JP2022518504A - 閉端dna(cedna)ならびに遺伝子療法または核酸療法に関連する免疫応答を低減させる方法における使用 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、細胞への所望の導入遺伝子の投与が、ceDNAベクターの反復投与と導入遺伝子の送達によって達成される場合、免疫応答の阻害剤、特に自然免疫応答の阻害剤を使用して免疫応答を最小限にすることに関する方法および構築物が提供される。本発明の実施形態は、標的の細胞、組織、器官または生物への外因性DNA配列の送達、ならびにそれらに対する免疫応答(例えば、自然免疫応答)を阻害するための修飾および方法を含む、遺伝子療法の分野に関する。
Description
関連出願
本出願は、2019年1月24日出願の米国仮出願第62/796,417号、2019年2月1日出願の米国仮出願第62/800,303号、2019年1月24日出願の米国仮出願第62/796,450号、2019年2月1日出願の米国仮出願第62/800,285号、2019年3月6日出願の米国仮出願第62/814,414号、2019年3月6日出願の米国仮出願第62/814,424号、および2019年6月5日出願の米国仮出願第62/857,542号に対して優先権を主張するものであり、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2019年1月24日出願の米国仮出願第62/796,417号、2019年2月1日出願の米国仮出願第62/800,303号、2019年1月24日出願の米国仮出願第62/796,450号、2019年2月1日出願の米国仮出願第62/800,285号、2019年3月6日出願の米国仮出願第62/814,414号、2019年3月6日出願の米国仮出願第62/814,424号、および2019年6月5日出願の米国仮出願第62/857,542号に対して優先権を主張するものであり、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。2020年1月24日に作成された前述のASCIIコピーは、131698-03320-Sequence_Listing-FINAL.txtという名称であり、サイズは117,124バイトである。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。2020年1月24日に作成された前述のASCIIコピーは、131698-03320-Sequence_Listing-FINAL.txtという名称であり、サイズは117,124バイトである。
本発明の実施形態は、標的の細胞、組織、器官または生物への外因性DNA配列の送達、ならびにそれらに対する免疫応答(例えば、自然免疫応答)を阻害するための修飾および方法を含む、遺伝子療法の分野に関する。
遺伝子療法は、遺伝子発現プロファイルにおける異常によって引き起こされる遺伝子変異または後天性疾患のいずれかに罹患している患者の臨床転帰を改善することを目的とする。遺伝子療法は、欠陥遺伝子、または障害、疾患、悪性腫瘍等をもたらし得る異常な調節もしくは発現、例えば過小発現もしくは過剰発現に起因する医学的状態の治療または予防を含む。例えば、欠陥遺伝子によって引き起こされる疾患または障害は、修復遺伝物質を患者に送達することによって治療、予防、もしくは改善され得るか、または患者の体内で遺伝物質の治療的発現をもたらす、例えば患者への修復遺伝物質を用いて欠陥遺伝子を改変もしくはサイレンシングすることによって治療、予防、もしくは改善され得る。
遺伝子療法の基礎は、転写カセットに活性遺伝子産物(導入遺伝子と称される場合がある)を供給することであり、例えば、正の機能獲得効果、負の機能喪失効果、または別の結果をもたらし得る。そのような結果は、活性化抗体もしくは融合タンパク質または阻害性(中和)抗体もしくは融合タンパク質の発現に起因し得る。遺伝子療法を使用して、他の要因によって引き起こされる疾患または悪性腫瘍を治療することもできる。ヒト単一遺伝障害は、標的細胞への正常遺伝子の送達および発現によって治療され得る。患者の標的細胞中の修復遺伝子の送達および発現は、操作されたウイルスおよびウイルス遺伝子送達ベクターの使用を含む、多くの方法を介して実行され得る。使用可能な多くのウイルス由来ベクター(例えば、組み換えレトロウイルス、組み換えレンチウイルス、組み換えアデノウイルス等)の中で、組み換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)は、遺伝子療法において多用途ベクターとして人気を集めている。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、パルボウイルス科に属し、より具体的にはディペンドパルボウイルス属を構成する。AAV由来のベクター(すなわち、組み換えAAV(rAVV)またはAAVベクター)は、(i)それらが筋細胞およびニューロンを含む多種多様な非分裂および分裂細胞型に感染する(形質導入する)ことができるため、(ii)それらがウイルス構造遺伝子を欠いていることによって、ウイルス感染に対する宿主細胞反応、例えばインターフェロン媒介性反応を減少させるため、(iii)野生型ウイルスが、ヒトにおいて非病理的であるとみなされるため、(iv)宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる野生型AAVと対照的に、複製欠損AAVベクターは、rep遺伝子を欠き、一般にエピソームとして持続し、したがって挿入変異または遺伝毒性の危険性を制限するため、ならびに(v)他のベクター系と比較して、AAVベクターは、一般に比較的不良な免疫原であるとみなされるため、著しい免疫応答を誘起せず(iiを参照)、したがって治療導入遺伝子のベクターDNAおよび潜在的に長期発現の持続を得るため、遺伝物質を送達するために魅力的である。
しかしながら、AAV粒子を遺伝子送達ベクターとして使用することには、いくつかの重大な欠陥が存在する。rAAVに関連する1つの重大な欠点は、約4.5kbの異種DNAの制限されたウイルスパッケージング能力であり(Dong et al.,1996、Athanasopoulos et al.,2004、Lai et al.,2010)、結果として、AAVベクターの使用は、150,000Da未満のタンパク質コーディング能力に制限されている。第2の欠点は、集団における野生型AAV感染の流行の結果として、rAAV遺伝子療法の候補を、患者からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングする必要があることである。第3の欠点は、初回治療から排除されなかった患者への再投与を予防するカプシド免疫原性に関する。患者における免疫系は、「ブースター」ショットとして有効に作用するベクターに反応して、将来の治療を妨げる高力価抗AAV抗体を生成する免疫系を刺激し得る。いくつかの最近の報告は、高用量状況における免疫原性との関係を示している。一本鎖AAV DNAが異種遺伝子発現前に二本鎖DNAに変換されなければならないことを考えると、別の顕著な欠点は、AAV媒介性遺伝子発現の始まりが比較的遅いことである。
追加として、カプシドを有する従来のAAVビリオンは、AAVゲノム、rep遺伝子、およびcap遺伝子を含有する1つ以上のプラスミドを導入することによって産生される(Grimm et al.,1998)。しかしながら、そのようなカプシド化AAVウイルスベクターは、ある特定の細胞および組織型を非効率的に形質導入し、カプシドはまた、免疫応答を誘導することもわかった。したがって、遺伝子療法のためのアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの使用は、(患者免疫応答に起因する)患者への単回投与、最小ウイルスパッケージング能力(約4.5kb)に起因するAAVベクター中の送達に好適な導入遺伝子遺伝物質の制限された範囲、および遅いAAV媒介性遺伝子発現に起因して制限される。
さらに、哺乳動物の免疫系は、侵入する病原体および異常な細胞の活動およびプロセスを検出し排除するための多くの機構を含み、これらは、ウイルスベクターまたは核酸を対象に投与すると誘発され得る。例えば、パターン認識受容体(PRR)は、外来核酸、例えば、ウイルスDNAおよびウイルスRNAなどの保存された病原体関連分子を検出するためのセンサーとして機能し、自然免疫応答を誘起するように進化した分子のクラスである。トール様受容体(TLR)は、エンドソームの状況で核酸を検出するPRR群であり、TLR9(dsDNA、優先的には非メチル化CpG反復を検出する)、TLR3(dsRNAを検出する)、およびTLR7(ssRNAを検出する)が含まれる。PRRの第2のシステムは、感染細胞内の外来核酸、特に二本鎖RNAを検出するためにサイトゾルに位置している。1「RIG-I様受容体」またはRLRと呼ばれるこれらのPRRには、RIG-IおよびMDA5が含まれる。これらのPRRは、5’トリホスフェートおよびジホスフェート、RNA複製中間体、および/または転写産物などのRNAの構造特徴を検出し、I型インターフェロン応答の活性化を開始するヘリカーゼである。1、2PRRの第3のクラスは、細胞質DNAによって誘起され、主な細胞内DNAセンサーは、cGAS(環状GMP-AMPシンターゼ)であり、これはDNAに結合し、インターフェロン遺伝子のER結合刺激因子(STING)を活性化し、I型インターフェロン応答の活性化、場合によっては、黒色腫で欠損(AIM2)、IFN-γ誘導性タンパク質16(IFI16)、インターフェロン誘導性タンパク質X(IFIX)、LRRFIP1、DHX9、DHX36、DDX41、Ku70、DNA-PKcs、MRN複合体(MRE11、Rad50およびNbs1を含む)2、7およびRNAポリメラーゼIII10を含む他の提唱された細胞質DNAセンサー1、4、5の活性化をもたらす。AIM2、IFI16、およびIFIXはピリンドメインおよびHIN200ドメインタンパク質(PYHIN)タンパク質である。2、6さらに、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)に由来する一本鎖DNA(ssDNA)のステムループ構造のように、短い塩基対のDNA区間に隣接する不対のDNAヌクレオチドが、配列依存的な様式でI型インターフェロン誘導DNAセンサーcGASを活性化したことが示された8、9。短い(12~20bp)dsDNA(Y型DNA)に隣接する不対グアノシンを含むDNA構造は、非常に刺激性であり、cGASの酵素活性を特異的に増強した8、9。
最近では、NOD様受容体(NLR)を含む他の細胞内微生物センサーが同定されている。一部のNLRは、非微生物の危険シグナルも感知し、インフラマソームと呼ばれる大きな細胞質タンパク質複合体を形成し、インフラマソームは、自然免疫および炎症の中心的な調節因子である(Martinon et al.,Annu.Rev.Immunol.2009 27:229-65)。
インフラマソームは、NLRまたはAIM2ファミリー受容体およびプロカスパーゼ-1で構成されている。カスパーゼ動員ドメイン(ASC)を含むアポトーシス関連斑点様タンパク質はアダプタータンパク質であり、NLRファミリーのメンバーをプロカスパーゼ1に結び付ける。NLRファミリーのメンバーは、インフラマソーム複合体をASCと組み立て、次に、カスパーゼ1が動員され、活性化される。NLRファミリータンパク質のいくつかのメンバーは、NLRファミリーピリンドメイン含有3(NLRP3、クリオピリンまたはNALP3としても知られる)、NLRファミリーCARDドメイン含有4(NLRC4、IPAFとしても知られる)およびNLRP1など、異なるインフラマソームの形成に関与している。様々な刺激によって異なるインフラマソームが活性化される。例えば、NLRP1はBacillus anthracisによって産生される致死毒素によって活性化される一方、NLRC4はSalmonella、Legionella、およびPseudomonas菌種に感染した細胞では細胞質フラジェリンに応答する。NLRP3インフラマソームは、尿酸結晶、シリカ、アミロイド線維、およびATPなどの微生物産物および内因性シグナルを含む多種多様な刺激によって活性化される。
NOD様受容体(NLR)センサー成分(すなわち、クリオピリン(NLRP3またはNALP3))は、組織損傷またはストレス(例えば、細胞外ATP、尿酸結晶、β-アミロイド、細胞片)中に放出される損傷関連分子パターン分子(DAMP)および病原体関連分子パターン(PAMP)などの危険シグナルを認識する。インフラマソームは、これらの病原体感染または「危険」シグナルに応答して組み立てられ、クリオピリンのピリンドメインおよびアダプター成分ASCの相互作用を必要とし、(プロカスパーゼ-1から)カスパーゼ-1の動員および活性化、続いて、インターロイキン-1β(IL-1β)、IL-18、およびIL-33を含むいくつかの炎症誘発性サイトカインの成熟および放出につながる)。
NLRに加えて、AIM2ファミリーメンバーはインフラマソームを活性化し得る。AIM2は、ピリンドメインおよびDNA結合HINドメインの存在を特徴とし、細胞質DNAを検出することによってカスパーゼ-1を活性化する(Fernandes-Alnemri T,et al.2009.Nature 458:509-513).インフラマソームの組み立てには、第2のシグナルがインフラマソーム複合体形成を開始する前に、インフラマソーム受容体および基質プロIL-1βの発現を上方調節するために必要なTLRを介した先行のプライミングシグナルが必要である。(Bauernfeind FG,et al.2009.J.Immunol.183:787-791)。
概念的には明解だが、ヒト疾患を治療するための遺伝子療法に核酸分子を使用する見通しは依然として不確かである。この不確実性の主な原因は、核酸治療薬に対する宿主の自然免疫応答に関する明らかな有害事象であり、したがって、これらの材料が免疫応答の状況で目的とする標的の発現を調節する方法である。臨床応用に採用され得る核酸分子の作製、機能、挙動および最適化を取り巻く技術の現況は、特に次の点に焦点を当てている。(1)翻訳および遺伝子発現を直接調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび二本鎖RNA、(2)長期的なエピジェネティック修飾をもたらす転写型遺伝子サイレンシングRNA、(3)遺伝子スプライシングパターンと相互作用して改変するアンチセンスオリゴヌクレオチド、(4)天然のAAVまたはレンチウイルスゲノムの生理学的機能を模倣する合成ベクターまたはウイルスベクターの作製、ならびに(5)治療用オリゴヌクレオチドのインビボ送達。しかしながら、最近の臨床成果から明らかなように核酸治療薬の開発が進歩しているにもかかわらず、遺伝子療法の分野は、治療用核酸自体によって誘起されるレシピエントの望ましくない有害事象によって依然厳しく制限されている。
したがって、多種多様な疾患を治療するために、細胞、組織または対象における治療用タンパク質の発現を可能にするベクターまたは核酸を対象に投与する際に免疫応答を阻害(例えば、低減、改善、軽減、予防)する新しい技術の分野が必要である。
したがって、多種多様な疾患を治療するために、細胞、組織または対象における治療用タンパク質の発現を可能にするベクターまたは核酸を対象に投与する際に免疫応答を阻害(例えば、低減、改善、軽減、予防)する新しい技術の分野が必要である。
Martinon et al.,Annu.Rev.Immunol.2009 27:229-65
Fernandes-Alnemri T,et al.2009.Nature 458:509-513
Bauernfeind FG,et al.2009.J.Immunol.183:787-791
本開示は、遺伝障害に罹患し、遺伝子療法または核酸療法(「核酸治療薬」または「治療用核酸」(TNA))を受ける対象において免疫応答を阻害(すなわち、低減または抑制)するための方法および医薬組成物を提供する。本明細書で提供されるのは、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)および免疫応答(例えば、自然免疫応答)を阻害するための阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物および製剤は、ラパマイシンおよびそのラパマイシン類似体、TLRアンタゴニスト(例えば、TLR9アンタゴニスト)、cGASアンタゴニストおよびインフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)などの1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を含み得る。
いくつかの態様によれば、本開示は、共有結合性閉端を有するカプシド不含(例えば、非ウイルス性)DNAベクター(本明細書では「閉端DNAベクター」または「ceDNAベクター」と呼ばれる)から自然免疫応答の阻害剤を発現させるため、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)を使用して、免疫応答(例えば、自然免疫応答)を阻害(すなわち、低減または抑制)するための組成物および方法を提供し、ceDNAベクターは、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の核酸配列またはそのコドン最適化版を含む。
いくつかの態様によれば、本開示は、共有結合性閉端を有するカプシド不含(例えば、非ウイルス性)DNAベクター(本明細書では「閉端DNAベクター」または「ceDNAベクター」と呼ばれる)からラパマイシンおよびそのラパマイシン類似体を発現させるため、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)を使用して、免疫応答(例えば、自然免疫応答)を阻害(すなわち、低減または抑制)するための組成物および方法を提供し、ceDNAベクターは、ラパマイシンおよびそのラパマイシン類似体の核酸配列またはそのコドン最適化版を含む。したがって、これらのceDNAベクターを使用して、免疫系(例えば、自然免疫系)を阻害するために、ラパマイシンおよびそのラパマイシン類似体を産生することができる。
いくつかの態様によれば、本開示は、共有結合性閉端を有するカプシド不含(例えば、非ウイルス性)DNAベクター(本明細書では「閉端DNAベクター」または「ceDNAベクター」と呼ばれる)からTLRアンタゴニストを発現させるため、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)を使用して、免疫応答(例えば、自然免疫応答)を阻害(すなわち、低減または抑制)するための組成物および方法を提供し、ceDNAベクターは、TLRアンタゴニストの核酸配列またはそのコドン最適化版を含む。したがって、これらのceDNAベクターを使用して、免疫系(例えば、自然免疫系)を阻害するために、TLRアンタゴニストを産生することができる。
いくつかの態様によれば、本開示は、共有結合性閉端を有するカプシド不含(例えば、非ウイルス性)DNAベクター(本明細書では「閉端DNAベクター」または「ceDNAベクター」と呼ばれる)からcGASアンタゴニストを発現させるため、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)を使用して、免疫応答(例えば、自然免疫応答)を阻害(すなわち、低減または抑制)するための組成物および方法を提供し、ceDNAベクターは、cGASアンタゴニストの核酸配列またはそのコドン最適化版を含む。したがって、これらのceDNAベクターを使用して、免疫系(例えば、自然免疫系)を阻害するために、cGASアンタゴニストを産生することができる。
いくつかの態様によれば、本開示は、共有結合性閉端を有するカプシド不含(例えば、非ウイルス性)DNAベクター(本明細書では「閉端DNAベクター」または「ceDNAベクター」と呼ばれる)からNLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、AIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせを発現させるために、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)を使用して、免疫応答(例えば、自然免疫応答)を阻害(すなわち、低減または抑制)するための組成物および方法を提供し、ceDNAベクターは、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせの核酸配列またはそのコドン最適化版を含む。したがって、免疫系(例えば、自然免疫系)を阻害するために、これらのceDNAベクターを使用して、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせを産生し得る。
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物および製剤は、本明細書に記載されるように、様々な種類の治療用核酸(TNA)および担体(例えば、脂質ナノ粒子)と併用して、1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を含み得る。いくつかの実施形態によれば、組成物は賦形剤または担体をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、脂質ナノ粒子(LNP)を含む。一実施形態では、LNPはカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態によれば、LNPはポリエチレングリクロール(PEG)を含む。いくつかの実施形態によれば、LNPはコレステロールを含む。
本明細書に記載の方法は、一般に、導入遺伝子(例えば、治療用核酸(TNA))の投与に伴う免疫応答を予防、低減、弱毒化、またはさらに排除する1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤(例えば、ラパマイシンおよびその類似体、TLRアンタゴニスト、cGASアンタゴニスト)の使用を含む。上記を投与することを含む方法は、本明細書に記載されている。
一実施形態では、治療用核酸はRNA分子またはその誘導体である。一実施形態では、RNA分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンスRNAである。一実施形態では、RNAはRNA干渉(RNAi)である。
一実施形態では、治療用核酸はmRNA分子である。
一実施形態では、治療用核酸は、DNA分子またはその誘導体である。
一実施形態では、治療用核酸はDNAアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、DNAアンチセンスオリゴヌクレオチドはモルホリノ系核酸である。一実施形態では、モルホリノ系核酸は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PMO)である。
一実施形態では、治療用核酸は、閉端DNA(ceDNA)である。一実施形態では、ceDNAは、プロモーター配列および導入遺伝子を含む発現カセットを含む。一実施形態では、ceDNAは、ポリアデニル化配列を含む発現カセットを含む。一実施形態では、ceDNAは、発現カセットの5’または3’末端のいずれかに隣接する少なくとも1つの逆位末端反復(ITR)を含む。一実施形態では、発現カセットは、2つのITRに隣接し、2つのITRは、1つの5’ITRおよび1つの3’ITRを含む。一実施形態では、発現カセットは、3’末端でITR(3’ITR)に連結される。一実施形態では、発現カセットは、5’末端でITR(5’ITR)に連結される。一実施形態では、ceDNAは、5’ITRと発現カセットとの間にスペーサー配列をさらに含む。
一実施形態では、ceDNAは、3’ITRと発現カセットとの間にスペーサー配列をさらに含む。一実施形態では、スペーサー配列は、長さが少なくとも5塩基対である。一実施形態では、スペーサー配列は、長さが5~200塩基対である。一実施形態では、スペーサー配列は、長さが5~500塩基対である。
一実施形態では、ITRは、AAV血清型に由来するITRである。一実施形態では、AAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11およびAAV12からなる群から選択される。一実施形態では、ITRはガチョウウイルスのITRに由来する。一実施形態では、ITRは、B19ウイルスITRに由来する。一実施形態では、ITRはパルボウイルス由来の野生型ITRである。一実施形態では、ITRは変異ITRである。一実施形態では、ceDNAは、発現カセットの5’および3’の両末端に2つの変異ITRを含む。
一実施形態では、ceDNAはニックまたはギャップを有する。
一実施形態では、ceDNAは無細胞環境で合成的に産生される。
一実施形態では、ceDNAは細胞内で産生される。一実施形態では、ceDNAは昆虫細胞で産生される。一実施形態では、昆虫細胞はSf9である。一実施形態では、ceDNAは哺乳動物細胞で産生される。一実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞株である。
一実施形態では、治療用核酸は、発現カセットの5’および3’末端に少なくとも1つのプロテロメラーゼ標的配列を含む閉端DNAである。
一実施形態では、治療用核酸は、発現カセットの5’および3’末端にITRの2つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端DNAである。
一実施形態では、治療用核酸は、DNA系のミニサークルまたはMIDGEである。
一実施形態では、治療用核酸は、直鎖状共有結合性閉端DNAベクターである。一実施形態では、直鎖状共有結合性閉端DNAベクターはミニストリングDNAである。
一実施形態では、治療用核酸は、doggybone(dbDNA(商標))DNAである。
一実施形態では、治療用核酸はミニ遺伝子である。
一実施形態では、治療用核酸はプラスミドである。
したがって、本明細書では、いくつかの態様では、細胞内で導入遺伝子を発現する場合の免疫応答を阻害または抑制する方法を提供し、本方法は、(1)共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)を含む組成物および(2)本明細書に記載の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を細胞に同時投与することを含む。ceDNAでは、ceDNAベクターの単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なDNA対照と比較して、直鎖状かつ連続的なDNAの特徴的なバンドが存在するように、ceDNAベクターは、2つの異なるAAV逆位末端反復配列(ITR)の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ITRの一方は、機能的AAV末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRの一方は、他方のITRと比べて欠失、挿入、または置換を含む。本明細書に示されるように、いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、WO2016/073799に記載されている合成ナノ担体を使用して同時投与され、公開内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ceDNAベクターはナノ担体にも存在する。いくつかの実施形態によれば、1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、ラパマイシンおよびそのラパマイシン類似体、TLRアンタゴニスト(例えば、TLR9アンタゴニスト)、cGASアンタゴニストおよびインフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)から選択される。いくつかの実施形態によれば、TLR9阻害オリゴヌクレオチドは、ITRの少なくとも1つに存在する。いくつかの実施形態によれば、cGASの阻害剤は、ceDNAによってコードされ、誘導性プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結される。他の実施形態では、cGASの阻害剤はceDNAによってコードされない。
さらに、本明細書では、一態様では、(i)共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)(ceDNAベクターは、2つの異なるAAV逆位末端反復配列(ITR)の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ITRの一方は、機能的AAV末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRの一方は、他方のITRと比べて欠失、挿入、または置換を含み、ceDNAでは、ceDNAベクターの単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なDNA対照と比較して、直鎖状かつ連続的なDNAの特徴的なバンドが存在する)、ならびに(ii)免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を含む組成物が提供される。本明細書に示されるように、いくつかの実施形態では、組成物の成分は、別個の合成ナノ担体で製剤化される。一実施形態では、組成物の成分は、同じ合成ナノ担体で製剤化される。いくつかの実施形態によれば、1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、ラパマイシンおよびそのラパマイシン類似体、TLRアンタゴニスト(例えば、TLR9アンタゴニスト)、cGASアンタゴニストおよびインフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)から選択される。
本明細書に記載の非ウイルス性カプシド不含DNAベクターは、許容宿主細胞において発現構築物(例えば、プラスミド、バクミド、バキュロウイルス、または組み込み細胞株)から産生することができる。例えば、2018年9月7日に出願された国際特許出願第PCT/US18/49996号に開示された実施例を参照、または合成生成を使用して、例えば、2018年12月6日に出願された国際特許出願第PCT/US19/14122号に開示された例を参照。各文献は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物において有用なceDNAベクターは、異種核酸、例えば2つの逆位末端反復(ITR)配列の間に位置付けられる導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ITRのうちの少なくとも1つは、野生型ITR配列(例えば、AAV ITR)と比較して欠失、挿入、および/または置換によって修飾され、ITRのうちの少なくとも1つは、機能性末端分解部位(TRS)およびRep結合部位を含む。
別の態様によれば、本開示は、対象における遺伝障害を治療する方法を特徴とし、本方法は、本明細書に開示される医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。
核酸伝達ベクターおよび治療剤は、遺伝子発現およびその調節など、様々な用途に有望な治療薬である。ウイルス伝達ベクターは、タンパク質または核酸をコードする導入遺伝子を含み得る。その例には、AAVベクター、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、およびメッセンジャーRNA(小核RNA(snRNA)など)の変異部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。残念ながら、これらの治療法の展望はまだ実現されておらず、その大部分は、ウイルス伝達ベクターに対する細胞性および体液性免疫応答に起因する。これらの免疫応答には、抗体、B細胞およびT細胞の応答が含まれ、多くの場合、ウイルスカプシドまたはその被覆タンパク質またはペプチドなどのウイルス導入ベクターのウイルス抗原に特異的である。
現在、多くの潜在的な患者は、ウイルス伝達ベクターの基礎となっているウイルスに対して、ある程度のレベルの既存の免疫を保有している。実際、ウイルスの核酸(DNAとRNAの両方)またはタンパク質に対する抗体は、ヒト集団で非常に普及している。さらに、例えばウイルス導入ベクターの免疫原性が低いために既存の免疫のレベルが低い場合でも、そのような低いレベルが依然として形質導入の成功を妨げる可能性がある(例えば、Jeune,et al.,Human Gene Therapy Methods,24:59-67(2013))。したがって、既存の免疫のレベルが低くても、患者の特定のウイルス伝達ベクターの使用を妨げる可能性があり、臨床医は、それほど効果的ではない可能性のある異なる血清型のウイルスに基づいたウイルス伝達ベクターを選択する必要があるか、または、別のウイルス伝達ベクター療法が利用できない場合は、別の種類の療法を完全に免除することさえある。
さらに、アデノ随伴ベクターなどのウイルスベクターは、免疫原性が高く、特に再投与に関して有効性を損なう可能性のある体液性免疫および細胞性免疫を誘発し得る。実際、ウイルス伝達ベクターに対する細胞性および体液性免疫応答は、ウイルス伝達ベクターの単回投与後に発生する可能性がある。ウイルス伝達ベクターの投与後、中和抗体価は数年間増加して高いままであり、ウイルス伝達ベクターの再投与の有効性を低減する可能性がある。実際、ウイルス伝達ベクターを反復投与すると、一般に、望ましくない免疫応答が強化される。さらに、ウイルス導入ベクターに特異的なCD8+T細胞が生じ、例えば、ウイルス抗原様ウイルス核酸またはカプシドタンパク質への再曝露時に、所望の導入遺伝子産物を発現する形質導入細胞を排除することができる。例えば、AAV核酸またはカプシド抗原は、AAVウイルス導入ベクターで形質導入された肝細胞の免疫介在性破壊を誘起できることが示されている。多くの治療用途では、長期的な利益のために、ウイルス伝達ベクターの投与を複数回行う必要があると考えられている。しかしながら、特に再投与が必要な場合、本明細書で提供される方法および組成物がなければ、そうする能力は著しく制限されるだろう。
ウイルスまたは非ウイルス(合成)伝達ベクター、および治療用の他の核酸治療薬を含む、様々な核酸治療薬の効果的な使用に対する前述の障壁への解決策を提供する方法および組成物が提供される。本開示は、標的細胞、組織、器官または生物への外因性DNA配列の送達、ならびにそれらに対する免疫応答(例えば、自然免疫応答)を阻害(すなわち、低減または抑制)するための修飾および方法に関する。免疫応答(例えば、自然免疫応答)を阻害(すなわち、低減または抑制)するためのそのような修飾および方法は、例えば、導入遺伝子発現の持続時間を増強するために使用することができる。
DNA伝達ベクターに対する免疫応答(例えば、自然免疫応答)は、本明細書で提供される方法および関連する組成物を用いて弱毒化できることが予期せず発見された。したがって、本方法および組成物は、ウイルス伝達ベクターおよび他の治療用核酸分子による治療の有効性を潜在的に高め、ウイルス伝達ベクターまたは他の核酸治療薬の投与が繰り返された場合でも、長期的な治療効果を提供することができる。
I.定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関して使用される科学的および技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,19th Edition,published by Merck Sharp&Dohme Corp.,2011(ISBN978-0-911910-19-3)、Robert S.Porter et al.(eds.),Fields Virology,6th Edition,published by Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,USA(2013),Knipe,D.M.and Howley,P.M.(ed.),The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine,published by Blackwell Science Ltd.,1999-2012(ISBN9783527600908)、およびRobert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN1-56081-569-8)、Immunology by Werner Luttmann,published by Elsevier,2006、Janeway‘s Immunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(eds.),Taylor&Francis Limited,2014(ISBN0815345305,9780815345305)、Lewin’s Genes XI,published by Jones&Bartlett Publishers,2014(ISBN-1449659055)、Michael Richard Green and Joseph Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN1936113414)、Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(2012)(ISBN044460149X)、Laboratory Methods in Enzymology:DNA,Jon Lorsch(ed.)Elsevier,2013(ISBN0124199542)、Current Protocols in Molecular Biology(CPMB),Frederick M.Ausubel(ed.),John Wiley and Sons,2014(ISBN047150338X,9780471503385),Current Protocols in Protein Science(CPPS),John E.Coligan(ed.),John Wiley and Sons,Inc.,2005、およびCurrent Protocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe,(eds.)John Wiley and Sons,Inc.,2003(ISBN0471142735,9780471142737)に見出すことができ、これらの内容はすべて、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関して使用される科学的および技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,19th Edition,published by Merck Sharp&Dohme Corp.,2011(ISBN978-0-911910-19-3)、Robert S.Porter et al.(eds.),Fields Virology,6th Edition,published by Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,USA(2013),Knipe,D.M.and Howley,P.M.(ed.),The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine,published by Blackwell Science Ltd.,1999-2012(ISBN9783527600908)、およびRobert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN1-56081-569-8)、Immunology by Werner Luttmann,published by Elsevier,2006、Janeway‘s Immunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(eds.),Taylor&Francis Limited,2014(ISBN0815345305,9780815345305)、Lewin’s Genes XI,published by Jones&Bartlett Publishers,2014(ISBN-1449659055)、Michael Richard Green and Joseph Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN1936113414)、Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(2012)(ISBN044460149X)、Laboratory Methods in Enzymology:DNA,Jon Lorsch(ed.)Elsevier,2013(ISBN0124199542)、Current Protocols in Molecular Biology(CPMB),Frederick M.Ausubel(ed.),John Wiley and Sons,2014(ISBN047150338X,9780471503385),Current Protocols in Protein Science(CPPS),John E.Coligan(ed.),John Wiley and Sons,Inc.,2005、およびCurrent Protocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe,(eds.)John Wiley and Sons,Inc.,2003(ISBN0471142735,9780471142737)に見出すことができ、これらの内容はすべて、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「投与」、「投与する」という用語およびその変形は、組成物または薬剤(例えば、本明細書に記載の治療用核酸または免疫抑制剤)を対象に導入することを指し、1つ以上の組成物または薬剤の同時導入および連続導入を含む。「投与」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、プラセボ、および実験方法を指し得る。「投与」には、インビトロおよびエクスビボ治療も含まれる。組成物または薬剤の対象への導入は、経口、肺、鼻腔内、非経口(静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下)、直腸、リンパ管内、腫瘍内、または局所を含む任意の好適な経路による。組成物または薬剤の対象への導入は、エレクトロポレーションによる。投与には、自己管理および他者による投与が含まれる。投与は、任意の好適な経路で実施することができる。好適な投与経路は、組成物または薬剤がその意図された機能を遂行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈に導入することによって投与される。
本明細書で使用される場合、「核酸治療薬」、「治療用核酸」および「TNA」という句は交換可能に使用され、疾患または障害を治療するための治療剤の活性成分として核酸を使用する治療の任意のモダリティを指す。本明細書で使用される場合、これらの句は、RNAベースの治療剤およびDNAベースの治療剤を指す。RNA系治療薬の非限定的な例としては、mRNA、アンチセンスRNAおよびオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉RNA(RNAi)、ダイサー基質dsRNA、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、非対称干渉RNA(aiRNA)、マイクロRNA(miRNA)が挙げられる。DNA系治療薬の非限定的な例としては、ミニサークルDNA、ミニ遺伝子、ウイルスDNA(例えば、レンチウイルスまたはAAVゲノム)もしくは非ウイルス合成DNAベクター、閉端直鎖状二重鎖DNA(ceDNA/CELiD)、プラスミド、バクミド、doggybone(dbDNA(商標))DNAベクター、最小限度に免疫学的に定義された遺伝子発現(MIDGE)ベクター、非ウイルスミニストリングDNAベクター(直鎖状の共有結合性閉鎖DNAベクター)、またはダンベル型DNAミニマルベクター(「ダンベルDNA」)が挙げられる。
本明細書で使用される場合、活性剤または治療剤、例えば、免疫抑制剤および/または治療用核酸などの治療剤の「有効量」または「治療有効量」とは、治療用核酸および/または免疫抑制剤の不在下で検出された発現レベルと比較して、所望の効果、例えば、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の正常化または低減および標的配列の発現または発現阻害を生じるのに十分な量である。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するための好適なアッセイとしては、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ELISA、免疫沈降、酵素機能および当業者に既知の表現型アッセイなどの、当業者に既知の技術を使用するタンパク質またはRNAレベルの検査が挙げられる。しかしながら、投与量レベルは、傷害のタイプ、年齢、体重、性別、患者の病状、病状の重症度、投与経路、用いられる特定の活性剤など、様々な要因に基づく。したがって、投与計画は大きく異なる可能性があるが、標準的な方法を使用して医師が常套的に決定することができる。さらに、「治療量」、「治療有効量」および「薬学的有効量」という用語は、記載された本発明の組成物の予防(prophylactic)量または予防(preventative)量を含む。記載された本発明の予防的適用または予防的適用において、医薬組成物または薬剤は、疾患、障害または病態に罹患しやすい患者、あるいはそのリスクがある患者に、リスクを排除または低減し、重症度を低減し、疾患、障害または病態の発症を遅らせるのに十分な量で投与され、疾患、障害または病態としては、疾患、障害または病態の生化学的、組織学的および/または行動症状、その合併症、ならびに疾患、障害または病態の発症中に現れる中間の病理学的表現型が挙げられる。いくつかの医学的判断によれば、最大用量、すなわち最高の安全用量を使用することが一般的に好ましい。「用量」および「投与量」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、治療の結果を指し、その結果は、望ましくかつ有益であると判断される。治療効果としては、直接的または間接的に、疾患症状の阻止、低減、または排除を挙げることができる。治療効果としてはまた、直接的または間接的に、疾患症状の進行の阻止、低減、または排除を挙げることができる。
本明細書に記載される任意の治療剤について、治療有効量は、予備的なインビトロ研究および/または動物モデルから最初に決定することができる。治療有効用量はまた、ヒトのデータから決定することができる。適用される用量は、投与される化合物の相対的な生物学的利用能および効力に基づいて調整することができる。上記の方法および他の周知の方法に基づいて最大の効力を達成するように用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。参照により本明細書に組み込まれる、Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,10th Edition,McGraw-Hill(New York)(2001)の第1章に見出され得る治療有効性を決定するための一般原則を以下に要約する。
薬物動態学的原理は、許容できない副作用を最小限に抑えながら、望ましい程度の治療効果を得るために投与計画を変更するための基礎を提供する。薬物の血漿濃度を測定でき、治療濃度域に関連している状況では、投与量の変更に関する追加のガイダンスを入手することができる。
本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」および「導入遺伝子」という用語は、交換可能に使用され、本明細書で開示されるceDNAベクターに組み込まれ、それによって送達および発現され得る、関心対象の(カプシドポリペプチドをコードする核酸以外の)核酸を指す。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」および「転写カセット」という用語は、交換可能に使用され、導入遺伝子の転写を配向するのに十分な1つ以上のプロモーターまたは他の調節配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含むが、カプシドをコードする配列、他のベクター配列、または逆位末端反復領域を含まない核酸の直鎖状ストレッチを指す。発現カセットは、追加として、1つ以上のシス作用性配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー)、1つ以上のイントロン、および1つ以上の転写後調節要素を含んでもよい。
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のDNAもしくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然、化学的修飾もしくは生化学的修飾、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖または二本鎖DNAの約5~約100ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、この開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離するか、または当該技術分野で既知である方法によって化学的に合成することができる。「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能であるように、一本鎖(センスまたはアンチセンスなど)および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。DNAは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドDNA、DNA-DNA二重鎖、事前に凝縮されたDNA、PCR産物、ベクター(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、発現カセット、キメラ配列、染色体DNA、またはこれらのグループの誘導体および組み合わせの形態であり得る。DNAは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングDNA(直鎖状の共有結合的に閉じたDNAベクター)、閉端直鎖状二重鎖DNA(CELiDまたはceDNA)、doggybone(dbDNA(商標))DNA、ダンベル型DNA、ミニマル免疫学的定義遺伝子発現(MIDGE)ベクター、ウイルスベクター、または非ウイルスベクターの形態であり得る。RNAは、低分子干渉RNA(siRNA)、ダイサー基質dsRNA、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、非対称干渉RNA(aiRNA)、マイクロRNA(miRNA)、mRNA、rRNA、tRNA、ウイルスRNA(vRNA)、およびそれらの組み合わせの形態であり得る。核酸としては、既知のヌクレオチド類似体または修飾型骨格残基もしくは連結を含む核酸が挙げられ、これらは、合成、天然に存在する、および天然に存在しないものであり、参照核酸と同様の結合特性を有する。そのような類似体および/または修飾残基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(モルホリノ)、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2’-O-メチルリボヌクレオチド、ロックド核酸(LNA(商標))、およびペプチド核酸(PNA)が挙げられるが、限定されない。別途限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別途明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾型変異体(例えば、縮重コドン置換)、対立遺伝子、相同分子腫、SNP、および相補的配列、ならびに明示的に示された配列を暗黙的に包含する。
「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース(DNA)またはリボース(RNA)、塩基、およびリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を介してともに連結している。
「塩基」には、プリンおよびピリミジンが含まれ、プリンおよびピリミジンは、天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類似体、ならびにプリンおよびピリミジンの合成誘導体がさらに含まれ、該誘導体には、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、およびアルキルハライドなどであるがこれらに限定されない新しい反応基を配置する修飾が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「干渉RNA」または「RNAi」または「干渉RNA配列」という用語は、一本鎖RNA(例えば、成熟miRNA、ssRNAiオリゴヌクレオチド、ssDNAiオリゴヌクレオチド)、二本鎖RNA(すなわち、siRNAなどの二本鎖RNA、ダイサー基質dsRNA、shRNA、aiRNA、またはプレmiRNA)、DNA-RNAハイブリッド(例えば、PCT公開第WO2004/078941号を参照)、または干渉RNAが標的の遺伝子もしくは配列と同じ細胞に存在する場合、(例えば、分解を媒介するか、または干渉RNA配列に相補的なmRNAの翻訳を阻害することによって)標的の遺伝子もしくは配列の発現を低減もしくは阻害することができるDNA-DNAハイブリッド(例えば、PCT公開第WO2004/104199号を参照)を含む。したがって、干渉RNAは、標的mRNA配列に相補的な一本鎖RNA、または2つの相補鎖または単一の自己相補鎖によって形成される二本鎖RNAを指す。干渉RNAは、標的の遺伝子または配列に対して実質的なもしくは完全な同一性を有し得るか、またはミスマッチの領域(すなわち、ミスマッチモチーフ)を含み得る。干渉RNAの配列は、全長の標的遺伝子またはその部分配列に対応し得る。好ましくは、干渉RNA分子は化学合成される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
干渉RNAには、「低分子干渉RNA」または「siRNA」、例えば、長さ約15~60、15~50、または15~40(二重鎖)ヌクレオチド、より典型的には長さ約15~30、15~25、または19~25(二重鎖)ヌクレオチドの干渉RNAを含み、好ましくは長さ約20~24、21~22、または21~23(二重鎖)ヌクレオチドである(例えば、二本鎖siRNAの各相補配列は、長さ15~60、15~50、15~40、15~30、15~25、または19~25ヌクレオチドであり、好ましくは長さ約20~24、21~22、または21~23ヌクレオチドであり、二本鎖siRNAは、長さ約15~60、15~50、15~40、15~30、15~25、または19~25塩基対であり、好ましくは長さ約18~22、19~20、または19~21塩基対である)。siRNA二重鎖は、約1~約4ヌクレオチドまたは約2~約3ヌクレオチドの3’オーバーハングおよび5’ホスフェート末端を含み得る。siRNAの例には、2つの別個の鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子(一方の鎖はセンス鎖であり、他方は相補的アンチセンス鎖である)、一本鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子(センスおよびアンチセンス領域が核酸系または非核酸系のリンカーによって連結される)、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子、ならびに2つ以上のループ構造および自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチド分子(環状ポリヌクレオチドはインビボまたはインビトロでプロセシングされ、活性な二本鎖siRNA分子を生成し得る)が含まれるが、限定されない。本明細書で使用される場合、「siRNA」という用語は、RNA-RNA二本鎖およびDNA-RNAハイブリッドを含む(例えば、PCT公開第WO2004/078941号を参照)。
本明細書で使用される「核酸構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、またはそうでなければ天然に存在しないような様式で核酸のセグメントを含むように修飾されるか、または合成である、一本鎖または二本鎖の核酸分子を指す。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本開示のコード配列の発現に必要な制御配列を含む場合、「発現カセット」という用語と同義である。「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結されたDNAコード配列を含む。
「ハイブリダイズ可能」または「相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸(例えば、RNA)が、非共有結合する、すなわち、ワトソン・クリック塩基対および/またはG/U塩基対を形成する、温度および溶液イオン強度の適切なインビトロおよび/またはインビボ条件下で配列特異的、逆平行な様式で別の核酸に「アニール」または「ハイブリダイズ」する(すなわち、核酸は、相補的核酸に特異的に結合する)のを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当該技術分野で既知であるように、標準的なワトソン・クリック塩基対合には、チミジン(T)とのアデニン(A)対合、ウラシル(U)とのアデニン(A)対合、およびシトシン(C)とのグアニン(G)対合が含まれる。さらに、2つのRNA分子(例えば、dsRNA)間のハイブリダイゼーションのために、グアニン(G)塩基がウラシル(U)と対合することも当該技術分野で既知である。例えば、G/U塩基対合は、mRNA中のコドンとのtRNAアンチコドン塩基対合の状況で、遺伝暗号の縮重(すなわち、冗長性)を部分的に担っている。この開示の文脈において、対象のDNA標的化RNA分子のタンパク質結合セグメント(dsRNA二重鎖)のグアニン(G)は、ウラシル(U)に相補的であるとみなされ、逆もまた同様である。したがって、対象のDNA標的RNA分子のタンパク質結合セグメント(dsRNA二重鎖)の所与のヌクレオチド位置でG/U塩基対を作製できる場合、その位置は、非相補的であるとみなされないが、代わりに相補的であるとみなされる。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。
特定のインフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)を「コードする」DNA配列は、特定のRNAおよび/またはタンパク質に転写されるDNA核酸配列である。DNAポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるRNA(mRNA)をコードし得るか、またはDNAポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないRNA(例えば、tRNA、rRNA、またはDNA標的RNA、「非コード」RNAまたは「ncRNA」とも呼ばれる)をコードし得る。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、少なくとも2つの異なるタンパク質からのタンパク質ドメインを含むポリペプチドを指す。例えば、融合タンパク質は、(i)インフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)またはその断片、および(ii)少なくとも1つの非対象遺伝子(GOI)タンパク質、または別のインフラマソームアンタゴニストタンパク質を含み得る。本明細書に包含される融合タンパク質には、インフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)、例えば、受容体の細胞外ドメイン、リガンド、酵素またはペプチドと融合した抗体、または抗体のFcもしくは抗原結合断片が含まれるが、これらに限定されない。融合タンパク質の一部であるインフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)またはその断片は、単一特異性抗体または二重特異性または多重特異性の抗体であり得る。
本明細書で使用される場合、「ゲノムセーフハーバー遺伝子」または「セーフハーバー遺伝子」という用語は、内因性遺伝子活性に重大な悪影響を及ぼすことなく、または癌を促進することなく、配列が予測可能な様式で統合および機能し得る(例えば、関心対象のタンパク質を発現する)ように、核酸配列を挿入することができる遺伝子または遺伝子座を指す。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子はまた、挿入された核酸配列が非セーフハーバー部位よりも効率的かつ高レベルで発現され得る遺伝子座または遺伝子である。
本明細書で使用される場合、「遺伝子送達」という用語は、外来DNAが遺伝子療法の適用のために宿主細胞に導入されるプロセスを意味する。
本明細書で使用される場合、「末端反復」または「TR」という用語は、少なくとも1つの最小限必要な複製起源、および回文ヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端配列または合成配列を含む。Rep結合配列(「RBS」)(RBE(Rep結合要素)とも称される)および末端分解部位(「TRS」)は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、TRは、少なくとも1つのRBSおよび少なくとも1つのTRSを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補体であるTRは、典型的に、各々「逆位末端反復」または「ITR]と称される。ウイルスの文脈において、ITRは、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、およびプロウイルスレスキューを媒介する。本明細書で本発明において予想外に見出されたように、全長にわたって逆相補体でないTRは、依然としてITRの従来の機能を遂行することができ、したがって、ITRという用語は、本明細書において、ceDNAベクターの複製を媒介することができるceDNAゲノムまたはceDNAベクター中のTRを指すように使用される。複合ceDNAベクター構成中、3つ以上のITRまたは非対称ITR対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ITRは、AAV ITRもしくは非AAV ITRであり得るか、またはAAV ITRもしくは非AAV ITRに由来し得る。例えば、ITRは、パルボウイルスおよびディペンドウイルス(例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスB-19)を包含するパルボウイルス科に由来し得るか、またはSV40複製起点として役立つSV40ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、および/もしくは付加によってさらに修飾され得る、ITRとして使用され得る。パルボウイルス科ウイルスは、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科(Parvovirinae)および無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科(Densovirinae)の2つの亜科で構成されている。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、ヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ随伴ウイルス(AAV)のウイルス科を含む。本明細書では便宜上、ceDNAベクター中の発現カセットに対して5’(その上流)に位置するITRは、「5’ITR」または「左ITR」と称され、ceDNAベクター中の発現カセットに対して3’(その下流)に位置するITRは、「3’ITR」または「右ITR」と称される。
