “감소시키다”, “방해하다”, “저해하다” 및/또는 “줄이다” (및 유사 용어)라는 용어는, 일반적으로, 본래 값, 예측 값 또는 평균 값에 비해, 또는 대조군 조건에 비해, 농도, 수준, 기능, 활성 또는 거동을, 직접적으로 또는 간접적으로, 감소시키는 작용을 나타낸다. 면역억제제에 의해 면역 반응(예를 들어, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응))이 “감소하다” “감소하는” “줄어들다” 또는 “줄어든” 것은, 소정의 면역억제제에 대한 면역 반응이 탐지 가능할 정도로 감소된 것을 의미하는 것으로 의도된다. 면역억제제에 의한 면역 반응의 감소량은, 면역억제제의 존재 하에서 면역 반응의 수준에 비교하여 결정될 수 있다. 탐지 가능한 감소는, 면역억제제의 존재 하에서 탐지되는 면역 반응보다 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 더 낮거나, 또는 그 이상 더 낮을 수 있다.
본원에 사용된 “지질”이라는 용어는, 지방산의 에스테르를 포함하나, 이에 제한되지 않는 유기 화합물의 그룹을 지칭하는데, 물에는 용해되지 않으나, 많은 유기 용매에 용해될 수 있는 것을 특징으로 한다. 이들은 통상 이하의 적어도 3개의 부류로 나누어진다: (1) 지방과 오일, 뿐만 아니라 왁스를 포함하는 “단순 지질”; (2) 인지질과 당지질을 포함하는 “화합물 지질”; 및 (3) “유도 지질”, 예컨대 스테로이드.
본원에 사용된 “지질 입자”라는 용어는, 관심 대상인 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 치료제, 예컨대 핵산 치료제 및/또는 면역억제제를 전달하는데 사용될 수 있는 지질 제제를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 지질 입자는 핵산 함유 지질 입자인데, 전형적으로 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 선택적으로 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질로부터 형성된다. 다른 바람직한 구현예에서, 치료제, 예컨대 치료 핵산은 입자의 지질 부분 내에 캡슐화되어, 효소적 분해로부터 보호될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 면역억제제는 선택적으로 핵산 함유 지질 입자 내에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 “캡슐화된 지질(lipid encapsulated)”라는 용어는, 활성제 또는 치료제, 예컨대 핵산(예를 들어, ceDNA)을 완전히 캡슐화시키거나, 부분적으로 캡슐화시키거나, 또는 이들 둘 다인 지질 입자를 지칭할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 지질 입자 내에 완전 캡슐화되어 (예를 들어, 핵산 함유 지질 입자를 형성한다).
본원에 사용된 “지질 접합물”이라는 용어는, 지질 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 지칭한다. 이러한 지질 접합물은, PEG-지질 접합물, 예컨대 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 접합물), 디아실글리세롤에 접합된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 접합물), 콜레스테롤에 접합된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 접합된 PEG, 및 세라마이드에 접합된 PEG(예를 들어, 미국 특허 제5,885,613호 참고), 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)- 지질 접합물(예를 들어, POZ-DAA 접합물; 예를 들어, 2010년 1월 13일자 제출된 미국 임시 출원 제61/294,828호, 및 2010년 1월 14일자 제출된 미국 임시 출원 제61/295,140호 참고), 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA- 지질 접합물), 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. POZ-지질 접합물의 추가적인 예는, PCT 공보 WO 2010/006282에 기재되어 있다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합되거나, 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG 또는 POZ를 지질에 커플링시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있는데, 예를 들어 비-에스테르 함유 링커 모이어티 및 에스테르 함유 링커 모이어티를 포함한다. 특정 바람직한 구현예에서, 비-에스테르 함유 링커 모이어티, 예컨대 아미드 또는 카바메이트가 사용된다. 상기 특허 문헌 각각의 내용은 모든 목적을 위해 본원에 전문이 참조로서 인용된다.
인지질의 대표적인 예는, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 및 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인이 부족한 다른 화합물, 예컨대 스핑고지질, 글리코스핑고지질 패밀리, 디아실글리세롤, 및 β-아실옥시산도, 또한 양쪽성 지질로 지정된 그룹 내에 있다. 추가로, 상기 기재된 양쪽성 지질은 트리글리세리드와 스테롤을 포함하는 다른 지질과 혼합될 수 있다.
본원에 사용된 “중성 지질”이라는 용어는, 선택된 pH에서 비전하성 또는 중성의 쯔비터 형태로 존재하는 다수의 임의의 지질 종을 지칭한다. 생리학적 pH에서, 이러한 지질은 예를 들어, 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 세팔린(cephalin), 콜레스테롤, 세레브로시드(cerebroside) 및 디아실글리세롤을 포함한다.
본원에 사용된 “비-양이온성 지질”이라는 용어는, 양쪽성 지질, 뿐만 아니라 임의의 다른 중성 지질 또는 음이온성 지질을 지칭한다.
본원에 사용된 “음이온성 지질”이라는 용어는, 생리학적 pH에서 음전하를 띄는 임의의 지질을 지칭한다. 이들 지질은 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀(cardiolipin), 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레이올(oleyol)포스파티딜글리세롤 (POPG), 및 중성 지질에 연결된 다른 음이온성 변형 기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 “소수성 지질”이라는 용어는, 장쇄의 치환 및 비치환된 지방족 탄화수소 기, 및 선택적으로 하나 이상의 방향족 지환족 또는 헤테로사이클릭 기(들)에 의해 치환된 이러한 기를 포함하나, 이에 제한되지 않는 무극성 기를 갖는 화합물을 지칭한다. 적합한 예는 디아실글리세롤, 디알킬글리세롤, N―N-디알킬아미노, 1,2-디아실옥시-3-아미노프로판, 및 1,2-디알킬-3-아미노프로판을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 “수용액”이라는 용어는, 전체적으로 또는 부분적으로, 물을 포함하는 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 “유기 지질 용액”이라는 용어는, 전체적으로 또는 부분적으로 지질을 갖는 유기 용매를 포함하는 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 “전신 전달”이라는 용어는 유기체 내에서 활성제, 예컨대 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)를 널리 생체내 확산시키는 지질 입자의 전달을 지칭한다. 일부 투여 기술은, 특정 제제를 전신 전달시킬 수 있지만, 다른 것들은 전달하지 않는다. 전신 전달은 유용한 제제, 바람직하게는 치료제의 양이 신체의 대부분에 노출되는 것을 의미한다. 넓은 생체내 확산을 얻으려면 일반적으로 혈액 수명(blood lifetime)을 요구하므로, 투여 부위에서 먼 질병 부위에 도달하기 전에 (예컨대, 제1 통과 기관(간, 폐 등)에 의해, 또는 신속하고 비특이적인 세포 결합에 의해) 신속히 분해 또는 정화되지 않는다. 지질 입자의 전신 전달은 예를 들어, 정맥내, 피하, 및 복강내를 포함하는 당업계에 알려진 임의의 수단에 의할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 지질 입자의 전신 전달은 정맥내 전달이다.
본원에 사용된 “국소 전달”이라는 용어는, 유기체 내에서 활성제, 예컨대 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)를 표적 부위로 직접 전달하는 것을 말한다. 예를 들어, 작용제는 종양과 같은 질환 부위 또는 염증 부위와 같은 다른 표적 부위, 또는 간, 심장, 췌장, 신장 등과 같은 표적 기관에 직접 주사하는 방식으로 국소적으로 전달될 수 있다.
본원에 사용된 “말단반복” 또는 “TR”이라는 용어는, 적어도 하나의 최소 필수 복제 기점과 회문 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는, 임의의 바이러스 말단반복 또는 합성 서열을 포함한다. Rep-결합 서열(“RBS”)(RBE(Rep-결합 요소)로도 지칭됨)과 말단 분해 부위(“TRS”)는 함께 “최소 필수 복제 기점”을 구성하기 때문에, TR은 적어도 하나의 RBS와 적어도 하나의 TRS를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열의 주어진 스트레치 내에서 서로 역 상보체인 TR은, 전형적으로 “역말단반복” 또는 “ITR”로 지칭된다. 바이러스의 맥락에서, ITR은 복제, 바이러스 패키징, 통합 및 프로바이러스 회수를 매개한다. 본원의 발명에서 예측하지 못하게 발견되는 바와 같이, 전체 길이에 걸쳐 역 상보체인 TR은 여전히 ITR의 전통적인 기능을 수행할 수 있고, 따라서 ITR이라는 용어는 ceDNA 게놈 또는 ceDNA에서 ceDNA 벡터의 복제를 매개할 수 있는 TR을 지칭하는데 사용된다. 당업계의 통상의 숙련자는 복합체 ceDNA 벡터 구조 내에, 둘 초과의 ITR 또는 비대칭적인 ITR 쌍이 존재할 수 있다고 이해할 것이다. ITR은 AAV ITR 또는 비(非)AAV ITR일 수 있거나, AAV ITR 또는 비AAV ITR에서 유도될 수 있다. 예를 들어, ITR은 파보바이러스 및 데펜도바이러스(예를 들어, 개 파보바이러스, 소 파보바이러스, 마우스 파보바이러스, 돼지 파보바이러스, 인간 파보바이러스 B-19)를 포함하는 파보바이러스과에서 유도될 수 있거나, 또는 SV40 복제 기점으로 작용하는 SV40 헤어핀(이는 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 의해 추가로 변형될 수 있음)이 ITR로서 사용될 수 있다. 파보바이러스과 바이러스는 척추동물을 감염시키는 파보바이러스아과(Parvovirinae)와 무척추동물을 감염시키는 덴소바이러스아과(Densovirinae)의 2개의 아과로 이루어진다. 데펜도파보바이러스에는, 비제한적으로, 인간, 영장류, 소, 개, 말 및 양 종을 포함하는 척추동물 숙주에서 복제 가능한 아데노관련바이러스(AAV)의 바이러스과가 포함된다. 본원에서 편의를 위해, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 업스트림) 5’에 위치한 ITR은 “5’ ITR” 또는 “좌측 ITR”로 지칭되고, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 다운스트림) 3’에 위치한 ITR은 “3’ ITR” 또는“우측 ITR”로 지칭된다.
“야생형 ITR” 또는 “WT-ITR”은, AAV, 또는 예를 들어 Rep 결합 활성 및 Rep 닉 생성 능력을 보유하는 다른 디펜도바이러스에서의 자연발생적인 ITR 서열의 서열을 지칭한다. 임의의 AAV 혈청형의 WT-ITR의 뉴클레오티드 서열은 유전자 코드 또는 드리프트의 축퇴로 인해 기본형 자연 발생 서열에서 약간 달라질 수 있기 때문에, 본원에의 사용을 위해 포함된 WT-ITR 서열은 생산 과정 동안 일어나는 자연적으로 발생하는 변화(예를 들어, 복제 오류)의 결과로서의 WT-ITR 서열을 포함한다.
본원에 사용된 “실질적으로 대칭인 WT-ITR” 또는 “실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍”이라는 용어는, 둘 모두 이의 전체 길이에 걸쳐 역 상보체 서열을 갖는 야생형 ITR인, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 WT-ITR의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, ITR은, 기본형 자연 발생 서열에서 벗어난 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖더라도, 변화가 서열의 특성 및 전체 3차원 구조에 영향을 미치지 않는 한, 야생형 서열인 것으로 간주될 수 있다. 일부 양태에서, 벗어난 뉴클레오티드는 보존적 서열 변화를 나타낸다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 다른 WT-ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 3D 공간에 동일한 A, C-C’ 및 B-B’ 루프를 갖는다. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은, 이것이 적절한 Rep 단백질과 쌍을 이루는 작동 가능한 Rep 결합 부위(RBE 또는 RBE’)와 말단 분해 부위(TRS)를 가지고 있음을 결정하는 방식으로 WT로서 기능적으로 확인될 수 있다. 선택적으로, 허용 조건 하에서의 전이유전자 발현을 포함하는 다른 기능을 시험할 수 있다.
본원에 사용된 “변형된 ITR” 또는 “mod-ITR” 또는 “돌연변이 ITR”이라는 구절은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 동일한 혈청형의 WT-ITR과 비교하여 적어도 하나의 또는 그 이상의 뉴클레오티드에 돌연변이를 갖는 ITR을 나타낸다. 돌연변이는 ITR 내 A 영역, C 영역, C’ 영역, B 영역, B’ 영역 중 하나 이상을 변경시킬 수 있으며, 동일한 혈청형의 WT-ITR의 3D 공간 구성과 비교하여 3차원 공간 구성(즉, 기하학적 공간에서의 3D 구조)을 변경시킬 수 있다.
“비대칭적인 ITR 쌍”이라고도 지칭되는 본원에 사용된 “비대칭적인 ITR”이라는 용어는, 전체 길이에 걸쳐 역 상보체인, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 ITR의 쌍을 말한다. 하나의 비-제한적인 예로서, 비대칭적인 ITR 쌍은 이들의 동족 ITR에 대해 대칭적인 3-차원 공간 구성을 가지지 않아서, 이들의 3D 구조들은 기하학적 공간에서 서로 상이한 형태이다. 달리 말해, 비대칭적인 ITR 쌍은 전체적으로 상이한 기하학적 구조를 갖는데, 즉 이들은 3D 공간에서 이들의 A, C-C’ 및 B-B’ 루프가 상이한 구성을 갖는다(예를 들어, 하나의 ITR은 동족 ITR에 비해 짧은 C-C’ 아암 및/또는 짧은 B-B’ 아암을 가질 수 있다). 2개의 ITR 사이의 서열 차이는, 하나 이상의 뉴클레오티드 첨가, 결실, 절단 또는 점 돌연변이에 기인할 수 있다. 일 구현예에서, 비대칭적 ITR 쌍 중 하나의 ITR은 야생형 AAV ITR 서열일 수 있고, 다른 하나의 ITR은 본원에서 정의된 바와 같은 변형된 ITR(예를 들어, 비-야생형 또는 합성 ITR 서열)일 수 있다. 일부 구현예에서, 비대칭적인 ITR 쌍의 어느 ITR도 야생형AAV 서열이 아니며, 두 개의 ITR은 기하학적 공간에서 상이한 형태(즉, 상이한 전체 기하학적 구조)를 갖는 변형된 ITR이다. 일부 구현예에서, 비대칭적인 ITR 쌍 중 하나의 변형된-ITR은 짧은 C-C’ 아암을 가질 수 있고, 다른 하나의 ITR은 상이한 변형(예를 들어, 단일 아암, 또는 짧은 B-B’ 아암 등)을 가질 수 있어서, 이들은 동족 비대칭적인 변형된- ITR에 비해 상이한 3-차원 공간 구성을 갖는다.
본원에 사용된 “대칭적인 ITR”이라는 용어는, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의, 야생형 또는 돌연변이(예를 들어, 야생형에 비해 변형된) 데펜도바이러스 ITR 서열이며, 전체 길이에 대해 역 상보체인 ITR의 쌍을 말한다. 하나의 비-제한적 예에서, 양쪽 ITR은 AAV2 유래의 야생형 ITR 서열이다. 다른 예에서, 어느 ITR도 야생형 ITR AAV2 서열이 아니고(즉, 이들은 돌연변이 ITR라고도 지칭되는 변형된 ITR임), 뉴클레오티드 첨가, 결실, 치환, 절단 또는 점 돌연변이 때문에 야생형 ITR과는 서열 차이를 가질 수 있다. 본원에서 편의를 위해, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 업스트림) 5’에 위치한 ITR은 “5’ ITR” 또는 “좌측 ITR”로 지칭되고, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 다운스트림) 3’에 위치한 ITR은 “3’ ITR” 또는“우측 ITR”로 지칭된다.
본원에서 사용된 “실질적으로 대칭적인 변형-ITR” 또는 “실질적으로 대칭적인 변형-ITR 쌍”이라는 용어는, 둘 모두 전체 길이에 걸쳐 역 상보체 서열을 갖는, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 변형된-ITR의 쌍을 말한다. 예를 들어, 변형된 ITR은, 역 상보체 서열에서 벗어난 일부 뉴클레오티드 서열을 갖더라도, 변화가 특성 및 전체 형상에 영향을 미치지 않는 한, 실질적으로 대칭인 것으로 간주될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 동족 변형된 ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 달리 말하면, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은 3D 공간에 구성된 동일한 A, C-C’ 및 B-B’ 루프를 갖는다. 일부 구현예에서, mod-ITR 쌍으로부터의 ITR은 상이한 역 상보체 뉴클레오티드 서열을 갖지만, 여전히 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 가질 수 있으며, 즉, 두 개의 ITR은 동일한 전체 3D 형상을 생성하는 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, mod-ITR 쌍에서 하나의 ITR(예를 들어, 5’ ITR)은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 ITR(예를 들어, 3’ ITR)은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있지만, 두 가지 모두 동일한 상응하는 돌연변이를 가질 수 있으므로(예를 들어, 5’ ITR이 C 영역에 결실을 갖는 경우, 상이한 혈청형으로부터의 동족의 변형된 3’ ITR은 C’ 영역의 상응하는 위치에 결실을 가짐), 변형된 ITR 쌍은 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 이러한 구현예에서, 변형된 ITR 쌍의 각각의 ITR은 상이한 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12), 예컨대 AAV2와 AAV6의 조합에서 유래할 수 있으며, 여기서 하나의 ITR에서의 변형은 상이한 혈청형의 동족 ITR 내 상응하는 위치에 반영된다. 하나의 구현예에서, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은, ITR 사이의 뉴클레오티드 서열 차이가 특성 또는 전체 형상에 영향을 미치지 않고 이들이 3D 공간에서 실질적으로 동일한 형상을 갖는 한, 변형된 ITR(mod-ITR)의 쌍을 나타낸다. 비제한적인 예로서, mod-ITR은 기본 설정의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(BLASTN)와 같은 당업계에 널리 공지된 표준 수단에 의해 측정 시 기본형 mod-ITR과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C’ 및 B-B’ 루프를 가지며, 예를 들어 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C’ 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 mod-ITR은 C-C’ 루프의 상응하는 결실을 갖고, 또한 이의 동족 mod-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형상으로 나머지 A 및 B-B’ 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다.
“측접하는(flanking)”이라는 용어는, 한 핵산 서열의 다른 핵산 서열에 대한 상대적 위치를 말한다. 일반적으로, 서열 ABC에서, B에는 A와 C가 측접하고 있다. 이는 배열 AxBxC에 대해서도 동일하게 적용된다. 따라서, 측접 서열은 측접된 서열의 앞에 있거나 뒤에 있지만, 측접된 서열에 인접하거나 바로 근접할 필요는 없다. 일 구현예에서, 측접이라는 용어는 선형 이중체 ceDNA 벡터의 각 말단에 있는 말단 반복부를 말한다.
본원에 사용된 “ceDNA 게놈”이라는 용어는, 적어도 하나의 역말단반복 영역을 추가로 포함하는 발현 카세트를 나타낸다. ceDNA 게놈은 하나 이상의 스페이서 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 게놈은 DNA의 분자간 이중체 폴리뉴클레오티드로서 플라스미드 또는 바이러스 게놈에 혼입된다.
본원에 사용된 “ceDNA 스페이서 영역”이라는 용어는, ceDNA 벡터 또는 ceDNA 게놈에서 기능성 요소를 분리하는 개재 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 최적의 기능을 위해 2개의 기능성 요소를 목적하는 거리로 유지시킨다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은, 예를 들어 플라스미드 또는 바큘로바이러스 내에 ceDNA 게놈의 유전적 안정성을 제공하거나 부가한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은, 클로닝 부위 등에 대한 편리한 위치를 제공하는 방식으로, ceDNA 게놈의 준비된 유전자 조작을 용이하게 한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 몇몇 제한 뉴클레아제 부위 또는 알려지지 않은 단백질(예를 들어, 전사 인자) 결합 부위를 갖도록 고안된 비-오픈리딩프레임 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 “폴리링커(polylinker)”는, ceDNA 게놈에서 cis-작용 인자들을 분리시키도록 위치되어, 예를 들어, 말단 분해 부위와 업스트림 전사 조절 요소의 사이에 6량체, 12량체, 18량체, 24량체, 48량체, 86량체, 176량체 등을 삽입할 수 있다. 유사하게, 스페이서는 폴리아데닐화 신호 서열과 3’-말단 분해 부위 사이에 혼입될 수 있다.
본원에 사용된 “ceDNA-플라스미드”라는 용어는, 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 플라스미드를 나타내다.
본원에 사용된 “ceDNA-박미드”라는 용어는, 플라스미드로서 대장균에서 증식할 수 있고, 따라서 바큘로바이러스에 대한 셔틀 벡터로서 작용할 수 있는 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 감염성 바큘로바이러스 게놈을 나타낸다.
본원에 사용된 “ceDNA-바큘로바이러스”라는 용어는, 바큘로바이러스 게놈 내에 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 바큘로바이러스를 나타낸다.
본원에 사용된 “ceDNA-바큘로바이러스 감염된 곤충 세포” 및 “ceDNA-BIIC”라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, ceDNA-바큘로바이러스로 감염된 무척추동물 숙주 세포(비제한적으로, 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포) 포함)를 나타낸다.
본원에 사용된 “폐쇄-말단 DNA 벡터”라는 용어는, 적어도 하나의 공유적으로 폐쇄된 말단을 갖는 캡시드-불포함 DNA 벡터를 말하며, 여기에서 상기 벡터의 적어도 일부는 분자내 이중체 구조를 갖는다.
본원에 사용된 “ceDNA”라는 용어는, 비-바이러스성 유전자 전달을 위한 캡시드-불포함 폐쇄-말단 선형 이중가닥(ds) 이중체 DNA를 말하며, 합성되거나, 그렇지 않을 수 있다. ceDNA에 대한 상세한 설명은, 2017년 3월 3일자 출원된 국제 출원 PCT/US2017/020828에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 명백하게 본원에 참조로서 인용된다. 세포 기반 방법을 사용하여 다양한 역말단반복(ITR) 서열 및 구성을 포함하는 ceDNA의 생산을 위한 특정 방법은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 출원 PCT/US18/49996 및 2018년 12월 6일자 출원된 PCT/US2018/064242의 실시예 1에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 다양한 ITR 서열 및 구성을 포함하는 합성 ceDNA 벡터의 생산을 위한 특정 방법은, 예를 들어 2019년 1월 18일자 출원된 국제 출원 PCT/US2019/14122에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로서 인용된다.
본원에 사용된 “ceDNA 벡터” 및 “ceDNA”라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 적어도 하나의 말단 회문 구조를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터를 지칭한다. 일부 구현예에서, ceDNA는 공유결합으로 폐쇄된 2개의 말단을 포함한다.
본원에 사용된 “neDNA” 또는 “닉 ceDNA”는, 오픈리딩프레임의 5’ 업스트림(예를 들어, 프로모터 및 발현될 전이유전자)의 스템 영역 또는 스페이서 영역에 있는, 닉 또는 1 내지 100개 염기쌍의 갭을 갖는 폐쇄-말단 DNA 염기쌍을 말한다.
본원에 사용된 “갭” 및 “닉(nick)”이라는 용어는, 상호 교환적으로 사용되며, 본 발명의 합성 DNA 벡터의 불연속 부분을 말하는데, 이는 그렇지 않았다면 이중 가닥 ceDNA에서 단일 가닥 DNA 부분의 스트레치를 형성한다. 갭은 이중체 DNA의 하나의 가닥에서 1개 염기쌍 내지 100개 염기쌍 길이일 수 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 설계되고 형성된 전형적인 갭, 및 이러한 방법에 의해 생성된 합성 벡터는, 예를 들어 길이가 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 11 bp, 12 bp, 13 bp, 14 bp, 15 bp, 16 bp, 17 bp, 18 bp, 19 bp, 20 bp, 21 bp, 22 bp, 23 bp, 24 bp, 25 bp, 26 bp, 27 bp, 28 bp, 29 bp, 30 bp, 31 bp, 32 bp, 33 bp, 34 bp, 35 bp, 36 bp, 37 bp, 38 bp, 39 bp, 40 bp, 41 bp, 42 bp, 43 bp, 44 bp, 45 bp, 46 bp, 47 bp, 48 bp, 49 bp, 50 bp, 51 bp, 52 bp, 53 bp, 54 bp, 55 bp, 56 bp, 57 bp, 58 bp, 59 bp 또는 60 bp일 수 있다. 본 개시내용에 예시된 갭은 길이가 1 bp 내지 10 bp, 1 bp 내지 20 bp, 1 bp 내지 30 bp일 수 있다.
본원에 사용된 “Rep 결합 부위”, “Rep 결합 요소”, “RBE” 및 “RBS”라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, Rep 단백질에 의해 결합될 때, Rep 단백질이 RBS를 포함하는 서열에서 이의 부위 특이적 엔도뉴클레아제 활성을 수행할 수 있게 하는 Rep 단백질(예를 들어, AAV Rep 78 또는 AAV Rep 68)에 대한 결합 부위를 나타낸다. RBS 서열과 이의 역 상보체는 함께 단일 RBS를 형성한다. RBS 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 AAV2에서 식별된 RBS 서열인 5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3′(서열번호: 39)를 포함한다. 다른 공지된 AAV RBS 서열, 및 다른 자연적으로 공지된 또는 합성 RBS 서열을 포함하는, 임의의 공지된 RBS 서열이 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, Rep 단백질의 뉴클레아제 도메인은 이중체 뉴클레오티드 서열 GCTC에 결합하기 때문에, 2개의 공지된 AAV Rep 단백질이 이중체 올리고뉴클레오티드인 5’-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3’(서열번호: 39) 상에 직접 결합하여 안정적으로 어셈블링된다고 여겨진다. 또한, 가용성 응집된 이형태체(conformer)(즉, 정의되지 않은 수의 상호 연관된 Rep 단백질)는 해리되어, Rep 결합 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드에 결합한다. 각각의 Rep 단백질은 각 가닥에서 질소성 염기 및 포스포디에스테르 백본과 상호작용한다. 질소성 염기와의 상호작용은 서열 특이성을 제공하지만, 포스포디에스테르 백본과의 상호작용은 비(非)서열 특이적 또는 덜 서열 특이적이며, 단백질-DNA 복합체를 안정화시킨다.
본원에 사용된 “말단 분해 부위(terminal resolution site)” 및 “TRS”라는 용어는, 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, Rep이 5’ 티미딘과 티로신-포스포디에스테르 결합을 형성하여, 세포 DNA 중합 효소, 예를 들어, DNA pol 델타 또는 DNA pol 엡실론을 통해 DNA 신장을 위한 기질로 작용하는 3’ OH를 생성하는 부위를 지칭한다. 대안적으로, Rep-티미딘 복합체는 조정된 결찰 반응에 참여할 수 있다. 일부 구현예에서, TRS는 염기쌍을 이루지 않은 티미딘을 최소한으로 포함한다. 일부 구현예에서, TRS의 닉킹 효율은 RBS로부터의 동일한 분자 내 거리에 의해 적어도 부분적으로 제어될 수 있다. 수용체 기질이 상보적 ITR인 경우, 생성되는 산물은 분자내 이중체이다. TRS 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 AAV2로 식별된 헥사뉴클레오티드 서열인 5’-GGTTGA-3’(서열번호: 804)를 포함한다. 다른 공지된 AAV TRS 서열 및 다른 자연적으로 알려진 또는 합성 TRS 서열, 예컨대 AGTT(서열번호: 085), GGTTGG(서열번호: 806), AGTTGG(서열번호: 807), AGTTGA(서열번호: 808), 및 RRTTRR(서열번호: 809)과 같은 다른 모티프를 포함하는, 임의의 공지된 TRS 서열이 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 “센스” 및 “안티센스”라는 용어는, 폴리뉴클레오티드 상의 구조 요소의 방향을 말한다. 요소의 센스 및 안티센스 버전은 서로 역 상보체이다.
본원에 사용된 “합성 AAV 벡터” 및 “AAV 벡터의 합성에 의한 생산”이라는 용어는, 전체적인 무세포 환경에서의 AAV 벡터 및 이의 합성 생산 방법을 말한다.
본원에 사용된 “리포터”는 탐지 가능한 판독물(read-out)을 제공하는데 사용될 수 있는 단백질을 말한다. 리포터는 일반적으로 형광, 색상 또는 발광과 같은 측정 가능한 신호를 생성한다. 리포터 단백질 코딩 서열은 세포 또는 유기체에서의 존재가 용이하게 관찰되는 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 형광 단백질은 특정 파장의 빛으로 여기될 때 세포가 형광을 나타내게 하고, 루시퍼라제는 세포가 빛을 생성하는 반응을 촉진시키게 하며, β-갈락토시다제와 같은 효소는 기질을 착색된 산물로 전환시킨다. 실험 또는 진단 목적에 유용한 예시적인 리포터 폴리펩타이드에는, 비제한적으로 β-락타마아제, β -갈락토시다제(LacZ), 알칼리성 포스파타제(AP), 티미딘 키나제(TK), 녹색 형광 단백질(GFP) 및 다른 형광 단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 및 당업계에 널리 공지된 다른 것들이 포함된다.
본원에 사용된 “이펙터(effector) 단백질”이라는 용어는, 예를 들어 리포터 폴리펩타이드, 또는 보다 적절하게는, 세포를 사멸시키는 폴리펩타이드, 예를 들어 독소, 또는 세포가 선택된 작용제 또는 이의 결여로 인해 사멸하기 쉽게 만드는 작용제로서 검출 가능한 판독물을 제공하는 폴리펩타이드를 나타낸다. 이펙터 단백질에는, 숙주 세포의 DNA 및/또는 RNA를 직접 표적으로 하거나 이를 손상시키는 임의의 단백질 또는 펩타이드가 포함된다. 예를 들어, 이펙터 단백질은, 비제한적으로, 숙주 세포 DNA 서열(게놈 요소인지 또는 염색체외 요소인지에 관계없이)을 표적으로 하는 제한 엔도뉴클레아제, 세포 생존에 필요한 폴리펩타이드 표적을 분해하는 프로테아제, DNA 자이라아제(gyrase) 억제제 및 리보뉴클레아제 유형 독소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 합성 생물학적 회로에 의해 제어되는 이펙터 단백질의 발현은, 또 다른 합성 생물학적 회로에 인자로 참여하여, 생물학적 회로 시스템의 반응성의 범위 및 복잡성을 확장시킬 수 있다.
전사 조절인자는 관심 대상 유전자, 예컨대 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로 중 하나 이상의 억제제, 또는 카스파제 1 억제제)의 전사를 활성화하거나, 억제하는 전사 활성자 및 억제제를 말한다. 프로모터는 특정 유전자의 전사를 개시하는 핵산의 영역이다. 전사 활성화제는 전형적으로 전사 프로모터 근처에 결합하고 RNA 폴리머라아제를 동원하여, 직접 전사를 개시한다. 억제제는 전사 프로모터에 결합하여, RNA 폴리머라아제에 의한 전사 개시를 입체적으로 방해한다. 다른 전사 조절인자는 이들의 결합하는 위치, 및 세포 및 환경 조건에 따라 활성화제 또는 억제제로 작용할 수 있다. 전사 조절인자 부류의 비제한적인 예에는, 비제한적으로, 호메오도메인(homeodomain) 단백질, 아연-핑거 단백질, 날개있는 나선형(winged-helix)(포크헤드(forkhead)) 단백질 및 류신-지퍼 단백질이 포함된다.
본원에 사용된 “억제 단백질” 또는 “유도 단백질”은, 조절 서열 요소에 결합하여, 조절 서열 요소에 작동적으로 연결된 서열의 전사를, 각각, 억제 또는 활성화시키는 단백질이다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 억제 및 유도 단백질은 적어도 하나의 입력물질 또는 환경 입력의 존재 또는 부재에 민감하다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 단백질은, 예를 들어 분리 가능한 DNA-결합 및 입력물질-결합, 또는 반응성 요소 또는 도메인을 포함하는 형태의 모듈이다.
본원에 사용된 “담체”에는, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등이 포함된다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. “약학적으로 허용 가능한”이라는 구절은, 숙주에게 투여될 때 독성, 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 생성하지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 나타낸다.
본원에 사용된 “입력물질 반응성 도메인”은, 연결된 DNA 결합 융합 도메인을 해당 조건 또는 입력의 존재에 대해 반응성으로 만드는 방식으로 조건 또는 입력물질에 결합하거나 다르게는 이에 반응하는 전사인자의 도메인이다. 하나의 구현예에서, 조건 또는 입력의 존재는 입력물질 반응성 도메인 또는 이와 융합되는 단백질에서 입체형태 변화를 유도하여, 전사인자의 전사 조절 활성을 변형시킨다.
“생체내”라는 용어는, 다세포 동물과 같은 유기체에서 또는 유기체 내에서 일어나는 검정 또는 과정을 나타낸다. 본원에 기재된 일부 양태에서, 방법 또는 용도는, 박테리아와 같은 단세포 유기체가 사용될 때, “생체내”에서 일어난다고 할 수 있다. “생체외”라는 용어는, 다세포 동물 또는 식물의 체외, 예를 들어 특히 외식편, 배양된 세포(1차 세포 및 세포주 포함), 형질전환된 세포주 및 추출된 조직 또는 세포(혈액 세포 포함)에 있는 온전한 막을 갖는 살아있는 세포를 사용하여 수행되는 방법 및 용도를 나타낸다. “시험관내”라는 용어는, 세포 추출물과 같은 온전한 막을 갖는 세포의 존재를 필요로 하지 않는 검정 및 방법을 나타내며, 세포를 포함하지 않는 배지와 같은 비(非)세포 시스템, 또는 세포 추출물과 같은 세포 시스템에 프로그래밍 가능한 합성 생물학적 회로를 도입하는 것을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 “프로모터”라는 용어는, 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 이종 표적 유전자일 수 있는 핵산 서열의 전사를 유도하는 방식으로 또 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 임의의 핵산 서열을 나타낸다. 프로모터는 구성적, 유도성, 억제성, 조직 특이적 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 프로모터는 핵산 서열의 나머지 부분의 전사 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 제어 영역이다. 프로모터는 또한 RNA 폴리머라아제 및 다른 전사인자와 같은, 조절 단백질 및 분자에 결합할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 양태의 일부 구현예에서, 프로모터는 프로모터 그 자체의 발현을 조절하는 전사 인자의 발현을 구동시킬 수 있다. 프로모터 서열 내에는 전사 개시 부위뿐 아니라, RNA 폴리머라아제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인이 발견될 것이다. 진핵생물 프로모터는 종종, 항상은 아니지만, “TATA” 박스와 “CAT” 박스를 함유할 것이다. 유도성 프로모터를 비롯한 다양한 프로모터는, 본원에 개시된 ceDNA 벡터의 전이유전자의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 프로모터 서열은 이의 3’ 말단에서 전사 개시 부위에 의해 경계를 이루고, 업스트림(5’ 방향)으로는 전사를 탐지 가능한 상기 배경 수준으로 개시하는데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함하도록 연장될 수 있다.
본원에 사용된 “인핸서”라는 용어는, 하나 이상의 단백질(예를 들어, 활성자 단백질 또는 전사 인자)에 결합하여, 핵산 서열의 전사 활성화를 증가시키는 시스-작용 조절 서열(예를 들어, 50 내지 1,500개 염기쌍)을 말한다. 인핸서는 이들이 조절하는 유전자 시작 부위의 업스트림 또는 유전자 시작 부위의 다운스트림에 최대 1,000,000개 염기쌍으로 배치될 수 있다. 인핸서는 인트론 영역 내, 또는 관련없는 유전자의 엑손 영역에 배치될 수 있다.
프로모터는 이것이 조절하는 핵산 서열의 발현을 유도하거나 전사를 유도한다고 할 수 있다. “작동 가능하게 연결된”, “작동적으로 배치된”, “작동적으로 연결된”, “제어 하에 있는” 및 “전사 제어 하에 있는”이라는 구절은, 프로모터가 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 위해 조절하는 핵산 서열에 대해 정확한 기능적 위치 및/또는 배향으로 존재한다는 것을 나타낸다. 본원에 사용된 “역 프로모터”는, 코딩 가닥이 비코딩 가닥이 되고, 그 반대로도 되도록, 핵산 서열이 역 배향으로 존재하는 프로모터를 나타낸다. 역 프로모터 서열은 다양한 구현예에서 스위치의 상태를 조절하는 데 사용될 수 있다. 또한, 다양한 구현예에서, 프로모터는 인핸서와 함께 사용될 수 있다.
프로모터는 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 분절 및/또는 엑손의 업스트림에 위치한 5' 비코딩 서열을 단리하여 얻을 수 있는 바와 같이 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 “내인성”으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 일부 구현예에서, 인핸서는 해당 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한, 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 코딩 핵산 분절은 “재조합 프로모터” 또는 “이종 프로모터”의 제어 하에 배치되며, 여기서 두 가지 프로모터는 모두 자연 환경에서 작동 가능하게 연결된 인코딩된 핵산 서열과 통상적으로 연관되지 않은 프로모터를 나타낸다. 재조합 또는 이종 인핸서는, 자연 환경에서 주어진 핵산 서열과 통상적으로 연관되지 않은 인핸서를 나타낸다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는, 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서; 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포에서 단리된 프로모터 또는 인핸서; 및 “자연 발생”이 아닌, 즉, 상이한 전사조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 당업계에 공지된 유전자 조작 방법을 통해 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함하는 합성 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터와 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것에 더하여, 프로모터 서열은 본원에 개시된 합성 생물학적 회로 및 모듈과 관련하여, 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술(PCR 포함)을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호(이들은 각각 본원에 참조로서 인용됨) 참조). 나아가, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비(非)핵 세포소기관 내 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열이 또한 이용될 수 있다고 고려된다.
본원에 기재된 “유도성 프로모터”는, 유도제 또는 유도 작용제의 존재 하에 있거나, 이에 의해 영향을 받거나 또는 이에 의해 방해를 받을 때 전사 활성을 개시하거나 증강시키는 것을 특징으로 하는 것이다. 본원에 정의된 “유도제” 또는 “유도 작용제”는, 유도성 프로모터로부터 전사 활성을 유도하는 데 활성이 되는 방식으로 투여되는, 내인성, 또는 통상적으로 외인성 화합물 또는 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 유도제 또는 유도 작용제, 즉, 화학물질, 화합물 또는 단백질은, 그 자체가 핵산 서열의 전사 또는 발현 결과일 수 있으며(즉, 유도제는 또 다른 구성요소 또는 모듈에 의해 발현된 유도제 단백질일 수 있음), 이는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 억제제와 같은 특정 작용제의 부재 하에서 유도된다. 유도성 프로모터의 예에는, 비제한적으로, 테트라시클린(tetracycline), 메탈로티오닌(metallothionine), 엑디손(ecdysone), 포유류 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 및 마우스 유선종양바이러스 말단반복(MMTV-LTR)), 및 다른 스테로이드 반응성 프로모터, 라파마이신(rapamycin) 반응성 프로모터 등이 포함된다.
“DNA 조절 서열”, “조절 요소(control element)” 및 “조절 요소(regulatory element)”는 본원에서 상호 교환적으로 사용되는데, 비-코딩 서열(예를 들어, DNA-표적화 RNA) 또는 코딩 서열(예를 들어, 부위-지향된 변형 폴리펩티드, 또는 Cas9/Csn1 폴리펩티드)의 전사를 제공하고/하거나 이를 조절하고/거나, 인코딩된 폴리펩티드의 번역을 조절하는 전사 및 번역 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결자, 단백질 분해 신호 등을 지칭한다.
“작용 가능하게 연결된”이라는 어구는, 상기 기재된 요소들이 이들의 의도된 방식으로 기능을 할 수 있게 하는 관계일 때의 병렬을 말한다. 예를 들어, 프로모터가 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. “발현 카세트”는 프로모터, 또는 ceDNA 벡터에서 전이 유전자의 전사를 유도하기에 충분한 다른 조절 서열에 작용 가능하게 연결된 이종 DNA 서열을 포함한다. 적합한 프로모터는 예를 들어 조직 특이적인 프로모터를 포함한다. 프로모터는 또한 AAV 기원을 갖는 것일 수 있다.
본원에 사용된 “대상”이라는 용어는, 본 발명에 따른 ceDNA 벡터로 치료(예방적 치료 포함)가 제공되는 인간 또는 동물을 나타낸다. 통상적으로, 동물은, 비제한적으로, 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥감 동물과 같은 척추동물이다. 영장류에는, 비제한적으로, 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 스파이더 원숭이 및 마카크(macaque), 예를 들어 레서스(Rhesus)가 포함된다. 설치류에는, 마우스, 래트, 마멋(woodchuck), 페럿(ferret), 토끼 및 햄스터가 포함된다. 가축 및 사냥감 동물에는, 비제한적으로, 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과 종류(예를 들어, 집고양이), 개과 종류(예를 들어, 개, 여우, 늑대), 조류(예를 들어, 닭, 에뮤, 타조) 및 어류(송어, 메기 및 연어)가 포함된다. 본원에 기재된 양태의 특정 구현예에서, 대상은 포유류, 예를 들어 영장류 또는 인간이다. 대상은 남성 또는 여성일 수 있다. 또한, 대상은 유아 또는 어린이일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 신생아 또는 태어나지 않은 대상, 예를 들어 자궁에 있는 대상일 수 있다. 바람직하게는, 대상은 포유류이다. 포유류는 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이러한 예에 제한되지 않는다. 인간 이외의 포유류는 질환 및 장애의 동물 모델을 나타내는 대상으로 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 가축 및/또는 애완동물에 대해 사용될 수 있다. 인간 대상은 임의의 연령, 성별, 인종 또는 민족, 예를 들어 코카시안(백인), 아시아인, 아프리카인, 흑인, 아프리카계 미국인, 아프리카계 유럽인, 히스패닉계, 중동인 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 임상 설정에서의 환자 또는 다른 대상일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 이미 치료를 받고 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 배아(embryo), 태아(fetus), 신생아, 유아, 아동, 청소년 또는 성인이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 태아, 인간 신생아, 인간 유아, 인간 아동, 인간 청소년 또는 인간 성인이다. 일부 구현예에서, 대상체는 동물 배아, 또는 비-인간 배아 또는 비-인간 영장류 배아이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 배아이다.
본원에 사용된 “숙주 세포”라는 용어는, 핵산 제작물 또는 본 개시 내용의 ceDNA 발현 벡터에 의한 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 형질도입(transduction) 등에 취약한 임의의 세포 타입을 포함한다. 비제한적인 예로서, 숙주 세포는 단리된 1차 세포, 다능성 줄기세포, CD34+ 세포, 유도된 다능성 줄기세포, 또는 다수의 불멸화된 세포주 중 임의의 것(예를 들어, HepG2 세포)일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 조직, 기관 또는 유기체의 제자리 또는 생체내 세포일 수 있다.
“외인성”이라는 용어는 자연적인 공급원이 아닌, 세포에 존재하는 물질을 지칭한다. 본원에 사용된 “외인성”이라는 용어는, 인간의 손이 관여하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템에 도입된 핵산(예를 들어, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산) 또는 폴리펩타이드로서, 통상적으로 발견되지 않으며 인간이 이러한 세포 또는 유기체에 도입하고자 하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 대안적으로, “외인성”은, 인간의 손이 관여하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템에 도입된 핵산 또는 폴리펩타이드로서, 비교적 낮은 수준으로 발견되며, 인간이, 예를 들어 이소성(ectopic) 발현 또는 수준을 생성하도록 이러한 세포 또는 유기체 내 핵산 또는 폴리펩타이드의 양을 증가시키기 위해 도입하고자 하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 반대로, “내인성”이라는 용어는 생물계 또는 세포에 원래 있는 물질을 지칭한다.
“서열 동일성”이라는 용어는, 두 뉴클레오티드 서열들 간의 관련성을 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 2개의 데옥시리보뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성 정도는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 상기 Rice 등의 문헌(2000) 참조)의 니들(Needle) 프로그램(바람직하게는 버전 3.0.0 이상)에서 구현된 바와 같이 니들만 브니쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘(상기 Needleman 및 Wunsch의 문헌(1970) 참조)을 사용하여 결정된다. 사용되는 선택적 매개변수는 갭 오픈 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. 니들 표지된 “최장 동일성”의 출력(-nobrief 옵션을 사용하여 수득됨)은 동일성%로 사용되며, 이는 다음과 같이 계산된다: (동일한 데옥시뉴클레오티드 x 100)/(정렬 길이 - 정렬의 총 갭 수). 정렬의 길이는 바람직하게는 적어도 10개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 25개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 적어도 100개 뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 “상동성” 또는 “상동성이 있는”라는 용어는, 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 서열 동일성의 최대 퍼센트를 얻기 위해 갭을 도입한 후, 표적 염색체 상의 상응하는 서열의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 뉴클레오티드 잔기의 백분율로서 정의된다. 뉴클레오티드 서열 상동성 %를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당업계의 기술 내에서 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 상동성 아암(arm)의 핵산 서열 (예를 들어, DNA 서열)은, 그 서열이 숙주 세포의 상응하는 천연 핵산 서열 또는 편집되지 않은 핵산 서열 (예를 들어, 게놈 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상 동일한 때, “상동성이 있는” 것으로 고려된다.
본원에 사용된 “이종성”이라는 용어는, 각각 천연 핵산 또는 단백질에서는 발견되지 않는 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전 공학에 의해) 자연-발생적인 핵산 서열 (또는 이의 변형체)에 연결되어, 키메라 폴리펩티드를 인코딩하는 키메라 뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전자 조작에 의해) 변이형 폴리펩타이드에 연결되어, 융합 변이형 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다.
“벡터” 또는 “발현 벡터”는, 다른 DNA 세그먼트, 즉 “삽입체”가 부착되어, 부착된 세그먼트를 세포 내에서 복제시키는 레플리콘(replicon), 예컨대 플라스미드, 박미드, 파지, 바이러스, 비리온, 또는 코스미드이다. 벡터는 숙주 세포로의 전달, 또는 상이한 숙주 세포 사이에서의 전달을 위해 설계된 핵산 제작물일 수 있다. 본원에 사용된 벡터는, 원래의 및/또는 최종 형태의 바이러스 또는 비-바이러스일 수 있으나, 본 개시 내용의 목적을 위해 상기 용어가 본원에 사용될 때, “벡터”는 일반적으로 ceDNA 벡터를 지칭한다. “벡터”라는 용어는, 적절한 조절 요소와 연결될 때 복제가능하고, 유전자 서열을 세포에 전달할 수 있는 임의의 유전적 요소를 포괄한다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터 또는 재조합 벡터일 수 있다.
본원에 사용된 “발현 벡터”라는 용어는, 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩티드의 발현을 유도하는 벡터를 지칭한다. 발현된 서열은, 종종 세포와 이종성을 갖지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 발현 벡터는 추가적인 요소를 포함할 수 있는데, 예를 들어, 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가져서, 2개의 유기체 내에 유지될 수 있으며, 예를 들어 발현을 위해서는 인간 세포 내에, 클로닝과 증폭을 위해서는 원핵 숙주 내에 유지된다. “발현”이라는 용어는, RNA 및 단백질, 그리고 적절한 경우, 분비 단백질의 생산에 관여하는 세포내 과정을 지칭하는데, 이는 응용 가능하다면, 예를 들어, 전사, 전사체 가공, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 가공을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. “발현 산물”은, 유전자로부터 전사된 RNA, 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 얻은 폴리펩티드를 포함한다. “유전자”라는 용어는, 적절한 조절 서열에 작용 가능하게 연결될 때, 시험관 내 또는 생체 내에서 RNA로 전사되는 핵산 서열(DNA)을 의미한다. 유전자는 암호화 부위, 예를 들어, 5’ 비번역(5’UTR) 또는 “리더” 서열, 및 3’ UTR 또는 “트레일러” 서열, 뿐만 아니라 개별적인 코딩 세그먼트들(엑손들) 사이의 개재 서열(인트론)의 앞쪽 영역과 뒤쪽 영역을 포함하거나, 포함하지 않을 수 있다.
“재조합 벡터”는, 생체 내에서 발현될 수 있는 이종 핵산 서열, 또는 “전이유전자”를 포함하는 벡터를 의미한다. 일부 구현예에서는, 본원에 기재된 벡터를 다른 적합한 조성물 및 치료와 조합할 수 있다고 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 벡터는 에피솜 상태이다. 적합한 에피솜 벡터의 사용은 대상에서 관심 뉴클레오티드를 염색체외 DNA에 높은 카피수로 유지하여, 염색체 통합의 잠재적인 영향을 제거하는 수단을 제공한다.
본원에 사용된 “유전 질환”이라는 문구는, 게놈 내의 하나 이상의 비정상에 의해 부분적으로, 완전히, 직접 또는 간접적으로 유발된 질병, 특히 출생시부터 존재하는 질환을 지칭한다. 상기 비정상은 돌연변이, 삽입 또는 결실일 수 있다. 비정상은 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 미칠 수 있다. 유전병은 DMD, 혈우병(hemophilia), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 헌팅톤 무도병(Huntington's chorea), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종(hepatoblastoma), 윌슨병(Wilson's disease), 선천성 간 포르피린증(congenital hepatic porphyria), 간 대사의 유전적 장애, 레쉬 니한 증후군(Lesch Nyhan syndrome), 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia), 지중해빈혈(thalassaemia), 색소성 건피증(xeroderma pigmentosum), 판코니 빈혈(Fanconi's anemia), 망막세포변성증(retinitis pigmentosa), 모세혈관확장성 실조증(ataxia telangiectasia), 블룸 증후군(Bloom's syndrome), 망막모세포종(retinoblastoma), 및 테이-삭스 병(Tay-Sachs disease)을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원에 사용된 “억제성 폴리뉴클레오티드”는, 제2(표적) 폴리뉴클레오티드의 발현(전사 또는 번역)을 감소시키거나 방해하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 억제성 폴리뉴클레오티드는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 리보자임 및 외부 가이드 서열을 포함한다. “억제성 폴리뉴클레오티드”라는 용어는, DNA 및 RNA 분자, 예를 들어, 실제 억제성 종, 예컨대 리보자임을 인코딩하는 DNA 분자를 억제하는 RNAi를 추가로 포함한다.
RNAi 분자, 예를 들어 siRNA 또는 miRNA의 활성에 관하여 본원에 사용된 “유전자 침묵” 또는 “침묵된 유전자”는, 표적 유전자(예를 들어, NLRP3, AIM2 또는 카스파제-1 mRNA)에 대한 세포내 mRNA 수준이, miRNA 또는 RNA 간섭 분자의 존재 없이, 세포 내에서 발견되는 상기 mRNA 수준의 적어도 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%만큼 감소한 것을 말한다. 하나의 바람직한 구현예에서, mRNA 수준은 적어도 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100% 감소한다.
본원에 사용된 “RNAi”라는 용어는, siRNAi, shRNAi, 내인성 마이크로RNA 및 인공 마이크로RNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 타입의 간섭 RNA를 지칭한다. 예를 들어, 이는 이전에 siRNA로서 식별된 서열을 포함하나, RNA의 다운-스트림 가공의 메커니즘과 무관하다(즉, 비록 siRNA가 생체 내 가공의 특정 방법에 의해 mRNA를 절단시키는 것으로 생각되기는 하지만, 이러한 서열은 본원에 기재된 측접 서열들의 맥락에서 벡터 내에 포함될 수 있다). “RNAi”라는 용어는, 유전자 침묵 RNAi 분자와, 또한 유전자의 발현을 활성화시키는 RNAi 이펙터 분자를 둘 다 포함할 수 있다. 단지 예시의 방식으로, 일부 구현예에서, 유전자를 억제하거나 침묵시키는 RNAi 제제는, 예를 들어, 면역 반응 (예를 들어, 선천적 면역 반응)을 억제하기 위한, 본원에 개시된 방법, 키트 및 조성물에 유용하다.
본원에 사용된 “포함하는” 또는 “포함하다”라는 용어는, 방법 또는 조성물에 필수적이지만, 필수적인지 여부에 관계없이 명시되지 않은 요소를 포함할 수도 있는, 조성물, 방법, 및 이의 각 구성요소(들)에 관하여 사용된다.
본원에 사용된 “~로 본질적으로 이루어진”이라는 용어는, 주어진 구현예에 필요한 요소를 나타낸다. 상기 용어는, 해당 구현예의 기본적인 및 신규한 또는 기능적인 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다. “포함하는”이라는 용어는, 제한적이기보다는 포함적이다.
“~로 이루어진”이라는 용어는, 구현예의 설명에 언급되지 않은 임의의 요소를 배제하는, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법 및 이의 각 구성요소를 나타낸다.
본원에 사용된 "~로 본질적으로 이루어진"이라는 용어는, 주어진 구현예에 필요한 요소를 나타낸다. 상기 용어는 본 발명의 구현예의 기본적이고 신규하거나 기능적인 특징(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 추가 요소들의 존재를 허용한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 표현은, 문맥에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, “방법”에 대한 언급은 본원에 기재된 및/또는 본 개시내용 등을 읽을 때 당업자에게 명백해질 수 있는 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다. 유사하게, “또는”이라는 단어는, 문맥에서 달리 명백하게 지시되지 않는 한, “및”을 포함한다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재된다. “e.g.”라는 약어는, 라틴어 예를 들어(exempli gratia)에서 유도된 것이며, 이는 본원에서 비제한적인 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, “e.g.”라는 약어는, “예를 들어”라는 용어와 동의어이다.
실시예 이외에 또는 달리 지시된 경우에, 본원에 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 표현하는 모든 수치는, 모든 경우에 “약”이라는 용어에 의해 변형되는 것으로 이해해야 한다. 백분율과 관련하여 사용될 때 “약”은, 평균 ±1%일 수 있다. 본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 상세하게 설명되지만, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적인 요소 또는 구현예의 그룹 지정은, 제한으로서 해석되지 않을 것이다. 각각의 그룹의 일원은, 개별적으로 또는 그 그룹의 다른 일원 또는 본원에서 발견된 다른 요소들과 임의로 조합하여 지칭되고, 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 일원은, 편의성 및/또는 특허성의 이유로 한 그룹 내에 포함되거나, 이로부터 배제될 수 있다. 이러한 임의의 포함 또는 결실이 일어날 때, 본 명세서는 그 그룹을 첨부된 청구 범위에서 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 그룹에 대한 서면 설명(written description)을 충족시키도록 변화된 그룹으로 포함하는 것으로 간주한다.
임의의 양태의 일부 구현예에서, 본원에 기재된 본 개시 내용은 인간을 클로닝하기 위한 공정, 인간의 생식 계열의 유전적 동일성을 변형시키는 과정, 산업적 또는 상업적 목적을 위한 인간 배아의 사용, 또는 인간 또는 동물에게 어떠한 실질적인 의학적 이점도 없이 이들에게 고통을 유발할 가능성이 높은, 동물의 유전적 동일성을 변형시키기 위한 과정, 및 이러한 과정으로부터 생성된 동물과는 관련되지 않는다.
다른 용어는 본 발명의 다양한 양태의 설명에서 본원에 정의되어 있다.
II. 핵산
핵산은 크고, 고 전하를 띄며, 신속히 분해되고, 신체로부터 제거되며, 이들이 신체에 대해 외부체로 인식되어, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 표적이 되므로, 일반적으로 좋지 않은 약학적 특성을 제공한다. 이런 이유로, 연구 목적으로 사용된 특정 핵산, 예컨대 치료 핵산 또는 핵산(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터)은, 종종 생체 내에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 본 개시 내용은 이러한 면역 반응을 개선, 감소 또는 제거할 수 있고, 대상 수여자에서 감소된 면역-반응 상태에서 핵산 지속성을 최대화함으로써 발현 수준을 증가시켜 핵산의 효능을 향상시킬 수 있는 약학적 조성물 및 방법을 제공한다. 이것은 또한 유전자 치료 코스에서 장기 손상 또는 다른 독성으로 이어질 수 있는 임의의 잠재적인 유해 사례를 최소화할 수 있다. 본원에 제공된 많은 조성물 및 방법은, 핵산(예를 들어, 연구 목적으로 사용된 치료 핵산 또는 핵산)과 함께 특이적인 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 투여하는 것에 관한 것으로, 이로 인해 핵산의 존재에 의해 유발된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)이 감소된다.
면역원성/면역자극성 핵산은, 데옥시리보핵산과 리보핵산을 둘 다 포함할 수 있다. 데옥시리보핵산 (DNA)에 대하여, 특정 서열 또는 모티프는 포유류에서 면역 자극을 유도하는 것으로 나타났다. 이들 서열 또는 모티프는, CpG 모티프, 피리미딘-풍부 서열 및 회문(palindrome) 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 데옥시리보핵산 내의 CpG 모티프는, 종종 엔도좀의 toll-유사 수용체 9 (TLR-9)에 의해 인식되고, 그 다음에 선천성 면역 자극 경로와 후천성 면역 자극 경로를 둘 다 유발한다. 특정 면역자극성 리보핵산 (RNA) 서열은, toll-유사 수용체 6 및 7(TLR-6 및 TLR-7)에 결합하고, 면역 반응 (예를 들어, 선천적 면역 반응)을 통해 면역전(proimmune) 반응을 활성화하는 것으로 생각된다. 또한, 이중-가닥 RNA는 종종 TLR-3에 대한 이의 결합 때문에 면역자극성일 수 있다. 따라서, 병원체 유래이거나, 원래 치료제인 외부 핵산 분자는, 생체 내에서 고 면역원성을 가질 수 있다.
적절한 경우, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 길항제와 함께 잠재적인 치료 용도로서 사용되는 핵산 분자의 특징 및 개발이, 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 필요하다면, 생체 내 특성(전달, 안정성, 수명, 폴딩, 표적 특이성)을 변화 및 개선시킬 목적을 위한 올리고뉴클레오티드의 화학적 변형, 뿐만 아니라 치료적 응용과 직접 관련되는 이들의 생물학적 기능과 메커니즘이 기재된다.
면역자극성이고, 본원에 개시된 면역억제제의 사용을 요구할 수 있는, 본 개시 내용의 예시적인 치료 핵산은, 미니유전자, 플라스미드, 미니서클, 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 리보자임, 폐쇄 말단 이중 가닥ed DNA(예를 들어, ceDNA, CELiD, 선형 공유적으로 폐쇄된 DNA(“미니스트링”), doggybone(dbDNA™), 프로텔로미어(protelomere) 폐쇄 말단 DNA, 또는 덤벨 선형 DNA), 다이서-기질 dsRNA, 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭성 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNS(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, 및 DNA 바이러스 벡터, 바이러스 RNA 벡터, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
RNA 간섭(RNAi)으로 불리는 과정을 통해 특정 단백질의 세포내 수준을 하향 조절할 수 있는 siRNA 또는 miRNA가 또한 본 발명에서 핵산 치료제로 고려된다. siRNA 또는 miRNA가 숙주 세포의 세포질에 도입된 후, 이러한 이중가닥 RNA 제작물은 RISC로 불리는 단백질에 결합할 수 있다. siRNA 또는 miRNA의 센스 가닥은 RISC 복합체에 의해 제거된다. RISC 복합체는, 상보적 mRNA와 조합될 때, mRNA를 절단하고 절단된 가닥을 방출한다. RNAi는 mRNA의 특이적 파괴를 유도하여, 상응하는 단백질을 하향 조절한다.
단백질로의 mRNA 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)와 리보자임은, 핵산 치료제일 수 있다. 안티센스 제작물의 경우, 이러한 단일가닥 데옥시핵산은 표적 단백질 mRNA의 서열에 상보적인 서열, 및 mRNA에 결합할 수 있는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 갖는다. 이러한 결합은 표적 mRNA의 번역을 방지하고/하거나 mRNA 전사체의 RNaseH 분해를 촉발시킨다. 그 결과, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 작용의 특이성(즉, 특정 질환 관련 단백질의 하향 조절)이 증가했다.
본원에 제공된 임의의 방법에서, 치료용 핵산은 치료용 RNA일 수 있다. 치료 RNA는 mRNA 번역의 억제제, 간섭 RNA 제제(RNAi), 촉매 활성 RNA 분자(리보자임), 전달 RNA (tRNA) 또는 mRNA 전사체에 결합하는 RNA(ASO), 단백질 또는 다른 분자성 리간드(압타머)일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 방법에서, RNAi 작용제는 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 마이크로RNA, 짧은 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA 또는 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
일부 구현예에 의하면, 치료 핵산은 폐쇄 말단 이중 가닥 DNA, 예를 들어, ceDNA이다. 일부 구현예에 의하면, 세포에서 치료 단백질의 발현 및/또는 생산은, 비-바이러스성 DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA 벡터로부터 이루어진다. 전통적인 AAV 벡터 및 심지어 렌티바이러스 벡터에 대비된 치료 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 확실한 장점은, 원하는 단백질을 인코딩하는 이종 핵산 서열에 대한 크기 제한이 없다는 점이다. 따라서, 심지어 큰 치료 단백질조차도 단일 ceDNA 벡터로부터 발현될 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터는 치료 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에서 발현시키는데 사용될 수 있다.
일반적으로, 본원에 개시된 치료 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 5’에서 3’ 방향으로 이하의 것들을 포함한다: 제1 아데노-관련 바이러스(AAV) 역위 말단 반복부(ITR), 관심 대상인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 발현 카세트), 및 제2 AAV ITR. ITR 서열이 이하의 것들 중 어느 것으로부터 선택된다: (i) 적어도 하나 WT ITR과 적어도 하나의 변형된 AAV 역위 말단 반복부(변형된-ITR)(예를 들어, 비대칭적인 변형된 ITR); (ii) 변형된-ITR 쌍이 서로에 대해 상이한 3-차원 공간 구성을 갖는 2개의 변형된 ITR(예를 들어, 비대칭적인 변형된 ITR), 또는 (iii) 각각의 WT-ITR이 동일한 3-차원 공간 구성을 갖는, 대칭적인 또는 실질적으로 대칭적인 WT-WT ITR 쌍, 또는 (iv) 각각의 변형된-ITR이 동일한 3-차원 공간 구성을 갖는, 대칭적인 또는 실질적으로 대칭적인 변형된 ITR 쌍.
III. ceDNA 벡터
일부 양태에 의하면, 본 개시 내용은 라파마이신 또는 라파마이신 유사체와 함께 투여된 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA 벡터)를 제공한다. 일부 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 WO 2016/073799에 기재된 합성 나노담체 내에 과-포화량으로 존재한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 또한 동일한 나노담체 내에 존재한다.
일부 양태에 의하면, 본 개시 내용은 하나 이상의 TLR9 길항제와 함께 투여된, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA)를 제공한다. 또한, 부분적으로 하나 이상의 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 ceDNA 제작물이 본원에 제공된다.
일부 양태에 의하면, 본 개시 내용은 하나 이상의 cGAS 길항제와 함께 투여된, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA)를 제공한다. 또한, 부분적으로, 하나 이상의 cGAS 억제성 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 ceDNA 제작물도 본원에 제공된다.
일부 양태에 의하면, 본 개시 내용은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA(ceDNA) 벡터를 제공하는데, 이는 하나 이상의 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나 이상)와 함께 투여된다. 또한, 부분적으로, 하나 이상의 인플라마좀 길항제 (예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나 이상)을 인코딩하는 서열을 포함하는 ceDNA 제작물도 본원에 제공된다.
이해된 바와 같이, 본원에 기재된 ceDNA 벡터 기술은 임의의 수준의 복잡성에 적응할 수 있거나, 모듈식 경향으로 사용될 수 있는데, 여기에서 면역 반응 (예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제, 예컨대 본원에 기재된 것들의 상이한 요소들의 발현은, 독립적인 방식으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 특히 본원에서 고안된 ceDNA 벡터 기술이 단순히 단일 ceDNA 벡터를 사용하여 단일 이종 유전자 서열(예를 들어, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 단일 억제제, 예컨대 본원에 기재된 것들)을 발현시킬 수 있거나, 또는 복합적으로 다수의 ceDNA 벡터를 사용할 수 있다는 사실이 고려되는데, 여기에서 각각의 벡터는 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 다수의 억제제, 예컨대 본원에 기재된 것들, 또는 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 하나 이상의 억제제, 예컨대 본원에 기재된 것들을 인코딩하는 핵산 서열, 및 예를 들어 상이한 프로모터에 의해 각각 개별적으로 조절되는 보조-인자 또는 보조 단백질과 관련된 것들을 발현시킨다.
일 구현예에서, 단일 ceDNA 벡터는 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나 이상)의 단일 요소를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 단일 ceDNA 벡터는 다수의(예를 들어, 적어도 2개의) 요소들을 발현시키는데 사용될 수 있는데, 예를 들어, 이는 단일 프로모터(예를 들어, 강한 프로모터)의 조절 하에, 선택적으로 IRES 서열(들)을 사용하여, 2개 이상의 NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 및/또는 2개 이상의 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 및/또는 2개 이상의 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합을 발현하여, 각각의 요소, 예를 들어, 보조-인자 또는 보조 단백질의 적절한 발현을 보장한다.
또한, 다른 구현예에서는, 적어도 2개의 삽입체를 포함하는 단일 ceDNA 벡터가 본원에서 고려되는데, 여기에서 각 삽입체의 발현은 그 자체의 프로모터의 조절 하에 있다. 프로모터는 다수의 카피의 동일한 프로모터, 다수의 상이한 프로모터, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 당업계의 숙련자가 이해하는 바와 같이, 종종 다수의 인플라마좀 길항제를 상이한 발현 수준으로 발현하고, 이로 인해 발현된 개별 성분들의 화학 양론적 양을 조절하여, 세포에서 효율적인 발현, (단백질인 경우) 단백질 폴딩, 및 이들의 조합을 보장하는 것이 바람직하다.
일부 구현예에 의하면, 합성 ceDNA는 이중-가닥 DNA 분자로부터 절단(excision)을 통해 생산된다. ceDNA 벡터의 합성 생산은 2019년 1월 18일자 출원된 국제 출원 PCT/US19/14122의 실시예 2 내지 실시예 6에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 이중가닥 DNA 분자의 절제를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 하나의 예시적인 방법. 간략하게, ceDNA 벡터는 이중가닥 DNA 제작물을 사용하여 생성할 수 있다(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 7a 내지 도 8e 참조). 일부 구현예에서, 이중가닥 DNA 제작물은 ceDNA 플라스미드이다(예를 들어, 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/064242의 도 6 참조).
일부 구현예에서, ceDNA 벡터 제조용 제작물은 본원에 기재된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다.
다양한 올리고뉴클레오티드의 어셈블리를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 또 다른 예시적인 방법이, PCT/US19/14122의 실시예 3에 제공되어 있으며, 여기서 ceDNA 벡터는 5’ 올리고뉴클레오티드와 3’ ITR 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계, 및 ITR 올리고뉴클레오티드를 발현 카세트를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오티드에 결찰시키는 단계를 통해 생산된다. PCT/US19/14122의 도 11b는, 5’ ITR 올리고뉴클레오티드와 3’ ITR 올리고뉴클레오티드를 발현 카세트를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오티드에 결찰시키는 예시적인 방법을 보여준다.
합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 예시적인 방법은, PCT/US19/14122의 실시예 4에 제공되어 있는데, 2개의 센스 ITR를 포함하는 단일-가닥 선형 DNA를 사용하며, 상기 2개의 센스 ITR은 센스 발현 카세트 서열에 측접하고, 안티센스 발현 카세트에 측접하는 2개의 안티센스 ITR에 공유적으로 부착되며, 상기 단일 가닥 선형 DNA의 말단들은 이후 결찰되어 폐쇄-말단 단일-가닥 분자를 형성한다. 하나의 비제한적인 예는, 단일가닥 DNA 분자를 합성 및/또는 생산하는 단계, 분자의 일부를 어닐링하여 하나 이상의 2차 구조 염기쌍 영역을 갖는 단일 선형 DNA 분자를 형성하는 단계, 및 유리된 5’ 및 3’ 말단을 서로 결찰시켜 폐쇄형 단일가닥 분자를 형성하는 단계를 포함한다.
당업계의 숙련자는 ceDNA 벡터 기술의 추가적인 변형을 구상할 수 있거나, 이를 종래의 벡터를 사용하는 단백질 생산 방법으로부터 조정할 수 있다.
비-바이러스성 캡시드 불포함 DNA 벡터는, 허용성 숙주 세포 내에서 발현 제작물(예를 들어, 플라스미드, 박미드, 바큘로바이러스, 또는 통합된 세포주)(예를 들어, 2018년 9월 7일자 제출된 국제 특허 출원 PCT/US18/49996에 개시된 실시예 참고)로부터 생산되거나, 또는 합성 생산(예를 들어, 2018년 12월 6일자 제출된 국제 특허 출원 PCT/US19/14122에 개시된 실시예 참고)을 사용하여 생산될 수 있고, 상기 문헌 각각은 본원에 전문이 참조로서 인용된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 유용한 ceDNA 벡터는, 이종 핵산, 예를 들어 2개의 역위 말단 반복부(ITR) 서열들 사이에 위치한 전이유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, ITR들 중 적어도 하나는 야생형 ITR 서열(예를 들어 AAV ITR)에 비해 결실, 삽입, 및/또는 치환에 의해 변형되며; ITR들 중 적어도 하나는 기능성 말단 분해 부위(TRS)와 Rep 결합 부위를 포함한다. 일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 상응하는 AAV ITR(예를 들어, 야생형 AAV2에 대해서는 서열번호: 1, 또는 서열번호: 51)에 비해 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 결실, 삽입, 또는 치환을 가져서, Rep 단백질의 존재 하에 숙주 세포 내에서 DNA 벡터의 복제를 유도한다. 상기 논의된 바와 같이, 임의의 ITR가 사용될 수 있다. 예를 들어, 표 1A에서 ceDNA 제작물 내의 ITR들은 변형된 ITR 및 WT ITR이다. 그러나, 2개의 역위 말단 반복부(ITR) 서열들 사이에 위치한 이종 핵산 서열(예를 들어, 전이유전자)을 함유하는 ceDNA 벡터가 본원에 포함되는데, 여기에서 ITR 서열들은 비대칭적인 ITR 쌍이거나, 대칭적인- 또는 실질적으로 대칭적인 ITR 쌍일 수 있으며, 이들 용어는 본원에 정의된 바와 같다. 본원에 개시된 NLS를 포함하는 ceDNA 벡터는, 이하의 것들 중 어느 것으로부터 선택된 ITR 서열을 포함할 수 있고: (i) 적어도 하나의 WT ITR 및 적어도 하나의 변형된 AAV 역위 말단 반복부(변형된-ITR) (예를 들어, 비대칭적인 변형된 ITR); (ii) 변형된-ITR 쌍이 서로에 대해 상이한 3-차원 공간 구성을 갖는, 2개의 변형된 ITR (예를 들어, 비대칭적인 변형된 ITR), 또는 (iii) 각각의 WT-ITR이 동일한 3-차원 공간 구성을 갖는, 대칭적인 또는 실질적으로 대칭적인 WT-WT ITR 쌍, 또는 (iv) 각각의 변형된-ITR이 동일한 3-차원 공간 구성을 갖는, 대칭적인 또는 실질적으로 대칭적인 변형된 ITR 쌍, 여기에서 본 개시 내용의 방법은 예컨대 리포좀 나노입자 전달 시스템에 제한되지 않는 전달 시스템을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 2018년 9월 7일자 제출된 국제 특허 출원 PCT/US18/49996 에 개시된 바와 같은 비대칭성 ITR를 포함하는 ceDNA 벡터(예를 들어, 실시예 1 내지 4 참고); 2018년 12월 6일자 제출된 국제 특허 출원 PCT/US18/64242(예를 들어, 실시예 1 내지 7 참고)에 개시된 바와 같은 유전자 편집을 위한 ceDNA 벡터, 또는 2019년 2월 14일자 제출된 국제 특허 출원 PCT/US19/18016에 개시된 바와 같은 항체 또는 융합 단백질의 생산을 위한 ceDNA 벡터(예를 들어, 실시예 1 내지 4 참고), 또는 2019년 2월 22일자 제출된 국제 특허 출원 PCT/US19/18927에 개시된 바와 같은 조절된 전이유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 ceDNA 벡터와 함께 공동 투여하기 위한 본원에 개시된 면역 반응 (예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 사용과 관련되며, 상기 문헌 각각은 본원에 전문이 참조로서 인용된다. 일부 구현예에서는, 또한 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 사용하는 본원에 기재된 방법 및 조성물을, 합성에 의해 생산된 ceDNA 벡터, 예를 들어, 본원에 전문이 참조로서 인용된 2019년 1월 18일자 제출된 국제 출원 PCT/US19/14122에 개시된 바와 같은 무세포 또는 곤충-불포함 시스템의 ceDNA 생산에서 제조된 ceDNA 벡터와 함께 사용할 수 있는 경우도 구상된다.
ceDNA 벡터는 바람직하게는 이중체이거나, 분자, 예를 들어 전이유전자의 적어도 일부에 대해 자가-상보성을 갖는다. ceDNA 벡터는 공유적으로 폐쇄된 말단을 가지므로, 바람직하게는 1시간 동안 37℃에서 엑소뉴클레아제 절단(예를 들어, Exo I 또는 Exo III)에 대한 저항성을 갖는다. 숙주 세포(예를 들어, 곤충 세포 또는 포유류 세포) 내의 Rep 단백질의 존재는, 공유적으로 폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드 불포함 DNA 벡터의 생산을 유도하는 변형된 ITR을 갖는 ceDNA 벡터 폴리뉴클레오티드 템플레이트의 복제를 촉진시킨다. 공유결합에 의한 폐쇄 말단을 갖는 분자는, 복제를 통해 허용성 세포 내에 계속하여 축적되고, 바람직하게는 표준 복제 조건 하의 Rep 단백질의 존재 하에서 시간이 경과함에 따라 충분히 안정되어, 예를 들어 적어도 1 pg/세포, 바람직하게는 적어도 2 pg/세포, 바람직하게는 적어도 3 pg/세포, 더욱 바람직하게는 적어도 4 pg/세포, 더욱 더 바람직하게는 적어도 5 pg/세포의 수율로 축적된다.
특히, 일 구현예에서, DNA 벡터는 2개의 상이한 ITR(예를 들어, AAV ITR)과 상기 ITR들의 사이에 위치한 관심 대상 뉴클레오티드 서열(이종 핵산, 발현 카세트)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터 템플레이트(예를 들어, 발현 제작물)를 보유하는 세포(예를 들어, 곤충 세포 또는 포유류 세포, 예를 들어 293 세포 등)를 제공함으로써 생산되는데, 여기에서 ITR들 중 적어도 하나는 다른 하나의 ITR에 비해 삽입, 치환, 또는 결실을 포함하는 변형된 ITR이다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 벡터 템플레이트는 Rep-결합 부위(RBS; 예를 들어 5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’ for AAV2) 및 기능성 말단 분해 부위(TRS; 예를 들어 5’-AGTT)를 포함하는 적어도 하나의 기능성 ITR을 함유한다. 상기 세포는 바이러스 캡시드 단백질을 발현하지 않고, 폴리뉴클레오티드 벡터 템플레이트는 바이러스 캡시드 코딩 서열이 결핍되어 있다.
Rep의 존재 하에서, 적어도 하나의 변형된 ITR을 갖는 벡터 폴리뉴클레오티드 템플레이트는, 복제되어 ceDNA 벡터를 생산한다. ceDNA 벡터 생산은 2단계로 실시된다: 먼저, Rep 단백질을 통한 벡터 골격으로부터의 템플레이트(예를 들어, 플라스미드, 박미드, 게놈 등)의 절단(“탈출”), 및 두번째, 상기 절단된 벡터 게놈의 Rep 매개 복제. 다양한 AAV 혈청형의 Rep 단백질 및 Rep 결합 부위는, 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 당업계의 숙련자는 기능성 ITR에 결합하여 이를 복제하는 혈청형으로부터의 Rep 단백질을 선택하는 것을 이해한다.
벡터 폴리뉴클레오티드를 보유하는 세포는, 이미 Rep를 함유하거나(예를 들어, 유도성 rep를 갖는 세포주), 또는 Rep를 함유하는 벡터에 의해 형질도입된 후 ceDNA 벡터의 복제 및 방출을 허용하는 조건 하에서 성장한다. 이후, ceDNA 벡터 DNA를 수확하여, 세포로부터 단리한다. 캡시드-불포함, 비-바이러스성 DNA ceDNA 벡터의 존재는, 세포로부터 단리된 벡터 DNA를 DNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소에 의해 절단시키고, 절단된 DNA 물질을 비-변성 겔에서 분석하여, 선형의 불연속 DNA에 비해 선형의 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 도 6은 실시예에 기재된 이들 벡터를 생산하는 일 구현예를 사용하여, 다수의 TTX 플라스미드 제작물로부터의 ceDNA 벡터의 생산을 확인하는 겔이다. ceDNA 벡터는 도 4D에 대해 논의한 바와 같이, 겔에서 특징적인 밴드 패턴에 의해 확인된다. 도 5A 및 도 5B는 본원에서 가공에 의해 생산된 폐쇄 말단 ceDNA 벡터의 존재를 확인하기 위한 일 구현예를 나타내는 도면이다.
벡터 폴리뉴클레오티드 발현 템플레이트 (예를 들어 TTX-플라스미드, 박미드 등), 및/또는 ii) Rep를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 형질감염을 포함하나, 이에 제한되지 않는 당업계의 숙련자들에게 잘 알려진 임의의 수단(예를 들어 인산칼슘, 나노입자, 또는 리포좀), 또는 바이러스 벡터, 예를 들어 HSV 또는 바큘로바이러스에 의한 도입을 사용하여, 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ceDNA 벡터를 생성하는데 사용된 벡터 폴리뉴클레오티드 발현 제작물의 템플레이트는, 플라스미드(예를 들어, TTX-플라스미드, 예컨대 도 4b를 참고하라), 박미드(예를 들어, TTX-박미드), 및/또는 바큘로바이러스(예를 들어, TTX- 바큘로바이러스)일 수 있다. 일 구현예에서, TTX-플라스미드는 ITR들의 사이에 작용 가능하게 위치한 제한 클로닝 부위(예를 들어, 서열번호: 7)을 포함하며, 여기에 이종 핵산(예를 들어, 리포터 유전자 또는 치료 핵산을 포함하는 발현 카세트)이 삽입될 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 제조하는데 사용된 숙주 세포는 곤충 세포이다. 다른 바람직한 구현예에서, 바큘로바이러스는 Rep 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와, ceDNA 벡터에 대한 비-바이러스성 DNA 벡터 폴리뉴클레오티드 발현 제작물을 모두 전달하는데 사용된다. ceDNA 벡터를 얻고 이를 단리하기 위한 이러한 공정의 예는, 도 1 내지 33에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 비-바이러스 DNA 벡터의 생산에 사용하기 위해, 본원에 기재된 DNA 벡터 뉴클레오티드 발현 템플레이트(ceDNA 벡터 템플레이트)가 자신의 게놈에 안전하게 통합된 숙주 세포를 제공한다. 이러한 세포주의 생산 방법은, 전문이 본원에 참조로서 인용된 문헌[Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879]에 기재되어 있다. 바람직하게는, (예를 들어, 실시예 1에 기재된) Rep 단백질은, MOI가 3이 되도록 숙주 세포에 첨가된다. 일 구현예에서, 숙주 세포주는 무척추동물 세포주, 바람직하게는 곤충 Sf9 세포이다. 숙주 세포가 포유동물 세포주, 바람직하게는 293 세포인 경우, 그 세포주는 안정하게 통합된 폴리뉴클레오티드 벡터 템플레이트를 가질 수 있고, 제2 벡터, 예컨대 헤르페스바이러스는 Rep 단백질을 세포로 도입시키는데 사용되어, Rep의 존재 하에서 ceDNA 벡터를 절제 및 증폭시킬 수 있다.
바람직하게는, ceDNA는 Rep-결합 부위(RBS; AAV2에 대하여 5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’, 서열번호: 39)와 말단 분해 부위(TRS; 5’-AGTT)를 포함하는, 하나 이상의 기능성 ITR 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다.
캡시드-불포함 ceDNA 벡터는, 시스-조절 요소, 예컨대 WHP 전사-후 조절 요소(WPRE)와 BGH 폴리A의 특정 조합을 추가로 포함하는 발현 제작물(예를 들어, TTX-플라스미드, TTX-박미드, TTX-바큘로바이러스)로부터 생산될 수 있다. 발현 제작물에 사용하기에 적합한 발현 카세트는 바이러스 캡시드에 의해 부과된 패키징 제약에 의해 제한되지 않는다. 본 개시 내용의 발현 카세트는 전체 발현 수준, 뿐만 아니라 세포-특이성에도 영향을 줄 수 있는 프로모터를 포함한다. 전이유전자 발현을 위해, 이는 고도로 활성인 바이러스 유래의 극초기 프로모터를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 조직-특이적인 진핵 프로모터를 함유하여, 전이 유전자의 발현을 특정 세포 타입에 국한시키고, 조절되지 않은 전위성(ectopic) 발현으로부터 발생하는 독성 효과와 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 합성 조절 요소, 예컨대 CAG 프로모터(서열번호: 3)을 함유할 수 있다. CAG 프로모터는, (i) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소(예를 들어, 서열번호: 309), (ii) 프로모터, 닭의 베타-글로빈 유전자의 제1 엑손과 제1 인트론, 및 (iii) 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체(acceptor)를 포함한다. 대안적으로, 예를 들어 발현 카세트는 알파-1-항트립신(AAT) 프로모터(예를 들어, 서열번호: 4), 간 특이적인(LP1) 프로모터(예를 들어, 서열번호: 5), 또는 HAAT 프로모터(예를 들어, 서열번호: 135) 또는 인간 신장 인자-1 알파(EF1-α) 프로모터(서열번호: 6) 또는 EF1-α 절편(서열번호: 66), 또는 MND 프로모터(서열번호: 70)를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 하나 이상의 항시적인 프로모터, 예를 들어, (선택적으로, RSV 인핸서를 갖는) 레트로바이러스성 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, (선택적으로, CMV 인핸서를 갖는) 사이토메갈로바이러스(CMV) 극초기 프로모터 등을 포함한다. 대안적으로, 유도성 프로모터, 전이유전자에 대한 천연 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 당업계에 공지된 다양한 프로모터가 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 유전자 코딩 서열에 대한 내인성 또는 자연적 프로모터가, 발현 카세트에 사용된다.
ceDNA 벡터를 사용하는 유도성 유전자 편집은, 예들 들어, 문헌[Dow 등 Nat Biotechnol 33:390-394 (2015)]; 문헌[Zetsche et al. Nat Biotechnol 33:139-42 (2015)]; 문헌[Davis 등 Nat Chem Biol 11:316-318 (2015)]; 문헌[Polstein 등 Nat Chem Biol 11:198-200 (2015)]; 및/또는 문헌[Kawano 등 Nat Commun 6:6256 (2015)]에 기재된 방법을 사용하여 실시될 수 있고, 상기 문헌 각각의 내용은 본원에 전문이 참조로서 인용된다. 발현 카세트는 또한 전사-후 요소, 특히 우드척 간염 바이러스(WHP: Woodchuck Hepatitis Virus)의 전사-후 조절 요소(WPRE: Woodchuck Hepatitis Virus (WHP) posttranscriptional regulatory element)(서열번호: 72)를 포함하여, 전이 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 다른 전사 후 가공 요소, 예컨대 헤르페스 단순 바이러스 또는 B형 간염 바이러스(HBV)의 티미딘 키나제 유전자로부터의 전사-후 요소도 사용될 수 있다. 발현 카세트는 당업계에 알려진 폴리-아데닐화 서열 또는 이의 변형체, 예컨대 소의 BGHpA 또는 바이러스 SV40pA (예를 들어, 서열번호: 10)로부터 단리된 자연발생적 서열, 또는 합성 서열을 포함할 수 있다. 일부 발현 카세트는 또한 SV40 후기 폴리A 신호 업스트림 인핸서(USE) 서열을 포함할 수 있다. USE는 SV40pA 또는 이종 폴리-A 신호와 조합하여 사용될 수 있다.
세포로부터 본원에 기재된 DNA 벡터를 수확하고 수집하는 시간은, DNA 벡터의 고-수율 생산을 달성하도록 선택 및 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수확 시간은 세포 생존능, 세포 형태, 세포 성장 등의 관점에서 선택될 수 있다. 통상, 세포는 바큘로바이러스 감염 이후 DNA-벡터(예를 들어, TTX-벡터)를 생성하기 위한 충분한 시간 후에, 그러나 대부분의 세포가 바이러스 독성 때문에 사멸되기 시작하기 전에 수확될 수 있다. DNA-벡터는 예를 들어 플라스미드 정제 키트, 예컨대 Qiagen Endo-Free™ 플라스미드 키트를 사용하여 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법도, 또한 DNA-벡터에 대해 조정될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 알려진 임의의 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.
조절 서열 및 이펙터
구현예에서, ceDNA 벡터는 치료 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 외에, 제2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 조절 서열)을 포함한다. 구현예에서, 유전자 조절 서열은 치료 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작용 가능하게 연결된다. 구현예에서, 조절 서열은 숙주 세포 내에서 치료 단백질의 발현을 조절하는데 적합하다. 구현예에서, 조절 서열은 적합한 프로모터 서열을 포함하여, 프로모터 서열에 작용 가능하게 연결된 유전자, 예컨대 본 개시 내용의 치료 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 유도할 수 있다. 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 치료 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5’ 말단에 연결된 인트론 서열을 포함한다. 구현예에서, 인핸서 서열은 프로모터의 업스트림에 제공되어, 프로모터의 효능을 증가시킨다. 구현예에서, 조절 서열은 인핸서 및 프로모터를 포함하는데, 여기에서 제2 뉴클레오티드 서열은 치료 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 업스트림에 인트론 서열을 포함하고, 상기 인트론은 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위(들)를 포함하고, 상기 프로모터는 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작용 가능하게 연결된다. 구현예에서, 사용된 조절 서열은 벡터 내의 코딩 서열을 경험한 적 없다.
프로모터: 상기 기재된 것들을 포함하는 적합한 프로모터는, 바이러스에서 유도될 수 있고, 따라서 바이러스 프로모터로 지칭될 수 있거나, 원핵생물 또는 진핵생물 유기체를 포함하는 임의의 유기체에서 유도될 수 있다. 적합한 프로모터는 임의의 RNA 폴리머라아제(예를 들어, pol I, pol II, pol III)에 의한 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 프로모터는, SV40 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (Ad MLP); 헤르페스 단순포진 바이러스(HSV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 극초기 프로모터 영역(CMVIE), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 인간 U6 작은 핵 프로모터(U6, 예를 들어, 서열번호: 18 (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), 개선된 U6 프로모터(예를 들어, 문헌[Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31(17)]), 인간 H1 프로모터(H1)(예를 들어, 서열번호: 19), CAG 프로모터, 인간 알파 1-항트립신(HAAT) 프로모터 (예를 들어, 서열번호: 135) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구현예에서, 이러한 프로모터는 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위를 포함하도록 이의 다운스트림 인트론 함유 말단에서 변경된다. 구현예에서, 뉴클레아제 절단 부위(들)을 함유하는 DNA는 프로모터 DNA에 대해 이질적이다.
프로모터는 발현을 추가로 향상시키고/거나, 이의 공간적 발현 및/또는 임시 발현을 변화시키기 위해 하나 이상의 특이적인 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 전사 시작 부위에서 수천 개 염기쌍 만큼 위치할 수 있는 원위 인핸서 또는 억제제 요소를 포함할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 공급원에서 유도될 수 있다. 프로모터는 유전자 구성요소의 발현을 구성적으로, 또는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 대해, 발현이 일어나는 발달 단계에 대해, 또는 생리학적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제와 같은 외부 자극에 반응하여 차별적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예에는, 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 작동자 프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터뿐 아니라, 하기에 열거된 프로모터가 포함된다. 이러한 프로모터 및/또는 인핸서는 임의의 관심 유전자(예를 들어, 유전자 편집 분자, 공여체 서열, 치료용 단백질 등)의 발현에 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 치료용 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 치료용 단백질 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는, 원숭이바이러스 40(SV40)으로부터의 프로모터, 마우스 유선종양바이러스(MMTV) 프로모터, 소 면역결핍바이러스(BIV) 긴말단반복(LTR) 프로모터와 같은 인간 면역결핍바이러스(HIV) 프로모터, 몰로니(Moloney) 바이러스 프로모터, 조류백혈병바이러스(ALV) 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 극초기 프로모터와 같은 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 엡스타인바(Epstein Barr) 바이러스(EBV) 프로모터, 또는 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 인간 유비퀴틴 C(hUbC), 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자 유래의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 조직 특이적 프로모터, 예컨대 천연 또는 합성의 인간 알파 1-항트립신(HAAT)과 같은 간 특이적 프로모터일 수 있다. 하나의 구현예에서, 간으로의 전달은, 간세포 표면에 존재하는 저밀도 지질단백질(LDL) 수용체를 통해, 간세포에 대한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 내인성 ApoE 특이적 표적화를 사용하여 달성될 수 있다.
하나의 구현예에서, 사용된 프로모터는 치료용 단백질을 인코딩하는 유전자의 천연 프로모터이다. 치료용 단백질을 인코딩하는 각각의 유전자에 대한 프로모터 및 다른 조절 서열은 공지되어 있고, 특성화되어 있다. 사용된 프로모터 영역은, 하나 이상의 추가적인 조절 서열(예를 들어, 자연적인 서열), 예컨대 인핸서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 적합한 프로모터의 비-제한적인 예는, 예를 들어(서열번호: 3)의 CAG 프로모터, HAAT 프로모터(서열번호: 135), 인간 EF1-α 프로모터(서열번호: 6) 또는 EF1-α 프로모터(서열번호: 66)의 절편, 및 래트 EF1-α 프로모터(서열번호: 310)를 포함한다.
인핸서: 일부 구현예에서, 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로 중 하나 이상의 억제제, 또는 카스파제 1 억제제)를 발현시키는 ceDNA는, 하나 이상의 인핸서를 포함한다. 일부 구현예에서, 인핸서 서열은 프로모터 서열의 5’에 위치한다. 일부 구현예에서, 인핸서 서열은 프로모터 서열의 3’에 위치한다. 예시적인 인핸서는 본원에서 표 1에 나열되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
5’ UTR 서열 및 인트론 서열: 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 5’ UTR 서열 및/또는 5’ UTR의 3’에 위치한 인트론 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5’ UTR은 전이 유전자, 예를 들어 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로 중 하나 이상의 억제제, 또는 카스파제 1 억제제)를 인코딩하는 서열의 5’에 위치한다. 예시적인 5’ UTR은 표 2A에 나열되어 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
3’ UTR 서열: 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 3’ ITR 서열의 5’에 위치하는 3’ UTR 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3’ UTR은 전이 유전자, 예를 들어 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로 중 하나 이상의 억제제, 또는 카스파제 1 억제제)를 인코딩하는 서열의 3’에 위치한다. 예시적인 3’ UTR 서열은 표 2B에 나타나 있다.
Figure pct00006
Figure pct00007
폴리아데닐화 서열: 폴리아데닐화 서열을 인코딩하는 서열은, 본원에 기재된 면역반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터 내에 포함되어, ceDNA 벡터로부터 발현된 mRNA를 안정화시키고, 핵 유출과 번역을 도울 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 인플라마좀 길항제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개 또는 그 이상의 아데닌 디뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 서열은 약 43개의 뉴클레오티드, 약 40 내지 50개의 뉴클레오티드, 약 40개 내지 55개의 뉴클레오티드, 약 45개 내지 50개의 뉴클레오티드, 약 35개 내지 50개의 뉴클레오티드, 또는 상기 개시된 범위 사이의 임의의 범위의 뉴클레오티드를 포함한다.
발현 카세트는 당업계에 알려진 임의의 폴리-아데닐화 서열, 또는 이의 변형체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리-아데닐화(폴리A) 서열은 표 3에 나열된 임의의 것들로부터 선택된다. 통상 당업계에 알려진 다른 폴리A 서열도 또한 사용될 수 있는데, 이는 예를 들어 소의 BGHpA(예를 들어, 서열번호: 9) 또는 바이러스 SV40pA(예를 들어, 서열번호: 10)로부터 단리된 자연 발생적인 서열, 또는 합성 서열도 포함할 수 있다. 일부 발현 카세트는 또한 SV40 후기 폴리A 신호 업스트림 인핸서(USE) 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, USE 서열은 SV40pA 또는 이종 폴리A-신호와 조합하여 사용될 수 있다. 폴리A 서열은 인플라마좀 길항제를 인코딩하는 전이유전자의 3’에 위치한다.
발현 카세트는 또한 전이유전자의 발현을 증가시키기 위해 전사 후 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 우드척 간염바이러스(WHP: Woodchuck Hepatitis Virus) 전사 후 조절 요소(WPRE)(예를 들어, 서열번호: 72)가 전이유전자의 발현을 증가시키기 위해 사용된다. 단순헤르페스바이러스의 티미딘 키나제 유전자, 또는 B형 간염 바이러스(HBV)로부터의 전사 후 요소와 같은 다른 전사 후 처리 요소가 사용될 수 있다. 분비 서열은 전이유전자, 예를 들어 VH-02 및 VK-A26 서열, 예를 들어 서열번호: 950 및 서열번호: 951에 연결될 수 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
일 구현예에서, 벡터 폴리뉴클레오티드(ceDNA 벡터)는 서열번호: 1과 서열번호: 52; 및 서열번호: 2와 서열번호: 51로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 상이한 ITR의 쌍을 포함한다. 이러한 각각의 양태의 일 구현예에서, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 벡터 폴리뉴클레오티드 또는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터는, 서열번호: 101과 서열번호: 102; 서열번호: 103 과 서열번호:104, 서열번호: 105와 서열번호: 106; 서열번호: 107 과 서열번호: 108; 서열번호: 109와 서열번호: 110; 서열번호: 111과 서열번호: 112; 서열번호: 113과 서열번호: 114; 및 서열번호: 115와 서열번호: 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 한 쌍의 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 서열번호: 500 내지 529로부터 선택된 임의의 서열을 포함하는 ITR을 갖지 않는다.
세포로부터 본원에 기재된 DNA 벡터를 수확 및 수집하기 위한 시간은, ceDNA 벡터의 고-수율 생산을 달성하도록 선택 및 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존력, 세포 형태, 세포 성장 등의 관점에서 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 바큘로바이러스가 감염된 후, 그러나 대부분의 세포가 바이러스 독성 때문에 사멸되기 전에, DNA-벡터(예를 들어, TTX-벡터)를 생산하기에 충분한 조건 하에서 성장하고, DNA-벡터(예를 들어, TTX-벡터)를 생산하기에 충분한 시점에 수확된다. DNA-벡터는 플라스미드 정제 키트, 예컨대 Qiagen Endo- Free 플라스미드 키트를 사용하여 단리될 수 있다. 플라스미드 분리 위해 개발된 다른 방법들은, 또한 DNA-벡터에 맞게 조정될 수도 있다. 일반적으로, 임의의 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.
DNA 벡터는 DNA의 정제에 대해 당업자에게 공지된 임의의 수단을 통해 정제될 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로 정제된다. 또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 마이크로입자로 정제된다.
일 구현예에서, 캡시드 불포함 비-바이러스 DNA 벡터는 이하의 제1 아데노-관련 바이러스(AAV) 역위 말단 반복부(ITR), 관심 대상인 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외인성 DNA의 발현 카세트) 및 변형된 AAV ITR을 이 순서로 포함하는 폴리뉴클레오티드 템플레이트를 포함하는 플라스미드를 포함하거나, 또는 이로부터 얻어지는데, 상기 템플레이트 핵산 분자는 AAV 캡시드 단백질 코딩이 결핍되어 있다. 추가적 구현예에서, 본 발명의 핵산 템플레이트는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 결핍되어 있다(즉, 이는AAV 캡시드 유전자가 결핍되어 있으나, 또한 다른 바이러스의 캡시드 유전자도 결핍되어 있다). 또한, 특정 구현예에서, 템플레이트 핵산 분자는 또한 AAV Rep 단백질 코딩 서열도 결핍되어 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 기능성 AAV cap와 AAV rep 유전자 모두가 결핍되어 있다.
일 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원에 개시된 야생형 AAV2 ITR에 대해 돌연변이화되었으나, 작용 가능한 RBE, trs 및 RBE´ 영역을 보유하는 ITR 구조를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 서열번호: 500 내지 529로부터 선택된 임의의 서열을 포함하는 ITR을 갖지 않는다.
일부 구현예에서, 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나 이상)을 인코딩하는 전이유전자는, 또한 분비 서열도 인코딩할 수 있어서, 인플라마좀 길항제는 골지체 및 소포체로 유도되고, 여기에서 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나 이상)는, ER을 통과하여 세포 밖으로 나갈 때, 샤페론 분자에 의해 정확한 형태로 폴딩될 것이다. 예시적인 분비 서열은, VH-02(서열번호: 950) 및 VK-A26(서열번호: 951) 및 Igĸ 신호 서열, 뿐만 아니라 표지된 단백질을 사이토졸 밖으로 분비시키는 Gluc 분비 신호, 표지된 단백질을 골지체로 유도하는 TMD-ST 분비 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
핵 국재화 서열: 일부 구현예에서, 예를 들어 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 하나 이상의 핵 국재화 서열 (NLS), 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 NLS을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 NLS는 아미노-말단 또는 그 근처, 카르복시-말단 또는 그 근처, 또는 이들의 조합(예를 들어, 아미노-말단의 하나 이상의 NLS 및/또는 카르복시 말단의 하나 이상의 NLS)에 위치한다. 하나 초과의 NLS가 존재하는 경우, 각각은 서로 독립적으로 선택될 수 있어서, 단일 NLS는 하나 초과의 카피로 존재하고/거나, 하나 이상의 카피에 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 함께 존재한다. NLS의 비-제한적인 예는, 표 4에 나타나 있다.
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조절 스위치: 분자 조절 스위치는 신호에 반응하여 측정 가능한 상태 변화를 생성하는 스위치이다. 조절 스위치는 또한 본원에 기재된 바와 같이 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 미세 조정하는데 사용될 수 있어서, 면역 반응의 억제제는 원할 때(면역 반응의 억제제를 원하는 발현 수준 또는 양으로 발현시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않음), 또는 대안적으로, 세포 신호 전달 사례를 포함하는 특정 신호가 존재하거나 부재할 때 발현된다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, ceDNA 벡터로부터의 면역 반응의 억제제의 발현은 특정 조건이 발생하면 켜지거나, 꺼질 수 있다. 일부 구현예에서, 스위치는 ceDNA 벡터에서 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 조절 및 제어가능한 경향으로 개시 또는 중단(즉, 셧 다운(shut down))시키도록 고안된 “개폐(ON/OFF)” 스위치이다. 일부 구현예에서, 상기 스위치는 스위치가 활성화되면 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 세포의 프로그래밍된 사멸을 거치도록 지시할 수 있는 “사멸 스위치”를 포함할 수 있다. 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포함된 예시적인 조절 스위치는, 전이유전자의 발현을 조절하는데 사용될 수 있고, 본원에 전문이 참조로서 인용된 국제 출원 PCT/US18/49996에서 더욱 상세히 논의되어 있다
(i) 바이너리 조절 스위치
일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 인플라마좀 길항제의 발현을 조절 가능하게 조작하는 역할을 할 수 있는 조절 스위치를 포함한다. 예를 들어, ceDNA 벡터의 ITR들 사이에 위치한 발현 카세트는 조절 부위, 예를 들어, 프로모터, 시스-요소, 억제제, 인핸서 등을 추가로 포함할 수 있는데, 이는 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 인코딩하는 핵산 서열에 작용 가능하게 연결되며, 여기에서 상기 조절 부위는 하나 이상의 보조 인자 또는 외인성 제제에 의해 조절된다. 단지 예로서, 조절 영역은 소분자 스위치, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 비제한적인 예는, 호르몬 유도성 또는 금속 유도성 프로모터이다. 다른 예시적인 유도성 프로모터/인핸서 요소에는, 비제한적으로, RU486-유도성 프로모터, 엑디손-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터가 포함된다.
(ii) 소분자 조절 스위치
선행 기술에서 알려진 다양한 소-분자 기반의 조절 스위치가 당업계에 알려져 있는데, 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제와 조합하여, 조절-스위치 제어된 ceDNA 벡터를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는, 문헌[Taylor, et al. BMC Biotechnology 10 (2010): 15]에 개시된 바와 같은 작동적으로 연결된 전이유전자의 발현을 제어하는 인공 프로모터와 함께, 직교 리간드/핵 수용체 쌍, 예를 들어 레티노이드 수용체 변이체/LG335 및 GRQCIMFI; 조작된 스테로이드 수용체, 예를 들어 프로게스테론에 결합할 수 없지만 RU486(미페프리스톤(mifepristone))에 결합하는 C-말단 절단을 갖는 변형된 프로게스테론 수용체(미국 특허 제5,364,791호); 초파리의 엑디손 수용체 및 이의 엑디스테로이드 리간드(문헌[Saez, et al., PNAS, 97(26)(2000), 14512-14517]); 또는 문헌[Sando R 3rd; Nat Methods. 2013, 10(11):1085-8]에 개시된 바와 같은 항생제 트리메토프림(TMP: trimethoprim)에 의해 제어되는 스위치 중 어느 하나 또는 이들의 조합에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이유전자를 제어하거나 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 조절 스위치는, 미국 특허 제8,771,679호 및 제6,339,070호에 개시된 것들과 같은 전구약물 활성화 스위치이다.
(iii) “패스코드” 조절 스위치
일부 구현예에서, 조절 스위치는 “패스코드 스위치” 또는 “패스코드 회로”일 수 있다. 패스코드 스위치는, 특정 조건이 발생하는 경우에 ceDNA 벡터로부터의 전이유전자 발현 제어를 미세 조정하는 것을 가능하게 하며, 즉, 전이유전자 발현 및/또는 억제가 일어나기 위해서는 조건의 조합이 존재해야 한다. 예를 들어, 전이유전자의 발현이 일어나기 위해서는, 적어도 조건 A 및 B가 발생해야 한다. 패스코드 조절 스위치는, 전이유전자의 발현이 일어나기 위해 존재하는 임의의 수의 조건, 예를 들어 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 그 이상의 조건일 수 있다. 일부 구현예에서는, 적어도 2개의 조건(예를 들어, 조건 A, B)이 발생해야 하고, 일부 구현예에서는, 적어도 3개의 조건(예를 들어, A, B 및 C, 또는 A, B 및 D)이 발생해야 한다. 단지 예로서, 패스코드 “ABC” 조절 스위치를 갖는 ceDNA에서 유전자 발현이 일어나기 위해서는, 조건 A, B 및 C가 존재해야 한다. 조건 A, B 및 C는 다음과 같을 수 있다: 조건 A는 병태 또는 질환의 존재이고, 조건 B는 호르몬 반응이고, 조건 C는 전이유전자 발현에 대한 반응이다. 예를 들어, 전이유전자가 결함있는 EPO 유전자를 편집하는 경우, 조건 A는 만성 신장 질환(CKD)의 존재이고, 조건 B는 대상체가 신장 내 저산소 조건을 갖는 경우에 발생하며, 조건 C는 신장 내 에리트로오이에틴-생산 세포(EPC)의 소환이 손상되거나; 대안적으로 HIF-2 활성화가 손상된 것이다. 일단 산소 수준이 증가하거나, 원하는 수준의 EPO에 도달하면, 전이 유전자는 3개의 조건이 발생할 때까지 꺼진 후, 다시 켜진다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에의 사용을 위해 포함된 패스코드 조절 스위치 또는 “패스코드 회로”는, 생물학적 봉쇄 조건을 정의하는 데 사용되는 환경 신호의 범위 및 복잡성을 확장시키기 위해 하이브리드 전사인자(TF)를 포함한다. 사전 결정된 조건의 존재 하에 세포 사멸을 유발시키는 사망자의 스위치와는 반대로, “패스코드 회로”는 특정 “패스코드”의 존재 하에서 세포 생존 또는 전이 유전자 발현을 허용하며, 단지 사전 결정된 환경 조건 또는 패스코드가 존재하는 때에만 전이유전자 발현 및/또는 세포 생존을 허용하도록, 용이하게 재프로그램화될 수 있다.
본원에 개시된 조절 스위치의 임의의 및 모든 조합, 예를 들어 소분자 스위치, 핵산 기반 스위치, 소분자-핵산 하이브리드 스위치, 전사 후 전이유전자 조절 스위치, 번역 후 조절, 방사선 제어 스위치, 저산소증 매개 스위치, 및 본원에 개시된 바와 같은 당업자에게 공지된 다른 조절 스위치가, 본원에 개시된 바와 같은 패스코드 조절 스위치에 사용될 수 있다. 사용을 위해 포함된 조절 스위치는 또한 리뷰 논문인 문헌[Kis et al., J R Soc Interface. 12: 20141000 (2015)]에 논의되어 있고, Kis의 표 1에 요약되어 있다. 일부 구현예에서, 패스코드 시스템에 사용하기 위한 조절 스위치는, 본원에 전문이 참조로서 인용된 국제 특허 출원 PCT/US18/49996의 표 11에 개시된 임의의 스위치 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
(iv). 전이 유전자 발현을 조절하기 위한 핵산-계 조절 스위치
일부 구현예에서, ceDNA에 의한 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 조절하기 위한 조절 스위치는, 핵산-계 조절 메커니즘에 기초한다. 예시적인 핵산 제어 메커니즘은 당업계에 공지되어 있으며, 사용을 위해 고려된다. 예를 들어, 이러한 메커니즘은, 예를 들어 US2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, 미국 특허 제9,222,093호 및 EP 출원 EP288071에 개시된 것들, 및 문헌[Villa JK et al., Microbiol Spectr. 2018 May;6(3)]에 개시된 것과 같은 리보스 위치를 포함한다. WO2018/075486 및 WO2017/147585에 개시된 것들과 같은 대사산물 반응성 전사 바이오센서가 또한 포함된다. 사용을 위해 고려되는 다른 업계 공지 메커니즘에는, siRNA 또는 RNAi 분자(예를 들어, miR, shRNA)를 이용한 전이유전자의 침묵(silencing)이 포함된다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터에 의해 발현된 전이유전자의 일부에 상보적인 RNAi 분자를 인코딩하는 조절 스위치를 포함할 수 있다. 비록 전이 유전자(예를 들어, 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 길항제 경로 중 하나 이상의 억제제, 또는 카스파제 1 억제제))가 ceDNA 벡터에 의해 발현되더라도 이러한 RNAi가 발현될 때, 이는 상보성 RNAi 분자에 의해 침묵될 것이고, 전이 유전자가 ceDNA 벡터에 의해 발현될 때 RNAi가 발현되지 않는 경우, 전이 유전자(예를 들어, 인플라마좀 길항제)는 RNAi에 의해 침묵되지 않는다.
일부 구현예에서, 조절 스위치는 예를 들어 US2002/0022018에 개시된 조직-특이적인 자가-불활성화 조절 스위치인데, 이로 인해 조절 스위치는 그렇지 않다면 전이 유전자가 발현되면 불리할 수도 있었던 부위에서 전이 유전자(예를 들어, 인플라마좀 길항제)를 의도적으로 꺼버린다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어 US2014/0127162 및 미국 특허 제8,324,436호에 개시된 바와 같은 재조합효소 가역적 유전자 발현 시스템이다.
(v). 전사-후 및 번역-후 조절 스위치.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의한 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 조절하기 위한 조절 스위치는, 전사-후 변형 시스템이다. 예를 들어, 이러한 조절 스위치는 US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, EP 특허 제2707487호 및 문헌[Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp 526-534]; 문헌[Zhong et al., Elife. 2016 Nov 2;5. pii: e18858]에 개시된 바와 같은, 테트라시클린 또는 테로필린에 민감한 압타자임(aptazyme) 리보스 위치일 수 있다. 일부 구현예에서, 당업자는 리간드 민감성(OFF-스위치) 압타머를 함유하는 저해성 siRNA와 전이유전자를 모두 인코딩할 수 있으며, 최종 결과는 리간드 민감성 ON-스위치가 되는 것으로 예상된다.
(vi). 다른 예시적인 조절 스위치
환경 변화에 의해 유발되는 것들을 포함한 임의의 알려진 조절 스위치는, ceDNA 벡터에서, ceDNA에 의한 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 추가의 예에는, 비제한적으로, 문헌[Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018)]의 BOC 방법; 유전 코드 확장 및 비(非)생리학적 아미노산; 방사선 제어 또는 초음파 제어 온/오프 스위치(예를 들어, 문헌[Scott S et al., Gene Ther. 2000 Jul;7(13):1121-5]; 미국 특허 제5,612,318호; 제5,571,797호; 제5,770,581호; 제5,817,636호; 및 WO1999/025385A1 참조)가 포함된다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어 미국 특허 제7,840,263호; US2007/0190028A1에 개시된 바와 같은 이식 가능한 시스템에 의해 제어되며, 여기서 유전자 발현은 ceDNA 벡터 내 전이유전자에 작동적으로 연결된 프로모터를 활성화시키는 전자기 에너지를 포함하는 하나 이상의 에너지 형태에 의해 제어된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에의 사용을 위해 고려되는 조절 스위치는, 저산소증 매개 또는 스트레스 활성화 스위치, 예를 들어 WO1999060142A2, 미국 특허 제5,834,306호; 제6,218,179호; 제6,709,858호; US2015/0322410; 문헌[Greco et al., (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368]에 개시된 바와 같은 것들뿐 아니라, 예를 들어 미국 특허 제9,394,526호에 개시된 바와 같은, FROG, TOAD 및 NRSE 요소, 및 조건부 유도성 침묵 요소(저산소증 반응 요소(HRE), 염증 반응 요소(IRE) 및 전단 응력 활성화 요소(SSAE) 포함)이다. 이러한 구현예는, 허혈 후, 허혈 조직 및/또는 종양에서 ceDNA 벡터로부터의 전이유전자의 발현을 조정하는 데 유용하다.
(vii). 사멸 스위치
본원에 기재된 다른 구현예는, 사멸 스위치를 포함하는 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터와 관련된다. 본원에 개시된 바와 같은 사멸 스위치는, 대상의 시스템으로부터 도입된 ceDNA 벡터를 영구적으로 제거하는 수단으로서, ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 사멸시키거나 프로그래밍된 세포 사멸에 거치게 할 수 있다. 당업계의 숙련자는, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터에서의 사멸 스위치의 사용이, 전형적으로 대상체가 허용 가능하게 잃을 수 있는 제한된 수의 세포, 또는 어팝토시스가 바람직한 세포 타입(예를 들어, 암 세포)에 대한 ceDNA 벡터의 표적화와 결합될 것이라는 점을 이해할 것이다. 모든 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 “사멸 스위치”는, 입력 생존 신호 또는 다른 명시된 조건의 부재 하에서 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 신속하고 강력한 세포 사멸을 제공하도록 설계된다. 달리 말하면, 본원에 기재된 인플라마좀 길항제의 발현을 위해 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 사멸 스위치는, ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 생존을, 특정 입력 신호에 의해 정의되는 환경에 국한시킬 수 있다. 이러한 사멸 스위치는, 대상체에서 인플라마좀 길항제의 ceDNA 벡터 발현을 제거하거나, 이것이 인코딩된 인플라마좀 길항제를 발현하지 않도록 보장하는 것이 바람직한 경우, 생물학적 생체봉쇄(biocontainment) 기능의 역할을 한다.
당업계의 숙련자에게 알려진 다른 사멸 스위치는, 예를 들어 US2010/0175141; US2013/0009799; US2011/0172826; US2013/0109568에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제, 뿐만 아니라 문헌[Jusiak et al., Reviews in Cell Biology and molecular Medicine; 2014; 1-56]; 문헌[Kobayashi et al., PNAS, 2004; 101; 8419-9]; 문헌[Marchisio et al., Int. Journal of Biochem and Cell Biol., 2011; 43; 310-319]; 및 문헌[Reinshagen et al., Science Translational Medicine, 2018, 11]에 개시된 사멸 스위치의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포함된다.
따라서, 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 사멸 스위치 핵산 제작물을 포함할 수 있는데, 이는 이펙터 독소 또는 리포터 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기에서 상기 이펙터 독소(예를 들어, 사멸 단백질) 또는 리포터 단백질의 발현은 사전 결정된 조건에 의해 조절된다. 예를 들어, 선결된 조건은 환경 작용제, 예를 들어 외인성 작용제의 존재일 수 있으며, 그렇지 않으면 세포는 이펙터 독소(예를 들어, 사멸 단백질)의 발현이 기본 설정이 되어 사멸되게 된다. 대안적인 구현예에서, 선결된 조건은 2개 이상의 환경 작용제의 존재이며, 예를 들어 세포는 2개 이상의 필요한 외인성 작용제가 공급되는 경우에만 생존할 것이고, 둘 중 어느 하나가 없는 경우에, ceDNA 벡터를 포함한 세포는 사멸된다.
일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 사멸-스위치를 포함하도록 변형되어, ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 파괴하고, ceDNA 벡터에 의해 발현되는 전이 유전자의 생체내 발현(예를 들어, 인플라마좀 길항제의 발현)을 효과적으로 종결시킨다. 구체적으로, ceDNA 벡터는 정상적인 생리학적 조건 하의 포유류 세포에서 기능성이 아닌 스위치-단백질을 발현하도록 추가로 유전자 조작된다. 이러한 스위치-단백질을 특이적으로 표적화하는 환경 조건 또는 약물의 투여 시에만, 스위치-단백질을 발현하는 세포가 파괴되어 치료용 단백질 또는 펩타이드의 발현이 종결될 것이다. 예를 들어, HSV-티미딘 키나제를 발현하는 세포는 간시클로버(ganciclovir) 및 시토신 데아미나아제와 같은 약물의 투여 시 사멸될 수 있다고 보고되었다. 예를 들어 문헌[Dey and Evans, Suicide Gene Therapy by Herpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase (HSV-TK), in Targets in Gene Therapy, edited by You (2011)]; 및 문헌[Beltinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(15):8699-8704 (1999)] 참조. 일부 구현예에서 ceDNA 벡터는 DISE(생존 유전자 제거로 인해 유도된 사멸(Death Induced by Survival gene Elimination))로 지칭되는 siRNA 사멸 스위치를 포함할 수 있다(문헌[Murmann et al., Oncotarget. 2017; 8:84643-84658, Induction of DISE in ovarian cancer cells in vivo]).
다른 구현예에서, ceDNA로부터 발현된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 추가적인 기능, 예컨대 형광, 효소 활성, 분비 신호 또는 면역 세포 활성자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 인코딩하는 ceDNA는, 예를 들어 링커 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 “링커 도메인”은, 2개 내지 100개 아미노산 길이의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 영역을 지칭하며, 이는 본원에 기재된 임의의 인플라마좀 길항제의 도메인/영역을 함께 연결시킨다. 일부 구현예에서, 링커는 유연성 잔기, 예컨대 글리신 및 세린을 포함하거나, 이로서 구성될 수 있어서, 인접하는 단백질 도메인들이 서로에 대해 자유롭게 움직인다. 더 긴 링커는, 2개의 인접한 도메인들이 서로 입체적으로 방해되지 않게 보장하는 것이 요망될 경우 사용될 수 있다. 링커는 절단 가능하거나, 절단 가능하지 않을 수 있다. 절단 가능한 링커의 예는, 2A 링커(예를 들어, T2A), 2A-유사 링커, 또는 이들의 기능성 동등체 및 이들의 조합을 포함한다. 링커는 토레아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스로부터 유래한 T2A인 링커 영역일 수 있다.
IV. ceDNA 벡터의 생산 방법
A. 생산 전반
본원에 정의된 비대칭적인 ITR 쌍 또는 대칭적인 ITR 쌍을 포함하는, 예를 들어 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산을 위한 특정 방법은, 2018년 9월 7일자 제출된 국제 출원 PCT/US18/49996의 섹션 IV에 기재되어 있는데, 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로서 인용된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 인플라마좀 길항제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 본원에 기재된 곤충 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 본원에 개시된 인플라마좀 길항제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 합성에 의해 생산될 수 있고, 일부 구현예에서는, 2019년 1월 18일자 제출된 국제 출원 PCT/US19/14122에 개시된 무-세포 방법으로 생산될 수 있으며, 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로서 인용된다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어, 이하의 단계들을 포함하는 공정에 의해 얻을 수 있다: a) 바이러스 캡시드 코딩 서열이 결핍된, 폴리뉴클레오티드 발현 제작물 템플레이트(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큘로바이러스)를 보유하는 숙주 세포 (예를 들어, 곤충 세포)의 집단을, 숙주 세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재 하에서 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는 바이러스 캡시드 코딩 서열을 포함하지 않는 단계; 및 b) 상기 숙주 세포로부터 ceDNA 벡터를 수확 및 단리하는 단계. Rep 단백질의 존재는 변형된 ITR을 갖는 벡터 폴리뉴클레오티드의 복제를 유도하여, 숙주 세포에서 ceDNA 벡터를 생산한다. 하지만, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 비리온)는 발현되지 않는다. 따라서, AAV 또는 다른 바이러스 기반 벡터에 자연적으로 부과되는 것과 같은 크기 제한이 없다.
숙주 세포에서 단리된 ceDNA 벡터의 존재는, 숙주 세포에서 단리된 DNA를 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 절단시키고, 절단된 DNA 물질을 미변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하는 방식으로 확인될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 예를 들어 문헌[L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879]에 기재된 바와 같은 비-바이러스성 DNA 벡터의 생산에서의, DNA 벡터 뉴클레오티드 발현 템플레이트(ceDNA 템플레이트)를 이들 자신의 게놈으로 안정하게 통합시키는 숙주 세포주의 사용을 제공한다. 바람직하게는, Rep는 약 3의 MOI에서 숙주 세포에 첨가된다. 숙주 세포주가 포유류 세포주, 예를 들어 HEK293 세포인 경우, 상기 세포주는 안정적으로 통합된 폴리뉴클레오티드 벡터 주형을 가질 수 있고, 헤르페스바이러스와 같은 제2 벡터를 사용하여 Rep 단백질을 세포에 도입하여, Rep 및 헬퍼 바이러스의 존재 하에서 ceDNA의 절제 및 증폭을 가능하게 할 수 있다.
일 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 제조하는데 사용된 숙주 세포는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 곤충 세포이고, 바큘로바이러스는 Rep 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드와 도 4a 내지 4d 및 실시예 1에 기재된 바와 같은, ceDNA를 위한 비-바이러스 DNA 벡터 폴리뉴클레오티드 발현 제작물 템플레이트를 둘 다 전달하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 Rep 단백질을 발현하도록 조작된다.
이어서, 숙주 세포에서 ceDNA 벡터를 수거하고 단리한다. 상기 세포에서 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 수거하고 수집하는 시간은, ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하기 위해 선택 및 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존력, 세포 형태, 세포 성장 등의 관점에서 선택될 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포를 충분한 조건 하에서 성장시키고, ceDNA 벡터를 생산하기 위한 바큘로바이러스 감염 후, 하지만 바큘로바이러스 독성으로 인해 세포의 대부분이 사멸되기 시작하기 전에 충분한 시간 동안 수거한다. DNA 벡터는 Qiagen Endo-Free Plasmid 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법이 또한 DNA 벡터에 적용될 수 있다. 일반적으로, 임의의 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.
DNA 벡터는 DNA의 정제에 대해 당업자에게 공지된 임의의 수단을 통해 정제될 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로 정제된다. 또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 마이크로입자로 정제된다.
면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 존재는, 세포로부터 단리된 벡터 DNA를 DNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소에 의해 절단시키고, 겔 전기 영동을 사용하여 절단 및 비절단된 DNA 물질을 분석하여, 선형의 불연속 DNA에 대비된 선형의 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확정될 수 있다. 도 4c 및 도 4d는, 본원의 공정에 의해 생산된 폐쇄 말단 ceDNA의 존재를 확인하기 위한 일 구현예를 나타낸다.
B. ceDNA 플라스미드
ceDNA-플라스미드는 이후 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산에 사용되는 플라스미드이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 예를 들어, ceDNA-플라스미드는 공지의 기술을 사용하여 제작되어, 적어도 전사의 방향으로 작용 가능하게 연결된 이하의 것들을 제공할 수 있고: (1) 변형된 5’ ITR 서열; (2) 시스-조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 유도성 프로모터, 조절 스위치, 인핸서 등을 포함하는 발현 카세트; 및 (3) 변형된 3’ ITR 서열, 상기 3’ ITR 서열은 5’ ITR 서열에 대해 대칭적이다. 일부 구현예에서, ITR이 플랭킹된 발현 카세트는 외인성 서열을 도입하기 위한 클로닝 부위를 포함한다. 발현 카세트는 AAV 게놈의 rep 및 cap 코딩 영역을 대체한다.
일 양태에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어 플라스미드(본원에서 “ceDNA-플라스미드”라고도 지칭됨)로부터 얻으며, 이 순서로 인코딩되고: 제1 아데노-관련 바이러스(AAV) 역위 말단 반복부(ITR), 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 돌연변이화 또는 변형된 AAV ITR, 여기에서 상기 ceDNA-플라스미드는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 결핍되어 있다. 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 이 순서로 인코딩되고: 제1 (또는 5’) 변형 또는 돌연변이화된 AAV ITR, 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2 (또는 3’) 변형된 AAV ITR, 여기에서 상기 ceDNA-플라스미드는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 결핍되어 있고, 상기 5’ 및 3’ ITR은 서로 대칭적이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 이 순서로 인코딩되고: 제1 (또는 5’)의 변형 또는 돌연변이화된 AAV ITR, 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2 (또는 3’)의 돌연변이화 또는 변형된 AAV ITR, 여기에서 상기 ceDNA-플라스미드는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 결핍되어 있고, 상기 5’ 및 3’ 변형된 ITR은 동일한 변형을 갖는다(즉, 이들은 서로에 대해 역 상보적이거나, 대칭적이다).
추가의 구현예에서, ceDNA-플라스미드 시스템에는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다(즉, AAV 캡시드 유전자뿐 아니라 다른 바이러스의 캡시드 유전자가 없음). 또한, 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드에는 또한 AAV Rep 단백질 코딩 서열이 없다. 따라서, 바람직한 구현예에서, ceDNA-플라스미드에는 AAV2에 대한 기능성 AAV cap 및 AAV rep 유전자 GG-3′, 및 헤어핀 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열이 없다.
본 발명의 ceDNA-플라스미드는 당업계에 널리 공지된 임의의 AAV 혈청형의 게놈의 천연 뉴클레오티드 서열을 사용하여 생성될 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈에서 유도된다. 예를 들어, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261; Kotin and Smith, The Springer Index of Viruses(Springer가 유지 관리하는 URL에서 이용 가능함)(www 웹 주소: oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.)(참고: URL 또는 데이터베이스에 대한 참조는 현재 본 출원의 유효 출원일자의 URL 또는 데이터베이스의 내용을 나타냄). 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV2 게놈에서 유도된다. 또 다른 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 이러한 AAV 게놈 중 하나에서 유도된 5’ 및 3’ ITR을 포함하도록 유전자 조작된 합성 백본이다.
ceDNA-플라스미드는 선택적으로 ceDNA 벡터 생산 세포주의 확립에 사용하기 위한 선별 가능한 또는 선별 마커를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 선별 마커는 3’ ITR 서열의 다운스트림(즉, 3’)에 삽입될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 선별 마커는 5’ ITR 서열의 업스트림(즉, 5’)에 삽입될 수 있다. 적절한 선별 마커에는, 예를 들어 약물 내성을 부여하는 것들이 포함된다. 선별 마커, 예를 들어 블라스티시딘(blasticidin) S 내성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 제네티신(geneticin) 등일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 약물 선별 마커는 블라스티시딘 S 내성 유전자이다.
인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로 중 하나 이상의 억제제, 또는 카스파제 1 억제제)의 발현을 위한 예시적인 ceDNA(예를 들어, rAAV0) 벡터는, rAAV 플라스미드로부터 생산된다. rAAV 벡터의 생산 방법은 (a) 상기 기재된 바와 같은 rAAV 플라스미드를 갖는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 숙주 세포와 플라스미드에는 모두 캡시드 단백질 인코딩 유전자가 없는 단계, (b) ceDNA 게놈의 생성을 가능하게 하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 (c) 세포를 수거하고 상기 세포에서 생산된 AAV 게놈을 단리하는 단계를 포함할 수 있다.
C. ceDNA 플라스미드로부터 ceDNA 벡터를 제조하는 예시적인 방법
면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 저-캡시드 ceDNA 벡터의 제조 방법, 특히 충분히 높은 수율을 가져서 생체 내 실험을 위해 충분한 벡터를 제공하는 방법도, 또한 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산 방법은, 예를 들어 이하의 단계들을 포함한다: (1) 발현 카세트와 2개의 대칭적인 ITR 서열을 포함하는 핵산 제작물을 숙주 세포(예를 들어, Sf9 세포)에 도입하는 단계, (2) 선택적으로, 예를 들어, 플라스미드 상에 존재하는 선별 마커를 사용함으로써 클론 세포주를 확립하는 단계, (3) (상기 유전자를 갖는 바큘로바이러스에 의한 형질감염 또는 감염 중 하나에 의해) Rep 코딩 유전자를 상기 곤충 세포에 도입하는 단계, 및 (4) 세포를 수확하고, ceDNA 벡터를 정제하는 단계. ceDNA 벡터의 생산을 위한, 상기 기재된 발현 카세트 및 2개의 ITR 서열을 포함하는 핵산 제작물은, 이하에 기재된 ceDNA 플라스미드에 의해 생성된 ceDNA 플라스미드, 또는 박미드 또는 바큘로바이러스의 형태일 수 있다. 핵산 제작물은 형질감염, 바이러스 형질도입, 안정적인 통합 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다.
D. 세포주:
예를 들어, 면역반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산에 사용된 숙주 세포주는, 열대거세미나방(Spodoptera frugiperda), 또는 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni )세포로부터 유래한 곤충 세포주, 예컨대Sf9, Sf21, 또는 다른 무척추동물, 척추동물, 또는 포유류 세포를 포함하는 다른 진핵 세포주를 포함할 수 있다. HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, HeplA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1 180, 단핵구 및 성숙 및 미성숙 수지상세포와 같은 당업자에게 공지된 다른 세포주가 또한 사용될 수 있다. 숙주 세포주는 고수율 ceDNA 벡터 생산을 위한 ceDNA-플라스미드의 안정한 발현을 위해 형질감염될 수 있다.
CeDNA-플라스미드는 당업계에 알려진 시약(예를 들어, 리포좀, 인산 칼슘) 또는 물리적인 수단(예를 들어, 전기천공)을 사용하는 일시적인 형질감염에 의해, Sf9 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, ceDNA-플라스미드를 게놈에 안정적으로 통합시킨 안정한 Sf9 세포주가 확립될 수 있다. 이러한 안정적인 세포주는 선별 마커를 상기 기재된 바와 같은 ceDNA 플라스미드에 혼입시키는 방식으로 확립될 수 있다. 세포주를 형질감염시키는 데 사용되는 ceDNA 플라스미드가 항생제와 같은 선별 마커를 포함하는 경우, ceDNA-플라스미드로 형질감염시키고 ceDNA-플라스미드 DNA를 게놈에 통합시킨 세포는 세포 성장 배지에 항생제를 첨가하여 선별할 수 있다. 이어서, 세포의 내성 클론을 단일 세포 희석 또는 콜로니 전달 기술로 단리하고, 증식시킬 수 있다.
E. ceDNA 벡터의 단리 및 정제:
ceDNA 벡터를 얻고 단리하기 위한 공정의 예는, 도 1 내지 7과 이하의 특정 실시예에 설명되어 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 면역반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, 또는 ceDNA-바큘로바이러스에 의해 추가로 형질전환된, AAV Rep 단백질(들)을 발현시키는 생산자 세포로부터 얻을 수 있다. ceDNA 벡터의 생산에 유용한 플라스미드는, 인플라마좀 길항제를 인코딩하는 플라스미드, 또는 하나 이상의 REP 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 포함한다.