「野生型ITR」または「WT-ITR」は、例えば、Rep結合活性およびRepニッキング能力を保持する、AAVまたは他のディペンドウイルスにおける天然ITR配列の配列を指す。任意のAAV血清型からのWT-ITRのヌクレオチド配列は、遺伝コードの縮重または遺伝的浮動により、天然に存在するカノニカル配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるWT-ITR配列は、産生プロセス中に発生する天然の変化(例えば、複製エラー)の結果としてWT-ITR配列を含む。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称なWT-ITR」または「実質的に対称なWT-ITR対」という用語は、それらの全長にわたって逆相補配列を有する両野生型ITRである単一のceDNAゲノムまたはceDNAベクター内のWT-ITRの対を指す。例えば、変化が配列の特性および全体的な3次元構造に影響を及ぼさない限り、天然に存在するカノニカル配列から逸脱する1つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ITRが野生型の配列であるとみなすことができる。いくつかの態様では、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、カノニカル配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性(例えば、デフォルト設定でBLASTを使用して測定される)を有し、またそれらの3次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のWT-ITRに対して対称な3次元空間構成を有する。実質的に対称なWT-ITRは、3次元空間で同じA、C-C’、およびB-B’ループを有する。実質的に対称なWT-ITRは、適切なRepタンパク質と対合する操作可能なRep結合部位(RBEまたはRBE’)および末端分解部位(TRS)を有することを決定することによって、WTとして機能的に確認することができる。任意選択的に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。
本明細書で使用される場合、「修飾型ITR」または「mod-ITR」または「変異ITR」の語句は、本明細書で交換可能に使用され、同じ血清型からのWT-ITRと比較して、少なくとも1つ以上のヌクレオチドに変異を有するITRを指す。変異は、同じ血清型のWT-ITRの3次元空間構成と比較して、ITRのA、C、C’、B、B’領域のうちの1つ以上の変化をもたらし、3次元空間構成(すなわち、幾何学的空間におけるその3次元構造)の変化をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「非対称ITR対」とも呼ばれる「非対称ITR」という用語は、全長にわたって逆相補体ではない単一のceDNAゲノムまたはceDNAベクター内のITRの対を指す。非限定的な一例として、非対称ITR対は、それらの3次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ITRに対して対称の3次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のITR対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、3次元空間でのそれらのA、C-C’、およびB-B’ループの構成が異なる(例えば、同族ITRと比較して、1つのITRは、短いC-C’アームおよび/または短いB-B’アームを有し得る)。2つのITR間の配列の相違は、1つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、または点変異に起因し得る。一実施形態では、非対称ITR対の一方のITRは、野生型AAV ITR配列であり得、他方のITRは、本明細書で定義される修飾型ITR(例えば、非野生型または合成ITR配列)であり得る。別の実施形態では、非対称ITR対のどちらのITRも野生型AAV配列ではなく、2つのITRは、幾何学的空間において異なる形状(すなわち、異なる全体的な幾何学的構造)を有する修飾型ITRである。いくつかの実施形態では、非対称ITR対の一方のmod-ITRは、短いC-C’アームを有することができ、他方のITRは、それらが同族の非対称mod-ITRと比較して、異なる3次元空間構成を有するように異なる修飾(例えば、単一アーム、または短いB-B’アーム等)を有し得る。
本明細書で使用される場合、「対称ITR」という用語は、野生型ディペンドウイルスITR配列に対して変異または修飾され、それらの全長にわたって逆相補である単一のceDNAゲノムまたはceDNAベクター内の一対のITRを指す。どちらのITRも野生型ITR AAV2配列ではなく(すなわち、それらは修飾型ITRであり、変異ITRとも呼ばれる)、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、または点変異により、野生型ITRとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、ceDNAベクター中の発現カセットに対して5’(その上流)に位置するITRは、「5’ITR」または「左ITR」と称され、ceDNAベクター中の発現カセットに対して3’(その下流)に位置するITRは、「3’ITR」または「右ITR」と称される。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称の修飾型ITR」または「実質的に対称のmod-ITR対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する単一のceDNAゲノムまたはceDNAベクター内の修飾型ITRの対を指す。例えば、修飾型ITRは、変化が特性および全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆相補配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称とみなすことができる。非限定的な一例として、配列は、カノニカル配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性(デフォルト設定でBLASTを使用して測定される)を有し、またそれらの3次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ITRに対して対称な3次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称な修飾型ITR対は、3次元空間に構成された同じA、C-C’、およびB-B’ループを有する。いくつかの実施形態では、mod-ITR対からのITRは、異なる逆相補ヌクレオチド配列を有し得るが、依然として同じ対称な3次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のITRは、同じ全体的な3次元形状をもたらす変異を有する。例えば、mod-ITR対の1つのITR(例えば、5’ITR)は、1つの血清型に由来し得、他方のITR(例えば、3’ITR)は、異なる血清型に由来し得るが、両方が同じ対応する変異を有し得(例えば、5’ITRがC領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型3’ITRは、C’領域の対応する位置に欠失を有する)、それにより修飾型ITR対が同じ対称な3次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ITR対の各ITRは、AAV2およびAAV6の組み合わせなどの異なる血清型(例えば、AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、および12)に由来し得、1つのITRの修飾は、異なる血清型の同族のITRの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称な修飾型ITR対は、ITR間のヌクレオチド配列の相違が特性または全体的な形状に影響を与えず、それらが3次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ITR(mod-ITR)を指す。非限定的な例として、mod-ITRは、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)またはデフォルト設定のBLASTNなどの当該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、カノニカルmod-ITRに対して少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有し、またそれらの3次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称な3次元空間構成を有する。実質的に対称なmod-ITR対は、3次元空間で同じA、C-C’およびB-B’ループを有する。例えば、実質的に対称なmod-ITR対の修飾型ITRがC-C’アームの欠失を有する場合、同族のmod-ITRは、C-C’ループの対応する欠失を有し、またその同族のmod-ITRの幾何学的空間に同じ形状の残りのAおよびB-B’ループの同様の3次元構造を有する。
「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指す。一般に、配列ABCでは、Bの両側にAおよびCが隣接している。配置AxBxCについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前または後に続くが、隣接される配列と連続している、またはすぐ隣である必要はない。一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状二重鎖ceDNAベクターの各末端の末端反復を指す。本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、および/または「治療」という用語は、病態の進行を抑止する、実質的に阻害する、遅らせる、もしくは逆転させる、病態の臨床症状を実質的に改善する、または病態の臨床症状の出現を実質的に防止する、有益なもしくは所望の臨床結果を得ることを含む。さらに、治療することは、(a)障害の重症度を軽減すること、(b)治療中の障害(複数可)に特徴的な症状の発症を制限すること、(c)治療中の障害(複数可)に特徴的な症状の悪化を制限すること、(d)以前に障害(複数可)を有していた患者における障害(複数可)の再発を制限すること、および(e)以前は障害(複数可)に関して無症候性であった患者の症状の再発を制限することのうちの1つ以上を達成することを指す。薬理学的および/または生理学的効果などの有益なまたは所望の臨床結果としては、疾患、障害または病態の素因を有する可能性があるが、当該障害の症状をまだ経験していない、もしくは呈していない対象において疾患、障害または病態が発生するのを防ぐこと(予防的治療)、疾患、障害または病態の症状を緩和させること、疾患、障害または病態の程度を減少させること、疾患、障害または病態を安定化させる(すなわち、悪化させない)こと、疾患、障害または病態の蔓延を防止すること、疾患、障害または病態の進行を遅らせるまたは遅くすること、疾患、障害または病態の改善または軽減させること、およびそれらの組み合わせ、ならびに治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することが含まれるが、これらに限定されない。
「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指す。一般に、配列ABCでは、Bの両側にAおよびCが隣接している。配置AxBxCについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前または後に続くが、隣接される配列と連続している、またはすぐ隣である必要はない。一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状二重鎖ceDNAベクターの各末端の末端反復を指す。本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、および/または「治療」という用語は、病態の進行を抑止する、実質的に阻害する、遅らせる、もしくは逆転させる、病態の臨床症状を実質的に改善する、または病態の臨床症状の出現を実質的に防止する、有益なもしくは所望の臨床結果を得ることを含む。さらに、治療することは、(a)障害の重症度を軽減すること、(b)治療中の障害(複数可)に特徴的な症状の発症を制限すること、(c)治療中の障害(複数可)に特徴的な症状の悪化を制限すること、(d)以前に障害(複数可)を有していた患者における障害(複数可)の再発を制限すること、および(e)以前は障害(複数可)に関して無症候性であった患者の症状の再発を制限することのうちの1つ以上を達成することを指す。薬理学的および/または生理学的効果などの有益なまたは所望の臨床結果としては、疾患、障害または病態の素因を有する可能性があるが、当該障害の症状をまだ経験していない、もしくは呈していない対象において疾患、障害または病態が発生するのを防ぐこと(予防的治療)、疾患、障害または病態の症状を緩和させること、疾患、障害または病態の程度を減少させること、疾患、障害または病態を安定化させる(すなわち、悪化させない)こと、疾患、障害または病態の蔓延を防止すること、疾患、障害または病態の進行を遅らせるまたは遅くすること、疾患、障害または病態の改善または軽減させること、およびそれらの組み合わせ、ならびに治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「増加する」、「増強する」、「上昇させる」という用語(および同様の用語)は、一般に、天然、予測もしくは平均に対して、または対照条件に対して、直接的または間接的に、濃度、レベル、機能、活性、または挙動を増加させる作用を指す。
本明細書で使用される場合、「抑制する」、「減少する」、「妨害する」、「阻害する」および/または「低減する」という用語(ならびに同様の用語)は、一般に、天然、予想もしくは平均に対して、または対照条件に対して、直接的または間接的に、濃度、レベル、機能、活性、または挙動を低減する行為を指す。免疫抑制剤による免疫応答(例えば、免疫応答(例えば、自然免疫応答))が「低下」、「低下すること」、「低減」、または「低減すること」とは、所与の免疫抑制剤に対する検出可能な免疫応答の減少を意味することを意図する。免疫抑制剤による免疫応答の低下量は、免疫抑制剤の存在下における免疫応答のレベルと比較して決定され得る。検出可能な低下は、免疫抑制剤の存在下で検出された免疫応答よりも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%以下であり得る。
本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含むがこれらに限定されない有機化合物群を指し、水に不溶であるが、多くの有機溶媒に可溶であることを特徴とする。脂質は通常、少なくとも3つのクラスに分類される。(1)脂肪および油ならびにワックスを含む「単純脂質」、(2)リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」、(3)ステロイドなどの「誘導脂質」。
本明細書で使用される場合、「脂質粒子」という用語は、核酸治療薬および/または免疫抑制剤などの治療剤を関心対象の標的部位(例えば、細胞、組織、器官など)に送達するために使用され得る脂質製剤を含む。好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は核酸含有脂質粒子であり、これは典型的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および任意選択的に粒子の凝集を防止する複合脂質から形成される。他の好ましい実施形態では、治療用核酸などの治療剤を粒子の脂質部分にカプセル化し、それにより酵素分解から保護することができる。他の好ましい実施形態では、免疫抑制剤は、脂質粒子を含む核酸に任意選択的に含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「脂質でカプセル化する」という用語は、核酸(例えば、ceDNA)などの活性剤または治療剤を、完全カプセル化、部分カプセル化、またはその両方で提供する脂質粒子を指し得る。好ましい実施形態では、核酸は脂質粒子内に完全にカプセル化される(例えば、核酸を含有する脂質粒子を形成するため)。
本明細書で使用される「脂質複合体」という用語は、脂質粒子の凝集を阻害する複合脂質を指す。そのような脂質複合体には、例えば、ジアルキルオキシプロピルと共役したPEG(例えば、PEG-DAA複合体)、ジアシルグリセロールと共役したPEG(例えば、PEG-DAG複合体)、コレステロールと共役したPEG、ホスファチジルエタノールアミンと共役したPEG、およびセラミドと共役したPEG(例えば、米国特許第5,885,613号を参照)などのPEG-脂質複合体、カチオン性PEG脂質、ポリオキサゾリン(POZ)-脂質複合体(例えば、POZ-DAA複合体、例えば、2010年1月13日出願の米国仮出願第61/294,828号、および2010年1月14日出願の米国仮出願第61/295,140号を参照)、ポリアミドオリゴマー(例えば、ATTA-脂質複合体)、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。POZ-脂質複合体の追加例は、PCT公開第WO2010/006282号に記載されている。PEGまたはPOZは、脂質に直接結合するか、リンカー部分を介して脂質に結合することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、PEGまたはPOZを脂質に結合するのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、アミドまたはカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
リン脂質の代表的な例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ-アシルオキシ酸など、リンを欠く他の化合物も両親媒性脂質と呼ばれる群に含まれる。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含む他の脂質と混合することができる。
本明細書で使用される場合、「中性脂質」という用語は、選択されたpHで非荷電または中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種のいずれかを指す。生理学的pHでは、そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、およびジアシルグリセロールが含まれる。
本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質、および任意の他の中性脂質またはアニオン性脂質を指す。
本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という用語は、生理学的pHで負に荷電するあらゆる脂質を指す。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N-ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、N-スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)、および中性脂質と結合した他のアニオン性修飾基が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「疎水性脂質」という用語は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに1つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式基で任意に置換された基を含むがこれらに限定されない無極性基を有する化合物を指す。適切な例には、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、N-N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパン、および1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「水溶液」という用語は、全体または一部に水を含む組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「有機脂質溶液」という用語は、全体または一部に脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「全身送達」という用語は、生物内での干渉RNA(例えば、siRNA)などの活性剤の広範な生体内分布をもたらす脂質粒子の送達を指す。投与技術によっては、特定の薬剤の全身送達にいたることもあれば、そうでないものもある。全身送達とは、有用な量、好ましくは治療量の薬剤が身体のほとんどの部分にさらされることを意味する。広範な生体内分布を得るには、一般に、薬剤が、投与部位より遠位の疾患部位に到達する前に(初回通過器官(肝臓、肺など)によって、または急速な非特異的細胞結合によって)急速に分解または排出されないような血液寿命が必要である。脂質粒子の全身送達は、例えば静脈内、皮下、および腹腔内を含む、当技術分野で既知の任意の手段によることができる。好ましい実施形態では、脂質粒子の全身送達は静脈内送達による。
本明細書で使用される場合、「局所送達」という用語は、干渉RNA(例えば、siRNA)などの活性剤の、生物内の標的部位への直接の送達を指す。例えば、薬剤は、腫瘍などの疾患部位、または炎症部位などの他の標的部位、または肝臓、心臓、膵臓、腎臓などの標的器官への直接注射によって局所的に送達することができる。
本明細書で使用される場合、「末端反復」または「TR」という用語は、少なくとも1つの最小限必要な複製起源、および回文ヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端配列または合成配列を含む。Rep結合配列(「RBS」)(RBE(Rep結合要素)とも称される)および末端分解部位(「TRS」)は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、TRは、少なくとも1つのRBSおよび少なくとも1つのTRSを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補体であるTRは、典型的に、各々「逆位末端反復」または「ITR]と称される。ウイルスの文脈において、ITRは、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、およびプロウイルスレスキューを媒介する。本明細書で本発明において予想外に見出されたように、全長にわたって逆相補体でないTRは、依然としてITRの従来の機能を遂行することができ、したがって、ITRという用語は、本明細書において、ceDNAベクターの複製を媒介することができるceDNAゲノムまたはceDNAベクター中のTRを指すように使用される。複合ceDNAベクター構成中、3つ以上のITRまたは非対称ITR対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ITRは、AAV ITRもしくは非AAV ITRであり得るか、またはAAV ITRもしくは非AAV ITRに由来し得る。例えば、ITRは、パルボウイルスおよびディペンドウイルス(例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスB-19)を包含するパルボウイルス科に由来し得るか、またはSV40複製起点として役立つSV40ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、および/もしくは付加によってさらに修飾され得る、ITRとして使用され得る。パルボウイルス科ウイルスは、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科(Parvovirinae)および無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科(Densovirinae)の2つの亜科で構成されている。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、ヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ随伴ウイルス(AAV)のウイルスファミリーを含む。本明細書では便宜上、ceDNAベクター中の発現カセットに対して5’(その上流)に位置するITRは、「5’ITR」または「左ITR」と称され、ceDNAベクター中の発現カセットに対して3’(その下流)に位置するITRは、「3’ITR」または「右ITR」と称される。
「野生型ITR」または「WT-ITR」は、例えば、Rep結合活性およびRepニッキング能力を保持する、AAVまたは他のディペンドウイルスにおける天然ITR配列の配列を指す。任意のAAV血清型からのWT-ITRのヌクレオチド配列は、遺伝コードの縮重または遺伝的浮動により、天然に存在するカノニカル配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるWT-ITR配列は、産生プロセス中に発生する天然の変化(例えば、複製エラー)の結果としてWT-ITR配列を含む。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称なWT-ITR」または「実質的に対称なWT-ITR対」という用語は、それらの全長にわたって逆相補配列を有する両野生型ITRである単一のceDNAゲノムまたはceDNAベクター内のWT-ITRの対を指す。例えば、変化が配列の特性および全体的な3次元構造に影響を及ぼさない限り、天然に存在するカノニカル配列から逸脱する1つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ITRが野生型の配列であるとみなすことができる。いくつかの態様では、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、カノニカル配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性(例えば、デフォルト設定でBLASTを使用して測定される)を有し、またそれらの3次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のWT-ITRに対して対称な3次元空間構成を有する。実質的に対称なWT-ITRは、3次元空間で同じA、C-C’、およびB-B’ループを有する。実質的に対称なWT-ITRは、適切なRepタンパク質と対合する操作可能なRep結合部位(RBEまたはRBE’)および末端分解部位(TRS)を有することを決定することによって、WTとして機能的に確認することができる。任意選択的に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。
本明細書で使用される場合、「修飾型ITR」または「mod-ITR」または「変異ITR」の語句は、本明細書で交換可能に使用され、同じ血清型からのWT-ITRと比較して、少なくとも1つ以上のヌクレオチドに変異を有するITRを指す。変異は、同じ血清型のWT-ITRの3次元空間構成と比較して、ITRのA、C、C’、B、B’領域のうちの1つ以上の変化をもたらし、3次元空間構成(すなわち、幾何学的空間におけるその3次元構造)の変化をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「非対称ITR対」とも呼ばれる「非対称ITR」という用語は、全長にわたって逆相補体ではない単一のceDNAゲノムまたはceDNAベクター内のITRの対を指す。非限定的な一例として、非対称ITR対は、それらの3次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ITRに対して対称の3次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のITR対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、3次元空間でのそれらのA、C-C’、およびB-B’ループの構成が異なる(例えば、同族ITRと比較して、1つのITRは、短いC-C’アームおよび/または短いB-B’アームを有し得る)。2つのITR間の配列の相違は、1つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、または点変異に起因し得る。一実施形態では、非対称ITR対の一方のITRは、野生型AAV ITR配列であり得、他方のITRは、本明細書で定義される修飾型ITR(例えば、非野生型または合成ITR配列)であり得る。別の実施形態では、非対称ITR対のどちらのITRも野生型AAV配列ではなく、2つのITRは、幾何学的空間において異なる形状(すなわち、異なる全体的な幾何学的構造)を有する修飾型ITRである。いくつかの実施形態では、非対称ITR対の一方のmod-ITRは、短いC-C’アームを有することができ、他方のITRは、それらが同族の非対称mod-ITRと比較して、異なる3次元空間構成を有するように異なる修飾(例えば、単一アーム、または短いB-B’アーム等)を有し得る。
本明細書で使用される場合、「対称ITR」という用語は、野生型または変異型(例えば、野生型に対して修飾された)ディペンドウイルスITR配列であり、かつそれらの全長にわたって逆相補である、単一のceDNAゲノムまたはceDNAベクター内の一対のITRを指す。非限定的な一例において、両ITRは、AAV2からの野生型ITR配列である。別の例では、いずれのITRも野生型ITR AAV2配列ではなく(すなわち、修飾型ITRであり、変異ITRとも称される)、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、または点変異により、野生型ITRとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、ceDNAベクター中の発現カセットに対して5’(その上流)に位置するITRは、「5’ITR」または「左ITR」と称され、ceDNAベクター中の発現カセットに対して3’(その下流)に位置するITRは、「3’ITR」または「右ITR」と称される。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称の修飾型ITR」または「実質的に対称のmod-ITR対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する単一のceDNAゲノムまたはceDNAベクター内の修飾型ITRの対を指す。例えば、修飾型ITRは、変化が特性および全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆相補配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称とみなすことができる。非限定的な一例として、配列は、カノニカル配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性(デフォルト設定でBLASTを使用して測定される)を有し、またそれらの3次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ITRに対して対称な3次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称な修飾型ITR対は、3次元空間に構成された同じA、C-C’、およびB-B’ループを有する。いくつかの実施形態では、mod-ITR対からのITRは、異なる逆相補ヌクレオチド配列を有し得るが、依然として同じ対称な3次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のITRは、同じ全体的な3次元形状をもたらす変異を有する。例えば、mod-ITR対の1つのITR(例えば、5’ITR)は、1つの血清型に由来し得、他方のITR(例えば、3’ITR)は、異なる血清型に由来し得るが、両方が同じ対応する変異を有し得(例えば、5’ITRがC領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型3’ITRは、C’領域の対応する位置に欠失を有する)、それにより修飾型ITR対が同じ対称な3次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ITR対の各ITRは、AAV2およびAAV6の組み合わせなどの異なる血清型(例えば、AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、および12)に由来し得、1つのITRの修飾は、異なる血清型の同族のITRの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称な修飾型ITR対は、ITR間のヌクレオチド配列の相違が特性または全体的な形状に影響を与えず、それらが3次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ITR(mod-ITR)を指す。非限定的な例として、mod-ITRは、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)またはデフォルト設定のBLASTNなどの当該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、カノニカルmod-ITRに対して少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有し、またそれらの3次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称な3次元空間構成を有する。実質的に対称なmod-ITR対は、3次元空間で同じA、C-C’およびB-B’ループを有する。例えば、実質的に対称なmod-ITR対の修飾型ITRがC-C’アームの欠失を有する場合、同族のmod-ITRは、C-C’ループの対応する欠失を有し、またその同族のmod-ITRの幾何学的空間に同じ形状の残りのAおよびB-B’ループの同様の3次元構造を有する。
「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指す。一般に、配列ABCでは、Bの両側にAおよびCが隣接している。配置AxBxCについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前または後に続くが、隣接される配列と連続している、またはすぐ隣である必要はない。一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状二重鎖ceDNAベクターの各末端における末端反復を指す。
本明細書で使用される場合、「ceDNAゲノム」という用語は、少なくとも1つの逆位末端反復領域をさらに組み込む発現カセットを指す。ceDNAゲノムは、1つ以上のスペーサー領域をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ceDNAゲノムは、DNAの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミドまたはウイルスゲノムに組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ceDNAスペーサー領域」という用語は、ceDNAベクターまたはceDNAゲノム中の機能的要素を分離する介在配列を指す。いくつかの実施形態では、ceDNAスペーサー領域は、最適機能性のため所望の距離で2つの機能要素を保持する。いくつかの実施形態では、ceDNAスペーサー領域は、例えば、プラスミドまたはバキュロウイルス内のceDNAゲノムの遺伝的安定性を提供する、または増大させる。いくつかの実施形態では、ceDNAスペーサー領域は、クローニング部位などに便利な位置を提供することによって、ceDNAゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」、または既知のタンパク質(例えば、転写因子)結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をceDNAゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、末端分解部位と、上流転写調節要素との間に6mer、12mer、18mer、24mer、48mer、86mer、176merなどを挿入する。同様に、スペーサーを、ポリアデニル化シグナル配列と3’末端分解部位との間に組み込むことができる。
本明細書で使用される場合、「ceDNA-プラスミド」という用語は、分子間二重鎖としてceDNAゲノムを含むプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「ceDNA-バクミド」という用語は、E.coliにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてceDNAゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして操作し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指す。
本明細書で使用される場合、「ceDNA-バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてceDNAゲノムを含むバキュロウイルスを指す。
本明細書で使用される場合、「ceDNA-バキュロウイルス感染昆虫細胞」および「ceDNA-BIIC」という用語は、交換可能に使用され、ceDNA-バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞(限定されないが、昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)を含む)を指す。
本明細書で使用される場合、「閉端DNAベクター」という用語は、少なくとも1つの共有結合性閉端を有し、ベクターの少なくとも一部が分子内二重鎖構造を有する、カプシド不含DNAベクターを指す。
本明細書で使用される場合、「ceDNA」という用語は、合成またはその他の非ウイルス遺伝子導入のためのカプシド不含閉端直鎖状二本鎖(ds)二重鎖DNAを指す。ceDNAの詳細な説明は、2017年3月3日に出願されたPCT/US2017/020828の国際出願に記載されており、その全容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。細胞ベースの方法を使用して様々な逆位末端反復(ITR)配列および構成を含むceDNAベクターの産生のためのある特定の方法は、2018年9月7日に出願された国際出願第PCT/US18/49996号および2018年12月6日に出願された同第PCT/US2018/064242号の実施例1に記載されており、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。様々なITR配列および構成を含む合成ceDNAベクターの産生のためのある特定の方法は、例えば、2019年1月18日に出願された国際出願第PCT/US2019/14122号に記載されており、その全容は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ceDNAベクター」および「ceDNA」という用語は、交換可能に使用され、少なくとも1つの末端パリンドロームを含む閉端DNAベクターを指す。いくつかの実施形態では、ceDNAは、2つの共有結合性閉端を含む。
本明細書で使用される場合、「neDNA」または「ニックの入ったceDNA」という用語は、オープンリーディングフレーム(例えば、発現されるプロモーターおよび導入遺伝子)の5’上流のステム領域またはスペーサー領域に1~100塩基対のニックまたはギャップを有する閉端DNAを指す。
本明細書で使用される場合、「ギャップ」および「ニック」という用語は交換可能に使用され、本発明の合成DNAベクターの中断された部分を指し、その他の二本鎖ceDNAには一本鎖DNA部分のストレッチが作成される。ギャップは、二重鎖DNAの一本鎖の長さが1塩基対~100塩基対の長さであり得る。本明細書に記載される方法によって設計および作成された典型的なギャップ、ならびに該方法によって生成された合成ベクターは、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、または60bpの長さであり得る。本開示における例示的なギャップは、1bp~10bpの長さ、1~20bpの長さ、1~30bpの長さであり得る。
本明細書で使用される場合、「Rep結合部位」、「Rep結合要素」、「RBE」、および「RBS」は、交換可能に使用され、Repタンパク質(例えば、AAV Rep78またはAAV Rep68)の結合部位を指し、Repタンパク質による結合時に、Repタンパク質が、RBSを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実施することを可能にする。RBS配列およびその逆相補体は、一緒に単一RBSを形成する。RBS配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、AAV2で同定されたRBS配列である5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’(配列番号39)を含む。任意の既知のRBS配列は、他の既知のAAV RBS配列および他の天然に既知のまたは合成RBS配列を含む、本発明の実施形態において使用され得る。理論に束縛されるものではないが、Repタンパク質のヌクレアーゼドメインは、二重鎖ヌクレオチド配列GCTCに結合し、したがって2つの既知のAAV Repタンパク質は、二重鎖オリゴヌクレオチド、5’-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3’(配列番号39)に直接結合し、安定に組み立てられると考えられる。さらに、可溶性凝集配座異性体(すなわち、不定数の相互関連Repタンパク質)は解離し、Rep結合部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合する。各Repタンパク質は、各鎖上の窒素塩基およびホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は、配列特異性を提供するが、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非配列特異性または低配列特異性であり、タンパク質-DNA複合体を安定させる。
本明細書で使用される場合、「末端分解部位」および「TRS」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Repが、細胞DNAポリメラーゼ、例えばDNA polデルタまたはDNA polイプシロンを介してDNA伸長の基質として役立つ3’OHを生成する5’チミジンとのチロシン-ホスホジエステル結合を形成する領域を指す。代替的に、Rep-チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。いくつかの実施形態では、TRSは、最小限で非塩基対チミジンを包含する。いくつかの実施形態では、TRSのニッキング効率は、RBSからの同じ分子内のその距離によって少なくとも部分的に制御され得る。アクセプター基質が相補的ITRであるとき、得られる産物は、分子間二重鎖である。TRS配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、AAV2において同定されたヘキサヌクレオチド配列である5’-GGTTGA-3’(配列番号804)を含む。他の既知のAAV TRS配列、AGTT(配列番号085)、GGTTGG(配列番号806)、AGTTGG(配列番号807)、AGTTGA(配列番号808)などの他の天然の既知TRS配列または合成TRS配列、およびRRTTRR(配列番号809)などの他のモチーフを含む、任意の既知のTRS配列を、本発明の実施形態で使用することができる。
本明細書で使用される場合、「センス」および「アンチセンス」という用語は、ポリヌクレオチド上の構造要素の配向を指す。要素のセンスバージョンおよびアンチセンスバージョンは、互いの逆相補体である。
本明細書で使用される場合、「合成AAVベクター」および「AAVベクターの合成産生」という用語は、完全に無細胞環境でのAAVベクターおよびその合成産生方法を指す。
本明細書で使用される場合、「レポーター」は、検出可能な読み出しを提供するために使用することができるタンパク質を指す。レポーターは、一般に、蛍光、色、または発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞または生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定波長の光で励起されたときに細胞を蛍光させ、ルシフェラーゼは、細胞に光を産生する反応を触媒させ、β-ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産物に変換する。実験または診断目的のために有用な例示的なレポーターポリペプチドとしては、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ(LacZ)、アルカリホスファターゼ(AP)、チミジンキナーゼ(TK)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、および他の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ルシフェラーゼ、ならびに当該技術分野において周知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」という用語は、例えば、レポーターポリペプチドとして、あるいはより適切には、細胞を殺傷するポリペプチド、例えば毒素、または選択された薬剤もしくはその欠失で細胞を殺傷しやすくする薬剤として、検出可能な読み出しを提供するポリペプチドを指す。エフェクタータンパク質は、宿主細胞のDNAおよび/またはRNAを直接標的または損傷する任意のタンパク質またはペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質としては、宿主細胞DNA配列を標的とする制限エンドヌクレアーゼ(ゲノム因子であるか染色体外因子であるかにかかわらず)、細胞生存に必要なポリペプチドを標的とするプロテアーゼ、DNAギラーゼ阻害剤、およびリボヌクレアーゼ型毒素が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成生物的回路によって制御されるエフェクタータンパク質の発現は、別の合成生物的回路における因子として関与し得、それによって生物的回路系の反応性の範囲および複雑性を拡張する。
転写調節因子は、関心対象の遺伝子、例えば、インフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の1つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤)の転写を活性化または抑制する、転写アクチベーターおよびリプレッサーを指す。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸の領域である。転写アクチベーターは、典型的に、転写プロモーターの近くに結合し、RNAポリメラーゼを動員して転写を直接開始する。リプレッサーは、転写プロモーターに結合し、RNAポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨害する。他の転写調節因子は、それらが結合する場所、ならびに細胞条件および環境条件に応じて、アクチベーターまたはリプレッサーのいずれかとして役立ち得る。転写調節因子クラスの非限定例としては、ホメオドメインタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、翼状らせん(フォークヘッド)タンパク質、およびロイシン-ジッパータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「リプレッサータンパク質」または「誘導因子タンパク質」は、調節配列要素に結合するタンパク質であり、調節配列要素に作動可能に連結した配列の転写をそれぞれ抑制または活性化する。本明細書に記載される好ましいリプレッサーおよび誘導因子タンパク質は、少なくとも1つの入力剤または環境入力の存在または不在に敏感である。本明細書に記載される好ましいタンパク質は、例えば、分離可能なDNA結合および入力剤結合、または反応性要素もしくはドメインを含む形態のモジュールである。
本明細書で使用される場合、「担体」としては、ありとあらゆる溶媒、分散媒質、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが挙げられる。医薬活性物質に対するそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されたときに、毒性反応、アレルギー性反応、または同様の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「入力剤反応性ドメイン」は、条件または入力剤に結合するか、またはそうでなければ連結DNA結合融合ドメインをその条件もしくは入力の存在に対して反応性にするように、条件または入力剤に反応する転写因子のドメインである。一実施形態では、条件または入力の存在は、入力剤反応性ドメインまたはそれが融合するタンパク質の立体構造変化をもたらし、それが転写因子の転写調節活性を修飾する。
「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中または生物内で起こるアッセイまたはプロセスを指す。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法または使用は、細菌などの単細胞生物が使用されるときに「インビボ」で起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物または植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞(一次細胞および細胞株を含む)、形質転換細胞株、および抽出組織または細胞(血液細胞を含む)の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実施される方法および使用を指す。「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイおよび方法を指し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞または細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、タンパク質またはRNAをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指す。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る、遺伝子要素を含有し得る。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーター自体の発現を調節する転写因子の発現を駆動することができる。プロモーター配列内では、転写開始部位、ならびにRNAポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示されるceDNAベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。プロモーター配列は、その3’末端で転写開始部位によって結合され、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むように上流(5’配向)に伸びる。
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、1つ以上のタンパク質(例えば、活性因子タンパク質または転写因子)に結合して、核酸配列の転写活性化を増加させるシス作用性調節配列(例えば、50~1,500塩基対)を指す。エンハンサーは、それらが調節する遺伝子開始部位の上流または遺伝子開始部位の下流で最大1,000,000塩基対に位置付けられ得る。エンハンサーは、非関連遺伝子のイントロン領域内またはエクソン領域内に位置付けられ得る。
プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、または転写を駆動すると言うことができる。「作動可能に連結された」、「作動可能に位置付けられた」、「作動可能に連結された)、「制御下」、および「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置および/または配向にあり、その配列の転写開始および/または発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節する。さらに、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。
プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントおよび/またはエクソンの上流に位置する5’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子または配列と天然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、いくつかの実施形態では、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。
いくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組み換えプロモーター」または「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方が、その自然環境において作動可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。組み換えまたは異種エンハンサーは、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス性、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しない合成プロモーターまたはエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なる要素、および/または当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を改変する変異を含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路およびモジュールに関して、PCRを含む組み換えクローニングおよび/または核酸増幅技術を使用して産生され得る(例えば、米国特許第4,683,202号、米国特許第5,928,906号を参照されたく、各々は参照により本明細書に組み込まれる)。さらに、ミトコンドリア、クロロプラストなどの非核性細胞小器官内の配列の転写および/または発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。
本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子または誘導剤の存在下、それによって影響されるとき、またはそれによって接触されるときに、転写活性を開始または増強することによって特徴付けられるものである。本明細書に定義される場合、「誘導因子」または「誘導剤」は、内因性であり得るか、または誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方式で投与される、通常は外因性の化合物またはタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、誘導因子または誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、またはタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写または発現の結果であり得(すなわち、誘導因子は、別の構成要素またはモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る)、それ自体が誘導性プロモーターの制御下であり得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサーなどのある特定の薬剤の不在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、およびマウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復(MMTV-LTR))、ならびに他のステロイド反応性プロモーター、ラパマイシン反応性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で交換可能に使用される「DNA調節配列」、「制御要素」、および「調節要素」という用語は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写および翻訳制御配列を指し、これらは非コード配列(例えば、DNA標的化RNA)またはコード配列(例えば、部位特異的修飾ポリペプチドもしくはCas9/Csn1ポリペプチド)の転写を提供および/もしくは調節し、かつ/またはコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。
「作動可能に連結された」という語句は、そのように記載された構成要素が、それらが意図された様式で機能することを許可する関係にある並列を指す。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。「発現カセット」は、ceDNAベクターにおける導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモーターまたは他の調節配列に作動可能に連結されている異種DNA配列を含む。好適なプロモーターには、例えば、組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、AAV起源でもあり得る。
本明細書で使用される「対象」という用語は、本発明によるceDNAベクターでの予防的治療を含む治療が提供される、ヒトまたは動物を指す。通常、動物は、限定されないが、霊長類、げっ歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。飼育動物および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚、例えば、トラウト、ナマズ、およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類またはヒトである。対象は、男性または女性であり得る。追加として、対象は、幼児または子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児または胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患および障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。さらに、本明細書に記載される方法および組成物は、飼育動物および/またはペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、または民族グループ、例えば、コーカサス人(白人)、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、ラテンアメリカ系、中東系などであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者または他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、既に治療を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、胚、胎児、新生児、幼児、子供、青年、または成人である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胎児、ヒト新生児、ヒト幼児、ヒト子供、ヒト青年、またはヒト成人である。いくつかの実施形態では、対象は、動物胚、または非ヒト胚もしくは非ヒト霊長類胚である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胚である。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸構築物またはceDNA発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けやすい任意の細胞型を含む。非限定的な例として、宿主細胞は、単離された初代細胞、多能性幹細胞、CD34+細胞)、人工多能性幹細胞、またはいくつかの不死化細胞株(例えば、HepG2細胞)のいずれかであり得る。代替的に、宿主細胞は、組織、器官、または生物における原位置またはインビボの細胞であり得る。
「外因性」という用語は、その天然源以外の細胞中に存在する物質を指す。本明細書で使用される「外因性」という用語は、通常見られず、核酸またはポリペプチドをそのような細胞または生物に導入することが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸(例えば、ポリペプチドをコードする核酸)またはポリペプチドを指し得る。代替的に、「外因性」とは、それが比較的少量で見られ、細胞または生物における核酸またはポリペプチドの量を増加させること、例えば、異所性発現またはレベルをもたらすことが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸またはポリペプチドを指し得る。これとは対照的に、「内因性」という用語は、生物系または細胞に対して天然である物質を指す。
「配列同一性」という用語は、2つのヌクレオチド配列間の関連性を指す。本開示の目的のために、2つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,上記)、好ましくはバージョン3.0.0以降において実装されるように、Needleman-Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch,1970,上記)を使用して決定される。使用される任意のパラメータは、ギャップオープンペナルティ10、ギャップ拡張ペナルティ0.5、およびEDNAFULL(NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたNeedleの出力(-nobriefオプションを使用して取得される)は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される:(同一のデオキシリボヌクレオチド×100)/アラインメントの長さ-アラインメントにおけるギャップの総数)。アラインメントの長さは、好ましくは少なくとも10ヌクレオチド、好ましくは少なくとも25ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも100ヌクレオチドである。