일 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 생산자 세포로 전달된 AAV Rep 단백질(Rep 78 또는 68)을, 플라스미드(Rep- 플라스미드), 박미드(Rep- 박미드) 또는 바큘로바이러스(Rep- 바큘로바이러스) 내에서 인코딩한다. Rep-플라스미드, Rep-박미드 및 Rep-바큘로바이러스는 상기 기재된 방법에 의해 생성될 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 면역반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 제조 방법이 본원에 기재된다. 본원에 기재된 면역반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 생성하는데 사용된 발현 제작물은, 플라스미드(예를 들어, ceDNA-플라스미드), 박미드(예를 들어, ceDNA-박미드) 및/또는 바큘로바이러스(예를 들어, ceDNA-바큘로바이러스)일 수 있다. 단지 예시로서, ceDNA-벡터는 ceDNA-바큘로바이러스 및 Rep-바큘로바이러스로 동시 감염된 세포에서 생성될 수 있다. Rep-바큘로바이러스에서 생성된 Rep 단백질은 ceDNA-바큘로바이러스를 복제하여 ceDNA-벡터를 생성할 수 있다. 대안적으로, 인플라마좀 길항제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, Rep-플라스미드, Rep-박미드 또는 Rep- 바큘로바이러스에서 전달된 AAV Rep 단백질(Rep78/52)을 인코딩하는 서열을 포함하는 제작물에 의해 안정되게 형질감염된 세포로부터 생성될 수 있다. ceDNA-바큘로바이러스를 세포에 일시적으로 형질감염시키고, Rep 단백질을 통해 복제하여, ceDNA 벡터를 생산할 수 있다.
박미드(예를 들어, ceDNA-박미드)는 허용성 곤충 세포, 예컨대 Sf9, Sf21, Tni(Trichoplusia ni) 세포, High Five 세포로 형질감염되어, ceDNA- 바큘로바이러스를 생성할 수 있는데, 이는 대칭적인 ITR들을 포함하는 서열과 발현 카세트를 포함하는 재조합 바큘로바이러스이다. ceDNA-바큘로바이러스를 다시 곤충 세포에 감염시켜, 차세대 재조합 바큘로바이러스를 수득할 수 있다. 선택적으로, 상기 단계를 1회 또는 다회 반복하여 재조합 바큘로바이러스를 보다 많은 양으로 생산할 수 있다.
본원에 기재된 면역반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 세포로부터 수거 및 수집하기 위한 시간은, ceDNA 벡터의 고-수율 생산을 달성하도록 선택 및 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존력, 세포 형태, 세포 성장 등의 관점에서 선택될 수 있다. 통상적으로, 세포는 ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 벡터)를 생산하기 위한 바큘로바이러스 감염 후 충분한 시간 후에, 하지만 바이러스 독성으로 인해 세포의 대부분이 사멸되기 시작하기 전에 수거될 수 있다. ceDNA-벡터는 Qiagen ENDO-FREE PLASMID® 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 Sf9 세포에서 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법이 또한 ceDNA 벡터에 적용될 수 있다. 일반적으로, 임의의 업계 공지 핵산 정제 방법뿐 아니라, 상업적으로 입수 가능한 DNA 추출 키트가 채택될 수 있다.
대안적으로, 정제는 세포 펠릿을 알칼리성 용해 과정에 적용하고, 생성된 용해물을 원심분리하고, 크로마토그래피 분리를 수행하는 방식으로 구현될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 상기 공정은 핵산을 보유하는 이온 교환 컬럼(예를 들어, SARTOBIND Q®) 상에 상청액을 로딩한 후, 용리(예를 들어, 1.2 M NaCl 용액을 이용하여)하고, 겔 여과 컬럼(예를 들어, 6 fast flow GE) 상에서 추가로 크로마토그래피 정제를 수행하는 방식으로 수행될 수 있다. 이어서, 캡시드 미함유 AAV 벡터를, 예를 들어 침전으로 회수한다.
일부 구현예에서, 면역반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 또한 엑소좀, 또는 미세입자의 형태로 정제될 수도 있다. 많은 세포 타입은 막 미세소포 세딩(shedding)을 통해, 용해성 단백질뿐만 아니라 복합체 단백질/핵산 내용물도 방출한다고 당업계에 알려져 있다(Cocucci et al., 2009; EP 10306226.1). 이러한 소포는 미세소포(또한, 미세입자라고도 지칭됨) 및 엑소좀(또한, 나노소포라고도 지칭됨)을 포함하며, 이 둘은 내용물로서 단백질과 RNA를 포함한다. 미세소포는 원형질막의 직접 버딩(budding)으로부터 생성되고, 엑소좀은 다소포성 엔도좀과 원형질막의 융합 시 세포외 환경으로 방출된다. 따라서, ceDNA 벡터 함유 미세소포 및/또는 엑소좀은 ceDNA-플라스미드, 또는 ceDNA-플라스미드를 이용하여 생성된 박미드 또는 바큘로바이러스로 형질도입된 세포에서 단리될 수 있다.
배양 배지를 여과 또는 20,000 x g에서의 초원심분리에 적용하여 미세소포를 단리하고, 100,000 x g에서의 초원심분리하여 엑소좀을 단리할 수 있다. 초원심분리의 최적 기간은 실험적으로 결정될 수 있고, 소포가 단리되는 특정 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 배양 배지는 먼저 (예를 들어, 5 내지 20분 동안 2000 x g에서) 저속 원심분리함으로써 맑아지며, 예를 들어, AMICON® 스핀 컬럼 (Millipore®, 영국 와트포드 소재)를 사용하여 스핀 원심분리를 실시한다. 미세소포와 엑소좀은 미세소포와 엑소좀 상에 존재하는 특정 표면 항원을 인식하는 특정 항체를 사용하여 FACS 또는 MACS를 통해 추가로 정제될 수 있다. 다른 미세소포 및 엑소좀 정제 방법에는, 비제한적으로, 면역침강, 친화성 크로마토그래피, 여과, 및 특정 항체 또는 압타머가 코팅된 자성 비드가 포함된다. 정제 시, 소포를, 예를 들어 포스페이트 완충 염수로 세척한다. ceDNA-함유 소포를 전달하기 위해 미세소포 또는 엑소좀을 사용할 때의 하나의 장점은, 이 소포들이 이들의 막에 각 세포 타입의 특이적인 수용체에 의해 인식되는 단백질을 포함함으로써, 다양한 세포 타입에 대해 표적화될 수 있다는 점이다. (또한 EP 10306226 참조)
본원의 발명의 또 다른 양태는, ceDNA 제작물이 그 자체의 게놈에 안정적으로 통합된 숙주 세포주로부터 ceDNA 벡터를 정제하는 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로 정제된다. 또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 마이크로입자로 정제된다.
국제 출원 PCT/US18/49996의 도 5는, 실시예에 기재된 방법을 사용하여 다수의 ceDNA-플라스미드 제작물로부터 ceDNA의 생성을 확인하는 겔을 보여준다. ceDNA는 겔에서의 특징적인 밴드 패턴에 의해 확인된다(도 5a 참고).
V. 약학적 조성물 및 제제
본 발명은 치료 핵산과 본원에 기재된 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 포함하는 약학적 조성물 및 제제를 고려한다. 일부 구현예에서, 치료 핵산과 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 포함하는 약학적 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 의하면, 약학적 조성물은 폐쇄-말단 DNA 벡터, 예를 들어, 본원에 기재된 ceDNA 벡터, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 일부 구현예에 의하면, 약학적 조성물은 폐쇄-말단 DNA 벡터, 예를 들어, 본원에 기재된 ceDNA 벡터, TLR 억제제(예를 들어, TLR9 억제제), 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 일부 구현예에 의하면, 약학적 조성물은 폐쇄-말단 DNA 벡터, 예를 들어, 본원에 기재된 ceDNA 벡터, cGAS 억제제, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 일부 구현예에 의하면, 약학적 조성물은 폐쇄-말단 DNA 벡터, 예를 들어, 본원에 기재된 ceDNA 벡터, 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나 이상), 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
본원에 개시된 DNA-벡터는 대상체의 세포, 조직 또는 기관에 생체 내 전달되기 위해, 대상체의 투여에 적합한 약학적 조성물에 포함될 수 있고, 여기에는 일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 포함하는 약학적 조성물이 포함된다. 전형적으로, 약학적 조성물은 본원에 개시된 DNA-벡터와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 TTX-벡터는 원하는 치료 투여 경로(예를 들어, 비경구 투여)에 적합한 약학적 조성물로 포함될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 전달이 또한 고려된다. 치료 목적의 약학적 조성물은 용액, 미세 에멀전, 분산체, 리포좀, 또는 고 TTX-벡터 농도에 적합한 다른 규칙적 구조로서 제제화될 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요량의 TTX- 벡터 화합물을 하나의 성분 또는 상기 나열된 성분들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 포함시킨 후, 이를 멸균 여과시킴으로써 제조될 수 있다.
TTX-벡터를 포함하는 약학적 활성 조성물은, 핵산 내의 전이유전자를 수여자의 세포에 전달하도록 제제화되어, 본원의 전이유전자를 치료적으로 발현시킬 수 있다. 상기 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 조성물 및 벡터는 다양한 목적으로 전이 유전자를 전달시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이유전자는, 예를 들어 전이유전자 산물의 기능을 연구하기 위해, 예를 들어 전이유전자를 보유하는 체세포 유전자도입 동물 모델을 생성하기 위해, 연구 목적으로 사용하기 위한 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 또 다른 예에서, 전이유전자는 질환의 동물 모델을 생성하는 데 사용하기 위한 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 전이유전자는 포유류 대상체에서 질병 상태의 치료 또는 예방에 유용한 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 전이유전자는 유전자의 발현 감소, 발현 결여 또는 기능장애와 연관된 질환을 치료하는 데 충분한 양으로 환자에게 전달(예를 들어, 환자에서 발현)될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 유전자 편집 분자(예를 들어, 뉴클레아제)이다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 CRISPR-관련 뉴클레아제(Cas 뉴클레아제)이다.
일부 구현예에 의하면, 본원에 기재된 약학적 활성 조성물은, 항히스타민 또는 스테로이드와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 구현예에 의하면, 항히스타민 또는 스테로이드는 본원에 기재된 약학적 활성 조성물과 동일 조성물 내에서 투여된다. 일부 구현예에 의하면, 항히스타민 또는 스테로이드는 본원에 기재된 약학적 활성 조성물과 별개의 조성물 내에서 투여된다. 일부 구현예에 의하면, 항히스타민 또는 스테로이드는 약학적 활성 조성물과 동시에 투여된다. 일부 구현예에 의하면, 항히스타민 또는 스테로이드는 약학적 활성 조성물과 순차적으로 투여된다. 당업계에 알려진 임의의 항히스타민은 본원의 구현예에 이용될 수 있다. 일부 구현예에 의하면, 항히스타민은 옴헤니라민(ompheniramine), 부클리진(buclizine), 클로르페니라민(chlorpheniramine), 신나리진(cinnarizine), 클레마스틴(clemastine), 시클리진(cyclizine), 시프로헵타딘(cyproheptadine), 디펜히드라민(diphenhydramine), diphenylpyraline, doxylamine, 메클로진(meclozine), 페니라민(pheniramine), 프로메타진(promethazine), 트리프롤리딘(triprolidine), 아크리바스틴(acrivastine), 아스테미졸(astemizole), 세티리진(cetirizine), 데슬로라타딘(desloratadine), 펙소페나딘(fexofenadine), 레보세티리진(levocetirizine), 로라타딘(loratadine), 미졸라스틴(mizolastine), 터페나딘(terfenadine), 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합 중 하나 이상이다. 당업계에 알려진 임의의 스테로이드가 본원의 구현예에 이용될 수 있다. 일부 구현예에 의하면, 스테로이드는 적어도 하나의 플루옥시메스테론(fluoxymesteron), 메스테롤론(mesterolone), 메탄드로스테놀론(methandrostenolone), 난드롤론 (nandrolone)-운데카노에이트, 난드롤론-시플로네이트(cyplonate), 옥산드롤론(oxandrolone), 옥시메톨론(oxymetholone), 난드롤론-헥실옥시 페닐프로피오네이트, 테스토스테론, 프레드리손(prednisone), 코르티졸(cortisol), 코르티손(cortisone), 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손(dexamethasone), 베타메타손(betamethasone), 트리암시놀론(triamcinolone), 베클로메타손(beclomethasone), 플루드로코르티손(fludrocortisone), 데옥시 코르티코스테론, 알도스테론(aldosterone) 및 스타노졸롤(stanozolol) 중 하나 이상이다.
치료 목적을 위한 약학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 멸균 주사액은, 필요한 경우 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 필요한 양의 ceDNA 벡터 화합물을 혼입시킨 후, 여과 멸균하는 방식으로 제조될 수 있다.
단위 투여량
일부 구현예에 의하면, 약학적 조성물은 단위 투여 형태로 존재할 수 있다. 단위 투여 형태는 전형적으로 약학적 조성물의 하나 이상의 특정 투여 경로에 맞게 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 흡입에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 기화기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 분무기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 에어로졸 생성기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경구 투여, 협측 투여 또는 설하 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경막내 또는 뇌실내 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 수 있다.
IV. 투여 및 투여량
본원에 제공된 본 개시 내용은, 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제 및 핵산 (예를 들어, 치료 핵산, 연구 목적으로 사용된 핵산) 중 적어도 하나를 대상체에 투여함으로써, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 원치 않는 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)을 예방, 감소 또는 제거하는 방법을 설명하는데, 여기에서 상기 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 투여와 핵산의 투여는 시간적으로 관련되어, 2개의 제제들의 투여를 조합하여 제공할 때, 면역 반응 (예를 들어, 선천적 면역 반응)이 조작된다. 이들 2개의 제제는 하나의 공동-제제 중에 동시에, 상이한 제제 중에 동시에 투여될 수 있거나, 이들은 상이한 시간에 별도로 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 발현된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 면역계 반응을 유발하지 않고, 오히려 이것은 대상체에서 상기 억제제를 발현하는 ceDNA 벡터의 투여가 없을 때보다 선천성 면역계를 적어도 10%, 또는 20%, 또는 30%, 또는 40%, 또는 50%, 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 95%, 또는 98%, 또는 99% 또는 100% 더 억제한다.
본원에 기재된 기술은, 전반적으로, 폐쇄-말단 DNA 벡터를 라파마이신 또는 라파마이신 유사체, TLR(예를 들어, TLR9) 의 억제제, cGAS의 억제제, 및 본원에 기재된 하나 이상의 인플라마좀 길항제(예를 들어, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1의 억제제, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나 이상) 중 하나 이상 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 면역반응(예를 들어 선천적 면역 반응)의 억제제와 함께 대상체에 공동-투여하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 폐쇄-말단 DNA 벡터는 본원에 개시된 ceDNA 벡터, 및 mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질(Dicer-substrate) dsRNA, 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭성 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비-바이러스 합성 DNA 벡터, 폐쇄-말단 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, doggybone(dbDNA™) DNA 벡터, 최소의 면역학적으로 정의된 유전자 발현 (MIDGE)-벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형-공유적으로 폐쇄된 DNA 벡터), 또는 덤벨-형태의 DNA 최소 벡터(“덤벨 DNA”)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. (예를 들어, 그 내용이 본원에 전문이 참조로서 인용된 WO2010/0086626를 참고한다). 일부 구현예에 의하면, 선천적 면역 반응의 억제제들과 핵산은 임의의 조합으로 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제가 투여될 수 있다. 일부 구현예에 의하면, 대상체 또는 환자에게 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제 및 핵산(예를 들어, 미니서클, 미니유전자, 미니스트링 공유적으로 폐쇄된 DNA, doggybone(dbDNA™) DNA, 덤벨형 DNA, 선형 폐쇄-말단 이중체 DNA (ceDNA 및 CELiD), 플라스미드 기반의 환형 벡터, 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO), RNAi, siRNA, mRNA 등)이 투여된다. 일부 구현예에 의하면, 대상체 또는 환자에게 라파마이신 또는 라파마이신 유사체, 하나 이상의 TLR9 억제제 및 핵산이 투여된다. 일부 구현예에 의하면, 대상체 또는 환자에게 라파마이신 또는 라파마이신 유사체, cGAS 억제제 및 핵산 중 하나 이상이 투여된다. 일부 구현예에 의하면, 대상체 또는 환자에게 라파마이신 또는 라파마이신 유사체, 하나 이상의 인플라마좀 길항제, 및 핵산이 투여된다. 일부 구현예에 의하면, 대상체 또는 환자에게 라파마이신 또는 라파마이신 유사체, 하나 이상의 TLR9 억제제, 하나 이상의 cGAS 억제제 및 핵산이 투여된다. 일부 구현예에 의하면, 대상체 또는 환자에게 라파마이신 또는 라파마이신 유사체, 하나 이상의 TLR9 억제제, 하나 이상의 인플라마좀 길항제 및 핵산이 투여된다. 일부 구현예에 의하면, 대상체 또는 환자에게 하나 이상의 TLR9 억제제, 하나 이상의 cGAS 억제제, 및 핵산을 포함하는 ceDNA 벡터가 투여된다. 일부 구현예에 의하면, 대상체 또는 환자에게 하나 이상의 TLR9 억제제, 하나 이상의 cGAS 억제제, 하나 이상의 인플라마좀 길항제 및 핵산이 투여된다. 일부 구현예에 의하면, 대상체 또는 환자에게 라파마이신 또는 라파마이신 유사체, 하나 이상의 TLR9 억제제, 하나 이상의 cGAS 억제제, 하나 이상의 인플라마좀 길항제 및 핵산이 투여된다.
일부 구현예에서는, 대상체에게 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제 및 하나 이상의 핵산(예를 들어, 미니서클, 미니유전자, 미니스트링 공유적으로 폐쇄된 DNA, doggybone(dbDNA™) DNA, 덤벨형 DNA, 선형 폐쇄-말단 이중체 DNA (ceDNA 및 CELiD), 플라스미드 기반의 환형 벡터, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), RNAi, siRNA, mRNA 등)을 부수적으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 대상체에게 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제 및 핵산 치료제를 2개의 별도의 제형으로, 그러나 부수적으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 상기 방법은 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제 및 치료 핵산을 하나의 제형 내에서 동시에 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서는, 대상체에게 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제 및 하나 이상의 핵산(예를 들어, 미니서클, 미니유전자, 미니스트링 공유적으로 폐쇄된 DNA, doggybone(dbDNA™) DNA, 덤벨형 DNA, 선형 폐쇄-말단 이중체 DNA (ceDNA 및 CELiD), 플라스미드 기반의 환형 벡터, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), RNAi, siRNA, mRNA 등)을 순차적으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 치료 핵산의 투여 이전에 투여될 수 있다.
순차 투여의 경우, 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제와 TNA의 투여 사이에 지연된 시기가 있을 수 있다. 예를 들어, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 TNA 투여의 수 시간, 수일, 또는 수 주 전에(예를 들어, 핵산 투여의 적어도 30분, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 8시간, 적어도 9시간, 적어도 10시간, 적어도 11시간, 적어도 12시간, 적어도 13시간, 적어도 14시간, 적어도 15시간, 적어도 16시간, 적어도 17시간, 적어도 18시간, 적어도 19시간, 적어도 20시간, 적어도 21시간, 적어도 22시간, 적어도 23시간, 적어도 24시간, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 및 적어도 약 4주 전에) 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 TNA 투여의 약 삼십(30) 분 전에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 핵산 투여의 약 한(1) 시간 전에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 핵산 투여의 약 두(2) 시간 전에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 핵산 투여의 약 세(3) 시간 전에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 핵산 투여의 약 네(4) 시간 전에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 핵산 투여의 약 다섯(5) 시간 전에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 핵산 투여의 약 여섯(6) 시간 전에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 핵산 투여의 약 일곱(7) 시간 전에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 핵산 투여의 약 여덟(8) 시간 전에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 핵산 투여의 약 아홉(9) 시간 전에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 핵산 투여의 약 열(10) 시간 전에 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 겨우 핵산 투여의 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 또는 24시간 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 겨우 핵산 투여의 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 6일, 또는 약 7일 전에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 핵산 투여의 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 또는 24시간 후에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 핵산 투여의 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 6일, 또는 약 7일 후에 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 겨우 핵산 투여의 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 또는 24시간 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 겨우 핵산 투여의 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 6일, 또는 약 7일 후에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 핵산 투여 전에, 이와 동시에, 및/또는 그 후에 다수 회 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산(예를 들어, ceDNA 벡터)은 단일 용량 또는 다수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에 의하면, 1회 초과의 용량이 대상체에 투여될 수 있다. 필요한 경우, 다수의 용량이 투여될 수 있는데, 그 이유는 ceDNA 벡터가 바이러스 캡시드가 없으므로 항-캡시드 숙주 면역 반응을 유발하지 않기 때문이다. 일부 구현예에 의하면, 투여되는 용량의 횟수는 예를 들어, 2 내지 10회 또는 그 이상의 용량, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산은, 본원에 개시된 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제와 함께 투여되고, 다수 회 재-투여될 수 있다. 예를 들어, 치료 핵산은 0일차에 하나 이상의 면역 반응의 억제제와 함께 투여될 수 있고, 상기 억제제는 핵산 투여의 전, 후 또는 이와 동시에 제1 투여 요법으로 투여된다. 0일차의 초기 치료 이후, 제2 투여(재-용량)는 핵산 및 바람직하게는 본원에 개시된 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제에 의한 초기 치료의 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 또는 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 또는 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 6년, 약 7년, 약 8년, 약 9년, 약 10년, 약 11년, 약 12년, 약 13년, 약 14년, 약 15년, 약 16년, 약 17년, 약 18년, 약 19년, 약 20년, 약 21년, 약 22년, 약 23년, 약 24년, 약 25년, 약 26년, 약 27년, 약 28년, 약 29년, 약 30년, 약 31년, 약 32년, 약 33년, 약 34년, 약 35년, 약 36년, 약 37년, 약 38년, 약 39년, 약 40년, 약 41년, 약 42년, 약 43년, 약 44년, 약 45년, 약 46년, 약 47년, 약 48년, 약 49년 또는 약 50년 후에 실시될 수 있다.
일부 구현예에 의하면, 핵산의 재-투여는 핵산의 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에 의하면, 재-투여 이후 핵산의 발현 증가는, 제1 투여 이후의 핵산의 발현에 비해, 핵산의 재-투여 이후 약 0.5-배 내지 약 10-배, 약 1-배 내지 약 5-배, 약 1-배 내지 약 2-배, 또는 약 0.5-배, 약 1-배, 약 2-배, 약 3-배, 약 4-배, 약 5-배, 약 6-배, 약 7-배, 약 8-배, 약 9-배 또는 약 10-배 더 높다.
일반적으로, 투여량은 ceDNA 벡터의 특정한 특징, 발현 효율, 및 환자의 나이, 건강 상태 및 성별에 따라 달라질 것이다. 투여량은 당업계의 숙련자에 의해 결정될 수 있고, 전통적인 AAV 벡터와는 달리, 임의의 합병증이 일어날 때 개별 의사가 조절할 수도 있는데, 그 이유는 ceDNA 벡터가 반복적인 투여를 방해하는 면역 활성화 캡시드 단백질을 포함하지 않기 때문이다.
일부 구현예에 의하면, 본원에 개시된 단백질의 발현을 위한 핵산(예를 들어, ceDNA 벡터)의 1회 초과의 투여(예를 들어, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 투여)는, 예를 들어, 매일, 매주, 매월, 매년 등의 다양한 간격의 기간 동안 이용되어, 원하는 수준의 유전자 발현을 달성할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 구현예에 의하면, 핵산은 치료 핵산일 수 있다.
치료 효과
선천성 면역계를 억제 또는 감소시키기 위한, 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 발현하는 ceDNA 벡터의 효능은, 당업계의 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 치료는 선천성 면역계의 징후 또는 증상 중 하나 또는 모두가 감소되고/거나, 유리한 방식으로 변하는 경우, 또는 질병의 임상적으로 허용된 다른 증상 또는 마커가 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 인코딩하는 ceDNA 벡터에 의한 치료 이후 예를 들어, 적어도 10% 향상 또는 개선되는 경우, 그 용어가 본원에 사용되는 바와 같이 “효과적인 치료"로서 간주된다. 예시적인 마커 및 증상은 본원의 실시예에서 논의된다. 효능은 또한 질병의 안정화, 또는 의료적 개제의 필요성(즉, 질병의 진행이 중단되거나, 적어도 늦춰짐)에 의해 평가될 때, 개인이 더 악화되지 않는 현상에 의해 측정될 수 있다. 이들 지표의 측정 방법은 당업계의 숙련자에 알려져 있고/거나, 본원에 기재되어 있다. 치료는 개인 또는 동물(일부 비-제한적인 예는 인간 또는 포유류를 포함함)에서의 임의의 질병 치료를 포함하고, (1) 질병의 억제, 예를 들어, 질병 또는 장애의 진행을 저지 또는 늦춤; 또는 (2) 질병의 완화, 예를 들어, 증상의 퇴행 유발; 및 (3) 질병 발달의 가능성의 예방 또는 감소, 또는 질병, 예컨대 간 또는 신 부전과 관련된 2차 질병/장애의 예방을 포함한다. 질병의 치료에 대한 유효량은, 이것이 필요한 포유류에게 투여될 때, 그 용어가 본원에 정의되는 바에 따라, 그 질병에 대해 효과적인 치료가 되기에 충분한 양을 의미한다.
제제의 효능은 소정의 질병에 특정되는 물리적인 지표를 평가함으로써 결정될 수 있다. 질병 지표의 분석을 위한 표준 방법은, 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 선천성 면역계를 위한 물리적인 지표는, 예를 들어, 혈장 또는 혈액 중의 용해성 CD14(sCD14) 및 IL-18, IL-22, CSF 또는 혈액 중의 인플라마좀 단백질, 예컨대 AIM2, NLRP3, NLRP1, ASC, 및 카스파제-1을 제한없이 포함하며, 사이토카인 경로의 활성화는 NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로, 또는 카스파제 1 활성화의 기능성 판독 정보로서 사용될 수 있고, 예컨대, 인터루킨(IL)-1β, IL-6, IL-8, IL-18, 인터페론(IFN)-γ, 인터페론(IFN)-α, 단핵구 화학주성 단백질(MCP)-1, 및/또는 종양 괴사 인자(TNF)-α를 포함하나, 이에 제한되지 않는 생체 마커를 포함한다.
일 구현예에서, ceDNA 벡터는 예를 들어 선천성 면역계의 억제를 위한 기능을 갖는, 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 발현시키는 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 예를 들어 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 면역계 반응을 유발하지 않고, 오히려 이는 대상체에서 면역계를 억제하거나, 감소시킨다.
치료 목적을 위한 약학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 미세에멀전, 분산체, 리포좀, 또는 고 농도의 폐쇄-말단 DNA 벡터, 예를 들어 ceDNA 벡터에 적합한 다른 규칙적인 구조로서 제제화될 수 있다. 멸균 주사 용액은 원하는 양의 ceDNA 벡터를 적절한 완충액 중에, 필요한 경우 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 포함시킨 후, 여과 멸균시킴으로써 제조될 수 있다.
ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 국소, 전신, 양막-내, 척추강내, 두개내, 동맥-내, 정맥내, 림프내, 복강내, 피하, 기관지, 조직-내(예를 들어, 근육 내, 심장내, 간내, 신장내, 뇌내), 척추강내, 방광내, 결막내(예를 들어, 안구-외, 안구 내, 안구 뒤, 망막내, 망막하, 맥락막, 맥락막-하, 기질내, 전방내 및 유리체 내), 달팽이관내, 및 점막(예를 들어, 경구, 직장, 비강) 투여에 적합한 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 전달이 또한 고려된다.
일부 양태에서, 본원에 제공된 방법은 ceDNA 벡터를 포함하는 하나 이상의 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 숙주 세포에 전달하는 단계를 포함한다. 또한, 이러한 방법에 의해 생산된 세포, 및 이러한 세포를 포함하거나 이로부터 생산된 유기체(예컨대, 동물, 식물, 또는 진균)도 본원에 제공된다. 핵산의 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션(nucleofection), 미세 주입, 유전자 총(biolistic), 리포좀, 면역리포좀, 다중 양이온 또는 지질: 핵산 접합물, 네이키드 DNA, 및 제제-개선된 DNA의 흡수를 포함할 수 있다. 리포펙션은 예를 들어, 미국 특허 제5,049,386호, 제4,946,787호; 및 제4,897,355호)에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 시판 중이다(예를 들어, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 전달은 세포(예를 들어, 시험관 내 또는 생체 외 투여) 또는 표적 조직(예를 들어, 생체 내 투여)에 대한 것일 수 있다.
핵산을 세포에 전달하는 다양한 기술 및 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터와, 본원에 기재된 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는, 지질 나노 입자(LNP), 리포이드, 리포좀, 지질 나노 입자, 리포플렉스(lipoplex), 또는 코어-쉘 나노입자로 제제화될 수 있다. 전형적으로, LNP는 핵산(예를 들어, ceDNA) 분자, 하나 이상의 이온화 가능하거나 양이온성인 지질(또는 이의 염), 하나 이상의 비이온성 또는 중성 지질(예를 들어, 인지질), 응집을 방지하는 분자(예를 들어, PEG 또는 PEG-지질 접합체), 및 선택적으로 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)로 구성된다.
ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단DNA 벡터, 및 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 세포에 전달하는 다른 방법은, 세포에 의해 내재화되는 리간드에 핵산을 접합시키는 것이다. 예를 들어, 리간드는 세포 표면 상의 수용체에 결합하여 엔도시토시스를 통해 내재화될 수 있다. 리간드는 핵산의 뉴클레오티드에 공유결합으로 연결될 수 있다. 핵산을 세포에 전달하기 위한 예시적인 접합체는, 예를 들어 WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 및 WO2017/177326에 기재되어 있다.
핵산 및 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단DNA 벡터는, 또한 형질감염에 의해 세포에 전달될 수도 있다. 유용한 형질감염 방법에는, 비제한적으로, 지질 매개 형질감염, 양이온성 중합체 매개 형질감염 또는 인산칼슘 침전이 포함된다. 형질감염 시약은 당업계에 잘 알려져 있는데, TurboFect 형질감염 시약(Thermo Fisher Scientific®), Pro-Ject 시약(Thermo Fisher Scientific®), TRANSPASS™ P 단백질 형질감염 시약(New England Biolabs®), CHARIOT™ 단백질 전달 시약(Active Motif), PROTEOJUICE™ 단백질 형질감염 시약(EMD Millipore®), 293fectin, LIPOFECTAMINE™ 2000, LIPOFECTAMINE™ 3000 (Thermo Fisher Scientific®), LIPOFECTAMINE™(Thermo Fisher Scientific®), LIPOFECTIN™(Thermo Fisher Scientific®), DMRIE-C, CELLFECTIN™(Thermo Fisher Scientific®), OLIGOFECTAMINE™(Thermo Fisher Scientific®), LIPOFECTACE™, FUGENE™(Roche®, 스위스 바젤 소재), FUGENE™ HD (Roche®), TRANSFECTAM™(Transfectam, Promega®, 위스콘신주 메디슨 소재), TFX-10™(Promega®), TFX-20™(Promega®), TFX-50™(Promega®), TRANSFECTIN™(BioRad®, 캘리포니아주 허큘리스 소재), SILENTFECT™(Bio-Rad®), Effectene™(Qiagen®, 캘리포니아주 발렌시아 소재), DC-chol(Avanti Polar Lipids), GENEPORTER™(Gene Therapy Systems®, 캘리포니아주 샌디에고 소재), DHARMAFECT 1™(Dharmacon®, 콜로라도주 라파예트 소재), DHARMAFECT 2™(Dharmacon®), DHARMAFECT 3™(Dharmacon®), DHARMAFECT 4™(Dharmacon®), ESCORT™ III(Sigma®, 미주리주 세인트 루이스 소재), 및 ESCORT™ IV(Sigma Chemical Co.)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. ceDNA와 같은 핵산은, 또한 당업자에게 공지된 미세유체 방법을 통해 세포에 전달될 수 있다.
ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 또한 생체 내에서 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수도 있다. 투여는, 비제한적으로, 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하는, 분자를 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적 접촉에 도입하는 데 통상적으로 사용되는 경로 중 임의의 것에 의해 이루어진다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법이 이용 가능하고 당업자에 널리 공지되어 있으며, 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있지만, 특정 경로가 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
ceDNA 벡터를 포함하는 말단-폐쇄 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 도입 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,928,638호에 기재된 방법에 의해, 조혈 줄기 세포로 전달될 수 있다.
ceDNA 벡터를 포함하는 말단-폐쇄 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 전달용 리포좀에 첨가되어, 대상체 내의 세포 또는 표적 기관에 전달될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포좀은 의약품 개발의 맥락에서 약물/치료제 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약학 성분(API)을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다. 예시적인 리포좀 및 리포좀 제제는, 2018년 9월 7일자 제출된 국제 출원 PCT/US2018/050042, 및 2018년 12월 6일자 제출된 국제 출원 PCT/US2018/064242에 개시되어 있는데, “약학적 조성물”이라고 명명된 섹션을 참고하라.
당업계에 알려진 다양한 전달 방법 및 이의 변형은, ceDNA 벡터를 포함하는 말단-폐쇄 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 생체내 또는 시험관내 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는, 표적화된 세포로의 DNA 유입이 용이하도록 기계적, 전기적, 초음파, 유체역학적 또는 레이저 기반 에너지에 의해 세포막에 일시적으로 침투하는 방식으로 전달된다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 세포막을 일시적으로 파괴하거나, 크기 제한 채널을 통해 세포를 밀어 넣거나, 또는 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 전달될 수 있다. 일부 경우에, ceDNA 벡터만 네이키드 DNA로서 피부, 흉선, 심근, 골격근 또는 간세포에 직접 주사된다. 일부 경우에, ceDNA 벡터는 유전자 총에 의해 전달된다. 캡시드 미함유 AAV 벡터로 코팅된 금 또는 텅스텐 구형 입자(직경 1 μm 내지 3 μm)는 가압 가스에 의해 고속으로 가속화되어 표적 조직세포에 침투할 수 있다.
ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 라파마이신 또는 라파마이신 유사체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이, 특히 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 지질 전달 시스템, 예를 들어, 본원에 기재된 리포좀과 함께 제제화된다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 숙련된 의료진에 의해 임의의 원하는 경로로 투여된다. 조성물은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 점막 통과, 국소, 흡입을 통해, 협측 투여를 통해, 흉막내, 정맥내, 동맥-내, 복강내, 피하, 근육 내, 비강내, 척추강내, 및 관절내, 또는 이들의 조합을 포함하는 상이한 경로에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 수의학적 용도로는, 상기 조성물은 정상적인 수의학적 관행에 따라서 적절하게 허용 가능한 제형으로 투여될 수 있다. 수의사는 특정 동물에게 가장 적절한 투여 요법 및 투여의 경로를 용이하게 결정할 수 있다. 조성물은 종래의 주사기, 바늘없는 주사 기기, “미세돌출 충격 유전자 총(microprojectile bombardment gene guns)”, 또는 다른 물리적인 방법, 예컨대 전기천공(“EP”), 수역학적 방법 또는 초음파에 의해 투여될 수 있다.
일부 경우, ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 수역학적 주사에 의해 전달되는데, 이는 임의의 수-용해성 화합물과 입자를 전체 사지의 내부 기관과 골격근으로 직접 세포내 전달하기 위한 단순하고 매우 효율적인 방법이다.
일부 경우, ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 초음파에 의해 막 내 나노 크기의 기공이 DNA 입자를 내부 기관 또는 종양의 세포로 용이하게 세포내 전달할 수 있도록 함으로써, 폐쇄-말단 DNA 벡터의 크기와 농도는 시스템의 효율성에 중요한 역할을 한다. 일부 경우, ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 자기장을 사용하여 핵산을 함유하는 입자를 표적 세포로 집중시키는 마그네토펙션(magnetofection)에 의해 전달된다.
일부 경우에, 양이온성 리포좀/미셀 또는 양이온성 중합체에 속하는 다가양이온성 나노머 입자에 의한 음으로 하전된 핵산의 압축을 포함하는, 예를 들어 나노머 복합체를 사용하는 화학적 전달 시스템이 사용될 수 있다. 전달 방법에 사용되는 양이온성 지질에는, 비제한적으로, 1가 양이온성 지질, 다가 양이온성 지질, 구아닌 함유 화합물, 콜레스테롤 유도체 화합물, 양이온성 중합체(예를 들어, 폴리(에틸렌이민), 폴리-L-리신, 프로타민, 다른 양이온성 중합체) 및 지질-중합체 하이브리드가 포함된다.
A. 엑소좀:
일부 구현예에서, ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 예를 들어 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 엑소좀 내에 패키징되어 전달된다. 엑소좀은 다소포체와 원형질막의 융합 후 세포외 환경으로 방출되는 엔도시토시스 기원의 작은 막 소포이다. 이의 표면은 공여체 세포의 세포막 유래의 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 엑소좀을 생산한 세포의 세포질을 함유하고, 표면에 모세포(parental cell)의 막 단백질을 나타낸다. 엑소좀은 내피세포, B 및 T 림프구, 비만세포(MC)뿐 아니라, 수지상세포(DC)를 포함하는 다양한 세포 유형에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 직경이 10 nm 내지 1 μm, 20 nm 내지 500 nm, 30 nm 내지 250 nm, 50 nm 내지 100 nm인 엑소좀이 사용을 위해 고려된다. 엑소좀은 이의 공여체 세포를 사용하거나 특정 핵산을 도입하는 방식으로 표적세포로의 전달을 위해 단리될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 접근법을 사용하여 본 발명의 캡시드 미함유 AAV 벡터를 함유하는 엑소좀을 생성할 수 있다.
B. 미세입자/나노입자:
일부 구현예에서, ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 본원에 기재된 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는, 지질 나노 입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 지질 나노입자는, 예를 들어 문헌[Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507]에 개시된 바와 같은, 이온화 가능한 아미노 지질(예를 들어, 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트, DLin-MC3-DMA, 포스파티딜콜린(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DSPC), 콜레스테롤 및 코트 지질(폴리에틸렌 글리콜-디미리스토일글리세롤, PEG-DMG)을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 약 10 nm 내지 약 1000 nm이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 300 nm 미만이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 약 10 nm 내지 약 300 nm이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 200 nm 미만이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 약 25 nm 내지 약 200 nm이다. 일부 다른 구현예에서, 치료 핵산 및/또는 면역 억제제를 포함하는 지질 입자는 전형적으로 약 20 nm 내지 약 100 nm, 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 또는 150 nm의 평균 직경을 가져서, 효율적인 전달을 보장한다. 지질 입자를 함유하는 핵산 및 이의 제조 방법은, 예를 들어 PCT/US18/50042, 미국 특허 공개20040142025호 및 제20070042031 호에 개시되어 있고, 상기 문헌의 개시 내용은 본원에 모든 목적을 위해 전문이 참조로서 인용된다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 제제(예를 들어, 다수의 지질 나노입자를 포함하는 조성물)는, 평균 크기(예를 들어, 직경)가 약 70 nm 내지 약 200 nm이고, 전형적으로 평균 크기가 약 100 nm 이하인 크기 분포를 갖는다.
일부 구현예에 의하면, 핵산(예를 들어, 치료 핵산, 연구 목적으로 사용되는 핵산) 및/또는 본 발명의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 포함하는 액체 약학적 조성물은, 지질 입자 내에 제제화될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산을 포함하는 지질 입자는 양이온성 지질로부터 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산을 포함하는 지질 입자는 비-양이온성 지질로부터 형성될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 지질 입자는 핵산 함유 지질 입자인데, 이는 mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭적인 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA (miRNA), 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스 DNA (예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비-바이러스성 합성 DNA 벡터, 폐쇄-말단의 선형 이중체 DNA (ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, doggybone(dbDNA™) DNA 벡터, 최소 면역학적으로 정의된 유전자 발현 (MIDGE)-벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형-공유적으로 폐쇄된 DNA 벡터), 또는 덤벨-형 DNA 최소 벡터(“덤벨 DNA”)로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산을 포함하는 양이온성 지질로부터 형성된다.
당업계에 알려진 다양한 지질 나노입자는, ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터를 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자를 사용하는 다양한 전달 방법은 미국 특허 제9,404,127호, 제9,006,417호 및 제9,518,272호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 금 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 핵산은, 예를 들어 문헌[Ding et al. (2014). Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1075-1083]에 기재된 바와 같이, 금 나노입자에 공유결합에 의해 결합되거나, 금 나노입자에 비-공유결합에 의해 결합될 수 있다(예를 들어, 전하-전하 상호작용에 의해 결합됨). 일부 구현예에서, 금 나노입자-핵산 접합체는, 예를 들어 미국 특허 제6,812,334호에 기재된 방법을 사용하여 생성된다.
C. 접합체
일부 구현예에서, ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 세포 흡수를 증가시키는 제제에 접합(예를 들어, 공유 결합)된다. “세포 흡수를 증가시키는 작용제”는 지질 막을 통한 핵산의 수송을 용이하게 하는 분자이다. 예를 들어, 핵산은 친유성 화합물(예를 들어, 콜레스테롤, 토코페롤 등), 세포 침투 펩타이드(CPP)(예를 들어, 페네트라틴(penetratin), TAT, Syn1B, 등) 및 폴리아민(예를 들어, 스퍼민(spermine))에 접합될 수 있다. 세포 흡수를 증가시키는 작용제의 추가 예는, 예를 들어 문헌[Winkler (2013). Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809]에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 중합체(예를 들어, 중합성 분자), 또는 폴레이트 분자(예를 들어, 엽산 분자)에 접합된다. 일반적으로, 중합체에 접합된 핵산의 전달은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 WO2000/34343 및 WO2008/022309에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 미국 특허 제8,987,377호에 기재된 바와 같이 폴리(아미드) 중합체에 접합된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 기재된 핵산은 미국 특허 제8,507,455호에 기재된 바와 같이 엽산 분자에 접합된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 예를 들어 미국 특허 제8,450,467호에 기재된 탄수화물에 접합된다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 응집을 막기 위해 다른 모이어티와 접합될 수 있다. 이러한 지질 접합물은, PEG-지질 접합물, 예컨대 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 접합물), 디아실글리세롤에 접합된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 접합물), 콜레스테롤에 접합된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 접합된 PEG, 및 세라마이드에 접합된 PEG(예를 들어, 미국 특허 제5,885,613호 참고), 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)- 지질 접합물(예를 들어, POZ-DAA 접합물; 예를 들어, 2010년 1월 13일자 제출된 미국 임시 출원 제61/294,828호, 및 2010년 1월 14일자 제출된 미국 임시 출원 제 61/295,140호 참고), 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA- 지질 접합물), 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. POZ-지질 접합물의 추가적인 예는, PCT 공보 WO 2010/006282에 기재되어 있다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합되거나, 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG 또는 POZ를 지질에 커플링시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있는데, 예를 들어 비-에스테르 함유 링커 모이어티 및 에스테르 함유 링커 모이어티를 포함한다. 특정 바람직한 구현예에서, 비-에스테르 함유 링커 모이어티, 예컨대 아미드 또는 카바메이트가 사용된다. 상기 특허 문헌 각각의 내용은 모든 목적을 위해 본원에 전문이 참조로서 인용된다.
D. 나노캡슐
대안적으로, ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 나노캡슐 제제도 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정적이고 재현 가능한 방식으로 물질을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 회피하기 위해, 이러한 초미세 입자(크기 약 0.1 μm)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이러한 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 사용을 위해 고려된다.
E. 리포좀
ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 리포좀에 첨가되어, 대상체 내의 세포 또는 표적 기관으로 전달될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포좀은 의약품 개발의 맥락에서 약물/치료제 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약학 성분(API)을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다.
리포좀의 형성 및 사용은 대체로 당업계의 숙련자들에게 알려져 있다. 리포좀은 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 갖도록 개발되었다(미국 특허 제5,741,516호). 나아가, 잠재적인 약물 담체로서의 리포좀 및 리포좀 유사 제제의 다양한 방법이 기재되어 있다(미국 특허 제5,567,434호; 제5,552,157호; 제5,565,213호; 제5,738,868호 및 제5,795,587호).
F. 예시적인 리포좀 및 지질 나노입자(LNP) 조성물
ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 하나 이상의 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 리포좀에 첨가되어, 세포, 예를 들어 전이 유전자의 발현이 필요한 세포에 전달될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포좀은 의약품 개발의 맥락에서 약물 / 치료제 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약학 성분(API)을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다.
ceDNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP)는, 각각 전문이 본원에 참조로서 인용된 2018년 9월 7일자 제출된 국제 출원 PCT/US2018/050042, 및 2018년 12월 6일자 제출된 국제 출원 PCT/US2018/064242에 개시되어 있고, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위해 구상된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 면역원성/항원성을 감소시키고, 화합물(들)에 친수성 및 소수성을 제공하고, 투여 빈도를 감소시킬 수 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관능기(소위 “PEG화 화합물”)를 갖는 하나 이상의 화합물을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 또는, 리포좀 제형은 단순히 추가 구성요소로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 포함한다. 이러한 양태에서, PEG 또는 PEG 관능기의 분자량은 62 Da 내지 약 5,000 Da일 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 수시간 내지 수주의 기간에 걸쳐 연장 방출 또는 제어 방출 프로파일로 API를 전달하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 관련 양태에서, 리포좀 제형은 지질 이중층에 의해 결합된 수성 챔버를 포함할 수 있다. 다른 관련 양태에서, 리포좀 제형은 수시간 내지 수주의 기간에 걸쳐 API를 방출하는 승온에서 물리적 전이를 거치는 구성요소로 API를 캡슐화한다.
일부 양태에서, 리포좀 제형은 스핑고미엘린과, 본원에 개시된 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 옵티좀을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 소듐 염, (디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합된 지질, HSPC(수소 첨가된 대두 포스파티딜콜린); PEG(폴리에틸렌 글리콜); DSPE(디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민); DSPC(디스테아로일포스파티딜콜린); DOPC(디올레오일포스파티딜콜린); DPPG(디팔미토일포스파티딜글리세롤); EPC(달걀 포스파티딜콜린); DOPS(디올레오일포스파티딜세린); POPC(팔미토일올레오일포스파티딜콜린); SM(스핑고미엘린); MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜); DMPC(디미리스토일 포스파티딜콜린); DMPG(디미리스토일 포스파티딜글리세롤); DSPG(디스테아로일포스파티딜글리세롤); DEPC(디에루코일포스파티딜콜린); DOPE(디올레오일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), 콜레스테릴 설페이트(CS), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), DOPC(디올레오일-sn-글리세로-포스파티딜콜린) 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 56:38:5의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형의 전체 지질 함량은 2 mg/mL 내지 16 mg/mL이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질 및 PEG화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질 및 PEG화 지질을, 각각, 3:0.015:2의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질과 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, PEG화 지질은 PEG-2000-DSPE이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 DPPG, 대두 PC, MPEG-DSPE 지질 접합체 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 하나 이상의 지질과 에탄올아민 관능기를 함유하는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질, 및 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤 중 하나 이상을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 DOPC/ DEPC; 및 DOPE를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 약학적 부형제, 예를 들어 수크로오스 및/또는 글리신을 추가로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 단일라멜라 또는 다중라멜라 구조의 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 다소포성 입자 및/또는 발포체 기반 입자를 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 통상의 나노입자에 비해 크기가 크고, 크기가 약 150 nm 내지 250 nm인 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 동결 건조된 분말이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 리포좀 외부에 단리된 ceDNA를 갖는 혼합물에 약염기를 첨가하여, 본원에 개시 또는 기재된 ceDNA 벡터로 제조되고 로딩되는 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 첨가는 리포좀 외부의 pH를 대략 7.3으로 증가시키고, API를 리포좀으로 유도한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 리포좀 내부에서 산성인 pH를 갖는 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우에, 리포좀의 내부는 pH 4 내지 6.9, 더욱 바람직하게는 pH 6.5일 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 리포좀내 약물 안정화 기술을 사용하여 제조된 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우에, 중합체성 또는 비중합체성의 고도로 하전된 음이온과, 리포좀내 포획제, 예를 들어 폴리포스페이트 또는 수크로오스 옥타설페이트가 이용된다.
일부 양태에서, 본 개시 내용은 본원에 기재된 ceDNA 벡터와 이온화 가능한 지질을 포함하는 DNA벡터를 포함하는 지질 나노입자를 제공한다. 예를 들어, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허 PCT/US2018/050042(이는 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 바와 같은 방법으로 수득된 ceDNA로 제조되고 로딩되는 지질 나노입자 제형. 이는, 이온화 가능한 지질을 양성자화하고 ceDNA/지질 회합 및 입자의 핵형성에 유용한 에너지를 제공하는, 낮은 pH에서의 에탄올성 지질과 수성 ceDNA의 고에너지 혼합에 의해 달성될 수 있다. 상기 입자는 수성 희석 및 유기 용매의 제거를 통해 추가로 안정화될 수 있다. 상기 입자는 목적하는 수준으로 농축될 수 있다.
일반적으로, 지질 입자는 약 10:1 내지 30:1의 총 지질 대 ceDNA의 (질량 또는 중량)비로 제조된다. 일부 구현예에서, 지질 대 ceDNA 비(질량/질량 비; w/w 비)는 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 수 있다. 본원의 임의의 양태 및 구현예에 의하면, 조성물은 총 지질 대 ceDNA의 비가 약 15:1이다. 본원의 임의의 양태 및 구현예에 의하면, 조성물은 총 지질 대 ceDNA의 비가 약 30:1이다. 본원의 임의의 양태 및 구현예에 의하면, 조성물은 총 지질 대 ceDNA의 비가 약 40:1이다. 본원의 임의의 양태 및 구현예에 의하면, 조성물은 총 지질 대 ceDNA의 비가 약 50:1이다. 지질과 ceDNA의 양은 목적하는 N/P 비, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 N/P 비를 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 지질 입자 제형의 전체 지질 함량은 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/mL 범위일 수 있다.
이온화 가능한 지질은 전형적으로 낮은 pH에서 핵산 카고, 예를 들어 ceDNA를 응축시키고, 막 회합과 푸소겐성(fusogenicity)을 유도하는 데 이용된다. 일반적으로, 이온화 가능한 지질은 산성 조건 하에서, 예를 들어 6.5 이하의 pH에서 양으로 하전되거나 양성자화되는 적어도 하나의 아미노기를 포함하는 지질이다. 이온화 가능한 지질은 또한 본원에서 양이온성 지질로 지칭된다.
예시적인 이온화 가능한 지질은 국제 PCT 특허 공보 WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346, 및 WO2013/086354, 및 미국 특허 공개 US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458, 및 US2013/0195920에 기재되어 있고, 상기 모든 문헌의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조를 갖는 MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다:
Figure pct00011
.
지질 DLin-MC3-DMA는 문헌[Jayaraman et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533]에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 이온성 지질은 WO2015/074085에 기재된 지질 ATX-002이며, 상기 문헌의 내용은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 이온성 지질은 WO2012/040184에 기재된 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민 (화합물 32)이며, 상기 문헌의 내용은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 이온성 지질은 WO2015/199952에 기재된 화합물 6 또는 화합물 22이며, 상기 문헌의 내용은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
비제한적으로, 이온화 가능한 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20% 내지 90%(몰)를 차지할 수 있다. 예를 들어, 이온화 가능한 지질 몰 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20% 내지 70%(몰), 30% 내지 60%(몰) 또는 40% 내지 50%(몰)일 수 있다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol% 내지 약 90 mol%를 차지한다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 비양이온성 지질을 추가로 포함할 수 있다. 비-이온성 지질에는, 양친매성 지질, 중성 지질 및 음이온성 지질이 포함된다. 따라서, 비-양이온성 지질은 중성의 하전되지 않은 지질, 쯔비터이온성(zwitterionic) 지질 또는 음이온성 지질일 수 있다. 비-양이온성 지질은 전형적으로 푸소겐성을 증강시키는 데 이용된다.
본 발명에 기재된 ceDNA 벡터를 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 방법 및 조성물에 사용하기 위해 구상된 예시적인 비-음이온성 지질은, 2018년 9월 7일자 제출된 국제 출원 PCT/US2018/050042, 및 2018년 12월 6일자 제출된 PCT/US2018/064242에 기재되어 있고, 상기 문헌은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
예시적인 비-양이온성 지질은, 국제 출원 공보 WO2017/099823 및 미국 특허 공개 US2018/0028664에 기재되어 있으며, 상기 두 문헌의 내용은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
비양이온성 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0 내지 30%(몰)를 차지할 수 있다. 예를 들어, 비양이온성 지질 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 5% 내지 20%(몰) 또는 10% 내지 15%(몰)이다. 다양한 구현예에서, 이온화 가능한 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1 범위이다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 임의의 인지질을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 지질 나노입자는 막 온전성을 제공하기 위해 스테롤과 같은 구성요소를 추가로 포함할 수 있다.
지질 나노입자에 사용될 수 있는 하나의 예시적인 스테롤은 콜레스테롤 및 이의 유도체이다. 예시적인 콜레스테롤 유도체는, 국제출원 WO2009/127060 및 미국 특허 공개 US2010/0130588에 기재되어 있고, 상기 두 문헌의 내용은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
스테롤과 같은 막 온전성을 제공하는 구성요소는, 지질 나노입자에 존재하는 지질의 0 내지 50%(몰)를 차지할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 구성요소는 지질 나노입자의 총 지질 함량의 20% 내지 50%(몰) 또는 30% 내지 40%(몰)이다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 접합된 지질 분자를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들은 지질 나노입자의 응집을 저해하고/하거나 입체 안정화를 제공하기 위해 사용된다. 예시적인 접합된 지질에는, 비제한적으로, PEG-지질 접합체, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체), 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 구현예에서, 접합된 지질 분자는 PEG-지질 접합체, 예를 들어 (메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합된 지질이다. 예시적인 PEG-지질 접합체에는, 비제한적으로, PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대, l-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라마이드(Cer), PEG화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대, 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(w-메톡시(폴리에톡시)에틸) 부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카르밤, N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 소듐 염, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 추가의 예시적인 PEG-지질 접합체는, 예를 들어 US5,885,613, US6,287,591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224 및 US2017/0119904에 기재되어 있으며, 모든 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 US2018/0028664에 개시된 화합물인데, 상기 문헌의 내용은 본원에 전문이 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 US20150376115 또는 US2016/0376224에 개시되어 있는데, 상기 두 문헌의 내용은 본원에 전문이 참조로서 인용된다.
PEG-DAA 접합체는, 예를 들어 PEG-디라우릴옥시프로필, PEG-디미리스틸옥시프로필, PEG-디팔미틸옥시프로필 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필일 수 있다. PEG-지질은 PEG-DMG, PEG-디라우릴글리세롤, PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테릴글리세롤, PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테릴글리카미드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕시벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르) 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 중 하나 이상일 수 있다. 일부 예에서, PEG-지질은 PEG-DMG, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
PEG 이외의 분자와 접합된 지질이 또한 PEG-지질 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체) 및 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체가 PEG-지질 대신 또는 이에 더하여 사용될 수 있다. 예시적인 접합된 지질, 즉 PEG-지질, (POZ)-지질 접합체, ATTA- 지질 접합체 및 양이온성 중합체-지질은, 국제 특허 출원 공보 WO1996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104, 및 WO2010/006282, 미국 특허 출원 공개 US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115, US2016/0376224, US2016/0317458, US2013/0303587, US2013/0303587, 및 US20110123453, 및 미국 특허 US5,885,613, US6,287,591, US6,320,017, 및 US6,586,559에 기재 되어 있고, 상기 모든 문헌은 본원에 전문이 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 화합물은 치료제일 수 있다. 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 다시 말해서, 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 다시 말해서, 치료제는 치료 목적 및 목적하는 생물학적 작용에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, LNP 내 ceDNA가 암 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 항암제(예를 들어, 화학요법제, 표적화 암치료(비제한적으로, 소분자, 항체, 또는 항체-약물 접합체 포함)일 수 있다. 또 다른 예에서, ceDNA를 함유하는 LNP이 감염의 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 항미생물제(예를 들어, 항생제 또는 항바이러스 화합물)일 수 있다. 또 다른 예에서, ceDNA를 함유하는 LNP이 면역 질환 또는 장애의 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 면역 반응을 조절하는 화합물(예를 들어, 면역억제제, 면역자극 화합물 또는 하나 이상의 특정 면역 경로를 조절하는 화합물)일 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 단백질 또는 상이한 화합물, 예컨대 치료제를 인코딩하는 ceDNA와 같은 상이한 화합물을 함유하는 상이한 지질 나노입자의 상이한 칵테일이, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 추가 화합물은 면역 조절제이다. 예를 들어, 추가 화합물은 면역억제제이다. 일부 구현예에서, 추가 화합물은 면역 자극제이다.
또한, 본원에 기재된 지질 나노입자-캡슐화된 ceDNA 벡터, 및 라파마이신 또는 라파마이신 유사체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 또한, 지질 나노입자-캡슐화된 ceDNA 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공되는데, 이 경우 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 본원에 기재된 다른 조성물 내에서 대상체에 공동-투여된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 약학적 부형제를 추가로 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 제형은 수크로오스, 트리스, 트레할로오스 및/또는 글리신을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터, 및 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 하나 이상의 억제제는, 입자의 지질 부분과 복합체를 이루거나, 지질 나노입자의 지질 위치 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 포함하는 DNA 벡터는, 지질 나노입자의 지질 위치 내에 완전히 캡슐화됨으로써, 예를 들어 수용액에서 뉴클레아제에 의한 분해로부터 자신을 보호할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 내의 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 포함하는 DNA 벡터는, 37℃에서 지질 나노입자를 뉴클레아제에 적어도 약 20분, 30분, 45분 또는 60분 동안 노출시킨 후에도, 실질적으로 분해되지 않는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 내 ceDNA는 상기 입자를 혈청에서 37℃에서 적어도 약 30분, 45분 또는 60분, 또는 적어도 약 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간 또는 36시간 동안 배양한 후 실질적으로 분해되지 않는다.
특정 구현예에서, 지질 나노입자는 대상, 예를 들어 인간과 같은 포유류에 실질적으로 비독성이다. 일부 양태에서, 지질 나노입자 제형은 동결 건조된 분말이다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 고체 코어 입자이다. 다른 구현예에서, 지질 나노입자는 비(非)이중층 구조, 즉, 비(非)라멜라(즉, 비이중층) 형태를 갖는다. 비제한적으로, 비이중층 형태는, 예를 들어 3차원 튜브, 막대, 입방 대칭 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자의 형태(라멜라 대 비라멜라)는, 예를 들어 US2010/0130588에 기재된 바와 같은 Cryo-TEM 분석을 사용하여 용이하게 평가 및 특징분석될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 추가의 구현예에서, 비라멜라 형태를 갖는 지질 나노입자는 전자 밀도가 높다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 단일라멜라 또는 다중라멜라 구조의 지질 나노입자를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 다소포성 입자 및/또는 발포체 기반 입자를 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다.
지질 구성요소의 조성 및 농도를 제어하는 방식으로, 지질 접합체가 지질 입자로부터 교환되는 속도, 및 결국, 지질 나노입자가 푸소겐성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 또한, 예를 들어 pH, 온도 또는 이온 강도를 포함하는 다른 변수를 사용하여, 지질 나노입자가 푸소겐성이 되는 속도를 변화시키고/시키거나 제어할 수 있다. 지질 나노입자가 푸소겐성이 되는 속도를 제어하는 데 사용될 수 있는 다른 방법이, 본 개시내용을 기반으로 당업자에게 명백할 것이다. 지질 접합체의 조성 및 농도를 제어하여 지질 입자 크기를 제어할 수 있다는 것이 또한 명백할 것이다. 제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관관계가 있을 수 있다(문헌[Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533]; 문헌[Semple et al., Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)] 참조, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨). pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다. 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 검정을 사용하여 지질 나노입자에서 결정될 수 있다.
VI. 면역 반응의 억제제
면역 반응의 억제제(inhibitors or the immune response)가 본원에 제공된다. 구현예에 의하면, 면역 반응의 억제제는 선천적 면역 반응의 억제제이다.
라파마이신 또는 라파마이신 유사체
일부 양태에 의하면, 본 개시 내용은 라파마이신 또는 라파마이신 유사체와 함께 투여된 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA 벡터)를 제공한다. 일부 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 WO 2016/073799에 기재된 합성 나노담체 내에 과-포화량으로 존재한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 또한 동일한 나노담체 내에 존재한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 ceDNA 벡터와 함께 대상체에 공동-투여된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, ceDNA 벡터 및 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 단일 제형으로 함께 공동-투여된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 WO 2016/073799에 기재된 합성 나노담체 내에 과포화된 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 또한 동일한 나노담체 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 지질 나노 입자 내에 제제화된 ceDNA 벡터는 또한 동일한 나노담체 내에 존재한다.
일부 구현예에서, 라파마이신 유사체는 당업계에 알려진 임의의 라파마이신 유사체, 예컨대 미국 특허 제5,138,051호, 또는 WO 2017/040341에 기재된 임의의 라파마이신 유사체이며, 상기 문헌 각각의 내용은 본원에 전문이 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 라파마이신 유사체는 이하에 나타난 화학식 I의 화합물이다:
Figure pct00012
일부 구현예에서, 라파마이신 유사체는 화학식 II의 화합물이며, 여기에서 화학식 I의 C-33의 치환기의 배치는 이하에 나타나 바와 같이 R 배치이다:
Figure pct00013
일부 구현예에서, 라파마이신 유사체는 이하에 나타난 화학식 III의 화합물:
Figure pct00014
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 상기 화학식에서: R1은 OH 또는 OCH3이고, R2는 H 또는 F이고, R3는 H, OH, 또는 OCH3이고; R4는 OH 또는 OCH3이다.
일부 구현예에서, 라파마이신 유사체는 이하에 나타난 화학식 IV의 단일 부분입체이성질체로서의, 순수한 키랄 형태의 화학식 III의 화합물이다:
Figure pct00015
일부 구현예에서, 라파마이신 유사체는 이하에 나타난 화학식 V의 단일 부분입체이성질체로서의, 순수한 키랄 형태의 화학식 III의 화합물이다:
Figure pct00016
일부 구현예에서, 라파마이신 유사체는 이하에 나타난 화학식 VI의 단일 부분입체이성질체로서의, 순수한 키랄 형태의 화학식 III의 화합물이다:
Figure pct00017
일부 구현예에서, 라파마이신 유사체는 이하에 나타난 화학식 VII의 단일 부분입체이성질체로서의, 순수한 키랄 형태의 화학식 III의 화합물이다:
Figure pct00018
일부 구현예에서, 라파마이신 유사체는 이하에 나타난 화학식 VIII의 단일 부분입체이성질체로서의, 순수한 키랄 형태의 화학식 III의 화합물이다:
Figure pct00019
일부 구현예에서, 라파마이신 유사체는 이하에 나타난 화학식 IX의 화합물:
Figure pct00020
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이고, 상기 화학식에서 R2는 H 또는 F이고, R3는 OH, 또는 OCH3이고; R4는 OCH3 또는 OH이다. 특정 구현예에서, R4는 OCH3이다. 특정 구현예에서, R4는 OCH3이고, R2는 F이고, R3는 OCH3이다. 특정 구현예에서, R4는 OCH3 이고, R2는 H이고, R3는 OH이다. 특정 구현예에서, R2 is H, R3 is H이고, R4는 OH이다. 다양한 구현예에서, 화학식 IX의 화합물은 라세미 혼합물로서 존재한다.
따라서, 일부 구현예에서, 라파마이신 유사체는 화학식 I-IX 또는 이의 유도체 중 어느 하나로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 본원에 전문이 참조로서 인용된 WO 2016/073799에 기재된 바와 같은 합성 나노담체를 사용하여 전달 또는 투여된다.
WO 2016/073799에 기재된 바와 같이, 상기 제형 내의 라파마이신의 용해도 제한 대비, 합성 나노담체 형성 동안의 제형 내의 라파마이신의 농도는, 생성된 합성 나노담체가 면역 관용을 유도하는 능력에 유의한 영향을 미칠 수 있다. 또한, 이러한 라파마이신이 합성 나노담체를 통해 어떻게 분산될 것인지는, 생성된 합성 나노담체가 초기에 멸균 여과될 수 있는지 여부에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 형성된 나노담체 현탁제 내에서의 이의 용해도를 초과하는 농도의 라파마이신을 생성하는 조건 하에서 생성된 나노담체가, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용된다. 이러한 합성 나노담체는 더욱 지속적인 면역 관용을 위해 제공되고, 초기에 멸균 여과될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 소수성 폴리에스테르 담체 물질과 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 포함하는 합성 나노담체를 포함하는 조성물과 함께 공동-투여되고, 여기에서 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 제공된 소수성 폴리에스테르 담체 물질의 중량 대비, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 중량을 기준으로 50 중량% 미만의 안정한 과-포화량으로 합성 나노담체 중에 존재한다.