本明細書で使用される「相同性」または「相同」という用語は、必要に応じて配列を整列させ、ギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、標的染色体上の対応する配列のヌクレオチド残基と同一であるヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。ヌクレオチド配列相同性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ClustalW2、またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当該技術分野の範囲内である様々な方式で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。いくつかの実施形態では、例えば相同性アームの核酸配列(例えば、DNA配列)は、配列が、宿主細胞の対応する未変性または未編集の核酸配列(例えば、ゲノム配列)と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上同一である場合、「相同」とみなされる。
本明細書で使用される「異種」という用語は、それぞれ天然の核酸またはタンパク質には見られないヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列(またはその変異体)に(例えば、遺伝子操作によって)連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。異種核酸配列は、変異体ポリペプチドに(例えば、遺伝子操作によって)連結されて、融合変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成し得る。
「ベクター」または「発現ベクター」は、細胞において結合されたセグメントの複製をもたらすために別のDNAセグメント、すなわち「挿入」が結合され得る、プラスミド、バクミド、ファージ、ウイルス、ビリオン、またはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、宿主細胞への送達のために、または異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物であり得る。本明細書で使用される場合、ベクターは、起源および/または最終形態でウイルス性または非ウイルス性であり得るが、本開示の目的のために、「ベクター」は、その用語が本明細書で使用されるとき、一般にceDNAベクターを指す。「ベクター」という用語は、適切な制御要素と関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝的要素を包含する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたは組み換えベクターであり得る。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのRNAまたはポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現される配列は、必ずしもそうではないが、細胞にとって異種であることが多い。発現ベクターは、追加の要素を含むことができ、例えば、発現ベクターは、2つの複製系を有することができるため、それを2つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、ならびにクローニングおよび増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。「発現」という用語は、RNAおよびタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写プロセシング、翻訳およびタンパク質の折りたたみ、修飾およびプロセシングを含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」には、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られたポリペプチドが含まれる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に作動可能に連結された場合に、インビトロまたはインビボでRNAに転写される核酸配列(DNA)を意味する。遺伝子には、コード領域の前後の領域、例えば、5’未翻訳(5’UTR)または「リーダー」配列および3’UTRまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント(エクソン)間の介在配列(イントロン)が含まれる場合と含まれない場合がある。
「組み換えベクター」とは、異種核酸配列を含むベクター、またはインビボで発現することができる「導入遺伝子」を意味する。本明細書に記載されるベクターは、いくつかの実施形態では、他の好適な組成物および療法と組み合わせることができることを理解されたい。いくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、対象における関心対象のヌクレオチドを高コピー数の染色体外DNAに維持し、それによって染色体組み込みの潜在的な影響を排除する手段を提供する。
本明細書で使用される「遺伝性疾患」という語句は、ゲノムの1つ以上の異常、特に出生時から存在する状態によって部分的または完全に、直接的または間接的に引き起こされる疾患を指す。異常は、変異、挿入、または欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を与える可能性がある。遺伝性疾患は、DMD、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症(LDL受容体欠損)、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性疾患、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコーニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、およびテイ・サックス病であり得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「阻害ポリヌクレオチド」は、第2の(標的)ポリヌクレオチドの発現(転写または翻訳)を低減または防止するDNAまたはRNA分子を指す。阻害ポリヌクレオチドには、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、および外部ガイド配列が含まれる。「阻害ポリヌクレオチド」という用語はさらに、DNAおよびRNA分子、例えばリボザイムをコードするDNA分子などの実際の阻害種をコードするRNAiを含む。
本明細書で使用される場合、RNAi分子、例えばsiRNAまたはmiRNAの活性に関する「遺伝子サイレンシング」または「遺伝子サイレンシングされた」とは、細胞における標的遺伝子(例えばNLRP3、AIM2またはカスパーゼ-1mRNA)のmRNAレベルにおいて、miRNAまたはRNA干渉分子が存在しない細胞で見られるmRNAレベルの少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%の低下を指す。好ましい一実施形態では、mRNAレベルは、少なくとも約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%低下する。
本明細書で使用される場合、「RNAi」という用語は、siRNAi、shRNAi、内因性マイクロRNA、および人工マイクロRNAを含むがこれらに限定されない、あらゆるタイプの干渉RNAを指す。例えば、RNAの下流プロセシングのメカニズムに関係なく、以前にsiRNAとして同定された配列が含まれる(すなわち、siRNAは、mRNAの切断をもたらす特定のインビボプロセシング方法を有すると考えられているが、そのような配列を本明細書に記載の隣接配列の状況におけるベクターに組み込むことができる)。「RNAi」という用語は、遺伝子サイレンシングRNAi分子、および遺伝子の発現を活性化するRNAiエフェクター分子の両方を含み得る。単なる一例として、いくつかの実施形態では、阻害する働きをする、または遺伝子サイレンシングのRNAi剤は、本明細書に開示される方法、キットおよび組成物において、例えば免疫応答(例えば、自然免疫応答)を阻害するために有用である。
本明細書で使用される場合、「含む(comprising)」または「含む(comprises)」という用語は、方法または組成物に必須であるが、必須であるか否かにかかわらず、不特定要素の包含に対して開かれている、その組成物、方法、およびそれぞれの構成要素(複数可)に関して使用される。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴(複数可)に物質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されてない任意の要素を除いて、本明細書に記載される組成物、方法、およびそれらのそれぞれの構成要素を指す。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、本発明の実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴(複数可)に物質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載される、および/または本開示などを読むことにより当業者に明らかとなるであろうタイプの1つ以上の方法、および/またはステップを含む。同様に、「または」という語は、文脈が別途明らかに示されない限り、「および」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記で説明される。省略形「例えば(e.g.)」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書では非限定例を示すように使用される。したがって、省略形「例えば(e.g.)」は、「例えば(for example)」と同義である。
作動例または別途示される場合を除いて、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。パーセンテージに関連して使用される「約」という用語は、±1%を意味する場合がある。本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、本発明の範囲は、それに限定されるべきではない。
本明細書に開示される本発明の代替的な要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーまたは本明細書で見られる他の要素との任意の組み合わせで参照および主張することができる。グループの1つ以上のメンバーは、利便性および/または特許性の理由から、グループに含める、またはグループから削除することができる。そのような任意の包含または削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修飾されたグループを含むとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されているすべてのマーカッシュグループの記述を満たす。
いずれかの態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される開示は、人間のクローン化プロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を修正するプロセス、産業もしくは商業目的でのヒト胚の使用、または人もしくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく苦しみを引き起こす可能性が高い動物、およびそのようなプロセスから生じる動物の遺伝的同一性を修飾するためのプロセスに関係しない。
本明細書では、本発明の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。
II.核酸
核酸は大きく、高電荷であり、急速に分解されて身体から排出され、一般に薬理学的特性は低い。なぜなら、身体にとって異物として認識され、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の標的になるためである。したがって、治療用核酸または研究目的に使用される核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはウイルスベクター)などの特定の核酸は、インビボで免疫応答を誘起することが多い。本開示は、対象レシピエントの低減した免疫応答状態で核酸の持続性を最大化することを通して発現レベルを増加させることにより、そのような免疫応答を改善、低減または排除し、核酸の効力を増強し得る医薬組成物および方法を提供する。これにより、遺伝子療法の過程で臓器損傷または他の毒性につながり得る潜在的な有害事象を最小限に抑えることができる。本明細書で提供される組成物および方法の多くは、核酸(例えば、治療用核酸または研究目的に使用される核酸)と併用した免疫応答(例えば、自然免疫応答)の特異的阻害剤の投与に関し、これにより、核酸の存在によって誘起される免疫応答(例えば、自然免疫応答)が低減される。
核酸は大きく、高電荷であり、急速に分解されて身体から排出され、一般に薬理学的特性は低い。なぜなら、身体にとって異物として認識され、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の標的になるためである。したがって、治療用核酸または研究目的に使用される核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはウイルスベクター)などの特定の核酸は、インビボで免疫応答を誘起することが多い。本開示は、対象レシピエントの低減した免疫応答状態で核酸の持続性を最大化することを通して発現レベルを増加させることにより、そのような免疫応答を改善、低減または排除し、核酸の効力を増強し得る医薬組成物および方法を提供する。これにより、遺伝子療法の過程で臓器損傷または他の毒性につながり得る潜在的な有害事象を最小限に抑えることができる。本明細書で提供される組成物および方法の多くは、核酸(例えば、治療用核酸または研究目的に使用される核酸)と併用した免疫応答(例えば、自然免疫応答)の特異的阻害剤の投与に関し、これにより、核酸の存在によって誘起される免疫応答(例えば、自然免疫応答)が低減される。
免疫原性/免疫刺激性核酸は、デオキシリボ核酸およびリボ核酸の両方を含むことができる。デオキシリボ核酸(DNA)の場合、特定の配列またはモチーフが哺乳動物の免疫刺激を誘導することが示されている。これらの配列またはモチーフには、CpGモチーフ、ピリミジンリッチ配列、およびパリンドローム配列が含まれるが、これらに限定されない。デオキシリボ核酸のCpGモチーフは、エンドソームのトール様受容体9(TLR-9)によって認識されることが多く、これが次に自然免疫刺激経路および獲得免疫刺激経路の両方を誘起する。特定の免疫刺激性リボ核酸(RNA)配列は、トール様受容体6および7(TLR-6およびTLR-7)に結合し、免疫応答(例えば、自然免疫応答)を通じて炎症誘発性応答を活性化すると考えられている。さらに、二本鎖RNAはTLR-3に結合するため、免疫刺激性であることが多い。したがって、外来核酸分子は、その起源が病原体由来であるか、または治療用であるかのいずれかであり、インビボで免疫原性が高い可能性がある。
免疫応答(例えば、自然免疫応答)のアンタゴニストと併用した潜在的な治療用途の核酸分子の特性評価および開発が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、必要に応じて、インビボ特性(送達、安定性、寿命、フォールディング、標的特異性)の改変および改善を目的としたオリゴヌクレオチドの化学修飾、ならびに治療適用と直接相関するそれらの生物学的機能およびメカニズムが、記載されている。
免疫刺激性であり得、かつ本明細書に開示される免疫抑制剤の使用を必要とし得る、本開示の例示的な治療用核酸としては、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、リボザイム、閉端二本鎖DNA(例えば、ceDNA、CELiD、直鎖状の共有結合的に閉じたDNA(「ミニストリング」)、doggybone(dbDNA(商標))DNA、プロテロメア閉端DNA、またはダンベル直鎖状DNA)、ダイサー基質dsRNA、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、非対称干渉RNA(aiRNA)、マイクロRNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、およびDNAウイルスベクター、ウイルスRNAベクター、ならびにそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
RNA干渉(RNAi)と呼ばれるプロセスを通じて特定のタンパク質の細胞内レベルを下方調節することができるsiRNAまたはmiRNAもまた、本発明によって核酸治療薬であると企図される。siRNAまたはmiRNAが宿主細胞の細胞質に導入された後、これらの二本鎖RNA構築物はRISCと呼ばれるタンパク質に結合することができる。siRNAまたはmiRNAのセンス鎖はRISC複合体によって除去される。RISC複合体は、相補的mRNAと結合すると、mRNAを切断し、切断された鎖を放出する。RNAiは、対応するタンパク質の下方調節をもたらすmRNAの特異的破壊を誘発することによるものである。
タンパク質へのmRNA翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)およびリボザイムは、核酸治療薬となり得る。アンチセンス構築物の場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質mRNAの配列に相補的な配列を有し、ワトソンは、クリック塩基対合によってmRNAに結合することができる。この結合は、標的mRNAの翻訳を防ぎ、かつ/またはmRNA転写産物のRNaseH分解を誘起する。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドは作用の特異性(すなわち、特定の疾患関連タンパク質の下方調節)を高めた。
本明細書で提供される方法のいずれにおいても、治療用核酸は治療用RNAであり得る。治療用RNAは、mRNA翻訳の阻害剤、RNA干渉(RNAi)の薬剤、触媒的に活性なRNA分子(リボザイム)、転移RNA(tRNA)、またはmRNA転写物(ASO)、タンパク質もしくは他の分子リガンドに結合するRNA(アプタマー)であり得る。本明細書で提供される方法のいずれにおいても、RNAiの薬剤は、二本鎖RNA、一本鎖RNA、マイクロRNA、短鎖干渉RNA、短鎖ヘアピンRNA、または三重らせん形成オリゴヌクレオチドであり得る。
いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は、閉端二本鎖DNA、例えば、ceDNAである。いくつかの実施形態によれば、細胞における治療用タンパク質の発現および/または産生は、非ウイルス性DNAベクター、例えば、ceDNAベクターに由来する。従来のAAVベクター、さらにはレンチウイルスベクターを超える、治療用タンパク質の発現に対するceDNAベクターの明確な利点は、所望のタンパク質をコードする異種核酸配列にサイズの制約がないことである。したがって、大きな治療用タンパク質でさえ、単一のceDNAベクターから発現することができる。したがって、ceDNAベクターを使用して、それを必要とする対象において治療用タンパク質を発現させることができる。
一般に、本明細書に開示されるような治療用タンパク質の発現のためのceDNAベクターは、5’から3’方向に、第1のアデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端反復(ITR)、関心対象のヌクレオチド配列(例えば、本明細書に記載されるような発現カセット)、および第2のAAV ITRを含む。ITR配列は、(i)少なくとも1つのWT ITRおよび少なくとも1つの修飾されたAAV逆位末端反復(mod-ITR)(例えば、非対称の修飾型ITR)、(ii)mod-ITR対が互いに対して異なる3次元空間構成を有する、2つの修飾型ITR(例えば、非対称の修飾型ITR)、または(iii)各WT-ITRが同じ3次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のWT-WT ITR対、または(iv)各mod-ITRが同じ3次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ITR対のうちのいずれかから選択される。
III.ceDNAベクター
いくつかの態様によれば、本開示は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体と併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)を提供する。いくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、WO2016/073799に記載されているように、合成ナノ担体中に過飽和量で存在する。いくつかの実施形態では、ceDNAベクターも同じナノ担体中に存在する。
いくつかの態様によれば、本開示は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体と併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)を提供する。いくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、WO2016/073799に記載されているように、合成ナノ担体中に過飽和量で存在する。いくつかの実施形態では、ceDNAベクターも同じナノ担体中に存在する。
いくつかの態様によれば、本開示は、1つ以上のTLR9アンタゴニストと併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を提供する。1つ以上のTLR9阻害オリゴヌクレオチドを部分的にコードする配列を含むceDNA構築物も本明細書で提供される。
いくつかの態様によれば、本開示は、1つ以上のcGASアンタゴニストと併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を提供する。1つ以上のcGAS阻害性RNAまたはタンパク質を部分的にコードする配列を含むceDNA構築物も本明細書に提供される。
いくつかの態様によれば、本開示は、1つ以上のインフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)と併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を提供する。1つ以上のインフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上、またはそれらの任意の組み合わせ)を部分的にコードする配列を含むceDNA構築物も本明細書に提供される。
理解されるように、本明細書に記載されるceDNAベクター技術は、任意のレベルの複雑さに適合させることができるか、モジュール方式で使用することができ、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の異なる成分、例えば、本明細書に記載される成分の発現が独立した様式で制御され得る。例えば、本明細書で設計されたceDNAベクター技術は、単一のceDNAベクターを使用して単一の異種遺伝子配列(例えば、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の単一阻害剤、例えば、本明細書に記載されるものなど)を発現させるような単純なものであり得るか、または複数のceDNAベクター(各ベクターは、複数の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤、例えば、本明細書に記載されるものなどを発現する)、もしくは1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤、例えば、本明細書に記載されるものなど、および例えば、異なるプロモーターによってそれぞれ独立して制御される関連補因子もしくはアクセサリータンパク質をコードする核酸配列を使用するような複雑なものであることが特に意図される。
一実施形態では、単一のceDNAベクターを使用して、インフラマソームアンタゴニストの単一成分(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)を発現することができる。代替的に、単一のceDNAベクターを使用して、複数の成分(例えば、少なくとも2つ)を発現することができ、例えば、2つ以上のNLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、および/または2つ以上のAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、および/または2つ以上のカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせ)を、各成分、例えば、補因子またはアクセサリータンパク質の適切な発現を保証するために任意でIRES配列(複数可)を使用して、単一のプロモーター(例えば、強力なプロモーター)の制御下で発現できる。
別の実施形態では、少なくとも2つの挿入物を含む単一のceDNAベクターも本明細書に企図され、各挿入物の発現はそれ自体のプロモーターの制御下にある。プロモーターは、同じプロモーターの複数のコピー、複数の異なるプロモーター、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。当業者が理解するように、多くの場合、複数のインフラマソームアンタゴニストを異なる発現レベルで発現させることが望ましく、したがって、発現される個々の成分の化学量論を制御して、細胞における効率的な発現、ならびにタンパク質の場合、タンパク質の折りたたみおよび組み合わせを確実にする。
いくつかの実施形態によれば、合成ceDNAは、二本鎖DNA分子からの切除を介して産生される。ceDNAベクターの合成産生は、2019年1月18日に出願された国際出願第PCT/US19/14122号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)の実施例2~6に記載される。二本鎖DNA分子の切除を伴う合成方法を使用してceDNAベクターを産生する1つの例示的な方法。手短に言えば、ceDNAベクターは、二本鎖DNA構築物を使用して生成され得る。例えば、PCT/US19/14122の図7A~8Eを参照されたい。いくつかの実施形態では、二本鎖DNA構築物はceDNAプラスミドであり、例えば、2018年12月6日に出願された国際特許出願第PCT/US2018/064242号の図6を参照されたい)。
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターを作製するための構築物は、本明細書に記載される調節スイッチを含む。
様々なオリゴヌクレオチドの集成を伴う合成方法を使用してceDNAベクターを産生する別の例示的な方法は、PCT/US19/14122の実施例3に提供されており、ceDNAベクターは、5´オリゴヌクレオチドおよび3´ITRオリゴヌクレオチドを合成し、ITRオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって産生される。PCT/US19/14122の図11Bは、5´ITRオリゴヌクレオチドおよび3´ITRオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする例示的な方法を示す。
合成方法を使用してceDNAベクターを産生する例示的な方法は、PCT/US19/14122の実施例4において提供され、センス発現カセット配列に隣接する2つのセンスITRを含む一本鎖の直鎖状DNAを使用し、アンチセンス発現カセットに隣接する2つのアンチセンスITRに共有結合し、次いで、この一本鎖の直鎖状DNAの末端をライゲーションして、閉端一本鎖分子を形成する。非限定的な一例は、一本鎖DNA分子を合成および/または産生し、分子の一部をアニーリングして、二次構造の1つ以上の塩基対合領域を有する単一の直鎖状DNA分子を形成し、次いで遊離5´および3´末端を互いにライゲーションして、閉じた一本鎖分子を形成する。
ceDNAベクター技術のさらなるバリエーションは、当業者によって想定され得るか、または従来のベクターを使用するタンパク質産生方法から適合され得る。
非ウイルス性カプシド不含DNAベクターは、許容宿主細胞において発現構築物(例えば、プラスミド、バクミド、バキュロウイルス、または組み込み細胞株)から産生することができる。例えば、2018年9月7日に出願された国際特許出願第PCT/US18/49996号に開示された実施例を参照、または合成産生を使用して、例えば、2018年12月6日に出願された国際特許出願第PCT/US19/14122号に開示された例を参照。各文献は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物において有用なceDNAベクターは、異種核酸、例えば2つの逆位末端反復(ITR)配列の間に位置付けられる導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ITRのうちの少なくとも1つは、野生型ITR配列(例えば、AAV ITR)と比較した欠失、挿入、および/または置換によって修飾され、ITRのうちの少なくとも1つは、機能性末端分解部位(TRS)およびRep結合部位を含む。一実施形態では、ITRの少なくとも1つは、対応するAAV ITR(例えば、野生型AAV2の場合、配列番号1、または配列番号51)に対して少なくとも1つのポリヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を有し、Repタンパク質の存在下で宿主細胞におけるDNAベクターの複製を誘導する。上記で論じたように、任意のITRを使用できる。例として、表1AにおけるceDNA構築物のITRは、修飾ITRおよびWT ITRである。しかしながら、本明細書では、2つの逆位末端反復(ITR)配列の間に位置付けられた異種核酸配列(例えば、導入遺伝子)を含むceDNAベクターが包含され、これらの用語が本明細書に定義されるように、ITR配列は、非対称ITR対または対称もしくは実質的に対称のITR対であり得る。本明細書に開示されるようなNLSを含むceDNAベクターは、(i)少なくとも1つのWT ITRおよび少なくとも1つの修飾型AAV逆位末端反復(mod-ITR)(例えば、非対称の修飾型ITR)、(ii)mod-ITR対が互いに対して異なる3次元空間構成を有する、2つの修飾型ITR(例えば、非対称の修飾型ITR)、または(iii)各WT-ITRが同じ3次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のWT-WT ITR対、または(iv)各mod-ITRが同じ3次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ITR対のうちのいずれかから選択されるITR配列を含み得、本開示の方法は、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、2018年9月7日出願の国際特許出願第PCT/US18/49996号(例えば、実施例1~4を参照)に開示される非対称ITRSを含むceDNAベクター、2018年12月6日出願の国際特許出願第PCT/US18/64242号(例えば、実施例1~7を参照)に開示される遺伝子編集用ceDNAベクター、または2019年2月14日出願の国際特許出願第PCT/US19/18016号(例えば、実施例1~4を参照)に開示される抗体もしくは融合タンパク質産生用ceDNAベクター、または2019年2月22日出願の国際特許出願第PCT/US19/18927号に開示される制御された導入遺伝子発現用ceDNAベクターを含むがこれに限定されない任意のceDNAベクターと同時投与するための本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の使用に関し、各文献は全体として参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を使用する本明細書に記載の方法および組成物は、合成的に産生されたceDNAベクター、例えば、2019年1月18日出願の国際出願第PCT/US19/14122号(参照により全体として本明細書に組み込まれる)に開示されている、ceDNA産生の無細胞または無昆虫システムで産生されるceDNAベクターとともに使用され得ることも想定される。
ceDNAベクターは、好ましくは、分子、例えば導入遺伝子の少なくとも一部にわたって二重鎖または自己相補的である。ceDNAベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、37℃で1時間超エキソヌクレアーゼ消化(例えば、ExoIまたはExoIII)に対して耐性であることが好ましい。宿主細胞(例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞)におけるRepタンパク質の存在は、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクターの産生を誘導する修飾型ITRを有するceDNAベクターポリヌクレオチドテンプレートの複製を促進する。共有結合性閉端分子は、複製中、許容細胞で蓄積し続け、Repタンパク質の存在下、標準複製条件下で、経時的に十分に安定であることが好ましく、例えば、少なくとも1pg/細胞、好ましくは少なくとも2pg/細胞、好ましくは少なくとも3pg/細胞、より好ましくは少なくとも4pg/細胞、さらにより好ましくは少なくとも5pg/細胞の量で蓄積する。
特に、一実施形態では、DNAベクターは、2つの異なるITR(例えば、AAV ITR)、およびITR間に位置付けられた関心対象のヌクレオチド配列(異種核酸、発現カセット)を含むポリヌクレオチドベクターテンプレート(例えば、発現構築物)を保有する細胞(例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞、例えば、293細胞など)を提供することにより産生され、ITRの少なくとも1つは、他のITRと比べて挿入、置換、または欠失を含む修飾型ITRである。本明細書に記載のポリヌクレオチドベクターテンプレートは、Rep結合部位(RBS;AAV2の場合、例えば、5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’)および機能的末端分解部位(TRS;例えば、5’-AGTT)を含む少なくとも1つの機能的ITRを含む。細胞は、ウイルスカプシドタンパク質を発現せず、ポリヌクレオチドベクターテンプレートは、ウイルスカプシドをコードする配列を欠いている。
Repの存在下で、少なくとも1つの修飾型ITRを有するベクターポリヌクレオチドテンプレートが複製して、ceDNAベクターを産生する。ceDNAベクターの産生は、2つのステップを経る。第1に、Repタンパク質を介したベクターバックボーン(例えば、プラスミド、バクミド、ゲノムなど)からのテンプレートの切除(「レスキュー」)、および第2に、切除されたベクターゲノムのRep媒介複製である。様々なAAV血清型のRepタンパク質およびRep結合部位は、当業者に周知である。当業者は、機能的ITRに結合して複製する血清型からRepタンパク質を選択することを理解する。
ベクターポリヌクレオチドを保有する細胞は、Repを既に含むか(例えば、誘導性repを有する細胞株)、Repを含むベクターで形質導入後、ceDNAベクターの複製および放出を可能にする条件下で増殖する。次いで、ceDNAベクターのDNAは、細胞から採取され、単離される。カプシド不含非ウイルス性DNAのceDNAベクターの存在は、DNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で細胞から単離されたベクターDNAを消化することと、消化されたDNA材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なDNAと比較して、直鎖状かつ連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を確認することとによって確認され得る。例えば、図6は、実施例に記載のこれらのベクターを産生するための一実施形態を使用して、複数のTTXプラスミド構築物からのceDNAベクターの産生を確認するゲルである。ceDNAベクターは、図4Dに関して考察されるように、ゲルの特徴的なバンドパターンによって確認される。図5Aおよび図5Bは、本明細書のプロセスによって産生された閉端ceDNAベクターの存在を同定するための一実施形態を示す図である。
ベクターポリヌクレオチド発現テンプレート(例えば、TTX-プラスミド、バクミドなど)、および/またはii)Repをコードするポリヌクレオチドは、トランスフェクション(例えば、リン酸カルシウム、ナノ粒子、またはリポソーム)、またはウイルスベクター、例えばHSVもしくはバキュロウイルスによる導入を含むが、これらに限定されない当業者に周知の任意の手段を用いて細胞に導入され得る。例えば、本発明のceDNAベクターを生成するために使用されるベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートは、プラスミド(例えば、TTX-プラスミド、例えば、図4Bを参照)、バクミド(例えば、TTX-バクミド)、および/またはバキュロウイルス(例えば、TTX-バキュロウイルス)であり得る。一実施形態では、TTX-プラスミドは、異種核酸(例えば、レポーター遺伝子または治療用核酸を含む発現カセット)を挿入できるITR間に作動可能に位置付けられた制限クローニング部位(例えば、配列番号7)を含む。
好ましい一実施形態では、本明細書に記載のceDNAベクターを作製するために使用される宿主細胞は昆虫細胞である。別の好ましい実施形態では、バキュロウイルスを使用して、Repタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ceDNAベクター用の非ウイルス性DNAベクターポリヌクレオチド発現構築テンプレートの両方を送達する。ceDNAベクターを入手し単離するためのプロセスの例は、図1~33に記載されている。
さらに別の態様では、本発明は、非ウイルスDNAベクターの産生に使用するため、本明細書に記載のDNAベクターポリヌクレオチド発現テンプレート(ceDNAベクターテンプレート)をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株を提供する。そのような細胞株を産生する方法は、Lee,L.et al.(2013)Plos One 8(8):e69879に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。好ましくは、Repタンパク質(例えば、実施例1に記載されているとおり)は、MOI3で宿主細胞に添加される。一実施形態では、宿主細胞株は無脊椎動物の細胞株、好ましくは昆虫Sf9細胞である。宿主細胞株が哺乳動物細胞株、好ましくは293細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し、ヘルペスウイルスなどの第2のベクターを使用して、Repタンパク質を細胞に導入することができ、Repの存在下でのceDNAベクターの切除および増幅を可能にする。
好ましくは、ceDNAは、Rep結合部位(RBS;AAV2の5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’、配列番号39)および末端分解部位(TRS;5’-AGTT)を含む1つ以上の機能的ITRポリヌクレオチド配列を含む。
カプシド不含ceDNAベクターは、WHP転写後調節要素(WPRE)およびBGHポリAなどのシス調節要素の特定の組み合わせをさらに含む発現構築物(例えば、TTX-プラスミド、TTX-バクミド、TTX-バキュロウイルス)から産生できる。発現構築物における使用のための好適な発現カセットは、ウイルスカプシドによって課されるパッケージング制約によって制限されない。本開示の発現カセットは、全体発現レベルならびに細胞特異性に影響を及ぼし得る、プロモーターを含む。導入遺伝子発現の場合、それらは、非常に活発なウイルス由来の最初期プロモーターを含み得る。発現カセットは、導入遺伝子発現を特定の細胞型に制限し、無秩序な異所性発現から生じる毒性効果および免疫応答を低減するために、組織特異的真核細胞プロモーターを含有し得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、CAGプロモーター(配列番号3)などの合成調節要素を含有し得る。CAGプロモーターは、(i)サイトメガロウイルス(CMV)初期エンハンサー要素(例えば、配列番号309)、(ii)プロモーター、ニワトリベータ-アクチン遺伝子の第1のエクソンおよび第1のイントロン、ならびに(iii)ウサギベータ-グロブリン遺伝子のスプライスアクセプターを含む。代替的に、例えば、発現カセットは、アルファ-1-アンチトリプシン(AAT)プロモーター(例えば、配列番号4)、肝臓特異的(LP1)プロモーター(例えば、配列番号5)、またはHAATプロモーター(例えば、配列番号135)またはヒト伸長因子-1アルファ(EF1-α)プロモーター(配列番号6)またはEF1-α断片(配列番号66)、またはMNDプロモーター(配列番号70)を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、1つ以上の構成的プロモーター、例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター(任意選択的にRSVエンハンサーを有する)、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター(任意選択的にCMVエンハンサーを有する)などを含む。代替的に、誘導性プロモーター、導入遺伝子の未変性プロモーター、組織特異的プロモーター、または当該技術分野において既知の様々なプロモーターを使用することができる。一実施形態では、遺伝子コード配列の内因性または天然のプロモーターが発現カセットで使用される。
ceDNAベクターを使用する誘導性遺伝子編集は、例えば、Dow et al.Nat Biotechnol 33:390-394(2015)、Zetsche et al.Nat Biotechnol 33:139-42(2015)、Davis et al.Nat Chem Biol 11:316-318(2015)、Polstein et al.Nat Chem Biol 11:198-200(2015)、および/またはKawano et al.Nat Commun 6:6256(2015)に記載される方法を使用して実施でき、文献の各内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。発現カセットは、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後要素、特にウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節要素(WPRE)(配列番号72)も含み得る。他の転写後プロセシング要素、例えば、単純ヘルペスウイルスまたはB型肝炎ウイルス(HBV)のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後要素が使用され得る。発現カセットは、当該技術分野において既知のポリアデニル化配列またはその変形、例えば、ウシBGHpAもしくはウイルスSV40pA(例えば、配列番号10)から単離された天然、または合成を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、SV40後期ポリAシグナル上流エンハンサー(USE)配列を含み得る。USEは、SV40pAまたは異種ポリAシグナルと組み合わせて使用され得る。
本明細書に記載されるDNAベクターを細胞から採取および収集するための時間は、DNAベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖などを考慮して選択され得る。通常、細胞は、DNA-ベクター(例えば、TTX-ベクター)を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大半がウイルス毒性のために死滅し始める前に採取され得る。DNA-ベクターは、例えば、Qiagen Endo-Free(商標)プラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法はまた、DNA-ベクターに対して適合され得る。一般に、当該技術分野において既知の任意の核酸精製方法が採用され得る。
本明細書に記載されるDNAベクターを細胞から採取および収集するための時間は、DNAベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖などを考慮して選択され得る。通常、細胞は、DNA-ベクター(例えば、TTX-ベクター)を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大半がウイルス毒性のために死滅し始める前に採取され得る。DNA-ベクターは、例えば、Qiagen Endo-Free(商標)プラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法はまた、DNA-ベクターに対して適合され得る。一般に、当該技術分野において既知の任意の核酸精製方法が採用され得る。
調節配列およびエフェクター
実施形態では、ceDNAベクターは、治療用タンパク質をコードする1つ以上のヌクレオチド配列に加えて、第2のヌクレオチド配列(例えば、調節配列)を含む。実施形態では、遺伝子調節配列は、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。実施形態では、調節配列は、宿主細胞における治療用タンパク質の発現を制御するのに適している。実施形態では、調節配列は、本開示の治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列などのプロモーター配列に操作可能に連結された遺伝子の転写を指示することができる、好適なプロモーター配列を含む。実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列の5’末端に連結されたイントロン配列を含む。実施形態では、エンハンサー配列がプロモーターの上流に提供されて、プロモーターの効力を増大させる。実施形態では、調節配列は、エンハンサーおよびプロモーターを含み、第2のヌクレオチド配列は、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン配列を含み、イントロンは、1つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含み、プロモーターは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている。実施形態では、使用される調節配列は、ベクター内のコード配列に固有のものである。
実施形態では、ceDNAベクターは、治療用タンパク質をコードする1つ以上のヌクレオチド配列に加えて、第2のヌクレオチド配列(例えば、調節配列)を含む。実施形態では、遺伝子調節配列は、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。実施形態では、調節配列は、宿主細胞における治療用タンパク質の発現を制御するのに適している。実施形態では、調節配列は、本開示の治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列などのプロモーター配列に操作可能に連結された遺伝子の転写を指示することができる、好適なプロモーター配列を含む。実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列の5’末端に連結されたイントロン配列を含む。実施形態では、エンハンサー配列がプロモーターの上流に提供されて、プロモーターの効力を増大させる。実施形態では、調節配列は、エンハンサーおよびプロモーターを含み、第2のヌクレオチド配列は、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン配列を含み、イントロンは、1つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含み、プロモーターは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている。実施形態では、使用される調節配列は、ベクター内のコード配列に固有のものである。
プロモーター:上記のものを含む好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得、したがってウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは、原核生物または真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のRNAポリメラーゼ(例えば、polI、polII、polIII)によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、SV40初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端配列(LTR)プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP);単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、例えばCMV最初期プロモーター領域(CMVIE)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、ヒトU6小核プロモーター(U6、例えば、配列番号18(Miyagishi et al.,Nature Biotechnology 20,497-500(2002))、強化U6プロモーター(例えば、Xia et al.,Nucleic Acids Res.2003 Sep.1;31(17))、ヒトH1プロモーター(H1)(例えば、配列番号19)、CAGプロモーター、ヒトα1-抗トリプシン(HAAT)プロモーター(例えば、配列番号135)などが挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、これらのプロモーターは、それらの下流イントロン含有端で改変されて、1つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位(複数可)を含有するDNAは、プロモーターDNAに対して外来である。
プロモーターは、1つ以上の特定の転写調節配列を含むことにより、発現をさらに増強する、および/またはその空間的発現および/または時間的発現を改変することができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素を含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織または器官に関して、または発現が起こる発達段階に関して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、または誘導剤などの外部刺激に応答して、構成的または示差的に遺伝子成分の発現を調節し得る。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージT7プロモーター、バクテリオファージT3プロモーター、SP6プロモーター、lacオペレータープロモーター、tacプロモーター、SV40後期プロモーター、SV40初期プロモーター、RSV-LTRプロモーター、CMV IEプロモーター、SV40初期プロモーターまたはSV40後期プロモーターおよびCMV IEプロモーター、ならびに以下に列挙されるプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターおよび/またはエンハンサーを使用して、関心対象の任意の遺伝子、例えば、遺伝子編集用分子、ドナー配列、治療用タンパク質など)を発現させることができる。例えば、ベクターは、治療用タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されるプロモーターを含み得る。治療用タンパク質コード配列に操作可能に連結されたプロモーターは、シミアンウイルス40(SV40)由来のプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)プロモーター、例えば、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)の長い末端反復(LTR)プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス(ALV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、例えば、CMV最初期プロモーター、エプスタインバーウイルス(EBV)プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトユビキチンC(hUbC)、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然または合成の、組織特異的プロモーター、例えば、肝臓特異的プロモーター、例えば、ヒトα1-アンチタイプシン(HAAT)であり得る。一実施形態では、肝臓への送達は、肝細胞の表面上に存在する低密度リポタンパク質(LDL)受容体を介して、肝細胞へのceDNAベクターを含む組成物の内因性ApoE特異的標的を使用して達成され得る。
一実施形態では、使用されるプロモーターは、治療用タンパク質をコードする遺伝子の未変性プロモーターである。治療用タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子のプロモーターおよび他の調節配列は既知であり、特徴付けられている。使用されるプロモーター領域は、1つ以上の追加の調節配列(例えば、未変性)、例えば、エンハンサーをさらに含み得る。
本発明に従って使用するための好適なプロモーターの非限定例としては、例えば、(配列番号3)のCAGプロモーター、HAATプロモーター(配列番号135)、ヒトEF1-αプロモーター(配列番号6)、またはEF1-αプロモーター(配列番号66)およびラットEF1-αプロモーター(配列番号310)の断片が挙げられる。
エンハンサー:いくつかの実施形態では、インフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の1つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤)を発現するceDNAは、1つ以上のエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、プロモーター配列の5’に位置する。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、プロモーター配列の3’に位置する。例示的なエンハンサーは、本明細書の表1に列挙される。
5’UTR配列およびイントロン配列:いくつかの実施形態では、ceDNAベクターは、5’UTR配列および/または5’ITR配列の3’に位置するイントロン配列を含む。いくつかの実施形態では、5’UTRは、導入遺伝子、例えば、インフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の1つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤)をコードする配列の5’に位置する。表2Aに列挙される例示的な5’UTR配列。
3’UTR配列:いくつかの実施形態では、ceDNAベクターは、3’ITR配列の5’に位置する3’UTR配列を含む。いくつかの実施形態では、3’UTRは、導入遺伝子、例えば、インフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の1つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ1阻害剤)をコードする配列の3’に位置する。表2Bに列挙される例示的な3’UTR配列。
ポリアデニル化配列:ポリアデニル化配列をコードする配列は、本明細書に記載される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用にceDNAベクターに含まれ、ceDNAベクターから発現するmRNAを安定化し、ならびに核輸送および翻訳を援助し得る。一実施形態では、ceDNAベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、インフラマソームアンタゴニストの発現のためのceDNAベクターは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50以上のアデニンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約43ヌクレオチド、約40~50ヌクレオチド、約40~55ヌクレオチド、約45~50ヌクレオチド、約35~50ヌクレオチド、またはその間の任意の範囲を含む。
発現カセットは、当技術分野で既知の任意のポリアデニル化配列またはその変形を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化(ポリA)配列は、表3に列挙されたもののいずれかから選択される。当技術分野で一般的に知られている他のポリA配列も使用することができ、例えば、ウシBGHpA(例えば、配列番号9)またはウイルスSV40pA(例えば、配列番号10)から単離された天然に存在する配列、または合成配列を含むが、これらに限定されない。いくつかの発現カセットはまた、SV40後期ポリAシグナル上流エンハンサー(USE)配列を含み得る。いくつかの実施形態では、USE配列は、SV40pAまたは異種ポリAシグナルと組み合わせて使用され得る。ポリA配列は、インフラマソームアンタゴニストをコードする導入遺伝子の3’に位置している。
発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後要素を含み得る。いくつかの実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節要素(WPRE)(例えば、配列番号72)を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後プロセシング要素、例えば、単純ヘルペスウイルスまたはB型肝炎ウイルス(HBV)のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後要素を使用することができる。分泌配列は、導入遺伝子、例えば、VH-02およびVK-A26配列、例えば、配列番号950および配列番号951に連結され得る。
一実施形態では、ベクターポリヌクレオチド(ceDNAベクター)は、配列番号1および配列番号52、ならびに配列番号2および配列番号51からなる群から選択される1対の2つの異なるITRを含む。これらの態様のそれぞれの一実施形態では、ベクターポリヌクレオチドまたは共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクターは、配列番号101および配列番号102;配列番号103、および配列番号104、配列番号105、および配列番号106;配列番号107、および配列番号108;配列番号109、および配列番号110;配列番号111、および配列番号112;配列番号113および配列番号114;および配列番号115および配列番号116からなる群から選択される1対のITRを含む。いくつかの実施形態では、ceDNAベクターは、配列番号500~529から選択される任意の配列を含むITRを有しない。
本明細書に記載されるDNAベクターを細胞から採取および収集するための時間は、ceDNAベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖などを考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、DNA-ベクター(例えば、TTX-ベクター)を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大半がウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。DNA-ベクターは、Qiagen Endo-Freeプラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、DNAベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。
DNAベクターは、DNAの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ceDNAベクターは、DNA分子として精製される。別の実施形態では、ceDNAベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
一実施形態では、カプシド不含非ウイルス性DNAベクターは、第1のアデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端反復(ITR)、関心対象のヌクレオチド配列(例えば、外因性DNAの発現カセット)および修飾AAV ITRをこの順で含むポリヌクレオチドテンプレートを含むプラスミドを含むか、またはそれから得られ、テンプレート核酸分子は、AAVカプシドタンパク質コードを欠いている。さらなる実施形態では、本発明の核酸テンプレートは、ウイルスカプシドタンパク質をコードする配列を欠いている(すなわち、AAVカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている)。さらに、特定の実施形態では、テンプレート核酸分子はまた、AAV Repタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、本発明の核酸分子は、機能的なAAVキャップおよびAAV rep遺伝子の両方を欠いている。
一実施形態では、ceDNAベクターは、本明細書に開示される野生型AAV2 ITRに関して変異のITR構造を含み得るが、依然として操作可能なRBE、trs、およびRBE’部分を保持する。いくつかの実施形態では、ceDNAベクターは、配列番号500~529から選択される任意の配列を含むITRを有しない。
いくつかの実施形態では、インフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)をコードする導入遺伝子は、インフラマソームアンタゴニストがゴルジ体および小胞体に向かうように、分泌配列もコードし、そこから、インフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)は、ERを通過し細胞の外に出る場合に、シャペロン分子によって正しい立体構造に折りたたまれるであろう。例示的な分泌配列には、VH-02(配列番号950)およびVK-A26(配列番号951)およびIgκシグナル配列、ならびにタグ付きタンパク質が細胞質から分泌されるのを可能にするGluc分泌シグナル、タグ付きタンパク質をゴルジ体に向けるTMD-ST分泌配列が含まれるが、これらに限定されない。
核局在化配列:いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用のceDNAベクターは、1つ以上の核局在化配列(NLS)、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のNLSを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のNLSは、アミノ末端またはその近く、カルボキシ末端またはその近く、またはこれらの組み合わせ(例えば、アミノ末端における1つ以上のNLSおよび/またはカルボキシ末端における1つ以上のNLS)に位置する。2つ以上のNLSが存在する場合、各々を他のNLSから独立して選択することができ、それにより、単一のNLSが2つ以上のコピーに、および/または1つ以上のコピーに存在する1つ以上の他のNLSと組み合わせて存在する。NLSの非限定的な例を表4に示す。
調節スイッチ:分子調節スイッチは、シグナルに応答して、状態の測定可能な変化を生成するものである。免疫応答の阻害剤が、所望するとおりに発現するように(所望の発現レベルまたは発現量での免疫応答の阻害剤の発現を含む、または代わりに、特定のシグナルの有無に関わらず、細胞シグナル伝達事象を含むがこれらに限定されない)、調節スイッチを使用して、本明細書に記載されるように、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現を微調整することもできる。例えば、本明細書に記載されるように、特定の状態が発生した場合、ceDNAベクターからの免疫応答の阻害剤の発現をオンまたはオフにすることができる。いくつかの実施形態では、スイッチは、ceDNAベクターにおける免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現を制御可能かつ調節可能な様式で開始または停止(すなわち、シャットダウン)するように設計された「オン/オフ」スイッチである。いくつかの実施形態では、スイッチは、一旦スイッチが起動されると、ceDNAベクターを含む細胞がプログラム細胞死を受けるよう指示することができる「キルスイッチ」を含み得る。免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターでの使用に含まれる例示的な調節スイッチは、導入遺伝子の発現を調節するために使用することができ、国際出願第PCT/US18/49996号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)においてより詳細に論じられている。
(i)バイナリ調節スイッチ
いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターは、インフラマソームアンタゴニストの発現を制御可能に調整するのに役立ち得る調節スイッチを含む。例えば、ceDNAベクターのITR間に位置する発現カセットは、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤をコードする核酸配列に作動可能に連結された調節領域、例えば、プロモーター、シス要素、リプレッサー、エンハンサーなどを追加で含み、この調節領域は、1つ以上の補因子または外因性薬剤によって調節される。単なる例として、調節領域は、小分子スイッチまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターによって調節され得る。誘導性プロモーターの非限定的な例は、ホルモン誘導性または金属誘導性プロモーターである。他の例示的な誘導性プロモーター/エンハンサー要素としては、RU486誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターは、インフラマソームアンタゴニストの発現を制御可能に調整するのに役立ち得る調節スイッチを含む。例えば、ceDNAベクターのITR間に位置する発現カセットは、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤をコードする核酸配列に作動可能に連結された調節領域、例えば、プロモーター、シス要素、リプレッサー、エンハンサーなどを追加で含み、この調節領域は、1つ以上の補因子または外因性薬剤によって調節される。単なる例として、調節領域は、小分子スイッチまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターによって調節され得る。誘導性プロモーターの非限定的な例は、ホルモン誘導性または金属誘導性プロモーターである。他の例示的な誘導性プロモーター/エンハンサー要素としては、RU486誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
(ii)小分子調節スイッチ
様々な技術で知られる小分子系調節スイッチは、当技術分野において既知であり、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤と組み合わせて、調節スイッチによって制御されるceDNAベクターを形成することができる。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、直交リガンド/核受容体対、例えば、レチノイド受容体変異体/LG335およびGRQCIMFI(Taylor,et al.BMC Biotechnology 10(2010):15に開示されているものなどの、操作可能に連結された導入遺伝子の発現を制御する人工プロモーターとともに);操作されたステロイド受容体、例えば、プロゲステロンに結合することはできないが、RU486(ミフェプリストン)には結合するC末端切断を有する修飾型プロゲステロン受容体(米国特許第5,364,791号);Drosophilaからのエクジソン受容体およびそれらのエクジステロイドリガンド(Saez,et al.,PNAS,97(26)(2000),14512-14517)、またはSando R 3rd;Nat Methods.2013,10(11):1085-8に開示されるような抗生物質トリメトプリム(TMP)によって制御されるスイッチのうちのいずれか1つまたは組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ceDNAベクターによって発現される導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、米国特許第8,771,679号および同第6,339,070号に開示されるものなどのプロドラッグ活性化スイッチである。
様々な技術で知られる小分子系調節スイッチは、当技術分野において既知であり、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤と組み合わせて、調節スイッチによって制御されるceDNAベクターを形成することができる。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、直交リガンド/核受容体対、例えば、レチノイド受容体変異体/LG335およびGRQCIMFI(Taylor,et al.BMC Biotechnology 10(2010):15に開示されているものなどの、操作可能に連結された導入遺伝子の発現を制御する人工プロモーターとともに);操作されたステロイド受容体、例えば、プロゲステロンに結合することはできないが、RU486(ミフェプリストン)には結合するC末端切断を有する修飾型プロゲステロン受容体(米国特許第5,364,791号);Drosophilaからのエクジソン受容体およびそれらのエクジステロイドリガンド(Saez,et al.,PNAS,97(26)(2000),14512-14517)、またはSando R 3rd;Nat Methods.2013,10(11):1085-8に開示されるような抗生物質トリメトプリム(TMP)によって制御されるスイッチのうちのいずれか1つまたは組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ceDNAベクターによって発現される導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、米国特許第8,771,679号および同第6,339,070号に開示されるものなどのプロドラッグ活性化スイッチである。
(iii)「パスコード」調節スイッチ
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、「パスコードスイッチ」または「パスコード回路」であり得る。パスコードスイッチは、特定の条件が起こったときに、ceDNAベクターからの導入遺伝子の発現の制御の微調整を可能にする。すなわち、導入遺伝子の発現および/または抑制が起こるためには、条件の組み合わせが存在する必要がある。例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも条件AおよびBが起こらなければならない。パスコード調節スイッチは、任意の数の条件であり得、例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも2、または少なくとも3、または少なくとも4、または少なくとも5、または少なくとも6、または少なくとも7つ以上の条件が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも2つの条件(例えば、A、B条件)が起こる必要があり、いくつかの実施形態では、少なくとも3つの条件が起こる必要がある(例えば、A、B、およびCまたはA、B、およびD)。単なる例として、パスコード「ABC」調節スイッチを有するceDNAからの遺伝子発現が起こるためには、条件A、B、およびCが存在しなければならない。条件A、B、およびCは、以下のとおりであり得る。条件Aは、病態または疾患の存在であり、条件Bは、ホルモン反応であり、条件Cは、導入遺伝子の発現に対する反応である。例えば、導入遺伝子が欠陥EPO遺伝子を編集する場合、条件Aは、慢性腎疾患(CKD)の存在であり、条件Bは、対象が腎臓中に低酸素状態を有する場合に起こり、条件Cは、腎臓中のエリスロポエチン産生細胞(EPC)動員が不全であるか、または代替的に、HIF-2活性化が不全である。一旦酸素レベルが増加するか、または所望のEPOレベルに達すると、導入遺伝子は、3つの条件が起こるまで再度オフになり、オンに戻る。
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、「パスコードスイッチ」または「パスコード回路」であり得る。パスコードスイッチは、特定の条件が起こったときに、ceDNAベクターからの導入遺伝子の発現の制御の微調整を可能にする。すなわち、導入遺伝子の発現および/または抑制が起こるためには、条件の組み合わせが存在する必要がある。例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも条件AおよびBが起こらなければならない。パスコード調節スイッチは、任意の数の条件であり得、例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも2、または少なくとも3、または少なくとも4、または少なくとも5、または少なくとも6、または少なくとも7つ以上の条件が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも2つの条件(例えば、A、B条件)が起こる必要があり、いくつかの実施形態では、少なくとも3つの条件が起こる必要がある(例えば、A、B、およびCまたはA、B、およびD)。単なる例として、パスコード「ABC」調節スイッチを有するceDNAからの遺伝子発現が起こるためには、条件A、B、およびCが存在しなければならない。条件A、B、およびCは、以下のとおりであり得る。条件Aは、病態または疾患の存在であり、条件Bは、ホルモン反応であり、条件Cは、導入遺伝子の発現に対する反応である。例えば、導入遺伝子が欠陥EPO遺伝子を編集する場合、条件Aは、慢性腎疾患(CKD)の存在であり、条件Bは、対象が腎臓中に低酸素状態を有する場合に起こり、条件Cは、腎臓中のエリスロポエチン産生細胞(EPC)動員が不全であるか、または代替的に、HIF-2活性化が不全である。一旦酸素レベルが増加するか、または所望のEPOレベルに達すると、導入遺伝子は、3つの条件が起こるまで再度オフになり、オンに戻る。
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターにおける使用のために包含されるパスコード調節スイッチまたは「パスコード回路」は、生物学的封じ込め条件を定義するために使用される環境シグナルの範囲および複雑性を拡張するために、ハイブリッド転写因子(TF)を含む。既定条件の存在下で細胞死を誘起するデッドマンスイッチとは対照的に、「パスコード回路」は、特定の「パスコード」の存在下での細胞生存または導入遺伝子発現を可能にし、所定の環境条件またはパスコードが存在する場合にのみ導入遺伝子発現および/または細胞生存を可能にするように容易に再プログラムされ得る。
本明細書に開示される調節スイッチ、例えば、小分子スイッチ、核酸系スイッチ、小分子-核酸ハイブリッドスイッチ、転写後導入遺伝子調節スイッチ、翻訳後調節放射線制御スイッチ、低酸素媒介性スイッチ、および本明細書に開示される当業者に既知の他の調節スイッチのうちのいずれかおよびすべての組み合わせを、本明細書に開示されるパスコード調節スイッチにおいて使用することができる。使用のために包含される調節スイッチはまた、レビュー論文Kis et al.,J R Soc Interface.12:20141000(2015)において考察され、Kisの表1に要約されている。いくつかの実施形態では、パスコードシステムで使用するための調節スイッチは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願第PCT/US18/49996号の表11に開示されるスイッチのうちのいずれかまたはそれらの組み合わせから選択することができる。
(iv).導入遺伝子発現を制御するための核酸系調節スイッチ
いくつかの実施形態では、ceDNAによる免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現を制御するための調節スイッチは、核酸系制御機序に基づく。例示的な核酸制御機序は、当該技術分野において既知であり、使用が想定される。例えば、そのような機序としては、リボスイッチ、例えば、US2009/0305253、US2008/0269258、US2017/0204477、WO2018/026762A1、米国特許第9,222,093号、および欧州特許出願第EP288071号に開示されるもの、またVilla JK et al.,Microbiol Spectr.2018 May;6(3)によるレビューに開示されるものなどが挙げられる。WO2018/075486およびWO2017/147585に開示されるものなどの、代謝物反応性転写バイオセンサーもまた含まれる。使用が想定される他の当該技術分野において既知の機序としては、siRNAまたはRNAi分子(例えば、miR、shRNA)による導入遺伝子のサイレンシングが挙げられる。例えば、ceDNAベクターは、ceDNAベクターによって発現される導入遺伝子の一部に対して相補的であるRNAi分子をコードする調節スイッチを含み得る。導入遺伝子(例えば、インフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の1つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤))が、ceDNAベクターによって発現されたとしても、そのようなRNAiが発現する場合、相補的RNAi分子によってサイレンシングされ、導入遺伝子がceDNAベクターによって発現する際にRNAiが発現しない場合、導入遺伝子は、RNAiによってサイレンシングされない。
いくつかの実施形態では、ceDNAによる免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現を制御するための調節スイッチは、核酸系制御機序に基づく。例示的な核酸制御機序は、当該技術分野において既知であり、使用が想定される。例えば、そのような機序としては、リボスイッチ、例えば、US2009/0305253、US2008/0269258、US2017/0204477、WO2018/026762A1、米国特許第9,222,093号、および欧州特許出願第EP288071号に開示されるもの、またVilla JK et al.,Microbiol Spectr.2018 May;6(3)によるレビューに開示されるものなどが挙げられる。WO2018/075486およびWO2017/147585に開示されるものなどの、代謝物反応性転写バイオセンサーもまた含まれる。使用が想定される他の当該技術分野において既知の機序としては、siRNAまたはRNAi分子(例えば、miR、shRNA)による導入遺伝子のサイレンシングが挙げられる。例えば、ceDNAベクターは、ceDNAベクターによって発現される導入遺伝子の一部に対して相補的であるRNAi分子をコードする調節スイッチを含み得る。導入遺伝子(例えば、インフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の1つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤))が、ceDNAベクターによって発現されたとしても、そのようなRNAiが発現する場合、相補的RNAi分子によってサイレンシングされ、導入遺伝子がceDNAベクターによって発現する際にRNAiが発現しない場合、導入遺伝子は、RNAiによってサイレンシングされない。
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、US2002/0022018に開示されるような組織特異的自己不活化調節スイッチであり、これにより調節スイッチは、そうでなければ導入遺伝子発現が不利益となり得る部位において、導入遺伝子(例えば、インフラマソームアンタゴニスト)を意図的にスイッチオフする。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、US2014/0127162および米国特許第8,324,436号に開示されるリコンビナーゼ可逆的遺伝子発現系である。
(v).転写後および翻訳後調節スイッチ。
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターによる免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現を制御する調節スイッチは、転写後修飾システムである。例えば、そのような調節スイッチは、US2018/0119156、GB2011/07768、WO2001/064956A3、欧州特許第2707487号、およびBeilstein et al.,ACS Synth.Biol.,2015,4(5),pp526-534、Zhong et al.,Elife.2016 Nov 2;5.pii:e18858に開示されているように、テトラサイクリンまたはテオフィリンに感受性であるアプタザイムリボスイッチであり得る。いくつかの実施形態では、当業者であれば、導入遺伝子、およびリガンド感受性(オフスイッチ)アプタマーを含有し、その最終結果がリガンド感受性オンスイッチである、阻害性siRNAの両方をコードすることができると想定される。
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターによる免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現を制御する調節スイッチは、転写後修飾システムである。例えば、そのような調節スイッチは、US2018/0119156、GB2011/07768、WO2001/064956A3、欧州特許第2707487号、およびBeilstein et al.,ACS Synth.Biol.,2015,4(5),pp526-534、Zhong et al.,Elife.2016 Nov 2;5.pii:e18858に開示されているように、テトラサイクリンまたはテオフィリンに感受性であるアプタザイムリボスイッチであり得る。いくつかの実施形態では、当業者であれば、導入遺伝子、およびリガンド感受性(オフスイッチ)アプタマーを含有し、その最終結果がリガンド感受性オンスイッチである、阻害性siRNAの両方をコードすることができると想定される。
(vi).他の例示的な調節スイッチ
任意の既知の調節スイッチをceDNAベクターで使用して、環境変化によって誘起されるものを含む、ceDNAベクターによって免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現を制御することができる。追加の例としては、Suzuki et al.,Scientific Reports 8;10051(2018)のBOC方法、遺伝子コード拡張および非生理的アミノ酸、放射線制御型または超音波制御型オン/オフスイッチが挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Scott S et al.,Gene Ther.2000 Jul;7(13):1121-5、米国特許第5,612,318号、同第5,571,797号、同第5,770,581号、同第5,817,636号、およびWO1999/025385A1を参照)。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許第7,840,263号、US2007/0190028A1に開示される、埋め込み可能な系によって制御され、遺伝子発現は、ceDNAベクター中の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを活性化する電磁エネルギーを含む、1つ以上のエネルギー形態によって制御される。
任意の既知の調節スイッチをceDNAベクターで使用して、環境変化によって誘起されるものを含む、ceDNAベクターによって免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現を制御することができる。追加の例としては、Suzuki et al.,Scientific Reports 8;10051(2018)のBOC方法、遺伝子コード拡張および非生理的アミノ酸、放射線制御型または超音波制御型オン/オフスイッチが挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Scott S et al.,Gene Ther.2000 Jul;7(13):1121-5、米国特許第5,612,318号、同第5,571,797号、同第5,770,581号、同第5,817,636号、およびWO1999/025385A1を参照)。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許第7,840,263号、US2007/0190028A1に開示される、埋め込み可能な系によって制御され、遺伝子発現は、ceDNAベクター中の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを活性化する電磁エネルギーを含む、1つ以上のエネルギー形態によって制御される。
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターにおける使用が想定される調節スイッチは、低酸素媒介性またはストレス活性化スイッチ、例えば、WO1999/060142A2、米国特許第5,834,306号、同第6,218,179号、同第6,709,858号、US2015/0322410、Greco et al.,(2004)Targeted Cancer Therapies 9,S368に開示されるものなど、ならびにFROG、TOAD、およびNRSE要素、および条件的に誘導可能なサイレンス要素(例えば、米国特許第9,394,526号に開示される、低酸素反応要素(HRE)、炎症反応要素(IRE)、および剪断応力活性化要素(SSAE)を含む)である。そのような実施形態は、虚血後、または虚血性組織および/もしくは腫瘍において、ceDNAベクターからの導入遺伝子の発現をオンにするために有用である。
(vii).キルスイッチ
本明細書に記載の他の実施形態は、キルスイッチを含む、本明細書に記載の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターに関する。本明細書に開示されるキルスイッチは、ceDNAベクターを含む細胞が殺傷されるか、または導入されたceDNAベクターを対象の系から永久に除去する手段としてプログラム細胞死を受けるようにすることができる。免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現に対するceDNAベクターにおけるキルスイッチの使用が、対象が許容可能に喪失し得る限定数の細胞、またはアポトーシスが望ましい細胞型(例えば、癌細胞)へのceDNAベクターの標的化と典型的に結びつけられ得ることは、当業者によって理解されるであろう。すべての態様では、本明細書に開示される「キルスイッチ」は、入力生存シグナルまたは他の指定条件の不在下でceDNAベクターを含む細胞の急速かつ強固な細胞殺傷をもたらすように設計される。言い換えれば、本明細書に記載されるようなインフラマソームアンタゴニストの発現のためのceDNAベクターによりコードされるキルスイッチは、ceDNAベクターを含む細胞の細胞生存を、特定の入力シグナルによって定義される環境に制限し得る。生物学的封じ込め機能として役立つようなキルスイッチは、対象のインフラマソームアンタゴニストのceDNAベクター発現を除去すること、またはコードされたインフラマソームアンタゴニストを発現しないことを保証することが望ましいはずである。
本明細書に記載の他の実施形態は、キルスイッチを含む、本明細書に記載の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターに関する。本明細書に開示されるキルスイッチは、ceDNAベクターを含む細胞が殺傷されるか、または導入されたceDNAベクターを対象の系から永久に除去する手段としてプログラム細胞死を受けるようにすることができる。免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現に対するceDNAベクターにおけるキルスイッチの使用が、対象が許容可能に喪失し得る限定数の細胞、またはアポトーシスが望ましい細胞型(例えば、癌細胞)へのceDNAベクターの標的化と典型的に結びつけられ得ることは、当業者によって理解されるであろう。すべての態様では、本明細書に開示される「キルスイッチ」は、入力生存シグナルまたは他の指定条件の不在下でceDNAベクターを含む細胞の急速かつ強固な細胞殺傷をもたらすように設計される。言い換えれば、本明細書に記載されるようなインフラマソームアンタゴニストの発現のためのceDNAベクターによりコードされるキルスイッチは、ceDNAベクターを含む細胞の細胞生存を、特定の入力シグナルによって定義される環境に制限し得る。生物学的封じ込め機能として役立つようなキルスイッチは、対象のインフラマソームアンタゴニストのceDNAベクター発現を除去すること、またはコードされたインフラマソームアンタゴニストを発現しないことを保証することが望ましいはずである。
当業者に既知である他のキルスイッチは、本明細書に開示されるような、例えば、US2010/0175141、US2013/0009799、US2011/0172826、US2013/0109568に開示されるような免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクター、ならびにJusiak et al,Reviews in Cell Biology and molecular Medicine;2014;1-56、Kobayashi et al.,PNAS,2004;101;8419-9、Marchisio et al.,Int.Journal of Biochem and Cell Biol.,2011;43;310-319、およびReinshagen et al.,Science Translational Medicine,2018,11に開示されるキルスイッチでの使用に包含される。
したがって、いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)阻害剤の発現用ceDNAベクターは、エフェクター毒素またはレポータータンパク質をコードする核酸を含むキルスイッチ核酸構築物を含むことができ、エフェクター毒素(例えば、細胞死タンパク質)またはレポータータンパク質の発現は、所定の条件によって制御される。例えば、所定の条件は、例えば外因性物質などの環境物質の存在であり得、それがなければ、細胞はデフォルトでエフェクター毒素(例えば、細胞死タンパク質)の発現を起こして殺傷される。代替的な実施形態では、所定の条件は、2つ以上の環境物質の存在であり、例えば、細胞は、2つ以上の必要な外因性物質が供給された場合のみに生き残り、いずれもなければ、ceDNAベクターを含む細胞が殺傷される。
いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターは、ceDNAベクターを含む細胞を破壊するキルスイッチを組み込むように修飾され、ceDNAベクターによって発現する導入遺伝子のインビボ発現(例えば、インフラマソームアンタゴニストの発現)を効果的に終了させる。具体的には、ceDNAベクターは、通常の生理学的条件下で哺乳動物細胞では機能しないスイッチタンパク質を発現するようにさらに遺伝子操作される。このスイッチタンパク質を特異的に標的とする薬物または環境条件を投与したときのみ、スイッチタンパク質を発現する細胞が破壊され、それにより治療用タンパク質またはペプチドの発現を終了させる。例えば、HSV-チミジンキナーゼを発現する細胞は、ガンシクロビルおよびシトシンデアミナーゼなどの薬物を投与すると殺傷される可能性があると報告された。例えば、Dey and Evans,Suicide Gene Therapy by Herpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase(HSV-TK),in Targets in Gene Therapy,edited by You(2011)、およびBeltinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(15):8699-8704(1999)を参照されたい。いくつかの実施形態では、ceDNAベクターは、DISE(生存遺伝子排除によって誘導される死)と称されるsiRNAキルスイッチを含むことができる(Murmann et al.,Oncotarget.2017;8:84643-84658.Induction of DISE in ovarian cancer cells in vivo)。
別の実施形態では、ceDNAベクターから発現する免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、蛍光、酵素活性、分泌シグナル、または免疫細胞活性化因子などの追加の機能をさらに含む。
いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤をコードするceDNAは、例えば、リンカードメインをさらに含むことができる。本明細書で使用される場合、「リンカードメイン」は、本明細書に記載されるようなインフラマソームアンタゴニストのドメイン/領域のうちのいずれかを一緒に連結する、長さが約2~100アミノ酸のオリゴまたはポリペプチド領域を指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して自由に移動できるように、グリシンおよびセリンなどの柔軟な残基を含むか、またはそれらから構成され得る。2つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないようにすることが望ましい場合は、より長いリンカーを使用することができる。リンカーは、切断可能であるか、または切断不可能であり得る。切断可能なリンカーの例には、2Aリンカー(例えば、T2A)、2A様リンカーまたはそれらの機能的同等物、およびそれらの組み合わせが含まれる。リンカーは、Thosea asignaウイルスに由来するT2Aであるリンカー領域であり得る。
IV.ceDNAベクターの産生の方法
A.一般的な産生
本明細書で定義されるような非対称ITR対または対称ITR対を含む、例えば、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターを産生するための特定の方法は、2018年9月7日出願の国際出願第PCT/US18/49996号の第IV章に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるインフラマソームアンタゴニストの発現用ceDNAベクターは、本明細書に記載されるように、昆虫細胞を使用して産生され得る。代替的な実施形態では、本明細書に開示されるようなインフラマソームアンタゴニストの発現のためのceDNAベクターは、2019年1月18日に提出された国際出願第PCT/US19/14122号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に開示されるように、合成的に、またいくつかの実施形態では無細胞法で産生することができる。
A.一般的な産生
本明細書で定義されるような非対称ITR対または対称ITR対を含む、例えば、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターを産生するための特定の方法は、2018年9月7日出願の国際出願第PCT/US18/49996号の第IV章に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるインフラマソームアンタゴニストの発現用ceDNAベクターは、本明細書に記載されるように、昆虫細胞を使用して産生され得る。代替的な実施形態では、本明細書に開示されるようなインフラマソームアンタゴニストの発現のためのceDNAベクターは、2019年1月18日に提出された国際出願第PCT/US19/14122号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に開示されるように、合成的に、またいくつかの実施形態では無細胞法で産生することができる。
本明細書に記載されるように、一実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターは、例えば、a)ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート(例えば、ceDNA-プラスミド、ceDNA-バクミド、および/またはceDNA-バキュロウイルス)を保有する宿主細胞(例えば、昆虫細胞)の集団をインキュベートするステップであって、Repタンパク質の存在下では、宿主細胞内のceDNAベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、b)ceDNAベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含むプロセスによって取得され得る。Repタンパク質の存在は、修飾型ITRを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でceDNAベクターを産生する。しかしながら、ウイルス粒子(例えば、AAVビリオン)は発現されない。したがって、AAVまたは他のウイルス系ベクターにおいて天然に課されるものなどのサイズ制限はない。
宿主細胞から単離されたceDNAベクターの存在は、宿主細胞から単離されたDNAをceDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化することと、消化されたDNA材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なDNAと比較して直鎖状かつ連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を確認することとによって確認され得る。
さらに別の態様では、本発明は、例えば、Lee,L.et al.(2013)Plos One 8(8):e69879に記載されるように、非ウイルスDNAベクターの産生において、DNAベクターポリヌクレオチド発現テンプレート(ceDNAテンプレート)をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株の使用を提供する。好ましくは、Repは、約3のMOIで宿主細胞に付加される。宿主細胞株が哺乳動物細胞株、例えば、HEK293細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し得、ヘルペスウイルスなどの第2のベクターを使用して、Repタンパク質を細胞に導入することができ、Repおよびヘルパーウイルスの存在下でのceDNAの切除および増幅を可能にする。
一実施形態では、例えば、本明細書に記載される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターを作製するために使用される宿主細胞は、昆虫細胞であり、バキュロウイルスは、Repタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、例えば、図4A~4Dおよび実施例1に記載される、ceDNAの非ウイルス性DNAベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートとを両方送達するために使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Repタンパク質を発現するために操作される。
次いで、ceDNAベクターは、宿主細胞から採取され、単離される。本明細書に記載されるceDNAベクターを細胞から採取および収集するための時間は、ceDNAベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖などを考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、ceDNAベクターを産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大半がバキュロウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。DNA-ベクターは、Qiagen Endo-Freeプラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、DNA-ベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。
DNAベクターは、DNAの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ceDNAベクターは、DNA分子として精製される。別の実施形態では、ceDNAベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターの存在は、細胞から単離されたベクターDNAをDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化することと、消化されたDNA材料および未消化のDNA材料の両方をゲル電気泳動を使用して分析して、直鎖状かつ非連続的なDNAと比較して、直鎖状かつ連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を確認することとによって確認され得る。図4Cおよび図4Dは、本明細書におけるプロセスによって産生された閉端ceDNAベクターの存在を同定するための一実施形態を示す。
免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターの存在は、細胞から単離されたベクターDNAをDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化することと、消化されたDNA材料および未消化のDNA材料の両方をゲル電気泳動を使用して分析して、直鎖状かつ非連続的なDNAと比較して、直鎖状かつ連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を確認することとによって確認され得る。図4Cおよび図4Dは、本明細書におけるプロセスによって産生された閉端ceDNAベクターの存在を同定するための一実施形態を示す。
B.ceDNAプラスミド
ceDNA-プラスミドは、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターを後に産生するために使用されるプラスミドである。いくつかの実施形態では、ceDNA-プラスミドは、転写方向の作動可能に連結された構成要素として、少なくとも(1)修飾型5’ITR配列、(2)シス調節要素を含有する発現カセット、例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、調節スイッチ、エンハンサーなど、および(3)修飾型3’ITR配列(3’ITR配列は、5’ITR配列に対して非対称である)を提供する既知の技術を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、ITRによって隣接された発現カセットは、外因性配列を導入するためのクローニング部位を含む。発現カセットは、AAVゲノムのrepおよびcapコード領域を置き換える。
ceDNA-プラスミドは、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターを後に産生するために使用されるプラスミドである。いくつかの実施形態では、ceDNA-プラスミドは、転写方向の作動可能に連結された構成要素として、少なくとも(1)修飾型5’ITR配列、(2)シス調節要素を含有する発現カセット、例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、調節スイッチ、エンハンサーなど、および(3)修飾型3’ITR配列(3’ITR配列は、5’ITR配列に対して非対称である)を提供する既知の技術を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、ITRによって隣接された発現カセットは、外因性配列を導入するためのクローニング部位を含む。発現カセットは、AAVゲノムのrepおよびcapコード領域を置き換える。
一態様では、免疫反応(例えば、自然免疫反応)の阻害剤の発現用ceDNAベクターは、第1のアデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端反復(ITR)、導入遺伝子を含む発現カセット、および変異型または修飾型AAV ITRをこの順序でコードする「ceDNA-プラスミド」と本明細書において称されるプラスミドから取得され、当該ceDNA-プラスミドは、AAVカプシドタンパク質コード配列を欠いている。代替的な実施形態では、ceDNA-プラスミドは、第1の(または5’)修飾型または変異型AAV ITR、導入遺伝子を含む発現カセット、および第2の(または3’)修飾型AAV ITRをこの順序でコードし、当該ceDNA-プラスミドは、AAVカプシドタンパク質コード配列を欠いており、5’および3’ITRは、互いに対して対称である。代替的な実施形態では、ceDNA-プラスミドは、第1の(または5’)修飾型または変異型AAV ITR、導入遺伝子を含む発現カセット、および第2の(または3’)変異型または修飾型AAV ITRをこの順序でコードし、当該ceDNA-プラスミドは、AAVカプシドタンパク質コード配列を欠いており、5’および3’修飾型ITRは、同じ修飾を有する(すなわち、それらは互いに対して逆相補または対称である)。
さらなる実施形態では、ceDNA-プラスミド系は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている(すなわち、AAVカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている)。さらに、特定の実施形態では、ceDNA-プラスミドはまた、AAV Repタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、ceDNA-プラスミドは、機能的AAV capおよびAAV rep遺伝子(AAV2の場合GG-3’)に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列を欠いている。
本発明のceDNA-プラスミドは、当該技術分野において周知の任意のAAV血清型のゲノムの天然ヌクレオチド配列を使用して生成され得る。一実施形態では、ceDNA-プラスミド骨格は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ、およびAAV-DJ8ゲノムに由来する。例えば、NCBI:NC002077、NC001401、NC001729、NC001829、NC006152、NC006260、NC006261、Springerによって維持されるURLで入手可能なKotin and Smith,The Springer Index of Viruses(wwwウェブアドレス:oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04)(注記-URLまたはデータベースに対する参照は、本出願の有効な出願日現在のURLまたはデータベースの内容を指す)。特定の実施形態では、ceDNA-プラスミド骨格は、AAV2ゲノムに由来する。別の特定の実施形態では、ceDNA-プラスミド骨格は、これらのAAVゲノムのうちの1つに由来する5’および3’ITRに含まれるように遺伝子操作された合成骨格である。
ceDNA-プラスミドは、ceDNAベクター産生細胞株の確立における使用のための選択可能または選択マーカーを任意選択的に含み得る。一実施形態では、選択マーカーは、3’ITR配列の下流(すなわち、3’)に挿入され得る。別の実施形態では、選択マーカーは、5’ITR配列の上流(すなわち、5’)に挿入され得る。適切な選択マーカーは、例えば、薬物耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、例えば、ブラスチシジンS耐性遺伝子、カナマイシン、ゲネチシンなどであり得る。好ましい実施形態では、薬物選択マーカーは、ブラスチシジンS耐性遺伝子である。
インフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の1つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ1阻害剤)の発現のための例示的なceDNA(例えば、rAAV0)ベクターは、rAAVプラスミドから産生される。rAAVベクターの産生のための方法は、(a)宿主細胞に上記のようなrAAVプラスミドを提供することであって、宿主細胞およびプラスミドの両方が、カプシドタンパク質コード遺伝子を欠いている、提供することと、(b)ceDNAゲノムの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、(c)細胞を採取し、当該細胞から産生されたAAVゲノムを単離することと、を含み得る。
C.ceDNAプラスミドからceDNAベクターを作製する例示的な方法
免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用カプシド不含ceDNAベクターを作製するための方法、特にインビボ実験に十分なベクターを提供するために十分に高い収率を有する方法もまた、本明細書に提供される。
免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用カプシド不含ceDNAベクターを作製するための方法、特にインビボ実験に十分なベクターを提供するために十分に高い収率を有する方法もまた、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、免疫反応(例えば、自然免疫反応)の阻害剤の発現用ceDNAベクターを産生するための方法は、(1)発現カセットおよび2つの対称ITR配列を含む核酸構築物を宿主細胞(例えば、Sf9細胞)中に導入するステップと、(2)任意選択的に、例えば、プラスミド上に存在する選択マーカーを使用することによってクローン細胞株を確立するステップと、(3)Repコード遺伝子を(当該遺伝子を担持するバキュロウイルスでのトランスフェクションまたは感染のいずれかによって)当該昆虫細胞中に導入するステップと、(4)細胞を採取し、ceDNAベクターを精製するステップと、を含む。ceDNAベクターの産生のために上記の発現カセットおよび2つのITR配列を含む核酸構築物は、ceDNA-プラスミド、または下記のようにceDNAプラスミドで生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスの形態であり得る。核酸構築物は、トランスフェクション、ウイルス形質導入、安定した組み込み、または当該技術分野において既知の他の方法によって宿主細胞中に導入され得る。
D.細胞株:
免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターの産生において使用される宿主細胞株は、例えば、Sf9、Sf21などのSpodoptera frugiperdaもしくはTrichoplusia ni細胞に由来する昆虫細胞株、または他の無脊椎動物、脊椎動物、または哺乳動物細胞を含む他の真核細胞株を含み得る。当業者に既知の他の細胞株、例えば、HEK293、Huh-7、HeLa、HepG2、HeplA、911、CHO、COS、MeWo、NIH3T3、A549、HT1180、単球、ならびに成熟および未成熟樹状細胞を使用することもできる。宿主細胞株は、高収率のceDNAベクター産生のために、ceDNA-プラスミドの安定した発現のためにトランスフェクトされ得る。
免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターの産生において使用される宿主細胞株は、例えば、Sf9、Sf21などのSpodoptera frugiperdaもしくはTrichoplusia ni細胞に由来する昆虫細胞株、または他の無脊椎動物、脊椎動物、または哺乳動物細胞を含む他の真核細胞株を含み得る。当業者に既知の他の細胞株、例えば、HEK293、Huh-7、HeLa、HepG2、HeplA、911、CHO、COS、MeWo、NIH3T3、A549、HT1180、単球、ならびに成熟および未成熟樹状細胞を使用することもできる。宿主細胞株は、高収率のceDNAベクター産生のために、ceDNA-プラスミドの安定した発現のためにトランスフェクトされ得る。
CeDNA-プラスミドは、当該技術分野において既知の試薬(例えば、リポソーム、リン酸カルシウム)または物理的手段(例えば、電気穿孔)を使用し、一時的なトランスフェクションによってSf9細胞中に導入され得る。代替的に、ceDNA-プラスミドをそれらのゲノム中に安定して組み込んでいる安定したSf9細胞株が確立され得る。そのような安定した細胞株は、選択マーカーを上記のceDNA-プラスミド中に組み込むことによって確立され得る。細胞株をトランスフェクトするために使用されるceDNA-プラスミドが、抗生物質などの選択マーカーを含む場合、ceDNA-プラスミドでトランスフェクトされ、ceDNA-プラスミドDNAをそれらのゲノム中に組み込んでいる細胞は、細胞増殖培地への抗生物質の添加によって選択され得る。次いで、細胞の耐性クローンは、単一細胞希釈またはコロニー移動技術によって単離され、伝播され得る。
E.ceDNAベクターを単離し、精製する
ceDNAベクターを入手し、単離するためのプロセスの例は、図1~7および下記の特定の実施例に記載される。例えば、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNA-ベクターは、AAV Repタンパク質(複数可)を発現するプロデューサー細胞から得られ、ceDNA-プラスミド、ceDNA-バクミド、またはceDNA-バキュロウイルスでさらに形質転換され得る。ceDNAベクターの産生に有用なプラスミドには、インフラマソームアンタゴニストをコードするプラスミド、または1つ以上のRepタンパク質をコードするプラスミドが含まれる。
ceDNAベクターを入手し、単離するためのプロセスの例は、図1~7および下記の特定の実施例に記載される。例えば、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNA-ベクターは、AAV Repタンパク質(複数可)を発現するプロデューサー細胞から得られ、ceDNA-プラスミド、ceDNA-バクミド、またはceDNA-バキュロウイルスでさらに形質転換され得る。ceDNAベクターの産生に有用なプラスミドには、インフラマソームアンタゴニストをコードするプラスミド、または1つ以上のRepタンパク質をコードするプラスミドが含まれる。
一態様では、ポリヌクレオチドは、プラスミド(Rep-プラスミド)、バクミド(Rep-バクミド)、またはバキュロウイルス(Rep-バキュロウイルス)中のプロデューサー細胞に送達されたAAV Repタンパク質(Rep78もしくは68)をコードする。Rep-プラスミド、Rep-バクミド、およびRep-バキュロウイルスは、上記の方法によって生成され得る。
免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターを産生する方法は、例えば、本明細書に記載されている。本明細書に記載される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターを生成するために使用される発現構築物は、プラスミド(例えば、ceDNA-プラスミド)、バクミド(例えば、ceDNA-バクミド)、および/またはバキュロウイルス(例えば、ceDNA-バキュロウイルス)であり得る。単なる例として、ceDNA-ベクターは、ceDNA-バキュロウイルスおよびRep-バキュロウイルスに共感染した細胞から生成され得る。Rep-バキュロウイルスから産生されたRepタンパク質は、ceDNA-バキュロウイルスを複製して、ceDNA-ベクターを生成する。代替として、インフラマソームアンタゴニストの発現用のceDNAベクターは、Rep-プラスミド、Rep-バクミド、またはRep-バキュロウイルスで送達されるAAV Repタンパク質(Rep78/52)をコードする配列を含む構築物で安定してトランスフェクトされた細胞から生成され得る。ceDNA-バキュロウイルスは、細胞に一過性にトランスフェクトされ、Repタンパク質によって複製され、ceDNAベクターを産生し得る。
バクミド(例えば、ceDNA-バクミド)は、Sf9、Sf21、Tni(Trichoplusia ni)細胞、High Five細胞などの許容昆虫細胞中にトランスフェクトされ得、対称ITRおよび発現カセットを含む配列を含む組み換えバキュロウイルスである、ceDNA-バキュロウイルスを生成し得る。ceDNA-バキュロウイルスを昆虫細胞中に再度感染させて、次世代の組み換えバキュロウイルスを取得することができる。任意選択的に、このステップを一回または複数回繰り返して、より多い量の組み換えバキュロウイルスを産生することができる。
本明細書に記載される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターを細胞から採取および収集するための時間は、ceDNAベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖などを考慮して選択され得る。通常、細胞は、ceDNAベクター(例えば、ceDNAベクター)を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大半がウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取され得る。ceDNA-ベクターは、Qiagen ENDO-FREE PLASMID(登録商標)キットなどのプラスミド精製キットを使用して、Sf9細胞から単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ceDNAベクターに対して適合され得る。一般に、任意の当該技術分野において既知の核酸精製方法、ならびに市販のDNA抽出キットが採用され得る。
代替的に、細胞ペレットをアルカリ溶解プロセスに供し、得られた溶解物を遠心分離し、クロマトグラフィー分離を実施することによって、精製が実装され得る。1つの非限定例として、このプロセスは、核酸を保持するイオン交換カラム(例えば、SARTOBIND Q(登録商標))上に上清を装填し、次いで溶出し(例えば、1.2M NaCl溶液で)、ゲル濾過カラム(例えば、6高速流GE)上でさらなるクロマトグラフィー精製を実施することによって実施され得る。次いで、カプシド不含AAVベクターは、例えば、沈殿によって回収される。
いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターはまた、エキソソームまたは微粒子の形態で精製され得る。多くの細胞型が、膜微小胞の脱落を介して、可溶性タンパク質だけでなく、複合タンパク質/核酸カーゴも放出することは、当該技術分野において既知である(Cocucci et al,2009、EP10306226.1)。そのような小胞は、微小胞(微粒子とも称される)およびエキソソーム(ナノ小胞とも称される)を含み、それらの両方が、タンパク質およびRNAをカーゴとして含む。微小胞は、形質膜の直接出芽から生成され、エキソソームは、多小胞エンドソームと形質膜との融合時に細胞外環境に放出される。したがって、ceDNAベクターを含有する微小胞および/またはエキソソームは、ceDNAプラスミド、またはceDNAプラスミドで生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスで形質導入された細胞から単離され得る。
微小胞は、培養培地を20,000xgでの濾過または超遠心分離、および100,000xgでのエキソソームに供することによって単離され得る。超遠心分離の最適な期間は、実験的に決定することができ、小胞が単離される特定の細胞型に依存するであろう。好ましくは、培養培地は、最初に低速遠心分離(例えば、2000×gで5~20分間)によって一掃され、例えば、AMICON(登録商標)スピンカラム(Millipore(商標登録),Watford,UK)を使用し、スピン濃度に供される。微小胞およびエキソソームは、微小胞およびエキソソーム上に存在する特定の表面抗原を認識する特定の抗体を使用することによって、FACSまたはMACSを介してさらに精製され得る。他の微小胞およびエキソソーム精製方法としては、免疫沈殿、親和性クロマトグラフィー、濾過、および特定の抗体またはアプタマーでコーティングされた磁気ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。精製時に、小胞を、例えば、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。ceDNA含有小胞を送達するために微小胞またはエキソソームを使用する1つの利点は、これらの小胞が、それぞれの細胞型上の特定の受容体によって認識されるそれらの膜タンパク質上に含めることによって、様々な細胞型に標的化され得ることである。(EP10306226も参照)
本明細書における本発明の別の態様は、ceDNA構築物をそれら自体のゲノム中に安定して組み込んでいる宿主細胞株からceDNAベクターを精製する方法に関する。一実施形態では、ceDNAベクターは、DNA分子として精製される。別の実施形態では、ceDNAベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
国際出願第PCT/US18/49996号の図5は、実施例に記載される方法を使用して、複数のceDNAプラスミド構築物からceDNAの産生を確認するゲルを示す。ceDNAは、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される(図5Aを参照)。
V.医薬組成物および製剤
本発明は、治療用核酸および本明細書に記載の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の1つ以上の阻害剤を含む医薬組成物および製剤を意図する。いくつかの実施形態では、治療用核酸および免疫応答(例えば、自然免疫応答)の1つ以上の阻害剤を含む医薬組成物は薬学的に許容される賦形剤または担体を含み得る。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、閉端DNAベクター、例えば、本明細書に記載のceDNAベクターおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、閉端DNAベクター、例えば、本明細書に記載のceDNAベクターおよびTLR阻害剤(例えば、TLR9阻害剤)、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、本明細書に記載される閉端DNAベクター、例えばceDNAベクター、およびcGAS阻害剤、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、閉端DNAベクター、例えば、本明細書に記載のceDNAベクター、およびインフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
本発明は、治療用核酸および本明細書に記載の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の1つ以上の阻害剤を含む医薬組成物および製剤を意図する。いくつかの実施形態では、治療用核酸および免疫応答(例えば、自然免疫応答)の1つ以上の阻害剤を含む医薬組成物は薬学的に許容される賦形剤または担体を含み得る。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、閉端DNAベクター、例えば、本明細書に記載のceDNAベクターおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、閉端DNAベクター、例えば、本明細書に記載のceDNAベクターおよびTLR阻害剤(例えば、TLR9阻害剤)、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、本明細書に記載される閉端DNAベクター、例えばceDNAベクター、およびcGAS阻害剤、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、閉端DNAベクター、例えば、本明細書に記載のceDNAベクター、およびインフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
本明細書に開示されるDNAベクターは、対象の細胞、組織、または器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な医薬組成物に組み込むことができ、いくつかの実施形態では、該組成物は、本明細書に記載する免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を含む医薬組成物を含む。典型的に、医薬組成物は、本明細書に開示されるDNAベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。例えば、本発明のTTX-ベクターは、治療的投与(例えば、非経口投与)の所望の経路に好適な医薬組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。治療目的のための医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高TTX-ベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のTTX-ベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの1つまたは組み合わせと組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。