본원에 제공된 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 중량은 합성 나노담체의 제제화 동안 조합되는 물질들의 레시피(recipe) 중량이다. 본원에 제공된 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 중량은 생성된 합성 나노담체 조성물 내의 물질의 중량이다.
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 45 중량% 미만의 안정한 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 40 중량% 미만의 안정한 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 35 중량% 미만의 안정한 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 30 중량% 미만의 안정한 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 25 중량% 미만의 안정한 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 20 중량% 미만 미만의 안정한 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 15 중량% 미만의 안정한 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 10 중량% 미만의 안정한 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 7 중량% 초과의 안정한 과-포화량으로 존재한다.
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 소수성 폴리에스테르 담체 물질은 PLA, PLG, PLGA 또는 폴리카프로락톤을 포함한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 소수성 폴리에스테르 담체 물질은 PLA-PEG, PLGA-PEG 또는 PCL-PEG를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 합성 나노담체 내의 소수성 폴리에스테르 담체 물질의 양은, 총 고체 대비 소수성 폴리에스테르 담체 물질이 5 내지 95 중량%이다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 합성 나노담체 내의 소수성 폴리에스테르 담체 물질의 양은, 총 고체 대비 소수성 폴리에스테르 담체 물질이 60 내지 95 중량%이다.
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 합성 나노담체는 10 이하의 HLB 값을 갖는 비-이온성 계면활성제를 추가로 포함한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 10 이하의 HLB 값을 갖는 비-이온성 계면활성제는 소르비탄 에스테르, 지방 알콜, 지방산 에스테르, 에톡시화 지방 알콜, 폴록사머, 지방산, 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체, 또는 담즙산 또는 염을 포함한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 10 이하의 HLB 값을 갖는 비-이온성 계면활성제는 SPAN 40, SPAN 20, 올레일 알콜, 스테아릴 알콜, 이소프로필 팔미테이트, 글리세롤 모노스테아레이트, BRIJ 52, BRIJ 93, Pluronic P-123, Pluronic L-31, 팔미트산, 도데칸산, 글리세릴 트리팔미테이트 또는 글리세릴 트리리놀레에이트를 포함한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 10 이하의 HLB 값을 갖는 비-이온성 계면활성제는 SPAN 40이다.
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 10 이하의 HLB 값을 갖는 비-이온성 계면활성제는 합성 나노담체 내에 캡슐화되거나, 합성 나노담체의 표면 상에 존재하거나, 또는 둘 다이다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 10 이하의 HLB 값을 갖는 비-이온성 계면활성제의 양은, 소수성 폴리에스테르 담체 물질 대비 10 이상의 HLB 값을 갖는 비-이온성 계면활성제가 0.1 중량% 초과, 15 중량% 미만이다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 10 이하의 HLB 값을 갖는 비-이온성 계면활성제의 양은, 소수성 폴리에스테르 담체 물질 대비 10 이상의 HLB 값을 갖는 비-이온성 계면활성제가 1 중량% 초과, 13 중량% 미만이다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 10 이하의 HLB 값을 갖는 비-이온성 계면활성제의 양은, 소수성 폴리에스테르 담체 물질 대비 10 이상의 HLB 값을 갖는 비-이온성 계면활성제가 1 중량% 초과, 9 중량% 미만이다.
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 조성물은 초기에 0.22 μm 필터를 통해 멸균 여과될 수 있다.
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 합성 나노담체의 동적 광 산란을 사용하여 얻은 입자 크기 분포의 평균은, 120 nm 초과의 직경이다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 직경은 150 nm 초과이다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 직경은 200 nm 초과이다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 직경은 250 nm 초과이다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 직경은 300 nm 미만이다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 직경은 250 nm 미만이다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 직경은 200 nm 미만이다.
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 합성 나노담체 내에 캡슐화된다.
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 소수성 폴리에스테르 담체 물질 내의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 포화 한계를 적어도 1% 초과하는 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 소수성 폴리에스테르 담체 물질 내의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 포화 한계를 적어도 5% 초과하는 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 소수성 폴리에스테르 담체 물질 내의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 포화 한계를 적어도 10% 초과하는 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 소수성 폴리에스테르 담체 물질 내의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 포화 한계를 적어도 15% 초과하는 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 소수성 폴리에스테르 담체 물질 내의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 포화 한계를 적어도 20% 초과하는 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 소수성 폴리에스테르 담체 물질 내의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 포화 한계를 적어도 25% 초과하는 과-포화량으로 존재한다. 본원에 제공된 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체는 소수성 폴리에스테르 담체 물질 내의 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 포화 한계를 적어도 30% 초과하는 과-포화량으로 존재한다.
본원에 제공된 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 일 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양은 포화 한계를 적어도 1% 초과한다. 다른 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양은 포화 한계를 적어도 5% 초과한다. 다른 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양은 포화 한계를 적어도 10% 초과한다. 다른 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양은 포화 한계를 적어도 15% 초과한다. 다른 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양은 포화 한계를 적어도 20% 초과한다. 다른 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양은 포화 한계를 적어도 25% 초과한다. 다른 구현예에서, 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 양은 포화 한계를 적어도 30% 초과한다.
cGAS의 억제제
일부 양태에 의하면, 본 개시 내용은 하나 이상의 cGAS 길항제와 함께 투여된, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA)를 제공한다. 또한, 부분적으로, 하나 이상의 cGAS 억제성 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 ceDNA 제작물도 본원에 제공된다.
cGAS는 사이토졸 DNA에 의해 유발되는 다른 부류의 PRR인데, 이는 DNA에 결합하여, 인터페론 유전자의 ER-행 자극제(STING)를 활성화한다. 이것은 타입 I 인터페론 반응을 활성화하고, 일부 경우, Absent in Melanoma (AIM2), IFN-γ-유도성 단백질 16 (IFI16), 인터페론-유도성 단백질 X (IFIX), LRRFIP1, DHX9, DHX36, DDX41, Ku70, DNA-PKcs, MRN 복합체 (MRE11, Rad50 및 Nbs1 포함) 및 RNA 중합효소 III를 포함하는 다른 제안된 사이토졸 DNA 센서를 활성화한다. AIM2, IFI16, 및 IFIX는 피린 및 HIN200 도메인 단백질 (PYHIN) 단백질이다. 또한, 인간 면역결핍성 바이러스 타입 1 (HIV-1)로부터 유래한 단일-가닥 DNA (ssDNA)의 스템-루프 구조로서의 짧은 염기-쌍 DNA 스트레치에 측접하는 짝을 이루지 않은 DNA 뉴클레오티드는, 타입 I 인터페론-유도 DNA 센서 cGAS를 서열-의존성 방식으로 활성화한다고 나타났다. 짧은(12- bp 내지 20-bp) dsDNA (Y-형 DNA)에 측접하는 짝을 이루지 않은 구아노신을 함유하는 DNA 구조는, 매우 자극적이며, 특히 cGAS의 효소 활성을 향상시킨다
cGAS는 양쪽 DNA 가닥의 당-포스페이트 골격과의 상호작용에 의해 DNA에 직접 결합한다(S.R. Paluden. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2015. 79(2): 225). 이것은 효소에 배치상의 변화를 유발하여, 뉴클레오티드 기질 ATP 및 GTP를 활성 부위에 접근하게 하여, cGAMP를 합성한다 (A. Dempsey and A.G. Bowie, Virology 2015 May, 0: 146-152). 이후, cGAMP는 STING에 결합하여, 타입 I 인터페론 생산을 유도한다(A. Dempsey and A.G. Bowie, Virology 2015 May, 0: 146-152). 중요한 것은, cGAS가 DNA 포스페이트 골격을 통해 단독으로 dsDNA와 접촉하여, 뉴클레오티드 서열-독립적인 감지(sensing)로 이어진다는 점이다(A. Dempsey and A.G. Bowie, Virology 2015 May, 0: 146-152). 또한, cGAS는 인간 면역결핍성 바이러스 타입 1(HIV-1)로부터 유래된 단일-가닥 DNA (ssDNA)의 스템-루프 구조로서 12 내지 20 bp의 짧은 염기-쌍의 DNA 스트레치에 측접하는, 짝을 이루지 않은 DNA 뉴클레오티드, 특히 구아노신에 의해 활성화될 수 있다고 나타났다(문헌[M.H. Christnesen and S.R. Paluden. Cellular and Molecular Immunology. 2017. 14:4-13]; 문헌[A-M Herzner et al., 2015. Nature Immunology]).
따라서, PRR에 의한 선천성 면역 활성화에 중요한 ceDNA의 구조적인 특징은, Rep-결합 부위 (RBS) 및 말단 분해 부위 (TRS)를 포함하는 변형된 AAV 역위 말단 반복 서열(ITR); ITR 내의 헤어핀 서열; RBS의 CG가 풍부한 특성; DNA 메틸화의 부재; 및 예를 들어 단일-가닥 루프 DNA를 가질 수 있는 측접하는 ITR들을 갖는 선형 이중체 DNA 구조를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, cGAS의 억제제는 ceDNA와 함께 대상체에 공동 투여된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, cGAS의 억제제가 RNA 또는 단백질 서열인 경우, ceDNA는 cGAS의 RNA 또는 단백질 억제제를 인코딩한다.
일부 구현예에서, cGAS의 억제는 항말라리아 약이다(J. An et al., J. Immunol. 2015년 3월 27일). 일부 구현예에서, 항말라리아 약은 아미노퀴놀린-계 또는 아미노아크리딘-계 항말라리아 약이다(J. An et al., J. Immunol. 2015년 3월 27일). 일부 구현예에서, 항말라리아 약은 퀴나크린(QC), 9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘(AMCA), 히드록시클로로퀸(HCQ), 및 클로로퀸(CQ)으로부터 선택된다(J. An et al., J. Immunol. March 27, 2015).
일부 구현예에서, cGAS의 억제제는 cGAS의 촉매성 포켓에 결합하는 소분자 화합물이다 (J. Vincent et al., Nature Communications, 8:750). 일부 구현예에서, cGAS의 촉매성 포켓에 결합하는 소분자 화합물은 RU166365, RU281332, RU320521, RU320519, RU320461, RU320462, RU320520, RU320467, 및 RU320582 로부터 선택된다(J. Vincent et al., Nature Communications, 8:750). 일부 구현예에서, cGAS의 촉매성 포켓에 결합하는 소분자 화합물은 RU320521이다 (J. Vincent et al., Nature Communications, 8:750). 일부 구현예에서, cGAS의 촉매성 포켓에 결합하는 소분자 화합물은 화합물 15, 화합물 16, 화합물 17, 화합물 18, 화합물 19, 및 PF-06928215 로부터 선택된다 (J. Vincent et al., Nature Communications, 8:750; PLOS ONE. 2017년 9월 21일). 일부 구현예에서, cGAS의 촉매성 포켓에 결합하는 소분자 화합물은 PF-06928215이다 (PLOS ONE. 2017년 9월 21일)
일부 구현예에서, cGAS의 억제제는 US20160068560에 기재된 임의의 소분자 화합물이며, 상기 문헌의 내용은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, cGAS의 억제제는 대상체에 투여된 ceDNA(예를 들어, ceDNA의 추후 전달 포함)에 의해 인코딩된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 ceDNA에 의해 인코딩된 cGAS의 억제제는, MAAPRGRPKKDLTMEDLTAKISQLTVENRELRKALGSTADPRDRPLTATEKEAQLTATVGALSAAAAKKIEARVRTIFSKVVTQKQVDDALKGLSLRIDVCMSDGGTAKPPPGANNRRRRGASTTRAGVDD (서열번호: 882)의 아미노산 서열을 갖는 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스 단백질 ORF52 또는 cGAS를 억제하는 이의 변형체이다 (M.H. Christnesen and S.R. Paluden. Cellular and Molecular Immunology. 2017. 14:4-13). 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 ceDNA에 의해 인코딩된 cGAS의 억제제는, ORF52의 감마헤르페스바이러스의 병렬 상동체(ortholog)이다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 ceDNA에 의해 인코딩된 cGAS의 억제제는, 본원에서 또한 “세포질 LANA 동형체”라고도 지칭되는 카포시 육종 헤르페스바이러스 LANA의 세포질 동형체(잠복-관련 핵 항원), 또는 cGAS를 억제하는 이의 변형체이다 (Zhang G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Feb 23;113(8):E1034-43). LANA 또는 ORF73는 이하의 1129개 아미노산의 서열을 갖는다: MAPPGMRLRSGRSTGAPLTRGSCRKRNRSPERCDLGDDLHLQPRRKHVADSVDGRECGPHTLPIPGSPTVFTSGLPAFVSSPTLPVAPIPSPAPATPLPPPALLPPVTTSSSPIPPSHPVSPGTTDTHSPSPALPPTQSPESSQRPPLSSPTGRPDSSTPMRPPPSQQTTPPHSPTTPPPEPPSKSSPDSLAPSTLRSLRKRRLSSPQGPSTLNPICQSPPVSPPRCDFANRSVYPPWATESPIYVGSSSDGDTPPRQPPTSPISIGSSSPSEGSWGDDTAMLVLLAEIAEEASKNEKECSENNQAGEDNGDNEISKESQVDKDDNDNKDDEEEQETDEEDEEDDEEDDEEDDEEDDEEDDEEDDEEDDEEEDEEEDEEEDEEEDEEEEEDEEDDDDEDNEDEEDDEEEDKKEDEEDGGDGNKTLSIQSSQQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQDEQQQDEQQQDEQQQDEQQQDEQQQDEQQQDEQQQDEQEQQDEQQQDEQQQQDEQEQQEEQEQQEEQQQDEQQQDEQQQDEQQQDEQEQQDEQQQDEQQQQDEQEQQEEQEQQEEQEQQEEQEQQEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQEQELEEVEEQEQEQEEQELEEVEEQEQEQEEQEEQELEEVEEQEEQELEEVEEQEEQELEEVEEQEQQGVEQQEQETVEEPIILHGSSSEDEMEVDYPVVSTHEQIASSPPGDNTPDDDPQPGPSREYRYVLRTSPPHRPGVRMRRVPVTHPKKPHPRYQQPPVPYRQIDDCPAKARPQHIFYRRFLGKDGRRDPKCQWKFAVIFWGNDPYGLKKLSQAFQFGGVKAGPVSCLPHPGPDQSPITYCVYVYCQNKDTSKKVQMARLAWEASHPLAGNLQSSIVKFKKPLPLTQPGENQGPGDSPQEMT(서열번호: 883).
본원에 기재된 ceDNA와 함께 사용하기 위한 절단된 세포질 LANA 동형체의 비-제한적인 예는, LANAΔ161 또는 (서열번호: 884의 아미노산 161 내지 1162가 결핍된) 서열번호: 532이다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, cGAS의 억제제는 cGAS에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, cGAS에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편은 ceDNA에 의해 인코딩된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, cGAS의 억제제는 cGAS의 RNA 억제제, 예컨대 cGAS에 특이적인 siRNA이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, RNA cGAS의 억제제는 ceDNA에 의해 인코딩된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, cGAS의 억제제는 cGAS의 miRNA 억제제, 예컨대 miR-25 (GGCCAGTGTTGAGAGGCGGAGACTTGGGCAATTGCTGGACGCTGCCCTGGGCATTGCACTTGTCTCGGTCTGACAGTGCCGGCC; 서열번호: 885) 및 miR-93 (CTGGGGGCTCCAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAGTGTGATTACCCAACCTACTGCTGAGCTAGCACTTCCCGAGCCCCCGG; 서열번호: 886)이다11. miR-25 및 miR-93은 cGAS 발현의 기저 수준을 유지하여 cGAS의 억제를 유도하는 후생 인자인, 핵 수용체 공동활성자 3 (NCOA3)을 표적화하는 것으로 생각된다 (Wu et al. 2017. Nat. Cell Biol. 19(10):1286-1296). 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, miRNA cGAS의 억제제는 ceDNA에 의해 인코딩된다.
TLR의 억제제
일부 양태에 의하면, 본 개시 내용은 하나 이상의 TLR 길항제와 함께 투여된, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA벡터(ceDNA)를 제공한다. 또한, 부분적으로, 하나 이상의 TLR 억제성 올리고뉴클레오티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 ceDNA 제작물이 본원에 제공된다. 일부 양태에 의하면, 본 개시 내용은 하나 이상의 TLR9 길항제와 함께 투여된, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA)를 제공한다. 또한, 부분적으로 하나 이상의 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 ceDNA 제작물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에 의하면, TLR9 억제제는 소분자 길항제이다. 다른 구현예에서, TLR9 억제제는 TLR9에 대한 항체이다. 일부 구현예에 의하면, TLR9 항체는 단일 클론 항체이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, ceDNA의 하나 이상의 말단 구조 요소, 예컨대 ITR 서열은, TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드는 이하의 특징들 중 하나 이상을 갖는다: (i) 3’ 말단의 3개의 연속 G 뉴클레오티드; (ii) 5’ 말단의 CC(T) 삼중체; (iii) 5’ CC(T)와 다운스트림 GGG 삼중체 사이의 거리는 선택적으로 3 내지 5개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드는 5’CCTN(3-5)G(3-5)RR3’의 서열(서열번호: 887)을 갖는다. 일부 구현예에서, TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드는 인접하는 G들 사이에 사슬내 및/또는 사슬간 Hoogsten 수소 결합을 갖지 않는다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드는 G4 스태킹(stacking) 특징을 갖는 부류 G의 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드이며, 다수의 G3 삼중체 또는 G4 사중체, 예컨대 TTAGGGn(서열번호: 888)를 포함하는 억제성 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 부류 G의 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드의 비-제한적인 예는, ODN-2088(TCCTGGCGGGGAAGT, 서열번호: 889), ODN-2114(TCCTGGAGGGGAAGT, 서열번호: 890), 폴리-G(GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, 서열번호: 891), ODN-A151(TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG, 서열번호: 892), G-ODN(CTCCTATTGGGGGTTTCCTAT, 서열번호: 893), 및 IRS-869(TCCTGGAGGGGTTGT, 서열번호: 894) 및 AS1411(GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG, 서열번호: 903)를 포함한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드는 회문 구조이고/이거나 짧은 5’ 또는 3’ 돌출부를 포함하는 특징을 갖는 부류 R의 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드, 예컨대 INH-1 억제성 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 부류 R의 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드의 비-제한적인 예는, INH-1 (CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG, 서열번호: 895), INH-4 (TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA, 서열번호: 896), 및 IRS-661 (TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA, 서열번호: 897)를 포함한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드는 선형 특징과 5’ CC(T) →GGG-3’ 모티프를 갖는 부류 B의 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드, 예컨대 INH-18 억제성 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 부류 B의 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드의 비-제한적인 예는, ODN-2088 (TCCTGGCGGGGAAGT, 서열번호: 889), ODN-2114 (TCCTGGAGGGGAAGT, 서열번호: 890), 4024 (TCCTGGATGGGAAGT, 서열번호: 898), 4084F (CCTGGATGGGAA, 서열번호: 899), INH-13 (CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA, 서열번호: 900), INH-18 (CCTGGATGGGAACTTACCGCTGCA, 서열번호: 901), G-ODN (CTCCTATTGGGGGTTTCCTAT, 서열번호: 893), IRS-869 (TCCTGGAGGGGTTGT, 서열번호: 864), IRS-954 TGCTCCTGGAGGGGTTGT, 서열번호: 902), 및 AS1411 (GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG, 서열번호: 903)를 포함한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, ceDNA에 의해 인코딩되는 코딩 서열, 예컨대 전이유전자 서열은, 선택된 아미노산에 대한 코돈 삼중체 내에 할당된 CpG 디-뉴클레오티드가 CpG 디-뉴클레오티드가 결핍된 동일한 아미노산에 대한 코돈 삼중체로 변화하도록 변형된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9의 억제제가 RNA 또는 단백질 서열인 경우, ceDNA는 TLR9의 RNA 또는 단백질 억제제를 인코딩한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9의 억제제는 TLR9에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편은 ceDNA에 의해 인코딩된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9의 억제제는 ceDNA와 함께 대상체에 공동-투여된다. TLR9의 억제제의 비-제한적인 예는, 문헌[“Classification, Mechanisms of Action, and Therapeutic Applications of Inhibitory Oligonucleotides for Toll-Like Receptors (TLR) 7 and 9,” P.S. Lenert, Mediators of Inflammation, Vol. 2010, 986596]; US20150203850; 및 US2017026800에서 찾아볼 수 있고, 상기 각 문헌의 내용은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
따라서, 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9의 억제제는 ceDNA와 함께 대상체에 공동-투여된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9의 억제제는 대상체에 투여되는 ceDNA(예를 들어, ceDNA의 추후 전달 포함)에 의해 시스(cis) 작용으로 인코딩된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9의 억제제는 대상체에 투여되는 ceDNA에 의해 트랜스(trans) 작용으로 인코딩된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9의 억제제는 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드이다
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드는 이하의 특징들 중 하나 이상을 갖는다: (i) 3’ 말단의 3개의 연속 G 뉴클레오티드; (ii) 5’ 말단의 CC(T) 삼중체; (iii) 5’ CC(T)와 다운스트림 GGG 삼중체 사이의 거리는 선택적으로 3 내지 5개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드는 5’CCTN(3-5)G(3-5)RR3’의 서열(서열번호: 887)을 갖는다. 일부 구현예에서, TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드는 인접하는 G들 사이에 사슬내 및/또는 사슬간 Hoogsten 수소 결합을 갖지 않는다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9의 억제제는 TLR9에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편은 ceDNA에 의해 인코딩된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TLR9의 억제제는 엔도좀 산성화의 억제제, 예를 들어, 클로로퀸이다.
인플라마좀 길항제
NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제:
일부 구현예에서, 인플라마좀 길항제는 NLRP3을 억제한다. 크리오피린(cryopyrin)으로도 또한 지칭되는 "NLRP3"라는 용어는, NOD-유사 수용체 패밀리인 피린 도메인 함유 3) 인플라마좀, 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3 (NALP3)를 지칭하며, 이는 또한 크리오피린, 추위 유도 자가염증 증후군 1 (CIAS1), 애벌레-유사 수용체 1.1 (CLR1.1) 또는 피린 도메인-함유 Apafl-유사 단백질 1 (PYPAF1)로도 알려져 있다. NALP3은 또한 이하의 별칭(alias)으로도 알려져 있다: NLRP3 PYD-NACHT-NAD-LRR NALP3 Cias1, Pypaf1, Mmig1 PYD-NACHT-NAD-LRR.). NLRP3는 NLRP3 단백질, ASC (어팝토시스-관련 스펙(speck)-유사 단백질 함유 CARD) 및 프로-카스파제 1으로 이루어지는 다중 단백질 올리고머의 구성 요소이다.
본원의 방법 및 조성물에 사용하기 위해 포함된 NLRP3 억제제는, 문헌[Shao, Bo-Zong, et al. “NLRP3 inflammasome and its inhibitors.” Frontiers in pharmacology 6 (2015): 262.], 및 문헌[Wang et al., Lab investigation, 2017, 97; 922-934]에 기재되어 있고, 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀의 억제제는 MCC950 또는 이의 기능성 유도체이다. MCC950는 이하의 화학식을 갖고:
Figure pct00021
NLRP3의 강력하고 선택적인 억제제이다. MCC950은 인플라마좀 어뎁터 단백질 ASC(어팝토시스-관련 스펙-유사 단백질 함유 CARD)의 올리고머화를 방해함으로써, NLRP3 활성자, 예컨대 ATP, MSU 및 니게리신(nigericin)에 의해 유도된 IL-1β의 방출을 차단한다(문헌[Coll RC. et al., 2015. A small-molecule inhibitor of the NLRP3 inflammasome for the treatment of inflammatory diseases. Nature Med 21(3), 248-255.]; 문헌[Guo H. et al., 2015. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21(7):677-87]; 문헌[Ren, Honglei, et al. “Selective NLRP3 (Pyrin Domain-Containing Protein 3) Inflammasome Inhibitor Reduces Brain Injury After Intracerebral Hemorrhage.” Stroke (2017): STROKEAHA-117.]).
일부 구현예에서, 이하와 같은 구조를 갖는 NLRP3 인플라마좀의 억제제는 이하와 같은 구조를 갖는 베이(Bay)11-7082이며:
Figure pct00022
NF-κB 활성에 대한 이들의 억제 효과와는 별개로, 대식 세포에서 NLRP3 인플라마좀 활성을 선택적으로 억제한다고 보고되었다(Juliana C. et al, 2010. Anti-inflammatory Compounds Parthenolide and Bay11-7082 Are Direct Inhibitors of the Inflammasome. J. Biol Chem. 285(13): 9792-9802].
일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀의 억제제는 이하와 같은 구조를 갖는 글리벤클라미드(Glybenclamide)(또한, 글리부리드(glyburide)로도 알려짐)이며:
Figure pct00023
K+ efflux를 억제함으로써, 카스파제-1 및 프로-IL-1β의 성숙을 차단한다 (Laliberte RE. et al., 1999. ATP treatment of human monocytes promotes caspase-1 maturation and externalization. J Biol Chem. 274(52):36944-51). 글리벤클라미드는 또한 PAMP, DAMP 및 결정성 물질에 의해 유도된 NRLP3 인플라마좀의 활성화를 강력히 차단한다(문헌[Lamkanfi M. et al., 2009. Glyburide inhibits the Cryopyrin/Nalp3 inflammasome. J. Cell Biol., 187: 61 - 70]; 문헌[Dostert C. et al., 2009. Malarial hemozoin is a Nalp3 inflammasome activating danger signal. PLoS One. 4(8): e6510)].
일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀의 억제제은 이하와 같은 구조를 갖는 이소리퀴리티게닌(isoliquiritigenin)(또한, ILG로도 알려짐)이며:
Figure pct00024
이는 감초(licorice root) (Glycyrrhiza uralensis)로부터 분리된 칼콘(chalcone)-타입의 플라보노이드이고, NLRP3-활성화 ASC 올리고머화를 억제하는 것으로 보고되었다(Honda H. et al., 2014. Isoliquiritigenin is a potent inhibitor of NLRP3 inflammasome activation and diet-induced adipose tissue inflammation. J Leukoc Biol. 96(6):1087-100.). NLRP3-의존적 IL-1β 생산은 저 농도의 이소리퀴리티게닌 (1 내지 10 μM)으로 억제되는데, 이는 이소리퀴리티게닌이 프라이밍 단계 및 활성화 단계 모두에서 NLRP3 인플라마좀을 차단할 수 있다는 사실을 입증한다.
일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀의 억제제는 미국 출원 US20160052876에 개시된 6673-34-0; (5-클로로-2-메톡시-N-[2-(4-설파모일페닐)-에틸]-벤즈아미드))인데, 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로서 인용된다. 일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀의 억제제는 US20160052876에 기재된 임의의 소분자 화합물이며, 상기 문헌의 내용은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀의 억제제는 문헌[Ozaki et al., 2015]; 문헌[Coll et al., 2011]; 문헌[Haerter et al., 2009] 및 미국 특허7,498,460에 개시된 시스테이닐 류코트리엔(cysteinyl leukotriene) 수용체 길항제인데, 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로서 인용된다. 시스테이닐 류코트리엔 수용체 길항제는 ASC 올리고머화를 방해함으로써 NLRP3 및 AIM2 인플라마좀-유도된 IL-1 가공을 둘 다 억제하는 것으로 보고되었으며, 이는 또한 인플라마좀 형성을 위한 어뎁터로서의 이의 역할과는 상이한, 선천적 면역 반응에서의 역할을 추가로 갖는 것으로 보인다(Ozaki et al., 2015).
일부 구현예에서, NLRP3 및 AIM2를 표적화하는 소-분자 억제제가, 특징화되어 왔고, (Ozaki et al., 2015)에 넓게 기재되어 있다. 이들의 대부분은 인플라마좀을 표적화하도록 변형된 약리학적 억제제이며(Guo et al., 2015), 이들은 이하의 것들을 포함한다: 파테놀리드(Parthenolide) (Juliana et al., 2010), 베이(Bay) 11-708 (Juliana et al., 2010), CRID3 (Coll et al., 2011), 오라노핀(Auranofin)(Isakov et al., 2014), 이소리퀴리티게닌(Isoliquiritigenin) (Honda et al., 2014), 3,4- 메틸리덴디옥시-*-니트로스티렌 (He et al., 2014), 사이클로펜테논 프로스타글란딘 15d-PJ2 (Maier et al., 2015) 및 25-히드록시콜레스테롤 (25-HC) (Reboldi et al., 2014). 게다가, 타입 I 인터페론은 또한 잘 이해되지 않은 메커니즘에 의해 인플라마좀 활성화도 억제하는 것으로 나타났다(Guarda et al., 2011). 그러나, 최근에는 IFN-자극 유전자 산물인 콜레스테롤 25-히드록실라제(Ch25h)가, Il1b 전사와 NLRP3, NLRC4와 AIM2 인플라마좀 활성화 모두에 대해 길항 작용을 한다는 점이 입증되었고, 이는 Ch25h가 다수의 인플라마좀에 대한 넓은 억제 활성을 갖는다는 것을 나타낸다(Reboldi et al., 2014).
NLRP3는 NCBI 접근 번호 NM―004895.1 (서열번호: 530), NM―183395 (서열번호: 531), NM―001079821 (서열번호: 532), NM―001127461 (서열번호: 533) 및 NM―001127462 (서열번호: 534)에 의해 인코딩된다. 여기에서, NLRP3의 번역 개시 코돈은 바람직하게는 이들 NCBI 접근 번호 각각에 기재된 번역 개시 코돈의 다운스트림에 있는 6개의 뉴클레오티드에 위치한 코돈이다. 돌연변이 NLRP3 유전자의 예는NLRP3 유전자를 포함하는데, 여기에서는 번역 개시 코돈으로부터 세어서 위치 1709(NCBI 접근 번호에 나타난 인코딩 부위의 경우, 번역 개시 코돈으로부터의 위치 1715)에 있는 아데닌이 구아닌이거나, 번역 개시 코돈으로부터 세어서 위치 1043 (NCBI 접근 번호에 나타난 인코딩 부위에서는 위치 1049)에 있는 시토신이 티민이거나, 번역 개시 코돈으로부터 세어서 위치 587 (NCBI 접근 번호에 나타난 암호화 부위에서는 위치 593)에 있는 구아닌이 아데닌이다. NLRP3는 바람직하게는 위치 1079의 뉴클레오티드가 구아닌으로 돌연변이화된 것이다. 당업계의 숙련자가 이해하는 바와 같이, 적어도 부분적으로, 카스파제-1를 활성화시키고/거나, 염증성 사이토카인, 예컨대 인터루킨 1 β 및 인터루킨 18의 성숙을 촉진시키는 기능적으로 균등한 NLRP3를 인코딩하는 기능을 유지하는 NLRP3 유전자의 변형체가 존재할 수도 있다. 따라서, 이러한 기능적으로 균등한 NLRP3는 활성을 파괴시키지 않는 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀의 억제제는 NLRP3의 RNA 억제제(RNAi), 예컨대 NLRP3에 특이적인 siRNA이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, NLRP3의 RNA 억제제는 ceDNA에 의해 인코딩된다. NLRP3 siRNA, 예를 들어, SI03060323 (Qiagen®)는 상업적으로 이용 가능하다.
일부 구현예에서, NLRP3의 억제제는 ceDNA에서 인코딩되는 RNAi이다. 어떠한 의혹도 피하기 위해, 인간 NLRP3 단백질의 아미노산 서열은 NM―004895.1 (서열번호: 539)에 상응하며, 이하와 같다:
Figure pct00025
인간 NLRP3 단백질은 핵산 서열 NM―004895.1(서열번호: 530), NM―183395(서열번호: 531), NM―001079821(서열번호: 532), NM―001127461(서열번호: 533) 및 NM―001127462(서열번호: 534)을 포함하는 NLRP3 유전자에 의해 인코딩되고, 인간 NLRP3 단백질은 NM―004895(서열번호: 539)의 아미노산을 갖는다.
NLRP3 억제제는 NLRP3 유전자 전사를 방해함으로써, NLRP3 인플라마좀 활성화를 방해하는데 사용할 수 있는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. NLRP3-암호화 폴리뉴클레오티드의 세그먼트에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 서열번호: 530 내지 534에 제시된 폴리뉴클레오티드)는, NLRP3-인코딩 mRNA에 결합하여, 이러한 mRNA의 번역을 억제하도록 디자인된다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 ceDNA 벡터에 의해 인코딩될 수 있고, 선택적으로, 본원에 개시된 조직 특이적인 프로모터 또는 유도성 프로모터에 작용 가능하게 연결될 수 있다.
NLRP3 mRNA의 억제는 당업계의 숙련자에게 통상 알려진 방법에 따라 유전자 침묵 RNAi 분자에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 특히 인간 NLRP3를 표적으로 하는 유전자 침묵 siRNA 올리고뉴클레오티드 이중체(NM―004895.1)는, NLRP3 발현을 녹다운시키는데 용이하게 사용될 수 있다. NLRP3 mRNA는 siRNA를 사용하여 성공적으로 표적화될 수 있고; 다른 siRNA 분자는 표적 mRNA의 알려진 서열을 기준으로, 당업계의 숙련자가 용이하게 제조할 수 있다. 따라서, 어떠한 의혹도 피하기 위해, 당업계의 통상의 숙련자는 이하와 같은 NM―004895.1의 핵산 서열에 대한 핵산 억제제, 예컨대 RNAi(RNA 침묵) 제제를 디자인할 수 있다:
Figure pct00026
Figure pct00027
일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀 억제제는 siRNA이므로, NLRP3 인플라마좀의 mRNA를 억제한다. 일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀 억제제는 인간 NLRP3 발현을 억제하는 GUGCAUUGAAGACAGGAAUTT(서열번호: 540)(본원에 전문이 참조로서 인용된 문헌[Wang et al., Laboratory Invest. (2017) 97: 922-934]), 또는 이의 절편, 또는 이와 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일한 이의 상동체이다. 일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀 억제제는 예컨대 Santa Cruz®로부터 시판되는 siRNA(cat # sc-40327)이다.
일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀 억제제는 인간 NM_001079821.2, NCBI 유전자 114548에서 RNAi 표적 서열(NLRP3)에 상보적인 RNAi이다. NLRP3를 억제하는 RNAi 제제는 표 5A에 나타난 서열번호: 541 내지 551의 17 내지 21개의 연속적인 염기들에 대해 상보적인 핵산일 수 있다.
Figure pct00028
일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀 억제제는 siRNA 제제이며, NLRP3를 억제하는 예시적인 siRNA 서열은 표 5B에 나타나 있다.
Figure pct00029
Figure pct00030
일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀 억제제는 NLRP3의 발현을 억제하는 miRNA(miR), 또는 NLRP3 발현을 억제하는 miR의 작용제이다. NLRP3를 억제하는 예시적인 miR은, miR-9 및 miR-223이다.
miR-9은 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제한다(Wang, Yue, et al. “MicroRNA-9 inhibits NLRP3 inflammasome activation in human atherosclerosis inflammation cell models through the JAK1/STAT signaling pathway.” Cellular Physiology and Biochemistry 41.4 (2017): 1555-1571.). 따라서, 사전-miR-9(MiR-9 전구체) 또는 miR-9은 NLRP3를 억제하는데 사용될 수 있다. 성숙한 miR-9(MIMAT0000441)의 서열은, 5’-UCU UUG GUU AUC U AG CUG UAU GA-3’(서열번호: 587)이다. hsa-miR-9-5p(UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA)(서열번호: 588). 일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀 억제제는 miR-9 작용제 SQ22538(SQ; 9―(테트라히드로―2―퓨라닐)―9H―퓨린―6―아민)인데, 이는 miR-9의 발현을 증가시키는 것으로 보고되었다(Ham, Onju, et al. “Small molecule-mediated induction of miR-9 suppressed vascular smooth muscle cell proliferation and neointima formation after balloon injury.” Oncotarget 8.55 (2017): 93360.). SQ22538의 화학식은 이하와 같다:
Figure pct00031
miR-223은 NLRP3 인플라마좀의 활성을 억제한다. (문헌[Bauernfeind, Franz, et al. “NLRP3 inflammasome activity is negatively controlled by miR-223.” The Journal of Immunology 189.8 (2012): 4175-4181]; 문헌[Feng, Zunyong, et al. “Ly6G+ neutrophil-derived miR-223 inhibits the NLRP3 inflammasome in mitochondrial DAMP-induced acute lung injury.” Cell death & disease 8.11 (2017): e3170]). miR-223은 mmu-miR-223로서 합성될 수 있다. miR-223(5’-TGGGGTATTTGACAAACTGACA-3’ (서열번호: 589)에 상보적인 서열의 적어도 1개, 또는 2개- 또는 3개 또는 4개의 블록은, NLRP3을 억제하는데 사용될 수 있다. cbn-mir-233 MI0024890은 UCGCCCAUCCCGUUGUUCCAAUAUUCCAACAACAAGUGAUUAUUGAGCAAUGCGCAUGUGCGG (서열번호: 590)의 서열을 갖고; cbr-mir-233 MI0000530은 AAGCAUUUUUCUGUCCCGCGCAUCCCUUUGUUCCAAUAUUCAAACCAGUAGAAAGAUUAUUGAGCAAUGCGCAUGUGCGGGACAGAUUGAAUAGCUG (서열번호: 591) 의 서열을 갖고; cel-mir-233 MI0000308은 AUAUAGCAUCUUUCUGUCUCGCCCAUCCCGUUGCUCCAAUAUUCUAACAACAAGUGAUUAUUGAGCAAUGCGCAUGUGCGGGAUAGACUGAUGGCUGC (서열번호: 592) 의 서열을 갖고; crm-mir-233 MI0011059는UGAAGCGUCUCUCUGUCCCGCUCAUCCUGUUGUUCCAAUAUUCCAACAGCCCAGUGAUUAUUGAGCAAUGCGCAUGUGCGGGACAGAUUGUAUGCUGCCAU (서열번호: 593) 의 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀 억제제는 NLRP3 발현 또는 기능을 억제하는 miR의 발현을 저해하는 항- miRNA(항-miR)이다. 예시적인 항-miR은 항-miR-22 및 항-miR-33이다. miR22는 NLRP3의 발현을 지속시킨다고 입증되었다(Li, S., et al., “MiR-22 sustains NLRP3 expression and attenuates H. pylori-induced gastric carcinogenesis.” Oncogene 37.7 (2018): 884.). miR-22의 성숙한 서열은, hsa-miR-22(hsa-miR-22-5p MIMAT000449): AGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUA(서열번호: 594)이고, 이하와 같은 스템 루프 서열을 갖고: hsa-mir-22 MI0000078는 이하의 서열을 갖는다: GGCUGAGCCGCAGUAGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUAUGUCCUGACCCAGCUAAAGCUGCCAGUUGAAGAACUGUUGCCCUCUGCC (서열번호: 595).
miR-33는 1차 대식 세포에서 NLRP3 mRNA 및 단백질의 발현, 뿐만 아니라 카스파제-1 활성을 상향 조절하는 것으로 보고되었다(Xie, Qingyun, et al. “MicroRNA-33 regulates the NLRP3 inflammasome signaling pathway in macrophages.” Molecular medicine reports 17.2 (2018): 3318-3327). miR-33의 성숙한 서열은 mmu-miR-33-5p 또는 MIMAT0000667이며; GUGCAUUGUAGUUGCAUUGCA (서열번호: 596)이고; 이하와 같은 스템 루프 서열을 갖는다: mmu-mir-33 MI0000707: CUGUGGUGCAUUGUAGUUGCAUUGCAUGUUCUGGCAAUACCUGUGCAAUGUUUCCACAGUGCAUCACGG (서열번호: 597)
따라서, 일부 구현예에서, NLRP3의 억제제는 적어도 일부, 예를 들어, 서열번호: 594 또는 서열번호: 595의 15 내지 25량체에 상보적인 항-miR-22이거나, 또는 적어도 일부, 예를 들어, 서열번호: 596 또는 서열번호: 597의 15 내지 21량체에 상보적인 항-miR-33이다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, NLRP3 인플라마좀의 억제제는 R&D Systems (미네소타주 미니에폴리스 소재)로부터의 항-인간 NLRP3(catalog no. AF6789)이다. 일부 구현예에서, NLRP3의 항체 억제제는 ceDNA에 의해 인코딩된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, NLRP3의 억제제는 NLRP3에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, NLRP3에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편은, ceDNA에 의해 인코딩된다.
A NLRP3 인플라마좀 억제제는 인플라마좀의 활성을 억제하거나, 적어도 감소시키는 화합물을 지칭하는데, 글리부리드 및 이의 기능적으로 균등한 전구체 또는 유도체, 카스파제-1 억제제, 아데노신 모노포스페이트-활성화 단백질 키나제(AMPK) 활성자 및 P2X7 억제제를 포함한다. NLRP3 인플라마좀의 억제는 인플라마좀 또는 카스파제-1을 억제하나, 시토크롬 P450 (cyp) 효소 활성을 변화시키지 않는 단일 화합물 또는 화합물들의 조합에 의해 달성될 수 있으며, 이들은 스타틴(statin)의 대사 작용에 유해한 영향을 미침으로써, 스타틴의 생체이용성을 감소시키는 cyp 동형체인 3A4, 2C9 및 2C19를 포함한다.
AIM2 인플라마좀 경로의 억제제
일부 구현예에서, 인플라마좀 길항제는 AIM2를 억제한다. 대안적으로, PISA라고도 알려진 AIM2는, 343개 아미노산의 폴리펩티드(Genbank 접근 번호 AF024714.1; RefSeq 접근 번호 NP_004824.1 참고)(서열번호: 598)이다. AIM2는 IFI20X/IF116 패밀리의 일원이며, 비장, 소장, 말초혈백혈구 및 정소에서 발현되는 것으로 알려져 있다. AIM2는 ASC와의 상호 작용에 관여하는 PYD 도메인, 뿐만 아니라 dsDNA와의 상호 작용에 관여하는 HIN200 도메인을 함유한다. AIM2는 종양 회귀(tumorigenic reversion)에 대한 역할을 갖는 것으로 추정되며, 세포 증식을 조절할 수 있다. AIM2의 발현은 인터페론-감마에 의해 유도된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, AIM2의 억제제는, AIM2에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, NLRP3에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편은, ceDNA에 의해 인코딩된다. AIM2의 억제제는 문헌[Farshchian et al., Oncotarget 2017; 8(28); 45825-45836]에 개시되어 있고, 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀의 억제제는 ASC의 PYD를 교란시킨다고 보고된 항-인간 ASC 단일 클론 항체(클론 23-4, MBL, 일본 나고야 소재)이다. 일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀의 억제제는 항-인간 AIM2(catalog no. 8055) 항체(Cell Signaling Technology® (메사추세츠주 베벌리 소재)이다. 일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀의 억제제는 (문헌[Khare et al., 2014]; 문헌[de Almeida et al., 2015])에 기재된 내인성 AIM2 억제제, 예컨대 피린-함유 단백질, 또는 문헌[Schauber and colleagues (Dombrowski et al., 2011)]에서 보고된 항미생물성 카텔리시딘(cathelicidin) 펩티드이다. 일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀의 억제제는 문헌[Miriam Canavase “the duality of AIM2 inflammasome: A focus on its role in autoimmunity and Skin diseases. Am. J. Pharm & Toxicology; 2016)]의 간이 리뷰에 개시된 임의의 화합물이다.
일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀의 억제제는 P202인데, p202 사량체이며, AIM2 활성화를 감소시킨다고 보고되었고, ASC의 dsDNA-의존적 군집화와 AIM2 인플라마좀 활성화를 방해한다(Fernandes-Alnemri, Teresa, et al. “The AIM2 inflammasome is critical for innate immunity to Francisella tularensis.” Nature immunology 11.5 (2010): 385; Yin, Qian, et al. “Molecular mechanism for p202-mediated specific inhibition of AIM2 inflammasome activation.” Cell reports 4.2 (2013): 327-339). 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, P202는 ceDNA에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀의 억제제는 WO2017138586A, 또는 US2013/0158100A1에 기재된 임의의 소분자 화합물이며, 상기 각 문헌은 본원에 전문이 참조로서 인용된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, AIM2의 억제제는 AIM2의 RNA 억제제, 예컨대 AIM2에 특이적인 siRNA이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, AIM2의 RNA 억제제는 ceDNA에 의해 인코딩된다. 인간 AIM2 단백질은 핵산 서열 NM_004833.2 (서열번호: 600)을 포함하는 AIM2 유전자에 의해 인코딩되고, 인간 AIM2 단백질은 NP_004824.1(서열번호: 598)의 아미노산을 갖는다. AIM2 억제제는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 이는 AIM2 유전자 전사를 억제함으로써, AIM2 인플라마좀 활성화를 억제하는데 사용될 수 있다. AIM2-암호화 폴리뉴클레오티드의 세그먼트에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 서열번호: 600에 제시된 폴리뉴클레오티드)는, AIM2-인코딩 mRNA에 결합하여, 이러한 mRNA의 번역을 억제하도록 디자인된다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 ceDNA 벡터에 의해 인코딩될 수 있고, 선택적으로, 본원에 개시된 조직 특이적인 프로모터 또는 유도성 프로모터에 작용 가능하게 연결될 수 있다. AIM2 mRNA의 억제는 당업계의 숙련자에게 통상 알려진 방법에 따라 유전자 침묵 RNAi 분자에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, 특히 인간 AIM2를 표적화하는 유전자 침묵 siRNA 올리고뉴클레오티드 이중체(NM_004833.2)는, AIM2 발현을 녹다운시키는데 용이하게 사용될 수 있다. AIM2 mRNA는 siRNA를 사용하여 성공적으로 표적화될 수 있고; 다른 siRNA 분자는 표적 mRNA의 알려진 서열을 기초로 하여 당업계의 숙련자가 용이하게 제조할 수 있다. 따라서, 어떠한 의혹도 피하기 위해, 당업계의 통상의 숙련자는 NM_004833.2의 핵산 서열에 대한 핵산 억제제, 예컨대 RNAi(RNA 침묵) 제제를 디자인할 수 있는데, 이하와 같다:
Figure pct00032
일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀 억제제는 siRNA이므로, AIM2 인플라마좀의 mRNA를 억제한다. 일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀 억제제는 인간 AIM2 발현을 억제하는 5’-CCCGAAGATCAACACGCTTCA-3’ (서열번호: 601) 또는 5’-AAAGGTTAATGTCCCGCTGAA-3’ (서열번호: 665), 또는 이와 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일한 이의 절편 또는 상동체이다(상기 둘은 문헌[Farshchian et al. Oncotarget (2017) 8: 45825-45836]에 기재됨).
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀의 억제제는 AIM2의 RNA 억제제, 예컨대 AIM2에 특이적인 siRNA이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, AIM2의 RNA 억제제는 ceDNA에 의해 인코딩된다. AIM2 siRNA는 예를 들어, OpenBiosystems®(알라바마주 헌츠빌 소재)로부터의 SI04261432 (Qiagen®); 또는 RCN0000096104 (#1), TRCN0000096105 (#2), TRCN0000096106 (#3)으로 시판되는 것일 수 있다.
일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀의 억제제는 포스포로티오에이트(PO) 골격을 갖도록 합성된 A151 (5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’ (서열번호: 602) 또는 C151 (5’-TTCAAATTCAAATTCAAATTCAAA-3’ (서열번호: 603)이다. A151(또한 ODN TTAGGG라고도 지칭됨)은, 포유류 텔로미어 DNA에서 통상 발견되는 면역억제성 TTAGGG(서열번호: 604) 모티프의 4개의 반복부를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드(ODN)이다(문헌[Steinhagen F. et al., 2017. Suppressive oligodeoxynucleotides containing TTAGGG motifs inhibit cGAS activation in human monocytes. Eur J Immunol]). A151은 사이토졸 dsDNA에 반응하여 AIM2 인플라마좀 활성화를 차단하나, 포스포티오에이트(PO) 골격이 필요하다(문헌[Kaminsji et al., J Immunol 2013; 191:3876-3883, Synthetic Oligodeoxynucleotides Containing Suppressive TTAGGG Motifs Inhibit AIM2 Inflammasome Activation]; 문헌[Eichholz K. et al., 2016. Immune-Complexed Adenovirus Induce AIM2-Mediated Pyroptosis in Human Dendritic Cells. PLoS Pathog. 12(9): e1005871]). 일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀의 억제제는 A151 (5′-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3′ (서열번호: 602) 또는 적어도 하나의 TTAGGG (서열번호: 604)의 반복부이며, 상기 각각은 포스포티오에이트(PO) 골격을 갖는다. 일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀의 억제제는 A151 (5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’ (서열번호: 602), 또는 포스포디에스테르(PE) 골격을 갖지 않는 적어도 하나의 TTAGGG (서열번호: 604)의 반복부이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀의 억제제는 대상체에 투여된(예를 들어, ceDNA의 추후 전달을 포함) ceDNA에 의해 인코딩된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 대상체에 투여된 ceDNA에 의해 인코딩된 AIM2 인플라마좀의 억제제는, A151(서열번호: 602)이다.
일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀 억제제는 인간NM_001348247.1 (서열번호: 566), NCBI 유전자9447에서의 RNAi 표적 서열(AIM2)에 상보적인 RNAi이다. AIM2를 억제하는 RNAi 제제는, 표 5C에 나타난 서열번호: 605 내지 610의 17 내지 21개의 연속적인 염기들에 상보적인 핵산일 수 있다.
Figure pct00033
일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀 억제제는 siRNA 제제이며, AIM2를 억제하는 예시적인 siRNA 서열은 표 5D에 나타나 있다.
Figure pct00034
Figure pct00035
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Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
일부 구현예에서, AIM2 인플라마좀 억제제는 AIM2의 발현을 억제하는 miRNA(miR), 또는 AIM2 발현을 억제하는 miR의 작용제이다. AIM2를 억제하는 예시적인 miR은 miR-223이다 (Yang, Fan, et al. “MicroRNA-223 acts as an important regulator to Kupffer cells activation at the early stage of Con A-induced acute liver failure via AIM2 signaling pathway.” Cellular Physiology and Biochemistry 34.6 (2014): 2137-2152). 따라서, 본원에서 사용하기 위한 AIM2 억제제는, 서열번호: 589 내지 593 중 어느 하나에 상응하는 miR-223이다.
무-세포 시스템에서 시험관 내 재구성된 AIM2 인플라마좀은, 문헌[Kaneko et al., 2015]에 개시된 방법, 또는 미국 출원 US2013/0158100A1에 개시된 방법에 따라 AIM2 인플라마좀 억제제를 스크리닝하기 위한 도구로서 사용될 수 있는데, 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로서 인용된다.
카스파제-1의 억제제
일부 구현예에서, 인플라마좀 길항제는 카스파제-1을 억제한다. 일부 구현예에서, 본원의 방법 및 조성물에 사용하기 위한 카스파제-1의 억제제는 벨나카산(Belnacasan)(VX-765)이다. VX-765는 ICE/카스파제-1 서브패밀리에 속하는 강력하고 선택적인 카스파제의 억제제인 VRT-043198의 경구로 흡수 프로드러그인데, 이하와 같은 화학식을 갖는다:
Figure pct00040
(문헌[Wannamaker W. et al., 2007. (S)-1-((S)-2-{[1-(4-amino-3-chloro-phenyl)-methanoyl]-amino}-3,3-dimethyl-butanoyl)-pyrrolidine-2-carboxylic acid ((2R,3S)-2-ethoxy-5-oxo-tetrahydro-furan-3-yl)-amide (VX-765), an orally available selective interleukin (IL)-converting enzyme/caspase-1 inhibitor, exhibits potent anti-inflammatory activities by inhibiting the release of IL-1beta and IL-18. J Pharmacol Exp Ther. 321(2):509-16] 참고).
일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 이하의 구조를 갖는 Z-VAD-FMK이며:
Figure pct00041
세포-투과성 범-카스파제 억제제 및 NLRP3-유도된 세포에서 카스파제-1 활성화의 강력한 억제제이다 (Dostert C. et al., 2009. Malarial hemozoin is a Nalp3 inflammasome activating danger signal. PLoS One. 4(8):e6510.). Z-VAD-FMK는 카스파제 프로테아제의 촉매 부위에 비가역적으로 결합한다(Slee EA. et al., 1996. Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (OMe) fluoromethylketone (Z-VAD.FMK) inhibits apoptosis by blocking the processing of CPP32. Biochem J. 315 (Pt 1):21-4.)
일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 이하의 구조를 갖는 Ac-YVAD-cmk이며:
Figure pct00042
카스파제-1 억제제, 및 proIL-1β 내의 표적 서열을 기초로 하는 클로로메틸 케톤 테트라펩티드(YVHD)이다. Ac-YVAD cmk는 인플라마좀 활성화를 차단하고, 이런 이유로 항-염증, 항-어팝토시스 및 항-파이롭토시스(anti-pyroptotic) 효과를 나타낸다고 보고되었다.
일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 이하의 구조를 갖는 Ac-YVAD-CHO이다:
Figure pct00043
(Brenner, B., et al. 1998. Cell Death Differ. 5: 29-37. PMID: 10200443) Caspase-1 substrate (CAS 143305-11-7)
일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 이하의 구조를 갖는 파테놀리드(Parthenolide)이고:
Figure pct00044
피퍼퓨(feverfew)로부터 유래된 세스퀴테르펜 락톤(sesquiterpene lactone)인 파테놀리드는, NF-κB 활성화의 알려진 억제제이며, 또한 카스파제-1, 및 NLRP3 및 NLRP1 인플라마좀을 포함하는 다수의 인플라마좀의 직접 억제제이기도 하다 (Juliana C. et al., 2010. Anti-inflammatory compounds parthenolide and Bay 11-7082 are direct inhibitors of the inflammasome. J Biol Chem. 285(13):9792-802.). 파테놀리드는 NLRP3 ATPase 활성을 교란함으로써, NLRP3 인플라마좀을 직접 억제한다.
일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 이하의 구조를 갖는 프랄나카산(Pralnacasan)(VX-740) 중 어느 하나 또는 이들의 조합이다:
Figure pct00045
Z-WEHD-FMK (또한, 벤질옥시카보닐-V-A-D-O-메틸 플루오로메틸 케톤으로도 알려짐).
일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 시코닌(shikonin) 또는 아세틸시코닌이며, 여기에서 시코닌은 이하와 같고:
Figure pct00046
아세틸시코닌은 이하와 같다:
Figure pct00047
시코닌은 한방 의학에서 다면 발현 효과에 사용되는 지치(Lithospermum erythrorhizon)의 뿌리에서 발견된 고 지질친화성 나프토퀴논(naphtoquinone)이며, NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제한다(Zorman et al., PLOS One, 2016; 11(7); e0159826.)
일부 구현예에서, 당업계의 숙련자가 인식하는 바와 같이, 카스파제-1의 억제제는 소분자 억제제일 수 있다. 비-제한적인 예는, 시아노프로파네이트-함유 분자, 예컨대 (S)-3-((S)-l- ((S)-2-(4-아미노-3-클로로벤즈아미도)-3,3-디메틸부타노일)피롤리딘-2-카복사미도)-3-시아노-프로판산, 뿐만 아니라 다른 소분자 카스파제-1 억제제 예컨대 (S)-l-((S)-2-{[l-(4-아미노-3-클로로-페닐)-메타노일]-아미노}-3,3-디메틸-부타노일)-피롤리딘-2-카르복실산 ((2R,3S)-2-에톡시-5-옥소-테트라히드로-퓨란-3-일)-아미드를 포함한다. 이러한 억제제는 화학적으로 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 카스파제-1 효소 활성의 직접 억제제일 수 있거나, 인플라마좀 조립체 또는 인플라마좀 신호 전파의 개시를 억제하는 간접 억제제일 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 카스파제-1 억제제는, 활성 산소 종(ROS) 억제제를 포함하는 항산화제일 수 있다. 이러한 카스파제-1 억제제의 예는, 플라본, 예컨대 아피게닌, 루테올린, 및 디오스민; 플라보놀, 예컨대 미리세틴, 피세틴 및 쿼세틴을 포함하는 플라보노이드; 플라바놀 및 이의 중합체, 예컨대 카테킨(Catechin), 갈로카테킨(Gallocatechin), 에피카테킨(Epicatechin), 에피갈로카테킨(Epigallocatechin), 에피갈로카테킨-3- 갈레이트 및 테아플라빈(theaflavin); 이소플라빈 피토에스트로겐(isoflavone phytoestrogen); 및 스틸베노이드(stilbenoid), 예컨대 레스베라트롤(resveratrol)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 페놀산 및 이들의 에스테르, 예컨대 갈산 및 살리사이클산; 터페노이드(terpenoid) 또는 이소프레노이드(isoprenoid), 예컨대 안드로그래폴리드(andrographolide) 및 파테놀리드; 비타민, 예컨대 비타민 A, C 및 E; 비타민 보조 인자, 예컨대 보조-효소 Q10, 망간 및 요오드화물, 다른 유기 항산화제, 예컨대 시트르산, 옥살산, 피트산 및 알파-리포산(alpha-lipoic acid), 및 옻나무(Rhus verniciflua stokes) 추출물도 포함된다. 카스파제-1 억제제는 이들 화합물의 조합, 예를 들어, α -리포산, 보조-효소 Q10 및 비타민 E의 조합, 또는 카스파제 1 억제제(들)과 다른 인플라마좀 억제제, 예컨대 글리부리드(glyburide) 또는 이의 기능적으로 균등한 전구체 또는 유도체의 조합일 수 있다.
일부 인플라마좀 억제제의 투여량의 예는 이하와 같다: 아피게닌(apigenin)(약 0.1 내지 10 mg/kg), 루테올린(Luteolin)(약 1 내지 100 mg), 디오스민(Diosmin)(약 100 내지 900 mg), 미리세틴(Myricetin)(약 10 내지 300 mg), 쿼세틴(Quercetin)(약 10 내지 1000 mg), 피세틴(Fisetin)(1 내지 200 mg/kg), 옻나무 추출물(1 내지 100 mg/kg), 카테킨(약 50 내지 500 mg), 갈로카테킨(약 100 내지 1000 mg), 에피카테킨(약 0.1 내지 10 mg/kg), 에피갈로카테킨(Epigallocatechin)(약 100 내지 1000 mg), 에피갈로카테킨-3-갈레이트(약 100 내지 1000 mg), 테아플라빈(약 75 내지 750 mg), 이소플라빈 피토에스트로겐(약 25 내지 250 mg), 레스베라트롤(약 100 내지 1000 mg), 안드로그래폴리드(약 100 내지 500 mg), 파테놀리드(약 0.1 내지 50 mg), 비타민 A(약 5000 내지 20000 IU), 비타민 C(약 100 내지 2000 mg), 보조-효소 Q10(약 30 내지 500 mg), 비타민 E (약 10 내지 1000 IU), α-리포산(약 10 내지 1000 mg), 보조-효소 Q10(30 내지 500 mg), 망간(약 1 내지 100 mg), α -리포산, 보조-효소 Q10 및 비타민 E(각각 약 10 내지 1000 mg, 30 내지 500 mg, 10 내지 1000 IU), 글리부리드(약 1 내지 20 mg), 및 사이클로헥실우레아 모이어티가 결핍된 글리부리드 유도체(약 1 내지 200 mg).
일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 미국 특허 제6,355,618호; 제6,632,962 호, 제 5,756,466 호 또는 국제 출원: WO2001/042,216; WO2004/064,713, WO98/16502, WO 97/24339, EP623592, 및 문헌[Dolle et al., J. Med. Chem. 39, 2438 (1996)]; 문헌[Dolle et al., J. Med. Chem. 40, 1941 (1997)]에 기재된 임의의 소분자 화합물이며, 상기 각 문헌은 본원에 전문이 참조로서 인용된다. 일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 보고된 적도 있는 카스파제-1의 비펩티드 억제제이다. 미국 특허 (Bemis et al.);
일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 이하의 구조를 갖는 ICE(카스파제-1) 억제제이다:
Figure pct00048
상기 화학식에서, R1 은 특히 R3CO―이고, R3 은 특히 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로아릴, ―(CHR)n-아릴, 및 ―(CHR)n-헤테로아릴이고, R2는 다양한 기로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 이하의 구조를 갖는 ICE(카스파제-1) 억제제이고:
Figure pct00049
상기 화학식에서, R1은 아릴 및 헤테로아릴을 포함하고; A는 아미노산이고; n은 0 내지 4이고; m은 0 또는 1이고; R2은 아릴이다. 일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 이하의 구조를 갖는 ICE(카스파제-1) 억제제이며:
Figure pct00050
상기 화학식에서, R1은 아릴 및 헤테로아릴을 포함하고; AA1 및 AA2는 단일 결합 또는 아미노산 잔기이고; Tet는 테트라졸 고리를 나타내고; Z는 알킬렌, 알케닐렌, O, S 등을 나타내고; E는 H, 알킬 등을 나타낸다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 카스파제-1의 RNA 억제제, 예컨대 카스파제-1에 특이적인 siRNA이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, AIM2의 RNA 억제제는 ceDNA에 의해 인코딩된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 카스파제-1의 RNA 억제제, 예컨대 카스파제-1에 특이적인 siRNA이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, RNA 카스파제-1의 억제제는 ceDNA에 의해 인코딩된다. 본원의 키트 및 조성물에 사용하기 위해 포함되는 카스파제-1 siRNA 서열의 예는, WO2008/033,285; 문헌[Keller, M., et al. Cell. 2008; 132(5): 818-831]; 문헌[Artlett, C.M., et al. Arthritis and Rheumatology. 2011 Jul; 63 (11): 3563-3574]; 문헌[Burdette, D., et al. J Gen Virology. 2012, 93: 235-246]에 개시되어 있고, 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로서 인용된다. 카스파제-1에 대한 siRNA 서열도 또한 상업적으로 이용 가능하며, 당업계의 통상의 숙련자에게 알려져 있다.
인간 카스파제-1 단백질은 핵산 서열 NM_033292.3 (서열번호: 611)을 포함하는 CASP1 유전자에 의해 인코딩되고, 인간 카스파제-1 단백질은 NP_150634.1 (서열번호: 612)의 아미노산을 갖는다. 카스파제-1의 억제제는 카스파제-1 유전자의 전사를 억제함으로써, 카스파제-1과 NLRP3 인플라마좀 및 AIM2 인플라마좀의 다운스트림 경로를 억제하는데 사용될 수 있는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 카스파제-1-암호화 폴리뉴클레오티드의 세그먼트에 상보적인 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 서열번호: 611에 제시된 폴리뉴클레오티드)는, 카스파제-1-암호화 mRNA에 결합하여, 이러한 mRNA의 번역을 억제하도록 디자인된다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 ceDNA 벡터에 의해 인코딩될 수 있고, 선택적으로, 본원에 개시된 조직 특이적인 프로모터 또는 유도성 프로모터에 작용 가능하게 연결될 수 있다.