TTX-ベクターを含む薬学的に活性な組成物は、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化され得、その中の導入遺伝子の治療的発現をもたらす。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
本明細書に提供される組成物およびベクターを使用して、様々な目的のために導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産生物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的RNAをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的RNAをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳動物対象における疾患状態の治療または予防に有用である、1つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で患者に導入され得る(例えば、発現され得る)。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子編集分子(例えば、ヌクレアーゼ)である。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、CRISPR関連ヌクレアーゼ(Casヌクレアーゼ)である。
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の薬学的に活性な組成物は、抗ヒスタミン剤またはステロイドと併用して投与することができる。いくつかの実施形態によれば、抗ヒスタミン剤またはステロイドは、本明細書に記載の薬学的に活性な組成物と同じ組成物で投与される。いくつかの実施形態によれば、抗ヒスタミン剤またはステロイドは、本明細書に記載の薬学的に活性な組成物として別個の組成物で投与される。いくつかの実施形態によれば、抗ヒスタミン剤またはステロイドは、薬学的に活性な組成物と同時に投与される。いくつかの実施形態によれば、抗ヒスタミン剤またはステロイドは、薬学的に活性な組成物と連続して投与される。当技術分野で知られている任意の抗ヒスタミン剤を本明細書の実施形態で使用することができる。いくつかの実施形態によれば、抗ヒスタミン剤は、オンフェニラミン、ブクリジン、クロルフェニラミン、シンナリジン、クレマスチン、シクリジン、シプロヘプタジン、ジフェンヒドラミン、ジフェニルピラリン、ドキシラミン、メクロジン、フェニラミン、プロメタジン、トリプロリジン、アクリバスチン、アステミゾール、セチリジン、デスロラタジン、フェキソフェナジン、レボセチリジン、ロラタジン、ミゾラスチン、テルフェナジン、その薬学的に許容される塩、またはそれらの組み合わせのうちの1つ以上である。当技術分野で知られている任意のステロイドを本明細書の実施形態で使用することができる。いくつかの実施形態によれば、ステロイドは、フルオキシメステロン、メステロロン、メタンドロステノロン、ナンドロロン-ウンデカノエート、ナンドロロン-シプロネート、オキサンドロロン、オキシメトロン、ナンドロロン-ヘキシルオキシフェニルプロピオネート、テストステロン、プレドニゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン、デオキシコルチコステロン、アルドステロン、およびスタノゾロールのうちの1つ以上である。
治療目的のための医薬組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のceDNAベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの1つまたは組み合わせと組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。
単位投与量
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、単位剤形で提示され得る。単位剤形は、典型的に、医薬組成物の1つ以上の投与経路に適合されるであろう。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、または舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内または脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と複合され得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となるであろう。
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、単位剤形で提示され得る。単位剤形は、典型的に、医薬組成物の1つ以上の投与経路に適合されるであろう。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、または舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内または脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と複合され得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となるであろう。
IV.投与および投薬
本明細書で提供される開示では、本明細書に記載される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の少なくとも1つの阻害剤および核酸(例えば、治療用核酸、研究目的で使用される核酸)を対象に投与することにより、対象(例えば、ヒト対象)の望ましくない免疫応答(例えば、自然免疫応答)を防止、低減または排除するための方法が記載され、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の投与および核酸の投与は、2剤の投与が併用して提供される場合、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の調節を提供するために時間内に相関している。これらの2剤は、合剤で同時に、異なる製剤で同時に投与することも、または別個に異なる時間で投与することもできる。
本明細書で提供される開示では、本明細書に記載される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の少なくとも1つの阻害剤および核酸(例えば、治療用核酸、研究目的で使用される核酸)を対象に投与することにより、対象(例えば、ヒト対象)の望ましくない免疫応答(例えば、自然免疫応答)を防止、低減または排除するための方法が記載され、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の投与および核酸の投与は、2剤の投与が併用して提供される場合、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の調節を提供するために時間内に相関している。これらの2剤は、合剤で同時に、異なる製剤で同時に投与することも、または別個に異なる時間で投与することもできる。
一実施形態では、本明細書に開示される発現された免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、免疫系反応を引き起こさず、むしろ、阻害剤を発現するceDNAベクターの投与がない場合と比較して、対象の自然免疫系を少なくとも10%、または20%、または30%、または40%、または50%、または60%、または70%、または80%、または90%、または95%、または98%、または99%、または100%抑制する。
本明細書に記載の技術は、一般に、閉端DNAベクターを、1つ以上の免疫応答の阻害剤、例えば自然免疫応答)とともに対象に同時投与する方法を対象とし、阻害剤は、本明細書に記載するように、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、TLR(例えば、TLR9)の阻害剤、cGASの阻害剤、および1つ以上のインフラマソームアンタゴニスト(例えば、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤、またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つ以上)の1つ以上、またはこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、閉端DNAベクターには、本明細書に開示されるceDNAベクター、およびmRNA、アンチセンスRNAおよびオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉RNA(RNAi)、ダイサー基質dsRNA、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、非対称干渉RNA(aiRNA)、マイクロRNA(miRNA)、ミニサークルDNA、ミニ遺伝子、ウイルス性DNA(例えば、レンチウイルスまたはAAVゲノム)または非ウイルス性合成DNAベクター、閉端直鎖状二重鎖DNA(ceDNA/CELiD)、プラスミド、バクミド、doggybone(dbDNA(商標))DNAベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現(MIDGE)ベクター、非ウイルス性ミニストリングDNAベクター(直鎖状共有結合性閉鎖DNAベクター)、またはダンベル型DNA最小ベクター(「ダンベルDNA」)が含まれるが、これらに限定されない。(例えば、WO2010/0086626を参照。その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。いくつかの実施形態によれば、自然免疫応答の阻害剤および核酸は、任意の組み合わせで対象または患者に投与することができる。例えば、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の1つ以上の阻害剤を投与することができる。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、本明細書に記載の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤、および核酸(例えば、ミニサークル、ミニ遺伝子、ミニストリング共有結合性閉鎖DNA、doggybone(dbDNA(商標))DNA、ダンベル型DNA、直鎖状閉端二重鎖DNA(ceDNAおよびCELiD)、プラスミド系環状ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、RNAi、siRNA、mRNAなど)が投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、1つ以上のTLR9阻害剤および核酸を投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、1つ以上のcGAS阻害剤および核酸を投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、1つ以上のインフラマソームアンタゴニスト、および核酸を投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、1つ以上のTLR9阻害剤、1つ以上のcGAS阻害剤および核酸を投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、1つ以上のTLR9阻害剤、1つ以上のインフラマソームアンタゴニスト、および核酸を投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、1つ以上のTLR9阻害剤、1つ以上のcGAS阻害剤、および核酸を含むceDNAベクターを投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者には、1つ以上のTLR9阻害剤、1つ以上のcGAS阻害剤、1つ以上のインフラマソームアンタゴニスト、および核酸が投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、1つ以上のTLR9阻害剤、1つ以上のcGAS阻害剤、1つ以上のインフラマソームアンタゴニストおよび核酸を投与される。
いくつかの実施形態では、対象は、1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤および1つ以上の核酸(例えば、ミニサークル、ミニ遺伝子、ミニストリング共有結合性閉鎖DNA、doggybone(dbDNA(商標))DNA、ダンベル型DNA、直鎖状閉端二重鎖DNA(ceDNAおよびCELiD)、プラスミド系環状ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、RNAi、siRNA、mRNAなど)を同時に投与され得る。例えば、本方法は、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤および核酸治療薬を、2つの別個の製剤としてだが同時に、対象に投与することを含み得る。別の例では、本方法は、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤および治療用核酸を1つの製剤で同時に対象に同時投与することを含み得る。
いくつかの実施形態では、対象は、1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤および1つ以上の核酸(例えば、ミニサークル、ミニ遺伝子、ミニストリング共有結合性閉鎖DNA、doggybone(dbDNA(商標))DNA、ダンベル型DNA、直鎖状閉端二重鎖DNA(ceDNAおよびCELiD)、プラスミド系環状ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、RNAi、siRNA、mRNAなど)を連続して投与され得る。例えば、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、治療用核酸の投与前に投与され得る。
連続投与の場合、1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤とTNAの投与間に遅延期間があってもよい。例えば、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、TNA投与の数時間、数日、または数週間前に(例えば、核酸投与の少なくとも30分、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、少なくとも10時間、少なくとも11時間、少なくとも12時間、少なくとも13時間、少なくとも14時間、少なくとも15時間、少なくとも16時間、少なくとも17時間、少なくとも18時間、少なくとも19時間、少なくとも20時間、少なくとも21時間、少なくとも22時間、少なくとも23時間、少なくとも24時間、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約1週間、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間前、および少なくとも約4週間前)投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、TNA投与の約30分前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約1時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約2時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約3時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約4時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約5時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約6時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約7時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約8時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約9時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約10時間前に投与され得る。
一実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または24時間以下前に投与される。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約1日、約2日、約3日、約4日、約6日、または約7日以下前に投与することができる。
いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約30分、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または24時間後に投与することができる。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約1日、約2日、約3日、約4日、約6日、または約7日後に投与することができる。
一実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または24時間以下後に投与される。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、核酸投与の約1日、約2日、約3日、約4日、約6日、または約7日以下後に投与することができる。
いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の1つ以上の阻害剤を、核酸投与の前、同時、および/または後に複数回投与することができる。
いくつかの実施形態では、核酸(例えば、ceDNAベクター)は、単回投与または複数回投与として投与され得る。いくつかの実施形態によれば、2回用量以上を対象に投与することができる。ceDNAベクターは、ウイルスカプシドの不在に起因して、抗カプシド宿主免疫応答を誘起しないため、複数の用量を必要に応じて投与することができる。いくつかの実施形態によれば、投与される用量の数は、例えば、2~10以上の用量、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に開示される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤と併せて、複数回、投与および再投与することができる。例えば、治療用核酸は、初回投薬計画における核酸投与の前、後、または同時に投与される、1つ以上の免疫応答の阻害剤とともに、0日目に投与することができる。0日目の初回治療に続いて、核酸、好ましくは本明細書に開示される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を用いた初回治療の約1週間、約2週間、約3週間、約4週間、約5週間、約6週間、約7週間、約8週間、または約3ヶ月、約4ヶ月、約5ヶ月、約6ヶ月、約7ヶ月、約8ヶ月、約9ヶ月、約10ヶ月、約11ヶ月、または約1年、約2年、約3年、約4年、約5年、約6年、約7年、約8年、約9年、約10年、約11年、約12年、約13年、約14年、約15年、約16年、約17年、約18年、約19年、約20年、約21年、約22年、約23年、約24年、約25年、約26年、約27年、約28年、約29年、約30年、約31年、約32年、約33年、約34年、約35年、約36年、約37年、約38年、約39年、約40年、約41歳、約42年、約43年、約44年、約45年、約46年、約47年、約48年、約49年または約50年後に、2回目の投薬(再投与)を実施することができる。
いくつかの実施形態によれば、核酸の再投与は、核酸の発現の増加をもたらす。いくつかの実施形態によれば、初回投与後の核酸の発現と比較して、再投与後の核酸の発現の増加は、核酸の再投与後、約0.5倍~約10倍、約1倍~約5倍、約1倍~約2倍、または約0.5倍、約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、または約10倍高い。
一般に、投与量は、ceDNAベクターの特定の特性、発現効率、ならびに患者の年齢、状態、および性別によって異なるだろう。投与量は、当業者が決定でき、ceDNAベクターは反復投与を防止する免疫活性化カプシドタンパク質を含まないため、従来のAAVベクターとは異なって、合併症の場合には個々の医師により調整することもできる。
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示されるタンパク質の産生のための核酸(例えば、ceDNAベクター)の2回以上の投与(例えば、2、3、または4回以上の投与)を用いて、様々な間隔の期間にわたって、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年など、所望の遺伝子発現レベルを達成することができる。
本明細書に開示される実施形態のいずれかによれば、核酸は治療用核酸であり得る。
治療効果
自然免疫系を抑制または低減するための、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を発現するceDNAベクターの有効性は、熟練医師によって決定され得る。しかしながら、自然免疫応答の兆候または症状のいずれか1つまたはすべてが有益な方法で低減および/または改変される場合、または他の臨床的に許容される疾患の症状またはマーカーが、例えば、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤をコードするceDNAベクターを用いた治療後に少なくとも10%向上または改善される場合、「有効な治療」という用語が本明細書で使用されるように、治療は「有効な治療」とみなされる。例示的なマーカーおよび症状は、本明細書の実施例で考察されている。有効性はまた、疾患の安定化、または医療介入の必要性(すなわち、疾患の進行が停止するか、少なくとも遅くなる)によって評価される個人の悪化の失敗によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、かつ/または本明細書に記載されている。治療は、個人または動物(いくつかの非限定的な例としては、ヒトまたは哺乳動物が挙げられる)における疾患の任意の治療を含み、以下:(1)疾患を阻害すること、例えば、疾患もしくは障害の進行を停止もしくは遅延させること、または(2)疾患を緩和すること、例えば、症状の軽減を引き起こすこと、および(3)疾患の発症の可能性を防止もしくは低減すること、または疾患に関連する二次的疾患/障害、例えば、肝不全または腎不全を防止することを含む。疾患の治療のための有効量とは、それを必要とする哺乳動物に投与したとき、その用語が本明細書で定義されているように、その疾患に対して有効な治療をもたらすのに十分である量を意味する。
自然免疫系を抑制または低減するための、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を発現するceDNAベクターの有効性は、熟練医師によって決定され得る。しかしながら、自然免疫応答の兆候または症状のいずれか1つまたはすべてが有益な方法で低減および/または改変される場合、または他の臨床的に許容される疾患の症状またはマーカーが、例えば、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤をコードするceDNAベクターを用いた治療後に少なくとも10%向上または改善される場合、「有効な治療」という用語が本明細書で使用されるように、治療は「有効な治療」とみなされる。例示的なマーカーおよび症状は、本明細書の実施例で考察されている。有効性はまた、疾患の安定化、または医療介入の必要性(すなわち、疾患の進行が停止するか、少なくとも遅くなる)によって評価される個人の悪化の失敗によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、かつ/または本明細書に記載されている。治療は、個人または動物(いくつかの非限定的な例としては、ヒトまたは哺乳動物が挙げられる)における疾患の任意の治療を含み、以下:(1)疾患を阻害すること、例えば、疾患もしくは障害の進行を停止もしくは遅延させること、または(2)疾患を緩和すること、例えば、症状の軽減を引き起こすこと、および(3)疾患の発症の可能性を防止もしくは低減すること、または疾患に関連する二次的疾患/障害、例えば、肝不全または腎不全を防止することを含む。疾患の治療のための有効量とは、それを必要とする哺乳動物に投与したとき、その用語が本明細書で定義されているように、その疾患に対して有効な治療をもたらすのに十分である量を意味する。
薬剤の有効性は、所与の疾患に特有の物理的指標を評価することによって決定することができる。疾患指標の標準的な分析方法は、当技術分野で知られている。例えば、自然免疫系の物的指標には、例えば、血漿または血液中の可溶性CD14(sCD14)およびIL-18、IL-22、CSFまたは血液中のAIM2、NLRP3、NLRP1、ASCおよびカスパーゼ1などのインフラマソームタンパク質が含まれるが、これらに限定されず、サイトカイン経路の活性化は、NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の活性化、またはカスパーゼ1活性化の機能的な読み出しとして使用でき、インターロイキン(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-18、インターフェロン(IFN)-γ、インターフェロン(IFN)-α、単球化学誘因タンパク質(MCP)-1、および/または腫瘍壊死因子(TNF)-αなどのバイオマーカーが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ceDNAベクターは、本明細書に開示される、例えば、自然免疫系の抑制に機能的である免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を発現する核酸配列を含む。好ましい実施形態では、本明細書に開示される、例えば本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、免疫系反応を引き起こさず、むしろ、対象の免疫系を抑制または低減する。
治療目的のための医薬組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高濃度の閉端DNAベクター、例えばceDNAベクターに好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のceDNAベクターを、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの1つまたは組み合わせと組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。
本明細書に開示されるような、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および免疫反応(例えば、自然免疫反応)の阻害剤は、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内(例えば、筋肉内、心臓内)、肝内、腎臓内、脳内)、くも膜下腔内、膀胱内、結膜(例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、房内、および硝子体内)、蝸牛内、ならびに粘膜(例えば、経口、直腸、経鼻)投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。
いくつかの態様では、本明細書で提供される方法は、ceDNAベクターを含む1つ以上の閉端DNAベクター、および本明細書に記載される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を宿主細胞に送達することを含む。本明細書ではまた、そのような方法によって産生される細胞、およびそのような細胞を含むかまたはそのような細胞から産生される生物(動物、植物、または真菌など)も提供される。核酸の送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸複合体、裸のDNA、およびDNAでの薬剤強化取り込みが含まれ得る。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、同第4,946,787号、および同第4,897,355号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている(例えば、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。送達は、細胞(例えば、インビトロもしくはエクスビボ投与)または標的組織(例えば、インビボ投与)に対するものであり得る。
核酸を細胞に送達するための様々な技術および方法が、当該技術分野において既知である。例えば、本明細書に記載されるceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、およびラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、脂質ナノ粒子(LNP)、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、またはコアシェルナノ粒子に製剤化され得る。典型的に、LNPは、核酸(例えば、ceDNA)分子、1つ以上のイオン化またはカチオン性脂質(もしくはそれらの塩)、1つ以上の非イオン性または中性脂質(例えば、リン脂質)、凝集を防ぐ分子(例えば、PEGもしくはPEG-脂質複合体)、および任意選択的にステロール(例えば、コレステロール)で構成される。
本明細書に記載されるceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を細胞に送達するための別の方法は、細胞により内在化されるリガンドと核酸を結合させることによる。例えば、リガンドは、細胞表面上の受容体に結合し、エンドサイトーシスを介して内在化され得る。リガンドは、核酸中のヌクレオチドに共有結合され得る。核酸を細胞中に送達するための例示的な複合体は、例えば、WO2015/006740、WO2014/025805、WO2012/037254、WO2009/082606、WO2009/073809、WO2009/018332、WO2006/112872、WO2004/090108、WO2004/091515、およびWO2017/177326に記載されている。
核酸、および本明細書に記載されるようなceDNAベクターを含む閉端DNAベクターはまた、トランスフェクションによって細胞に送達され得る。有用なトランスフェクション方法としては、脂質媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー媒介性トランスフェクション、またはリン酸カルシウム沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクション試薬は、当該技術分野において周知であり、TurboFectトランスフェクション試薬(Thermo Fisher Scientific(登録商標))、Pro-Ject試薬(Thermo Fisher Scientific(登録商標))、TRANSPASS(商標)Pタンパク質トランスフェクション試薬(New England Biolabs(登録商標))、CHARIOT(商標)タンパク質送達試薬(Active Motif)、PROTEOJUICE(商標)タンパク質トランスフェクション試薬(EMD Millipore(登録商標))、293フェクチン、LIPOFECTAMINE(商標)2000、LIPOFECTAMINE(商標)3000(Thermo Fisher Scientific(登録商標))、LIPOFECTAMINE(商標)(Thermo Fisher Scientific(登録商標))、LIPOFECTIN(商標)(Thermo Fisher Scientific(登録商標))、DMRIE-C、CELLFECTIN(商標)(Thermo Fisher Scientific(登録商標))、OLIGOFECTAMINE(商標)(Thermo Fisher Scientific(登録商標))、LIPOFECTACE(商標)、FUGENE(商標)(Roche(登録商標),Basel,Switzerland)、FUGENE(商標)HD(Roche(登録商標))、TRANSFECTAM(商標)(Transfectam,Promega(登録商標),Madison,Wis.)、TFX-10(商標)(Promega(登録商標))、TFX-20(商標)(Promega(登録商標))、TFX-50(商標)(Promega(登録商標))、TRANSFECTIN(商標)(BioRad(登録商標),Hercules,Calif.)、SILENTFECT(商標)(Bio-Rad(登録商標))、Effectene(商標)(Qiagen(登録商標),Valencia,Calif.)、DC-chol(Avanti Polar Lipids)、GENEPORTER(商標)(Gene Therapy Systems(登録商標),San Diego,Calif.)、DHARMAFECT 1(商標)(Dharmacon(登録商標),Lafayette,Colo.)、DHARMAFECT 2(商標)(Dharmacon(登録商標))、DHARMAFECT 3(商標)(Dharmacon(登録商標))、DHARMAFECT 4(商標)(Dharmacon(登録商標))、ESCORT(商標)III(Sigma(登録商標),St.Louis,Mo.)、およびESCORT(商標)IV(Sigma Chemical Co.)が挙げられるが、これらに限定されない。ceDNAなどの核酸もまた、当業者に既知のマイクロフルイディクス方法を介して細胞に送達され得る。
本明細書に記載されるceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものであり、注入、注射、局所適用、および電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって使用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために2つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時であり、効果的な反応をもたらし得る。
本明細書に記載されるceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および自然免疫応答の阻害剤の導入のための方法は、例えば、米国特許第5,928,638号に記載されている方法により、例えば、造血幹細胞に送達することができる。
本明細書に記載されるceDNAベクターを含む閉端DNAベクターおよび免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、対象の細胞または標的器官への送達のためにリポソームに付加することができる。リポソームは、少なくとも1つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物/治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分(API)を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。例示的なリポソームおよびリポソーム製剤は、2018年9月7日に出願された国際出願第PCT/US2018/050042号および2018年12月6日に出願された国際出願第PCT/US2018/064242号に開示されている。例えば、「薬学的製剤」と題されるセクションを参照されたい。
当該技術分野で既知の様々な送達方法またはその修正を使用して、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤をインビトロまたはインビボで送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ceDNAベクターは、機械的、電気的、超音波、流体力学的、またはレーザー系エネルギーによって細胞膜に一時的な貫通を作製することによって送達され、それにより標的化細胞へのDNA進入が促進される。例えば、ceDNAベクターは、サイズ制限されたチャネルを通して細胞を圧搾することによるか、または当該技術分野において既知の他の手段によって細胞膜を一時的に崩壊させることにより送達され得る。場合によっては、ceDNAベクターは単独で、裸のDNAとして皮膚、甲状腺、心筋、骨格筋、または肝臓細胞中に直接注入される。場合によっては、ceDNAベクターは、遺伝子銃によって送達される。カプシド不含AAVベクターでコーティングされた金またはタングステン球状粒子(1~3μm径)は、加圧ガスによって高速に加速され、標的組織細胞中に貫通することができる。
ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載されるラパマイシンまたはラパマイシン類似体、および薬学的に許容される担体を含む組成物は、本明細書で具体的に企図される。いくつかの実施形態では、ceDNAベクターは、脂質送達系、例えば、本明細書に記載されるリポソームで製剤化される。いくつかの実施形態では、そのような組成物は、熟練した開業医によって望まれる任意の経路によって投与される。組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介した、口腔内投与を介した、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせを含む異なる経路によって対象に投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学的慣習に従って適切に許容される製剤として投与され得る。獣医師は、特定の動物に最も適切な投薬計画および投与経路を容易に決定することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「マイクロプロジェクタイルボンバードメント遺伝子銃」、または電気穿孔(「EP」)、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与することができる。
場合によっては、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、内臓および肢全体の骨格筋への、任意の水溶性化合物および粒子の直接細胞内送達のための単純かつ非常に効率的な方法である流体力学注射によって送達される。
場合によっては、閉端DNAのサイズおよび濃度は、この系の効率性において大きな役割を果たすため、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、膜にナノスケールの孔を作製することにより、超音波によって送達され、内臓または腫瘍の細胞へのDNA粒子の細胞内送達を促進する。場合によっては、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、磁場を使用してマグネトフェクションによって送達され、核酸を含む粒子を標的細胞に濃縮する。
場合によっては、化学送達系は、例えば、カチオン性リポソーム/ミセルまたはカチオン性ポリマーに属するポリカチオン性ナノマー粒子による負電荷核酸の圧縮を含むナノマー複合体を使用することによって使用され得る。送達方法に使用されるカチオン性脂質としては、一価カチオン性脂質、多価カチオン性脂質、グアニジン含有化合物、コレステロール誘導体化合物、カチオン性ポリマー(例えば、ポリ(エチレンイミン)、ポリ-L-リジン、プロタミン、他のカチオン性ポリマー)、および脂質-ポリマーハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
A.エキソソーム:
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、エキソソームにパッケージされることによって送達される。エキソソームは、多胞体と形質膜との融合に続いて、細胞外環境中に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二層からなり、それらは、エキソソームを産生した細胞からのサイトゾルを含有し、表面上の親細胞からの膜タンパク質を呈する。エキソソームは、上皮細胞、BおよびTリンパ球、マスト細胞(MC)、ならびに樹状細胞(DC)を含む様々な細胞型によって産生される。いくつかの実施形態では、10nm~1μm、20nm~500nm、30nm~250nm、50nm~100nmの直径を有するエキソソームが、使用のために想定される。エキソソームは、それらのドナー細胞を使用するか、または特定の核酸をそれらに導入するかのいずれかによって、標的細胞への送達のために単離され得る。当該技術分野において既知の様々なアプローチを使用して、本発明のカプシド不含AAVベクターを含有するエキソソームを産生することができる。
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、エキソソームにパッケージされることによって送達される。エキソソームは、多胞体と形質膜との融合に続いて、細胞外環境中に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二層からなり、それらは、エキソソームを産生した細胞からのサイトゾルを含有し、表面上の親細胞からの膜タンパク質を呈する。エキソソームは、上皮細胞、BおよびTリンパ球、マスト細胞(MC)、ならびに樹状細胞(DC)を含む様々な細胞型によって産生される。いくつかの実施形態では、10nm~1μm、20nm~500nm、30nm~250nm、50nm~100nmの直径を有するエキソソームが、使用のために想定される。エキソソームは、それらのドナー細胞を使用するか、または特定の核酸をそれらに導入するかのいずれかによって、標的細胞への送達のために単離され得る。当該技術分野において既知の様々なアプローチを使用して、本発明のカプシド不含AAVベクターを含有するエキソソームを産生することができる。
B.微粒子/ナノ粒子:
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載されるラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、脂質ナノ粒子によって送達される。一般に、脂質ナノ粒子は、例えば、Tam et al.(2013).Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery.Pharmaceuticals 5(3):498-507によって開示されているイオン化アミノ脂質(例えば、ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート、DLin-MC3-DMA、ホスファチジルコリン(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、DSPC)、コレステロール、およびコート脂質(ポリエチレングリコール-ジミリストールグリセロール、PEG-DMG)を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約10~約1000nmの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、300nm未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約10~約300nmの直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、200nm未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約25~約200nmの直径を有する。いくつかの他の実施形態では、治療用核酸および/または免疫抑制剤を含む脂質粒子は、効果的な送達を保証するため、典型的には、約20nm~約100nm、30nm~約150nm、約40nm~約150nm、約50nm~約150nm、約60nm~約130nm、約70nm~約110nm、約70nm~約100nm、約80nm~約100nm、約90nm~約100nm、約70~約90nm、約80nm~約90nm、約70nm~約80nm、または約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、または150nmの平均径を有する。核酸含有脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、PCT/US18/50042、米国特許公開第2004/0142025号および同第2007/0042031号に開示されており、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子調製物(例えば、複数の脂質ナノ粒子を含む組成物)は、サイズ分布を有し、平均サイズ(例えば、直径)は、約70nm~約200nmであり、より典型的に、平均サイズは、約100nm以下である。
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載されるラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、脂質ナノ粒子によって送達される。一般に、脂質ナノ粒子は、例えば、Tam et al.(2013).Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery.Pharmaceuticals 5(3):498-507によって開示されているイオン化アミノ脂質(例えば、ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート、DLin-MC3-DMA、ホスファチジルコリン(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、DSPC)、コレステロール、およびコート脂質(ポリエチレングリコール-ジミリストールグリセロール、PEG-DMG)を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約10~約1000nmの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、300nm未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約10~約300nmの直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、200nm未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約25~約200nmの直径を有する。いくつかの他の実施形態では、治療用核酸および/または免疫抑制剤を含む脂質粒子は、効果的な送達を保証するため、典型的には、約20nm~約100nm、30nm~約150nm、約40nm~約150nm、約50nm~約150nm、約60nm~約130nm、約70nm~約110nm、約70nm~約100nm、約80nm~約100nm、約90nm~約100nm、約70~約90nm、約80nm~約90nm、約70nm~約80nm、または約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、または150nmの平均径を有する。核酸含有脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、PCT/US18/50042、米国特許公開第2004/0142025号および同第2007/0042031号に開示されており、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子調製物(例えば、複数の脂質ナノ粒子を含む組成物)は、サイズ分布を有し、平均サイズ(例えば、直径)は、約70nm~約200nmであり、より典型的に、平均サイズは、約100nm以下である。
いくつかの実施形態によれば、核酸(例えば、治療用核酸、研究目的に使用される核酸)および/または本発明の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を含む液体医薬組成物は、脂質粒子で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、核酸を含む脂質粒子は、カチオン性脂質から形成することができる。いくつかの他の実施形態では、核酸を含む脂質粒子は、非カチオン性脂質から形成され得る。好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸を含有する脂質粒子であり、これは、mRNA、アンチセンスRNAおよびオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉RNA(RNAi)、ダイサー基質dsRNA、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、非対称干渉RNA(aiRNA)、マイクロRNA(miRNA)、ミニサークルDNA、ミニ遺伝子、ウイルス性DNA(例えば、レンチウイルスまたはAAVゲノム)または非ウイルス性合成DNAベクター、閉端直鎖状二重鎖DNA(ceDNA/CELiD)、プラスミド、バクミド、doggybone(dbDNA(商標))DNAベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現(MIDGE)ベクター、非ウイルス性ミニストリングDNAベクター(直鎖状共有結合性閉鎖DNAベクター)、またはダンベル型DNA最小ベクター(「ダンベルDNA」)からなる群から選択される核酸を含むカチオン性脂質から形成される。
当該技術分野で既知の様々な脂質ナノ粒子を使用して、本明細書に記載されるようなceDNAベクターを含む、閉端DNAベクターを送達することができる。例えば、脂質ナノ粒子を使用する様々な送達方法は、米国特許第9,404,127号、同第9,006,417号、および同第9,518,272号に記載される。
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、金ナノ粒子によって送達される。一般に、核酸は、例えば、Ding et al.(2014).Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery.Mol.Ther.22(6);1075-1083によって記載されるように、金ナノ粒子に共有結合され得るか、または金ナノ粒子に非共有結合され得る(例えば、電荷-電荷相互作用によって結合される)。いくつかの実施形態では、金ナノ粒子-核酸複合体は、例えば、米国特許第6,812,334号に記載される方法を使用して産生される。
C.複合体
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に開示される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、本明細書に開示されるように、結合する(例えば、細胞取り込みを増加させる薬剤と共有結合する。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を通した核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物(例えば、コレステロール、トコフェロールなど)、細胞貫通ペプチド(CPP)(例えば、ペネトラチン、TAT、Syn1Bなど)、およびポリアミン(例えば、スペルミン)に複合され得る。細胞取り込みを増加させる薬剤のさらなる例は、例えば、Winkler(2013).Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications.Ther.Deliv.4(7);791-809に開示されている。
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に開示される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、本明細書に開示されるように、結合する(例えば、細胞取り込みを増加させる薬剤と共有結合する。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を通した核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物(例えば、コレステロール、トコフェロールなど)、細胞貫通ペプチド(CPP)(例えば、ペネトラチン、TAT、Syn1Bなど)、およびポリアミン(例えば、スペルミン)に複合され得る。細胞取り込みを増加させる薬剤のさらなる例は、例えば、Winkler(2013).Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications.Ther.Deliv.4(7);791-809に開示されている。
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、本明細書に開示されるように、ポリマー(例えば、ポリマー分子)または葉酸塩分子(例えば、葉酸分子)に複合される。一般に、ポリマーに複合された核酸の送達は、例えば、WO2000/34343およびWO2008/022309に記載されるように、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるceDNAベクターは、例えば、米国特許第8,987,377号によって記載されるように、ポリ(アミド)ポリマーに複合される。いくつかの実施形態では、本開示によって記載される核酸は、米国特許第8,507,455号に記載されるように、葉酸分子に複合される。
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載されるラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、本明細書に開示されるように、例えば、米国特許第8,450,467号に記載されるように、炭水化物と結合する。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、凝集を防止するために他の部分と結合してもよい。そのような脂質複合体には、例えば、ジアルキルオキシプロピルと共役したPEG(例えば、PEG-DAA複合体)、ジアシルグリセロールと共役したPEG(例えば、PEG-DAG複合体)、コレステロールと共役したPEG、ホスファチジルエタノールアミンと共役したPEG、およびセラミドと共役したPEG(例えば、米国特許第5,885,613号を参照)などのPEG-脂質複合体、カチオン性PEG脂質、ポリオキサゾリン(POZ)-脂質複合体(例えば、POZ-DAA複合体、例えば、2010年1月13日出願の米国仮出願第61/294,828号、および2010年1月14日出願の米国仮出願第61/295,140号)、ポリアミドオリゴマー(例えば、ATTA-脂質複合体)、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。POZ-脂質複合体の追加例は、PCT公開第WO2010/006282号に記載されている。PEGまたはPOZは、脂質に直接結合するか、リンカー部分を介して脂質に結合することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、PEGまたはPOZを脂質に結合するのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、アミドまたはカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
D.ナノカプセル
代替的に、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載されるラパマイシンまたはラパマイシン類似体のナノカプセル製剤は、本明細書に開示されるように使用することができる。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方式で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過装填に起因する副作用を避けるために、そのような微細粒子(およそ0.1μmのサイズ)は、ポリマーを使用して、インビボで分解され得るように設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル-シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。
代替的に、ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載されるラパマイシンまたはラパマイシン類似体のナノカプセル製剤は、本明細書に開示されるように使用することができる。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方式で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過装填に起因する副作用を避けるために、そのような微細粒子(およそ0.1μmのサイズ)は、ポリマーを使用して、インビボで分解され得るように設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル-シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。
E.リポソーム
ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、対象の細胞または標的器官への送達のためにリポソームに追加することができる。リポソームは、少なくとも1つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物/治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分(API)を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、対象の細胞または標的器官への送達のためにリポソームに追加することができる。リポソームは、少なくとも1つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物/治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分(API)を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に既知である。改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された(米国特許第5,741,516号)。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている(米国特許第5,567,434号、同第5,552,157号、同第5,565,213号、同第5,738,868号、および同第5,795,587号)。
F.例示的なリポソームおよび脂質ナノ粒子(LNP)組成物
ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、細胞、例えば、導入遺伝子の発現を必要としている細胞への送達のためにリポソームに追加することができる。リポソームは、少なくとも1つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物/治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分(API)を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および本明細書に記載される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、細胞、例えば、導入遺伝子の発現を必要としている細胞への送達のためにリポソームに追加することができる。リポソームは、少なくとも1つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物/治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分(API)を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
ceDNAを含む脂質ナノ粒子(LNP)は、2018年9月7日に出願された国際出願第PCT/US2018/050042号および2018年12月6日に出願された国際出願第PCT/US2018/064242号に開示されており、各々が参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に開示される方法および組成物での使用が想定されている。
いくつかの態様では、本開示は、免疫原性/抗原性を低減し、化合物(複数可)に対する親水性および疎水性を提供し、投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール(PEG)官能基を有する1つ以上の化合物(いわゆる「PEG化化合物」)を含む、リポソーム製剤を提供する。または、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール(PEG)ポリマーを追加の構成要素として含む。そのような態様では、PEGまたはPEG官能基の分子量は、62Da~約5,000Daであり得る。
いくつかの態様では、本開示は、延長放出または制御放出プロファイルを有するAPIを、数時間~数週間の期間にわたって送達するであろうリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間~数週間の期間にわたってAPIを放出する、高温で物理的移行を経る構成要素を有するAPIを封入する。
いくつかの態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリンおよび本明細書に開示される1つ以上の脂質を含む。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、Optisomeを含む。
いくつかの態様では、本開示は、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンナトリウム塩、(ジステアロイル-sn-グリセロ-ホスホエタノールアミン)、MPEG(メトキシポリエチレングリコール)複合脂質、HSPC(水素化ダイズホスファチジルコリン);PEG(ポリエチレングリコール);DSPE(ジステアロイル-sn-グリセロ-ホスホエタノールアミン);DSPC(ジステアロイルホスファチジルコリン);DOPC(ジオレオイルホスファチジルコリン);DPPG(ジパルミトイルホスファチジルグリセロール);EPC(卵ホスファチジルコリン);DOPS(ジオレオイルホスファチジルセリン);POPC(パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン);SM(スフィンゴミエリン);MPEG(メトキシポリエチレングリコール);DMPC(ジミリストイルホスファチジルコリン);DMPG(ジミリストイルホスファチジルグリセロール);DSPG(ジステアロイルホスファチジルグリセロール);DEPC(ジエルコイルホスファチジルコリン);DOPE(ジオレオイル-sn-グリセロ-ホスホエタノールアミン)、硫酸コレステリル(CS)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、DOPC(ジオレオイル-sn-グリセロ-ホスファチジルコリン)、またはそれらの任意の組み合わせから選択される1つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、リン脂質、コレステロール、およびPEG化脂質を56:38:5のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、2~16mg/mLである。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびPEG化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびPEG化脂質を、それぞれ3:0.015:2のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、コレステロール、およびPEG化脂質を含む脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基およびコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、PEG化脂質は、PEG-2000-DSPEである。いくつかの態様では、本開示は、DPPG、ダイズPC、MPEG-DSPE脂質複合体、およびコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する1つ以上の脂質、およびエタノールアミン官能基を含有する1つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、1つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、DOPC/DEPC、およびDOPEを含む。
いくつかの態様では、本開示は、1つ以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロースおよび/またはグリシンをさらに含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および/または発泡系粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約150~250nmのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。
いくつかの態様では、本開示は、リポソームの外側に単離されたceDNAを有する混合物に弱塩基を付加することにより、本明細書に開示または記載されるceDNAベクターで作製され、装填されたリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のpHをおよそ7.3まで増加させ、APIをリポソーム中に送る。いくつかの態様では、本開示は、リポソームの内側で酸性であるpHを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、pH4~6.9、より好ましくはpH6.5であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマーまたは非ポリマー高電荷アニオンおよびリポソーム内捕捉剤、例えばポリリン酸塩またはオクタ硫酸スクロースが利用される。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるようなceDNAベクターを含むDNAベクターと、イオン化脂質とを含む、脂質ナノ粒子を提供する。例えば、プロセスにより得られたceDNAを用いて作製および装填された脂質ナノ粒子製剤は、2018年9月7日に提出された国際出願第PCT/US2018/050042号に開示されており、本明細書に組み込まれる。これは、イオン化脂質をプロトン化し、粒子のceDNA/脂質会合および核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低pHでのエタノール脂質と水性ceDNAとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈および有機溶媒の除去によってさらに安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。
一般に、脂質粒子は、約10:1~30:1の全脂質対ceDNA(質量または重量)比で調製される。いくつかの実施形態では、脂質対ceDNA比(質量/質量比、w/w比)は、約1:1~約25:1、約10:1~約14:1、約3:1~約15:1、約4:1~約10:1、約5:1~約9:1、または約6:1~約9:1の範囲内であり得る。本明細書の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約15:1の全脂質対ceDNA比を有する。本明細書の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約30:1の全脂質対ceDNA比を有する。本明細書の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約40:1の全脂質対ceDNA比を有する。本明細書の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約50:1の全脂質対ceDNA比を有する。脂質およびceDNAの量を調整して、所望のN/P比、例えば3、4、5、6、7、8、9、10以上のN/P比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約5mg/mL~約30mg/mLの範囲であり得る。
イオン化脂質は、典型的に、核酸カーゴ、例えばceDNAを低pHで凝縮させるため、および膜会合および膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、イオン化脂質は、正に電荷される、または例えばpH6.5以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも1つのアミノ基を含む脂質である。イオン化脂質はまた、本明細書ではカチオン性脂質と称される。
例示的なイオン化脂質は、国際PCT特許公開第WO2015/095340号、同第WO2015/199952号、同第WO2018/011633号、同第WO2017/049245号、同第WO2015/061467号、同第WO2012/040184号、同第WO2012/000104号、同第WO2015/074085号、同第WO2016/081029号、同第WO2017/004143号、同第WO2017/075531号、同第WO2017/117528号、同第WO2011/022460号、同第WO2013/148541号、同第WO2013/116126号、同第WO2011/153120号、同第WO2012/044638号、同第WO2012/054365号、同第WO2011/090965号、同第WO2013/016058号、同第WO2012/162210号、同第WO2008/042973号、同第WO2010/129709号、同第WO2010/144740号、同第WO2012/099755号、同第WO2013/049328号、同第WO2013/086322号、同第WO2013/086373号、同第WO2011/071860号、同第WO2009/132131号、同第WO2010/048536号、同第WO2010/088537号、同第WO2010/054401号、同第WO2010/054406号、同第WO2010/054405号、同第WO2010/054384号、同第WO2012/016184号、同第WO2009/086558号、同第WO2010/042877号、同第WO2011/000106号、同第WO2011/000107号、同第WO2005/120152号、同第WO2011/141705号、同第WO2013/126803号、同第WO2006/007712号、同第WO2011/038160号、同第WO2005/121348号、同第WO2011/066651号、同第WO2009/127060号、同第WO2011/141704号、同第WO2006/069782号、同第WO2012/031043号、同第WO2013/006825号、同第WO2013/033563号、同第WO2013/089151号、同第WO2017/099823号、同第WO2015/095346号、および同第WO2013/086354号、ならびに米国特許公開第US2016/0311759号、同第US2015/0376115号、同第US2016/0151284号、同第US2017/0210697号、同第US2015/0140070号、同第US2013/0178541号、同第US2013/0303587号、同第US2015/0141678号、同第US2015/0239926号、同第US2016/0376224号、同第US2017/0119904号、同第US2012/0149894号、同第US2015/0057373号、同第US2013/0090372号、同第US2013/0274523号、同第US2013/0274504号、同第US2013/0274504号、同第US2009/0023673号、同第US2012/0128760号、同第US2010/0324120号、同第US2014/0200257号、同第US2015/0203446号、同第US2018/0005363号、同第US2014/0308304号、同第US2013/0338210号、同第US2012/0101148号、同第US2012/0027796号、同第US2012/0058144号、同第US2013/0323269号、同第US2011/0117125号、同第US2011/0256175号、同第US2012/0202871号、同第US2011/0076335号、同第US2006/0083780号、同第US2013/0123338号、同第US2015/0064242号、同第US2006/0051405号、同第US2013/0065939号、同第US2006/0008910号、同第US2003/0022649号、同第US2010/0130588号、同第US2013/0116307号、同第US2010/0062967号、同第US2013/0202684号、同第US2014/0141070号、同第US2014/0255472号、同第US2014/0039032号、同第US2018/0028664号、同第US2016/0317458号、同第US2013/0195920号に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、以下の構造を有するMC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル-4-(ジメチルアミノ)ブタン酸(DLin-MC3-DMAまたはMC3)である:
脂質DLin-MC3-DMAは、Jayaraman et al.,Angew.Chem.Int.Ed Engl.(2012),51(34):8529-8533に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、WO2015/074085(その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている、脂質ATX-002である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、WO2012/040184(その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている、(13Z,16Z)-N,N-ジメチル-3-ノニルドコサ-13,16-ジエン-1-アミン(化合物32)である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、WO2015/199952(その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている、化合物6または化合物22である。
無制限に、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の20~90%(mol)を構成し得る。例えば、イオン化脂質モル含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の20~70%(mol)、30~60%(mol)、または40~50%(mol)であり得る。いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の約50mol%~約90mol%を含む。
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、非カチオン性脂質をさらに含み得る。非イオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、およびアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、またはアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を増強するために用いられる。
本明細書に記載されるようなceDNAベクターを含む、DNAベクターを含む方法および組成物での使用が想定される例示的な非カチオン性脂質は、2018年9月7日に出願された国際出願第PCT/US2018/050042号、および2018年12月6日に出願された同第PCT/US2018/064242号(これはその全体が本明細書に取り込まれる)に記載されている。
例示的な非カチオン性脂質は、国際出願公開第WO2017/099823号および米国特許公開第US2018/0028664号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の0~30%(mol)を構成し得る。例えば、非カチオン性脂質含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の5~20%(mol)または10~15%(mol)である。様々な実施形態では、イオン化脂質対中性脂質のモル比は、約2:1~約8:1の範囲である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を全く含まない。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、膜統合性を提供するために、ステロールなどの構成要素をさらに含み得る。
脂質ナノ粒子中で使用され得る1つの例示的なステロールは、コレステロールおよびその誘導体である。例示的なコレステロール誘導体は、国際出願第WO2009/127060号および米国特許公開第US2010/0130588号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
ステロールなどの膜統合性を提供する構成要素は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の0~50%(mol)を構成し得る。いくつかの実施形態では、そのような構成要素は、脂質ナノ粒子の全脂質含有量の20~50%(mol)、30~40%(mol)である。
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール(PEG)または複合脂質分子をさらに含み得る。一般に、これらを使用して、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、かつ/または立体安定化を提供する。例示的な複合脂質としては、PEG-脂質複合体、ポリオキサゾリン(POZ)-脂質複合体、ポリアミド-脂質複合体(ATTA-脂質複合体など)、カチオン性-ポリマー脂質(CPL)複合体、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、複合脂質分子は、PEG-脂質複合体、例えば、(メトキシポリエチレングリコール)-複合脂質である。例示的なPEG-脂質複合体としては、PEG-ジアシルグリセロール(DAG)(1-(モノメトキシ-ポリエチレングリコール)-2,3-ジミリストイルグリセロール(PEG-DMG))、PEG-ジアルキルオキシプロピル(DAA)、PEG-リン脂質、PEG-セラミド(Cer)、PEG化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)、PEGコハク酸ジアシルグリセロール(PEGS-DAG)(4-O-(2’,3’-ジ(テトラデカノイルオキシ)プロピル-1-O-(w-メトキシ(ポリエトキシ)エチル)ブタンジオエート(PEG-S-DMG))、PEGジアルコキシプロピルカルバム、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンナトリウム塩、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的なPEG-脂質複合体は、例えば、US5,885,613、US6,287,591、US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224、およびUS2017/0119904に記載されており、これらのすべての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、PEG-脂質は、US2018/0028664(その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に開示されている化合物である。
いくつかの実施形態では、PEG-脂質は、US2015/0376115またはUS2016/0376224(これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる)に開示されている。
PEG-DAA複合体は、例えば、PEG-ジラウリルオキシプロピル、PEG-ジミリスチルオキシプロピル、PEG-ジパルミチルオキシプロピル、またはPEG-ジステアリルオキシプロピルであり得る。PEG-脂質は、PEG-DMG、PEG-ジラウリルグリセロール、PEG-ジパルミトイルグリセロール、PEG-ジステリルグリセロール、PEG-ジラウリルグリカミド、PEG-ジミリスチルグリカミド、PEG-ジパルミトイルグリカミド、PEG-ジステリルグリカミド、PEG-コレステロール(1-[8’-(コレスト-5-エン-3[β]-オキシ)カルボキシアミド-3’,6’-ジオキサオクタニル]カルバモイル-[ω]-メチル-ポリ(エチレングリコール)、PEG-DMB(3,4-ジテトラデコキシルベンジル-[ω]-メチル-ポリ(エチレングリコール)エーテル)、および1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]のうちの1つ以上であり得る。いくつかの実施例では、PEG-脂質は、PEG-DMG、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]からなる群から選択され得る。
PEG以外の分子と複合した脂質は、PEG-脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン(POZ)-脂質複合体、ポリアミド-脂質複合体(ATTA-脂質複合体など)、およびカチオン性-ポリマー脂質(CPL)複合体を、PEG-脂質の代わりに、またはそれに加えて使用することができる。例示的な複合脂質、すなわち、PEG-脂質、(POZ)-脂質複合体、ATTA-脂質複合体、およびカチオン性ポリマー-脂質は、国際特許出願公開第WO1996/010392号、同第WO1998/051278号、同第WO2002/087541号、同第WO2005/026372号、同第WO2008/147438号、同第WO2009/086558号、同第WO2012/000104号、同第WO2017/117528号、同第WO2017/099823号、同第WO2015/199952号、同第WO2017/004143号、同第WO2015/095346号、同第WO2012/000104号、同第WO2012/000104号、および同第WO2010/006282号、米国特許出願公開第US2003/0077829号、同第US2005/0175682号、同第US2008/0020058号、同第US2011/0117125号、同第US2013/0303587号、同第US2018/0028664号、同第US2015/0376115号、同第US2016/0376224号、同第US2016/0317458号、同第US2013/0303587号、同第US2013/0303587号、および同第US2011/0123453号、ならびに米国特許第US5,885,613号、同第US6,287,591号、同第US6,320,017号、および同第US6,586,559号に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、1つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、所望の治療目的および生物作用に従って選択され得る。例えば、LNP内のceDNAが、癌を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗癌剤(例えば、化学療法剤、標的癌療法(小分子、抗体、または抗体-薬物複合体を含むが、これらに限定されない)であり得る。別の実施例では、ceDNAを含有するLNPが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗菌剤(例えば、抗生物質または抗ウイルス化合物)であり得る。さらに別の実施例では、ceDNAを含有するLNPが、免疫疾患または障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫応答を調節する化合物(例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、または1つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物)であり得る。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質または異なる化合物(治療剤など)をコードするceDNAなどの、異なる化合物を含有する異なる脂質ナノ粒子の異なるカクテルを、本発明の組成物および方法で使用することができる。
いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激剤である。
本明細書では、脂質ナノ粒子に封入されたceDNAベクター、および本明細書に記載のラパマイシンまたはラパマイシン類似体および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物も提供される。脂質ナノ粒子に封入されたceDNAベクターおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物も本明細書に提供され、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、本明細書に記載の異なる組成物で対象に同時投与される。
いくつかの態様では、本開示は、1つ以上の薬学的賦形剤をさらに含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、および/またはグリシンをさらに含む。
ceDNAベクターを含む閉端DNAベクター、および任意で本明細書に記載される1つ以上の免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、粒子の脂質部分と結合するか、脂質ナノ粒子の脂質位置に封入することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなceDNAを含むDNAベクターは、脂質ナノ粒子の脂質位置に完全に封入され得、それによって、例えば、水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子において本明細書に記載されるようなceDNAベクターを含むDNAベクターは、37℃で少なくとも約20、30、45、または60分間のヌクレアーゼへの脂質ナノ粒子の曝露後に実質的に分解されない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のceDNAは、37℃で少なくとも約30、45、もしくは60分、または少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、もしくは36時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子製剤は、凍結乾燥粉末である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも1つの脂質二層を有する固体コア粒子である。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、非二層構造、すなわち非ラメラ(すなわち、非二層)形態を有する。制限なしに、非二重層の形態には、例えば、3次元のチューブ、ロッド、立方対称等が含まれ得る。例えば、脂質ナノ粒子の形態(ラメラ対非ラメラ)は、US2010/0130588(その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されるCryo-TEM分析を使用して容易に評価され、特性化され得る。
いくつかのさらなる実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質ナノ粒子は、高電子密度である。いくつかの態様では、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかである脂質ナノ粒子を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および/または発泡系粒子を含む脂質ナノ粒子を提供する。
脂質構成要素の組成物および濃度を制御することによって、脂質複合体が脂質粒子外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。さらに、例えば、pH、温度、またはイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を変化および/または制御することができる。脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質複合体の組成物および濃度を制御することによって、脂質粒径を制御することができることも明らかとなるであろう。製剤化されたカチオン性脂質のpKaは、核酸の送達のためのLNPの有効性と相関し得る(Jayaraman et al,Angewandte Chemie,International Edition(2012),51(34),8529-8533、Semple et al,Nature Biotechnology 28,172-176(2010)を参照。それらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。pKaの好ましい範囲は、約5~約7である。カチオン性脂質のpKaは、2-(p-トルイジノ)-6-ナフタレンスルホン酸(TNS)の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で決定され得る。
脂質構成要素の組成物および濃度を制御することによって、脂質複合体が脂質粒子外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。さらに、例えば、pH、温度、またはイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を変化および/または制御することができる。脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質複合体の組成物および濃度を制御することによって、脂質粒径を制御することができることも明らかとなるであろう。製剤化されたカチオン性脂質のpKaは、核酸の送達のためのLNPの有効性と相関し得る(Jayaraman et al,Angewandte Chemie,International Edition(2012),51(34),8529-8533、Semple et al,Nature Biotechnology 28,172-176(2010)を参照。それらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。pKaの好ましい範囲は、約5~約7である。カチオン性脂質のpKaは、2-(p-トルイジノ)-6-ナフタレンスルホン酸(TNS)の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で決定され得る。
VI.免疫応答の阻害剤
本明細書では、阻害剤または免疫応答が提供される。実施形態によれば、免疫応答の阻害剤は、自然免疫応答の阻害剤である。
本明細書では、阻害剤または免疫応答が提供される。実施形態によれば、免疫応答の阻害剤は、自然免疫応答の阻害剤である。
ラパマイシンまたはラパマイシン類似体
いくつかの態様によれば、本開示は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体と併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)を提供する。いくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、WO2016/073799に記載されているように、合成ナノ担体中に過飽和量で存在する。いくつかの実施形態では、ceDNAベクターも同じナノ担体中に存在する。
いくつかの態様によれば、本開示は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体と併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)を提供する。いくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、WO2016/073799に記載されているように、合成ナノ担体中に過飽和量で存在する。いくつかの実施形態では、ceDNAベクターも同じナノ担体中に存在する。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、対象にceDNAベクターと同時投与される。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ceDNAベクターおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、単一の製剤で一緒に同時投与される。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、WO2016/073799に記載の合成ナノ担体に過飽和濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ceDNAベクターも同じナノ担体中に存在する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子に製剤化されたceDNAベクターは、同じナノ担体にも存在する。
いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、当技術分野で既知のラパマイシン類似体のいずれかであり、例えば、米国特許第5,138,051号、またはWO2017/040341に記載されているラパマイシン類似体のいずれかであり、それぞれの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、以下に示す式IIIの化合物、
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、R1はOHまたはOCH3であり、R2はHまたはFであり、R3はH、OH、またはOCH3であり、R4は、OHまたはOCH3である。
いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、以下に示す式IXの化合物、
またはその薬学的に許容される塩であり、R2はHまたはFであり、R3はOHまたはOCH3であり、R4はOCH3またはOHである。ある特定の実施形態では、R4はOCH3である。ある特定の実施形態では、R4はOCH3であり、R2はFであり、R3はOCH3である。ある特定の実施形態では、R4はOCH3であり、R2はHであり、R3はOHである。ある特定の実施形態では、R2はHであり、R3はHであり、R4はOHである。様々な実施形態では、式IXの化合物はラセミ混合物として存在する。
したがって、いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、式I~IXのうちのいずれか1つまたはその誘導体から選択される。
いくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、WO2016/073799(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載される合成ナノ担体を使用して送達または投与される。
WO2016/073799に記載されているように、合成ナノ担体形成中の製剤のラパマイシンの濃度は、当該製剤のラパマイシンの溶解限度と比較して、結果として生じる合成ナノ担体の免疫寛容を誘導する能力に大きな影響を与える可能性がある。さらに、そのようなラパマイシンが合成ナノ担体を通してどのように分散されるかは、結果として得られる合成ナノ担体が最初は滅菌濾過可能であるか否かに影響を及ぼす可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、形成されたナノ担体懸濁液の溶解度を超えるラパマイシンの濃度をもたらす条件下で生成された合成ナノ担体が、本明細書に記載の組成物および方法で使用される。そのような合成ナノ担体は、より持続的な免疫寛容を提供し、最初は滅菌濾過可能である。
いくつかの実施形態では、ceDNAベクターは、疎水性ポリエステル担体材料およびラパマイシンまたはラパマイシン類似体を含む合成ナノ担体を含む組成物と同時投与され、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、安定で、疎水性ポリエステル担体材料の重量に対してラパマイシンまたはラパマイシン類似体の重量に基づいて50重量%未満が提供される過飽和量で、合成ナノ担体中に存在する。
本明細書で提供される組成物または方法のいずれか1つの一実施形態では、重量は、合成ナノ担体の製剤中に組み合わされる材料の処方重量である。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか1つの一実施形態では、重量は、結果として得られる合成ナノ担体組成物の材料の重量である。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つのいくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、45重量%未満の安定な過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、40重量%未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、35重量%未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、30重量%未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、25重量%未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、20重量%未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、15重量%未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、10重量%未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、7重量%超の安定な超飽和量で存在する。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、疎水性ポリエステル担体材料は、PLA、PLG、PLGAまたはポリカプロラクトンを含む。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、疎水性ポリエステル担体材料は、PLA-PEG、PLGA-PEGまたはPCL-PEGをさらに含む。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、合成ナノ担体の疎水性ポリエステル担体材料の量は、5~95重量%の疎水性ポリエステル担体材料/全固形分である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、合成ナノ担体の疎水性ポリエステル担体材料の量は、60~95重量%の疎水性ポリエステル担体材料/全固形分である。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、合成ナノ担体は、HLB値が10以下である非イオン性界面活性剤をさらに含む。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、HLB値が10以下である非イオン性界面活性剤は、ソルビタンエステル、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、エトキシル化脂肪アルコール、ポロクサマー、脂肪酸、コレステロール、コレステロール誘導体、または胆汁酸または塩を含む。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、10以下のHLB値を有する非イオン性界面活性剤は、SPAN(登録商標)40、SPAN(登録商標)20、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、パルミチン酸イソプロピル、グリセロールモノステアレート、BRIJ52、BRIJ93、Pluronic(登録商標) P-123、Pluronic(登録商標) L-31、パルミチン酸、ドデカン酸、グリセリルトリパルミテートまたはトリリノール酸グリセリルを含む。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、HLB値が10以下である非イオン性界面活性剤はSPAN(登録商標)40である。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、10以下のHLB値を有する非イオン性界面活性剤は、合成ナノ担体にカプセル化され、合成ナノ担体の表面に存在し、またはその両方である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、HLB値が10以下である非イオン性界面活性剤の量は、0.1重量%超であるが15重量%未満のHLB値が10以下である非イオン性界面活性剤/疎水性ポリエステル担体材料である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、HLB値が10以下である非イオン性界面活性剤の量は、1重量%超であるが13重量%未満のHLB値が10以下である非イオン性界面活性剤/疎水性ポリエステル担体材料である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、HLB値が10以下である非イオン性界面活性剤の量は、1重量%超であるが9重量%未満のHLB値が10以下である非イオン性界面活性剤/疎水性ポリエステル担体材料である。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、組成物は、最初は0.22μmフィルターを通して滅菌濾過可能である。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、合成ナノ担体の動的光散乱を使用して得られる粒径分布の平均は、120nm超の直径である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、直径は150nmよりも大きい。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、直径は200nmよりも大きい。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、直径は250nmより大きい。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、直径は300nm未満である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、直径は250nm未満である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、直径は200nm未満である。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、合成ナノ担体にカプセル化される。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか1つの一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
本明細書で提供される組成物または方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも1%超える過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも5%超える過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも10%超える過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも15%超える過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも20%超える過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも25%超える過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか1つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも30%超える過飽和量で存在する。
本明細書で提供される組成物または方法のいずれか1つの別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも1%超える。別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも5%超える。別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも10%超える。別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも15%超える。別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも20%超える。別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも25%超える。別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも30%超える。
cGASの阻害剤
いくつかの態様によれば、本開示は、1つ以上のcGASアンタゴニストと併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を提供する。1つ以上のcGAS阻害性RNAまたはタンパク質を部分的にコードする配列を含むceDNA構築物も本明細書に提供される。
いくつかの態様によれば、本開示は、1つ以上のcGASアンタゴニストと併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を提供する。1つ以上のcGAS阻害性RNAまたはタンパク質を部分的にコードする配列を含むceDNA構築物も本明細書に提供される。
cGASは、細胞質DNAによって誘起されるPRRの別のクラスであり、細胞質DNAはDNAに結合し、ERに結合したインターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)を活性化する。これにより、I型インターフェロン応答が活性化され、場合によっては、黒色腫で欠損(AIM2)、IFN-γ誘導性タンパク質16(IFI16)、インターフェロン誘導性タンパク質X(IFIX)、LRRFIP1、DHX9、DHX36、DDX41、Ku70、DNA-PKcs、MRN複合体(MRE11、Rad50およびNbs1を含む)およびRNAポリメラーゼIIIを含む他の提案された細胞質DNAセンサーが活性化される。AIM2、IFI16、およびIFIXは、パイリンおよびHIN200ドメインタンパク質(PYHIN)タンパク質である。さらに、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)に由来する一本鎖DNA(ssDNA)のステムループ構造のように、短い塩基対のDNA区間に隣接する不対のDNAヌクレオチドが、配列依存的な様式でI型インターフェロン誘導DNAセンサーcGASを活性化したことが示された。短い(12~20bp)dsDNA(Y型DNA)に隣接する不対グアノシンを含むDNA構造は、非常に刺激性であり、cGASの酵素活性を特異的に増強した。
cGASは、両DNA鎖の糖リン酸骨格と相互作用することにより、DNAに直接結合する(S.R.Paluden.Microbiology and Molecular Biology Reviews.2015.79(2):225).これにより、酵素の構造変化が起こり、ヌクレオチド基質であるATPおよびGTPが活性部位にアクセスできるようになり、cGAMPが合成される(A.Dempsey and A.G.Bowie,Virology 2015 May,0:146-152)。次にcGAMPがSTINGに結合するため、I型インターフェロンの産生につながる(A.Dempsey and A.G.Bowie,Virology 2015 May,0:146-152)。重要なことに、cGASはDNAリン酸骨格を介してのみdsDNAと接触し、ヌクレオチド配列に依存しないセンシングをもたらす(A.Dempsey and A.G.Bowie,Virology 2015 May,0:146-152)。また、cGASは、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)に由来する一本鎖DNA(ssDNA)のステムループ構造のように、12~20bpの短い塩基対のDNA区間に隣接する不対のDNAヌクレオチド、特にグアノシンによって活性化できることも示されている(M.H.Christnesen and S.R.Paluden.Cellular and Molecular Immunology.2017.14:4-13;A-M Herzner et al.,2015.Nature Immunology)。
したがって、PRRによる自然免疫活性化に重要なceDNAの構造的特徴には、Rep結合部位(RBS)および末端分解部位(TRS)を含む、修飾AAV逆位末端反復配列(ITR)、ITRのヘアピン配列、RBSのCGリッチ性、DNAメチル化の欠如、および例えば、一本鎖のループDNAを有し得る隣接ITRをもつ直鎖状二重鎖DNA構造が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、cGASの阻害剤は、ceDNAとともに対象に同時投与される。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、cGASの阻害剤がRNAまたはタンパク質配列であり、ceDNAは、cGASのRNAまたはタンパク質阻害剤をコードする。
いくつかの実施形態では、cGASの阻害剤は、抗マラリア薬である(J.An et al.,J.Immunol.March27,2015)。いくつかの実施形態では、抗マラリア薬は、アミノキノリン系またはアミノアクリジン系の抗マラリア薬である(J.An et al.,J.Immunol.March27,2015)。いくつかの実施形態では、抗マラリア薬は、キナクリン(QC)、9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン(AMCA)、ヒドロキシクロロキン(HCQ)、およびクロロキン(CQ)から選択される(J.An et al.,J.Immunol.March27,2015)。
いくつかの実施形態では、cGASの阻害剤は、cGASの触媒ポケットに結合する小分子化合物である(J.Vincent et al.,Nature Communications,8:750)。いくつかの実施形態では、cGASの触媒ポケットに結合する小分子化合物は、RU166365、RU281332、RU320521、RU320519、RU320461、RU320462、RU320520、RU320467、およびRU320582から選択される(J.Vincent et al.,Nature Communications,8:750)。いくつかの実施形態では、cGASの触媒ポケットに結合する小分子化合物はRU320521である(J.Vincent et al.,Nature Communications,8:750)。いくつかの実施形態では、cGASの触媒ポケットに結合する小分子化合物は、化合物15、化合物16、化合物17、化合物18、化合物19、およびPF-06928215から選択される(J.Vincent et al.,Nature Communications,8:750;PLOS ONE.September21,2017)。いくつかの実施形態では、cGASの触媒ポケットに結合する小分子化合物は、PF-06928215である(PLOS ONE.September21,2017)
いくつかの実施形態では、cGASの阻害剤は、US2016/0068560に記載されている小分子化合物のいずれかであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、cGASの阻害剤は、対象に投与されるceDNAによってコードされる(例えば、ceDNAのその後の送達を含む)。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、対象に投与されるceDNAによってコードされるcGASの阻害剤は、cGASを阻害するMAAPRGRPKKDLTMEDLTAKISQLTVENRELRKALGSTADPRDRPLTATEKEAQLTATVGALSAAAAKKIEARVRTIFSKVVTQKQVDDALKGLSLRIDVCMSDGGTAKPPPGANNRRRRGASTTRAGVDDのアミノ酸配列(配列番号882)を有するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ORF52またはその変異体である(M.H.Christnesen and S.R.Paluden.Cellular and Molecular Immunology.2017.14:4-13)。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、対象に投与されるceDNAによってコードされるcGASの阻害剤は、ORF52のガンマヘルペスウイルス相同分子腫である。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、対象に投与されるceDNAによってコードされるcGASの阻害剤は、本明細書では「細胞質LANAイソ型」とも呼ばれ、cGASを阻害するカポジ肉腫ヘルプレスウイルスLANA(潜伏期関連核抗原)の細胞質イソ型、またはその変異体である(Zhang G.et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2016 Feb 23;113(8):E1034-43)。LANAまたはORF73は、以下の1129個のアミノ酸の配列を有する:MAPPGMRLRSGRSTGAPLTRGSCRKRNRSPERCDLGDDLHLQPRRKHVADSVDGRECGPHTLPIPGSPTVFTSGLPAFVSSPTLPVAPIPSPAPATPLPPPALLPPVTTSSSPIPPSHPVSPGTTDTHSPSPALPPTQSPESSQRPPLSSPTGRPDSSTPMRPPPSQQTTPPHSPTTPPPEPPSKSSPDSLAPSTLRSLRKRRLSSPQGPSTLNPICQSPPVSPPRCDFANRSVYPPWATESPIYVGSSSDGDTPPRQPPTSPISIGSSSPSEGSWGDDTAMLVLLAEIAEEASKNEKECSENNQAGEDNGDNEISKESQVDKDDNDNKDDEEEQETDEEDEEDDEEDDEEDDEEDDEEDDEEDDEEDDEEEDEEEDEEEDEEEDEEEEEDEEDDDDEDNEDEEDDEEEDKKEDEEDGGDGNKTLSIQSSQQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQREPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQEPQQQDEQQQDEQQQDEQQQDEQQQDEQQQDEQQQDEQQQDEQEQQDEQQQDEQQQQDEQEQQEEQEQQEEQQQDEQQQDEQQQDEQQQDEQEQQDEQQQDEQQQQDEQEQQEEQEQQEEQEQQEEQEQQEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQELEEQEQEQELEEVEEQEQEQEEQELEEVEEQEQEQEEQEEQELEEVEEQEEQELEEVEEQEEQELEEVEEQEQQGVEQQEQETVEEPIILHGSSSEDEMEVDYPVVSTHEQIASSPPGDNTPDDDPQPGPSREYRYVLRTSPPHRPGVRMRRVPVTHPKKPHPRYQQPPVPYRQIDDCPAKARPQHIFYRRFLGKDGRRDPKCQWKFAVIFWGNDPYGLKKLSQAFQFGGVKAGPVSCLPHPGPDQSPITYCVYVYCQNKDTSKKVQMARLAWEASHPLAGNLQSSIVKFKKPLPLTQPGENQGPGDSPQEMT(配列番号883)。
本明細書に記載のceDNAとともに使用するための切断された細胞質LANAイソ型の非限定的な例は、LANAΔ161または配列番号532(配列番号884のアミノ酸161~1162を欠く)である。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、cGASの阻害剤は、cGASに結合する抗体または抗原結合断片である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、cGASに結合する抗体または抗原結合断片は、ceDNAによってコードされる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、cGASの阻害剤は、cGASに特異的なsiRNAなどのcGASのRNA阻害剤である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、cGASのRNA阻害剤はceDNAによってコードされる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、cGASの阻害剤は、miR-25(GGCCAGTGTTGAGAGGCGGAGACTTGGGCAATTGCTGGACGCTGCCCTGGGCATTGCACTTGTCTCGGTCTGACAGTGCCGGCC、配列番号885)およびmiR-93(CTGGGGGCTCCAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAGTGTGATTACCCAACCTACTGCTGAGCTAGCACTTCCCGAGCCCCCGG、配列番号886)などのcGASのmiRNA阻害剤である11。miR-25およびmiR-93は、cGASの抑制につながるcGAS発現の基底レベルを維持するエピジェネティック因子である核内受容体コアクチベーター3(NCOA3)を標的にすると考えられている(Wu et al.2017.Nat.Cell Biol.19(10):1286-1296)。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、cGASのmiRNA阻害剤は、ceDNAによってコードされる。
TLRの阻害剤
いくつかの態様によれば、本開示は、1つ以上のTLRアンタゴニストと併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を提供する。1つ以上のTLR阻害オリゴヌクレオチドを部分的にコードする配列を含むceDNA構築物も本明細書で提供される。いくつかの態様によれば、本開示は、1つ以上のTLR9アンタゴニストと併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を提供する。1つ以上のTLR9阻害オリゴヌクレオチドを部分的にコードする配列を含むceDNA構築物も本明細書で提供される。
いくつかの態様によれば、本開示は、1つ以上のTLRアンタゴニストと併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を提供する。1つ以上のTLR阻害オリゴヌクレオチドを部分的にコードする配列を含むceDNA構築物も本明細書で提供される。いくつかの態様によれば、本開示は、1つ以上のTLR9アンタゴニストと併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を提供する。1つ以上のTLR9阻害オリゴヌクレオチドを部分的にコードする配列を含むceDNA構築物も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態によれば、TLR9阻害剤は小分子アンタゴニストである。別の実施形態では、TLR9阻害剤は、TLR9に対する抗体である。いくつかの実施形態によれば、TLR9抗体はモノクローナル抗体である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ITR配列などのceDNAの1つ以上の末端構造要素は、TLR9阻害オリゴヌクレオチドの配列を含む。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9阻害オリゴヌクレオチドは、以下の特徴のうちの1つ以上を有する。(i)3’末端の3つの連続したGヌクレオチド、(ii)5’末端のCC(T)トリプレット、および(iii)最適には3~5ヌクレオチドの長さである、5’CC(T)と下流のGGGトリプレットとの間の距離。いくつかの実施形態では、TLR9阻害オリゴヌクレオチドは、5’CCTN(3-5)G(3-5)RR3’(配列番号887)の配列を有する。いくつかの実施形態では、TLR9阻害オリゴヌクレオチドは、隣接するG間に鎖内および/または鎖間のフーグスティーン水素結合を有しない。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9阻害オリゴヌクレオチドは、G4スタッキング特性を有するクラスG TLR9阻害オリゴヌクレオチドであり、TTAGGGn(配列番号888)を含む阻害オリゴヌクレオチドなど、複数のG3トリプレットまたはG4テトラドを含む。そのようなクラスG TLR9阻害オリゴヌクレオチドの非限定的な例には、ODN-2088(TCCTGGCGGGGAAGT、配列番号889)、ODN-2114(TCCTGGAGGGGAAGT、配列番号890)、ポリG(GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、配列番号891)、ODN-A151(TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、配列番号892)、G-ODN(CTCCTATTGGGGGTTTCCTAT、配列番号893)、およびIRS-869(TCCTGGAGGGGTTGT、配列番号894)、およびAS1411(GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG、配列番号903)が含まれる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9阻害オリゴヌクレオチドは、パリンドロームであるおよび/または短い5’または3’オーバーハングを有するなどの特徴を有するクラスR TLR9阻害オリゴヌクレオチド、例えばINH-1阻害オリゴヌクレオチドである。このようなクラスR TLR9阻害オリゴヌクレオチドの非限定的な例には、INH-1(CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG、配列番号895)、INH-4(TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA、配列番号896)、およびIRS-661(TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA、配列番号897)が含まれる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9阻害オリゴヌクレオチドは、直鎖状特性および5’CC(T)→GGG-3’モチーフを有するクラスB TLR9阻害オリゴヌクレオチド、例えばINH-18阻害オリゴヌクレオチドである。このようなクラスB TLR9阻害オリゴヌクレオチドの非限定的な例には、ODN-2088(TCCTGGCGGGGAAGT、配列番号889)、ODN-2114(TCCTGGAGGGGAAGT、配列番号890)、4024(TCCTGGATGGGAAGT、配列番号898)、4084F(CCTGGATGGGAA、配列番号899)、INH-13(CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA、配列番号900)、INH-18(CCTGGATGGGAACTTACCGCTGCA、配列番号901)、G-ODN(CTCCTATTGGGGGTTTCCTAT、配列番号893)、IRS-869(TCCTGGAGGGGTTGT、配列番号864)、IRS-954 TGCTCCTGGAGGGGTTGT、配列番号902)、およびAS1411(GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG、配列番号903)が含まれる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、導入遺伝子配列などのceDNAによってコードされるコード配列は、選択されたアミノ酸のコドントリプレット内に割り当てられたCpGジヌクレオチドが、CpGジヌクレオチドを欠く同じアミノ酸のコドントリプレットに変更されるように修飾される。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9の阻害剤がRNAまたはタンパク質配列であり、ceDNAは、TLR9のRNAまたはタンパク質阻害剤をコードする。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9の阻害剤は、TLR9に結合する抗体または抗原結合断片である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9に結合する抗体または抗原結合断片は、ceDNAによってコードされる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9の阻害剤は、ceDNAとともに対象に同時投与される。TLR9の阻害剤の非限定的な例は、「Classification,Mechanisms of Action,and Therapeutic Applications of Inhibitory Oligonucleotides for Toll-Like Receptors(TLR)7 and 9」、P.S.Lenert,Mediators of Inflammation,Vol.2010,986596、US2015/0203850、およびUS2017/026800に見出すことができ、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