카스파제-1 또는 프로카스파제-1 mRNA의 억제는 당업계의 숙련자가 통상 알려진 방법에 따라, 유전자 침묵 RNAi 분자에 의하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 특히 인간 카스파제-1을 표적화하는 유전자 침묵 siRNA 올리고뉴클레오티드 이중체(NM_033292.3)는, 프로-카스파제-1 발현을 녹다운시키는데 용이하게 사용될 수 있다. 카스파제-1 mRNA는 siRNA를 사용하여 성공적으로 표적화될 수 있고; 다른 siRNA 분자는 표적 mRNA의 알려진 서열을 기초로 하여 당업계의 숙련자가 용이하게 제조할 수 있다. 따라서, 어떠한 의혹도 피하기 위해, 당업계의 통상의 숙련자는 이하와 같은NM_033292.3의 핵산 서열에 대한 핵산 억제제, 예컨대 RNAi (RNA 침묵) 제제를 디자인할 수 있다:
Figure pct00051
일부 구현예에서, 카스파제-1 억제제는; 또한 NCBI 유전자 834 (CASP1)라고도 부르는 NM_033292.3 (서열번호: 611) 내의 RNAi 표적 서열에 상보적인 RNAi이다. 카스파제-1에 대한 최근의 야생형 전사체는 이하의 것들을 포함한다: NM_001223.4, NM_001257118.2, NM_001257119.2, NM_033292.3 (서열번호: 611), NM_033293.3, NM_033294.3, NM_033295.3, XM_017018393.1, XM_017018394.1, XM_017018395.1, XM_017018396.1. 카스파제-1을 억제하는 RNAi 제제는, 표 5E에 나타난 서열번호: 613 내지 619의 17 내지 21개의 연속적인 염기에 대해 상보적인 핵산일 수 있다.
Figure pct00052
일부 구현예에서, 카스파제-1 억제제는 siRNA제제이며, 카스파제-1을 억제하는 예시적인 siRNA 서열은 표 5F에 나타나 있다.
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
일부 구현예에서, 카스파제-1 억제제는 siRNA이므로, 카스파제-1 (또는 프로-카스파제-1 프로단백질)의 mRNA를 억제하여, NLRP3 인플라마좀 및/또는 AIM2 인플라마좀의 다운스트림 경로를 억제한다. 일부 구현예에서, 카스파제-1 억제제는 GAA GGC CCA UAU AGA GAA A (서열번호: 904; 센스 가닥의 서열이 나타남)인데, 인간 카스파제-1 발현 또는 이의 절편 또는 이와 적어도 50%, 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 상동체를 억제한다. 본원의 키트 및 조성물에서 사용하기 위해 포함되는 카스파제-1 siRNA 서열의 예는, WO2008/033285 또는 미국 출원 US20090280058, 문헌[Keller, M., et al. Cell. 2008; 132(5): 818-831]; 문헌[Artlett, C.M., et al. Arthritis and Rheumatology. 2011 Jul; 63 (11): 3563-3574]; 문헌[Burdette, D., et al. J Gen Virology. 2012, 93: 235-246]에 개시되어 있으며; 상기 문헌은 본원에 전문이 참조로서 인용된다.
NLRP3, AIM2 및 카스파제-1에 대한 맞춤형 siRNA는, Dharmacon Research, Inc.(콜로라도주 라파예트 소재)로부터 주문 제작될 수 있다. 맞춤형 siRNA 제조를 위한 다른 공급처는, Xeragon Oligonucleotides(알라바마주 헌츠빌 소재) 및 Ambion(텍사스주 오스틴 소재)를 포함한다. 대안적으로, siRNA는 리보뉴클레오시드 포스포라미다이트와 DNA/RNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, NLRP3, AIM2, 및 카스파제-1에 대한 RNAi 또는 siRNA 은 본원에 개시된 ceDNAs에서 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 이하의 구조를 갖는 카스파제-1 기질 (CAS 143305-11-7)이며:
Figure pct00056
이하의 서열을 갖는다: Asn-Glu-Ala-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn (서열번호: 538). 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 카스파제-1의 억제제는 대상체에 투여된 ceDNA(예를 들어, ceDNA의 추후 전달 포함)에 의해 인코딩된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 대상체에 투여된 ceDNA에 의해 인코딩된 카스파제-1의 억제제는 카스파제-1 기질(서열번호: 538)이다.
RNAi는 다양한 표적 mRNA에 맞게 디자인될 수 있다. RNAi, 예를 들어, siRNA를 디자인하기 위한 일반적인 전략은, AUG 정지 코돈으로부터 개시한 후, AA 디뉴클레오티드 서열에 대한 원하는 cDNA 표적의 길이를 스캐닝하는 것을 포함한다. AA 서열에 인접하는 3’의 19개 뉴클레오티드는, 잠재적인 siRNA 표적 부위로서 기록된다. 이후, 잠재적인 표적 부위를 적절한 게놈 데이터베이스와 비교하여, 비-표적 유전자에 대해 유의한 상동성을 갖는 임의의 표적 서열을 폐기할 수 있다. 유전자의 길이에 따라 다수의 표적 서열이 위치하여, 표적 서열은 mRNA의 3’, 5’ 및 중간 부분으로부터 유래되었다. 음성 대조군 siRNA는 대상체 siRNA와 동일한 뉴클레오티드 조성물을 사용하여 생성되었으나, 순서를 뒤섞어서(scrambled), 형질감염되는 세포의 임의의 유전자에 대한 서열 상동성이 없도록 체크하였다. (Elbashir, S. M., et al., 2001, Nature, 411, 494-498; Ambion siRNA Design Protocol, at www.ambion.com).
표적 서열은 AA로부터 시작하여, 17 내지 25개 염기 길이, 선택적으로 21개 염기 길이일 수 있다. 표적 서열에 결합하는 RNAi 또는 siRNA는 한 가닥의 5개의 C6 탄소에 티올 기를 갖도록 변형되었다.
VII. 사용 방법
예를 들어, 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 또한 (예를 들어, 선천적 면역 반응의 억제제를 인코딩하는) 관심 대상인 뉴클레오티드 서열을 표적 세포(예를 들어, 숙주 세포)로 전달하는 방법에도 사용될 수 있다. 상기 방법은 특히 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 이것이 필요한 대상체의 세포로 전달하여, 면역 장애를 치료하거나, 또는 선천성 면역계를 감소 또는 억제시키기 위한 방법일 수 있다. 본 발명은 대상체 세포 내의 ceDNA 벡터에서 인코딩된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제가 생체 내에서 발현되도록 하여, 인플라마좀 길항제 발현의 치료 효과가 발생한다. 이러한 결과는 ceDNA 벡터 전달의 생체내 및 시험관내 모드 둘 다에서 확인되었다.
또한, 본 발명은 예를 들어 이것이 필요한 대상체의 세포에서 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 전달하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 인플라마좀 길항제를 인코딩하는 본 발명의 ceDNA 벡터를 다중 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 ceDNA 벡터는 전형적으로 관찰되는 캡시드화 바이러스 벡터에 대한 면역 반응과 유사한 것을 유도하지 않기 때문에, 이러한 다수의 투여 전략은 ceDNA-기반 시스템에서 더 큰 성공을 거둘 가능성이 클 것이다. ceDNA 벡터는 원하는 조직의 세포를 형질감염시키고, 예를 들어 과도한 유해 작용 없이, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 유전자 전달 및 발현을 충분한 수준으로 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 종래의 약학적으로 허용 가능한 투여의 경로는, 망막 투여(예를 들어, 망막하 주사, 맥락막 위 주사, 또는 유리체 내 주사), (예를 들어, 리포좀 제형 내의) 정맥내 투여, 선택된 기관(예를 들어, 간, 신장, 담낭, 전립선, 부신, 심장, 장, 폐, 및 위로부터 선택된 임의의 하나 이상의 조직)으로의 직접 전달, 근육 내 투여, 및 다른 비경구 투여의 경로를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 투여 경로는, 원한다면, 조합될 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 전달은, 발현된 억제제의 전달에 제한되지 않는다. 예를 들어, 종래에 (예를 들어, 세포-기반 생산 방법 (예를 들어, 곤충-세포 생산 방법을 사용하여))생산되거나, 합성에 의해 생산된 본원에 기재된 ceDNA 벡터는, 제공된 다른 전달 시스템을 사용하여, 유전자 치료의 일부를 제공할 수 있다. 본 개시 내용에 따라 ceDNA 벡터와 조합하여 사용될 수 있는 시스템의 하나의 비-제한적인 예는, 면역 억제제를 발현시키는 ceDNA 벡터의 효과적인 유전자 발현을 위해 하나 이상의 보조-인자 또는 면역억제제들을 별도로 전달하는 시스템을 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에서 면역 반응, 예를 들어, 선천적 면역 반응을 억제하는 방법을 제공하는데, 이는 치료 유효량의 ceDNA 벡터를 선택적으로는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 이것이 필요한 대상체의 세포(특히, 근육 세포 또는 조직)에 도입하는 단계를 포함한다. ceDNA 벡터는 담체의 존재 하에서 도입될 수 있지만, 이러한 담체는 필요하지 않다. 선택된 ceDNA 벡터는 예를 들어, 면역계를 치료 또는 억제하는데 유용한 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히, ceDNA 벡터는 대상체에 도입될 때, 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩되는 원하는 인플라마좀 길항제의 전사를 유도할 수 있는 조절 요소에 작용 가능하게 연결된 원하는 인플라마좀 길항제 서열을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 상기 및 본원의 다른 곳에 제공된 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다.
본원에 제공된 조성물과 벡터는, 예를 들어 다양한 목적을 위해 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이유전자는 연구 목적을 위해 사용되도록 의도된, 예를 들어, 전이유전자를 보유하는 체세포 형질전환 동물 모델을 생성하여 예를 들어, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 기능을 연구하도록 의도된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 인코딩한다. 다른 실시예에서, 전이유전자는 면역계가 억제된 동물 모델 또는 면역약화된 대상체를 생성하는데 사용되도록 의도된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 인코딩된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는 대상체에서, 예를 들어, 유전자 치료에 대해 반응하거나, 또는 유사하게 포유류 대상체에서 상승된 면역 반응 또는 상승된 선천성 면역 상태를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제는, 대상체에서 상승된 면역 반응을 감소 또는 예방하기에 충분한 양으로 환자에서 전달(예를 들어, 발현)될 수 있다.
ceDNA 벡터는 한 종의 ceDNA 벡터에 제한되지 않는다. 실제로, 다른 양태에서는, 상이한 단백질들 또는 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 동일한 억제제들을 발현시키나, 예를 들어 상이한 프로모터 또는 시스-조절 요소에 작용 가능하게 연결된 다수의 ceDNA 벡터가, 표적 세포, 조직, 기관, 또는 대상체에 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 따라서, 이 전략은 다수의 인플라마좀 길항제의 유전자 치료 또는 유전자 전달을 동시에 할 수 있도록 해준다. 또한, 억제제의 상이한 부분들을, 별도의 ceDNA 벡터(예를 들어, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 기능에 필요한 상이한 도메인 및/또는 보조-인자)에 분리시키는 것도 가능한데, 이는 예를 들어 동시에 또는 상이한 시점에 투여되어, 하나 이상의 억제제의 발현 조절의 추가적인 수준을 제공할 수 있다. 바이러스 캡시드의 부재로 인한 항-캡시드 숙주 면역 반응의 결여를 고려할 때, 전달은 또한 중요하게는, 임상 설정에서 유전자 치료를 위해, 후속으로 용량을 증가시키거나 감소시키면서 다수 회 수행될 수 있다. 캡시드가 없으므로 항-캡시드 반응은 일어나지 않을 것으로 예측된다.
본 발명은 또한 대상체에서 면역 반응, 예를 들어, 선천적 면역 반응을 억제하는 방법을 제공하는데, 이는 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본원에 개시된 치료 유효량의 ceDNA 벡터를 대상체 내의 이것이 필요한 표적 세포(특히, 근육 세포 또는 조직)에 도입하는 단계를 포함한다. ceDNA 벡터는 담체의 존재 하에서 도입될 수 있지만, 이러한 담체는 필요하지 않다. 구현된 ceDNA 벡터는 관심 대상 뉴클레오티드 서열, 예컨대 선천성 면역계를 억제하거나, 대상체의 상승된 면역 상태를 감소시키는데 유용한 면역 반응의 억제제를 포함한다. 특히, ceDNA 벡터는, 대상에게 도입될 때, 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩되는 원하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 전사를 유도할 수 있는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 목적하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 상기 및 본원의 다른 곳에 제공된 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다.
생체 외 치료
일부 구현예에서, 세포를 대상체로부터 제거하여, 이에 예를 들어 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 도입한 후, 그 세포를 대상체에 다시 도입한다. 생체외 치료를 위해 대상에서 세포를 제거한 후, 다시 대상에게 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호; 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨). 대안적으로, ceDNA 벡터는 또 다른 대상의 세포, 배양된 세포 또는 임의의 다른 적합한 공급원의 세포에 도입되며, 세포는 이를 필요로 하는 대상에게 투여된다.
예를 들어 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제를 위한 ceDNA 벡터로 형질도입된 세포는, 바람직하게는 약학적 담체와 조합하여 “치료-유효량”으로 대상체에 투여된다. 당업자는, 일부 이점이 대상에게 제공되는 한, 치료 효과가 완전하거나 치유적일 필요가 없다는 것을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 예를 들어 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 세포에서 시험관내, 생체 외, 또는 생체 내에서 생산되는 본원에 기재된 인플라마좀 길항제 (때때로, 전이유전자 또는 이종 뉴클레오티드 서열로 불림)을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 논의된 치료 방법에 대한 본원에 기재된 ceDNA 벡터의 사용과는 반대로, 일부 구현예에서, 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 배양 세포 및 예를 들어, 항체와 융합 단백질의 생산을 위해 세포로부터 단리된, 발현된 인플라마좀 길항제에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 배양 세포는, 항체 또는 융합 단백질의 상업적 생산을 위해 사용될 수 있는데, 예를 들어, 항체 또는 융합 단백질의 소규모 또는 대규모 생체제조를 위한 세포 공급원으로서 작용할 수 있다. 대안적 구현예에서, 본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 소규모 생산, 뿐만 아니라 상업적인 대규모 인플라마좀 길항제 생산을 포함하는 항체 또는 융합 단백질의 생체 내 생산을 위해, 숙주 비-인간 대상체 내의 세포로 도입된다.
본원에 개시된 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 억제제의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 수의학 응용과 의학적 응용 모두에 사용될 수 있다. 상기 기재된 생체외 유전자 전달 방법에 적합한 대상체에는, 조류(예를 들어, 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조 및 꿩) 및 포유류(예를 들어, 인간, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개 및 토끼)가 모두 포함되며, 이 중 포유류가 바람직하다. 인간 대상체가 가장 바람직하다. 인간 대상체에는, 신생아, 유아, 청소년 및 성인이 포함된다.
본 출원의 전반에서 인용된 참고 문헌, 발간된 특허, 공개된 특허 출원, 및 동시-계류중인 특허 출원들을 포함하는 모든 특허 및 다른 간행물은, 예를 들어, 본원에 기재된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기재된 방법을 설명 및 개시할 목적으로 본원에 참조로서 명확히 포함된다. 이들 간행물은 본 출원의 제출일에 앞선 이들의 개시 내용만을 제공한다. 이에 대하여, 본 발명자가 선행 발명에 의하여 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시 내용을 앞당길 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이 문서들의 내용에 대한 일자 또는 묘사에 대한 모든 진술은, 본 출원인에게 이용 가능한 정보에 기초하며, 이 문서들의 일자 또는 내용에 대한 정확성에 대한 어떠한 인정이 되지는 않는다.
본 개시 내용의 구현예의 설명은 완전하다거나, 본 개시 내용을 개시된 특정 형태로 국한시키려는 의도는 아니다. 본 개시 내용의 특정 구현예 및 예는 예시의 목적으로 본원에 기재되어 있으나, 관련 분야의 숙련자들이 이해하는 바와 같이, 본 개시 내용의 범주 내에서 다양한 균등한 변형도 가능하다. 예를 들어, 방법 단계들 또는 기능들은 소정의 순서로 제시되어 있지만, 대안적인 구현예는 상이한 순서로 기능을 수행할 수 있거나, 또는 기능들이 실질적으로 동시에 실시될 수도 있다. 본원에 제공된 본 개시 내용의 교시 사항은, 적절한 경우 다른 과정 또는 방법에도 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 구현예들은 조합되어, 추가적인 구현예를 제공할 수 있다. 본 개시 내용의 양태는, 필요한 경우 변형되어, 상기 참고 문헌 및 응용의 조성, 기능 및 개념을 이용하여, 본 개시 내용의 추가적인 구현예를 제공할 수 있다. 게다가, 생물학적 기능 균등론을 고려하기 때문에, 생물학적 또는 화학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 미치지 않고도 단백질 구조에 일부 변화가 발생할 수 있다. 상세한 설명을 참작하여, 본 개시 내용에 대한 이들 및 다른 변화가 이루어질 수도 있다. 이러한 모든 변형은 첨부된 청구항의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
상기의 임의의 구현예의 특정 요소는, 다른 구현예의 요소와 조합되거나, 또는 다른 구현예의 요소로 치환될 수 있다. 또한, 본 개시 내용의 특정 구현예와 관련된 장점이 이 구현예의 맥락에서 설명되기는 했지만, 다른 구현예도 또한 이러한 장점을 나타낼 수 있고, 모든 구현예가 본 개시 내용의 범주 내에 속하는 이러한 장점을 반드시 나타낼 필요는 없다.
본원에 기재된 기술은 이하의 실시예에 의해 추가로 예시되나, 이는 결코 추가적인 제한으로 해석되어서는 안 될 것이다. 본 발명이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지, 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: TTX-플라스미드의 제작
도 4c(TTX-R) 또는 도 4d(TTX-L)에 나타난 구조 계획을 갖는 TTX 형식 플라스미드를 제작하였다. TTX-R 및 TTX-L 플라스미드의 예는 이하의 표 6a에 나타나 있다. TTX-R 및 TTX-L 플라스미드는 각각 도 4c 및 도 4d에 나타난 돌연변이 AAV2 ITR 서열의 위치가 상이하다. TTX-R 플라스미드(TTX-플라스미드 1, 3, 5, 및 7)를 본원에 개시된 분자 클로닝에 의해 생성하여, TTX-벡터를 생산하였다. TTX-벡터(TTX-벡터 2, 4, 6, 8)를 생산하는데 사용하기 위한 TTX-L 플라스미드(TTX-플라스미드 2, 4, 6, 및 8). 각각의 TTX-R 플라스미드는 도 4d에 나타난 바와 같이, (a) AAV2의 야생형 역위 말단 반복부(ITR); (b) 발현 카세트 및 (c) AAV2의 변형된 역위 말단 반복부(ITR)를 포함한다.
ceDNA 플라스미드(즉, 이후 ceDNA 벡터를 생산하는데 사용된 ceDNA 벡터 템플레이트를 포함하는 플라스미드)는, 공지의 기술을 사용하여 제작되어, 적어도 바람직하게는 전사의 방향으로 작용 가능하게 연결된 이하의: 5’ ITR(돌연변이 또는 AAV 야생형); 프로모터를 포함하는 조절 요소, 관심 대상인 외인성 DNA 서열; 전사 종결 부위; 및 3’ ITR (상응하는 AAV ITR의 돌연변이 또는 야생형)을 제공할 수 있다. 특히, ITR 내의 뉴클레오티드 서열은 실질적으로 rep 및 cap 코딩 구역으로 대체된다. rep 서열은 이상적으로는 헬퍼 플라스미드 또는 벡터에 의해 인코딩되는 반면, 이는 대안적으로 벡터 플라스미드 그 자체에 보유될 수 있다. 이러한 경우에, rep 서열은 바람직하게는 ITR들 사이에 끼여있는 부위 밖에 위치하나, 또한 ITR들 사이에 끼여있는 부위 내에 위치할 수도 있다. 원하는 외인성 DNA 서열은 세포, 조직, 기관, 또는 대상체에서(즉, 시험관내, 생체 외, 또는 생체 내에서) 이의 폴리펩티드, 단백질, 또는 올리고뉴클레오티드의 전사 또는 발현을 유도하는 조절 요소에 작용 가능하게 연결된다. 이러한 조절 요소는 선택된 유전자와 정상적으로 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이종성 조절 서열이 이용될 수 있다. 유용한 이종성 조절 서열은 일반적으로 포유류 또는 바이러스 유전자를 인코딩하는 서열로부터 유래된 것들을 포함한다.
ceDNA 벡터 내의 원하는 외인성 DNA 서열은, 세포, 조직, 기관, 또는 대상체에서(즉, 시험관내, 생체 외, 또는 생체 내에서) 이의 인코딩된 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 전사 또는 발현을 유도하는 조절 요소에 작용 가능하게 연결될 수 있다. 이러한 조절 요소는 선택된 유전자와 정상적으로 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이종성 조절 서열이 이용될 수 있다. 유용한 이종성 조절 서열은 일반적으로 포유류 또는 바이러스 유전자를 인코딩하는 서열로부터 유래된 것들을 포함한다. 예는 프로모터, 예컨대 SV40 초기 프로모터; 마우스 유선 종양 바이러스 LTR 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순포진(herpes simplex) 바이러스 (HSV) 프로모터; 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 극초기 프로모터 부위(CMVIE); 라우스 육종(rous sarcoma) 바이러스(RSV) 프로모터; 합성 프로모터; 혼성체 프로모터 등과 같은 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 비바이러스성 유전자, 예컨대 쥣과 메탈로티오네인 유전자로부터 유래한 서열도, 본원에서 용도를 찾을 것이다. 많은 AAV 혈청형의 ITR 서열들이 알려져 있다.
각각의 TTX 플라스미드(TTX-R 및 TTX-L 둘 다)의 발현 카세트는, ITR 서열들 사이에 이하의 것들을 포함한다: (i) 인핸서/프로모터; (ii) 전이유전자를 위한 클로닝 부위; (iii) WHP 전사 후 반응 요소(WPRE); 및 (iv) 소 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리-아데닐화 신호(BGHpA). 독특한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위(R1-6)(예를 들어, 도 4c 및 도 4d 참고)도 또한 각 요소들 사이에 도입하여, 새로운 유전적 요소가 제작물 내의 특정 부위에 용이하게 도입하도록 한다. R3 및 R4 효소 부위는 클로닝 부위에 전이유전자의 오픈리딩프레임이 도입되도록 조작한다. 이러한 서열을 ThermoFisher Scientific에서 입수한 pFastBac HT B 플라스미드에 클로닝하였다.
모든 TTX 플라스미드는 외인성 서열을 추가로 포함하는데, 전이유전자(반딧불이 루시퍼라제, 또는 “Luc” 또는 인간 인자 IX, 또는 “FIX”)를 위한 오픈리딩프레임은, 또한 상기 외인성 서열 클로닝 부위에 삽입함으로써 생성하였다. 표 6a에 제공된 TTX 플라스미드의 다수의 예의 구조는, 각각 도 4d(우측 돌연변이 AAV ITR) 또는 도 4c(좌측 돌연변이 ITR)의 패턴으로 제작되었다. 각각의 TTX 플라스미드는 인핸서/프로모터 및 전이유전자(예를 들어, 다양한 프로모터를 갖는 루시퍼라제, 또는 CAG 프로모터를 갖는 FIX), 번역-후 조절 요소(WPRE) 및 폴리아데닐화 종결 신호(BGH 폴리A)를 포함하고, 이들은: (a) 플라스미드 내에서 발현 카세트의 좌측(L) 또는 우측(R) 중 하나에서 인코딩되는, 돌연변이 AAV2 역위 말단 반복부(ITR) 폴리뉴클레오티드 서열, 및 (b) 발현 카세트의 반대 말단의 야생형(비돌연변이) AAV2 ITR 서열에 의해 측접된다.
표 6a의 TTX 플라스미드는 서열번호: 8을 포함하는 WPRE, 및 루시퍼라제 전이유전자와 우측 ITR 사이의 요소로서 서열번호: 9를 포함하는 BGHpA를 갖도록 제작하였다. 또한, 각각의 TTX 플라스미드 (TTX-1 내지 TTX-10)는 또한 루시퍼라제 또는 인자 IX (서열번호: 12의 Padua FIX, 또는 서열번호: 11의 FIX) ORF 리포터 서열 중 한 쪽에 R3/R4 클로닝 부위(서열번호: 7)를 포함하였다.
표 6a에 대해:
ㆍ “wt-L”은 플라스미드에서 (서열번호: 51의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는) 발현 카세트의 좌측에서 인코딩되는 야생형 AAV2 ITR을 지칭하고;
ㆍ “wt-R”은 플라스미드 내에서 (서열번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는) 발현 카세트의 우측에서 인코딩되는 야생형 AAV2 ITR을 지칭하고;
ㆍ “mut-L”은 서열번호: 52에 제공된 돌연변이 AAV2 ITR 서열을 지칭하고;
ㆍ “mut-R”은 서열번호: 2에 제공된 돌연변이 AAV2 ITR 서열을 지칭하고;
ㆍ “CAG”는 (C) 사이토메갈로바이러스 극초기 인핸서 및 프로모터 요소, (A) 닭 베타-액틴 유전자의 제1 엑손 및 제1 인트론, (G) 서열번호: 3의 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체로부터 제작된 합성 프로모터 제작물을 지칭하고;
ㆍ “AAT w/SV40 intr”은 서열번호: 4의 SV40 큰 T-항원 인트론을 갖는 (인간 알파 1-항트립신) AAT를 지칭하고; 그리고
ㆍ “hEF1-α”는 서열번호: 6의 인간 신장 인자-1 알파 (EF-1 알파)를 지칭한다.
Figure pct00057
Figure pct00058
일 구현예에서, 벡터 폴리뉴클레오티드(ceDNA 벡터)는 서열번호: 1과 서열번호: 52; 및 서열번호: 2와 서열번호: 51로 이루어진 군으로부터 선택된 한 쌍의 2개의 상이한 ITR을 포함한다. 각각의 이들 양태의 일 구현예에서, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 벡터 폴리뉴클레오티드 또는 비-바이러스성 캡시드-불포함 DNA 벡터는, 서열번호: 101과 서열번호: 102; 서열번호: 103 과 서열번호: 104, 서열번호: 105와 서열번호: 106; 서열번호: 107 과 서열번호: 108; 서열번호: 109와 서열번호: 110; 서열번호: 111 과 서열번호: 112; 서열번호: 113 과 서열번호: 114; 및 서열번호: 115와 서열번호: 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 한 쌍의 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 서열번호: 500 내지 529로부터 선택된 임의의 서열을 포함하는 ITR을 갖지 않는다.
실시예 2: 선형, 연속 및 비-캡슐화 DNA 벡터를 생성하기 위한 박미드 및 바큘로바이러스
웹사이트(Thermo Fisher, https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10361012)에서 제공하는 프로토콜에 따라서, DH10Bac 컴피턴트 세포 (MAX Efficiency® DH10Bac™ 컴피턴트 세포, Thermo Fisher, cat# 10361012)를 TTX 또는 대조군 플라스미드 중 하나로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 플라스미드와 바큘로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 박미드(“TTX-박미드”)를 생성하였다. X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 아가 플레이트 상에서의 E. coli의 청색-백색 스크리닝(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다제 유전자에 대한 α-상보 작용을 제공한다)에 기초한 양성 선택에 의해, 재조합 박미드를 선별하였다. 백색 콜로니를 따서, 10 ml의 배지에 배양하였다.
재조합 박미드(“TTX-박미드”)를 E. coli 로부터 단리하고, FugeneHD™를 사용하여 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 형질감염시켜, 감염성 바큘로바이러스를 생성하였다. 부착성 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 25℃에서 T25 플라스크 내 50 ml 배지에서 배양하였다. 4일 후, (P0 바이러스를 함유하는) 배양 배지를 세포로부터 제거하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하여, 감염성 재조합 바큘로바이러스 입자(“TTX-바큘로바이러스” 또는 “비교 대상-바큘로바이러스”)를 배양액 중의 세포로부터의 바큘로바이러스와 분리하였다.
선택적으로, 50 ml 내지 500 ml 배지에서 미경험 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 바큘로바이러스(P0)를 증폭시켰다. 세포를 25℃, 130 rpm에서 배양하고, 세포가 18 내지 19 nm의 직경(14 내지 15 nm의 자연적인 직경), 및 4.0E+6 세포/mL 이하의 밀도에 이를 때까지, 세포 직경 및 생존능을 모니터링한다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 원심분리한 후 배지 중 P1 바큘로바이러스 입자를 수집하여 세포와 잔해물을 제거하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.
TTX-바큘로바이러스를 모아서, 바큘로바이러스의 감염 활성을 결정하였다. 특히, 2.5E+6 세포/ml의 4개 x 20 ml의 Sf9 세포 배양액에, 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석한 P1 바큘로바이러스를 처리하고, 배양하였다. 감염도는 4 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가의 속도와 세포 주기 정지, 및 세포 생존능의 변화에 의해 결정하였다.
Rep 78 서열(서열번호: 13)을 IE1 프로모터 절편(서열번호: 15)에 작용 가능하게 연결한 후, pFASTBACTM-이중 발현 벡터(ThermoFisher Catalog No: 10712024)의 BamHI/KpnI 제한 부위에 삽입하여, Rep 78 서열이 3’-말단에서 HSV TK 폴리 A 서열에 연결된다. Rep 52 서열(서열번호: 14)은 이후 벡터의 SalI-HindIII 부위에 클로닝되어, Rep52 서열을 5’에서는 pPH 프로모터에, 그리고 3’에서는 SV40 폴리 A 서열에 작용 가능하게 연결시켰다. 생성된 제작물을 본원에서 “Rep-플라스미드”라고 지칭한다.
웹사이트(Thermo Fisher®, https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10361012)에서 이용 가능한 판매자에게 제공받은 프로토콜을 따라서, Rep-플라스미드를 DH10Bac 컴피턴트 세포(MAX Efficiency® DH10Bac™ 컴피턴트 세포, Thermo Fisher, cat# 10361012)에 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 Rep-플라스미드와 바큘로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 박미드(“Rep-박미드”)를 생성하였다. X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 아가 플레이트 상에서의 E. coli의 청색-백색 스크리닝(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다제 유전자에 대한 α-상보 작용을 제공한다)에 기초한 양성 선택에 의해, 재조합 박미드를 선별하였다. 단리된 백색 콜로니를 선별하고, 10 ml의 선택된 배지(LB 브로쓰 중의 카나마이신, 겐타마이신, 테트라시클린)에 접종하였다. 재조합 박미드(Rep-박미드)를 대장균에서 단리하고, Rep-박미드를 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 형질감염시켜, 감염성 바큘로바이러스를 생산하였다.
Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 50 ml 배지에서 4일 동안 배양하고, 감염성 재조합 바큘로바이러스(“Rep-바큘로바이러스”)를 배양물에서 단리하였다. 선택적으로, 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 바큘로바이러스(P0)를 증폭시키고, 50 ml 내지 500 ml 배지에서 배양하였다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 원심분리 또는 여과 또는 또 다른 분별 과정을 통해 세포를 분리하여, 배지 내 P1 바큘로바이러스 입자를 수집하였다. Rep-바큘로바이러스를 수집하고, 바큘로바이러스의 감염 활성을 측정하였다. 구체적으로, 4개 x 20 ml Sf9 세포 배양물(2.5x106개의 세포/ml)을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석된 P1 바큘로바이러스로 처리하고, 배양하였다. 감염도는 4 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가의 속도와 세포 주기 정지, 및 세포 생존능의 변화에 의해 결정하였다.
이후, (1) TTX 또는 α(알파)-바큘로바이러스, 또는 (2) 상기 기재된 Rep 바큘로바이러스 중 하나를 함유하는 Sf 세포 배양 배지를, Sf9 세포의 새로운 배지(2.5E+6 세포/ml, 20 ml)에 각각 1:1000 및 1:10,000의 비로 첨가하였다. 이어서, 세포를 25℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 공동 감염 4일 내지 5일 후, 세포 직경과 생존력을 검출하였다. 세포 직경이 18 nm 내지 20 nm에 도달하고, 생존력이 약 70% 내지 80%에 도달하면, 세포 배양물을 원심분리하고, 배지를 제거하고, 세포 펠릿을 수집하였다. 세포 펠릿을 먼저 적절한 부피의 물 또는 완충액인 수성 배지에 재현탁시켰다. Qiagen Midi 플러스 정제 프로토콜(Qiagen cat #12945, 컬럼당 0.2 mg의 가공된 세포 펠릿 질량)을 사용하여, TTX 또는 α(알파)-벡터를 세포로부터 단리 및 정제하였다.
Sf9 곤충 세포로부터 생산 및 정제된 DNA 벡터(예를 들어TTX 벡터)의 수율은, 초기에 260 nm에서의 UV흡광도를 기준으로 결정된다. UV흡광도를 기준으로 결정된 다양한 TTX-DNA 벡터의 수율은, 이하의 표 7에서 제공된다.
Figure pct00059
실시예 3: ceDNA 벡터의 생산을 확인하기 위한 변성 겔 전기영동
단리된 DNA 벡터 물질이 정의에 의해 요구되는 바와 같은 공유적으로 폐쇄된-말단인지를 정성적인 경향으로 입증하기 위해, 샘플을 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여, 단일 제한 부위를 갖는, 바람직하게는 불균일한 크기(예를 들어: 1000 bp 및 2000 bp)의 2개의 절단 산물을 생성하는 DNA 벡터 서열에 의해 확인하였다. 절단하고 변성 겔에서 전기영동한 후(2개의 상보성 DNA 가닥을 분리시킨), 선형의 비-공유적으로 폐쇄된 DNA는 1000 bp 및 2000 bp의 크기로 분해될 것이지만, 공유적으로 폐쇄된 DNA는 2x 크기(2000 bp 및 4000 bp)로 분해될 것인데, 이는 2개의 DNA 가닥이 연결되어, 이제 펼쳐진 상태이며, (단일 가닥이기는 해도) 2배의 길이이기 때문이다. 또한, 단량체, 이량체, 및 n-량체 형태의 DNA 벡터를 절단시키면, 모두 다량체 DNA 벡터의 말단-대-말단 연결 때문에, 동일한 크기 절편으로 분해될 것이다(도 5b 참고).
본원에 사용된 “미변성 겔 및 변성 조건 하의 아가로스 겔 전기영동에 의한 DNA 벡터의 식별을 위한 검정법”이라는 어구는, 이하의 검정법을 지칭한다. 제한 엔도뉴클레아제를 위해, 단일 절단 효소를 선택하여, DNA 벡터 길이의 대략 1/3x 및 2/3x의 산물을 생성한다. 이는, 미변성 및 변성 겔 모두에 대한 밴드를 분리한다. 변성 전, 샘플에서 완충액을 제거하는 것이 중요하다. Qiagen PCR clean-up 키트 (Qiagen cat# 28104) 또는 탈염 “스핀 컬럼”, 예를 들어 GE HealthCare IlustraTM MicroSpinTM G-25 컬럼(GE Healthcare cat # 27532501)은, 엔도뉴클레아제 절단과 함께 잘 작용한다.
1. DNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제(들)로 절단시킨다.
2. 이를 Qiagen PCR clean-up 키트에 적용하고, dH2O (30ul)로 용출한다
3. 4 ul의 10x 변성 용액(10x = 0.5 M NaOH, 10 mM EDTA)을 첨가한다
4. 6 ul의 10x 겔 로딩 용액(완충되지 않은 염료 추가(dye plus) 글리세롤 또는 피콜(ficoll))을 첨가한다
5. 10x 변성 용액을 4x의 최종 농도로 첨가함으로써, Qiagen 키트 없이 DNA 래더를 제조할 수 있다.
6. 마이크로웨이브 내에서 끓을 때까지 H2O 중 0.8 내지 1.0 % 겔을 제조하고, 이를 주위 온도에서 수 분 동안 방치한다.
7. 이를 콤(comb)이 달린 겔 트레이에 붓고, 서늘한 공간에 두어, 중합을 촉진시킨다(2hr)
8. 트레이를 전기영동 상자에 넣고, 1 mMEDTA 및 200 mM NaOH으로 2h 동안 평형화하고, 겔과 겔 상자에서 NaOH 농도가 확실히 균일해지도록 가끔 교반한다.
9. 1L의 1x 변성 용액(50 mM NaOH, 1 mM EDTA)을 제조한다
10. 충분한 부피를 겔 상자에 부어, 겔이 0.5 cm 초과의 깊이로 잠기도록 한다.
11. 큰 겔(15 내지 20 cm)- 밤새 25V에서 겔을 전개시킨다. 중간 겔(8 내지 11 cm)은 20V에서 밤새 전개시킨다.
겔 전개 이후
12. 겔을 트레이에 옮기고, dH2O로 세척한다
13. 배수하고, (20분 동안 가볍게 교반하면서) 1x TBE 또는 TAE에서 겔을 중화한다
14. (20분 동안 가볍게 교반하면서) 1x SYBR Gold가 포함된 dH2O (또는 1x TBE/TAE)에 겔을 옮긴다
Thermo Fisher, SYBR® Gold Nucleic Acid Stain (10,000X Concentrate in DMSO) 카탈로그 번호: S11494
15. 겔을 표면 형광(청색) 또는 UV(312 nm)에 의해 화상화한다.
단리된 DNA 벡터-벡터를 도 5 및 도 6에 나타낸 미변성 또는 변성 상태 하에 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인하였다. DNA 벡터는 도 5a에 제공된 미변성 겔에서 다수의 밴드를 생성한다. 각 밴드는 미변성 상태에서, 예를 들어, 연속, 불-연속, 단량체, 이량체 등의 상이한 배치를 갖는 벡터를 나타낼 수 있다.
단리된 DNA 벡터의 구조를, 제한 엔도뉴클레아제로 (본원에 기재된) 공동-감염된 Sf9 세포로부터 얻은 DNA를 절단시킴으로써 추가로 분석하였고, 상기 엔도뉴클레아제는 a) DNA 벡터 내의 단 하나의 단일 절단 부위의 존재, 및 b) 0.8% 변성 아가로스 겔 상에서 분획화될 때 충분히 명확하게 보일 정도로 큰, 생성된 절편 (>800 bp)를 갖도록 선택한다.
특히, 동일한 양(OD260을 기준으로 할 때 2 μg)의 TTX-플라스미드 및 TTX-벡터를, 37℃에서 1시간 동안 제한 엔도뉴클레아제로 절단시켰다. 절단 후, DNA 벡터 물질을 QIAquick 컬럼을 사용하여 단리하고, 물로 용출시켰다. 샘플을 변성 용액(0.05M NaOH, 1 mM EDTA)에서 변성시키고, 그 동안 물 중에 제조된 0.8% 아가로스 겔을 2시간 동안 평형 완충액(1 mM EDTA, 200 mM NaOH)에서 사전-평형화하였다. 이후, 샘플을 1X 변성 용액(50 mM NaOH, 1 mM EDTA)에 담그고, 4℃에서 밤새 겔 상에 전개시켰다. 다음 날, 겔을 세척하고, 20분 동안 TBE에서 중화하고, 1x SYBR Gold 수용액에 1시간 동안 담가두고, UV/청색 조명 하에 화상화하였다.
DNA 벡터의 존재는, 초기에 미변성 겔 상의 특징적인 다중-밴드 패턴에 의해 식별한 후(간격을 둔 1차 및 2차 밴드는, 2차 밴드가 1차 밴드 질량의 두 배를 갖는 물질을 나타낸다는 사실을 가리킨다), 변성된 겔에서 도 5a의 우측에 나타난 특징적인 다중 밴드 패턴에 의해 확인하였다. 도 5b에 나타난 바와 같이, 불-연속 구조를 갖는 선형 DNA 벡터와 선형의 연속 구조를 갖는 TTX-벡터는 이들의 반응 산물의 크기에 의해 구별할 수 있다- 예를 들어, 불-연속 구조를 갖는 DNA 벡터는1 kb 및 2 kb 절편을 생성할 것으로 예상되는 반면, 연속 구조를 갖는 비-캡시드화 벡터는 2 kb 및 4 kb 절편을 생성할 것으로 예상된다.
도 6은 엔도뉴클레아제에 의해 절단되거나(+), 되지 않은(-), TTX 벡터 1과 2, 3과 4, 5와 6, 그리고 7과 8 (모두 상기 표 1A에 모두 기재됨)을 갖는 실제 변성 겔의 예시적인 도면이다. 각각의 TTX 벡터는 엔도뉴클레아제 반응 이후 2개의 밴드(*)를 생성하였다. 크기 마커를 기준으로 결정된 이들의 2개의 밴드 크기는, 상기 도면의 하부에 제공되어 있다. 밴드 크기는 각각의 TTX 벡터가 연속 구조를 갖는다는 것을 확인한다.
UV 흡광도에 대한 TTX-플라스미드의 기여는, TTX-벡터의 형광 강도를 기준값에 비교함으로써 추정하였다. 예를 들어, UV 흡광도를 기준으로 하는 경우, 4 μg의 TTX-벡터를 겔에 로딩하였고, TTX-벡터 형광 강도는 1 μg으로 알려진 2 kb 밴드와 균등하여, 1 μg의 TTX-벡터가 있다. 따라서, TTX-벡터는 총 UV 흡광 물질의 25%이다. 이후, 겔 상의 밴드 강도를 밴드가 나타내는 계산된 유입량에 대해 플로팅한다- 예를 들어, 총 TTX-벡터가 8 kb이고, 절단된 비교 밴드가 2 kb인 경우, 밴드 강도는 총 유입량의 25%로서 플로팅될 것이고, 이 경우 1.0 μg 유입량에 대해 .25 μg일 것이다. TTX-플라스미드 적정을 사용하여 표준 곡선을 플로팅하고, 이후 회귀 직선 공식(regression line equation)을 사용하여 TTX-벡터 밴드의 양을 계산하는데, 이는 이후 TTX-벡터에 의해 나타나는 총 유입량의 퍼센트, 또는 퍼센트 순도를 결정하는데 사용될 수 있다(도 7).
실시예 4: DNA 벡터는 시험관 내에서 전이유전자 인코딩된 단백질을 발현한다
인간 인자 IX mRNA의 SA 야생형 cDNA 서열(“wtFIX”, 서열번호: 11) 또는 cDNA 서열의 Padua 변형체(“PaduaFIX”, 서열번호: 12)를, TTX-플라스미드 1의 클로닝 부위에 도입하여, 각각 TTX-플라스미드 1-wtFIX 및 TTX-플라스미드 1-PaduaFIX를 생성하였다. 이 플라스미드들을 Sf9 곤충 세포에 도입하고, 본원에 기재된 방법을 사용하여, 각각 TTX-박미드 1-wtFIX와 TTX-박미드 1-PaduaFIX, 및 TTX-바큘로바이러스 1-wtFIX와 TTX-바큘로바이러스 1-PaduaFIX를 생성하는데 사용하였다. TTX-플라스미드 및 TTX-벡터로부터의 시험관 내 단백질 발현은, Fugene6 형질감염 시약(3:1 Fugene6:DNA)를 사용하여, HEK293 세포(2E+5 세포/웰, 96 웰-플레이트)를 250 ng/웰의 (1) TTX-플라스미드 1-wtFIX, (2) TTX-플라스미드 1-PaduaFIX, (3) TTX-벡터 1-wtFIX, (4) TTX-벡터 1-PaduaFIX, (5) β(베타)-플라스미드 1-wtFIX, 또는 (6) β(베타)-벡터 1-wtFIX에 의해 형질감염시킴으로써 시험하였다. 웨스턴 블롯 분석의 결과가 도 8에 제공되어 있다. FIX-항체 반응은 55 kDa-밴드를 나타내었는데, 이는 생산된 FIX 단백질의 질량에 해당한다. β(베타)-플라스미드 1-wtFIX 또는 β(베타)-벡터 1-wtFIX에 의해 형질감염된 음성 대조군의 용해물은, 검출가능한 양의 FIX 단백질을 생산하지 않았다. 이 결과는 TTX-벡터 1이 치료 유전자, 예컨대 인간 인자 IX를 인코딩하는 유전자의 효과적인 전달 및 발현에 사용될 수 있다는 것을 확인한다.
ELISA: 간략히, 형질감염된 세포로부터의 배양 배지를 2개의 항-FIX 항체 처리된 웰에 첨가하고, 1시간 동안 배양한 후, 세척하고, 탐지 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 샘플을 다시 세척하고, TMB 기질을 첨가하여, 10분 동안 현상하고, 중단하고, 샘플에 대해 즉시 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다. TMB 기질 반응 이후의 샘플의 예는 도 15a에 제공되어 있고, 샘플의 450 nm에서의 흡광도를 기준으로 결정된 각각의 샘플 내의 FIX의 농도는 도 15a에 제공되어 있다. TTX-플라스미드 1 및 TTX-벡터 1으로부터의 FIX 단백질의 발현은 높은 수준으로 탐지된 반면, β (비교)-플라스미드 또는 β (비교) 벡터로부터는 FIX의 유의한 발현이 없었다.
이것은 5’에서 3’ 방향으로 WT-복제 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호: 51), CAG 프로모터(서열번호: 3), R3/R4 클로닝 부위(서열번호: 7), WPRE(서열번호: 8), BGHpA (서열번호: 9) 및 변형된 복제 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호: 2)을 포함하는, TTX-플라스미드 1으로부터 생산된 TTX-벡터 1이, WPRE(서열번호: 8) 및 BGHpA(서열번호: 9)를 포함하지 않는, α(알파)-플라스미드 1으로부터 생산된 α(알파)-벡터 1에 비해, 전이유전자의 발현 유도에 유의하게 더 효과적이라는 사실을 한 번 더 확인한다.
실시예 5: 인자 IX와 cGAS 억제제를 공동-발현하는 ceDNA의 제조
카포시 육종-관련 헤르페스바이러스 단백질 ORF52(서열번호: 882) 또는 cGAS를 억제하는 이의 변형체, 또는 (서열번호: 882의 아미노산 161 내지 1162이 없는) 절단된 세포질 LANA 동형체(LANAΔ161 또는 서열번호: 884)를, 프로모터에 연결하고, 이를 실시예 1 및 실시예 4에 기재된 바와 같이, 인자 IX 전이유전자를 인코딩하는 TTX 9 또는 TTX 10 플라스미드의 클로닝 부위 R5에 삽입한다. 따라서, 실시예 2 내지3에 기재된 바와 같은 인자 IX와 cGAS 억제제를 모두 인코딩하는 ceDNA가 제조된다.
실시예 6: ceDNA에 의해 발현된 cGAS 억제제의 발현의 확인
ceDNA에 의해 공동 발현되는 원하는 cGAS 억제제, 예컨대 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스 단백질 ORF52(서열번호: 882), 또는 cGAS를 억제하는 이의 변형체, 또는 절단된 세포질 LANA 동형체 (서열번호: 884)의 발현은, HeLa 세포 및 cGAS 억제제에 특이적인 항체, 예컨대 문헌[“Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus inhibitor of cGAS (KicGAS) Encoded by ORF52, is an Abundant Tegument protein and Is Required for Production of Infectious Progeny Viruses,” J. Virol. 2016, 90(11): 5329]에 기재된 ORF52에 대한 항체를 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, HeLA 세포를 배양하고, 예를 들어, Fusegene6 형질감염 시약(3:1; fusgene6:DNA)을 사용하여 인자 IX와 원하는 cGAS 억제제를 공동-발현하는 제작물의 일시적인 형질감염을 실시한다. 당업계의 숙련자들에게 알려진 웨스턴 블롯 기술 및/또는 유세포 분석을 사용하여, cGAS 억제제의 발현을 탐지한다. 인자 IX의 발현은 실시예 4에 기재된 바와 같이 확인한다.
실시예 7: 인자 IX와 TLR-9 억제제를 공동-발현하는 ceDNA의 제조
이하의 서열, 예컨대 (TCCTGGCGGGGAAGT, 서열번호: 889), ODN-2114 (TCCTGGAGGGGAAGT, 서열번호: 890), poly-G (GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, 서열번호: 891), ODN-A151 (TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG, 서열번호: 892), G-ODN (CTCC-TATTGGGGGTTTCCTAT, 서열번호: 893), IRS-869 (TCCTGGAGGGGTTGT, 서열번호: 894), INH-1 (CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG, 서열번호: 895), INH-4 (TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA, 서열번호: 896), (IRS-661 TGCTTGCAAGCTT-GCAAGCA, 서열번호: 897), 4024 (TCCTGGATGGGAAGT, 서열번호: 898), 4084F (CCTGGATGGGAA, 서열번호: 899), INH-13 (CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA, 서열번호: 900), INH-18 (CCTGGATGGGAACTTACCGCTGCA, 서열번호: 901), 및 IRS-954 TGCTCCTGGAGGGGTTGT, 서열번호: 902)을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드는, 5’에서 3’로 어닐링 이후, 3’에서 5’ 가닥에 상보적인 점착성 말단을 갖도록 조작되어, 이들은 실시예 1 및 실시예 4에 기재된 바와 같이 결찰에 의해 사전 선택된 제한 클로닝 부위, 예를 들어 R5, 또는 인자 IX 전이유전자를 인코딩하는 TTX 9 또는 TTX 10 플라스미드의 다른 부위에 삽입될 수 있다.
예를 들어, 적절한 제한 부위를 갖는 올리고는 각 가닥을 적합한 완충액: 예를 들어 100 mM 포타슘 아세테이트; 30 mM HEPES, pH 7.5) 중에서 균등한 몰량으로 혼합함으로써 어닐링하고, 이를 2분 동안 94℃로 가열하여, 서서히 냉각시켰다. 올리고는 다수의 2차 구조를 갖는 것으로 예측되므로, 더욱 점진적인 냉각/어닐링 단계가 유리하다. 이것은 올리고 용액을 수조 또는 히팅 블록 내에 두고, 기계의 플러그를 뽑고/기계를 꺼버림으로써 이루어진다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제 불포함 완충액에 희석하고, 4℃에서 이들의 이중-가닥 어닐링된 형태를 저장할 수 있다. 이후, TLR-9 억제성 올리고 서열을 갖는ceDNA 플라스미드를 (예를 들어, 겔 전기영동 또는 컬럼에 의해) 정제하여, cDNA 벡터를 제조하는데 사용한다. 인자 IX를 인코딩하고, TLR-9 길항제를 포함하는 ceDNA를 제조할 수 있다.
실시예 8: ceDNA로부터의 조절된 전이유전자 발현: ceDNA 벡터로부터의 전이유전자 발현은 생체 내에서 재-용량 투여에 의해 지속되고/되거나 증가될 수 있다.
ceDNA 벡터를 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라, CAG 프로모터(서열번호: 3)를 포함하는 ceDNA 플라스미드를 사용하여 제조하였고, 루시퍼라제 전이유전자(서열번호: 71)는 비대칭적인 ITR(예를 들어, 5’ WT-ITR (서열번호: 1)와 3’ 변형된-ITR (서열번호: 2) 사이에 측접된 예시적인 인플라마좀 길항제로서 사용되며, 이는 생체 내에서 상이한 치료 프로그램에서 평가되었다. 이 ceDNA 벡터를 실시예 6 내지 10에 기재된 추후의 모든 실험에서 사용하였다. 실시예 6에서, ceDNA 벡터를 정제하고, 이를 지질 나노 입자(LNP ceDNA)와 함께 제제화하여, 각각의 CD-1® IGS 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 콜레스테롤 및 PEG-지질을 포함하는 4개의 성분을 포함하는 적합한 지질 블렌드과 함께 리포좀을 제제화하여, 지질 나노 입자(LNP) 리포좀을 형성하였다.
생체 내에서 장기간에 걸친 ceDNA 벡터로부터의 전이유전자의 지속된 발현을 평가하기 위해, 멸균 PBS 중의 LNP-ceDNA를 대략 5 내지 7주령의 CD-1® IGS 마우스의 꼬리 정맥에 정맥내 주사에 의해 투여하였다. 3개의 상이한 투여량 그룹을 평가하였다: 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 및 1.0 mg/kg, 그룹당 10마리의 마우스(그룹당 15마리의 마우스를 갖는 1.0 mg/kg는 제외). 주사는 0일차에 투여하였다. 28일차에, 각 그룹으로부터의 5마리의 마우스에 추가적인 동일 용량을 주사하였다. 루시퍼라제 발현은 CD-1® IGS 마우스(Charles River Laboratories; WT 마우스)로의 정맥내 투여 이후 IVIS 화상화에 의해 측정하였다. 루시퍼라제 발현은 3, 4, 7, 14, 21, 28, 31, 35, 및 42일차에, 그리고 42일 내지 110일 사이에는 일상적으로(예를 들어, 주 1회, 주 2회, 또는 10-일마다 또는, 2주마다), 150 mg/kg의 루시페린 기질을 복강내 주사한 후, IVIS 화상화에 의해 평가하였다. 3개의 상이한 투여 프로토콜 이후 적어도 132일 동안 IVIS 화상화에 의해 측정했을 때의, 예시적인 인플라마좀 길항제로서의 루시퍼라제 전이유전자 발현(데이터는 나타내지 않음).
확장 연구는 LNP-ceDNA 처리된 대상체의 LNP-ceDNA 발현 루시퍼라제의 재-용량, 예를 들어, 재-투여의 효과를 조사하기 위해 실시하였다. 특히, 이는 발현 수준이 ceDNA 벡터의 1회 이상의 추가적인 투여에 의해 증가할 수 있는지를 결정하기 위해 평가되었다.
이 연구에서, ceDNA 벡터로부터의 루시퍼라제 발현의 생체분포는, 0일차 및 28일차에서 1.0 mg/kg의 초기 정맥내 투여(즉, 프라이밍 용량) 이후, CD-1® IGS 마우스에서 IVIS에 의해 평가하였다(그룹 A). ceDNA 벡터의 제2 투여는, 84일차에 꼬리 정맥에 1.2 mL 중 3 mg/kg (그룹 B) 또는 10 mg/kg (그룹 C)의 초기 정맥주사를 통해 투여하였다. 이 연구에서는, 다섯(5) 마리의 CD-1® 마우스를 각각의 A, B 및 C 그룹에 사용하였다. 루시퍼라제 발현에 대한 마우스의 IVIS 화상화는, 상기 기재된 바와 같이 추가적인 투여 전 49일차, 56일차, 63일차, 및 70일차에, 뿐만 아니라 재용량-후 84일차에, 그리고 91일차, 98일차, 105일차, 112일차 및 132일차에 실시하였다. 루시퍼라제 발현은 적어도 110일(평가되는 최장 기간)이 될 때까지, 모두 3개의 그룹 A, B 및 C에서 평가 및 탐지되었다.
루시퍼라제의 발현 수준은, 루시페린의 존재 하에 루시퍼라제 활성을 평가할 때, LNP-ceDNA-Luc의 재-용량(즉, ceDNA 조성물의 재-투여)에 의해 증가하는 것으로 나타났다. 3개의 상이한 투여 프로토콜(A, B 및 C 그룹) 이후 적어도 110일 동안 IVIS 화상화에 의해 측정될 때의, 예시적인 인플라마좀 길항제로서의 루시퍼라제 전이유전자 발현. 임의의 추가적인 재용량 (1 mg/kg 프라이밍 용량(즉, 그룹 A) 치료를 받지 않았던 마우스에서는, 연구 지속 기간 동안 안정한 루시퍼라제 발현이 관찰되었다. 3 mg/kg의 ceDNA 벡터의 재 용량을 투여받았던 그룹 B의 마우스는, 그룹 C의 마우스에 비해 관찰된 발광(radiance)이 대략 7-배 증가한 것으로 나타났다. 놀랍게도, 10 mg/kg의 ceDNA 벡터를 재-투여받은 마우스는, 어떠한 재용량도 받지 않은 마우스(그룹 A)에 비해 관찰된 루시퍼라제 발광이 17-배 증가하였다.
그룹 A는, 0일차 및 28일차에 1 mg/kg의 ceDNA 벡터를 꼬리 정맥에 정맥내 투여한 후, CD-1® IGS 마우스에서의 루시퍼라제 발현을 나타낸다. 그룹 B 및 C는 제1 시점(0일차)에서 1 mg/kg의 ceDNA 벡터가 투여된 CD-1® IGS 마우스, 및 84일의 제2 시점에서 ceDNA 벡터의 투여에 의해 재-투여된 CD-1® IGS 마우스에서의 루시퍼라제 발현을 나타낸다. ceDNA 벡터의 제2 투여(즉, 재-용량)는, 발현을 적어도 7-배, 심지어 최대 17-배 증가시켰다.
그룹 B에서 재-용량 투여시 ceDNA 벡터의 용량 (즉, 양)을 3-배 증가시켰더니(즉, 3 mg/kg이 재-용량으로 투여됨), 루시퍼라제의 발현이 7-배 증가하였다. 또한 예기치 못하게, 그룹 C에서 재-용량 투여의 ceDNA 벡터의 양을 10-배 증가시켰더니(즉, 10 mg/kg 재-용량이 투여됨), 루시퍼라제의 발현이 17-배 증가하였다. 따라서, ceDNA의 제2 투여(즉, 재-용량)는 발현을 적어도 7-배, 심지어 최대 17-배 증가시켰다. 이것은 재-용량에 의한 전이유전자 발현의 증가가, 기대한 것보다 크고, 재-용량 투여시 ceDNA 벡터의 용량 또는 양에 의존적이라는 것을 나타내며, 0일차의 초기 프라이밍 투여로부터의 초기 전이유전자 발현에 대해 시너지 작용을 하는 것으로 보인다. 즉, 전이유전자 발현의 용량-의존적인 증가는 추가적이지 않고, 오히려, 전이유전자의 발현 수준은 용량-의존적이며, 각 시점에 투여된 ceDNA 벡터 양의 합산값을 초과한다.
그룹 B 및 C는 둘 다 제2 시점에 ceDNA 벡터를 재-투여받지 않았던 대조군 마우스(그룹 A)에 비해, 루시퍼라제의 발현에서 유의한 용량-의존적인 증가를 나타내었다. 종합하면, 이 데이터들은, ceDNA 벡터로부터의 전이유전자의 발현이, 적어도 제2 시점에서 ceDNA 벡터의 재-용량(즉, 재-투여)에 의해 용량-의존적인 방식으로 증가할 수 있다는 것을 나타낸다.
종합하면, 이 데이터들은 ceDNA 벡터로부터의 전이유전자, 예를 들어, 인플라마좀(inflammasone) 길항제의 발현 수준이 적어도 84일 동안 지속적인 수준으로 유지될 수 있으며, 적어도 제2 시점에서 재용량의 ceDNA 벡터가 투여된 후 생체 내에서 증가할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 9: 과-포화량의 라파마이신을 갖는 합성 나노담체
중합체 PLGA (3:1 락티드: 글리콜리드, 고유 점도0.39 dL/g) 및 PLA-PEG (5 kDa PEG 블록, 고유 점도0.36 dL/g) 뿐만 아니라 라파마이신 (RAPA) 제제를 함유하는 나노담체 조성물은, 물 중 오일 에멀전 증발 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 유기 상은 중합체 및 RAPA를 디클로로메탄에 용해시킴으로써 형성한다. 에멀전은 계면활성제인 폴리비닐알콜(PVA)를 함유하는 수상 중에서 유기 상을 균질화함으로써 형성된다. 이후, 에멀전을 더 많은 양의 수성 완충액과 합치고, 혼합하여, 용매를 증발시킨다. RAPA 함량이 증가함에 따라 그 조성물이 시스템의 RAPA 포화 제한을 넘어서도록, 상이한 조성물 중의 RAPA 함량을 변화시킨다. 조성물의 포화 한계에서의 RAPA 함량은, 수상 및 분산된 나노담체 상에서의 RAPA의 용해도를 사용하여 계산한다. 수상 중의 1차 용질로서 PVA를 함유하는 조성물에 대하여, 수상 중의 RAPA 용해도는 PVA 농도에 비례하여, RAPA가 용해된 PVA에 대해 1:125의 질량 비로 용해된다는 사실이 밝혀졌다. 나노담체 중합체로서 기재된 PLGA 및 PLA-PEG를 함유하는 조성물에 대해서는, 분산된 나노담체 상 중의 RAPA 용해도가 7.2% wt/wt라고 밝혀졌다. 이하의 수식은 조성물에 대한 포화 한계에서의 RAPA 함량을 계산하는데 사용될 수 있다:
RAPA 함량 = V(0.008c PVA + 0.072c pol )
상기 수식에서, c PVA 는 PVA의 질량 농도이고, c pol 는 중합체의 합산된 질량 농도이고, V는 증발의 종결시 나노담체 현탁제의 부피이다.
Figure pct00060
도 1, 2 및 3에서, 지속적인 60%의 RAPA가 회수되지 않는데, 이는 수상과 유기상 사이의 반-포화 균형상태 상태(regime)를 나타낸다. 더 많은 양의 RAPA를 함유하는 잔여 나노담체에 대해서는, 지속적인 6.8 mg의 RAPA가 회수되지 않는다. 지속적인 절대 질량 손실은, 시스템이 과포화 상태에 있다는 것을 나타낸다(즉, 하나 이상의 상으로 과-포화되어 있다).
실시예 10: 과-포화된 라파마이신을 갖는 합성 나노 담체가 항체 발생을 없애거나, 지연시킨다
중합체 PLGA (3:1 락티드:글리콜리드, 고유 점도 0.39 dL/g) 및 PLA-PEG (5 kDa PEG 블록, 고유 점도 0.36 dL/g) 뿐만 아니라 RAPA 제제를 함유하는 나노담체 조성물은, 실시예 5에 기재된 물-중 오일 에멀전 증발 방법을 사용하여 합성된다. RAPA 함량이 증가함에 따라 그 조성물이 시스템의 RAPA 포화 제한을 넘어서도록, 상이한 조성물 중의 RAPA 함량을 변화시킨다.
Figure pct00061
조성물의 면역 관용 유도 능력을 평가하기 위하여, 마우스에 나노담체 및 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH)을 공동-투여로 주 3회 정맥내 주사한 후, KLH만을 단독으로 주 1회 면역화하였다. 그 후, KLH 면역화 이후, 마우스의 혈장을 KLH에 대한 항체에 대해 분석하였다. 과-포화 상태로 제조되고, 8% 이상의 최종 RAPA 로딩량을 갖는 조성물은, KLH에 대한 항체를 발생시키지 않거나, 포화 상태 이하이고, 5% 이하의 최종 RAPA 로딩량을 갖는 조성물보다 더 큰 정도로 KLH에 대한 항체 발달을 지연시켰다.
실시예 11: 과-포화량의 라파마이신을 갖는 합성 나노담체
중합체 PLA (고유 점도0.41 dL/g) 및 PLA-PEG (5 kDa PEG 블록, 고유 점도0.50 dL/g) 뿐만 아니라 RAPA 제제를 함유하는 나노담체 조성물을, 실시예 9에 기재된 물-중-오일 에멀전 증발 방법을 사용하여 합성하였다. 상이한 조성물 중의 RAPA 함량은, RAPA 함량이 증가할 때 조성물이 시스템의 RAPA 포화 한계를 넘어서도록 변화시켰다. 조성물에 대한 포화 한계시의 RAPA 함량은, 실시예 9에 기재된 방법을 사용하여 계산하였다. 나노담체 중합체로서 기재된 PLA 및 PLA-PEG를 함유하는 조성물에 대하여, 분산된 나노담체 상 중의 RAPA 용해도는 8.4% wt/wt인 것으로 밝혀졌다. 조성물에 대한 포화 한계시에 RAPA 함량을 계산하기 위해, 이하의 수식을 사용하였다:
RAPA 함량 = V(0.008c PVA + 0.084c pol )
상기 수식에서, c PVA 는 PVA의 질량 농도이고, c pol 는 중합체의 합산된 질량 농도이고, V는 증발의 종결시 나노담체 현탁제의 부피이다. 모든 나노담체 로트를 형성의 종결시 0.22 μm 필터를 통해 여과한다.
Figure pct00062
나노담체 12 내지 15에 대해 증가된 양의 RAPA를 첨가했음에도 불구하고, 나노담체 내의 최종 RAPA 함량은 증가하지 않은 반면, 필터 처리량은 감소하였다. 이것은 조성물이 RAPA로 과포화되었고, 과다 RAPA가 세척 및/또는 여과 과정 동안 제거된다는 사실을 나타낸다.