したがって、本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9の阻害剤は、ceDNAとともに対象に同時投与される。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9の阻害剤は、対象に投与されるceDNAによってシス位でコードされる(例えば、ceDNAのその後の送達を含む)。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9の阻害剤は、対象に投与されるceDNAによってトランスで投与される。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9の阻害剤は、TLR9阻害オリゴヌクレオチドである。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9阻害オリゴヌクレオチドは、以下の特徴のうちの1つ以上を有する。(i)3’末端の3つの連続したGヌクレオチド、(ii)5’末端のCC(T)トリプレット、および(iii)5’CC(T)と下流のGGGトリプレットの間の距離が、最適には3~5ヌクレオチドの長さであること。いくつかの実施形態では、TLR9阻害オリゴヌクレオチドは、5’CCTN(3-5)G(3-5)RR3’(配列番号887)の配列を有する。いくつかの実施形態では、TLR9阻害オリゴヌクレオチドは、隣接するG間に鎖内および/または鎖間のフーグスティーン水素結合を有さない。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9の阻害剤は、TLR9に結合する抗体または抗原結合断片である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9に結合する抗体または抗原結合断片は、ceDNAによってコードされる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、TLR9阻害剤は、エンドソーム酸性化の阻害剤、例えばクロロキンである。
インフラマソームアンタゴニスト
NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤:
いくつかの実施形態では、インフラマソームアンタゴニストはNLRP3を阻害する。「NLRP3」という用語は、クリオピリンとも呼ばれ、NOD様受容体ファミリー、ピリンドメインを含有する3)インフラマソームまたはNACHT、LRRおよびPYDドメインを含むタンパク質3(NALP3)(クリオピリンとしても知られる)、低温誘導性自己炎症性症候群1(CIAS1)、毛虫様受容体1.1(CLR1.1)またはピリンドメイン含有Apafl様タンパク質1(PYPAF1)を指す。NALP3は、別名、すなわちNLRP3 PYD-NACHT-NAD-LRR NALP3 Cias1、Pypaf1、Mmig1 PYD-NACHT-NAD-LRR.)でも知られている。NLRP3は、NLRP3タンパク質、ASC(CARDを含むアポトーシス関連斑点様タンパク質)およびプロカスパーゼ1からなる多タンパク質オリゴマーの構成要素である。
NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤:
いくつかの実施形態では、インフラマソームアンタゴニストはNLRP3を阻害する。「NLRP3」という用語は、クリオピリンとも呼ばれ、NOD様受容体ファミリー、ピリンドメインを含有する3)インフラマソームまたはNACHT、LRRおよびPYDドメインを含むタンパク質3(NALP3)(クリオピリンとしても知られる)、低温誘導性自己炎症性症候群1(CIAS1)、毛虫様受容体1.1(CLR1.1)またはピリンドメイン含有Apafl様タンパク質1(PYPAF1)を指す。NALP3は、別名、すなわちNLRP3 PYD-NACHT-NAD-LRR NALP3 Cias1、Pypaf1、Mmig1 PYD-NACHT-NAD-LRR.)でも知られている。NLRP3は、NLRP3タンパク質、ASC(CARDを含むアポトーシス関連斑点様タンパク質)およびプロカスパーゼ1からなる多タンパク質オリゴマーの構成要素である。
本明細書の方法および組成物での使用に包含されるNLRP3阻害剤は、Shao,Bo-Zong,et al.“NLRP3 inflammasome and its inhibitors:a review.” Frontiers in pharmacology 6(2015):262、およびWang et al.,Lab investigation,2017,97;922-934に開示されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソームの阻害剤は、MCC950またはその機能的誘導体である。MCC950は、次式を有し、
NLRP3の強力で選択的な阻害剤である。MCC950は、インフラマソームアダプタータンパク質ASC(CARDを含むアポトーシス関連斑点様タンパク質)のオリゴマー形成を防止することにより、ATP、MSU、およびニゲリシンなどのNLRP3アクチベーターによって誘導されるIL-1βの放出を遮断する(Coll RC.et al.,2015.A small-molecule inhibitor of the NLRP3 inflammasome for the treatment of inflammatory diseases.Nature Med 21(3),248-255、Guo H.et al.,2015.Inflammasomes:mechanism of action,role in disease,and therapeutics.Nat Med.21(7):677-87、Ren,Honglei,et al.“Selective NLRP3(Pyrin Domain-Containing Protein 3)Inflammasome Inhibitor Reduces Brain Injury After Intracerebral Hemorrhage.” Stroke(2017):STROKEAHA-117.)。
いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソームの阻害剤は、以下の構造を有するBay11-7082である。
NF-κB活性に及ぼす阻害効果とは無関係にマクロファージのNLRP3インフラマソーム活性を、選択的に阻害することも報告された(Juliana C.et al,2010.Anti-inflammatory Compounds Parthenolide and Bay11-7082 Are Direct Inhibitors of the Inflammasome.J.Biol Chem.285(13):9792-9802]。
いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソームの阻害剤は、以下の構造を有するグリベンクラミド(グリブリドとしても知られる)である。
これは、K+排出を阻害することにより、カスパーゼ-1およびプロIL-1βの成熟を遮断する(Laliberte RE.et al.,1999.ATP treatment of human monocytes promotes caspase-1 maturation and externalization.J Biol Chem.274(52):36944-51)。グリベンクラミドは、PAMP、DAMP、および結晶性物質によって誘導されるNRLP3インフラマソームの活性化も強力に遮断する(Lamkanfi M.et al.,2009.Glyburide inhibits the Cryopyrin/Nalp3 inflammasome.J.Cell Biol.,187:61-70、Dostert C.et al.,2009.Malarial hemozoin is a Nalp3 inflammasome activating danger signal.PLoS One.4(8):e6510)。
いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソームの阻害剤は、以下の構造を有するイソリキリチゲニン(ILGとしても知られる)である。
これは、カンゾウ根(Glycyrrhiza uralensis)から単離されたカルコン型フラボノイドであり、NLRP3活性化ASCオリゴマー形成を阻害することが報告された(Honda H.et al.,2014.Isoliquiritigenin is a potent inhibitor of NLRP3 inflammasome activation and diet-induced adipose tissue inflammation.J Leukoc Biol.96(6):1087-100.)。NLRP3依存性のIL-1β産生は、低濃度のイソリキリチゲニン(1~10μM)で阻害され、イソリキリチゲニンがプライミングステップと活性化ステップの両方でNLRP3インフラマソームを遮断できることを示している。
いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソームの阻害剤は、6673-34-0(5-クロロ-2-メトキシ-N-[2-(4-スルファモイルフェニル)-エチル]-ベンズアミド))であり、これは、米国出願第US2016/0052876号に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソームの阻害剤は、US2016/0052876に記載されている小分子化合物のいずれかであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソームの阻害剤は、Ozaki et al.,2015;Coll et al.,2011;Haerter et al.,2009 and 米国特許第7,498,460号に開示されているシステイニルロイコトリエン受容体アンタゴニストであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。システイニルロイコトリエン受容体アンタゴニストは、ASCのオリゴマー形成を防止することによって、NLRP3とAIM2の両インフラマソーム誘発性IL-1プロセシングを阻害することが報告されており、同様に、インフラマソーム形成のアダプターの役割とは異なり、自然免疫応答においてさらに役割を果たしているようである(Ozaki et al.,2015)。
いくつかの実施形態では、NLRP3およびAIM2を標的とする小分子阻害剤が特徴付けられており、(Ozaki et al.,2015)に広く記載されている。これらの大部分は、インフラマソームを標的とするために再利用された薬理学的阻害剤であり(Guo et al.,2015)、パルテノライド(Juliana et al.,2010)、Bay 11-708(Juliana et al.,2010)、CRID3(Coll et al.,2011)、オーラノフィン(Isakov et al.,2014)、イソリキリチゲニン(Honda et al.,2014)、3,4-メチレンジオキシ-*-ニトロスチレン(He et al.,2014)、シクロペンテノンプロスタグランジン15d-PJ2(Maier et al.,2015)および 25-ヒドロキシコレステロール(25-HC)(Reboldi et al.,2014)が含まれる。さらに、I型インターフェロンは、ほとんど解明されていないメカニズムでインフラマソームの活性化を抑制することも示されている(Guarda et al.,2011)。しかしながら、最近、IFN刺激遺伝子産物であるコレステロール25-ヒドロキシラーゼ(Ch25h)がIl1b転写ならびにNLRP3、NLRC4およびAIM2インフラマソーム活性化の両方と拮抗することが実証され、これはCh25hが複数のインフラマソームの広い阻害活性を有することを示している(Reboldi et al.,2014)。
NLRP3は、NCBI受入番号NM_004895.1(配列番号530)、NM_183395(配列番号531)、NM_001079821(配列番号532)、NM_001127461(配列番号533)およびNM_001127462(配列番号534)によってコードされる。ここで、NLRP3の翻訳開始コドンは、これらのNCBI受託番号のそれぞれに記載される翻訳開始コドンから6ヌクレオチド下流に位置するコドンであることが好ましい。変異型NLRP3遺伝子の例としては、翻訳開始コドンから数えて1709番目(NCBI受入番号で示されるコード領域の場合、翻訳開始コドンから数えて1715番目)のアデニンがグアニン、翻訳開始コドンから数えて1043番目(NCBI受入番号で示されるコード領域では1049番目)のシトシンがチミン、または翻訳開始コドンから数えて587番目(NCBI受入番号で示されるコード領域では593番目)のグアニンがアデニンであるNLRP3遺伝子が挙げられる。NLRP3は、1079番目のヌクレオチドがグアニンに変異したものであることが好ましい。当業者が理解するように、機能的に同等のNLRP3をコードし、少なくとも部分的にカスパーゼ-1を活性化し、および/またはインターロイキン1βおよびインターロイキン18などの炎症性サイトカインの成熟を促進する機能を維持するNLRP3遺伝子の変異体が存在し得る。したがって、そのような機能的に同等のNLRP3は、活性を消失しないアミノ酸の置換、欠失、または付加を組み込んでもよい。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソームの阻害剤は、NLRP3に特異的なsiRNAなど、NLRP3のRNA阻害剤(RNAi)である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、NLRP3のRNA阻害剤は、ceDNAによってコードされる。NLRP3 siRNAは、例えば、SI03060323(Qiagen(登録商標))など、市販されている場合もある。
いくつかの実施形態では、NLRP3の阻害剤は、ceDNAにコードされるRNAiである。疑義を回避するため、ヒトNLRP3タンパク質のアミノ酸配列は、NM_004895.1(配列番号539)に対応し、以下のとおりである。
MKMASTRCKLARYLEDLEDVDLKKFKMHLEDYPPQKGCIPLPRG
QTEKADHVDLATLMIDFNGEEKAWAMAVWIFAAINRRDLYEKAKRDEPKWGSDNARVS
NPTVICQEDSIEEEWMGLLEYLSRISICKMKKDYRKKYRKYVRSRFQCIEDRNARLGE
SVSLNKRYTRLRLIKEHRSQQEREQELLAIGKTKTCESPVSPIKMELLFDPDDEHSEP
VHTVVFQGAAGIGKTILARKMMLDWASGTLYQDRFDYLFYIHCREVSLVTQRSLGDLI
MSCCPDPNPPIHKIVRKPSRILFLMDGFDELQGAFDEHIGPLCTDWQKAERGDILLSS
LIRKKLLPEASLLITTRPVALEKLQHLLDHPRHVEILGFSEAKRKEYFFKYFSDEAQA
RAAFSLIQENEVLFTMCFIPLVCWIVCTGLKQQMESGKSLAQTSKTTTAVYVFFLSSL
LQPRGGSQEHGLCAHLWGLCSLAADGIWNQKILFEESDLRNHGLQKADVSAFLRMNLF
QKEVDCEKFYSFIHMTFQEFFAAMYYLLEEEKEGRTNVPGSRLKLPSRDVTVLLENYG
KFEKGYLIFVVRFLFGLVNQERTSYLEKKLSCKISQQIRLELLKWIEVKAKAKKLQIQ
PSQLELFYCLYEMQEEDFVQRAMDYFPKIEINLSTRMDHMVSSFCIENCHRVESLSLG
FLHNMPKEEEEEEKEGRHLDMVQCVLPSSSHAACSHGLVNSHLTSSFCRGLFSVLSTS
QSLTELDLSDNSLGDPGMRVLCETLQHPGCNIRRLWLGRCGLSHECCFDISLVLSSNQ
KLVELDLSDNALGDFGIRLLCVGLKHLLCNLKKLWLVSCCLTSACCQDLASVLSTSHS
LTRLYVGENALGDSGVAILCEKAKNPQCNLQKLGLVNSGLTSVCCSALSSVLSTNQNL
THLYLRGNTLGDKGIKLLCEGLLHPDCKLQVLELDNCNLTSHCCWDLSTLLTSSQSLR
KLSLGNNDLGDLGVMMFCEVLKQQSCLLQNLGLSEMYFNYETKSALETLQEEKPELTV
VFEPSW(配列番号539)
MKMASTRCKLARYLEDLEDVDLKKFKMHLEDYPPQKGCIPLPRG
QTEKADHVDLATLMIDFNGEEKAWAMAVWIFAAINRRDLYEKAKRDEPKWGSDNARVS
NPTVICQEDSIEEEWMGLLEYLSRISICKMKKDYRKKYRKYVRSRFQCIEDRNARLGE
SVSLNKRYTRLRLIKEHRSQQEREQELLAIGKTKTCESPVSPIKMELLFDPDDEHSEP
VHTVVFQGAAGIGKTILARKMMLDWASGTLYQDRFDYLFYIHCREVSLVTQRSLGDLI
MSCCPDPNPPIHKIVRKPSRILFLMDGFDELQGAFDEHIGPLCTDWQKAERGDILLSS
LIRKKLLPEASLLITTRPVALEKLQHLLDHPRHVEILGFSEAKRKEYFFKYFSDEAQA
RAAFSLIQENEVLFTMCFIPLVCWIVCTGLKQQMESGKSLAQTSKTTTAVYVFFLSSL
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VFEPSW(配列番号539)
ヒトNLRP3タンパク質は、核酸配列NM_004895.1(配列番号530)、NM_183395(配列番号531)、NM_001079821(配列番号532)、NM_001127461(配列番号533)およびNM_001127462(配列番号534)を含むNLRP3遺伝子によってコードされ、ヒトNLRP3タンパク質は、NM_004895(配列番号539)のアミノ酸を有する。
NLRP3阻害剤はアンチセンスポリヌクレオチドをさらに含み、これを使用して、NLRP3遺伝子転写を阻害し、それによりNLRP3インフラマソーム活性化を阻害することができる。NLRP3をコードするポリヌクレオチドのセグメント(例えば、配列番号530~534に記載のポリヌクレオチド)に相補的なポリヌクレオチドは、NLRP3をコードするmRNAに結合し、そのようなmRNAの翻訳を阻害するように設計されている。アンチセンスポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるようなceDNAベクターによってコードされ、任意で、本明細書に開示される組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結され得る。
NLRP3 mRNAの阻害は、当業者に一般的に知られている方法に従って、RNAi分子を遺伝子サイレンシングすることによるものであり得る。例えば、ヒトNLRP3(NM_004895.1)を特異的に標的とする遺伝子サイレンシングsiRNAオリゴヌクレオチド二本鎖は、NLRP3発現をノックダウンするために容易に使用できる。NLRP3 mRNAは、siRNAを使用して首尾よく標的化することができ、標的mRNAの既知の配列に基づいて、当業者は他のsiRNA分子を容易に調製することができる。したがって、疑義を回避するために、当業者は、以下のようなNM_004895.1の核酸配列に対するRNAi(RNAサイレンシング)剤などの核酸阻害剤を設計することができる。
いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソームの阻害剤はsiRNAであり、それによりNLRP3インフラマソームのmRNAを阻害する。いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソームの阻害剤は、ヒトNLRP3発現を阻害するGUGCAUUGAAGACAGGAAUTT(配列番号540)(Wang et al.,Laboratory Invest.(2017)97:922-934、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、またはその断片またはそれと少なくとも50%、もしくは少なくとも60%、もしくは少なくとも70%、もしくは少なくとも80%もしくは少なくとも90%同一な相同体である。いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソーム阻害剤は、Santa Cruz(登録商標)(カタログ番号sc-40327)から入手可能なものなど、市販のsiRNAである。
いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソーム阻害剤は、ヒトNM_001079821.2、NCBI遺伝子114548(NLRP3)におけるRNAi標的配列に相補的なRNAiである。NLRP3を阻害するRNAi剤は、表5Aに示す配列番号541~551の17~21個の連続した塩基に相補的な核酸であり得る。
いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソーム阻害剤は、NLRP3の発現を阻害するmiRNA(miR)、またはNLRP3の発現を阻害するmiRのアゴニストである。NLRP3を阻害する例示的なmiRは、miR-9およびmiR-223である。
miR-9は、NLRP3インフラマソーム活性化を阻害する(Wang,Yue,et al.“MicroRNA-9 inhibits NLRP3 inflammasome activation in human atherosclerosis inflammation cell models through the JAK1/STAT signaling pathway.” Cellular Physiology and Biochemistry 41.4(2017):1555-1571.)。したがって、プレmiR-9(MiR-9前駆体)またはmiR-9を使用して、NLRP3を阻害することができる。成熟miR-9(MIMAT0000441)の配列は、5’-UCU UUG GUU AUC U AG CUG UAU GA-3’(配列番号587)である。 hsa-miR-9-5p(UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA)(配列番号588)。いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソーム阻害剤は、miR-9アゴニストSQ22538(SQ;9-(テトラヒドロ-2-フラニル)-9H-プリン-6-アミン)であり、これはmiR-9の発現を増加させることが報告された(Ham,Onju,et al.“Small molecule-mediated induction of miR-9 suppressed vascular smooth muscle cell proliferation and neointima formation after balloon injury.” Oncotarget 8.55(2017):93360.)。SQ22538の式は、次のとおりである。
miR-223は、NLRP3インフラマソームの活性を阻害する(Bauernfeind,Franz,et al.“NLRP3 inflammasome activity is negatively controlled by miR-223.” The Journal of Immunology 189.8(2012):4175-4181、Feng,Zunyong,et al.“Ly6G+ neutrophil-derived miR-223 inhibits the NLRP3 inflammasome in mitochondrial DAMP-induced acute lung injury.” Cell death&disease 8.11(2017):e3170)。miR-223はmmu-miR-223として合成できる。miR-223(5’-TGGGGTATTTGACAAACTGACA-3’(配列番号589)に相補的な配列の少なくとも1つ、または2つまたは3つまたは4つの区間を使用して、NLRP3を阻害することができる。cbn-mir-233 MI0024890は、UCGCCCAUCCCGUUGUUCCAAUAUUCCAACAACAAGUGAUUAUUGAGCAAUGCGCAUGUGCGG(配列番号590)の配列を有し、cbr-mir-233 MI0000530は、AAGCAUUUUUCUGUCCCGCGCAUCCCUUUGUUCCAAUAUUCAAACCAGUAGAAAGAUUAUUGAGCAAUGCGCAUGUGCGGGACAGAUUGAAUAGCUG(配列番号591)の配列を有し、cel-mir-233 MI0000308は、AUAUAGCAUCUUUCUGUCUCGCCCAUCCCGUUGCUCCAAUAUUCUAACAACAAGUGAUUAUUGAGCAAUGCGCAUGUGCGGGAUAGACUGAUGGCUGC(配列番号592)の配列を有し、crm-mir-233 MI0011059は、UGAAGCGUCUCUCUGUCCCGCUCAUCCUGUUGUUCCAAUAUUCCAACAGCCCAGUGAUUAUUGAGCAAUGCGCAUGUGCGGGACAGAUUGUAUGCUGCCAU(配列番号593)の配列を有する。
いくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソーム阻害剤は、NLRP3の発現または機能を抑制するmiRの発現を阻害する抗miRNA(抗miR)である。例示的な抗miRは、抗miR-22および抗miR-33である。miR22はNLRP3の発現を維持することが実証されている(Li,S.,et al.,“MiR-22 sustains NLRP3 expression and attenuates H.pylori-induced gastric carcinogenesis.”Oncogene 37.7(2018):884.)。miR-22の成熟配列は、hsa-miR-22(hsa-miR-22-5p MIMAT000449)であり、AGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUA(配列番号594)であり、下記のとおりのステムループ配列をもつ。hsa-mir-22 MI0000078は、GGCUGAGCCGCAGUAGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUAUGUCCUGACCCAGCUAAAGCUGCCAGUUGAAGAACUGUUGCCCUCUGCC(配列番号595)の配列を有する。
miR-33は、初代マクロファージにおけるNLRP3 mRNAおよびタンパク質の発現、ならびにカスパーゼ-1活性を上方調節することが報告されている(Xie,Qingyun,et al.“MicroRNA-33 regulates the NLRP3 inflammasome signaling pathway in macrophages.” Molecular medicine reports 17.2(2018):3318-3327).miR-33の成熟配列は、mmu-miR-33-5pまたはMIMAT0000667であり、GUGCAUUGUAGUUGCAUUGCA(配列番号596)であり、下記のとおりのステムループ配列をもつ。mmu-mir-33 MI0000707:CUGUGGUGCAUUGUAGUUGCAUUGCAUGUUCUGGCAAUACCUGUGCAAUGUUUCCACAGUGCAUCACGG(配列番号597)
したがって、いくつかの実施形態では、NLRP3の阻害剤は、配列番号594もしくは配列番号595の少なくとも一部、例えば15~25塩基長に相補的な抗miR-22であり、または、例えば、配列番号596もしくは配列番号597の15~21塩基長の少なくとも一部に相補的な抗miR-33である。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、NLRP3インフラマソームの阻害剤は、R&D Systems(ミネソタ州ミネアポリス)の抗ヒトNLRP3(カタログ番号AF6789)である。いくつかの実施形態では、NLRP3の抗体阻害剤は、ceDNAによってコードされる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、NLRP3の阻害剤は、NLRP3に結合する抗体または抗原結合断片である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、NLRP3に結合する抗体または抗原結合断片は、ceDNAによってコードされる。
NLRP3インフラマソーム阻害剤とは、インフラマソームの活性を阻害または少なくとも低減させる化合物を指し、グリブリドおよび機能的に同等なその前駆体または誘導体、カスパーゼ-1阻害剤、アデノシンモノホスフェート活性化プロテインキナーゼ(AMPK)活性化因子およびP2X7阻害剤を含む。NLRP3インフラマソームの阻害は、インフラマソームまたはカスパーゼ-1を阻害する単一の化合物または化合物の組み合わせによって達成できるが、cypイソ型、3A4、2C9および2C19などのチトクロームP450(cyp)酵素活性に変化をもたらさず、スタチンの代謝に悪影響を及ぼし、スタチンの生物学的利用能を低下させるだろう。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、NLRP3の阻害剤は、NLRP3に結合する抗体または抗原結合断片である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、NLRP3に結合する抗体または抗原結合断片は、ceDNAによってコードされる。
NLRP3インフラマソーム阻害剤とは、インフラマソームの活性を阻害または少なくとも低減させる化合物を指し、グリブリドおよび機能的に同等なその前駆体または誘導体、カスパーゼ-1阻害剤、アデノシンモノホスフェート活性化プロテインキナーゼ(AMPK)活性化因子およびP2X7阻害剤を含む。NLRP3インフラマソームの阻害は、インフラマソームまたはカスパーゼ-1を阻害する単一の化合物または化合物の組み合わせによって達成できるが、cypイソ型、3A4、2C9および2C19などのチトクロームP450(cyp)酵素活性に変化をもたらさず、スタチンの代謝に悪影響を及ぼし、スタチンの生物学的利用能を低下させるだろう。
AIM2インフラマソーム経路の阻害剤
いくつかの実施形態では、インフラマソームアンタゴニストはAIM2を阻害する。代わりにPISAとして知られるAIM2は、343アミノ酸のポリペプチドである(Genbank受入番号AF024714.1、RefSeq受入番号NP_004824.1を参照)(配列番号598)。AIM2はIFI20X/IF116ファミリーの一員であり、脾臓、小腸、末梢血白血球、および精巣で発現することが知られている。AIM2には、ASCとの相互作用に関与するPYDドメインと、dsDNAとの相互作用に関与するHIN200ドメインが含まれている。AIM2は、腫瘍形成性の復帰において推定上の役割を果たし、細胞増殖を制御する可能性がある。AIM2の発現は、インターフェロン-ガンマによって誘導される。
いくつかの実施形態では、インフラマソームアンタゴニストはAIM2を阻害する。代わりにPISAとして知られるAIM2は、343アミノ酸のポリペプチドである(Genbank受入番号AF024714.1、RefSeq受入番号NP_004824.1を参照)(配列番号598)。AIM2はIFI20X/IF116ファミリーの一員であり、脾臓、小腸、末梢血白血球、および精巣で発現することが知られている。AIM2には、ASCとの相互作用に関与するPYDドメインと、dsDNAとの相互作用に関与するHIN200ドメインが含まれている。AIM2は、腫瘍形成性の復帰において推定上の役割を果たし、細胞増殖を制御する可能性がある。AIM2の発現は、インターフェロン-ガンマによって誘導される。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、AIM2の阻害剤は、AIM2に結合する抗体または抗原結合断片である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、NLRP3に結合する抗体または抗原結合断片は、ceDNAによってコードされる。AIM2の阻害剤は、Farshchian et al.,Oncotarget 2017;8(28);45825-45836に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、AIM2インフラマソームの阻害剤は、ASCのPYDに干渉することが報告されている抗ヒトASCモノクローナル抗体(クローン23-4、MBL、名古屋、日本)である。いくつかの実施形態では、AIM2インフラマソームの阻害剤は、抗ヒトAIM2(カタログ番号8055)抗体(Cell Signaling Technology(登録商標)(マサチューセッツ州ビバリー)である。いくつかの実施形態では、AIM2インフラマソームの阻害剤は、最近(Khare et al.,2014、de Almeida et al.,2015)によって記載されたピリン含有タンパク質、またはSchauberと同僚によって報告された(Dombrowski et al.,2011)抗菌性カテリシジンペプチドなどの内因性AIM2阻害剤である。いくつかの実施形態では、AIM2インフラマソームの阻害剤は、Miriam Canavaseによるミニレビュー「the duality of AIM2 inflammasome:A focus on its role in autoimmunity and Skin diseases.Am.J.Pharm&Toxicology;2016」に開示された任意の化合物である。
いくつかの実施形態では、AIM2インフラマソームの阻害剤はP202であり、これはp202四量体であり、AIM2活性化を低下させ、ASCおよびAIM2インフラマソーム活性化のdsDNA依存性クラスタリングを防止したことが報告されている(Fernandes-Alnemri,Teresa,et al.“The AIM2 inflammasome is critical for innate immunity to Francisella tularensis.” Nature immunology 11.5(2010):385、Yin,Qian,et al.“Molecular mechanism for p202-mediated specific inhibition of AIM2 inflammasome activation.” Cell reports 4.2(2013):327-339)。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、P202は、ceDNAによってコードされる。
いくつかの実施形態では、AIM2インフラマソームの阻害剤は、WO2017/138586AまたはUS2013/0158100A1に記載されている小分子化合物のいずれかであり、各内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、AIM2の阻害剤は、AIM2に特異的なsiRNAなどのAIM2のRNA阻害剤である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、AIM2のRNA阻害剤は、ceDNAによってコードされる。ヒトAIM2タンパク質は、核酸配列NM_004833.2(配列番号600)を含むAIM2遺伝子によってコードされ、ヒトAIM2タンパク質は、NP_004824.1(配列番号598)のアミノ酸を有する。AIM2阻害剤は、AIM2遺伝子転写を阻害し、それによりAIM2インフラマソーム活性化を阻害するために使用できるアンチセンスポリヌクレオチドをさらに含む。AIM2をコードするポリヌクレオチドのセグメント(例えば、配列番号600に記載のポリヌクレオチド)に相補的なポリヌクレオチドは、AIM2をコードするmRNAに結合し、そのようなmRNAの翻訳を阻害するように設計されている。アンチセンスポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるようなceDNAベクターによってコードされ、任意で、本明細書に開示される組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結され得る。AIM2 mRNAの阻害は、当業者に一般的に知られている方法に従って、RNAi分子を遺伝子サイレンシングすることによるものであり得る。例えば、ヒトAIM2(NM_004833.2)を特異的に標的とする遺伝子サイレンシングsiRNAオリゴヌクレオチド二本鎖は、AIM2発現をノックダウンするために容易に使用できる。AIM2 mRNAは、siRNAを使用して首尾よく標的化することができ、標的mRNAの既知の配列に基づいて、当業者は他のsiRNA分子を容易に調製することができる。したがって、疑義を回避するために、当業者は、以下のようなNM_004833.2の核酸配列に対するRNAi(RNAサイレンシング)剤などの核酸阻害剤を設計することができる。
いくつかの実施形態では、AIM2インフラマソーム阻害剤はsiRNAであり、それによりAIM2インフラマソームのmRNAを阻害する。いくつかの実施形態では、AIM2インフラマソームの阻害剤は、ヒトAIM2の発現を阻害する5’-CCCGAAGATCAACACGCTTCA-3’(配列番号601)または5’-AAAGGTTAATGTCCCGCTGAA-3’(配列番号665)(両方ともFarshchian et al.Oncotarget(2017)8:45825-45836)、またはその断片またはそれと少なくとも50%、もしくは少なくとも60%、もしくは少なくとも70%、もしくは少なくとも80%、もしくは少なくとも90%同一な相同体である。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、AIM2インフラマソームの阻害剤は、AIM2に特異的なsiRNAなど、AIM2のRNA阻害剤である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、AIM2のRNA阻害剤は、ceDNAによってコードされる。AIM2 siRNAは、例えば、SI04261432(Qiagen(登録商標))、または、OpenBiosystems(登録商標)(アラバマ州ハンツビル)のRCN0000096104(#1)、TRCN0000096105(#2)、TRCN0000096106(#3)など、市販されている。
いくつかの実施形態では、AIM2インフラマソームの阻害剤は、ホスホロチオエート(PO)骨格を用いて合成されるA151(5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’(配列番号602)またはC151(5’-TTCAAATTCAAATTCAAATTCAAA-3’)(配列番号603)である。A151(ODN TTAGGGとも呼ばれる)は、哺乳動物のテロメアDNAに一般的に見られる免疫抑制性TTAGGG(配列番号604)モチーフの4反復を含む合成オリゴヌクレオチド(ODN)である(Steinhagen F.et al.,2017.Suppressive oligodeoxynucleotides containing TTAGGG motifs inhibit cGAS activation in human monocytes.Eur J Immunol)。A151は、細胞質dsDNAに応答してAIM2インフラマソーム活性化を遮断するが、ホスホチオエート(PO)骨格を要する(Kaminsji et al.,J Immunol 2013;191:3876-3883,Synthetic Oligodeoxynucleotides Containing Suppressive TTAGGG Motifs Inhibit AIM2 Inflammasome Activation、Eichholz K.et al.,2016.Immune-Complexed Adenovirus Induce AIM2-Mediated Pyroptosis in Human Dendritic Cells.PLoS Pathog.12(9):e1005871)。いくつかの実施形態では、AIM2インフラマソームの阻害剤は、A151(5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’(配列番号602)またはTTAGGGの少なくとも1つの反復(配列番号604)であり、それぞれホスホチオエート(PO)骨格を有する。いくつかの実施形態では、AIM2インフラマソームの阻害剤は、ホスホジエステル(PE)骨格を有しないA151(5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’(配列番号602)またはTTAGGGの少なくとも1つの反復(配列番号604)である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、AIM2インフラマソームの阻害剤は、対象に投与されるceDNAによってコードされる(例えば、ceDNAのその後の送達を含む)。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、対象に投与されるceDNAによってコードされるAIM2インフラマソームの阻害剤はA151(配列番号602)である。
いくつかの実施形態では、AIM2インフラマソーム阻害剤は、ヒトNM_001348247.1(配列番号566)、NCBI遺伝子9447(AIM2)におけるRNAi標的配列に相補的なRNAiである。AIM2を阻害するRNAi剤は、表5Cに示す配列番号605~610の17~21個の連続した塩基に相補的な核酸であり得る。
いくつかの実施形態では、AIM2インフラマソーム阻害剤は、AIM2の発現を阻害するmiRNA(miR)、またはAIM2の発現を阻害するmiRのアゴニストである。AIM2を阻害する例示的なmiRは、miR-223である(Yang,Fan,et al.“MicroRNA-223 acts as an important regulator to Kupffer cells activation at the early stage of Con A-induced acute liver failure via AIM2 signaling pathway.” Cellular Physiology and Biochemistry 34.6(2014):2137-2152)。したがって、本明細書で使用するAIM2阻害剤は、配列番号589~593のいずれか1つに対応するmiR-223である。
無細胞系で再構成されたインビトロAIM2インフラマソームは、Kaneko et al.,2015に開示されている方法、または米国出願第US2013/0158100A1号に開示されている方法に従って、AIM2インフラマソーム阻害剤をスクリーニングするためのツールとして使用でき、文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
カスパーゼ-1の阻害剤
いくつかの実施形態では、インフラマソームアンタゴニストはカスパーゼ-1を阻害する。いくつかの実施形態では、本方法および組成物で使用するためのカスパーゼ-1の阻害剤は、ベルナカサン(VX-765)である。VX-765は、ICE/カスパーゼ-1サブファミリーに属するカスパーゼの強力かつ選択的な阻害剤であるVRT-043198の経口吸収プロドラッグであり、次の式を有する。
(Wannamaker W.et al.,2007.(S)-1-((S)-2-{[1-(4-amino-3-chloro-phenyl)-methanoyl]-amino}-3,3-dimethyl-butanoyl)-pyrrolidine-2-carboxylic acid((2R,3S)-2-ethoxy-5-oxo-tetrahydro-furan-3-yl)-amide(VX-765),an orally available selective interleukin(IL)-converting enzyme/caspase-1 inhibitor,exhibits potent anti-inflammatory activities by inhibiting the release of IL-1beta and IL-18.J Pharmacol Exp Ther.321(2):509-16を参照)。
いくつかの実施形態では、インフラマソームアンタゴニストはカスパーゼ-1を阻害する。いくつかの実施形態では、本方法および組成物で使用するためのカスパーゼ-1の阻害剤は、ベルナカサン(VX-765)である。VX-765は、ICE/カスパーゼ-1サブファミリーに属するカスパーゼの強力かつ選択的な阻害剤であるVRT-043198の経口吸収プロドラッグであり、次の式を有する。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、以下の構造を有するZ-VAD-FMKであり、
細胞透過性汎カスパーゼ阻害剤であり、NLRP3誘導性細胞におけるカスパーゼ1活性化の強力な阻害剤である(Dostert C.et al.,2009.Malarial hemozoin is a Nalp3 inflammasome activating danger signal.PLoS One.4(8):e6510.)。Z-VAD-FMKは、カスパーゼプロテアーゼの触媒部位に不可逆的に結合する(Slee EA.et al.,1996.Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(OMe)fluoromethylketone(Z-VAD.FMK)inhibits apoptosis by blocking the processing of CPP32.Biochem J.315(Pt1):21-4)。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、以下の構造を有するAc-YVAD-cmkであり、
カスパーゼ1阻害剤であり、proIL-1β(YVHD)の標的配列に基づくクロロメチルケトンテトラペプチドである。Ac-YVAD cmkはインフラマソームの活性化を遮断し、故に抗炎症、抗アポトーシス、および抗パイロトーシスの効果を示すことが報告された。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、以下の構造を有するAc-YVAD-CHOである。
(Brenner,B.,et al.1998.Cell Death Differ.5:29-37.PMID:10200443)カスパーゼ-1基質(CAS143305-11-7)
ナツシロギク由来のセスキテルペンラクトンであるパルテノライドは、NF-κB活性化の既知の阻害剤であり、カスパーゼ-1ならびにNLRP3およびNLRP1インフラマソームを含む複数のインフラマソームの直接阻害剤でもある(Juliana C.et al.,2010.Anti-inflammatory compounds parthenolide and Bay 11-7082 are direct inhibitors of the inflammasome.J Biol Chem.285(13):9792-802)。パルテノライドは、NLRP3 ATPアーゼ活性に干渉することにより、NLRP3インフラマソームを直接阻害する。
Z-WEHD-FMK(ベンジルオキシカルボニル-V-A-D-O-メチルフルオロメチルケトンとしても知られる)。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、シコニンまたはアセチルシコニンであり、シコニンは、
であり、アセチルシコニンは、
である。シコニンは、伝統的な漢方薬で多面発現効果に使用されるLithospermum erythrorhizonの根に見出される親油性の高いナフトキノンであり、NLRP3インフラマソームの活性化を抑制する(Zorman et al.,PLOS One,2016;11(7);e0159826)。
一部の実施形態では、当業者が理解するように、カスパーゼ-1の阻害剤は小分子阻害剤であり得る。非限定的な例には、(S)-3-((S)-1-((S)-2-(4-アミノ-3-クロロベンズアミド)-3,3-ジメチルブタノイル)ピロリジン-2-カルボキサミド)-3-シアノ-プロパン酸などのシアノプロパネート含有分子、および(S)-1-((S)-2-{[1-(4-アミノ-3-クロロ-フェニル)-メタノイル]-アミノ}-3,3-ジメチル-ブタノイル)-ピロリジン-2-カルボン酸((2R,3S)-2-エトキシ-5-オキソ-テトラヒドロ-フラン-3-イル)-アミドが含まれる)などの他の小分子カスパーゼ-1阻害剤が含まれる。そのような阻害剤は、化学的に合成することができる。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、カスパーゼ-1酵素活性の直接的な阻害剤であり得るか、またはインフラマソーム会合またはインフラマソームシグナル伝搬の開始を阻害する間接的な阻害剤であり得る。本発明で使用するカスパーゼ-1阻害剤は、活性酸素種(ROS)阻害剤を含む抗酸化剤であり得る。このようなカスパーゼ-1阻害剤の例には、アピゲニン、ルテオリン、およびジオスミンなどのフラボン、ミリセチン、フィセチン、およびケルセチンなどのフラボノール、カテキン、ガロカテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、エピガロカテキン-3-ガレートおよびテアフラビンなどのフラバノールおよびそのポリマー、イソフラボン植物エストロゲン、ならびにレスベラトロールなどのスチルベノイドを含むフラボノイドが含まれるが、これらに限定されない。没食子酸およびサリチル酸などのフェノール酸およびそれらのエステル、アンドログラホリドおよびパルテノライドなどのテルペノイドまたはイソプレノイド、ビタミンA、C、Eなどのビタミン類、補酵素Q10、マンガン、およびヨウ化物などのビタミン補因子、クエン酸、シュウ酸、フィチン酸、およびアルファ-リポ酸などの他の有機抗酸化剤、ならびにRhus verniciflua stokes抽出物も含まれる。カスパーゼ-1阻害剤は、これらの化合物の組み合わせ、例えば、a-リポ酸、補酵素Q10およびビタミンEの組み合わせ、またはカスパーゼ1阻害剤とグリブリドなどの他のインフラマソーム阻害剤との組み合わせ、またはその機能的に同等の前駆体または誘導体であり得る。
いくつかのインフラマソーム阻害剤の投与量の例は次のとおりである。アピゲニン(約0.1~10mg/kg)、ルテオリン(約1~100mg)、ジオスミン(約100~900mg)、ミリセチン(約10~300mg)、ケルセチン(約10~1000mg)、フィセチン(1~200mg/kg)、Rhus verniciflua stokes抽出物(1~100mg/kg)、カテキン(約50~500mg)、ガロカテキン(約100~1000mg)、エピカテキン(約0.1~10mg/kg)、エピガロカテキン(約100~1000mg)、エピガロカテキン-3-ガレート(約100~1000mg)、テアフラビン(約75~750mg)、イソフラボン植物エストロゲン(約25~250mg)、レスベラトロール(約100~1000mg)、アンドログラホリド(約100~500mg)、パルテノライド(約0.1~50mg)、ビタミンA(約5000~20000IU)、ビタミンC(約100~2000mg)、補酵素Q10(約30~500mg)、ビタミンE(約10~1000IU)、a-リポ酸(約10~1000mg)、補酵素Q10(30~500mg)、マンガン(約1~100mg)、a-リポ酸、補酵素Q10およびビタミンE(それぞれ約10~1000mg、30~500mg、10~1000IU)、グリブリド(約1~20mg)、ならびにシクロヘキシル尿素部分を欠くグリブリド誘導体(約1~200mg)。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、米国特許第6,355,618号、同第6,632,962号、同第5,756,466号または国際出願第WO2001/042,216号、同第WO2004/064,713号、同第WO98/16502号、同第WO97/24339号、EP623592、およびDolle et al.,J.Med.Chem.39,2438(1996)、Dolle et al.,J.Med.Chem.40,1941(1997)に記載されている小分子化合物のいずれかであり、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、米国特許(Bemis et al.)でも報告されたカスパーゼ-1の非ペプチド阻害剤である。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、以下の構造を有するICE(カスパーゼ-1)阻害剤であり、
式中、R1は、とりわけ、R3CO-であり、R3は、とりわけ、C1~C6アルキル、アリール、ヘテロアリール、-(CHR)n-アリール、および-(CHR)n-ヘテロアリールであり、R2は様々な群から選択される。いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、以下の構造を有するICE(カスパーゼ-1)阻害剤であり、
式中、R1にはアリールおよびヘテロアリールが含まれ、Aはアミノ酸であり、nは0~4であり、mは0または1であり、R2はアリールである。いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、以下の構造を有するICE(カスパーゼ-1)阻害剤であり、
式中、R1にはアリールおよびヘテロアリールが含まれ、AA1およびAA2は単結合またはアミノ酸残基であり、Tetはテトラゾール環を表し、Zは、アルキレン、アルケニレン、O、Sなどを表し、EはH、アルキルなどを表す。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、カスパーゼ-1に特異的なsiRNAなどのカスパーゼ-1のRNA阻害剤である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、AIM2のRNA阻害剤は、ceDNAによってコードされる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、カスパーゼ-1に特異的なsiRNAなどのカスパーゼ-1のRNA阻害剤である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、カスパーゼ-1のRNA阻害剤は、ceDNAによってコードされる。本明細書のキットおよび組成物での使用に包含されるカスパーゼ-1siRNA配列の例は、WO2008/033,285、Keller,M.,et al.Cell.2008;132(5):818-831、Artlett,C.M.,et al.Arthritis and Rheumatology.2011 Jul;63(11):3563-3574、Burdette,D.,et al.J Gen Virology.2012,93:235-246に開示されており、これらはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。カスパーゼ-1に対するsiRNA配列も市販されており、当業者に知られている。
ヒトカスパーゼ-1タンパク質は、核酸配列NM_033292.3(配列番号611)を含むCASP1遺伝子によってコードされ、ヒトカスパーゼ-1タンパク質はNP_150634.1(配列番号612)のアミノ酸を有する。カスパーゼ-1阻害剤には、カスパーゼ-1遺伝子の転写を阻害し、それによってカスパーゼ-1ならびにNLRP3インフラマソームおよびAIM2インフラマソームの下流経路を阻害するために使用できるアンチセンスポリヌクレオチドがさらに含まれる。カスパーゼ-1をコードするポリヌクレオチド(例えば、配列番号611に記載のポリヌクレオチド)のセグメントに相補的なポリヌクレオチドは、カスパーゼ-1をコードするmRNAに結合し、そのようなmRNAの翻訳を阻害するように設計されている。アンチセンスポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるようなceDNAベクターによってコードされ、任意で、本明細書に開示される組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結され得る。
カスパーゼ-1またはプロカスパーゼ-1mRNAの阻害は、当業者に一般的に知られている方法に従って、RNAi分子を遺伝子サイレンシングすることによるものであり得る。例えば、ヒトカスパーゼ-1(NM_033292.3)を特異的に標的とする遺伝子サイレンシングsiRNAオリゴヌクレオチド二本鎖は、プロカスパーゼ-1発現をノックダウンするために容易に使用できる。カスパーゼ-1mRNAは、siRNAを使用して首尾よく標的化することができ、標的mRNAの既知の配列に基づいて、当業者は他のsiRNA分子を容易に調製することができる。したがって、疑義を回避するために、当業者は、以下のようなNM_033292.3の核酸配列に対するRNAi(RNAサイレンシング)剤などの核酸阻害剤を設計することができる。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1阻害剤は、NM_033292.3(配列番号611)のRNAi標的配列に相補的なRNAiであり、NCBI遺伝子834(CASP1)とも呼ばれる。カスパーゼ-1の現在の野生型転写産物には、NM_001223.4、NM_001257118.2、NM_001257119.2、NM_033292.3(配列番号611)、NM_033293.3、NM_033294.3、NM_033295.3、XM_017018393.1、XM_017018394.1、XM_017018395.1、XM_017018396.1が含まれる。カスパーゼ-1を阻害するRNAi剤は、表5Eに示す配列番号613~619の17~21個の連続した塩基間に相補的な核酸であり得る。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1阻害剤はsiRNAであり、それによりカスパーゼ-1(またはプロカスパーゼ-1プロタンパク質)のmRNAを阻害し、それによってNLRP3インフラマソームおよび/またはAIM2インフラマソームの下流経路を阻害する。いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1阻害剤は、ヒトカスパーゼ-1の発現を阻害するGAA GGC CCA UAU AGA GAA A(配列番号904、センス鎖の配列が示されている)またはその断片またはそれと少なくとも50%、もしくは少なくとも60%、もしくは少なくとも70%、もしくは少なくとも80%、もしくは少なくとも90%同一な相同体である。本明細書のキットおよび組成物での使用に包含されるカスパーゼ-1siRNA配列の例は、WO2008/033285、または米国出願第US2009/0280058号、Keller,M.,et al.Cell.2008;132(5):818-831、Artlett,C.M.,et al.Arthritis and Rheumatology.2011 Jul;63(11):3563-3574、Burdette,D.,et al.J Gen Virology.2012,93:235-246に開示されており、これらはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
NLRP3、AIM2、およびカスパーゼ-1に対するカスタムsiRNAは、Dharmacon Research,Inc.(コロラド州ラファイエット)に発注して生成できる。カスタムsiRNA調製の他の供給源には、アラバマ州ハンツビルのXeragon Oligonucleotidesおよびテキサス州オースティンのAmbionが含まれる。代わりに、siRNAはリボヌクレオシドホスホラミダイトおよびDNA/RNA合成機を用いて化学合成できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、RNAiまたはsiRNAであるNLRP3、AIM2およびカスパーゼ-1を、ceDNAにコードすることができる。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、以下の構造を有するカスパーゼ-1基質(CAS143305-11-7)であり、
これは、次の配列を有する。Asn-Glu-Ala-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn(配列番号538)。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、カスパーゼ-1の阻害剤は、対象に投与されるceDNAによってコードされる(例えば、ceDNAのその後の送達を含む)。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、対象に投与されるceDNAによってコードされるカスパーゼ-1の阻害剤は、カスパーゼ-1基質(配列番号538)である。
RNAiは、様々なmRNAを標的とするように設計できる。RNAi、例えばsiRNAを設計するための一般的な戦略は、AUG終止コドンで開始し、次にAAジヌクレオチド配列について所望のcDNA標的の長さをスキャンすることを含む。AA配列に隣接する3’の19ヌクレオチドは、潜在的なsiRNA標的部位として記録された。次に、潜在的な標的部位を適切なゲノムデータベースと比較し、非標的遺伝子と有意な相同性を有する標的配列を破棄できるようにした。遺伝子の長さに沿った複数の標的配列が位置し、標的配列はmRNAの3’、5’および中間部分に由来した。陰性対照siRNAは、対象siRNAと同じヌクレオチド組成を使用して生成されたが、トランスフェクトされる細胞の任意の遺伝子に対する配列相同性を欠くように混ぜて確認した(Elbashir,S.M.,et al.,2001,Nature,411,494-498;Ambion siRNA Design Protocol,at www.ambion.com)。
標的配列は17~25塩基の長さであり、最適にはAAで始まる21塩基の長さであり得る。標的配列に結合するRNAiまたはsiRNAは、一方の鎖の5つのC6炭素でチオール基で修飾された。
VII.使用の方法
本明細書に開示される、例えば免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現のためのceDNAベクターは、関心対象のヌクレオチド配列(例えば、自然免疫応答の阻害剤をコードする)を標的細胞(例えば、宿主細胞)に送達するための方法においても使用できる。本方法は、特に、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤をそれを必要とする対象の細胞に送達し、免疫障害を治療するための方法、または自然免疫系を低減もしくは抑制するための方法であり得る。本発明は、インフラマソームアンタゴニストの発現の治療効果が生じるように、対象の細胞におけるceDNAベクターにコードされる免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤のインビボ発現を可能にする。これらの結果は、ceDNAベクター送達のインビボおよびインビトロの両様式で見られる。