실시예 12: 라파마이신과 공동 투여된 인자 IX 또는 인자 VIII를 인코딩하는 ceDNA를 갖는, 혈우병 B에 대한 인자 IX 또는 VIII
해로운 돌연변이(예를 들어, hF1X에 대해서는 R333Q)를 갖는 hFIX 또는 hFVIII 서열의 녹-인을 포함하는 인자 IX 또는 인자 VIII 결핍성 마우스에서, 실험을 실시한다. 수컷인 인자 IX 또는 FVIII 녹아웃 마우스는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체와 함께 공동 투여된 단일 또는 반복 용량의 LNP-ceDNA (지질 나노 입자 ceDNA)를 받았고, 여기에서 LNP-ceDNA와 라파마이신, 또는 라파마이신 유사체는 별개의 조성물 중에 투여할 수 있다. 1.2 mL 부피 중의 0.3 내지 5 mg/kg의 용량의 LNP-ceDNA 벡터와, 예를 들어, 0.05 mg/kg, 0.1 mg/kg 최대 5 mg/kg로 투여된 나노담체 라파마이신(예를 들어, 실시예 9 내지 11에 기재된 과포화된 라파마이신(예를 들어 SVP-라파마이신)), 또는 이의 유사체를 각각의 마우스에 공동-투여하였다. 치료 유효 용량은 (예를 들어, 단일 및 반복 투여시) 면역 반응의 억제 효능을 모니터링하고, 원하는 양의 전이유전자 발현을 측정함으로써 결정한다. 각 용량은 i.v. 투여를 통해 투여할 수 있다. SVP-Rap은 예를 들어 0일차 및 14일차에 공동-투여할 수 있다.
혈장 내 인자 IX 또는 인자 VIII의 발현은, 실시예 4에 기재된 바와 같이, 다양한 시점, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 1000 및 200일차 또는 그 이상 등에서 ELISA에 의해 평가한다. 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간과 출혈 시간도 또한 인자 VIII 또는 인자 IX의 발현에 대한 라파마이신, 또는 그 유사체의 공동-투여의 효능 및 효과를 결정할 때 측정될 수 있다. 라파마이신과 함께 공동-투여된 ceDNA 벡터를 받은 마우스는, 단지 ceDNA 벡터만을 받고 라파마이신 또는 이의 유사체를 받지 않은 마우스에 비해, 더 오랜 기간 동안 증가된 및/또는 지속된 인자 IX 또는 인자 VIII의 발현을 나타낼 것으로 예상된다. 재-투여 시, 재-용량의 ceDNA 벡터 및 라파마이신을 받은 마우스는, 라파마이신은 투여되지 않고 재-용량의 ceDNA 벡터를 받은 마우스에 비해, 사이토카인 분비의 활성화가 덜하고, 전이유전자 발현 지속성과 치료 효율이 증가할 것으로 추가로 예상된다. 공동-투여의 타이밍은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8시간까지 유발될 수 있다.
실시예 13: 인자 IX와 cGAS 길항제를 인코딩하는 ceDNA 갖는, B형 혈우병에 대한 인자 IX
본 실험은 해로운 돌연변이(R333Q)를 갖는 hFIX 서열의 녹-인을 함유하는 인자 IX 결핍성 마우스에서 실시하였다. 수컷인 인자 IX 녹아웃 마우스는, 단일 또는 반복 용량의 LNP-ceDNA (지질 나노 입자 ceDNA)를 받았다. 2개의 LNP-ceDNA 벡터를 사용한다; 1) 인간 인자 IX (천연 인간 서열 또는 Padua FIX 변형체 중 하나)를 인코딩하고, 또한 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스 단백질 ORF52를 인코딩하는 LNP-ceDNA; 비교 ceDNA 벡터로서, 단지 인자 IX만을 인코딩하고, cGAS 억제제를 인코딩하지 않는 LNP-ceDNA. LNP-ceDNA 벡터를 1.2 mL 부피 중의 0.3 내지 5 mg/kg로 각 마우스에 투여한다. 각 용량은 i.v. 수역학적 투여를 통해 투여될 것이다. 혈장 내 인자 IX의 발현은, 본원에 기재된 바와 같이 다양한 시점, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 1000 및 200일, 및 그 이상 등에서, ELISA에 의해 평가한다. 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간과 출혈 시간도 또한 효능의 결정시 측정된다. hFIX와 ORF52를 둘 다 발현하는 ceDNA 벡터를 받은 마우스는, 단지 인자 IX만을 발현하고, ORF52 또는 다른 cGAS 억제제는 발현하지 않는 ceDNA 벡터를 받은 마우스에 비해, 더욱 오랜 기간 동안 증가 및/또는 지속된 인자 IX의 발현을 나타낼 것으로 예상된다. 재-투여 시, ORF52와 인자 IX를 둘 다 포함하는 재-용량의 ceDNA 벡터를 받은 마우스는, 단지 인자 IX만을 인코딩하는 재-용량의 ceDNA 벡터를 마우스에 비해, 사이토카인 분비의 활성화가 덜 나타나고, 전이유전자 발현의 지속성과 치료 효율이 증가할 것으로 추가로 예상된다. cGAS 억제제와 인자 IX는 상이한 ceDNA 벡터 상에서 전달될 수 있으나, 바람직하게는 이들은 동일한 벡터에 의해 인코딩되고, 따라서 cGAS의 억제는 전이유전자, 예컨대 인자 IX를 인코딩하는 ceDNA 벡터를 받은 동일한 세포에서 발생한다.
실시예 14: 선천적 면역 반응과 인자 IX 발현 지속에 대한, ceDNA와 cGAS 길항제 공동-투여의 효과의 결정
시험관내에서 면역 반응 (예를 들어, 선천적 면역 반응)에 대한 관심 대상 ceDNA와 cGAS의 억제제 또는 cGAS 길항제의 공동-투여의 효과를 평가하기 위하여, cGAS 활성화를 평가하는 기능 검정법에 대해 리포터 세포주를 사용할 수 있다. 이러한 시험관 내 검정법에 유용한 cGAS 리포터 세포주는, 전사 인자 반응 요소, 예컨대 NF-kB 결합 부위, AP-1 결합 부위, 또는 이들의 조합의 전사 조절 하에, 전체-길이 인간 cGAS 및 리포터 유전자, 예컨대 분비된 알칼라인 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 발현하는 안정적으로 공동-형질전환된 세포주일 수 있다. 예를 들어, 리포터 세포를 96-웰-플레이트에 분주한다. 사전-결정된 시점, 예컨대 16시간 후에, cGAS의 억제제가 있거나 없는 상태에서, 인자 IX를 발현하는 ceDNA를 포함하는 다양한 양의 조성물에 의해 세포를 자극한다. cGAS의 억제제가 있거나 없는 상태에서, 리포터 유전자, 예컨대 SEAP의 활성을 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 방법 또는 검정법을 사용하여 분석하여, 관심 대상 ceDNA의 존재 하에서의 cGAS 활성화의 수준을 비교할 수 있다. cGAS의 억제제의 존재 하에서는, 리포터 분자의 활성화가 덜 나타날 것으로 예상된다.
또한, cGAS 녹-아웃 리포터 세포주, 예컨대 인간 THP-1 단핵구로부터 유래된 것들을 사용할 수 있으며, 이들은 지금까지 확인된 모든 사이토졸 DNA 센서(DAI 제외)를 발현하기 때문에 종종 DNA 감지 경로를 연구하는데 사용되는 세포주이다. 이러한 cGAS 녹-아웃 리포터 세포주는, 하나 이상의 분비된 유도성 리포터 유전자, 예컨대 Lucia 루시퍼라제 및 SEAP(분비된 배아 알칼라인 포스파타제)를 발현할 수 있다. 리포터 유전자는 하나 이상, 예컨대 5개의 IFN-자극 반응 요소와 함께 ISG54(인터페론-자극 유전자) 최소 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다. 리포터 유전자는 또한 하나 이상, 예컨대 5 카피의 반응 요소, 예컨대 NF-kB 반응 요소에 융합된 IFN-β 최소 프로모터의 조절 하에 있을 수도 있다. cGAS의 억제제와 본원에 기재된 ceDNA의 조합의 존재 하에서의 cGAS 활성을, 녹-아웃세포주 대 비경구 세포주에서 비교할 수 있다.
생체 외에서 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 cGAS 및 STING 활성화에 대한 관심 대상 ceDNA와 cGAS의 억제제 또는 cGAS 길항제의 공동-투여의 효과를 평가하기 위해, 예를 들어, 말초혈의 밀도 구배 원심분리와 자기적 분리에 의해 인간 단핵구를 단리할 수 있다. cGAS의 억제제가 있거나 없는 상태에서, 적합한 대조군과 함께, 이들 단핵구를 관심 대상 ceDNA와의 접촉 전후에, 및/또는 관심 대상 ceDNA에 의한 활성화의 전후에 평가하였다. 치료 후, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여, 혈청 및 세포 상청액을 cGAS/STING 경로, 예컨대 인터루킨(IL)-1β, IL-6, IL-8, 인터페론(IFN)-γ, 단핵구 화학주성 단백질(MCP)-1, 및/또는 종양 괴사 인자(TNF)-α의 활성화의 기능 판독 정보(functional readout)로서, 하나 이상의 사이토카인 경로를 측정하는데 사용한다. 또한, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여, NF-κB의 활성화를 검증하는데 핵 추출물을 사용할 수 있다. cGAS의 억제제의 존재 하에서는, ceDNA를 투여할 때, 사이토카인 경로와 사이토카인 분비의 활성화가 덜 관찰되어, 전이유전자 발현 지속성과 치료 효율의 증가로 이어질 것으로 예상된다.
생체 내에서 면역 반응(예를 들어, 선천적 면역 반응)의 cGAS 및 STING 활성화에 대한 관심 대상 ceDNA와 cGAS의 억제제 또는 cGAS 길항제의 공동-투여의 효과를 평가하기 위해, 마우스 모델을 사용할 수 있다. cGAS의 억제제가 있거나 없는 상태에서, 적합한 대조군과 함께, 마우스로부터의 혈청 또는 림프구 샘플을 관심대상인 전이유전자, 예컨대 인자 IX를 발현하는 ceDNA와의 접촉 전후에, 및/또는 관심대상인 전이유전자, 예컨대 인자 IX를 발현하는 ceDNA에 의한 활성화의 전후에, 평가하였다. 치료 후, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여, 혈청 및 세포 상청액을 cGAS/STING 경로, 예컨대 인터루킨(IL)-1β, IL-6, IL-8, 인터페론(IFN)-γ, 단핵구 화학주성 단백질(MCP)-1, 및/또는 종양 괴사 인자(TNF)-α의 활성화의 기능 판독 정보(functional readout)로서, 하나 이상의 사이토카인 경로를 측정하는데 사용한다. 또한, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여, NF-κB의 활성화를 검증하는데 핵 추출물을 사용할 수 있다. cGAS의 억제제의 존재 하에서는, ceDNA를 투여할 때, 활성화 및 사이토카인 분비가 덜 관찰되어, 전이유전자 발현 지속성과 치료 효율의 증가로 이어질 것으로 예상된다.
실시예 15: 인자 IX와 TLR-9 길항제를 인코딩하는 ceDNA를 갖는, B형 혈우병에 대한 인자 IX
본 실험은 해로운 돌연변이(R333Q)를 갖는 hFIX 서열의 녹-인을 함유하는 인자 IX 결핍성 마우스에서 실시하였다. 수컷인 인자 IX 녹아웃 마우스는, 단일 또는 반복 용량의 LNP-ceDNA (지질 나노 입자 ceDNA)를 받았다. 2개의 LNP-ceDNA 벡터를 사용한다; 1) 인간 인자 IX (천연 인간 서열 또는 Padua FIX 변형체 중 하나)를 인코딩하고, 또한 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스 단백질 ORF52를 인코딩하는 LNP-ceDNA; 비교 ceDNA 벡터로서, 단지 인자 IX만을 인코딩하고, cGAS 억제제를 인코딩하지 않는 LNP-ceDNA. LNP-ceDNA 벡터를 1.2 mL 부피 중의 0.3 내지 5 mg/kg로 각 마우스에 투여한다. 각 용량은 i.v. 수역학적 투여를 통해 투여될 것이다. 혈장 내 인자 IX의 발현은 실시예 4에 기재된 바와 같이, 다양한 시점, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 1000 및 200일 또는 그 이상 등에서 ELISA에 의해 평가한다. 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간과 출혈 시간도 또한 효능의 결정시 측정된다. TLR-9 길항제를 포함하고, hFIX를 발현하는 ceDNA 벡터를 받은 마우스는, 단지 인자 IX만을 발현하고, TLR-9 억제제는 발현하지 않는 ceDNA 벡터를 받은 마우스에 비해, 더 오랜 기간 동안 인자 IX의 증가 및/또는 지속된 발현을 나타낼 것으로 예상된다. 재-투여 시, TLR-9 억제제, 예를 들어 올리고 헤어핀 서열을 포함하는 재-용량의 ceDNA 벡터, 및 인자 IX를 받은 마우스는, 단지 인자 IX만을 인코딩하는 재-용량의 ceDNA 벡터를 받은 마우스에 비해, 사이토카인 분비의 활성화가 덜 나타나고, 전이유전자 발현 지속성과 치료 효율이 증가할 것으로 추가로 예상된다. TLR-9 억제제와 인자 IX는 상이한 ceDNA 벡터 상에서, 트랜스 작용으로 전달될 수도 있으나, 바람직하게는 이들은 동일한 벡터에 의해 인코딩되고, 따라서 TLR9의 억제는 인자 IX와 같은 전이유전자를 인코딩하는 ceDNA 벡터를 받은 동일한 세포에서 일어난다.
실시예 16: 선천성 면역과 전이유전자 발현 지속에 대한, ceDNA와 TLR 길항제의 효과의 결정
시험관 내에서의 선천적 면역 반응에 대한 관심 대상 ceDNA와 TLR9의 억제제 또는 TLR9 길항제의 공동-투여의 효과를 평가하기 위해, 리포터 세포주를 TLR9 활성화의 다운스트림 효과를 평가하는 TLR9-의존적인 기능 검정법에 사용할 수 있다. TLR9 리포터 세포주는 전사 인자 반응 요소, 예컨대 NF-kB 결합 부위, AP-1 결합 부위, 또는 이들의 조합의 전사 조절 하에서, 전체-길이의 인간 Toll-유사 수용체 9(TLR9) 및 리포터 유전자, 예컨대 분비된 알칼라인 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 발현하는 안정적으로 공동-형질전환된 세포주일 수 있다. 예를 들어, 리포터 세포를 96-웰-플레이트에 분주한다. 사전-결정된 시점, 예컨대 16시간 이후, TLR9 길항제가 있거나 없는 상태에서, 관심대상인 전이유전자를 발현하는 ceDNA를 포함하는 다양한 양의 조성물에 의해 세포를 자극한다. 이러한 길항제는 TLR 억제성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. TLR9 길항제가 있거나 없는 상태에서, 리포터 유전자, 예컨대 SEAP의 활성을, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 방법 또는 검정법을 사용하여 분석하여, 관심 대상 ceDNA의 존재 하의 TLR9 활성화 수준을 결정할 수 있다. TLR9의 억제제의 존재 하에서는, 리포터 분자의 활성화가 덜 나타날 것으로 예상된다.
생체 외에서의 선천적 면역 반응의 TLR9-매개 활성화에 대한 관심 대상 ceDNA와 TLR9의 억제제 또는 TLR9 길항제의 공동-투여의 효과를 평가하기 위해, 예를 들어, 말초혈의 밀도 구배 원심분리와 자기적 분리에 의해 인간 단핵구를 단리할 수 있다. TLR9 길항제가 있거나 없는 상태에서, 적합한 대조군과 함께, 이들 단핵구는 관심 대상 ceDNA와의 접촉의 전후, 및/또는 관심 대상 ceDNA에 의한 활성화의 전후에 평가될 수 있다. 치료 후, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여, 혈청 및 세포 상청액을 TLR9 활성화, 예컨대 인터루킨 (IL)-1β, IL-6, IL-8, 인터페론 (IFN)-γ, 단핵구 화학주성 단백질 (MCP)-1, 및/또는 종양 괴사 인자 (TNF)-α의 기능 판독 정보로서 하나 이상의 사이토카인 경로를 측정하는데 사용한다. 0914800 첨가 시, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여, 핵 추출물을 NF-κB의 활성화를 검증하는데 사용할 수 있다. TLR9의 억제제의 존재 하에서는, ceDNA의 투여시, 사이토카인 경로와 사이토카인 분비의 활성화가 덜 관찰되어, 전이유전자 발현 지속성과 치료 효율의 증가로 이어질 것으로 예상된다.
생체 내에서의 선천적 면역 반응의 TLR9-매개 활성화에 대한 관심 대상 ceDNA와 TLR9의 억제제 또는 TLR9 길항제의 공동-투여의 효과를 평가하기 위해, 마우스 모델을 사용할 수 있다. TLR9의 억제제가 있거나 없는 상태에서, 적합한 대조군과 함께, 마우스로부터의 혈청 또는 림프구 샘플을 관심대상인 전이유전자, 예컨대 인자 IX를 발현하는 ceDNA와의 접촉 전후에, 및/또는 관심대상인 전이유전자, 예컨대 인자 IX를 발현하는 ceDNA에 의한 활성화의 전후에 평가한다. 치료 후, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여, 혈청 및 세포 상청액을 cGAS/STING 경로, 예컨대 인터루킨(IL)-1β, IL-6, IL-8, 인터페론(IFN)-γ, 단핵구 화학주성 단백질(MCP)-1, 및/또는 종양 괴사 인자(TNF)-α의 활성화의 기능 판독 정보(functional readout)로서, 하나 이상의 사이토카인 경로를 측정하는데 사용한다. 또한, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여, NF-κB의 활성화를 검증하는데 핵 추출물을 사용할 수 있다. TLR9의 억제제의 존재 하에서는, ceDNA를 투여할 때, 활성화와 사이토카인 분비가 덜 관찰되어, 증가된 전이유전자 발현 지속성과 치료 효율의 증가로 이어질 것으로 예상된다.
실시예 17: ceDNA와 RAPA의 LNP 벡터로의 공동-제제화
일부 구현예에서, 라파마이신을 ceDNA 벡터에 직접 패키징하는 것이 바람직할 수 있다. ceDNA 및 RAPA의 이러한 직접 공동-제제에 대한 하나의 비-제한적 예는 이하와 같다.
지질 나노 입자(LNP) 내의 ceDNA와 라파마이신의 조합은, 12 ml/분의 총 유속을 갖는 미세 유동 장비(예를 들어, NanoAssemblrTM)를 사용하여, 라파마이신을 함유하는 알코올성 지질 용액과 ceDNA 수용액을 1:3 (vol/vol)의 비로 혼합함으로써 제조할 수 있다. 총 지질 대 ceDNA의 중량 비는 대략 10:1 대 30:1일 수 있다. 간략히, 이온성 지질(예를 들어, MC3), 비-양이온성-지질(예를 들어, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)), 막의 무결성을 제공하는 성분(예컨대, 스테롤, 예를 들어, 콜레스테롤) 및 접합된 지질 분자(예컨대, PEG-지질, 예를 들어, 2000의 평균 PEG 분자 중량(“PEG-DMG”)을 갖는 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤)을, 알콜(예를 들어, 에탄올)에 50:10:38.5:1.5의 몰비로 가용화시킨다. 이후, 라파마이신을 지질 용액에 원하는 농도로 용해시킨다. ceDNA를 25 mM 소듐 아세테이트 완충액, pH 4에 0.2 mg/mL로 희석한다. (예를 들어, NanoAssemblrTM를 사용하여) LNP를 형성한 후, 알코올을 제거하고, 소듐 아세테이트 완충액을 투석에 의해 PBS로 교체한다. 알콜 제거와 동시 완충액 교환은 예를 들어, 투석 또는 접선 유동 여과에 의해 달성할 수 있다. 얻어진 지질 나노 입자를 0.2 μm 기공의 멸균 필터로 여과하고, 상기 기재된 ceDNA LNP 벡터와 유사하게 저장한다.
실시예 18: 선천적 면역 반응과 인자 IX 발현 지속성에 대한 ceDNA 벡터와 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 공동-투여의 효과 결정
시험관 내에서의 선천적 면역 반응에 대한 관심 대상 ceDNA와 라파마이신 또는 그 유사체의 공동-투여의 효과를 평가하기 위해, TLR 및 mTORC1 활성화의 다운스트림 효과를 평가하는 기능 검정법에 리포터 세포주를 사용할 수 있다. TLR9 리포터 세포주는 전사 인자 반응 요소, 예컨대 NF-kB 결합 부위, AP-1 결합 부위, 또는 이들의 조합의 전사 조절 하에서, 전체-길이의 인간 Toll-유사 수용체 9(TLR9) 및 리포터 유전자, 예컨대 분비된 알칼라인 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 발현하는 안정적으로 공동-형질전환된 세포주일 수 있다. 예를 들어, 리포터 세포를 96-웰-플레이트에 분주한다. 사전-결정된 시점, 예컨대 16시간 후에, 라파마이신 또는 이의 유사체가 있거나 없는 상태에서, 관심대상인 전이유전자를 발현하는 ceDNA를 포함하는 다양한 양의 조성물로 세포를 자극한다. 라파마이신 또는 이의 유사체가 있거나 없는 상태에서, 리포터 유전자, 예컨대 SEAP의 활성을, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 방법 또는 검정법을 사용하여 분석하여, 관심 대상 ceDNA의 존재 하의 mTORC1 활성화의 수준을 결정할 수 있다. 라파마이신의 존재 하에서는, 리포터 분자의 활성화가 더 많이 나타나고, 사이토카인 IL-10, 및 다른 사이토카인의 STAT3 유도가 감소될 것으로 예상된다.
생체 외에서의 선천적 면역 반응의 활성화에 대한 관심 대상 ceDNA와 라파마이신의 공동-투여의 효과를 평가하기 위해, 인간 단핵구를 예를 들어, 말초혈의 밀도 구배 원심분리와 자기성 분리에 의해 단리할 수 있다. 라파마이신 또는 이의 유사체가 있거나 없는 상태에서, 적합한 대조군과 함께, 이들 단핵구를 관심 대상 ceDNA과의 접촉 전후 및/또는 관심 대상 ceDNA에 의한 활성화 전후에 평가할 수 있다. 치료 후, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여, mTORC1 활성화 및/또는 IL-10과 같은 기능 판독 정보로서 하나 이상의 사이토카인 경로를 측정하는데 혈청 및 세포 상청액을 사용한다. 또한, 핵 추출물은 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여 NF-KB의 활성화를 검증하는데 사용될 수 있다. 라파마이신 또는 이의 유사체의 존재 하에서는, ceDNA를 투여할 때, 사이토카인 경로와 사이토카인 분비, 예를 들어 IL-10 및 타입 I IFN의 활성화가 덜 관찰되어, 전이유전자 발현 지속성과 치료 효율의 증가로 이어질 것으로 예상된다.
실시예 19: 인자 IX와 TLR-9 억제제를 공동-발현시키는 ceDNA 벡터의 제조
이하의 서열, 예컨대 (TCCTGGCGGGGAAGT, 서열번호: 889), ODN-2114 (TCCTGGAGGGGAAGT, 서열번호: 890), poly-G (GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, 서열번호: 891), ODN-A151 (TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG, 서열번호: 892), G-ODN (CTCC-TATTGGGGGTTTCCTAT, 서열번호: 893), IRS-869 (TCCTGGAGGGGTTGT, 서열번호: 894), INH-1 (CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG, 서열번호: 895), INH-4 (TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA, 서열번호: 896), (IRS-661 TGCTTGCAAGCTT-GCAAGCA, 서열번호: 897), 4024 (TCCTGGATGGGAAGT, 서열번호: 898), 4084F (CCTGGATGGGAA, 서열번호: 899), INH-13 (CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA, 서열번호: 900), INH-18 (CCTGGATGGGAACTTACCGCTGCA, 서열번호: 901), 및 IRS-954 TGCTCCTGGAGGGGTTGT, 서열번호: 902)을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드는, 5’에서 3’로 어닐링 이후, 3’에서 5’ 가닥에 상보적인 점착성 말단을 갖도록 조작되어, 이들은 실시예 1 및 실시예 4에 기재된 바와 같이 결찰에 의해 사전 선택된 제한 클로닝 부위, 예를 들어 R5, 또는 인자 IX 전이유전자를 인코딩하는 TTX 9 또는 TTX 10 플라스미드의 다른 부위에 삽입될 수 있다.
예를 들어, 적절한 제한 부위를 갖는 올리고는 각 가닥을 적합한 완충액: 예를 들어 100 mM 포타슘 아세테이트; 30 mM HEPES, pH 7.5) 중에서 균등한 몰량으로 혼합함으로써 어닐링하고, 이를 2분 동안 94℃로 가열하여, 서서히 냉각시켰다. 올리고는 다수의 2차 구조를 갖는 것으로 예측되므로, 더욱 점진적인 냉각/어닐링 단계가 유리하다. 이것은 올리고 용액을 수조 또는 히팅 블록 내에 두고, 기계의 플러그를 뽑고/기계를 꺼버림으로써 이루어진다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제 불포함 완충액에 희석하고, 이들의 이중-가닥 어닐링된 형태로 4℃에서 저장할 수 있다. 이후, TLR-9 억제성 올리고 서열을 갖는 ceDNA 벡터를 (예를 들어, 겔 전기영동 또는 컬럼에 의해) 정제하여, cDNA 벡터를 제조하는데 사용한다. 실시예 2 내지 3에 기재된 바와 같이, 인자 IX를 인코딩하고, TLR-9 길항제를 포함하는 ceDNA 벡터를 제조할 수 있다. TLR-9 억제제를 발현하는 ceDNA 벡터와 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 공동-투여의 효과를 결정하기 위한 방법이 본원에 기재된다.
실시예 20: 인자 IX와 cGAS 억제제를 공동-발현시키는 ceDNA 벡터의 제조
카포시 육종-관련 헤르페스바이러스 단백질 ORF52(서열번호: 882), 또는 cGAS를 억제하는 이의 변형체, 또는 절단된 세포질 LANA 동형체(LANAΔ161 또는 서열번호: 883의 아미노산 161 내지 1162이 결핍된 서열번호: 884)는, 실시예 1 및 실시예 4에 기재된 바와 같이, 프로모터에 작용 가능하게 연결되고, 인자 IX 전이유전자를 인코딩하는 TTX 9 또는 TTX 10 플라스미드의 제한 클로닝 부위 R5에 삽입된다. 따라서, 실시예 2 내지 3에 기재된 바와 같이 인자 IX와 cGAS 억제제를 모두 인코딩하는 ceDNA 벡터를 제조한다. cGAS 억제제를 발현하는 ceDNA 벡터와 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 공동-투여 효과를 결정하기 위한 방법이 본원에 제시된다.
실시예 21: 생체내 LNP-제제화된 ceDNA 벡터의 지속된 전이유전자 발현
상이한 지질 나노 입자에 의한, 실시예 7의 결과의 재현성을, 마우스의 생체 내에서 평가하였다. 0일차에, CAG 프로모터에 의해 구동된 루시퍼라제 전이유전자를 포함하되, 실시예 6에서 사용된 것과 상이한 LNP 내에 캡슐화된 ceDNA 벡터, 또는 폴리C를 포함하나, ceDNA 또는 루시퍼라제 유전자가 결핍된 동일한 LNP 중 하나를 마우스에 투여하였다. 특히, 대략 4주령의 수컷인 CD-1® 마우스에 0.5 mg/kg LNP-TTX-루시퍼라제의 단일 주사 또는 대조군 LNP-폴리C를 처리하였고, 이는 0일차에 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여하였다. 14일차에, 동물에게 2.5 mL/kg의 복강내 주사를 통해 150 mg/kg의 루시페린을 전신 투여하였다. 루시페린을 투여한지 대략 15분 후에, 생체 내 화상화 시스템(“IVIS”)을 사용하여 각 동물을 화상화하였다.
모든 4마리의 ceDNA-처리된 마우스의 간에서 유의한 형광이 관찰되었고, 동물 내에서 주사 부위가 아닌 곳에서는 다른 형광이 거의 관찰되지 않았는데, 이는 LNP가 ceDNA 제작물의 간-특이적 전달을 매개하며, 전달된 ceDNA 벡터는 적어도 투여 2주 후에 이의 전이 유전자의 지속적인 발현을 조절할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 22: 생체 내 간에서 ceDNA 벡터 투여로부터의 지속된 전이유전자 발현
별개의 실험에서, 처리된 동물의 간 내에서의 LNP-전달된 ceDNA의 국재화를 평가하였다. 관심대상인 기능성 전이유전자를 포함하는 ceDNA 벡터를, 실시예 17에서 사용된 것과 동일한 LNP 내에 캡슐화시키고, 생체 내에서 0.5 mg/kg의 용량 수준으로 정맥내 주사에 의해 마우스에 투여하였다. 6시간 후, 마우스를 희생시키고, 간 샘플을 채취하여, 표준 프로토콜을 사용하여 포르말린으로 고정시키고, 파라핀으로 포매하였다. ceDNA 전이유전자에 특이적인 프로브를 사용하고, 발색 반응과 헤마톡실린 염색(Advanced Cell Diagnostics)을 사용하여 탐지하는 RNAscope® 제자리 혼성화 검정법을 실시하여, 조직 내의 ceDNA 벡터를 시각화하였다. 화상화 분석으로, 처리된 마우스로부터 얻은 간세포 샘플 내에 ceDNA가 존재한다는 것을 확인하였다. 숙련자는 ceDNA 벡터에서 루시퍼라제를 표 5에서 선택된 임의의 핵산 서열로 대체할 수 있다는 사실을 이해할 것이다.
실시예 23: 생체 내에서 ceDNA의 지속된 안구 전이유전자 발현
간이 아닌 조직에서 ceDNA 벡터 전이유전자 발현의 지속성을 평가하여, 생체 내에서 안구 투여 이후의 ceDNA 벡터의 허용성(tolerability)과 발현을 결정하였다. 루시퍼라제가 예시적인 전이유전자로서 사용되었지만, 당업계의 통상의 숙련자는 루시퍼라제 전이유전자를 표 5a~5f에 나열된 임의의 것들의 인플라마좀 길항제 서열로 용이하게 대체할 수 있다.
0일차에, 대략 9주령의 수컷 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트에, jetPEI® 형질감염 시약(Polyplus)과 함께 제제화된 루시퍼라제 전이유전자를 포함하는 5 μL의 ceDNA 벡터(0.25 μg/μL의 농도), 또는 jetPEI®와 함께 제제화된 루시퍼라제를 인코딩하는 5 μL의 플라스미드 DNA(0.25 μg/μL의 농도) 중 하나를, 망막-하 주사하였다. 각 그룹에서, 4마리의 래트를 시험하였다. 동물에게 진정제를 투여하고, 33 게이지 바늘을 사용하여 시험품을 오른쪽 눈에 망막하 주사하였다. 각 동물의 왼쪽 눈은 처리하지 않았다. 주사한 직후, 망막하 수포의 존재를 확인하기 위해, 눈을 광간섭 단층촬영(optical coherence) 또는 안저(fundus) 화상화에 의해 체크하였다. 표준 절차에 따라, 래트에 부프레노핀(buprenorphine)과 국소 항생제 연고를 처리하였다.
7일차, 14일차, 21일차, 28일차 및 35일차에, 2.5 mL/kg의 복강내 주사를 통해 신선하게 제조된 150 mg/kg의 루시페린을 양쪽 그룹의 동물들에게 전신 투여하였다. 루시퍼라제 투여 5 내지 15분 후에, 모든 동물들은 이소퓨란 마취 하에 IVIS를 사용하여 화상화하였다. 눈을 포함하는 관심 부위의 총 자속밀도[p/s]와 평균 자속밀도(p/s/sr/cm2)를, 5분간의 노출 동안 얻었다. 그 결과를 비처리된 눈의 각각의 치료 그룹(“비주사”)의 평균 발광에 비교된, 치료된 눈의 각각의 치료 그룹(“주사”)의 평균 발광의 그래프로 나타내었다. ceDNA 벡터-처리된 눈에서 유의한 형광이 쉽게 탐지되었지만, 플라스미드-처리된 눈에서는 형광이 훨씬 약했다. 35일 후, 플라스미드-주사된 래트를 희생시켰으나, ceDNA-처리된 래트에 대한 연구는 계속하였고, 루시페린 주사와 IVIS 화상화는 42, 49, 56, 63, 70, 및 99일차에 실시하였다. 그 결과는 단일 주사로 래트의 눈에 도입된 ceDNA 벡터가 생체 내에서 전이유전자 발현을 매개하며, 그 발현이 적어도 주사 이후99일에 걸쳐 높은 수준으로 지속된다는 것을 입증한다.
실시예 24: ceDNA의 수역학적 전달
설치류의 간에 핵산을 도입하는 잘-알려진 방법은, 수역학적 꼬리 정맥주사에 의한 것이다. 이 시스템에서, 큰 부피의 비-캡슐화 핵산의 가압 주사는, 세포 투과성과 조직 및 세포로의 직접 전달을 일시적으로 증가시킨다. 이것은 많은 숙주 면역계, 예컨대 대식 세포 전달을 우회하는 실험적인 메커니즘을 제공한다. 따라서, 네이키드 ceDNA 벡터의 수역학적 주사 이후에 관찰되는 루시퍼라제 발현을, 추가적인 종래의 LNP-캡슐화 ceDNA의 정맥내 주사 이후 관찰되는 것과 비교하였다. 이 실험을 위해, ceDNA 벡터는 야생형 AAV2 좌측 ITR과 돌연변이 우측 ITR을 이용하였다.
간략히, CAG 프로모터의 조절 하에서 루시퍼라제를 인코딩하는 ceDNA 벡터를 제작하고, 이를 LNP 내에 캡슐화하거나, 캡슐화하지 않고 그대로 두었다. 성체 수컷 CD-1 마우스에 (i) 5 mL/kg의 총 부피 중 0.5 mg/kg의 용량의 LNP-캡슐화 ceDNA 벡터, 또는 (ii) 캡슐화되지는 않았지만, 1.2 mL의 총 부피 중 0.01 mg/kg의 용량의 동일한 벡터 중 하나를 꼬리 정맥주사에 의해 투여하였다. 각 치료 그룹에는, 세 마리의 마우스가 있었다. 1, 2, 및 3일차에 체중을 기록하였다. In-life 화상화는 1일 및 3일에 생체 내 화상화 시스템(IVIS)을 사용하여 실시하였다. 화상화를 위해, 각 마우스에 2.5 mL/kg의 복강내 주사를 통해 150 mg/kg의 루시페린을 주사하였다. 15분 후, 각 마우스를 마취하고, 화상화하였다.
심지어 50-배 더 적은 용량으로 투여된 경우에도, 수역학적으로 주사된 마우스에서 관찰된 루시퍼라제 발현 (~1010 최대 총 자속밀도)이, 비-수역학적으로 주사된 마우스 (~107 최대 총 자속밀도)보다 훨씬 더 컸다(도 9). 이전 연구에서, ceDNA 벡터 내용물 없이 LNP만을 단독으로 투여한 경우에는 면역 반응을 유발하지 않았고(데이터는 나타내지 않음), 따라서 2개의 용량 그룹들 간에 차이가 생기는 이유는 하나 이상의 숙주 면역계에 대한 LNP-캡슐화 ceDNA 벡터의 관여와 수역학적 투여에 의한 이 시스템(들)의 회피 때문이라는 사실이 밝혀졌다.
실시예 25: 배양된 세포에서의 면역 경로의 조작과 ceDNA 벡터 발현에 대한 효과
숙주 반응에 대한 다양한 면역 경로가 ceDNA 투여에 기여하는지를 용이하게 조사하기 위해, 세포-기반 검정법을 확립하였다. 상기 검정법은 몇 개의 THP-1 세포 (급성 단핵구 백혈병 세포주)를 일부 변형하여 사용하였다: NF-κB 활성화(TLR9 경로, Qu항- Blue™에 의한 SEAP 탐지에 의함) 및 (Qu항-Luc™에 의한 분비된 루시퍼라제를 통한) IRF 경로 활성화를 둘 다 탐지하기 위한 리포터 제작물이 안정하게 통합된 THP-1 Dual™ 세포(Invitrogen), cGAS 면역 경로에서의 항시적인 녹아웃을 갖는 THP-1 세포, 및 STING 면역 경로에서의 항시적인 녹아웃을 갖는 THP-1 세포. 특정 경로의 알려진 억제제를 사용하면, 주어진 자극에 대한 관찰된 면역 반응에 대한 내인성 면역 경로의 상대적인 기여를 더욱 잘 이해하는 것도 가능하다.
간략히, 배양액 중의 THP-1 세포를 Opti-MEM™ 배지(ThermoFisher)에 0.5x106/mL로 희석하여, 96 웰-플레이트의 각 웰에 150 μL를 첨가하였다. 세포에 억제제를 사전 처하였고: 원하는 억제제를 Opti-MEM™에 희석하여, 지정된 샘플 웰에 첨가하였다. 이 실험을 위해, A151(올리고뉴클레오티드 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(서열번호: 892) 및 BX795(N-[3-[[5-아이오도-4-[[3-[(2-티에닐카보닐)아미노]프로필]아미노]-2-피리미디닐]아미노]페닐]-1-피롤리딘카르복사미드, CAS 702675-74-9)를, 각 샘플의 웰에서 0 μM, 0.625 μM, 1.25 μM, 또는 2.5 μM의 최종 농도로 사용하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 항온 처리하였다. 200 ng의 원하는 ceDNA 벡터를 리포펙타민™ 3000에 1:3으로 희석하고, 5 내지 10분 동안 실온에서 항온 처리하였다. 이후, ceDNA 벡터-리포펙타민 복합체를 샘플 웰에 첨가하였다. 플레이트를 24시간 동안 37℃에서 항온 처리하였다. NF-κB 활성화와 IRF2 활성화의 양을 각각 Quanti-Blue™ 및 Quanti-Luc™ 키트에 의해, 제조자의 설명서에 따라 정량화하였다.
ceDNA 벡터의 2개의 상이한 제제를 THP-1 이중 리포터 세포에 투여하면, 둘 다 인터페론을 유의하게 유도하였는데, 이는 적어도 하나 면역 경로가 활성화되었다는 것을 나타낸다(도 10a). 특히, 2개의 THP-1 녹아웃 종 중 하나에 동일한 농도의 ceDNA를 처리했을 때, 인터페론의 유도는 관찰되지 않았고(도 10a), 이는 cGAS/STING 경로가 ceDNA 투여에 반응하여 사이토카인 유도에 관여한다는 것을 나타낸다. 유사한 결과는, THP-1 이중 리포터 세포에 ceDNA와 BX795를 모두 투여했을 때에도 나타났는데; BX795는 STING 경로-특이적인 억제제이며, 이것이 ceDNA-유도된 인터페론 유도를 파괴하는 현상은, STING 경로가 관여한다는 것을 다시 한번 암시한다 (도 10a). A151은 cGAS/STING 경로, TLR9 경로, 및 또한 인플라마좀-매개 면역 경로도 억제하는 것으로 알려져 있다. 이는 BX795 처리에서 관찰되는 것과 유사한 효과를 갖는다(도 10a).
제2 실험에서는 ceDNA 투여시 보호 효과를 관찰하는데 필요한 억제제의 농도를 검정하였다(도 10b). A151과 AS1411 둘 다에 대하여, 인터페론 유도의 억제는 농도-의존적인 것으로 관찰되었고, 최대 억제는 2.5 μM의 농도에서 관찰되었다(도 10b).
실시예 26: 면역 반응에 대한 ceDNA 비메틸화 CpG 함량의 조작의 효과
유전자 서열 내의CpG 모티프는 TLR9 DNA 감지 경로를 자극하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 생체 내에서 그 서열의 도입시, ceDNA 제작물 서열 내의 CpG 모티프 감소가 선천성 면역 경로 활성화에 대해 갖는 효과를 조사하였다.
A. ceDNA 비메틸화 CpG의 최소화의 영향을 시험하는 세포-기반 검정법
(i) ceDNA 투여에 반응한 TLR9 경로 활성화, 및 (ii) 이러한 활성화에 대한 CpG 존재/메틸화 상태의 조작의 효과를 평가하기 위해, 본 연구를 실시하였다. 이러한 특정 연구를 위해, 녹색 형광 단백질을 발현하고, 야생형 좌측 ITR과 돌연변이 우측 ITR을 포함하는 ceDNA 벡터를 사용하였다.
인간 TLR9를 발현하는 HEK-293 세포(HEK- BLUE.hTLR9 세포, InvivoGen)를, 96 웰-플레이트에 웰당 50,000개 세포로 분주하였다. 상기 플레이트를 밤새 37℃에서 배양하였다. 메틸화 사전 처리를 한 ceDNA 샘플에 대해, 당업계에 알려진 방법에 따라서 ceDNA 벡터, 완충액, S-아데노실 메티오닌, CpG 메틸트랜스퍼라제 및 물을 50 μL의 총 반응 부피로 처리하였다. 반응을 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하고, 그 후 20분 동안 65℃로 가열함으로써 반응을 중단시켰다. ceDNA를 상업적으로 이용 가능한 정제 키트(PCR clean 키트, Qiagen®)를 사용하여 반응 혼합물로부터 정제하고, 생성된 DNA 농도를 측정하였다.
세포에 3시간 동안 임의의 원하는 억제제를 처리한다 - 이 실험에서, A151를 10 μM의 웰 당 최종 농도로 사용하였다. 사전 치료 후, 세포를 300 ng의 ceDNA와 Opti-MEM™에 희석된 리포펙타민(Lipofectamine) 3000(1:3 비), 또는 TLR9 경로를 자극한다고 알려진 양성 대조군ODN2006로 형질감염시켰다. 세포를 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양하다. 이후, Quanti-BLUE™(InvivoGen)를 사용하여 Seap 발현(TLR9 경로의 요소)을 측정하였다.
도 11a에 나타난 바와 같이, ODN2006은 굳건한 NF-κB 반응을 유도하였고; ceDNA 제작물은 더 적은 반응을 유도하였고, 사전-메틸화될 때, 반응은 배경 수준으로 떨어졌다. (TLR9 경로를 억제한다고 알려진) A151과 조합될 때, ceDNA-처리된 샘플도 또한 최소 수준의 NF-κB 유도를 나타내었다(도 11b). 이것은 먼저, TLR9 경로가 ceDNA 투여에 대한 숙주의 면역 반응에 기인한다는 사실을 입증한다. 추가로, 메틸화에 의한 CpG 함량의 최소화는 ceDNA에 의한 대부분의 TLR9 활성화를 제거하는데, 이 효과는 CpG 함량 또는 메틸화 상태를 변화시키지 않는, A151에 의한 세포의 사전 처리에 의해 모방될 수 있다.
B. ceDNA 비메틸화 CpG 최소화의 효과를 평가하는 쥣과의 연구
ceDNA 벡터 내 CpG 최소화의 효과도, 또한 마우스에서 평가하였다. ceDNA 벡터를 마우스에 투여할 때의 사이토카인 반응과 ceDNA-인코딩 유전자 발현을 측정하였다.
3개의 상이한 ceDNA 벡터를 사용하였고, 각각은 전이유전자로서 루시퍼라제를 인코딩한다. 제1 ceDNA 벡터는 다수의 비메틸화 CpG(~350개)를 갖고(“ceDNA 고 CpG”), 항시적인 CAG 프로모터를 포함하며; 두번째는 중간 정도의 수의 비메틸화 CpG(~60개)를 갖고(“ceDNA 저 CpG”), 간-특이적인 hAAT 프로모터를 포함하며; 세번 째는 두번째의 메틸화 형태여서, 이것은 비메틸화 CpG를 포함하지 않고(“ceDNA 무 CpG”), 또한 hAAT 프로모터를 포함한다. 그렇지 않았다면, ceDNA 벡터들은 동일하였다. 벡터들은 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
대략 4주령의 4마리의 수컷 CD-1 마우스의 4개의 그룹에, LNP 내에 캡술화된 ceDNA 벡터 또는 폴리C 대조군 중 하나를 처리하였다. 0일차에, 각각의 마우스에 5 mL/kg의 부피 중 0.5 mg/kg의 ceDNA 벡터의 단일 정맥내 꼬리 정맥주사를 투여하였다. -1일차, -, 1일차, 2일차, 3일차, 7일차, 및 그 후에는 마우스가 희생될 때까지 매주마다 체중을 기록하였다. 전혈과 혈청 샘플은 0일차, 1일차 및 35일차에 채취하였다. In-life 화상화는 7, 14, 21, 28, 및 35일차, 및 그 후에는 매주마다 생체 내 화상화 시스템 (IVIS)를 사용하여 실시하였다. 화상화를 위해, 각 마우스에 2.5 mL/kg의 복강내 주사를 통해 150 mg/kg의 루시페린을 주사하였다. 15분 후, 각 마우스를 마취하고, 화상화하였다. 마우스를 93일차에 희생시키고, 간과 비장을 포함하는 최종 조직을 모았다. 사이토카인 측정은 0일차에 투여 6시간 후 실시하였다.
각각의 ceDNA-처리된 마우스 그룹 (5 내지 7%)에서 유사한 체중 손실이 관찰되었으나, 이는 7일차까지 신속히 회복되었다. 0일차 샘플로부터의 사이토카인 분석에서, 평가된 많은 사이토카인들이 모든 치료 그룹에서 유사하게 상승되기는 했지만, 인터페론 알파, 종양 괴사 인자 알파 및 MIP-1 알파는 고 CpG 샘플에 비해 저- 또는 무-CpG 샘플에서 모두 감소한 것으로 나타났다(도 12a 및 도 12b).
저 CpG 및 고 CpG ceDNA-처리된 마우스 둘 다에서 7일차 및 14일차에 유의한 형광이 나타났지만, 그 형광은 14일차 이후의 고 CpG 마우스에서 신속히 감소하였고, 나머지 연구 기간 동안에도 지속적으로 감소하였다. 반대로, 저 CpG 및 무 CpG ceDNA-처리된 마우스에 대한 총 자속밀도는, 높은 수준으로 유지되었는데(도 12c), 이는 ceDNA 벡터 내에서 비메틸화 CpG 존재를 일부 역치 이하로 유지함으로써 TLR9 경로를 유발하지 않는 것이, 이 연구에서 (그렇지 않았다면 관찰되었을) ceDNA-암호화 단백질 발현(과 이로 인한 형광)의 더욱 신속한 감소를 회피하도록 하는데 도움을 준다는 사실을 암시한다.
실시예 27: 신생아 마우스에서의 발현과 숙주 반응
이전 실험은, ceDNA 벡터를 세포에 투여할 때 관찰되는 사이토카인 유도 반응에 cGAS/STING 경로가 적어도 부분적으로 관여한다는 사실을 나타낸다. 이 경로는 이후 발생 시에 활성을 갖게 되는 것으로 알려져 있으므로, 미성숙한 면역계를 갖는 신생아 마우스는 활성 cGAS/STING 경로가 결핍된다. 따라서, 신생아 마우스 실험은 ceDNA 벡터의 발현과 지속성에 대한 상기 경로의 부재의 효과를 평가하기 위해 실시하였다.
야생형 AAV2 좌측 ITR과 돌연변이 우측 ITR과 CAG 프로모터를 갖고, 전이유전자로서 루시퍼라제를 인코딩하는 ceDNA 벡터를 사용하였다. ceDNA 벡터는 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. ceDNA 벡터 샘플 또는 폴리 C 대조군을, 최대 5 mL/kg의 부피 중의0.1 또는 0.5 mg/kg의 용량 수준으로, 신생아(8일령) 수컷 CD-1 마우스의 꼬리 정맥주사를 통해 정맥내 투여하였다. 각 샘플 그룹에, 5개의 복제물을 포함시켰다. 1일차 및 그 이후 3일 동안 체중을 기록하였다. 7일차, 14일차 및 21일차에, 생체 내 화상화 시스템(IVIS)을 사용하여, In-life 화상화를 실시하였다. 화상화를 위해, 각 마우스에 2.5 mL/kg의 복강내 주사를 통해 150 mg/kg의 루시페린을 주사하였다. 15분 후, 각 마우스를 마취하고, 화상화하였다.
특히, 체중 손실은 0일차 주사 이후 어떠한 치료 그룹에서도 관찰되지 않았다. 모든 ceDNA-투여된 동물에서 (도입된 ceDNA 벡터로부터의 루시퍼라제 발현을 나타내는) 높은 수준의 총 자속밀도를 관찰하였고, 0.5 mg/kg 용량은 첫번째 14일 동안 0.1 mg/kg 용량보다 대략 1 로그(log) 더 큰 발현 수준을 생성하였다(도 13). 그 이후, 발현 수준은 안정화되었고, 두 용량 그룹 모두에서 동일한 수준으로 지속되었다. 심지어 14일 이후의 신생아 마우스에서의 ceDNA 벡터 발현 수준도, 성체 CD-1 마우스에서의 유사한 연구에 비해, 적어도 2로그 더 컸다(데이터는 나타나지 않음). 이 결과는 cGAS/STING 경로 활성화의 회피가 조성 중인(fostering) ceDNA 벡터의 발현과 지속성에 유익하다는 것을 암시한다.
실시예 28: ceDNA 지속성, 발현 및 사이토카인 유도에 대한 다수의 면역 경로들의 조작의 효과
이전 연구는 배양된 세포와 쥣과 시스템 둘 다에서 TLR9 경로 조작의 효과를 평가하였다. 그러나, 다수의 분자 경로가 외부 DNA에 대한 숙주 반응에 관여한다고 알려져 있으며, TLR9 경로의 유발을 회피하는 효과는, 하나 이상의 다른 경로가 계속하여 ceDNA 투여에 관여하는 경우 용이하게 관찰되지 않을 수도 있다. 이것을 시험하기 위해, STING 기능을 없애는 돌연변이를 갖는 골든티켓(goldenticket) 마우스 종에 대해, CpG 최소화 ceDNA 벡터를 시험하였다. 따라서, 상기 실험으로 cGAS/STING 경로 활성의 교란 없이 TLR9 경로를 추적할 수 있다.
3개의 상이한 ceDNA 벡터를 사용하였고, 각각은 전이유전자로서 루시퍼라제를 인코딩한다. 제1 ceDNA 벡터는 다수의 비메틸화 CpG(~350개)를 갖고(“ceDNA 고 CpG”), 항시적인 프로모터(cET)를 포함하며, 두번째는 중간 수의 비메틸화 CpG(~60개)를 갖고(“ceDNA 저 CpG”), 세번째는 소수의 CpG(~36개)를 갖지만 메틸화되어, 비메틸화 CpG를 함유하지 않는다(“ceDNA 무 CpG”). 제2 제작물과 제3 제작물은 둘 다 간-특이적인 hAAT 프로모터를 포함하였다. 그렇지 않았다면, ceDNA 벡터들은 동일하였다. 벡터들은 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
각각의 ceDNA 벡터 샘플 또는 폴리 C 대조군을, 5 mL/kg의 부피 중의 0.5 mg/kg의 용량 수준으로 꼬리 정맥주사를 통해 성체 수컷 골든 마우스 (Tmem173 gt )에 정맥내 투여하였다. 일부 경우, 제2 용량의 ceDNA 벡터 샘플을 22일차에 마우스에 투여하였다. 각 샘플 그룹에, 4개의 복제물이 포함하였다. 투여일과 그 후 3일 동안 체중을 기록하였다. 전혈과 혈청 샘플을 0일차(투여 6시간 후) 및 22일차(투여 6시간 후)에 채취하였다. In-life 화상화는 7, 14, 22, 29, 36 및 43일에 생체 내 화상화 시스템(IVIS)을 사용하여 실시하였다. 화상화를 위해, 각 마우스에 2.5 mL/kg의 복강내 주사를 통해 150 mg/kg의 루시페린을 주사하였다. 15분 후, 각 마우스를 마취하고, 화상화하였다. 마우스를 43일에 희생시키고, 간과 비장을 포함하는 최종 조직을 모았다. 사이토카인 측정은 0일차 및 22일차에 혈액으로부터 실시하였다.
ceDNA 투여 시의 체중 손실은 5% 미만이었고, 3일차까지 모든 경우에 필수적으로 회복되었다. 22일차의 재투여시, 처리된 마우스는 다시 체중의 5% 미만이 손실되었고, 이는 그 후의 일자에 빠르게 회복되었다. 사이토카인 유도는 0일차 혈액 샘플로부터 평가하였다(도 14a). IL-18을 제외하고, 각각의 검정된 사이토카인의 수준은 ceDNA 제작물 내 CpG의 존재의 정도와 관련되고(도 14a), IFN-알파, IFN-감마, IL-6, IP-10, MCP-1, MIP-1알파, MIP-1 베타 및 RANTES의 ceDNA 무 CpG 처리된 마우스에서는 적게 내지 전혀 유도되지 않았다. 재-투여된 마우스에서, 모든 샘플은 0일차 판독에 비해 모든 사이토카인 수준이 증가했지만(도 14b), IL-18을 제외한 모든 경우에, 활성화의 정도는 다시 한번 투여된 ceDNA 벡터 내에 존재하는 CpG의 양과 관련된다.
상이한 치료 그룹들에서 루시퍼라제의 발현은 22일까지 유사하였다(도 14c). 그 시점 이후, 단일-투여 및 재-투여된 ceDNA 고 CpG 샘플에서는 둘 다 총 자속밀도가 급격히 감소한 반면, 저 CpG 및 무 CpG 그룹에서는 지속적인 총 자속밀도 측정치를 유지하거나, 고 CpG 그룹에 비해 신호 손실이 약화되었다. 상기 결과를 조합하면, 투여된 ceDNA 벡터의 CpG 함량을 최소화하면-확장에 의해, TLR9 선천성 면역 경로에 관여하는 것을 회피하면- 사이토카인 유도의 현저한 감소와, 처리된 골든티켓 마우스에서 ceDNA로부터의 좀더 굳건한 유전자 발현에 기여한다는 사실을 입증한다.
실시예 29: Rag2 마우스에서 ceDNA 벡터의 지속된 투여 및 재투여.
ceDNA 벡터의 유전자 발현 카세트에서 인코딩되는 하나 이상의 전이유전자가, 발현된 단백질이 외부로서 인식되는 숙주 환경(예를 들어, 세포 또는 대상체)에서 발현되는 상황에서는, 숙주가 적응 면역 반응을 유도하여 발현 생성물의 원치 않는 고갈을 발생시킬 가능성이 있고, 이는 잠재적으로 발현의 결핍과 혼란을 일으킬 수 있다. 일부 경우, 이것은 정상적인 숙주 환경에 대해 이종성인 리포터 분자에 의해 발생할 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터 전이유전자 발현은 Rag2 마우스 모델에서 생체 내 평가했으며, 이는 B 세포와 T 세포가 결핍되어, 비-자연적인 쥣과 단백질, 예컨대 루시퍼라제에 대한 적응 면역 반응을 발생시키지 않는다. 간략히, 0일차에 c57bl/6 및 Rag2 녹아웃 마우스에, 루시퍼라제를 발현하는 0.5 mg/kg의 LNP-캡슐화 ceDNA 벡터 또는 폴리C 대조군을 꼬리 정맥주사를 통해 정맥내 투여하였고, 21일차에 특정 마우스에 동일한 LNP-캡슐화 ceDNA 벡터를 동일한 용량 수준으로 재투여하였다. 모든 시험 그룹은 각각 4마리의 마우스로 이루어진다. IVIS 화상화는 루시페린 주사 이후 1주 간격으로 실시하였다.
IVIS 분석으로부터 관찰된 총 자속밀도를 비교하면, LNP-ceDNA 벡터-Luc를 투여받은 야생형 마우스에서 관찰된 형광(발현된 루시퍼라제의 존재의 직접 측정치)은 21일 이후 점차적으로 감소한 반면, 동일한 처리를 투여받은 Rag2 마우스는 42일 실험 동안 비교적 일정하게 지속된 루시퍼라제 발현을 나타내었다(도 16a). 야생형 마우스에서 감소가 관찰된 대략 21-일 시점은, 적응 면역 반응이 생성될 것으로 예상될 수 있는 기간에 상응한다. Rag2 마우스에 LNP-ceDNA 벡터를 재-투여하면, 발현이 현저히 증가되며, 이는 이 연구에서 추적된 적어도 21일 동안 지속되었다(도 16b). 그 결과는, 비-자연적인 단백질이 숙주 내의 ceDNA 벡터로부터 발현될 때, 적응 면역이 역할을 할 수 있고, 초기 투여로부터의 20+일 기간 내에 관찰된 발현의 감소는, 발현의 감소라기보다는 오히려 (또는 발현의 감소에 추가하여), 발현된 분자에 대한 교란 적응 면역 반응을 나타낼 수 있다는 것을 암시한다. 특히, 이 반응은 숙주에서 자연적인 단백질을 발현할 때는 낮을 것으로 예상되며, 이 경우 숙주는 발현된 분자를 자기라고 적절히 인식하여, 이러한 면역 반응을 발생시키지 않을 것으로 기대된다.
실시예 30: 지속된 발현에 대한 간-특이적인 발현과 CpG 조작의 효과
실시예 29에 기재된 바와 같이, 일부 경우 원치 않는 숙주 면역 반응은 (그렇지 않았다면) 도입된 ceDNA 벡터로부터의 하나 이상의 원하는 전이유전자가 지속적으로 발현되었을 것을 인공적으로 약화시킬 수 있다. ceDNA 벡터로부터의 지속된 발현에 대한 잠재적인 숙주 면역 반응의 회피 및/또는 약화의 효과를 평가하기 위해, 두 가지 접근법을 실시하였다. 먼저, 선행 실시예에서 사용된 ceDNA-Luc 벡터가 항시적인 CAG 프로모터의 조절 하에 있으므로, 간-특이적인 프로모터(hAAT) 또는 상이한 항시적인 프로모터(hEF-1)를 사용하여 유사한 제작물을 제작하여, 골수 세포 또는 비-간 조직에 대한 연장된 노출을 피하는 것이 임의의 관찰된 면역 효과를 감소시키는지 여부를 살폈다. 둘째로, 특정 ceDNA-루시퍼라제 제작물을 조작하여 CpG 함량을 감소시켰고, 이는 숙주 면역 반응에 대한 유발제로 알려져 있다. 이러한 조작된 ceDNA 벡터와 프로모터-스위치 ceDNA 벡터를 마우스에 투여할 때의, ceDNA-암호화 루시퍼라제 유전자 발현을 측정하였다.
3개의 상이한 ceDNA 벡터를 사용하였고, 각각은 전이유전자로서 루시퍼라제를 인코딩한다. 제1 ceDNA 벡터는 다수의 비메틸화 CpG를 갖고(~350개), 항시적인 CAG 프로모터를 포함하였고(“ceDNA CAG”); 두번째는 중간 정도의 수의 비메틸화 CpG를 갖고(~60개), 간-특이적인 hAAT 프로모터를 포함하였고(“ceDNA hAAT 저 CpG”); 세번째는 두번째의 메틸화 형태여서, 비메틸화 CpG를 포함하지 않고, 또한 hAAT 프로모터 포함한다(“ceDNA hAAT 무 CpG”). 그렇지 않았다면, ceDNA 벡터들은 동일하였다. 벡터들은 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
대략 4주령의 4마리의 수컷 CD-1® 마우스의 4개의 그룹에, LNP 내에 캡슐화된 ceDNA 벡터, 또는 폴리C 대조군 중 하나를 처리하였다. 0일차에, 각각의 마우스에 5 mL/kg의 부피 중 0.5 mg/kg의 ceDNA 벡터의 단일 정맥내 꼬리 정맥주사를 투여하였다. -1일차, -, 1일차, 2일차, 3일차, 7일차, 및 그 후에는 마우스가 희생될 때까지 매주마다 체중을 기록하였다. 전혈과 혈청 샘플은 0일차, 1일차 및 35일차에 채취하였다. In-life 화상화는 7, 14, 21, 28, 및 35일차, 및 그 후에는 매주마다 생체 내 화상화 시스템 (IVIS)를 사용하여 실시하였다. 화상화를 위해, 각 마우스에 2.5 mL/kg의 복강내 주사를 통해 150 mg/kg의 루시페린을 주사하였다. 15분 후, 각 마우스를 마취하고, 화상화하였다. 마우스를 93일차에 희생시키고, 간과 비장을 포함하는 최종 조직을 모았다. 사이토카인 측정은 0일차에 투여 6시간 후 실시하였다.
모든 ceDNA-처리된 마우스에서 7일 및 14일에 유의한 형광이 나타내기는 했지만, 그 형광은 14일 이후 ceDNA CAG 마우스에서 신속히 감소하였고, 나머지 연구 동안에는 더욱 서서히 감소하였다. 반대로, ceDNA hAAT 저 CpG 및 무 CpG-처리된 마우스에 대한 총 자속밀도는, 높은 수준을 유지하였다(도 17). 이것은, ceDNA 벡터를 특히 간으로 전달되도록 유도하면, 단일 주사 이후 적어도 77일 동안 벡터로부터 전이유전자가 지속적으로 오랫동안 발현된다는 사실을 암시한다. CpG가 최소화되거나, CpG 함량이 전혀 없는 제작물은, 오래동안 지속된 유사한 발현 특성을 갖는 반면, 고 CpG 항시적인 프로모터 제작물에서는 시간의 경과에 따라 발현이 감소되었는데, 이는 ceDNA 벡터 도입에 의한 숙주 면역의 활성화가 대상체 내의 이러한 벡터로부터 관찰되는 어떠한 감소된 발현에 대해서도 역할을 할 수 있다는 사실을 암시한다. 이 결과들은, 숙주 면역 반응이 관찰되는 경우에, 조직-제한된 프로모터를 선택하고/거나, ceDNA 벡터의 CpG 함량을 변화시킴으로써, 반응의 지속성을 원하는 수준으로 맞춤 제작하는 대안적인 방법을 제공한다-잠재적인 전이유전자-특이적인 반응.
실시예 31: 인플라마좀 길항제의 생체내 발현
시험관내에서 수여자 세포(recipient cell)의 적절한 단백질 발현과 기능을 확인할 때, 인플라마좀 길항제를 인코딩하는 서열을 갖는 ceDNA 벡터를 지질 나노 입자와 함께 제제화하여, 생체 내에서의 발현과 단백질 기능의 검증을 위해 다양한 시점에서(자궁 내에서, 신생아, 4주령, 및 8주령) 각각의 단백질 생산의 기능 발현이 결핍된 마우스에 투여하였다.
LNP-ceDNA 벡터를 1.2 mL 부피 중의 0.3 내지 5 mg/kg로 각 마우스에 투여한다. 각 용량은 i.v. 수역학적 투여를 통해 투여되거나, 예를 들어 복강내 주사에 의해 투여될 것이다. 정상적인 마우스에 대한 투여는 대조군으로 작용하며, 또한 치료 단백질의 존재와 양을 탐지하는 데에도 사용한다.
급성 투여, 예를 들어, 단일 용량의 LNP- ceDNA 이후, 수여자 마우스의 간 조직에서의 발현은 다양한 시점, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 1000 및 200일 또는 그 이상 등에서 결정될 것이다. 특히, 마우스의 간과 담관의 샘플에 대해, 조직 섹션의 면역염색을 사용하여 단백질 존재에 대해 분석을 실시할 것이다. 단백질 존재는 정량적으로 평가되고, 또한 조직과 이의 세포 내의 적절한 국재화에 대해서도 평가될 것이다. 간의 세포(예를 들어, 간세포 및 표피 세포)와 담관의 세포(예를 들어, 담관 세포)를 단백질 발현에 대해 평가할 것이다.
실시예 32: 치료 유전자 ( 예를 들어 , 인자 IX)와 NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제를 공동 발현하는 ceDNA의 제조.
A151(서열번호: 892) 또는 AIM2를 억제하는 이의 변형체를 프로모터에 작용 가능하게 연결하고, 이를 실시예 1에 기재된 바와 같이, ceDNA 벡터의 제한 클로닝 부위 R5에 삽입하였다. 따라서, 인자 IX와 AIM2 억제제를 모두 인코딩하는 ceDNA가 제조된다.
실시예 33: ceDNA에 의해 발현된 NLRP3 인플라마좀 억제제의 발현의 확인
ceDNA, 예컨대 A151 (서열번호: 892)와 공동-발현된 원하는 NLRP3 또는 AIM2 또는 카스파제-1 억제제의 발현은, HeLa 세포 및 상기 억제제에 특이적인 항체를 사용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, HeLa 세포를 배양하고, 예를 들어, Fusegene6 형질감염 시약(3:1; fusgene6: DNA)을 사용하여, 인자 IX 및 원하는 NLRP3 또는 AIM2 또는 카스파제-1 억제제를 공동-발현하는 제작물의 일시적인 형질감염을 실시하였다. 당업계의 숙련자들에게 알려진 웨스턴 블롯 기술 및/또는 유세포 분석을 사용하여, NLRP3 또는 AIM2 또는 카스파제-1 억제제의 발현을 탐지한다.
실시예 34: 인자 IX와 NLRP3 인플라마좀의 억제제를 인코딩하는 ceDNA를 갖는, 혈우병 B에 대한 인자 IX.
본 실험은 해로운 돌연변이(R333Q)를 갖는 hFIX 서열의 녹-인을 함유하는 인자 IX 결핍성 마우스에서 실시하였다. 수컷인 인자 IX 녹아웃 마우스는, 단일 또는 반복 용량의 LNP-ceDNA (지질 나노 입자 ceDNA)를 받았다. 2개의 LNP-ceDNA 벡터를 사용한다; 1) 인간 인자 IX(자연적인 인간 서열 또는 Padua FIX 변형체 중 하나)를 인코딩하고, A151(서열번호: 892)를 인코딩하는, LNP-ceDNA; 비교 ceDNA 벡터로서, 인자 IX만을 인코딩하고, cGAS 억제제는 인코딩하지 않는, LNP-ceDNA. LNP-ceDNA 벡터를 1.2 mL 부피 중의 0.3 내지 5 mg/kg로 각 마우스에 투여한다. 각 용량은 i.v. 수역학적 투여를 통해 투여될 것이다. 혈장 내 인자 IX의 발현은, 다양한 시점, 예를 들어, 7일차, 14일차 및 21일차 또는 그 이상 등에서 ELISA에 의해 평가한다. 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간과 출혈 시간도 또한 효능의 결정시 측정된다. hFIX와 A151을 모두 발현하는 ceDNA 벡터를 받은 마우스는, 단지 인자 IX만을 발현하고, A151 또는 다른 NLRP3 또는 AIM2 또는 카스파제-1의 억제제는 발현하지 않는 ceDNA 벡터를 받은 마우스에 비해, 더 오랜 기간 동안 증가된 및/또는 지속된 인자 IX의 발현을 나타낼 것으로 기대된다. 재-투여 시, A151와 인자 IX를 모두 포함하는 재-용량의 ceDNA 벡터를 받은 마우스는, 단지 인자 IX만을 인코딩하는 재-용량의 ceDNA 벡터를 받은 마우스에 비해, 사이토카인 분비의 활성화가 덜 하고, 전이유전자 발현 지속성과 치료 효율이 증가할 것으로 추가로 예상된다. NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제와 인자 IX는 상이한 ceDNA 벡터 상에서 전달될 수도 있지만, 바람직하게는 이들은 동일한 벡터에 의해 인코딩되고, 따라서, NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제의 억제는, 전이유전자, 예컨대 인자 IX를 인코딩하는 ceDNA 벡터를 받은 동일한 세포 내에서 발생한다.
실시예 35: 선천적 면역 반응과 인자 IX 발현 지속에 대한, ceDNA와NLRP3 인플라마좀 억제제의 공동 투여의 효과 결정
시험관내에서의 선천적 면역 반응에 대한 대상 ceDNA과 NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제의 공동-투여의 효과를 평가하기 위해, 리포터 세포주를 NLRP3 인플라마좀 또는 카스파제-1 활성화를 평가하는 기능 검정법에 대해 사용할 수 있다. 이러한 시험관 내 검정법에 유용한 NLRP3 인플라마좀 리포터 세포주는, 전사 인자 반응 요소, 예컨대 NF-kB 결합 부위, AP-1 결합 부위 또는 이들의 조합의 전사 조절 하에서, 전체-길이의 NLRP3 및 리포터 유전자, 예컨대 분비된 알칼라인 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 발현하는 안정적으로 공동-형질전환된 세포주일 수 있다. 예를 들어, 리포터 세포를 96-웰-플레이트에 분주한다. 사전-결정된 시점, 예컨대 16시간 이후, NLRP3 인플라마좀의 억제제가 있거나 없는 상태에서, 인자 IX를 발현하는 ceDNA를 포함하는 다양한 양의 조성물로 세포를 자극한다. NLRP3 인플라마좀 경로의 억제제가 있거나 없는 상태에서, 리포터 유전자, 예컨대 SEAP의 활성을, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 방법 또는 검정법을 사용하여 분석하여, 관심 대상 ceDNA의 존재 하에서의 카스파제-1 활성화 또는 NLRP3 인플라마좀 활성화의 수준을 비교할 수 있다. NLRP3 인플라마좀의 억제제의 존재 하에서는, 리포터 분자의 활성화가 덜 나타날 것으로 예상된다. 동일한 리포터 검정법은 카스파제-1의 억제제를 평가하는데 사용될 수 있다.
유사하게, 시험관내에서의 선천적 면역 반응에 대한 대상 ceDNA와 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제의 공동-투여의 효과를 평가하기 위해, 리포터 세포주를 AIM2 인플라마좀 또는 카스파제-1 활성화를 평가하는 기능 검정법에 사용할 수 있다. 이러한 시험관 내 검정법에 유용한 AIM2 인플라마좀 리포터 세포주는, 전사 인자 반응 요소, 예컨대 NF-kB 결합 부위, AP-1 결합 부위 또는 이들의 조합의 전사 조절 하에, 전체-길이의 인간 AIM2와 리포터 유전자, 예컨대 분비된 알칼라인 포스파타(SEAP) 리포터 유전자를 발현시키는 안정적으로 공동-형질감염된 세포주일 수 있다. 검정법은 NLRP3 인플라마좀 리포터 검정법으로서 실시될 수 있는데, 이는 AIM2 인플라마좀의 억제제가 있거나 없는 상태에서, 사전-결정된 기간 이후, 인자 IX를 발현하는 ceDNA를 포함하는 다양한 양의 조성물에 의해, 예를 들어, 96-웰-플레이트에 분주된 리포터 세포를 자극한다. AIM2 인플라마좀 경로의 억제제가 있거나 없는 상태에서, 리포터 유전자, 예컨대 SEAP의 활성을 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 방법 또는 검정법을 사용하여 분석하여, 관심 대상 ceDNA의 존재 하에서의 카스파제-1 활성화 또는 AIM2 인플라마좀 활성화의 수준을 비교할 수 있다. AIM2 인플라마좀의 억제제의 존재 하에서는, 리포터 분자의 활성화가 덜 나타날 것으로 예상된다. 동일한 리포터 검정법은 카스파제-1의 억제제를 평가하는데 사용될 수 있다.
또한, NLRP3 인플라마좀 또는 AIM2 인플라마좀 녹-아웃 리포터 세포주, 예컨대 THP1-defNLRP3 세포(InvivoGen) 또는 AIM2 인플라마좀을 억제하는 TRIM11-과다발현 THP-1 세포(Liu et al., Cell Reports (2016) 16: 1988-2002), 및 당업계에 알려진 다른 세포주를 사용할 수 있다. 이러한 AIM2 또는 NLRP3 녹-아웃 리포터 세포주는, 하나 이상의 유도성 분비된 리포터 유전자, 예컨대 Lucia 루시퍼라제와 SEAP(분비된 배아 알칼라인 포스파타제)를 발현할 수 있다. 리포터 유전자는 하나 이상, 예컨대 5개의 IFN-자극 반응 요소와 함께 ISG54(인터페론-자극 유전자) 최소 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다. 리포터 유전자는 또한 하나 이상, 예컨대 5 카피의 반응 요소, 예컨대 NF-kB 반응 요소에 융합된 IFN-β 최소 프로모터의 조절 하에 있을 수도 있다. 녹-아웃세포주 대 비경구 세포주에서, NLRP3 또는 AIM2 또는 카스파제-1의 억제제 중 적어도 하나의 존재 하에서, 본원에 기재된 ceDNA와 조합된 NLRP3 또는 AIM2 또는 카스파제-1 활성을 비교할 수 있다.
생체 외에서의 NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로 활성화에 대한, 관심 대상 ceDNA와 NLRP3 인플라마좀의 억제제 및/또는 AIM2 인플라마좀의 억제제, 또는 NLRP3 길항제 또는 AIM2 길항제의 공동-투여의 효과를 평가하기 위해, 인간 단핵구를 예를 들어, 말초혈의 밀도 구배 원심분리와 자기성 분리에 의해 단리할 수 있다. NLRP3 인플라마좀의 억제제 및/또는 AIM2 인플라마좀의 억제제, 또는 NLRP3 길항제 또는 AIM2 길항제, 또는 카스파제-1 억제제가 있거나 없는 상태에서, 이들 단핵구를 관심 대상 ceDNA와의 접촉 전후 및/또는 관심 대상 ceDNA에 의한 활성화의 전후에 적합한 대조군과 함께 평가할 수 있다. 처리 후, 혈청과 세포 상청액은 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여, NLRP3 인플라마좀 경로 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 예컨대 인터루킨 (IL)-1β, IL-6, IL-8, IL-18, 인터페론(IFN)-γ, 인터페론(IFN)-α, 단핵구 화학주성 단백질(MCP)-1, IP-10, 및/또는 종양 괴사 인자(TNF)-α의 활성화의 기능 판독 정보로서 하나 이상의 사이토카인 경로를 측정하는데 사용된다. 또한, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여, NF-κB의 활성화를 검증하는데 핵 추출물을 사용할 수 있다. ceDNA를 투여할 때, NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로, 또는 카스파제 1 억제제의 존재 하에서는, 사이토카인 경로와 사이토카인 분비의 활성화가 덜 관찰되어, 증가된 전이유전자 발현 지속성과 치료 효율을 촉진시킬 것으로 예상된다.
생체 내에서의 NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로 활성화, 또는 카스파제 1 활성화에 대한, 관심 대상 ceDNA와 NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제, 또는 카스파제 1 억제제의 공동-투여의 효과를 평가하기 위하여, 마우스 모델을 사용할 수 있다. NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제 또는 카스파제 1 억제제가 있거나 없는 상태에서, 적합한 대조군과 함께, 마우스로부터의 혈청 또는 림프구 샘플을 관심대상인 전이유전자, 예컨대 인자 IX를 발현하는 ceDNA와의 접촉 전후 및/또는 관심대상인 전이유전자, 예컨대 인자 IX를 발현하는 ceDNA에 의한 활성화 전후에 평가하였다. 처리 후, 혈청과 세포 상청액은 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여, NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로, 또는 카스파제 1 활성화, 예컨대 인터루킨 (IL)-1β, IL-6, IL-8, IL-18, 인터페론(IFN)-γ, 인터페론(IFN)-α, 단핵구 화학주성 단백질(MCP)-1, 및/또는 종양 괴사 인자(TNF)-α의 활성화의 기능 판독 정보로서 하나 이상의 사이토카인 경로를 측정하는데 사용된다. 또한, 당업계의 숙련자에게 알려진 임의의 검정법 또는 방법을 사용하여, NF-κB의 활성화를 검증하는데 핵 추출물을 사용할 수 있다. ceDNA를 투여할 때, NLRP3 및/또는 AIM2 인플라마좀 경로의 억제제 또는 카스파제 1 억제제의 존재 하에서는, 면역 활성화와 사이토카인 분비가 덜 관찰되어, 증가된 전이유전자 발현 지속성과 치료 효율이 촉진될 것으로 예상된다.
플라스미드 TTX-9로부터 생산된 인간 인자 IX를 발현하는 관심 대상 ceDNA와, NLRP3 인플라마좀 및 카스파제-1의 억제제의 공동-투여를, 평가하였다. C57bL 마우스의 그룹(n=8)은 표 11에 나타난 바와 같이 평가하였다.
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간략히, 동물들은 표 12에 나타난 그룹에 따라서 대식세포 활성화의 억제제 또는 대조군으로 전-처리되었다. 동물들에게 꼬리 정맥을 통한 IV 투여에 의해 0.5 mg/kg ceDNA(TTX9-LNP)(그룹 1) 또는 LNP-siRNA(음성 대조군)(그룹 1)을 측면 투여하기 12 내지 16시간 전, 및 이후 상기 투여의 1시간 전에 MCC950 (NLRP2 억제제)(그룹 5) 또는 VX765(벨나카산; 선택적인 카스파제-1 억제제)(그룹 4)를 i.p. 투여하였다. 전-처리 대조군은 단지 클론드로네이트(용매 대조군)만을 투여받았다(그룹 3). 0일차, 1일차, 7일차 및 21일차에, 꼬리 정맥 또는 안면 정맥 또는 안구 혈액을 통해 각 그룹으로부터 전혈을 채취하였다.
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사이토카인 수준은 제조사의 설명에 따라 ProcartaPlex Multiplex 면역검정법(Invitrogen)을 사용하여 정량화하고, 평가하였는데, 상기 검정법은 Luminex technology platform을 사용하여 다양한 사이토카인과 케모카인의 수준을 평가하기 위한 정량적 다중 비드-기반 면역검정법이다. 연구 마우스로부터 얻은 샘플을 사전-혼합된 맞춤형 마우스 사이토카인 8-plex 키트, 자기 비드와 혼합하고, IFN-α, IFN-γ, IL-6, IP-10, IL-18, IL-1β, MCP-1, 및 TNF-알파의 수준에 대해 검정하였다. 도 18a 내지 18h에서, TTX-9 투여 이후의 사이토카인 수준은, NLRP3 억제제(MCC950) 또는 카스파제 1 억제제 (VX765)에 의한 약리학적 대식세포 고갈에 의해 평가되었다. IFNγ 및 IL-18의 수준은 MCC950(NLRP3 억제제) 처리에 의해 유의하게 감소하였고(도 18b 및 도 18d), IP-10의 수준은MCC950에 의해 감소하였다(도 18f). IL-18의 수준도 또한 VX765(카스파제-1 억제제)에 의해 감소하였다(도 18d).
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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 6 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240 gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300 acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360 gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420 cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480 ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540 caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600 gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660 gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720 ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780 gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 12 atgcagcgcg tgaacatgat catggccgag agccccggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60 ggctacctgc tgagcgccga gtgcaccgtg ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120 ctgaaccgcc ccaagcgcta caacagcggc aagctggagg agttcgtgca gggcaacctg 180 gagcgcgagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg cccgcgaggt gttcgagaac 240 accgagcgca ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgaccagtg cgagagcaac 300 ccctgcctga acggcggcag ctgcaaggac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360 ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggccgc 420 tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg caccgagggc 480 taccgcctgg ccgagaacca gaagagctgc gagcccgccg tgcccttccc ctgcggcagg 540 gtgagcgtga gccagaccag caagctgacc cgcgccgagg ccgtgttccc cgacgtggac 600 tacgtgaaca gcaccgaggc cgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagagc 660 ttcaacgact tcacccgcgt ggtgggcggc gaggacgcca agcccggcca gttcccctgg 720 caggtggtgc tgaacggcaa ggtggacgcc ttctgcggcg gcagcatcgt 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 16 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt 180 agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc 240 aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt 300 ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc 360 ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacactcg agggccctgt ctcctcagct 420 tcaggcacca ccactgacct gggacagtga atccggacat cgattctaag gtaaatataa 480 aatttttaag tgtataattt gttaaactac tgattctaat tgtttctctc ttttagattc 540 caacctttgg aactga 556 <210> 17 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 18 <211> 241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60 ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120 aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180 atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240 c 241 <210> 19 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 19 gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60 cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120 tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180 gatttgggaa tcgtataaga actgtatgag accac 215 <210> 20 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 20 ataaacgata acgccgttgg tggcgtgagg catgtaaaag gttacatcat tatcttgttc 60 gccatccggt tggtataaat 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polynucleotide <400> 51 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 52 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 52 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 130 <210> 53 <211> 3123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 53 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcc 60 cgggcgcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg 120 gttcctgaac agagaaacag gagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc 180 ctgccccggc tcagggccaa gaacagttgg aacagcagaa tatgggccaa acaggatatc 240 tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc 300 ccgccctcag cagtttctag 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ttgttttgtt ttgttttgtt ttttgagatg gaggtttgct ctgtcgccca ggctggagtg 660 cagtgacaca atctcatctc accacaacct tcccctgcct cagcctccca agtagctggg 720 attacaagca tgtgccacca cacctggcta attttctatt tttagtagag acgggtttct 780 ccatgttggt cagcctcagc ctcccaagta actgggatta caggcctgtg ccaccacacc 840 cggctaattt tttctatttt tgacagggac ggggtttcac catgttggtc aggctggtct 900 agaggtaccg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga 960 gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg 1020 gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg 1080 aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag 1140 ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca 1200 ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc 1260 cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgccgcca ccatggaaga 1320 cgccaaaaac ataaagaaag gcccggcgcc attctatccg ctggaagatg gaaccgctgg 1380 agagcaactg cataaggcta tgaagagata cgccctggtt cctggaacaa ttgcttttac 1440 agatgcacat atcgaggtgg acatcactta cgctgagtac ttcgaaatgt ccgttcggtt 1500 ggcagaagct atgaaacgat atgggctgaa tacaaatcac agaatcgtcg tatgcagtga 1560 aaactctctt caattcttta tgccggtgtt gggcgcgtta tttatcggag ttgcagttgc 1620 gcccgcgaac gacatttata atgaacgtga attgctcaac agtatgggca tttcgcagcc 1680 taccgtggtg ttcgtttcca aaaaggggtt gcaaaaaatt ttgaacgtgc aaaaaaagct 1740 cccaatcatc caaaaaatta ttatcatgga ttctaaaacg gattaccagg gatttcagtc 1800 gatgtacacg ttcgtcacat ctcatctacc tcccggtttt aatgaatacg attttgtgcc 1860 agagtccttc gatagggaca agacaattgc actgatcatg aactcctctg gatctactgg 1920 tctgcctaaa ggtgtcgctc tgcctcatag aactgcctgc gtgagattct cgcatgccag 1980 agatcctatt tttggcaatc aaatcattcc ggatactgcg attttaagtg ttgttccatt 2040 ccatcacggt tttggaatgt ttactacact cggatatttg atatgtggat ttcgagtcgt 2100 cttaatgtat agatttgaag aagagctgtt tctgaggagc cttcaggatt acaagattca 2160 aagtgcgctg ctggtgccaa ccctattctc cttcttcgcc aaaagcactc tgattgacaa 2220 atacgattta tctaatttac acgaaattgc ttctggtggc gctcccctct ctaaggaagt 2280 cggggaagcg gttgccaaga ggttccatct gccaggtatc aggcaaggat atgggctcac 2340 tgagactaca tcagctattc tgattacacc cgagggggat gataaaccgg gcgcggtcgg 2400 taaagttgtt ccattttttg aagcgaaggt tgtggatctg gataccggga aaacgctggg 2460 cgttaatcaa agaggcgaac tgtgtgtgag aggtcctatg attatgtccg gttatgtaaa 2520 caatccggaa gcgaccaacg ccttgattga caaggatgga tggctacatt ctggagacat 2580 agcttactgg gacgaagacg aacacttctt catcgttgac cgcctgaagt ctctgattaa 2640 gtacaaaggc tatcaggtgg ctcccgctga attggaatcc atcttgctcc aacaccccaa 2700 catcttcgac gcaggtgtcg caggtcttcc cgacgatgac gccggtgaac ttcccgccgc 2760 cgttgttgtt ttggagcacg gaaagacgat gacggaaaaa gagatcgtgg attacgtcgc 2820 cagtcaagta acaaccgcga aaaagttgcg cggaggagtt gtgtttgtgg acgaagtacc 2880 gaaaggtctt accggaaaac tcgacgcaag aaaaatcaga gagatcctca taaaggccaa 2940 gaagggcgga aagatcgccg tgtaagagca tcttaccgcc atttattccc atatttgttc 3000 tgtttttctt gatttgggta tacatttaaa tgttaataaa acaaaatggt ggggcaatca 3060 tttacatttt tagggatatg taattactag ttcaggtgta ttgccacaag acaaacatgt 3120 taagaaactt tcccgttatt tacgctctgt tcctgttaat caacctctgg attacaaaat 3180 ttgtgaaaga ttgactgata ttcttaacta tgttgctcct tttacgctgt gtggatatgc 3240 tgctttatag cctctgtatc tagctattgc ttcccgtacg gctttcgttt tctcctcctt 3300 gtataaatcc tggttgctgt ctcttttaga ggagttgtgg cccgttgtcc gtcaacgtgg 3360 cgtggtgtgc tctgtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcattg ccaccacctg 3420 tcaactcctt tctgggactt tcgctttccc cctcccgatc gccacggcag aactcatcgc 3480 cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc taggttgctg ggcactgata attccgtggt 3540 gttgtctgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 3600 gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 3660 ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 3720 ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg caggaacccc 3780 tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 3840 caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 3900 gctgcctgca gg 3912 <210> 58 <211> 3906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 58 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tggctcagag gctcagaggc acacaggagt ttctgggctc 180 accctgcccc cttccaaccc ctcagttccc atcctccagc agctgtttgt gtgctgcctc 240 tgaagtccac actgaacaaa cttcagccta ctcatgtccc taaaatgggc aaacattgca 300 agcagcaaac agcaaacaca cagccctccc tgcctgctga ccttggagct ggggcagagg 360 tcagagacct ctctgggccc atgccacctc caacatccac tcgacccctt ggaatttcgg 420 tggagaggag cagaggttgt cctggcgtgg tttaggtagt gtgagagggt ccgggttcaa 480 aaccacttgc tgggtgggga gtcgtcagta agtggctatg ccccgacccc gaagcctgtt 540 tccccatctg tacaatggaa atgataaaga cgcccatctg atagggtttt tgtggcaaat 600 aaacatttgg tttttttgtt ttgttttgtt ttgttttttg agatggaggt ttgctctgtc 660 gcccaggctg gagtgcagtg acacaatctc atctcaccac aaccttcccc tgcctcagcc 720 tcccaagtag ctgggattac aagcatgtgc caccacacct ggctaatttt ctatttttag 780 tagagacggg tttctccatg ttggtcagcc tcagcctccc aagtaactgg gattacaggc 840 ctgtgccacc acacccggct aattttttct atttttgaca gggacggggt ttcaccatgt 900 tggtcaggct ggtctagagg taccggatct tgctaccagt ggaacagcca ctaaggattc 960 tgcagtgaga gcagagggcc agctaagtgg tactctccca gagactgtct gactcacgcc 1020 accccctcca ccttggacac aggacgctgt ggtttctgag ccaggtacaa tgactccttt 1080 cggtaagtgc agtggaagct gtacactgcc caggcaaagc gtccgggcag cgtaggcggg 1140 cgactcagat cccagccagt ggacttagcc cctgtttgct cctccgataa ctggggtgac 1200 cttggttaat attcaccagc agcctccccc gttgcccctc tggatccact gcttaaatac 1260 ggacgaggac agggccctgt ctcctcagct tcaggcacca ccactgacct gggacagtgc 1320 cgccaccatg gaagacgcca aaaacataaa gaaaggcccg gcgccattct atccgctgga 1380 agatggaacc gctggagagc aactgcataa ggctatgaag agatacgccc tggttcctgg 1440 aacaattgct tttacagatg cacatatcga ggtggacatc acttacgctg agtacttcga 1500 aatgtccgtt cggttggcag aagctatgaa acgatatggg ctgaatacaa atcacagaat 1560 cgtcgtatgc agtgaaaact ctcttcaatt ctttatgccg gtgttgggcg cgttatttat 1620 cggagttgca gttgcgcccg cgaacgacat ttataatgaa cgtgaattgc tcaacagtat 1680 gggcatttcg cagcctaccg tggtgttcgt ttccaaaaag gggttgcaaa aaattttgaa 1740 cgtgcaaaaa aagctcccaa tcatccaaaa aattattatc atggattcta aaacggatta 1800 ccagggattt cagtcgatgt acacgttcgt cacatctcat ctacctcccg gttttaatga 1860 atacgatttt gtgccagagt ccttcgatag ggacaagaca attgcactga tcatgaactc 1920 ctctggatct actggtctgc ctaaaggtgt cgctctgcct catagaactg cctgcgtgag 1980 attctcgcat gccagagatc ctatttttgg caatcaaatc attccggata ctgcgatttt 2040 aagtgttgtt ccattccatc acggttttgg aatgtttact acactcggat atttgatatg 2100 tggatttcga gtcgtcttaa tgtatagatt tgaagaagag ctgtttctga ggagccttca 2160 ggattacaag attcaaagtg cgctgctggt gccaacccta ttctccttct tcgccaaaag 2220 cactctgatt gacaaatacg atttatctaa tttacacgaa attgcttctg gtggcgctcc 2280 cctctctaag gaagtcgggg aagcggttgc caagaggttc catctgccag gtatcaggca 2340 aggatatggg ctcactgaga ctacatcagc tattctgatt acacccgagg gggatgataa 2400 accgggcgcg gtcggtaaag ttgttccatt ttttgaagcg aaggttgtgg atctggatac 2460 cgggaaaacg ctgggcgtta 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aatcctggtt gctgtctctt ttagaggagt tgtggcccgt 3360 tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac gcaaccccca ctggctgggg 3420 cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct ttccccctcc cgatcgccac 3480 ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctaggt tgctgggcac 3540 tgataattcc gtggtgttgt ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 3600 ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 3660 ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 3720 ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 3780 tatggcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca 3840 ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagctgcc 3900 tgcagg 3906 <210> 59 <211> 3630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 59 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcc 60 cgggcgcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg 120 gttcctggct cagaggctca gaggcacaca ggagtttctg ggctcaccct gcccccttcc 180 aacccctcag ttcccatcct ccagcagctg tttgtgtgct gcctctgaag tccacactga 240 acaaacttca gcctactcat gtccctaaaa tgggcaaaca ttgcaagcag caaacagcaa 300 acacacagcc ctccctgcct gctgaccttg gagctggggc agaggtcaga gacctctctg 360 ggcccatgcc acctccaaca tccactcgac cccttggaat ttcggtggag aggagcagag 420 gttgtcctgg cgtggtttag gtagtgtgag agggtccggg ttcaaaacca cttgctgggt 480 ggggagtcgt cagtaagtgg ctatgccccg accccgaagc ctgtttcccc atctgtacaa 540 tggaaatgat aaagacgccc atctgatagg gtttttgtgg caaataaaca tttggttttt 600 ttgttttgtt ttgttttgtt ttttgagatg gaggtttgct ctgtcgccca ggctggagtg 660 cagtgacaca atctcatctc accacaacct tcccctgcct cagcctccca agtagctggg 720 attacaagca tgtgccacca cacctggcta attttctatt tttagtagag acgggtttct 780 ccatgttggt cagcctcagc ctcccaagta actgggatta caggcctgtg ccaccacacc 840 cggctaattt tttctatttt tgacagggac ggggtttcac catgttggtc aggctggtct 900 agaggtaccg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga 960 gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg 1020 gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg 1080 aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag 1140 ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca 1200 ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc 1260 cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgccgcca ccatgatcat 1320 ggccgagagc cctggcctga tcaccatctg cctgctgggc tacctgctga gcgccgagtg 1380 caccgtgttc ctggaccacg agaacgccaa caagatcctg aaccggccca agagatacaa 1440 cagcggcaag ctggaggagt tcgtgcaggg caacctggag agggagtgca tggaggagaa 1500 gtgcagcttc gaggaggcca gggaagtgtt cgagaacacc gagcggacca ccgagttctg 1560 gaagcagtac gtggacggcg accagtgcga gagcaaccct tgcctgaacg gcggcagctg 1620 caaggacgac atcaacagct acgagtgctg gtgccctttc ggcttcgagg gcaagaactg 1680 cgagctggac gtgacctgca acatcaagaa cggccgctgc gagcagttct gcaagaacag 1740 cgccgacaac aaagtggtgt gtagctgcac cgagggctac agactggccg agaaccagaa 1800 gagctgcgag cccgccgtgc ccttcccctg cggcagagtg agcgtgtccc agaccagcaa 1860 gctgaccaga gccgagaccg tgttccccga cgtggactac gtgaatagca ccgaggccga 1920 gaccatcctg gacaacatca cccagagcac ccagtccttc aacgacttca ccagagttgt 1980 gggcggcgag gacgccaagc ccggccagtt cccctggcag gtggtgctga acggcaaagt 2040 ggatgccttc tgcggcggca gcatcgtgaa cgagaagtgg atcgtgacag ccgcccactg 2100 cgtggagacc ggcgtgaaga tcaccgtggt ggccggcgaa cacaatatcg aggagaccga 2160 gcacaccgag cagaagcgga acgtcatccg gattatcccc caccacaact acaacgccgc 2220 catcaacaag tacaaccacg acatcgccct gctggagctg gacgagcctc tggtgctgaa 2280 tagctacgtg acccccatct gcatcgccga caaggagtac accaacatct tcctgaagtt 2340 cggcagcggc tacgtgtccg gctggggcag agtgttccac aagggcagaa gcgccctggt 2400 gctgcagtac ctgagagtgc ccctggtgga cagagccacc tgcctgttga gcaccaagtt 2460 caccatctac aacaacatgt tctgcgccgg cttccacgag ggcggcagag acagctgcca 2520 gggcgacagc ggcggacccc acgtgaccga agtggagggc accagcttcc tgaccggcat 2580 catcagctgg ggcgaggagt gcgccatgaa gggcaagtac ggcatctaca ccaaagtgag 2640 ccggtacgtg aactggatca aggagaaaac caagctgacc tgagagcatc ttaccgccat 2700 ttattcccat atttgttctg tttttcttga tttgggtata catttaaatg ttaataaaac 2760 aaaatggtgg ggcaatcatt tacattttta gggatatgta attactagtt caggtgtatt 2820 gccacaagac aaacatgtta agaaactttc ccgttattta cgctctgttc ctgttaatca 2880 acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactgatatt cttaactatg ttgctccttt 2940 tacgctgtgt ggatatgctg ctttatagcc tctgtatcta gctattgctt cccgtacggc 3000 tttcgttttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct cttttagagg agttgtggcc 3060 cgttgtccgt caacgtggcg tggtgtgctc tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggctg 3120 gggcattgcc accacctgtc aactcctttc tgggactttc gctttccccc tcccgatcgc 3180 cacggcagaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggcta ggttgctggg 3240 cactgataat tccgtggtgt tgtctgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 3300 ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 3360 tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 3420 gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg 3480 ctctatggca ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc 3540 tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag 3600 tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 3630 <210> 60 <211> 3624 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 60 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tggctcagag gctcagaggc acacaggagt ttctgggctc 180 accctgcccc cttccaaccc ctcagttccc atcctccagc agctgtttgt gtgctgcctc 240 tgaagtccac actgaacaaa cttcagccta ctcatgtccc taaaatgggc aaacattgca 300 agcagcaaac agcaaacaca cagccctccc tgcctgctga ccttggagct ggggcagagg 360 tcagagacct ctctgggccc atgccacctc caacatccac tcgacccctt ggaatttcgg 420 tggagaggag cagaggttgt cctggcgtgg tttaggtagt gtgagagggt ccgggttcaa 480 aaccacttgc tgggtgggga gtcgtcagta agtggctatg ccccgacccc gaagcctgtt 540 tccccatctg tacaatggaa atgataaaga cgcccatctg atagggtttt tgtggcaaat 600 aaacatttgg tttttttgtt ttgttttgtt ttgttttttg agatggaggt ttgctctgtc 660 gcccaggctg gagtgcagtg acacaatctc atctcaccac aaccttcccc tgcctcagcc 720 tcccaagtag ctgggattac aagcatgtgc caccacacct ggctaatttt ctatttttag 780 tagagacggg tttctccatg ttggtcagcc tcagcctccc aagtaactgg gattacaggc 840 ctgtgccacc acacccggct aattttttct atttttgaca gggacggggt ttcaccatgt 900 tggtcaggct ggtctagagg taccggatct tgctaccagt ggaacagcca ctaaggattc 960 tgcagtgaga gcagagggcc agctaagtgg tactctccca gagactgtct gactcacgcc 1020 accccctcca ccttggacac aggacgctgt ggtttctgag ccaggtacaa tgactccttt 1080 cggtaagtgc agtggaagct gtacactgcc caggcaaagc gtccgggcag cgtaggcggg 1140 cgactcagat cccagccagt ggacttagcc cctgtttgct cctccgataa ctggggtgac 1200 cttggttaat attcaccagc agcctccccc gttgcccctc tggatccact gcttaaatac 1260 ggacgaggac agggccctgt ctcctcagct tcaggcacca ccactgacct gggacagtgc 1320 cgccaccatg atcatggccg agagccctgg cctgatcacc atctgcctgc tgggctacct 1380 gctgagcgcc gagtgcaccg tgttcctgga ccacgagaac gccaacaaga tcctgaaccg 1440 gcccaagaga tacaacagcg gcaagctgga ggagttcgtg cagggcaacc tggagaggga 1500 gtgcatggag gagaagtgca gcttcgagga ggccagggaa gtgttcgaga acaccgagcg 1560 gaccaccgag ttctggaagc agtacgtgga cggcgaccag tgcgagagca acccttgcct 1620 gaacggcggc agctgcaagg acgacatcaa cagctacgag tgctggtgcc ctttcggctt 1680 cgagggcaag aactgcgagc tggacgtgac ctgcaacatc aagaacggcc gctgcgagca 1740 gttctgcaag aacagcgccg acaacaaagt ggtgtgtagc tgcaccgagg gctacagact 1800 ggccgagaac cagaagagct gcgagcccgc cgtgcccttc ccctgcggca gagtgagcgt 1860 gtcccagacc agcaagctga ccagagccga gaccgtgttc cccgacgtgg actacgtgaa 1920 tagcaccgag gccgagacca tcctggacaa catcacccag agcacccagt ccttcaacga 1980 cttcaccaga gttgtgggcg gcgaggacgc caagcccggc cagttcccct ggcaggtggt 2040 gctgaacggc aaagtggatg ccttctgcgg cggcagcatc gtgaacgaga agtggatcgt 2100 gacagccgcc cactgcgtgg agaccggcgt gaagatcacc gtggtggccg gcgaacacaa 2160 tatcgaggag accgagcaca ccgagcagaa gcggaacgtc atccggatta tcccccacca 2220 caactacaac gccgccatca acaagtacaa ccacgacatc gccctgctgg agctggacga 2280 gcctctggtg ctgaatagct acgtgacccc catctgcatc gccgacaagg agtacaccaa 2340 catcttcctg aagttcggca gcggctacgt gtccggctgg ggcagagtgt tccacaaggg 2400 cagaagcgcc ctggtgctgc agtacctgag agtgcccctg gtggacagag ccacctgcct 2460 gttgagcacc aagttcacca tctacaacaa catgttctgc gccggcttcc acgagggcgg 2520 cagagacagc tgccagggcg acagcggcgg accccacgtg accgaagtgg agggcaccag 2580 cttcctgacc ggcatcatca gctggggcga ggagtgcgcc atgaagggca agtacggcat 2640 ctacaccaaa gtgagccggt acgtgaactg gatcaaggag aaaaccaagc tgacctgaga 2700 gcatcttacc gccatttatt cccatatttg ttctgttttt cttgatttgg gtatacattt 2760 aaatgttaat aaaacaaaat ggtggggcaa tcatttacat ttttagggat atgtaattac 2820 tagttcaggt gtattgccac aagacaaaca tgttaagaaa ctttcccgtt atttacgctc 2880 tgttcctgtt aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg atattcttaa 2940 ctatgttgct ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta tagcctctgt atctagctat 3000 tgcttcccgt acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctctttt 3060 agaggagttg tggcccgttg tccgtcaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc 3120 aacccccact ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt 3180 ccccctcccg atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 3240 ggctaggttg ctgggcactg ataattccgt ggtgttgtct gtgccttcta gttgccagcc 3300 atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 3360 cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 3420 ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 3480 tggggatgcg gtgggctcta tggcaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc 3540 tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc gggaaacccg ggcgtgcgcc tcagtgagcg 3600 agcgagcgcg cagctgcctg cagg 3624 <210> 61 <211> 4257 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 61 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctacgt 180 agccatgctc tagagcggcc gcacgcgtag atcttcaata ttggccatta gccatattat 240 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cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg 1980 ctctagagcc tctgctaacc atgttttagc cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa 2040 cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt gtcgacagaa ttcctcgaag atccgaaggg 2100 gttcaagctt ggcattccgg tactgttggt aaagccacca tggaagacgc caaaaacata 2160 aagaaaggcc cggcgccatt ctatccgctg gaagatggaa ccgctggaga gcaactgcat 2220 aaggctatga agagatacgc cctggttcct ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc 2280 gaggtggaca tcacttacgc tgagtacttc gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg 2340 aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa 2400 ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac 2460 atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt atgggcattt cgcagcctac cgtggtgttc 2520 gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg aacgtgcaaa aaaagctccc aatcatccaa 2580 aaaattatta tcatggattc taaaacggat taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc 2640 gtcacatctc atctacctcc cggttttaat gaatacgatt ttgtgccaga gtccttcgat 2700 agggacaaga caattgcact gatcatgaac tcctctggat ctactggtct gcctaaaggt 2760 gtcgctctgc ctcatagaac tgcctgcgtg agattctcgc atgccagaga tcctattttt 2820 ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt 2880 ggaatgttta ctacactcgg atatttgata tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga 2940 tttgaagaag agctgtttct gaggagcctt caggattaca agattcaaag tgcgctgctg 3000 gtgccaaccc tattctcctt cttcgccaaa agcactctga ttgacaaata cgatttatct 3060 aatttacacg aaattgcttc tggtggcgct cccctctcta aggaagtcgg ggaagcggtt 3120 gccaagaggt tccatctgcc aggtatcagg caaggatatg ggctcactga gactacatca 3180 gctattctga ttacacccga gggggatgat aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca 3240 ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat accgggaaaa cgctgggcgt taatcaaaga 3300 ggcgaactgt gtgtgagagg tcctatgatt atgtccggtt atgtaaacaa tccggaagcg 3360 accaacgcct tgattgacaa ggatggatgg ctacattctg gagacatagc ttactgggac 3420 gaagacgaac acttcttcat cgttgaccgc ctgaagtctc tgattaagta caaaggctat 3480 caggtggctc ccgctgaatt ggaatccatc ttgctccaac accccaacat cttcgacgca 3540 ggtgtcgcag gtcttcccga cgatgacgcc ggtgaacttc ccgccgccgt tgttgttttg 3600 gagcacggaa 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gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctacgt 180 agccatgctc tagagcggcc gcgctagccc ctaaaatggg caaacattgc aagcagcaaa 240 cagcaaacac acagccctcc ctgcctgctg accttggagc tggggcagag gtcagagacc 300 tctctgggcc catgccacct ccaacatcca ctcgacccct tggaatttcg gtggagagga 360 gcagaggttg tcctggcgtg gtttaggtag tgtgagaggg gaatgactcc tttcggtaag 420 tgcagtggaa gctgtacact gcccaggcaa agcgtccggg cagcgtaggc gggcgactca 480 gatcccagcc agtggactta gcccctgttt gctcctccga taactggggt gaccttggtt 540 aatattcacc agcagcctcc cccgttgccc ctctggatcc actgcttaaa tacggacgag 600 gacactcgag ggccctgtct cctcagcttc aggcaccacc actgacctgg gacagtgaat 660 ccggacatcg attctaaggt aaatataaaa tttttaagtg tataatttgt taaactactg 720 attctaattg tttctctctt ttagattcca acctttggaa ctgaattcta gaccaccatg 780 cagagggtga acatgatcat ggctgagagc cctggcctga tcaccatctg cctgctgggc 840 tacctgctgt ctgctgagtg cactgtgttc ctggaccatg agaatgccaa caagatcctg 900 aacaggccca agagatacaa ctctggcaag ctggaggagt ttgtgcaggg caacctggag 960 agggagtgca tggaggagaa gtgcagcttt gaggaggcca gggaggtgtt tgagaacact 1020 gagaggacca ctgagttctg gaagcagtat gtggatgggg accagtgtga gagcaacccc 1080 tgcctgaatg ggggcagctg caaggatgac atcaacagct atgagtgctg gtgccccttt 1140 ggctttgagg gcaagaactg tgagctggat gtgacctgca acatcaagaa tggcagatgt 1200 gagcagttct gcaagaactc tgctgacaac aaggtggtgt gcagctgcac tgagggctac 1260 aggctggctg agaaccagaa gagctgtgag cctgctgtgc cattcccatg tggcagagtg 1320 tctgtgagcc agaccagcaa gctgaccagg gctgaggctg tgttccctga tgtggactat 1380 gtgaacagca ctgaggctga aaccatcctg gacaacatca cccagagcac ccagagcttc 1440 aatgacttca ccagggtggt ggggggggag gatgccaagc ctggccagtt cccctggcaa 1500 gtggtgctga atggcaaggt ggatgccttc tgtgggggca gcattgtgaa tgagaagtgg 1560 attgtgactg ctgcccactg tgtggagact ggggtgaaga tcactgtggt ggctggggag 1620 cacaacattg aggagactga gcacactgag cagaagagga atgtgatcag gatcatcccc 1680 caccacaact acaatgctgc catcaacaag tacaaccatg acattgccct gctggagctg 1740 gatgagcccc tggtgctgaa cagctatgtg acccccatct gcattgctga caaggagtac 1800 accaacatct tcctgaagtt tggctctggc tatgtgtctg gctggggcag ggtgttccac 1860 aagggcaggt ctgccctggt gctgcagtac ctgagggtgc ccctggtgga cagggccacc 1920 tgcctgagga gcaccaagtt caccatctac aacaacatgt tctgtgctgg cttccatgag 1980 gggggcaggg acagctgcca gggggactct gggggccccc atgtgactga ggtggagggc 2040 accagcttcc tgactggcat catcagctgg ggggaggagt gtgccatgaa gggcaagtat 2100 ggcatctaca ccaaagtctc cagatatgtg aactggatca aggagaagac caagctgacc 2160 taatgactcc atggttcgaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg 2220 taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc 2280 aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt aaaactagtg cggccgctct agagcatggc 2340 tacgtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag 2400 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 2460 cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 2510 <210> 63 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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1876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 67 cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga 60 gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 120 gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 180 gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 240 tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 300 caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 360 tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 420 cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 480 gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 540 cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 600 gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 660 atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 720 ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca 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polynucleotide <400> 72 gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60 ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt 120 actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc 180 tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt 240 aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct 300 attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 360 ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac 420 gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480 ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540 ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c 581 <210> 73 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 73 tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 60 ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 120 gagtaggtgt cattctattc 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<400> 104 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 105 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 106 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 107 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg ctttgcccgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 108 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca aagcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 60 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oligonucleotide <400> 113 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 114 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 115 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 116 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 117 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc 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<210> 126 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cggtttccgg 60 gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87 <210> 127 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg aaacgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85 <210> 128 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgtttcgggc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85 <210> 129 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccca aagggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 130 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc ctttgggcgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 131 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccaa aggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc 60 tcagtgagcg agcgagcgcg c 81 <210> 132 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc tttggcggcc 60 tcagtgagcg agcgagcgcg c 81 <210> 133 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcaaa gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 134 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgct ttgcggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 135 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 135 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180 gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240 gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300 gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 360 gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 420 ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa 480 gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg 540 gaactg 546 <210> 136 <400> 136 000 <210> 137 <400> 137 000 <210> 138 <400> 138 000 <210> 139 <400> 139 000 <210> 140 <400> 140 000 <210> 141 <400> 141 000 <210> 142 <400> 142 000 <210> 143 <400> 143 000 <210> 144 <400> 144 000 <210> 145 <400> 145 000 <210> 146 <400> 146 000 <210> 147 <400> 147 000 <210> 148 <400> 148 000 <210> 149 <400> 149 000 <210> 150 <400> 150 000 <210> 151 <211> 1530 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 atgtccatgg gggcaccgcg gtccctcctc ctggccctgg ctgctggcct ggccgttgcc 60 cgtccgccca acatcgtgct gatctttgcc gacgacctcg gctatgggga cctgggctgc 120 tatgggcacc ccagctctac cactcccaac ctggaccagc tggcggcggg agggctgcgg 180 ttcacagact tctacgtgcc tgtgtctctg tgcacaccct ctagggccgc cctcctgacc 240 ggccggctcc cggttcggat gggcatgtac cctggcgtcc tggtgcccag ctcccggggg 300 ggcctgcccc tggaggaggt gaccgtggcc gaagtcctgg ctgcccgagg ctacctcaca 360 ggaatggccg gcaagtggca ccttggggtg gggcctgagg gggccttcct gcccccccat 420 cagggcttcc atcgatttct aggcatcccg tactcccacg accagggccc ctgccagaac 480 ctgacctgct tcccgccggc cactccttgc gacggtggct gtgaccaggg cctggtcccc 540 atcccactgt tggccaacct gtccgtggag 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ccgcccctaa 180 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 240 aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 300 gcctaggctt ttgcaaa 317 <210> 309 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 309 tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120 atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180 tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240 cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300 tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360 cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420 ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480 aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540 gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcag 576 <210> 310 <211> 1313 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 310 ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcaaggggag agcccaggga 60 ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc cccacgacag cgcgaggagc 120 atgcgcccag ggctgagcgc gggtagatca gagcacacaa gctcacagtc cccggcggtg 180 gggggagggg cgcgctgagc gggggccagg gagctggcgc ggggcaaact gggaaagtgg 240 tgtcgtgtgc tggctccgcc ctcttcccga gggtggggga gaacggtata taagtgcggt 300 agtcgccttg gacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgtc agaacgcagg tgagtggcgg 360 gtgtggcttc cgcgggcccc ggagctggag ccctgctctg agcgggccgg gctgatatgc 420 gagtgtcgtc cgcagggttt agctgtgagc attcccactt cgagtggcgg gcggtgcggg 480 ggtgagagtg cgaggcctag cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc 540 tagcgtggtg tccgccgccg cgtgccactc cggccgcact atgcgttttt tgtccttgct 600 gccctcgatt gccttccagc agcatgggct aacaaaggga gggtgtgggg ctcactctta 660 aggagcccat gaagcttacg ttggatagga atggaagggc aggaggggcg actggggccc 720 gcccgccttc ggagcacatg tccgacgcca cctggatggg gcgaggcctg tggctttccg 780 aagcaatcgg gcgtgagttt agcctacctg ggccatgtgg ccctagcact gggcacggtc 840 tggcctggcg gtgccgcgtt cccttgcctc ccaacaaggg tgaggccgtc ccgcccggca 900 ccagttgctt gcgcggaaag atggccgctc ccggggccct gttgcaagga gctcaaaatg 960 gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aagagggcct 1020 tgcccctcgc cggccgctgc ttcctgtgac cccgtggtct atcggccgca tagtcacctc 1080 gggcttctct tgagcaccgc tcgtcgcggc ggggggaggg gatctaatgg cgttggagtt 1140 tgttcacatt tggtgggtgg agactagtca ggccagcctg gcgctggaag tcattcttgg 1200 aatttgcccc tttgagtttg gagcgaggct aattctcaag cctcttagcg gttcaaaggt 1260 attttctaaa cccgtttcca ggtgttgtga aagccaccgc taattcaaag caa 1313 <210> 311 <400> 311 000 <210> 312 <400> 312 000 <210> 313 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 313 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 314 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 314 Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly <210> 315 <211> 7 <212> PRT <213> Simian virus 40 <400> 315 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 316 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Nucleoplasmin bipartite NLS sequence <400> 316 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 317 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: C-myc NLS sequence <400> 317 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 318 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: C-myc NLS sequence <400> 318 Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro 1 5 10 <210> 319 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 319 Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro 20 25 30 Arg Asn Gln Gly Gly Tyr 35 <210> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 502 gcccgggcac gcccgggttt cccgggcg 28 <210> 503 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 503 cgtgcgggcc caaagggccc gc 22 <210> 504 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 504 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 505 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 505 cgcccgggct ttgcccgggc 20 <210> 506 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 506 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gc 42 <210> 507 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 507 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 508 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 508 cgcccgggct ttgcccgggc 20 <210> 509 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 509 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg cggc 34 <210> 510 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 510 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 511 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 511 cgcccgggct ttgcccgggc 20 <210> 512 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 512 cggggcccga cgcccgggct ttgcccgggc 30 <210> 513 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 513 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 514 <211> 20 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 520 gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cg 42 <210> 521 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 521 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 522 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 522 cgggcgacct ttggtcgccc g 21 <210> 523 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 523 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 524 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 524 cgggcgacct ttggtcgccc g 21 <210> 525 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 525 gccgcccggg cgacgggcga cctttggtcg cccg 34 <210> 526 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 526 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 527 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 527 cgggcgacct ttggtcgccc g 21 <210> 528 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 528 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 529 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 529 cgggcgacct ttggtcgccc g 21 <210> 530 <211> 4470 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 530 gtagatgagg aaactgaagt tgaggaatag tgaagagttt gtccaatgtc atagccccgt 60 aatcaacggg acaaaaattt tcttgctgat gggtcaagat ggcatcgtga agtggttgtt 120 caccgtaaac tgtaatacaa tcctgtttat ggatttgttt gcatattttt ccctccatag 180 ggaaaccttt cttccatggc tcaggacaca ctcctggatc gagccaacag gagaactttc 240 tggtaagcat ttggctaact tttttttttt tgagatggag tcttgctgtg tcgcctaggc 300 tggagtgcag tggcgtgatc ttggctcact gcagcctcca cttcccgggt tcaatcaatt 360 ctcctacctc aacttcctga gtagctggga ttacaggcgc ccgccaccac acccggctca 420 tttttgtact tttagtagag acacagtttt gccatgttgg ccaggctggt cttgaattcc 480 tcagctcagg tgatctgcct gccttggcct ctcaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc 540 actgtgcccg gccttggcta acttttcaaa attaaagatt ttgacttgtt acagtcatgt 600 gacatttttt tctttctgtt tgctgagttt ttgataattt atatctctca aagtggagac 660 tttaaaaaag actcatccgt gtgccgtgtt cactgcctgg tatcttagtg tggaccgaag 720 cctaaggacc ctgaaaacag ctgcagatga agatggcaag cacccgctgc aagctggcca 780 ggtacctgga ggacctggag gatgtggact tgaagaaatt taagatgcac ttagaggact 840 atcctcccca gaagggctgc atccccctcc cgaggggtca gacagagaag gcagaccatg 900 tggatctagc cacgctaatg atcgacttca atggggagga gaaggcgtgg gccatggccg 960 tgtggatctt cgctgcgatc aacaggagag acctttatga gaaagcaaaa agagatgagc 1020 cgaagtgggg ttcagataat gcacgtgttt cgaatcccac tgtgatatgc caggaagaca 1080 gcattgaaga ggagtggatg ggtttactgg agtacctttc gagaatctct atttgtaaaa 1140 tgaagaaaga ttaccgtaag aagtacagaa agtacgtgag aagcagattc cagtgcattg 1200 aagacaggaa tgcccgtctg ggtgagagtg tgagcctcaa caaacgctac acacgactgc 1260 gtctcatcaa ggagcaccgg agccagcagg agagggagca ggagcttctg gccatcggca 1320 agaccaagac gtgtgagagc cccgtgagtc ccattaagat ggagttgctg tttgaccccg 1380 atgatgagca ttctgagcct gtgcacaccg tggtgttcca gggggcggca gggattggga 1440 aaacaatcct ggccaggaag atgatgttgg actgggcgtc ggggacactc taccaagaca 1500 ggtttgacta tctgttctat atccactgtc gggaggtgag ccttgtgaca cagaggagcc 1560 tgggggacct gatcatgagc tgctgccccg acccaaaccc acccatccac aagatcgtga 1620 gaaaaccctc cagaatcctc ttcctcatgg acggcttcga tgagctgcaa ggtgcctttg 1680 acgagcacat aggaccgctc tgcactgact ggcagaaggc cgagcgggga gacattctcc 1740 tgagcagcct catcagaaag aagctgcttc ccgaggcctc tctgctcatc accacgagac 1800 ctgtggccct ggagaaactg cagcacttgc tggaccatcc tcggcatgtg gagatcctgg 1860 gtttctccga ggccaaaagg aaagagtact tcttcaagta cttctctgat 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cagatgaaga tggcaagcac 780 ccgctgcaag ctggccaggt acctggagga cctggaggat gtggacttga agaaatttaa 840 gatgcactta gaggactatc ctccccagaa gggctgcatc cccctcccga ggggtcagac 900 agagaaggca gaccatgtgg atctagccac gctaatgatc gacttcaatg gggaggagaa 960 ggcgtgggcc atggccgtgt ggatcttcgc tgcgatcaac aggagagacc tttatgagaa 1020 agcaaaaaga gatgagccga agtggggttc agataatgca cgtgtttcga atcccactgt 1080 gatatgccag gaagacagca ttgaagagga gtggatgggt ttactggagt acctttcgag 1140 aatctctatt tgtaaaatga agaaagatta ccgtaagaag tacagaaagt acgtgagaag 1200 cagattccag tgcattgaag acaggaatgc ccgtctgggt gagagtgtga gcctcaacaa 1260 acgctacaca cgactgcgtc tcatcaagga gcaccggagc cagcaggaga gggagcagga 1320 gcttctggcc atcggcaaga ccaagacgtg tgagagcccc gtgagtccca ttaagatgga 1380 gttgctgttt gaccccgatg atgagcattc tgagcctgtg cacaccgtgg tgttccaggg 1440 ggcggcaggg attgggaaaa caatcctggc caggaagatg atgttggact gggcgtcggg 1500 gacactctac caagacaggt ttgactatct gttctatatc cactgtcgag aggtgagcct 1560 tgtgacacag aggagcctgg gggacctgat catgagctgc tgccccgacc 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 540 gugcauugaa gacaggaaut t 21 <210> 541 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 541 ggctgtaaca ttcggagatt g 21 <210> 542 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 542 tcatcattcc cgctatcttt c 21 <210> 543 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 543 ccgtaagaag tacagaaagt a 21 <210> 544 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 544 gagactcagg agtcgcaatt t 21 <210> 545 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 545 cctcatgtaa ttagctcatt c 21 <210> 546 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 546 gtggatctag ccacgctaat g 21 <210> 547 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 547 ccacagtgta acctgcagaa a 21 <210> 548 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 548 ccagccagag tctaactgaa t 21 <210> 549 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 549 gcgttagaaa cacttcaaga a 21 <210> 550 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 550 gctggaattg ttctactgtt t 21 <210> 551 <211> 21 <212> DNA <213> Homo 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cgctatcttt cctcgaggaa agatagcggg aatgatga 58 <210> 558 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 558 ccgtaagaag tacagaaagt a 21 <210> 559 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 559 ccggccgtaa gaagtacaga aagtactcga gtactttctg tacttcttac ggtttttg 58 <210> 560 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 560 aattcaaaaa ccgtaagaag tacagaaagt actcgagtac tttctgtact tcttacgg 58 <210> 561 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 561 gagactcagg agtcgcaatt t 21 <210> 562 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 562 ccgggagact caggagtcgc aatttctcga gaaattgcga ctcctgagtc tctttttg 58 <210> 563 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 563 aattcaaaaa gagactcagg agtcgcaatt tctcgagaaa ttgcgactcc tgagtctc 58 <210> 564 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 564 cctcatgtaa ttagctcatt c 21 <210> 565 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 565 ccggcctcat gtaattagct cattcctcga ggaatgagct aattacatga ggtttttg 58 <210> 566 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 566 aattcaaaaa cctcatgtaa ttagctcatt cctcgaggaa tgagctaatt acatgagg 58 <210> 567 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 567 gtggatctag ccacgctaat g 21 <210> 568 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 568 ccgggtggat ctagccacgc taatgctcga gcattagcgt ggctagatcc actttttg 58 <210> 569 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 569 aattcaaaaa gtggatctag ccacgctaat gctcgagcat tagcgtggct agatccac 58 <210> 570 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 570 ccacagtgta acctgcagaa a 21 <210> 571 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 571 aattcaaaaa ccacagtgta acctgcagaa actcgagttt ctgcaggtta cactgtgg 58 <210> 572 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 572 ccagccagag tctaactgaa t 21 <210> 573 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 573 ccggccagcc agagtctaac tgaatctcga gattcagtta gactctggct ggtttttg 58 <210> 574 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 574 aattcaaaaa ccagccagag tctaactgaa tctcgagatt cagttagact ctggctgg 58 <210> 575 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 575 gcgttagaaa cacttcaaga a 21 <210> 576 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 576 ccgggcgtta gaaacacttc aagaactcga gttcttgaag tgtttctaac gctttttg 58 <210> 577 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 577 aattcaaaaa gcgttagaaa cacttcaaga actcgagttc ttgaagtgtt tctaacgc 58 <210> 578 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 578 gctggaattg ttctactgtt t 21 <210> 579 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 579 ccgggctgga attgttctac tgtttctcga gaaacagtag aacaattcca gctttttg 58 <210> 580 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 580 aattcaaaaa gctggaattg ttctactgtt tctcgagaaa cagtagaaca attccagc 58 <210> 581 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 581 ccacatgact ttccaggagt t 21 <210> 582 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 582 ccggccacat gactttccag gagttctcga gaactcctgg aaagtcatgt ggtttttg 58 <210> 583 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 583 aattcaaaaa ccacatgact ttccaggagt tctcgagaac tcctggaaag tcatgtgg 58 <210> 584 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 584 gaaagccaaa gctaagaagt a 21 <210> 585 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 585 ccgggaaagc caaagctaag aagtactcga gtacttctta gctttggctt tctttttg 58 <210> 586 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 586 aattcaaaaa gaaagccaaa gctaagaagt actcgagtac ttcttagctt tggctttc 58 <210> 587 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 587 ucuuugguua ucuagcugua uga 23 <210> 588 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 588 ucuuugguua ucuagcugua uga 23 <210> 589 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 589 tggggtattt gacaaactga ca 22 <210> 590 <211> 63 <212> RNA <213> Caenorhabditis brenneri <400> 590 ucgcccaucc cguuguucca auauuccaac aacaagugau uauugagcaa ugcgcaugug 60 cgg 63 <210> 591 <211> 97 <212> RNA <213> Caenorhabditis briggsae <400> 591 aagcauuuuu cugucccgcg caucccuuug uuccaauauu caaaccagua gaaagauuau 60 ugagcaaugc gcaugugcgg gacagauuga auagcug 97 <210> 592 <211> 98 <212> RNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 592 auauagcauc uuucugucuc gcccaucccg uugcuccaau auucuaacaa caagugauua 60 uugagcaaug cgcaugugcg ggauagacug auggcugc 98 <210> 593 <211> 101 <212> RNA <213> Caenorhabditis remanei <400> 593 ugaagcgucu cucugucccg cucauccugu uguuccaaua uuccaacagc ccagugauua 60 uugagcaaug cgcaugugcg ggacagauug uaugcugcca u 101 <210> 594 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 594 aguucuucag uggcaagcuu ua 22 <210> 595 <211> 85 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 595 ggcugagccg caguaguucu ucaguggcaa gcuuuauguc cugacccagc uaaagcugcc 60 aguugaagaa cuguugcccu cugcc 85 <210> 596 <211> 21 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 596 gugcauugua guugcauugc a 21 <210> 597 <211> 69 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 597 cuguggugca uuguaguugc auugcauguu cuggcaauac cugugcaaug uuuccacagu 60 gcaucacgg 69 <210> 598 <211> 343 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 598 Met Glu Ser Lys Tyr Lys Glu Ile Leu Leu Leu Thr Gly Leu Asp Asn 1 5 10 15 Ile Thr Asp Glu Glu Leu Asp Arg Phe Lys Phe Phe Leu Ser Asp Glu 20 25 30 Phe Asn Ile Ala Thr Gly Lys Leu His Thr Ala Asn Arg Ile Gln Val 35 40 45 Ala Thr Leu Met Ile Gln Asn Ala Gly Ala Val Ser Ala Val Met Lys 50 55 60 Thr Ile Arg Ile Phe Gln Lys Leu Asn Tyr Met Leu Leu Ala Lys Arg 65 70 75 80 Leu Gln Glu Glu Lys Glu Lys Val Asp Lys Gln Tyr Lys Ser Val Thr 85 90 95 Lys Pro Lys Pro Leu Ser Gln Ala Glu Met Ser Pro Ala Ala Ser Ala 100 105 110 Ala Ile Arg Asn Asp Val Ala Lys Gln Arg Ala Ala Pro Lys Val Ser 115 120 125 Pro His Val 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Lys Lys Lys Thr 340 <210> 599 <400> 599 000 <210> 600 <211> 1558 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 600 atagacattt tcttctgtgg ctgctagtga gaacccaaac cagctcagcc aattagagct 60 ccagttgtca ctcctaccca cactgggcct gggggtgaag ggaagtgttt attaggggta 120 catgtgaagc cgtccagaag tgtcagagtc tttgtagctt tgaaagtcac ctaggttatt 180 tgggcatgct ctcctgagtc ctctgctagt taagctctct gaaaagaagg tggcagaccc 240 ggtttgctga tcgccccagg gatcaggagg ctgatcccaa agttgtcaga tggagagtaa 300 atacaaggag atactcttgc taacaggcct ggataacatc actgatgagg aactggatag 360 gtttaagttc tttctttcag acgagtttaa tattgccaca ggcaaactac atactgcaaa 420 cagaatacaa gtagctacct tgatgattca aaatgctggg gcggtgtctg cagtgatgaa 480 gaccattcgt atttttcaga agttgaatta tatgcttttg gcaaaacgtc ttcaggagga 540 gaaggagaaa gttgataagc aatacaaatc ggtaacaaaa ccaaagccac taagtcaagc 600 tgaaatgagt cctgctgcat ctgcagccat cagaaatgat gtcgcaaagc aacgtgctgc 660 accaaaagtc tctcctcatg ttaagcctga acagaaacag atggtggccc agcaggaatc 720 tatcagagaa gggtttcaga agcgctgttt gccagttatg gtactgaaag caaagaagcc 780 cttcacgttt gagacccaag aaggcaagca ggagatgttt catgctacag tggctacaga 840 aaaggaattc ttctttgtaa aagtttttaa tacactgctg aaagataaat tcattccaaa 900 gagaataatt ataatagcaa gatattatcg gcacagtggt ttcttagagg taaatagcgc 960 ctcacgtgtg ttagatgctg aatctgacca aaaggttaat gtcccgctga acattatcag 1020 aaaagctggt gaaaccccga agatcaacac gcttcaaact cagccccttg gaacaattgt 1080 gaatggtttg tttgtagtcc agaaggtaac agaaaagaag aaaaacatat tatttgacct 1140 aagtgacaac actgggaaaa tggaagtact gggggttaga aacgaggaca caatgaaatg 1200 taaggaagga gataaggttc gacttacatt cttcacactg tcaaaaaatg gagaaaaact 1260 acagctgaca tctggagttc atagcaccat aaaggttatt aaggccaaaa aaaaaacata 1320 gagaagtaaa aaggaccaat tcaagccaac tggtctaagc agcatttaat tgaagaatat 1380 gtgatacagc ctcttcaatc agattgtaag ttacctgaaa gctgcagttc acaggctcct 1440 ctctccacca aattaggata gaataattgc tggataaaca aattcagaat atcaacagat 1500 gatcacaata aacatctgtt tctcattcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1558 <210> 601 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 601 cccgaagatc aacacgcttc a 21 <210> 602 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 602 ttagggttag ggttagggtt aggg 24 <210> 603 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 603 ttcaaattca aattcaaatt caaa 24 <210> 604 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 604 ttaggg 6 <210> 605 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 605 agccactaag tcaagctgaa a 21 <210> 606 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 606 ccaactggtc taagcagcat t 21 <210> 607 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 607 gaaacgagga cacaatgaaa t 21 <210> 608 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 608 gccactaagt caagctgaaa t 21 <210> 609 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 609 ctggagttca tagcaccata a 21 <210> 610 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 610 cccgctgaac attatcagaa a 21 <210> 611 <211> 1393 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 611 atactttcag tttcagtcac acaagaaggg aggagagaaa agccatggcc gacaaggtcc 60 tgaaggagaa gagaaagctg tttatccgtt ccatgggtga aggtacaata aatggcttac 120 tggatgaatt attacagaca agggtgctga acaaggaaga gatggagaaa gtaaaacgtg 180 aaaatgctac agttatggat aagacccgag ctttgattga ctccgttatt ccgaaagggg 240 cacaggcatg ccaaatttgc atcacataca tttgtgaaga agacagttac ctggcaggga 300 cgctgggact ctcagcagat caaacatctg gaaattacct taatatgcaa gactctcaag 360 gagtactttc ttcctttcca gctcctcagg cagtgcagga caacccagct atgcccacat 420 cctcaggctc agaagggaat gtcaagcttt gctccctaga agaagctcaa aggatatgga 480 aacaaaagtc ggcagagatt tatccaataa tggacaagtc aagccgcaca cgtcttgctc 540 tcattatctg caatgaagaa tttgacagta ttcctagaag aactggagct gaggttgaca 600 tcacaggcat gacaatgctg ctacaaaatc tggggtacag cgtagatgtg aaaaaaaatc 660 tcactgcttc ggacatgact acagagctgg aggcatttgc acaccgccca gagcacaaga 720 cctctgacag cacgttcctg gtgttcatgt ctcatggtat tcgggaaggc atttgtggga 780 agaaacactc tgagcaagtc ccagatatac tacaactcaa tgcaatcttt aacatgttga 840 ataccaagaa ctgcccaagt ttgaaggaca aaccgaaggt gatcatcatc caggcctgcc 900 gtggtgacag ccctggtgtg gtgtggttta aagattcagt aggagtttct ggaaacctat 960 ctttaccaac tacagaagag tttgaggatg atgctattaa gaaagcccac atagagaagg 1020 attttatcgc tttctgctct tccacaccag ataatgtttc ttggagacat cccacaatgg 1080 gctctgtttt tattggaaga ctcattgaac atatgcaaga atatgcctgt tcctgtgatg 1140 tggaggaaat tttccgcaag gttcgatttt catttgagca gccagatggt agagcgcaga 1200 tgcccaccac tgaaagagtg actttgacaa gatgtttcta cctcttccca ggacattaaa 1260 ataaggaaac tgtatgaatg tctgtgggca ggaagtgaag agatccttct gtaaaggttt 1320 ttggaattat gtctgctgaa taataaactt ttttgaaata ataaatctgg tagaaaaatg 1380 aaaaaaaaaa aaa 1393 <210> 612 <211> 404 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 612 Met Ala Asp Lys Val Leu Lys Glu Lys Arg Lys Leu Phe Ile Arg Ser 1 5 10 15 Met Gly Glu Gly Thr Ile Asn Gly Leu Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr 20 25 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tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 908 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 908 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 909 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 909 ttggccactc cctctatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gggtttccac gtccggcccc accgagcgag cgagtgcgca tagagggagt 120 ggccaactcc atcactagag gtat 144 <210> 910 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 910 atacctctag tgatggagtt ggccactccc tctatgcgca ctcgctcgct cggtggggcc 60 ggacgtggaa acccacgtcc gtctggcgac ctttggtcgc caggccccac cgagcgagcg 120 agtgcgcata 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 914 cttacaaaac ccccttgctt gagagtgtgg cactctcccc cctgtcgcgt tcgctcgctc 60 gctggctcgt ttgggggggt ggcagctcaa agagctgcca gacgacggcc ctctggccgt 120 cgccccccca aacgagccag cgagcgagcg aacgcgacag ggggga 166 <210> 915 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 915 ttgcccactc cctctaatgc gcgctcgctc gctcggtggg gcctgcggac caaaggtccg 60 cagacggcag aggtctcctc tgccggcccc accgagcgag cgagcgcgca tagagggagt 120 gggcaactcc atcactaggg gtat 144 <210> 916 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 916 atacccctag tgatggagtt gcccactccc tctatgcgcg ctcgctcgct cggtggggcc 60 ggcagaggag acctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga 120 gcgcgcatta gagggagtgg gcaa 144 <210> 917 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 917 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 cgcacgcccg ggtttcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 120 <210> 918 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 918 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 919 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 919 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcgcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct 120 gcctgcagg 129 <210> 920 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 920 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ctttgcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag g 101 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 924 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcaaag cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 120 agctgcctgc agg 133 <210> 925 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 925 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gtttcccggg cggcctcagt gagcgagcga 120 gcgcgcagct gcctgcagg 139 <210> 926 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 926 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg tttccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 120 gcgcagctgc ctgcagg 137 <210> 927 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 927 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgt ttcgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 120 gcagctgcct gcagg 135 <210> 928 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 928 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccctt tgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 120 agctgcctgc agg 133 <210> 929 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 929 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccttt ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 120 ctgcctgcag g 131 <210> 930 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 930 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgctttg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct 120 gcctgcagg 129 <210> 931 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cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct 120 <210> 935 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 935 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgt cgggcgacct ttggtcgccc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 120 ct 122 <210> 936 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 936 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 120 ct 122 <210> 937 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 937 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcgcc cgggcgtcgg gcgacctttg 60 gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120 ggggttcct 129 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cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgtttcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120 tcactagggg ttcct 135 <210> 942 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 942 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggctttgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt cct 133 <210> 943 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 943 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtcgg 60 gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac 120 tccatcacta ggggttcct 139 <210> 944 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 944 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccggaaaccg ggcgtcgggc 60 gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 120 catcactagg ggttcct 137 <210> 945 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 945 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgaaacggg cgtcgggcga 60 cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120 tcactagggg ttcct 135 <210> 946 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 946 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccaaagggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt cct 133 <210> 947 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 947 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc caaaggcgtc gggcgacctt 60 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120 taggggttcc t 131 <210> 948 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 948 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc aaagcgtcgg gcgacctttg 60 gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120 ggggttcct 129 <210> 949 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 949 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccga aacgtcgggc gacctttggt 60 cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg 120 ggttcct 127 <210> 950 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 950 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 951 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 951 Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly <210> 952 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 952 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 953 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 953 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 954 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 954 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc 120 tgcctgcagg 130 <210> 955 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 955 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 130 <210> 956 <211> 143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 956 ttgcccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga ggtctcctct gccggcccca ccgagcgagc gacgcgcgca gagagggagt 120 gggcaactcc atcactaggg taa 143 <210> 957 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 957 ttggccactc cctctatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gggtttccac gtccggcccc accgagcgag cgagtgcgca tagagggagt 120 ggccaactcc atcactagag gtat 144 <210> 958 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 958 ttggccactc cctctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagggagtg 120 gccaact 127 <210> 959 <211> 166 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 959 tcccccctgt cgcgttcgct cgctcgctgg ctcgtttggg ggggcgacgg ccagagggcc 60 gtcgtctggc agctctttga gctgccaccc ccccaaacga gccagcgagc gagcgaacgc 120 gacagggggg agagtgccac actctcaagc aagggggttt tgtaag 166 <210> 960 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 960 ttgcccactc cctctaatgc gcgctcgctc gctcggtggg gcctgcggac caaaggtccg 60 cagacggcag aggtctcctc tgccggcccc accgagcgag cgagcgcgca tagagggagt 120 gggcaactcc atcactaggg gtat 144 <210> 961 <211> 143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 961 ttaccctagt gatggagttg cccactccct ctctgcgcgc gtcgctcgct cggtggggcc 60 ggcagaggag acctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga 120 gcgcgcagag agggagtggg caa 143 <210> 962 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 962 atacctctag tgatggagtt ggccactccc tctatgcgca ctcgctcgct cggtggggcc 60 ggacgtggaa acccacgtcc gtctggcgac ctttggtcgc caggccccac cgagcgagcg 120 agtgcgcata gagggagtgg ccaa 144 <210> 963 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 963 agttggccac attagctatg cgcgctcgct cactcactcg gccctggaga ccaaaggtct 60 ccagactgcc ggcctctggc cggcagggcc gagtgagtga gcgagcgcgc atagagggag 120 tggccaa 127 <210> 964 <211> 166 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 964 cttacaaaac ccccttgctt gagagtgtgg cactctcccc cctgtcgcgt tcgctcgctc 60 gctggctcgt ttgggggggt ggcagctcaa agagctgcca gacgacggcc ctctggccgt 120 cgccccccca aacgagccag cgagcgagcg aacgcgacag ggggga 166 <210> 965 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 965 atacccctag tgatggagtt gcccactccc tctatgcgcg ctcgctcgct cggtggggcc 60 ggcagaggag acctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga 120 gcgcgcatta gagggagtgg gcaa 144 <210> 966 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 966 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 cgcacgcccg ggtttcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 120 <210> 967 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 967 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 968 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 968 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcgcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct 120 gcctgcagg 129 <210> 969 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 969 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ctttgcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag g 101 <210> 970 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 970 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgaca aagtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 120 gcgcgcagct gcctgcagg 139 <210> 971 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 971 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgaaa atcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 120 gcgcagctgc ctgcagg 137 <210> 972 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 972 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgaaa cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 120 gcagctgcct gcagg 135 <210> 973 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 973 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcaaag cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 120 agctgcctgc agg 133 <210> 974 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 974 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gtttcccggg cggcctcagt gagcgagcga 120 gcgcgcagct gcctgcagg 139 <210> 975 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 975 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg tttccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 120 gcgcagctgc ctgcagg 137 <210> 976 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 976 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgt ttcgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 120 gcagctgcct gcagg 135 <210> 977 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 977 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccctt tgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 120 agctgcctgc agg 133 <210> 978 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 978 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccttt ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 120 ctgcctgcag g 131 <210> 979 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 979 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgctttg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct 120 gcctgcagg 129 <210> 980 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 980 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgtttcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 120 ctgcagg 127 <210> 981 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 981 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 982 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 982 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc 120 tgcctgcagg 130 <210> 983 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 983 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct 120 <210> 984 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 984 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgt cgggcgacct ttggtcgccc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 120 ct 122 <210> 985 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 985 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 120 ct 122 <210> 986 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 986 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcgcc cgggcgtcgg gcgacctttg 60 gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120 ggggttcct 129 <210> 987 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 987 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcaaa gcctcagtga gcgagcgagc 60 gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc t 101 <210> 988 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 988 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacttt gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac 120 tccatcacta ggggttcct 139 <210> 989 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 989 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgatttt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 120 catcactagg ggttcct 137 <210> 990 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 990 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgtttcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120 tcactagggg ttcct 135 <210> 991 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 991 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggctttgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt cct 133 <210> 992 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 992 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtcgg 60 gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac 120 tccatcacta ggggttcct 139 <210> 993 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 993 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccggaaaccg ggcgtcgggc 60 gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 120 catcactagg ggttcct 137 <210> 994 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 994 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgaaacggg cgtcgggcga 60 cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120 tcactagggg ttcct 135 <210> 995 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 995 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccaaagggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt cct 133 <210> 996 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 996 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc caaaggcgtc gggcgacctt 60 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120 taggggttcc t 131 <210> 997 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 997 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc aaagcgtcgg gcgacctttg 60 gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120 ggggttcct 129 <210> 998 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 998 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccga aacgtcgggc gacctttggt 60 cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg 120 ggttcct 127 <210> 999 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 999 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 1000 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1000 cgatcgttcg at 12 <210> 1001 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1001 atcgaaccat cg 12 <210> 1002 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1002 atcgaacgat cg 12 <210> 1003 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1003 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 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1007 gccgccacca tggaagacgc caaaaacata aagaaaggcc cggcgccatt ctatccgctg 60 gaagatggaa ccgctggaga gcaactgcat aaggctatga agagatacgc cctggttcct 120 ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc gaggtggaca tcacttacgc tgagtacttc 180 gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga 240 atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt 300 atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt 360 atgggcattt cgcagcctac cgtggtgttc gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg 420 aacgtgcaaa aaaagctccc aatcatccaa aaaattatta tcatggattc taaaacggat 480 taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc gtcacatctc atctacctcc cggttttaat 540 gaatacgatt ttgtgccaga gtccttcgat agggacaaga caattgcact gatcatgaac 600 tcctctggat ctactggtct gcctaaaggt gtcgctctgc ctcatagaac tgcctgcgtg 660 agattctcgc atgccagaga tcctattttt ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt 720 ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt ggaatgttta ctacactcgg atatttgata 780 tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga tttgaagaag agctgtttct gaggagcctt 840 caggattaca 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <400> 1008 Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1016 agttga 6 <210> 1017 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1017 rrttrr 6 <210> 1018 <211> 581 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1018 gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60 ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt 120 actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc 180 tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt 240 aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct 300 attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 360 ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac 420 gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480 ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540 ggggctaggt tgctgggcac 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1023 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg 540 cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta 600 attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg 660 gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg 720 cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg 780 aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgac gctgccttcg 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gtctagaggt 780 accggatctt gctaccagtg gaacagccac taaggattct gcagtgagag cagagggcca 840 gctaagtggt actctcccag agactgtctg actcacgcca ccccctccac cttggacaca 900 ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg 960 tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg 1020 gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca 1080 gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc 1140 tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagt 1177 <210> 1026 <211> 547 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1026 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180 gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240 gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300 gtttgctcct ccgataactg 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1030 ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60 agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 120 tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 180 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 240 aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 300 gcctaggctt ttgcaaa 317 <210> 1031 <211> 241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1031 gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60 ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120 aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180 atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240 c 241 <210> 1032 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1032 gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60 cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120 tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180 gatttgggaa tcgtataaga actgtatgag accac 215 <210> 1033 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1033 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180 gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240 gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300 gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 360 gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 420 ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa 480 gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg 540 gaactg 546 <210> 1034 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1034 tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120 atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180 tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240 cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300 tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360 cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420 ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480 aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540 gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcag 576 <210> 1035 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1035 ataaacgata acgccgttgg tggcgtgagg catgtaaaag gttacatcat tatcttgttc 60 gccatccggt tggtataaat agacgttcat gttggttttt gtttcagttg caagttggct 120 gcggcgcgcg cagcaccttt gcggccatct 150 <210> 1036 <211> 1313 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1036 ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcaaggggag agcccaggga 60 ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc cccacgacag cgcgaggagc 120 atgcgcccag ggctgagcgc gggtagatca gagcacacaa gctcacagtc cccggcggtg 180 gggggagggg cgcgctgagc gggggccagg gagctggcgc ggggcaaact gggaaagtgg 240 tgtcgtgtgc tggctccgcc ctcttcccga gggtggggga gaacggtata taagtgcggt 300 agtcgccttg gacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgtc agaacgcagg tgagtggcgg 360 gtgtggcttc cgcgggcccc ggagctggag ccctgctctg agcgggccgg gctgatatgc 420 gagtgtcgtc cgcagggttt agctgtgagc attcccactt cgagtggcgg gcggtgcggg 480 ggtgagagtg cgaggcctag cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc 540 tagcgtggtg tccgccgccg cgtgccactc cggccgcact atgcgttttt tgtccttgct 600 gccctcgatt gccttccagc agcatgggct aacaaaggga gggtgtgggg ctcactctta 660 aggagcccat gaagcttacg ttggatagga atggaagggc aggaggggcg actggggccc 720 gcccgccttc ggagcacatg tccgacgcca cctggatggg gcgaggcctg tggctttccg 780 aagcaatcgg gcgtgagttt agcctacctg ggccatgtgg ccctagcact gggcacggtc 840 tggcctggcg gtgccgcgtt cccttgcctc ccaacaaggg tgaggccgtc ccgcccggca 900 ccagttgctt gcgcggaaag atggccgctc ccggggccct gttgcaagga gctcaaaatg 960 gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aagagggcct 1020 tgcccctcgc cggccgctgc ttcctgtgac cccgtggtct atcggccgca tagtcacctc 1080 gggcttctct tgagcaccgc tcgtcgcggc ggggggaggg gatctaatgg cgttggagtt 1140 tgttcacatt tggtgggtgg agactagtca ggccagcctg gcgctggaag tcattcttgg 1200 aatttgcccc tttgagtttg gagcgaggct aattctcaag cctcttagcg gttcaaaggt 1260 attttctaaa cccgtttcca ggtgttgtga aagccaccgc taattcaaag caa 1313 <210> 1037 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1037 taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60 tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 120 ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt 180 tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gta 213 <210> 1038 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1038 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 1039 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1039 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 1040 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1040 Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly <210> 1041 <211> 7 <212> PRT <213> Simian virus 40 <400> 1041 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 1042 <211> 21 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 1042 cccaagaaga agaggaaggt g 21 <210> 1043 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Nucleoplasmin bipartite NLS sequence <400> 1043 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 1044 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: C-myc NLS sequence <400> 1044 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 1045 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: C-myc NLS sequence <400> 1045 Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro 1 5 10 <210> 1046 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1046 Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro 20 25 30 Arg Asn Gln Gly Gly Tyr 35 <210> 1047 <211> 42 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: IBB domain from importin-alpha sequence <400> 1047 Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys 20 25 30 Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val 35 40 <210> 1048 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Myoma T protein sequence <400> 1048 Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro 1 5 <210> 1049 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Myoma T protein sequence <400> 1049 Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp 1 5 <210> 1050 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1050 Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu 1 5 <210> 1051 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1051 Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro 1 5 10 <210> 1052 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1052 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtgcgcct cagtgagcga 60 gcgagcgcgc 70 <210> 1053 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1053 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcacgc ccgggtttcc cgggcggcct cagtgagcga 60 gcgagcgcgc 70 <210> 1054 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1054 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 1055 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1055 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 1056 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1056 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 1057 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1057 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 1058 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1058 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg ctttgcccgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 1059 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1059 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca aagcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 1060 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1060 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgaaac gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 60 tgagcgagcg agcgcgc 77 <210> 1061 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1061 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgtt tcggcctcag 60 tgagcgagcg agcgcgc 77 <210> 1062 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1062 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcaaagcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51 <210> 1063 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1063 gcgcgctcgc tcgctcactg aggctttgcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51 <210> 1064 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1064 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 1065 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1065 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 1066 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1066 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 1067 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1067 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 1068 <211> 5 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 1068 Asp Arg Leu Arg Arg 1 5 <210> 1069 <211> 7 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 1069 Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys 1 5 <210> 1070 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis delta virus <400> 1070 Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 1071 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1071 Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg 1 5 10 <210> 1072 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1072 Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys 1 5 10 15 Lys Ser Lys Lys 20 <210> 1073 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1073 Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys 1 5 10 15 Lys <210> 1074 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1074 gtttaaac 8 <210> 1075 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1075 ttaattaa 8 <210> 1076 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1076 aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt 60 cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc 120 tgcggcgcgc gcagcacctt t 141 <210> 1077 <211> 317 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1077 ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60 agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 120 tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 180 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 240 aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 300 gcctaggctt ttgcaaa 317 <210> 1078 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1078 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 1079 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1079 gagacagaca cactcctgct atgggtactg ctgctctggg ttccaggttc cactggtgac 60 <210> 1080 <211> 1260 <212> DNA <213> Adeno-associated virus - 2 <400> 1080 atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60 gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag 120 gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180 gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240 aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300 ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360 gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420 cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480 aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540 tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600 tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660 atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720 gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780 tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag 840 cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 900 aactacgcag acaggtacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg 960 tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga 1020 cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa 1080 aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc 1140 actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataaatgatt 1200 taaatcaggt atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga 1260 <210> 1081 <211> 1932 <212> DNA <213> Adeno-associated virus - 2 <400> 1081 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180 cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240 caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300 aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360 taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420 gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480 acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540 aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600 gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660 tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720 cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780 tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840 cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900 attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920 cactctctct ga 1932 <210> 1082 <211> 1876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1082 cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg 60 gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 120 gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 180 gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 240 tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 300 caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg 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gtggatccag 60 gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag 120 gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180 gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240 aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300 ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360 gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420 cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480 aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540 tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600 tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660 atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720 gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780 tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag 840 cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 900 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ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 480 gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 540 cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 600 gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 660 atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 720 ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 780 caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac 840 taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg 900 gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct 960 gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac 1020 taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt 1080 aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg 1140 ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag 1200 caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat 1260 cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca 1320 ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga 1380 ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt 1440 ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc 1500 cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac 1560 gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca 1620 cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc 1680 aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc 1740 tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat 1800 gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg 1860 catctttgaa caataa 1876 <210> 1085 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1085 ctaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg c 51 <210> 1086 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1086 ctaggactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtc 65 <210> 1087 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1087 ggactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 60 tcctgca 67 <210> 1088 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1088 gtgcgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggcgcactc a 41 <210> 1089 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1089 ggactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg cggcctcagt cctgca 56 <210> 1090 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1090 ctaggactga ggccgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc agtc 54 <210> 1091 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial 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tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 660 ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 720 gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 780 cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 840 ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 900 agtcgctgcg acgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc 960 cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc 1020 cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa 1080 gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggga gcggctcggg gggtgcgtgc 1140 gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggcccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct 1200 gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg 1260 gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt 1320 gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cggcggtcgg gctgtaaccc ccccctgcac 1380 ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt 1440 ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg 1500 gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc 1560 ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg 1620 cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc 1680 ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag 1740 ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg 1800 cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg 1860 accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttttagcct tcttcttttt cctacagctc 1920 ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcatttgt cgacagaatt cctcgaagat 1980 ccgaaggggt tcaagcttgg cattccggta ctgttggtaa agccagttta aacgccgcca 2040 ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg 2100 acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct 2160 acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca 2220 ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga 2280 agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc 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tcactagggg ttccttgtag ttaatgatta acccgccatg ctacttatcg cggccgctca 180 atattggcca ttagccatat tattcattgg ttatatagca taaatcaata ttggctattg 240 gccattgcat acgttgtatc tatatcataa tatgtacatt tatattggct catgtccaat 300 atgaccgcca tgttggcatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 360 attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 420 tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt 480 aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 540 cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg tcaatgacgg 600 taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta cgggactttc ctacttggca 660 gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt 720 cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt 780 attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg 840 gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc 900 gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag 960 cgcgcggcgg 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<400> 1099 tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 60 ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 120 gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 180 ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc 225 <210> 1100 <211> 1177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1100 ggctcagagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca ccctgccccc ttccaacccc 60 tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct gaagtccaca ctgaacaaac 120 ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac 180 agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca 240 tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc 300 ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggtc cgggttcaaa accacttgct gggtggggag 360 tcgtcagtaa gtggctatgc cccgaccccg aagcctgttt ccccatctgt acaatggaaa 420 tgataaagac gcccatctga tagggttttt gtggcaaata aacatttggt ttttttgttt 480 tgttttgttt tgttttttga 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cgccttcgca 60 aggggagagc ccagggaccg tccctaaatt ctcacagacc caaatccctg tagccgcccc 120 acgacagcgc gaggagcatg cgcccagggc tgagcgcggg tagatcagag cacacaagct 180 cacagtcccc ggcggtgggg ggaggggcgc gctgagcggg ggccagggag ctggcgcggg 240 gcaaactggg aaagtggtgt cgtgtgctgg ctccgccctc ttcccgaggg tgggggagaa 300 cggtatataa gtgcggtagt cgccttggac gttctttttc gcaacgggtt tgccgtcaga 360 acgcaggtga gtggcgggtg tggcttccgc gggccccgga gctggagccc tgctctgagc 420 gggccgggct gatatgcgag tgtcgtccgc agggtttagc tgtgagcatt cccacttcga 480 gtggcgggcg gtgcgggggt gagagtgcga ggcctagcgg caaccccgta gcctcgcctc 540 gtgtccggct tgaggcctag cgtggtgtcc gccgccgcgt gccactccgg ccgcactatg 600 cgttttttgt ccttgctgcc ctcgattgcc ttccagcagc atgggctaac aaagggaggg 660 tgtggggctc actcttaagg agcccatgaa gcttacgttg gataggaatg gaagggcagg 720 aggggcgact ggggcccgcc cgccttcgga gcacatgtcc gacgccacct ggatggggcg 780 aggcctgtgg ctttccgaag caatcgggcg tgagtttagc ctacctgggc catgtggccc 840 tagcactggg cacggtctgg cctggcggtg ccgcgttccc ttgcctccca acaagggtga 900 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cacatgactg cccaaatggg agcttgacag tgacagtgac agtagatatg 1500 ccaaagtgga tgagggaaag accacaagag ctaaaccctg taaaaagaac tgtaggcaac 1560 taaggaatgc agagagaaga agttgccttg gaagagcata ccaactgcct ctccaatacc 1620 aatggtcatc cctaaaacat acgtatgaat aacatgcaga ctaagcaggc tacatttagg 1680 aatatacatg tatttacata aatgtatatg catgtaacaa caatgaatga aaactgaggt 1740 catggatctg aaagagagca agggggctta catgagaggg tttggaggga ggggttggag 1800 ggagggaggt attattcttt agttttacag ggaacgtagt aaaaacatag gcttctccca 1860 aaggagcaga gcccatgagg agctgtgcaa ggttccccag cttgatttta cctgctcctc 1920 aaattccctt gatttgtttt tattataatg actttactcc tagcttttag tgtcagatag 1980 aaaacatgga agg 1993 <210> 1104 <211> 1350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1104 taggaggctg aggcaggagg atcgcttgag cccaggagtt cgagaccagc ctgggcaaca 60 tagtgtgatc ttgtatctat aaaaataaac aaaattagct tggtgtggtg gcgcctgtag 120 tccccagcca cttggagggg tgaggtgaga ggattgcttg agcccgggat ggtccaggct 180 gcagtgagcc atgatcgtgc cactgcactc cagcctgggc gacagagtga gaccctgtct 240 cacaacaaca 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gaattgctga ttcttgagtt tagtgatctg aacagaaata ccaaaattat ttcagaaatg 600 tacaactttt tacctagtac aaggcaacat ataggttgta aatgtgttta aaacaggtct 660 ttgtcttgct atggggagaa aagacatgaa tatgattagt aaagaaatga cacttttcat 720 gtgtgatttc ccctccaagg tatggttaat aagtttcact gacttagaac caggcgagag 780 acttgtggcc tgggagagct ggggaagctt cttaaatgag aaggaatttg agttggatca 840 tctattgctg gcaaagacag aagcctcact gcaagcactg catgggcaag cttggctgta 900 gaaggagaca gagctggttg ggaagacatg gggaggaagg acaaggctag atcatgaaga 960 accttgacgg cattgctccg tctaagtcat gagctgagca gggagatcct ggttggtgtt 1020 gcagaaggtt tactctgtgg ccaaaggagg gtcaggaagg atgagcattt agggcaagga 1080 gaccaccaac agccctcagg tcagggtgag gatggcctct gctaagctca aggcgtgagg 1140 atgggaagga gggaggtatt cgtaaggatg ggaaggaggg aggtattcgt gcagcatatg 1200 aggatgcaga gtcagcagaa ctg 1223 <210> 1106 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1106 gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60 cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120 tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180 gatttgggaa tcttataagt tctgtatgag accac 215 <210> 1107 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1107 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca cctaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctaggtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 1108 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1108 gcgcgctcgc tcgctcacc 19 <210> 1109 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1109 ctaggtgagc gagcgagcgc gc 22 <210> 1110 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1110 cctgcaggac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg 60 cctcagtcct gcagg 75 <210> 1111 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1111 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagt 60 gcgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcgcactcag tgagcgagcg agcgcgcagc 120 tgcctgcagg 130 <210> 1112 <211> 142 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1112 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctcc ctaggactga ggccgcccgg gcgtcgggcg 60 acctttggtc gcccggcctc agtcctaggg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc 120 aactccatca ctaggggttc ct 142 <210> 1113 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1113 gcgcgctcgc tcgctcactg agtgcgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcact 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 1114 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1114 gcgcgctcgc tcgctcactg a 21 <210> 1115 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1115 gtgagcgagc gagcgcgc 18 <210> 1116 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1116 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgactttgtc 60 gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89 <210> 1117 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1117 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaagtcgc ccgacgcccg ggctttgccc 60 gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89 <210> 1118 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1118 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgattttcgc 60 ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87 <210> 1119 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1119 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaaatcgccc gacgcccggg ctttgcccgg 60 gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87 <210> 1120 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1120 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgtttcgccc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85 <210> 1121 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1121 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaacgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85 <210> 1122 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1122 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtcgggcg acctttggtc 60 gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89 <210> 1123 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1123 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggtttccc 60 gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89 <210> 1124 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1124 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg gaaaccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc 60 ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87 <210> 1125 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1125 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cggtttccgg 60 gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87 <210> 1126 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1126 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg aaacgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85 <210> 1127 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1127 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgtttcgggc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85 <210> 1128 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1128 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccca aagggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 1129 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1129 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc ctttgggcgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 1130 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1130 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccaa aggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc 60 tcagtgagcg agcgagcgcg c 81 <210> 1131 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1131 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc tttggcggcc 60 tcagtgagcg agcgagcgcg c 81 <210> 1132 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1132 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcaaa gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 1133 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1133 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgct ttgcggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 1134 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1134 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgaa acgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgca g 81 <210> 1135 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1135 ctgcgcgctc gctcgctcac 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1140 attcatacca acttgaagaa aaagttcagc ctcttcatcc tggtctttct cctgttcgca 60 gtcatctgtg tttggaagaa agggagcgac tatgaggcc 99 <210> 1141 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1141 gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60 gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120 ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180 gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240 aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300 tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360 acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420 aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480 gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540 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gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatgg 518 <210> 1148 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1148 aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60 ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120 tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180 cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240 tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300 ggtttaggta gtgtgagagg gtccgggttc aaaaccactt gctgggtggg gagtcgtcag 360 taagtggcta tgccccgacc ccgaagcctg tttccccatc tgtacaatgg aaatgataaa 420 gacgcccatc tgatagggtt tttgtggcaa ataaacattt ggtttttttg ttttgttttg 480 ttttgttttt tgagatggag gtttgctctg tcgcccaggc tggagtgcag tgacacaatc 540 tcatctcacc 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1150 cgggggaggc tgctggtgaa tattaaccaa ggtcacccca gttatcggag gagcaaacag 60 gggctaagtc cacacgcgtg gta 83 <210> 1151 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1151 aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60 ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120 tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180 cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240 tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300 ggtttaggta gtgtgagagg gtccgggttc aaaaccactt gctgggtggg gagtcgtcag 360 taagtggcta tgccccgacc ccgaagcctg tttccccatc tgtacaatgg aaatgataaa 420 gacgcccatc tgatagggtt tttgtggcaa ataaacattt ggtttttttg ttttgttttg 480 ttttgttttt tgagatggag gtttgctctg tcgcccaggc tggagtgcag tgacacaatc 540 tcatctcacc acaaccttcc cctgcctcag cctcccaagt agctgggatt acaagcatgt 600 gccaccacac ctggctaatt ttctattttt agtagagacg ggtttctcca tgttggtcag 660 cctcagcctc ccaagtaact gggattacag gcctgtgcca ccacacccgg ctaatttttt 720 ctatttttga cagggacggg gtttcaccat gttggtcagg ctggtctaga ggtactg 777 <210> 1152 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1152 gtttgctgct tgcaatgttt gcccatttta gggtggacac aggacgctgt ggtttctgag 60 ccaggg 66 <210> 1153 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1153 ggaggggtgg agtcgtgacc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca 60 cacagccctc cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc 120 ccatgccacc tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt 180 gtcctggcgt ggtttaggta gtgtgagagg gg 212 <210> 1154 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1154 aggctcagag gcacacagga gtttctgggc 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120 agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc 180 ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccacta 240 <210> 1157 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1157 cgggggaggc tgctggtgaa tattaaccaa ggtcacccca gttatcggag gagcaaacag 60 gggctaagtc cac 73 <210> 1158 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1158 aggttaattt ttaaaaagca gtcaaaagtc caagtggccc ttggcagcat ttactctctc 60 tgtttgctct ggttaataat ctcaggagca caaacattcc 100 <210> 1159 <211> 296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1159 gttacataac ttatggtaaa tggcctgcct ggctgactgc ccaatgaccc ctgcccaatg 60 atgtcaataa tgatgtatgt tcccatgtaa tgccaatagg gactttccat tgatgtcaat 120 gggtggagta tttatggtaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 180 tatgccccct 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gcggcccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 300 ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcgcggccgg 360 gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt 420 gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcggcggtc gggctgtaac ccccccctgc 480 acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 540 gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 600 cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 660 gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 720 cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 780 ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 840 agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 900 cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 960 tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttttagc cttcttcttt ttcctacagc 1020 tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt gtcgacagaa ttcctcgaag 1080 atccgaaggg gttcaagctt ggcattccgg tactgttggt aaagcca 1127 <210> 1162 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1162 ctctaaggta aatataaaat ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga ttctaattgt 60 ttctctcttt tagattccaa cctttggaac tga 93 <210> 1163 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1163 gccctgtctc ctcagcttca ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cgga 54 <210> 1164 <211> 173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1164 ctgccttctc cctcctgtga gtttggtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg 60 ggcaggagat ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctagacaatt 120 gtactaacct tcttctcttt cctctcctga caggttggtg tacagtagct tcc 173 <210> 1165 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1165 aagaggtaag ggtttaaggg atggttggtt ggtggggtat taatgtttaa 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oligonucleotide <400> 1169 tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagtgaa tcgccacc 48 <210> 1170 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1170 gctagcaggt aagtgccgtg tgtggttccc gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc 60 cttgcgtgcc ttgaattact gacactgaca tccacttttt ctttttctcc acaggtttaa 120 acgccacc 128 <210> 1171 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1171 aagaggtaag ggtttaagtt atcgttagtt cgtgcaccat taatgtttaa ttacctggag 60 cacctgcctg aaatcatttt tttttcaggt tggctagt 98 <210> 1172 <211> 172 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1172 gcttagtgct gagcacatcc agtgggtaaa gttccttaaa atgctctgca aagaaattgg 60 gacttttcat taaatcagaa attttacttt tttcccctcc tgggagctaa agatatttta 120 gagaagaatt aaccttttgc ttctccagtt gaacatttgt agcaataagt ca 172 <210> 1173 <211> 160 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1173 gccctgtctc ctcagcttca ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa 60 ggtaaatata aaatttttaa gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct 120 cttttagatt ccaacctttg gaactgaatt ctagaccacc 160 <210> 1174 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1174 accactttca caatctgcta gcaaaggtt 29 <210> 1175 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1175 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120 tttctctcca cag 133 <210> 1176 <211> 341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1176 tgggcaggaa ctgggcactg tgcccagggc atgcactgcc tccacgcagc aaccctcaga 60 gtcctgagct gaaccaagaa ggaggagggg gtcgggcctc cgaggaaggc ctagccgctg 120 ctgctgccag gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt caggccactc 180 tcctgtgcct gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca ggaaagcctc 240 ccccgttgcc cctctggatc cactgcttaa atacggacga ggacagggcc ctgtctcctc 300 agcttcaggc accaccactg acctgggaca gtgaatcgac a 341 <210> 1177 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1177 tctagagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca gtcagtgctt 60 ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gtgactctct taaggtagcc ttgcagaagt 120 tggtcgtgag gcactgggca ggtaagtatc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa 180 tagaaactgg gcttgtcgag acagagaaga ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt 240 cttactgaca tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc actcccagtt caattacagc 300 tcttaaggcc ctgcag 316 <210> 1178 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1178 caaagtccag gcccctctgc tgcagcgccc gcgcgtccag aggccctgcc agacacgcgc 60 gaggttcgag gctgag 76 <210> 1179 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1179 agaatgatga aaaccgaggt tggaaaaggt tgtgaaacct tttaactctc cacagtggag 60 tccattattt cctctggctt cctcaaattc atattcacag ggtcgttggc tgtgggttgc 120 aattacc 127 <210> 1180 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1180 atagcagagc aatcaccacc aagcctggaa taactgcaag ggctctgctg acatcttcct 60 gaggtgccaa ggaaatgagg 80 <210> 1181 <211> 208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1181 gggtcaccac cacctccaca gcacagacag acactcagga gccagccagc caggtaagtt 60 tagtcttttt gtcttttatt tcaggtcccg gatccggtgg tggtgcaaat caaagaactg 120 ctcctcagtg gatgttgcct ttacttctag gcctgtacgg aagtgttact tctgctctaa 180 aagctgcgga attgtacccg cggccgcg 208 <210> 1182 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1182 aagcttctgc cttctccctc ctgtgagttt ggtaagtcac tgactgtcta tgcctgggaa 60 agggtgggca ggagatgggg cagtgcagga aaagtggcac tatgaaccct gcagccctag 120 acaattgtac taaccttctt ctctttcctc tcctgacag 159 <210> 1183 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1183 cgcgcctagc agtgtcccag ccgggttcgt gtcgcc 36 <210> 1184 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1184 acgccgcctg ggtcccagtc cccgtcccat cccccggcgg cctaggcagc gtttccagcc 60 ccgagaactt tgttcttttt gtcccgcccc ctgcgcccaa ccgcctgcgc cgccttccgg 120 cccgagttct ggagactcaa c 141 <210> 1185 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1185 gttggatgaa accttcctcc tactgcacag cccgcccccc tacagccccg 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ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt caggccactc 180 tcctgtgcct gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca ggaaagcctc 240 ccccgttgcc cctctggatt cactgcttaa atacggacga ggacagggcc ctgtctcctc 300 agcttcaggc accaccactg acctgggaca gtgaatcgac a 341 <210> 1189 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1189 tccataaagt aggaaacact acacgattcc ataaagtagg aaacactaca tcactccata 60 aagtaggaaa cactaca 77 <210> 1190 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1190 tgaaagatgg atttccaagg ttaattcatt ggaattgaaa attaacagag atctagagct 60 gaattcctgc agccaggggg atcagcct 88 <210> 1191 <211> 395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1191 taaaatacag catagcaaaa ctttaacctc caaatcaagc ctctacttga atccttttct 60 gagggatgaa taaggcatag gcatcagggg ctgttgccaa tgtgcattag ctgtttgcag 120 cctcaccttc tttcatggag tttaagatat agtgtatttt cccaaggttt gaactagctc 180 ttcatttctt tatgttttaa atgcactgac ctcccacatt ccctttttag taaaatattc 240 agaaataatt taaatacatc attgcaatga aaataaatgt tttttattag gcagaatcca 300 gatgctcaag gcccttcata atatccccca gtttagtagt tggacttagg gaacaaagga 360 acctttaata gaaattggac agcaagaaag cgagc 395 <210> 1192 <211> 800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1192 agtcaatatg ttcaccccaa aaaagctgtt tgttaacttg ccaacctcat tctaaaatgt 60 atatagaagc ccaaaagaca ataacaaaaa tattcttgta gaacaaaatg ggaaagaatg 120 ttccactaaa tatcaagatt tagagcaaag catgagatgt gtggggatag acagtgaggc 180 tgataaaata gagtagagct cagaaacaga cccattgata tatgtaagtg acctatgaaa 240 aaaatatggc attttacaat gggaaaatga tggtcttttt cttttttaga aaaacaggga 300 aatatattta tatgtaaaaa ataaaaggga acccatatgt cataccatac acacaaaaaa 360 attccagtga attataagtc taaatggaga aggcaaaact ttaaatcttt tagaaaataa 420 tatagaagca tgccatcaag acttcagtgt agagaaaaat ttcttatgac tcaaagtcct 480 aaccacaaag aaaagattgt taattagatt gcatgaatat taagacttat ttttaaaatt 540 aaaaaaccat taagaaaagt caggccatag aatgacagaa aatatttgca acaccccagt 600 aaagagaatt gtaatatgca gattataaaa agaagtctta caaatcagta aaaaataaaa 660 ctagacaaaa atttgaacag atgaaagaga aactctaaat aatcattaca catgagaaac 720 tcaatctcag aaatcagaga actatcattg catatacact aaattagaga aatattaaaa 780 ggctaagtaa catctgtggc 800 <210> 1193 <211> 407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1193 aattatctct aaggcatgtg aactggctgt cttggttttc atctgtactt catctgctac 60 ctctgtgacc tgaaacatat ttataattcc attaagctgt gcatatgata gatttatcat 120 atgtattttc cttaaaggat ttttgtaaga actaattgaa ttgatacctg taaagtcttt 180 atcacactac ccaataaata ataaatctct ttgttcagct ctctgtttct ataaatatgt 240 accagtttta ttgtttttag tggtagtgat tttattctct ttctatatat atacacacac 300 atgtgtgcat tcataaatat atacaatttt tatgaataaa aaattattag caatcaatat 360 tgaaaaccac tgatttttgt ttatgtgagc 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<211> 580 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1196 gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60 ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt 120 actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc 180 tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt 240 aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct 300 attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 360 ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac 420 gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480 ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540 ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt 580 <210> 1197 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1197 cctcgccccg gacctgccct cccgccaggt gcacccacct 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1201 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1201 aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtg 49 <210> 1202 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1202 gcggccgcaa taaaagatca gagctctaga gatctgtgtg ttggtttttt gtgt 54 <210> 1203 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1203 ggatccaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgttttc 60 ctgtaacgat cggg 74 <210> 1204 <211> 143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1204 ctcgatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct 60 gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg 120 tgtgggaggt tttttaaact agt 143 <210> 1205 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1205 ctactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccttg ccttccttga 60 ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcacatt 120 gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 180 attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcagtggg ctctatgg 228 <210> 1206 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1206 cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60 aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120 ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggagatgt 180 gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg ta 222 <210> 1207 <211> 226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1207 ccagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa 60 aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat 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gatccagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga 60 aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc 120 tgcaataaac aagtt 135 <210> 1211 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1211 cggcaataaa aagacagaat aaaacgcacg ggtgttgggt cgtttgttc 49 <210> 1212 <211> 226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1212 ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa 60 cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg 120 ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc 180 tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgg 226 <210> 1213 <211> 416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1213 catcacattt aaaagcatct cagcctacca tgagaataag agaaagaaaa tgaagatcaa 60 aagcttattc atctgttttt ctttttcgtt ggtgtaaagc caacaccctg tctaaaaaac 120 ataaatttct ttaatcattt tgcctctttt ctctgtgctt caattaataa aaaatggaaa 180 gaatctaata gagtggtaca gcactgttat ttttcaaaga tgtgttgcta tcctgaaaat 240 tctgtaggtt ctgtggaagt tccagtgttc tctcttattc cacttcggta gaggatttct 300 agtttcttgt gggctaatta aataaatcat taatactctt ctaagttatg gattataaac 360 attcaaaata atattttgac attatgataa ttctgaataa aagaacaaaa accatg 416 <210> 1214 <211> 415 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1214 atcacattta aaagcatctc agcctaccat gagaataaga gaaagaaaat gaagatcaaa 60 agcttattca tctgtttttc tttttcgttg gtgtaaagcc aacaccctgt ctaaaaaaca 120 taaatttctt taatcatttt gcctcttttc tctgtgcttc aattaataaa aaatggaaag 180 aatctaatag agtggtacag cactgttatt tttcaaagat gtgttgctat cctgaaaatt 240 ctgtaggttc tgtggaagtt ccagtgttct ctcttattcc acttcggtag aggatttcta 300 gtttcttgtg ggctaattaa ataaatcatt aatactcttc taagttatgg attataaaca 360 ttcaaaataa tattttgaca ttatgataat tctgaataaa 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1219 Tyr Val His Asp 1 <210> 1220 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1220 Trp Glu His Asp 1

Claims (156)

  1. 전이유전자가 세포에서 발현될 때 면역 반응을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은:
    공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA 벡터)를 포함하는 조성물을 세포에 투여하는 단계로서, 상기 ceDNA 벡터는 2개의 측접하는 역위 말단 반복 서열(ITR)들 사이에 작용 가능하게 위치한 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단계; 및
    상기 세포에 적어도 하나의 면역 반응의 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역 반응은 선천적 면역 반응인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역 반응의 억제제는 선천적 면역 반응의 억제제인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 적어도 하나의 면역 반응의 억제제를 추가로 인코딩하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응의 억제제는 ceDNA 벡터와 별도로 투여되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응의 억제제는 NLRP3 인플라마좀의 억제제, AIM2 인플라마좀의 억제제, 또는 카스파제-1 억제제인, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응의 억제제는 사이클릭 GMP-AMP 합성효소(cGAS)의 억제제인, 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응의 억제제는 toll 유사 수용체(TLR)의 억제제인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 TLR 억제제는 TLR9 억제제인, 방법.
  10. 제1항 내지 제3항, 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응의 억제제는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체인, 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 ceDNA에 의해 인코딩되는 상기 AIM2 인플라마좀의 억제제는 AIM2 인플라마좀 또는 카스파제-1을 억제하는 서열번호: 602의 A151 또는 이의 변형체인, 방법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 ceDNA에 의해 인코딩되는 NLRP3 인플라마좀의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀의 억제제, 또는 카스파제-1 억제제는, NLRP3 인플라마좀, AIM2 인플라마좀 또는 카스파제-1 중 어느 것에 대해 특이적인 miRNA인, 방법.
  13. 제6항에 있어서, 상기 ceDNA에 의해 인코딩되는 NLRP3 인플라마좀의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀의 억제제, 또는 카스파제-1 억제제는 NLRP3 인플라마좀, AIM2 인플라마좀 또는 카스파제-1 중 어느 것에 대해 특이적인 siRNA인, 방법.
  14. 제6항에 있어서, 상기 ceDNA에 의해 인코딩되는 NLRP3 인플라마좀의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀의 억제제, 또는 카스파제-1 억제제는, NLRP3 인플라마좀, AIM2 인플라마좀 또는 카스파제-1 중 어느 것에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편인, 방법.
  15. 제6항에 있어서, 상기 ceDNA에 의해 인코딩되는 NLRP3 인플라마좀의 억제제, 또는 AIM2 인플라마좀의 억제제, 또는 카스파제-1 억제제는, NLRP3 인플라마좀, AIM2 인플라마좀 또는 카스파제-1 중 어느 것에, 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편인, 방법.
  16. 제6항에 있어서, 상기 NLRP3 인플라마좀의 억제제는 MCC950, 16673-34-0, Bay11-7082, 글리벤클라미드 또는 이소리퀴리티게닌 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제6항에 있어서, 상기 AIM2 인플라마좀의 억제제는 A151(서열번호: 602), miR-223 또는 항-인간 ASC 단일 클론 항체 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제6항에 있어서, 상기 카스파제-1의 억제제는 벨나카산, 시코닌, 아세틸시코닌, 프랄나카산, Z-VAD-FMK, Z-WEHD-FMK; Ac-YVAD-cmk, Ac-YVAD-CHO 또는 파르테놀리드 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  19. 제7항에 있어서, 상기 cGAS의 억제제는 서열번호: 882의 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스 단백질 ORF52, 또는 cGAS를 억제하는 이의 변형체, 또는 ORF52의 감마헤르페스바이러스 동원체인, 방법.
  20. 제7항에 있어서, 상기 cGAS의 억제제는 서열번호: 883의 카포시 육종 헤르페스바이러스 LANA(잠복성-관련 핵 항원)의 세포질 동형체인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 카포시 육종 헤르페스바이러스 LANA의 세포질 동형체는 LANAΔ161(서열번호: 884)인, 방법.
  22. 제7항에 있어서, 상기 cGAS의 억제제는 cGAS에 특이적인 miRNA인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 cGAS에 특이적인 miRNA는, miR-25(서열번호: 885) 및 miR-93(서열번호: 886)으로부터 선택되는, 방법.
  24. 제7항에 있어서, 상기 cGAS의 억제제는 cGAS에 특이적인 siRNA인, 방법.
  25. 제7항에 있어서, 상기 cGAS의 억제제는 cGAS에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편인, 방법.
  26. 제7항에 있어서, 상기 cGAS의 억제제는 항말라리아 약인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 항말라리아 약은 아미노퀴놀린-계 또는 아미노아크리딘-계 항말라리아 약인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항말라리아 약은 퀴나크린(QC), 9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘(AMCA), 히드록시클로로퀸(HCQ), 및 클로로퀸(CQ)으로부터 선택되는, 방법.
  29. 제7항에 있어서, 상기 cGAS의 억제제는 cGAS의 촉매성 포켓에 결합하는 소분자 화합물인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기cGAS의 촉매성 포켓에 결합하는 소분자 화합물은 RU166365, RU281332, RU320521, RU320519, RU320461, RU320462, RU320520, RU320467, 및 RU320582로부터 선택되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기cGAS의 촉매성 포켓에 결합하는 소분자 화합물은 RU320521인, 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 cGAS의 촉매성 포켓에 결합하는 소분자 화합물은 화합물 15, 화합물 16, 화합물 17, 화합물 18, 화합물 19 및 PF-06928215로부터 선택되는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 cGAS의 촉매성 포켓에 결합하는 소분자 화합물은PF-06928215인, 방법.
  34. 제9항에 있어서, 상기 TLR9 억제제는 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드 서열은 이하의 특징들 중 하나 이상을 갖는, 방법: (i) 3’ 말단의 3개의 연속적인 G 뉴클레오티드; (ii) 5’ 말단의 CC(T) 삼중체; 및 (iii) 5’ CC(T)와 다운스트림 GGG 삼중체 사이의 거리가 최적으로 3 내지 5개 뉴클레오티드 길이이어야 함.
  36. 제34항에 있어서, 상기 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드 서열은 TTAGGGn(서열번호: 888)의 서열을 포함하는, 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 TLR9 억제성 올리고뉴클레오티드 서열은 ODN-2088(TCCTGGCGGGGAAGT, 서열번호: 889), ODN-2114(TCCTGGAGGGGAAGT, 서열번호: 890), 폴리-G(GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, 서열번호: 891), ODN-A151(TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG, 서열번호: 892), G-ODN(CTCC-TATTGGGGGTTTCCTAT, 서열번호: 893), IRS-869(TCCTGGAGGGGTTGT, 서열번호: 894), INH-1(CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG, 서열번호: 895), INH-4(TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA, 서열번호: 896), IRS-661(TGCTTGCAAGCTT-GCAAGCA, 서열번호: 897), 4024(TCCTGGATGGGAAGT, 서열번호: 898), 4084F(CCTGGATGGGAA, 서열번호: 899), INH-13(CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA, 서열번호: 900), INH-18(CCTGGATGGGAACTTACCGCTGCA, 서열번호: 901), 및 IRS-954 TGCTCCTGGAGGGGTTGT, 서열번호: 902) 및 AS1411(GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG, 서열번호: 903)로부터 선택되는, 방법.
  38. 제9항에 있어서, 상기 TLR9 억제제는 TLR9에 특이적인 miRNA인, 방법.
  39. 제9항에 있어서, 상기 TLR9 억제제는 TLR9에 특이적인 siRNA인, 방법.
  40. 제9항에 있어서, 상기 TLR9 억제제는 TLR9에 결합하는 항체 또는 항원-결합 절편인, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 2개의 측접하는 야생형 역위 말단 반복 서열(WT-ITR)들 사이에 작용 가능하게 위치하는, 방법.
  42. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 2개의 측접하는 돌연변이 역위 말단 반복 서열(돌연변이 ITR)들 사이에 작용 가능하게 위치하는, 방법.
  43. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 2개의 측접하는 역위 말단 반복 서열들 사이에 작용 가능하게 위치하며, 여기에서 하나의 ITR은 WT-ITR이고, 하나의 ITR은 돌연변이 ITR인, 방법.
  44. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR은 대칭적인 ITR인, 방법.
  45. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR은 비대칭적인 ITR인, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 파보바이러스, 데펜도바이러스, 및 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래되는, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측접하는 ITR은 대칭적이거나, 비대칭적인, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 측접하는 ITR은 대칭성 또는 실질적으로 대칭성인, 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 측접하는 ITR은 비대칭적인, 방법.
  50. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다가 야생형이거나, 또는 상기 ITR이 둘 다 야생형인, 방법.
  51. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측접하는 ITR은 상이한 바이러스 혈청형으로부터 유래된, 방법.
  52. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 적어도 하나는 결실, 첨가 또는 치환에 의해 야생형 AAV ITR 서열로부터 변화되어, ITR의 전체 3-차원 배치에 영향을 미치는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 다는 합성되는, 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다가 야생형 ITR이 아니거나, 또는 상기 ITR이 둘 다 야생형이 아닌, 방법.
  56. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 A, A’, B, B’, C, C’, D, 및 D’로부터 선택된 적어도 하나의 ITR 영역이 결실, 삽입, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 결실, 삽입 및/또는 치환으로 A, A’, B, B’, C 또는 C’ 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부가 결실되는, 방법.
  58. 제56항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되어, B 및 B’ 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부가 결실되는, 방법.
  59. 제56항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되어, C 및 C’ 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부가 결실되는, 방법.
  60. 제56항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되어, B 및 B’ 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 일부, 및/또는 C 및 C’ 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 일부가 결실되는, 방법.
  61. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 B 및 B’ 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조와, C 및 C’ 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 정상적으로 포함하는 영역에, 단일 스템-루프 구조를 포함하는, 방법.
  62. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 정상적으로 B 및 B’ 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조와, C 및 C’ 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에, 단일 스템 및 2개의 루프를 포함하는, 방법.
  63. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 B 및 B’ 구역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조와, C 및 C’ 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 정상적으로 포함하는 영역에 단일 스템 및 단일 루프를 포함하는, 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 양쪽 ITR은 ITR들이 서로에 대해 반전될 때, 전체 3-차원 대칭을 생성하는 방식으로 변화되는, 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 조절 스위치의 조절 하에 있는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조절 스위치는 바이너리 조절 스위치, 소분자 조절 스위치, 패스코드 조절 스위치, 핵산-계 조절 스위치, 전사-후 조절 스위치, 방사선-조절된 또는 초음파 조절된 조절 스위치, 저산소증-매개 조절 스위치, 염증 반응 조절 스위치, 전단-활성화 조절 스위치, 및 사멸 스위치로부터 선택되는, 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터 및/또는 면역 반응의 억제제는 캡슐화되는, 방법.
  68. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터 및/또는 면역 반응의 억제제는 나노담체 내에 있는, 방법.
  69. 제67항에 있어서, 상기 나노담체는 지질 나노 입자(LNP)를 포함하는, 방법.
  70. 제1항에 있어서, 상기 ceDNA는, ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소에 의해 절단될 때, 비-변성 겔에서 분석될 때의 선형의 불-연속 DNA 대조군에 비해, 선형의 연속 DNA의 특징적인 밴드가 존재하는, 방법.
  71. 제1항 내지 제4항 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 적어도 하나의 면역 반응의 억제제에 작용 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 프로모터는 표 1의 것들 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 표 2의 것들 중 어느 것으로부터 선택된 인핸서를 추가로 포함하는, 방법.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 표 2A의 것들 중 어느 것으로부터 선택된 5’ UTR 및/또는 인트론 서열을 포함하는, 방법.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 표 2B의 것들 중 어느 것으로부터 선택된 3’ UTR을 포함하는, 방법.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기ceDNA 벡터는 표 3의 것들 중 어느 것으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리 A 서열을 포함하는, 방법.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열에 작용 가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터를 포함하는, 방법.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 방법.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 투여되는 상기 ceDNA 벡터의 양을 증가시키면, 세포 내의 전이유전자의 발현이 증가하는, 방법.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 핵산 서열은 치료 전이유전자를 인코딩하고, 여기에서 전이유전자 발현의 원하는 수준은 치료 유효량인, 방법.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은, 전사되거나 번역될 때, 대상체에서 비정상적인 양의 내인성 단백질을 교정하는, 방법.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은, 전사되거나 번역될 때, 대상체에서 내인성 단백질의 비정상적인 기능 또는 활성 또는 경로를 교정하는, 방법.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 상기 대상체는 치료가 필요한 인간 환자인, 방법.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 RNAi, siRNA, miRNA, lncRNA, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 분자를 인코딩하거나, 이를 포함하는, 방법.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 단백질을 인코딩하는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 단백질은 마커 단백질(예를 들어, 리포터 단백질)인, 방법.
  87. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 상기 질환 또는 장애와 관련된 내인성 단백질 또는 경로의 작용제 또는 길항제를 인코딩하는, 방법.
  88. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 항체를 인코딩하는, 방법.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적인 면역 반응의 억제제의 공동-투여를 추가로 포함하는, 방법.
  90. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는: (a) 적어도 하나의 Rep 단백질의 존재 하에 ceDNA 발현 제작물을 보유하는 곤충 세포의 집단을 배양하는 단계로서, 상기 ceDNA 발현 제작물은 곤충 세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 ceDNA 벡터를 인코딩하는 단계; 및 (b) 상기 ceDNA 벡터를 곤충 세포로부터 단리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 수득되는, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 ceDNA 발현 제작물은 ceDNA 플라스미드, ceDNA 박미드, 및 ceDNA 바큘로바이러스로부터 선택되는, 방법.
  92. 제90항에 있어서, 상기 곤충 세포는 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현하는, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 적어도 하나의 Rep 단백질은 파보바이러스, 데펜도바이러스, 및 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래되는, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 적어도 하나의 Rep 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 방법.
  95. 제90항의 방법에 의해 생성된 ceDNA 벡터를 인코딩하는, ceDNA 발현 제작물.
  96. 제95항에 있어서, ceDNA 플라스미드, ceDNA 박미드 또는 ceDNA 바큘로바이러스인, ceDNA 발현 제작물.
  97. 제95항 또는 제96항의 ceDNA 발현 제작물을 포함하는 숙주 세포.
  98. 제97항에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현하는, 숙주 세포.
  99. 제98항에 있어서, 상기 적어도 하나의 Rep 단백질은 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노관련바이러스(AAV)에서 선택되는 바이러스에서 유래되는, 숙주 세포.
  100. 제99항에 있어서, 상기 적어도 하나의 Rep 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12에서 선택되는 AAV 혈청형에서 유래되는, 숙주 세포.
  101. 제97항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포인, 숙주 세포.
  102. 제101항에 있어서, 상기 곤충 세포는 Sf9 세포인, 숙주 세포.
  103. ceDNA 벡터를 생산하는 방법으로서, (a) 제97항 내지 제102항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 배양하는 단계; 및 (b) 숙주 세포에서 ceDNA를 단리하는 단계를 포함하는, ceDNA 벡터를 생산하는 방법.
  104. 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-불포함 DNA 벡터(ceDNA 벡터)를 포함하는 조성물로서, 상기 ceDNA 벡터는 2개의 측접하는 역위 말단 반복 서열(ITR)들 사이에 작용 가능하게 위치한 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
  105. 제104항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 적어도 하나의 면역 반응의 억제제를 추가로 인코딩하는, 조성물.
  106. 제104항 또는 제105항에 있어서, 상기 면역 반응은 선천적 면역 반응인, 조성물.
  107. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 2개의 측접하는 야생형 역위 말단 반복 서열(WT-ITR)들 사이에 작용 가능하게 위치하는, 조성물.
  108. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 2개의 측접하는 돌연변이 역위 말단 반복 서열(돌연변이 ITR)들 사이에 작용 가능하게 위치하는, 조성물.
  109. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 2개의 측접하는 역위 말단 반복 서열들 사이에 작용 가능하게 위치하고, 여기에서 하나의 ITR은 WT-ITR이고, 하나의 ITR은 돌연변이 ITR인, 조성물.
  110. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR은 대칭적인 ITR인, 조성물.
  111. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR은 비대칭적인 ITR인, 조성물.
  112. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래하는, 조성물.
  113. 제112항에 있어서, 상기 측접하는 ITR은 대칭적 또는 비대칭적인, 조성물.
  114. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 둘 다는 야생형인, 조성물.
  115. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측접하는 ITR은 상이한 바이러스 혈청형으로부터 유래되는, 조성물.
  116. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 적어도 하나는 결실, 첨가, 또는 치환에 의해 야생형 AAV ITR 서열로부터 변화되어, ITR의 전체 3-차원 배치에 영향을 미치는, 조성물.
  117. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래된, 조성물.
  118. 제104항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 다는 합성되는, 조성물.
  119. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 둘 다는 야생형이 아닌, 조성물.
  120. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 A, A’, B, B’, C, C’, D, 및 D’로부터 선택된 적어도 하나의 ITR 영역이 결실, 삽입, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 조성물.
  121. 제120항에 있어서, 상기 결실, 삽입, 및/또는 치환은 A, A’, B, B’, C 또는 C’ 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는, 조성물.
  122. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 결실, 삽입, 및/또는 치환에 의해 변형되어, B 및 B’ 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는, 조성물.
  123. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 결실, 삽입, 및/또는 치환에 의해 변형되어, C 및 C’ 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는, 조성물.
  124. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 결실, 삽입, 및/또는 치환에 의해 변형되어, B 및 B’ 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 일부 및/또는 C 및 C’ 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 일부를 결실시키는, 조성물.
  125. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 B 및 B’ 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조와, C 및 C’ 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 정상적으로 포함하는 영역에 단일 스템-루프 구조를 포함하는, 조성물.
  126. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 B 및 B’ 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조와, C 및 C’ 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 정상적으로 포함하는 영역에 단일 스템 및 2개의 루프를 포함하는, 조성물.
  127. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 다는 B 및 B’ 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조와, C 및 C’ 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 정상적으로 포함하는 영역에, 단일 스템과 단일 루프를 포함하는, 조성물.
  128. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 둘 다는, ITR들이 서로에 대해 반전될 때 전체적인 3-차원 대칭을 생성하는 방식으로 변화되는, 조성물.
  129. 제104항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR은 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스 유래의 서열에 기초하는, 조성물.
  130. 제104항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 조절 스위치의 조절 하에 있는, 조성물.
  131. 제130항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조절 스위치는 바이너리 조절 스위치, 소분자 조절 스위치, 패스코드 조절 스위치, 핵산-계 조절 스위치, 전사-후 조절 스위치, 방사선-조절된 또는 초음파 조절된 조절 스위치, 저산소증-매개 조절 스위치, 면역 반응 조절 스위치, 전단-활성화 조절 스위치, 및 사멸 스위치로부터 선택되는, 조성물.
  132. 제104항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 캡슐화되는, 조성물.
  133. 제104항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 나노담체 내에 있는, 조성물.
  134. 제133항에 있어서, 상기 나노담체는 지질 나노 입자(LNP)를 포함하는, 조성물.
  135. 제104항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA는, ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 절단될 때, 비-변성 겔에서 분석될 때의 선형 불연속 DNA 대조군에 비해, 선형 연속 DNA의 특징적인 밴드가 존재하는, 조성물.
  136. 제104항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 적어도 하나의 면역 반응의 억제제에 작용 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 조성물.
  137. 제104항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 표 2의 것들 중 어느 것으로부터 선택된 인핸서를 포함하는, 조성물.
  138. 제104항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 표 2A의 것들 중 어느 것으로부터 선택된 5’ UTR 및/또는 인트론 서열을 포함하는, 조성물.
  139. 제104항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 표 2B의 것들 중 어느 것으로부터 선택된 3’ UTR를 포함하는, 조성물.
  140. 제104항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 표 3의 것들 중 어느 것으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리 A 서열을 포함하는, 조성물.
  141. 제104항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열에 작용 가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터를 포함하는, 조성물.
  142. 제104항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 ITR은 기능성 말단 분해 부위와 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 하나의 ITR에 비해 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는, 조성물.
  143. 제104항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 진핵 세포에서 발현되기 위해 코돈 최적화되는, 조성물.
  144. 제104항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  145. 제104항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응의 억제제는 NLRP3 인플라마좀의 억제제, AIM2 인플라마좀의 억제제, 또는 카스파제-1 억제제인, 조성물.
  146. 제104항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응의 억제제는 사이클릭 GMP-AMP 합성효소(cGAS)의 억제제인, 조성물.
  147. 제104항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응의 억제제는 toll 유사 수용체(TLR)의 억제제인, 조성물.
  148. 제147항에 있어서, 상기 TLR 억제제는 TLR9 억제제인, 조성물.
  149. 제104항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응의 억제제는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체인, 조성물.
  150. 세포에서 면역 반응의 억제제를 발현시키는 방법으로서, 상기 방법은 세포를 제104항 내지 제149항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  151. 제150항에 있어서, 상기 세포는 시험관 내 또는 생체 내에 있는, 방법.
  152. 제104항 내지 제149항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 약학적 조성물.
  153. 제152항에 있어서, 선천적 면역 반응의 억제제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  154. 제153항에 있어서, 상기 선천적 면역 반응의 억제제는 ceDNA 벡터와는 별도로 제제화되는, 약학적 조성물.
  155. 제104항 내지 제149항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 세포.
  156. 제104항 내지 제149항 중 어느 한 항의 조성물, 제152항 내지 제154항 중 어느 한 항의 약학적 조성물, 또는 제155항의 세포를 포함하는, 키트.
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