本明細書に開示される、例えば免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現のためのceDNAベクターは、関心対象のヌクレオチド配列(例えば、自然免疫応答の阻害剤をコードする)を標的細胞(例えば、宿主細胞)に送達するための方法においても使用できる。本方法は、特に、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤をそれを必要とする対象の細胞に送達し、免疫障害を治療するための方法、または自然免疫系を低減もしくは抑制するための方法であり得る。本発明は、インフラマソームアンタゴニストの発現の治療効果が生じるように、対象の細胞におけるceDNAベクターにコードされる免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤のインビボ発現を可能にする。これらの結果は、ceDNAベクター送達のインビボおよびインビトロの両様式で見られる。
さらに、本発明は、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を、例えば、それを必要とする対象の細胞に送達するための方法を提供し、本方法は、インフラマソームアンタゴニストをコードする本発明のceDNAベクターの複数回投与を含む。本発明のceDNAベクターは、カプシド形成されたウイルスベクターに対して典型的に観察されるような免疫応答を誘導しないため、そのような複数回投与戦略は、ceDNAベースの系においてより大きな成功を収めるであろう。ceDNAベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、例えば、過度の副作用なしに、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の十分なレベルの遺伝子導入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路には、網膜投与(例えば、網膜下注射、脈絡膜上注射または硝子体内注射)、静脈内(例えば、リポソーム製剤で)、選択された器官への直接送達(例えば、肝臓、腎臓、胆嚢、前立腺、副腎、心臓、腸、肺、および胃から選択される任意の1つ以上の組織)、筋肉内、および他の親投与経路が含まれるが、これらに限定されない。所望される場合、投与経路を組み合わせることができる。
本明細書に記載の、例えば免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターの送達は、発現された阻害剤の送達に限定されない。例えば、従来の方法で産生された(例えば、細胞ベースの産生方法(例えば、昆虫細胞産生方法)を使用して)または合成的に産生された本明細書に記載されるceDNAベクターは、遺伝子療法の一部を提供するために提供される他の送達系とともに使用され得る。本開示に従ってceDNAベクターと組み合わされ得る系の1つの非限定的な例は、阻害剤を発現するceDNAベクターの効果的な遺伝子発現のために1つ以上の補因子または免疫抑制因子を別個に送達する系を含む。
本発明はまた、治療有効量のceDNAベクターを、任意に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞(特に筋細胞または組織)に導入することを含む、対象における免疫反応、例えば、自然免疫反応を抑制する方法も提供する。ceDNAベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。選択されたceDNAベクターは、例えば、免疫系の治療または抑制に有用な免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤をコードするヌクレオチド配列を含む。特に、ceDNAベクターは、対象に導入された場合に、外因性DNA配列によってコードされる所望のインフラマソームアンタゴニストの転写を指示することができる制御要素に作動可能に連結された所望のインフラマソームアンタゴニストを含み得る。ceDNAベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
本明細書で提供される組成物およびベクターは、例えば様々な目的で、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を送達するために使用することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の機能を研究するために使用されることが意図される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤をコードする。別の例では、導入遺伝子は、抑制された免疫系または免疫不全の対象の動物モデルを作成するために使用されることを意図した免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤をコードする。いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)のコードされた阻害剤は、対象における、例えば、遺伝子療法などに応答して、哺乳動物の対象における増強された免疫応答または増強された自然免疫状態の治療または予防に有用である。免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤は、対象における増強された免疫応答を低減または予防するのに十分な量で患者に移行(例えば、発現)することができる。
ceDNAベクターは、1種のceDNAベクターに限定されない。そのようなものとして、別の態様では、異なるタンパク質、または例えば異なるプロモーターもしくはシス調節要素に作動可能に連結されるが同じ免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤を発現する複数のceDNAベクターは、標的細胞、組織、器官、または対象に同時にまたは順次に送達され得る。したがって、この戦略では、複数のインフラマソームアンタゴニストの遺伝子療法または遺伝子送達を同時に行うことができる。阻害剤の異なる部分を別々のceDNAベクターに分離することも可能であり(例えば、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の機能に必要な異なるドメインおよび/または補因子)、例えば、同時にまたは異なる時間に投与することができ、別々に調節可能であり、それによって1つ以上の阻害剤の発現制御の追加レベルを付加する。送達はまた、複数回、および重要なことに、ウイルスカプシドの不在に起因する抗カプシド宿主免疫反応の欠失を仮定して、後に増加または減少する用量で臨床状況において遺伝子療法のために実施され得る。カプシドが存在しないため、抗カプシド反応は起こらないと予想される。
本発明はまた、治療有効量の本明細書に開示されるようなceDNAベクターを、任意に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞(特に筋細胞または組織)に導入することを含む、対象における免疫反応、例えば、自然免疫反応を抑制する方法も提供する。ceDNAベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるceDNAベクターは、関心対象のヌクレオチド配列、例えば、対象における自然免疫系の抑制、または増強された免疫状態の低減に有用な免疫応答の阻害剤を含む。特に、ceDNAベクターは、対象に導入されたときに、外因性DNA配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御要素に操作可能に連結された所望の外因性DNA配列を含み得る。ceDNAベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
エクスビボ治療
いくつかの実施形態では、細胞を対象から除去し、例えば、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターをその中に導入した後、細胞を対象に戻す。エクスビボでの治療のために対象から細胞を除去し、続いて対象に戻す方法は、当該技術分野において既知である(例えば、米国特許第5,399,346号を参照されたく、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。代替的に、ceDNAベクターは、別の対象からの細胞中に、培養細胞中に、または任意の他の好適な源からの細胞中に導入され、これらの細胞は、それを必要とする対象に投与される。
いくつかの実施形態では、細胞を対象から除去し、例えば、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターをその中に導入した後、細胞を対象に戻す。エクスビボでの治療のために対象から細胞を除去し、続いて対象に戻す方法は、当該技術分野において既知である(例えば、米国特許第5,399,346号を参照されたく、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。代替的に、ceDNAベクターは、別の対象からの細胞中に、培養細胞中に、または任意の他の好適な源からの細胞中に導入され、これらの細胞は、それを必要とする対象に投与される。
例えば、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターで形質導入された細胞は、好ましくは薬学的担体と組み合わせて、「治療有効量」で対象に投与される。当業者であれば、いくらかの利益が対象にもたらされる限り、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞内で産生される、本明細書に記載されるインフラマソームアンタゴニスト(導入遺伝子または異種ヌクレオチド配列と呼ばれることもある)をコードすることができる。例えば、本明細書で論じられる治療方法における本明細書に記載のceDNAベクターの使用とは対照的に、いくつかの実施形態では、免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターを培養細胞に導入し、発現したインフラマソームアンタゴニストを、例えば、抗体および融合タンパク質の産生のために細胞から単離することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターを含む培養細胞は、抗体または融合タンパク質の商業的産生に使用することができ、例えば、抗体または融合タンパク質の小規模または大規模バイオ製造の細胞源として役立つ。代替的な実施形態では、本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターは、小規模な産生を含む抗体または融合タンパク質のインビボ産生ならびにインフラマソームアンタゴニストの商業的な大規模産生のために、宿主非ヒト対象の細胞に導入される。
本明細書に開示される免疫応答(例えば、自然免疫応答)の阻害剤の発現用ceDNAベクターは、獣医学的および医学的適用の両方で使用することができる。上記のエクスビボ遺伝子送達方法に好適な対象としては、鳥類(例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、七面鳥、およびキジ)および哺乳動物(例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、およびウサギ類)が挙げられ、哺乳動物が好ましい。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は、新生児、幼児、年少者、および成人を含む。
文献参照、発行済み特許、公開済みの特許出願、および係属中の特許出願を含む、本出願を通して引用されるすべての特許および他の出版物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を説明および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行発明のおかげで、またはいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関するすべての記述またはこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態および実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップまたは機能は、所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、または機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照文献および出願の構成、機能、および概念を用いて本開示のさらなる実施形態を提供するように修正することができる。さらに、生物学的機能の同等性の考慮により、種類または量の生物学的または化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更および他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正はすべて、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
前述の実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせるか、または置き換えることができる。さらに、本開示のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、すべての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
本明細書に記載される技術は、以下の実施例によってさらに説明されており、決してこれらをさらに限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例1:TTXプラスミドの構築
図4C(TTX-R)または図4D(TTX-L)に示す構造スキームを有するTTXフォーマットプラスミドを調製した。TTX-RおよびTTX-Lプラスミドの例は、以下の表6Aに記載されている。TTX-RおよびTTX-Lプラスミドは、図4Cおよび図4Dに示すように、変異したAAV2 ITR配列の位置がそれぞれ異なる。TTX-Rプラスミド(TTX-プラスミド1、3、5、および7)は、TTX-ベクターを産生するために、本明細書に開示される分子クローニングによって生成された。TTX-ベクター(TTX-ベクター2、4、6、8)の産生に使用するためのTTX-Lプラスミド(TTX-プラスミド2、4、6、および8)。各TTX-Rプラスミドは、図4Dに示すように、(a)AAV2の野生型逆位末端反復(ITR)、(b)発現カセットおよび(c)AAV2の修飾逆位末端反復(ITR)を含む。
図4C(TTX-R)または図4D(TTX-L)に示す構造スキームを有するTTXフォーマットプラスミドを調製した。TTX-RおよびTTX-Lプラスミドの例は、以下の表6Aに記載されている。TTX-RおよびTTX-Lプラスミドは、図4Cおよび図4Dに示すように、変異したAAV2 ITR配列の位置がそれぞれ異なる。TTX-Rプラスミド(TTX-プラスミド1、3、5、および7)は、TTX-ベクターを産生するために、本明細書に開示される分子クローニングによって生成された。TTX-ベクター(TTX-ベクター2、4、6、8)の産生に使用するためのTTX-Lプラスミド(TTX-プラスミド2、4、6、および8)。各TTX-Rプラスミドは、図4Dに示すように、(a)AAV2の野生型逆位末端反復(ITR)、(b)発現カセットおよび(c)AAV2の修飾逆位末端反復(ITR)を含む。
ceDNAプラスミド(すなわち、ceDNAベクターを後で産生するために使用されるceDNAベクターテンプレートを含むプラスミド)は、既知の技術を使用して構築することができ、少なくとも好ましくは、転写方向に作動可能に連結された成分として次のものを提供する。5’ITR(変異型またはAAV野生型)、プロモーター、関心対象の外因性DNA配列を含む制御要素、転写終結領域、および3’ITR(対応するAAV ITRの変異型または野生型)。特に、ITR内のヌクレオチド配列は、実質的にrepおよびcapコード領域を置き換える。rep配列は、理想的にはヘルパープラスミドまたはベクターによってコードされるが、代わりにベクタープラスミド自体によって運ばれることもできる。このような場合、rep配列は、ITRに挟まれた領域の外側に位置することが好ましいが、ITRに挟まれた領域内に位置することもできる。所望の外因性DNA配列は、細胞、組織、器官、または対象(すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ)におけるコードされたポリペプチド、タンパク質、またはそれらのオリゴヌクレオチドの転写または発現を指示する制御要素に作動可能に連結されている。そのような制御要素は、通常、選択された遺伝子に関連する制御配列を含むことができる。代わりに、異種制御配列を使用することができる。有用な異種制御配列には、一般に、哺乳動物またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものが含まれる。
ceDNAベクターの望ましい外因性DNA配列は、細胞、組織、器官、または対象(すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ)におけるコードされたポリペプチド、タンパク質、またはそれらのオリゴヌクレオチドの転写または発現を指示する制御要素に作動可能に連結することができる。そのような制御要素は、通常、選択された遺伝子に関連する制御配列を含むことができる。代わりに、異種制御配列を使用することができる。有用な異種制御配列には、一般に、哺乳動物またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものが含まれる。例として、SV40初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)、単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモーター、CMV前初期プロモーター領域(CMVIE)などのサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどのプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子に由来する配列も、本明細書で使用される。多くのAAV血清型のITR配列が知られている。
各TTXプラスミド(TTX-RとTTX-Lの両方)の発現カセットには、ITR配列間に次のものが含まれる。(i)エンハンサー/プロモーター、(ii)導入遺伝子のクローニング部位、(iii)WHP転写後応答要素(WPRE)、および(iv)ウシ成長ホルモン遺伝子(BGHpA)からのポリアデニル化シグナル。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位(R1~6)(例えば、図4Cおよび図4Dを参照)もまた、各構成要素の間に導入されて、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成要素の導入を促進した。R3およびR4酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位に設計される。これらの配列を、ThermoFisher Scientificから取得したpFastBac HT Bプラスミドにクローニングした。
すべてのTTXプラスミドは外因性配列をさらに含み、導入遺伝子(ホタルルシフェラーゼ、または「Luc」またはヒト因子IX、または「FIX」)のオープンリーディングフレームも、外因性配列をクローニング部位に挿入することによって生成された。表6Aに提供されるTTXプラスミドの複数例の構造は、それぞれ、図4D(右側変異AAV ITR)または図4C(左側変異ITR)のパターンで構築された。各TTXプラスミドには、(a)発現カセットの左側(L)または右側(R)のいずれかでプラスミドにコードされた変異AAV2逆位末端反復(ITR)ポリヌクレオチド配列、および(b)発現カセットの反対端にある野生型(未変異)AAV2 ITR配列に隣接しているエンハンサー/プロモーターおよび導入遺伝子(例えば、様々なプロモーターをもつルシフェラーゼまたはCAGプロモーターをもつFIX)、翻訳後調節要素(WPRE)、およびポリアデニル化終結シグナル(BGHポリA)が含まれた。
表6AのTTXプラスミドは、ルシフェラーゼ導入遺伝子と右側ITRとの間の構成要素として、配列番号8を含むWPREおよび配列番号9を含むBGHpAを用いて構築された。さらに、各TTXプラスミド(TTX-1からTTX-10)は、ルシフェラーゼまたは第IX因子(配列番号12のPadua FIXまたは配列番号11のFIX)ORFレポーター配列の両側にR3/R4クローニング部位(配列番号7)も含んだ。
表6Aを参照。
●「wt-L」は、発現カセット(配列番号51のポリヌクレオチド配列を含む)の左側でプラスミドにコードされる野生型AAV2 ITRを指す。
●「wt-R」は、発現カセット(配列番号1のポリヌクレオチド配列を含む)の右側でプラスミドにコードされる野生型AAV2 ITRを指す。
●「変異型-L」は、配列番号52で提供される変異AAV2 ITR配列を指す。
●「変異型-R」は、配列番号2で提供される変異AAV2 ITR配列を指す。
●「CAG」とは、配列番号3の(C)サイトメガロウイルス前初期エンハンサーおよびプロモーター要素、(A)ニワトリベータアクチン遺伝子の第1エクソンおよび第1イントロン、(G)ウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターから構成される合成プロモーターを指す。
●「AAT w/SV40 intr」は、配列番号4のSV40大型T抗原イントロンを有する(ヒトアルファ1-アンチトリプシン)AATを指す。そして
●「hEF1-α」は、配列番号6のヒト伸長因子-1アルファ(EF-1アルファ)を指す。
●「wt-L」は、発現カセット(配列番号51のポリヌクレオチド配列を含む)の左側でプラスミドにコードされる野生型AAV2 ITRを指す。
●「wt-R」は、発現カセット(配列番号1のポリヌクレオチド配列を含む)の右側でプラスミドにコードされる野生型AAV2 ITRを指す。
●「変異型-L」は、配列番号52で提供される変異AAV2 ITR配列を指す。
●「変異型-R」は、配列番号2で提供される変異AAV2 ITR配列を指す。
●「CAG」とは、配列番号3の(C)サイトメガロウイルス前初期エンハンサーおよびプロモーター要素、(A)ニワトリベータアクチン遺伝子の第1エクソンおよび第1イントロン、(G)ウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターから構成される合成プロモーターを指す。
●「AAT w/SV40 intr」は、配列番号4のSV40大型T抗原イントロンを有する(ヒトアルファ1-アンチトリプシン)AATを指す。そして
●「hEF1-α」は、配列番号6のヒト伸長因子-1アルファ(EF-1アルファ)を指す。
表6Bの各構築物は、導入遺伝子と変異型-RITRの間の3’非翻訳領域(UTR)に位置する、修飾されたSV40ポリA配列(配列番号10)を含む。
「LP-1 β」は、LP-1 βプロモーター(配列番号16)を指し、これは、2つの追加の制限酵素部位を有するLP-1プロモーター(配列番号5)と同じである。
一実施形態では、ベクターポリヌクレオチド(ceDNAベクター)は、配列番号1および配列番号52、ならびに配列番号2および配列番号51からなる群から選択される2つの異なるITR対を含む。これらの態様のそれぞれの一実施形態では、ベクターポリヌクレオチドまたは共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクターは、配列番号101および配列番号102、配列番号103、および配列番号104、配列番号105、および配列番号106、配列番号107、および配列番号108、配列番号109、および配列番号110、配列番号111、および配列番号112、配列番号113および配列番号114、および配列番号115および配列番号116からなる群から選択される1対のITRを含む。いくつかの実施形態では、ceDNAベクターは、配列番号500~529から選択される任意の配列を含むITRを有しない。
実施例2:直鎖状、連続的、および非カプセル化DNAベクターを生成するためのバクミドおよびバキュロウイルス
DH10Bacコンピテント細胞(MAX Efficiency(登録商標)DH10Bac(商標)コンピテント細胞、Thermo Fisher、カタログ番号10361012)は、製造元により提供されウェブサイトで入手できるプロトコルに従って、TTXまたは対照プラスミドのいずれかで形質転換された(Thermo Fisher、https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10361012のワールドワイドウェブで見出される)。DH10Bac細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えバクミド(「TTX-バクミド」)を生成した。X-galおよびIPTGを含有する細菌寒天平板上のE.coli中の青白スクリーニング(Φ80dlacZΔM15マーカーは、バクミドベクターからのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子のα-相補性を提供する)に基づく正の選択によって、組み換えバクミドを選択した。白いコロニーを採取し、10mlの培地で培養した。
DH10Bacコンピテント細胞(MAX Efficiency(登録商標)DH10Bac(商標)コンピテント細胞、Thermo Fisher、カタログ番号10361012)は、製造元により提供されウェブサイトで入手できるプロトコルに従って、TTXまたは対照プラスミドのいずれかで形質転換された(Thermo Fisher、https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10361012のワールドワイドウェブで見出される)。DH10Bac細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えバクミド(「TTX-バクミド」)を生成した。X-galおよびIPTGを含有する細菌寒天平板上のE.coli中の青白スクリーニング(Φ80dlacZΔM15マーカーは、バクミドベクターからのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子のα-相補性を提供する)に基づく正の選択によって、組み換えバクミドを選択した。白いコロニーを採取し、10mlの培地で培養した。
組み換えバクミド(「TTX-バクミド」)をE.coliから単離し、FugeneHD(商標)を使用してSf9またはSf21昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着したSf9またはSf21昆虫細胞を、25℃のT25フラスコ中の50mLの培地で培養した。4日後、培養培地(P0ウイルスを含む)を細胞から除去し、0.45μmフィルターで濾過し、感染性組み換えバキュロウイルス粒子(「TTX-バキュロウイルス」または「比較バキュロウイルス」)は、バキュロウイルスを培養中の細胞から分離した。
任意選択的に、第1世代のバキュロウイルス(P0)を、ナイーブSf9またはSf21昆虫細胞を感染させることによって50~500mLの培地中で増幅させた。細胞を、130rpm、25℃で培養し、細胞が(14~15nmのナイーブ直径から)18~19nmの直径に到達するまで、細胞直径および生存性、ならびに約4.0E+6細胞/mLの密度を監視した。感染3日後~8日後に、培地中のP1バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に収集し、細胞および残屑を除去した後、0.45μmフィルターで濾過した。
TTX-バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を判定した。具体的には、2.5E+6細胞/mlで4×20mlのSf9細胞培養物を、以下の希釈:1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000のP1バキュロウイルスで処理し、インキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存率の変化によって4~5日間にわたって毎日判定した。
Rep78配列(配列番号13)は、Rep78配列が、3’末端のHSV TKポリA配列に連結されるように、IE1プロモーター断片(配列番号15)に作動可能に連結され、次にpFASTBAC(商標)-二重発現ベクター(ThermoFisherカタログ番号:10712024)のBamHI/KpnI制限部位に挿入された。次に、Rep52配列(配列番号14)をベクターのSalI-HindIII部位にクローニングして、Rep52配列を5’上のpPHプロモーターおよび3’上のSV40ポリA配列に作動可能に連結させた。得られた構築物は、本明細書では「Rep-プラスミド」と呼ばれる。
Rep-プラスミドを、製造元によって提供され、ウェブサイト(Thermo Fisher(登録商標)、https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10361012)で入手できるプロトコルに従って、DH10Bacコンピテント細胞(MAX EFFICIENCY(登録商標)DH10Bac(商標)コンピテント細胞、Thermo Fisher、カタログ番号10361012)に形質転換した。DH10Bac細胞中のRep-プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えバクミド(「Rep-バクミド」)を生成した。X-galおよびIPTGを含有する細菌寒天平板上のE.coli中の青白スクリーニング(Φ80dlacZΔM15マーカーは、バクミドベクターからのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子のα-相補性を提供する)に基づく正の選択によって、組み換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、10mLの選択培地(LBブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラシクリン)中に播種した。組み換えバクミド(Rep-バクミド)をE.coliから単離し、Rep-バクミドをSf9またはSf21昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。
Sf9またはSf21昆虫細胞を、50mLの培地中で4日間培養し、感染性組み換えバキュロウイルス(「Rep-バキュロウイルス)を、培養物から単離した。任意選択的に、第1世代のRep-バキュロウイルス(P0)を、ナイーブSf9またはSf21昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、50~500mLの培地中で培養した。感染3日後~8日後に、培地中のP1バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、または濾過もしくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Rep-バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を判定した。具体的には、2.5×106細胞/mlの4×20ml Sf9細胞培養物を、次の希釈1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000のP1バキュロウイルスで処理し、インキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存率の変化によって4~5日間にわたって毎日判定した。
次いで、(1)TTXもしくはα(アルファ)-バキュロウイルス、または(2)上記のRep-バキュロウイルスのいずれかを含有するSf細胞培養培地を、Sf9細胞(2.5E+6細胞/mL、20mL)の新鮮な培養物に、1:1000および1:10,000の比でそれぞれ添加した。次いで、細胞を25℃、130rpmで培養した。同時感染の4~5日後に、細胞の直径および生存率が検出される。生存率が約70~80%で細胞直径が18~20nmに到達したとき、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを収集した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地(水または緩衝液のいずれか)に再懸濁する。TTXまたはα(アルファ)-ベクターを単離し、Qiagen Midi Plus精製プロトコル(Qiagen カタログ番号12945、カラムあたり0.2mgの処理された細胞ペレット質量)を使用して、細胞から精製した。
Sf9昆虫細胞から産生および精製されるDNAベクター(例えば、TTXベクター)の収率は、最初に、260nmでのUV吸光度に基づいて判定した。UV吸光度に基づいて判定された様々なTTX-DNAベクターの収率を表7に提供する。
実施例3:ceDNAベクターの産生を同定するための変性ゲル電気泳動
したがって、定義によって必要とされるように、単離されたDNAベクター材料が共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、単一制限部位を有するとDNAベクター配列によって同定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ(例えば、1000bpおよび2000bp)の2つの切断産物をもたらす。変性ゲル(2つの相補的DNA鎖を分離する)上の消化および電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的に閉じたDNAは、2つのDNA鎖が連結され、展開されて2倍の長さであるとき(但し、一本鎖である)、1000bpおよび2000bpのサイズで溶解するが、共有結合的に閉じたDNAは、2倍サイズ(2000bpおよび4000bp)で溶解するであろう。さらに、DNAベクターの単量体、二量体、およびn量体形態の消化は、多量体DNAベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片としてすべて溶解するであろう(図5Bを参照)。
したがって、定義によって必要とされるように、単離されたDNAベクター材料が共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、単一制限部位を有するとDNAベクター配列によって同定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ(例えば、1000bpおよび2000bp)の2つの切断産物をもたらす。変性ゲル(2つの相補的DNA鎖を分離する)上の消化および電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的に閉じたDNAは、2つのDNA鎖が連結され、展開されて2倍の長さであるとき(但し、一本鎖である)、1000bpおよび2000bpのサイズで溶解するが、共有結合的に閉じたDNAは、2倍サイズ(2000bpおよび4000bp)で溶解するであろう。さらに、DNAベクターの単量体、二量体、およびn量体形態の消化は、多量体DNAベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片としてすべて溶解するであろう(図5Bを参照)。
本明細書で使用される場合、「未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるDNAベクターの同定のためのアッセイ」という句は、以下のアッセイを指す。制限エンドヌクレアーゼの場合、DNAベクターの長さの約1/3倍および2/3倍の製品を生成するシングルカット酵素を選択する。これは、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Qiagen PCR clean-upキット(Qiagen カタログ番号28104)または脱塩「スピンカラム」、例えば、GE HealthCare Ilustra(商標)MicroSpin(商標)G-25カラム(GE Healthcare カタログ番号27532501)は、エンドヌクレアーゼ消化でうまく機能する。
1.適切な制限エンドヌクレアーゼ(複数可)でDNAを消化する
2.Qiagen PCR clean-upキットに適用し、dH2O(30ul)で溶出する
3.4ulの10倍変性溶液(10x=0.5M NaOH、10mM EDTA)を追加する
4.6ulの10倍ゲルローディング溶液を追加する(色素とグリセロールまたはフィコール、緩衝化していない)
5.DNAラダーは、Qiagenキットを使用せずに、10倍の変性溶液を追加することで4倍の最終濃度に調製できる。
6.0.8~1.0%のゲルをH2Oで電子レンジで沸騰するまで調製し、周囲温度で数分間静置する。
7.コームを備えたゲルトレーに注ぎ、低温室に置いて重合を促進する(2時間)
8.トレーを電気泳動ボックスに入れ、1mM EDTAおよび200mM NaOHで2時間平衡化し、時折撹拌して、ゲルとゲルボックスのNaOH濃度が均一になるようにする。
9.1Lの1倍変性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)を作製する。
10.ゲルが0.5cm超の深さまで浸るように、十分な量をゲルボックスに注ぐ。
11.大きなゲル(15~20cm)-25Vで一晩ゲルを泳動する。中程度のゲル(8~11cm)は、20Vで一晩泳動する。
ゲル泳動後
12.ゲルをトレーに移し、dH2Oで洗浄する
13.排出し、1xTBEまたはTAEでゲルを中和する(穏やかに撹拌しながら20分)
14.ゲルを1xSYBR Goldを含むdH2O(または1xTBE/TAE)に移す(穏やかに撹拌しながら20分)
Thermo Fisher,SYBR(登録商標)Gold核酸ゲル染色(DMSOで10,000倍濃縮)カタログ番号S11494
15.落射蛍光(青)またはUV(312nm)による画像ゲル
1.適切な制限エンドヌクレアーゼ(複数可)でDNAを消化する
2.Qiagen PCR clean-upキットに適用し、dH2O(30ul)で溶出する
3.4ulの10倍変性溶液(10x=0.5M NaOH、10mM EDTA)を追加する
4.6ulの10倍ゲルローディング溶液を追加する(色素とグリセロールまたはフィコール、緩衝化していない)
5.DNAラダーは、Qiagenキットを使用せずに、10倍の変性溶液を追加することで4倍の最終濃度に調製できる。
6.0.8~1.0%のゲルをH2Oで電子レンジで沸騰するまで調製し、周囲温度で数分間静置する。
7.コームを備えたゲルトレーに注ぎ、低温室に置いて重合を促進する(2時間)
8.トレーを電気泳動ボックスに入れ、1mM EDTAおよび200mM NaOHで2時間平衡化し、時折撹拌して、ゲルとゲルボックスのNaOH濃度が均一になるようにする。
9.1Lの1倍変性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)を作製する。
10.ゲルが0.5cm超の深さまで浸るように、十分な量をゲルボックスに注ぐ。
11.大きなゲル(15~20cm)-25Vで一晩ゲルを泳動する。中程度のゲル(8~11cm)は、20Vで一晩泳動する。
ゲル泳動後
12.ゲルをトレーに移し、dH2Oで洗浄する
13.排出し、1xTBEまたはTAEでゲルを中和する(穏やかに撹拌しながら20分)
14.ゲルを1xSYBR Goldを含むdH2O(または1xTBE/TAE)に移す(穏やかに撹拌しながら20分)
Thermo Fisher,SYBR(登録商標)Gold核酸ゲル染色(DMSOで10,000倍濃縮)カタログ番号S11494
15.落射蛍光(青)またはUV(312nm)による画像ゲル
単離されたDNAベクター-ベクターは、図5および図6に示すように、未変性または変性条件下でアガロースゲル電気泳動によって同定される。DNAベクターは、図5Aに提示されるように、変性ゲルに複数のバンドを生成する。各バンドは、未変性状態で異なるコンフォメーションを有するベクター、例えば連続、非連続、単量体、二量体などを表し得る。
単離されたDNAベクターの構造を、共感染Sf9細胞から得られたDNA(本明細書に記載されるように)を、a)DNAベクター内の単一切断部位のみの存在、およびb)0.8%変性アガロースゲル(>800bp)上で分画した場合に明らかに見えるほど十分に大きい、得られる断片について選択された、制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、さらに分析した。
具体的には、等量(OD260に基づいて2μg)のTTX-プラスミドおよびTTX-ベクターを、制限エンドヌクレアーゼを用いて37℃で1時間消化した。消化後、QIAquickカラムを使用してDNAベクター材料を単離し、水で溶出した。水中で作成した0.8%アガロースゲルを2時間平衡緩衝液(1mM EDTA、200mM NaOH)で前平衡化しながら、試料を変性溶液(0.05M NaOH、1mM EDTA)で変性させた。次に、1倍変性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)に漬けたゲルに試料を4℃で一晩泳動した。翌日、ゲルを洗浄し、TBEで20分間中和し、1xSYBR Gold水溶液に1時間浸漬し、UV/青照明の下で画像化した。
DNAベクターの存在は、最初に未変性ゲルで特徴的な複数バンドのパターン(一次バンドと二次バンドでは間隔が空いており、二次バンドが一次バンドの質量の約2倍の物質を表すことが示される)によって同定され、その後、図5Aの右側に示される特徴的な複数バンドのパターンにより変性ゲルで確認される。図5Bに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状DNAベクターおよび直鎖状かつ連続的な構造を有するTTX-ベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するDNAベクターは、1kbおよび2kb断片を産生することが期待されるが、連続的な構造を有する非カプシド化ベクターは、2kbおよび4kb断片を産生することが期待される。
図6は、TTXベクター1および2、3および4、5および6および7および8(すべて上記の表1Aに記載)を有する実際の変性ゲルの例示的な写真であり、エンドヌクレアーゼ消化あり(+)またはなし(-)である。各TTXベクターは、エンドヌクレアーゼ反応後に2つのバンド(*)を産生した。サイズマーカーに基づいて決定された2つのバンドのサイズは、写真の下に表示される。バンドのサイズは、各TTXベクトルが連続構造を有することを確認する。
UV吸収に対するTTXプラスミドの寄与は、TTXベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定された。例えば、UV吸光度に基づいて、4μgのTTXベクターをゲルに装填し、TTXベクターの蛍光強度が、1μgであることが知られている2kbバンドに相当する場合、1μgのTTXベクターが存在する。したがって、TTXベクターは、総UV吸収材料の25%である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全TTX-ベクターが8kbであり、切除された比較バンドが2kbである場合、バンド強度は、全インプットの25%としてプロットされ、この場合、1.0μgのインプットに対して0.25μgとなる。TTXプラスミド滴定を使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、TTXベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、TTXベクターにより表される全インプットのパーセント、または純度パーセントを判定することができる(図7)。
実施例4:DNAベクターは、インビトロで導入遺伝子によってコードされたタンパク質を発現する。
ヒト因子IX mRNAのSA野生型cDNA配列(「wtFIX」、配列番号11)またはcDNA配列のPadua変異型(「PaduaFIX」、配列番号12)は、TTXプラスミド1のクローニング部位に導入され、TTX-プラスミド1-wtFIXおよびTTX-プラスミド1-PaduaFIXをそれぞれ生成した。本明細書に記載の方法を用いて、これらのプラスミドをSf9昆虫細胞に導入し、使用して、TTX-バクミド1-wtFIXおよびTTX-バクミド1-PaduaFIX、ならびにTTX-バキュロウイルス1-wtFIXおよびTTX-バキュロウイルス1-PaduaFIXをそれぞれ生成した。TTXプラスミドおよびTTXベクターからのインビトロのタンパク質発現は、Fugene6トランスフェクション試薬(3:1 Fugene6:DNA)を使用して、250ng/ウェルの(1)TTX-プラスミド1-wtFIX、(2)TTX-プラスミド1-PaduaFIX、(3)TTX-ベクター1-wtFIX、(4)TTX-ベクター1-PaduaFIX、(5)β(ベータ)-プラスミド1-wtFIX、または(6)β(ベータ)-ベクター1-wtFIXでHEK293細胞(2E+5細胞/ウェル、96ウェルプレート)をトランスフェクションすることにより試験した。ウェスタンブロット分析の結果を図8に示す。FIX抗体反応により、産生されたFIXタンパク質の質量に対応する55kDaのバンドが明らかになった。β(ベータ)-プラスミド1-wtFIXまたはβ(ベータ)-ベクター1-wtFIXでトランスフェクションされた陰性対照溶解物は、検出可能な量のFIXタンパク質を産生しなかった。この結果は、TTX-ベクター1が、ヒト第IX因子をコードする遺伝子などの治療遺伝子の効果的な導入および発現に使用できることを確認している。
ヒト因子IX mRNAのSA野生型cDNA配列(「wtFIX」、配列番号11)またはcDNA配列のPadua変異型(「PaduaFIX」、配列番号12)は、TTXプラスミド1のクローニング部位に導入され、TTX-プラスミド1-wtFIXおよびTTX-プラスミド1-PaduaFIXをそれぞれ生成した。本明細書に記載の方法を用いて、これらのプラスミドをSf9昆虫細胞に導入し、使用して、TTX-バクミド1-wtFIXおよびTTX-バクミド1-PaduaFIX、ならびにTTX-バキュロウイルス1-wtFIXおよびTTX-バキュロウイルス1-PaduaFIXをそれぞれ生成した。TTXプラスミドおよびTTXベクターからのインビトロのタンパク質発現は、Fugene6トランスフェクション試薬(3:1 Fugene6:DNA)を使用して、250ng/ウェルの(1)TTX-プラスミド1-wtFIX、(2)TTX-プラスミド1-PaduaFIX、(3)TTX-ベクター1-wtFIX、(4)TTX-ベクター1-PaduaFIX、(5)β(ベータ)-プラスミド1-wtFIX、または(6)β(ベータ)-ベクター1-wtFIXでHEK293細胞(2E+5細胞/ウェル、96ウェルプレート)をトランスフェクションすることにより試験した。ウェスタンブロット分析の結果を図8に示す。FIX抗体反応により、産生されたFIXタンパク質の質量に対応する55kDaのバンドが明らかになった。β(ベータ)-プラスミド1-wtFIXまたはβ(ベータ)-ベクター1-wtFIXでトランスフェクションされた陰性対照溶解物は、検出可能な量のFIXタンパク質を産生しなかった。この結果は、TTX-ベクター1が、ヒト第IX因子をコードする遺伝子などの治療遺伝子の効果的な導入および発現に使用できることを確認している。
ELISA:簡潔に述べれば、トランスフェクションされた細胞からの培養培地を抗FIX抗体処理ウェルに2連で加え、1時間インキュベーションし、続いて洗浄し、室温で1時間検出抗体とインキュベーションした。試料を再度洗浄し、TMB基質を添加して10分間展開し、停止し、試料の450nmでの吸光度を即時に読み取った。TMB基質反応後の試料の例を図15Aに示し、450nmでの試料の吸光度に基づいて決定された各試料中のFIX濃度を図15Aに示す。TTX-プラスミド1およびTTX-ベクター1からはFIXタンパク質の高レベルの発現が検出されたが、β(比較)-プラスミドまたはβ(比較)ベクターからはFIXの有意な発現は検出されなかった。
これにより、5’から3’のWT複製ポリヌクレオチド配列(配列番号51)、CAGプロモーター(配列番号3)、R3/R4クローニング部位(配列番号7)、WPRE(配列番号8)、BGHpA(配列番号9)、および修飾複製ポリヌクレオチド配列(配列番号2)を含むTTX-プラスミド1から産生されたTTX-ベクター1を、WPRE(配列番号8)およびBGHpA(配列番号9)を含まないα(アルファ)-プラスミド1から産生されたα(アルファ)-ベクター1と比較すると、導入遺伝子の発現を誘導するのに有意に効果的であることが再度確認される。
実施例5:第IX因子およびcGAS阻害剤を共発現するceDNAの調製
cGASを阻害するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ORF52(配列番号882)もしくはその変異型、または配列番号882のアミノ酸161~1162を欠く切断された細胞質LANAイソ型(LANAΔ161または配列番号884)は、実施例1および実施例4に記載されているように、プロモーターに作動可能に連結され、第IX因子導入遺伝子をコードするTTX9またはTTX10プラスミドの制限クローニング部位R5に挿入される。したがって、実施例2~3に記載されるように、第IX因子およびcGAS阻害剤の両方をコードするceDNAが調製される。
cGASを阻害するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ORF52(配列番号882)もしくはその変異型、または配列番号882のアミノ酸161~1162を欠く切断された細胞質LANAイソ型(LANAΔ161または配列番号884)は、実施例1および実施例4に記載されているように、プロモーターに作動可能に連結され、第IX因子導入遺伝子をコードするTTX9またはTTX10プラスミドの制限クローニング部位R5に挿入される。したがって、実施例2~3に記載されるように、第IX因子およびcGAS阻害剤の両方をコードするceDNAが調製される。
実施例6:ceDNAによって発現されるcGAS阻害剤の発現の確認
cGASを阻害するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ORF52(配列番号882)もしくはその変異型、または切断された細胞質LANAイソ型(配列番号884)などのceDNAによって共発現する所望のcGAS阻害剤の発現は、HeLa細胞およびcGAS阻害剤に特異的な抗体、例えばLiらに記載されているORF52に対する抗体を使用して確認できる。(“Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus inhibitor of cGAS(KicGAS)Encoded by ORF52,is an Abundant Tegument protein and Is Required for Production of Infectious Progeny Viruses,”J.Virol.2016,90(11):5329)。例えば、HeLA細胞を培養し、例えば、Fusegene6トランスフェクション試薬(3:1;fusgene6:DNA)を使用して、第IX因子および所望のcGAS阻害剤を共発現する構築物の一過性トランスフェクションを実施する。当業者に知られているウェスタンブロット技術および/またはフローサイトメトリーは、cGAS阻害剤の発現を検出するために使用される。第IX因子の発現は、実施例4で説明されているように確認される。
cGASを阻害するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ORF52(配列番号882)もしくはその変異型、または切断された細胞質LANAイソ型(配列番号884)などのceDNAによって共発現する所望のcGAS阻害剤の発現は、HeLa細胞およびcGAS阻害剤に特異的な抗体、例えばLiらに記載されているORF52に対する抗体を使用して確認できる。(“Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus inhibitor of cGAS(KicGAS)Encoded by ORF52,is an Abundant Tegument protein and Is Required for Production of Infectious Progeny Viruses,”J.Virol.2016,90(11):5329)。例えば、HeLA細胞を培養し、例えば、Fusegene6トランスフェクション試薬(3:1;fusgene6:DNA)を使用して、第IX因子および所望のcGAS阻害剤を共発現する構築物の一過性トランスフェクションを実施する。当業者に知られているウェスタンブロット技術および/またはフローサイトメトリーは、cGAS阻害剤の発現を検出するために使用される。第IX因子の発現は、実施例4で説明されているように確認される。
実施例7:第IX因子およびTLR-9阻害剤を共発現するceDNAの調製
(TCCTGGCGGGGAAGT、配列番号889)、ODN-2114(TCCTGGAGGGGAAGT、配列番号890)、ポリ-G(GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、配列番号891)、ODN-A151(TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、配列番号892)、G-ODN(CTCC-TATTGGGGGTTTCCTAT、配列番号893)、IRS-869(TCCTGGAGGGGTTGT、配列番号894)、INH-1(CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG、配列番号895)、INH-4(TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA、配列番号896)、(IRS-661 TGCTTGCAAGCTT-GCAAGCA、配列番号897)、4024(TCCTGGATGGGAAGT、配列番号898)、4084F(CCTGGATGGGAA、配列番号:899)、INH-13(CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA、配列番号900)、INH-18(CCTGGATGGGAACTTACCGCTGCA、配列番号901)、およびIRS-954 TGCTCCTGGAGGGGTTGT、配列番号902)などの以下の配列を含むヘアピン構造を形成できるオリゴヌクレオチドは、実施例1および実施例4に記述されているとおり、例えば、R5または第IX因子導入遺伝子をコードするTTX9もしくはTTX10プラスミドの他の部位など、事前に選択された制限クローニング部位にライゲーションによって挿入できるように、5’から3’鎖と相補的な3’から5’鎖のアニーリング後、付着末端を有するように設計される。
(TCCTGGCGGGGAAGT、配列番号889)、ODN-2114(TCCTGGAGGGGAAGT、配列番号890)、ポリ-G(GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、配列番号891)、ODN-A151(TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、配列番号892)、G-ODN(CTCC-TATTGGGGGTTTCCTAT、配列番号893)、IRS-869(TCCTGGAGGGGTTGT、配列番号894)、INH-1(CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG、配列番号895)、INH-4(TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA、配列番号896)、(IRS-661 TGCTTGCAAGCTT-GCAAGCA、配列番号897)、4024(TCCTGGATGGGAAGT、配列番号898)、4084F(CCTGGATGGGAA、配列番号:899)、INH-13(CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA、配列番号900)、INH-18(CCTGGATGGGAACTTACCGCTGCA、配列番号901)、およびIRS-954 TGCTCCTGGAGGGGTTGT、配列番号902)などの以下の配列を含むヘアピン構造を形成できるオリゴヌクレオチドは、実施例1および実施例4に記述されているとおり、例えば、R5または第IX因子導入遺伝子をコードするTTX9もしくはTTX10プラスミドの他の部位など、事前に選択された制限クローニング部位にライゲーションによって挿入できるように、5’から3’鎖と相補的な3’から5’鎖のアニーリング後、付着末端を有するように設計される。
例えば、適切な制限部位をもつオリゴは、各鎖を好適な緩衝液(例えば、100mM酢酸カリウム、30mM HEPES、pH7.5)で等モル量で混合することによりアニーリングし、94℃で2分間加熱し、徐々に冷却する。多くの二次構造を有すると予測されるオリゴの場合、より緩やかな冷却/アニーリングステップが有益である。これは、オリゴ溶液を水浴またはヒートブロックに入れ、機械のプラグを抜く/電源を切ることによって行われる。アニーリングされたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼを含まない緩衝液中で希釈され、4℃で二本鎖のアニーリングされた形態で保存され得る。次に、TLR-9阻害性オリゴ配列を有するceDNAプラスミドを精製し(例えば、ゲル電気泳動またはカラムにより)、cDNAベクターを作製するために使用する。第IX因子をコードし、TLR-9アンタゴニストを含むceDNAを調製することができる。
実施例8:ceDNAからの制御された導入遺伝子発現:インビボでのceDNAベクターからの導入遺伝子発現は、再用量投与によって持続および/または増加させることができる。
ceDNAベクターは、CAGプロモーター(配列番号3)、および非対称ITR(例えば、5´WT-ITR(配列番号1)と3´mod-ITR(配列番号2))の間に隣接したインフラマソームアンタゴニストとして使用されるルシフェラーゼ導入遺伝子(配列番号71)を含むceDNAプラスミドを使用して、上記の実施例1に記載される方法に従って産生され、異なる治療パラグラムにおいてインビボで評価された。このceDNAベクターは、実施例6~10に記載されているすべての後続の実験で使用された。実施例6では、ceDNAベクターを精製し、脂質ナノ粒子(LNP ceDNA)で製剤化し、各CD-1(登録商標)IGSマウスの尾静脈に注入した。リポソームは、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、およびPEG脂質を含む脂質ナノ粒子(LNP)リポソームを形成するための4つの構成成分を含む適切な脂質ブレンドで製剤化された。
ceDNAベクターは、CAGプロモーター(配列番号3)、および非対称ITR(例えば、5´WT-ITR(配列番号1)と3´mod-ITR(配列番号2))の間に隣接したインフラマソームアンタゴニストとして使用されるルシフェラーゼ導入遺伝子(配列番号71)を含むceDNAプラスミドを使用して、上記の実施例1に記載される方法に従って産生され、異なる治療パラグラムにおいてインビボで評価された。このceDNAベクターは、実施例6~10に記載されているすべての後続の実験で使用された。実施例6では、ceDNAベクターを精製し、脂質ナノ粒子(LNP ceDNA)で製剤化し、各CD-1(登録商標)IGSマウスの尾静脈に注入した。リポソームは、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、およびPEG脂質を含む脂質ナノ粒子(LNP)リポソームを形成するための4つの構成成分を含む適切な脂質ブレンドで製剤化された。
ceDNAベクターからのインビボでの導入遺伝子の持続的な発現を長期間にわたって評価するために、LNP-ceDNAをおよそ5~7週齢のCD-1(登録商標)IGSマウスに尾静脈内注入によって滅菌PBSで投与した。3つの異なる投与量群:0.1mg/kg、0.5mg/kg、および1.0mg/kgを、群あたり10匹のマウス(群あたり15匹のマウスを有していた1.0mg/kgを除く)を評価した。注入は、0日目に投与された。各群からの5匹のマウスに、28日目に追加の同一用量を注入した。ルシフェラーゼ発現は、CD-1(登録商標)IGSマウス(Charles River Laboratories,WTマウス)への静脈内投与後のIVIS撮像によって測定された。ルシフェラーゼ発現は、3、4、7、14、21、28、31、35、および42日目、ならびに定期的に(例えば、毎週、隔週、または10日毎、または2週間毎)、42~110日に150mg/kgのルシフェリン基質を腹腔内注入した後、IVIS撮像によって評価した。3つの異なる投与プロトコル後、少なくとも132日間IVIS撮像によって測定された例示的インフラマソームアンタゴニストとしてのルシフェラーゼ導入遺伝子の発現(データは示していない)。
再用量、例えばLNP-ceDNAで治療した対象のLNP-ceDNA発現ルシフェラーゼの再投与の効果を調査するために、延長研究を実施した。特に、ceDNAベクターの1回以上の追加投与によって発現レベルが増加され得るかどうかを決定するために評価した。
この研究では、ceDNAベクターからのルシフェラーゼ発現の生体内分布を、0日目および28日目(群A)における、1.0mg/kg(すなわち、プライミング用量)の初回静脈内投与後にCD-1(登録商標)IGSマウスにおけるIVISによって評価した。ceDNAベクターの第2の投与は、84日目に、1.2mLの3mg/kg(B群)または10mg/kg(C群)の尾静脈注入によって投与した。この研究では、群A、B、およびCの各々における5匹のCD-1(登録商標)マウスを使用した。上記のような49、56、63、および70日目の追加投与前、ならびに84日目と91、98、105、112、および132日目の再用量後に、ルシフェラーゼ発現についてのマウスのIVIS撮像を実施した。ルシフェラーゼ発現は、少なくとも110日(評価された最長期間)まで、群A、B、およびCの3つすべてにおいて評価され、検出された。
ルシフェリンの存在下でのルシフェラーゼ活性の評価によって決定されるように、ルシフェラーゼの発現レベルは、LNP-ceDNA-Lucの再用量(すなわち、ceDNA組成物の再投与)によって増加することが示された。3つの異なる投与プロトコル後、少なくとも110日間IVIS撮像によって測定された例示的インフラマソームアンタゴニストとしてのルシフェラーゼ導入遺伝子の発現(A、BおよびC群)。追加の再用量(1mg/kgプライミング用量(すなわち、群A)治療を受けなかったマウスは、研究の期間にわたって安定したルシフェラーゼ発現が観察された。3mg/kgの再用量のceDNAベクターを投与されたB群のマウスは、C群のマウスと比較して、観察された放射輝度のおよそ7倍の増加を示した。驚いたことに、10mg/kgのceDNAベクターは、いかなる再用量も受けていないマウス(A群)と比較して、観察されたルシフェラーゼ放射輝度が17倍増加した。
A群は、0日目および28日目での尾静脈への1mg/kgのceDNAベクターの静脈内投与後の、CD-1(登録商標)IGSマウスにおけるルシフェラーゼ発現を示す。B群およびC群は、第1の時点(0日目)で1mg/kgのceDNAベクターを投与され、84日目の第2の時点でceDNAベクターの投与により再投与されたCD-1(登録商標)IGSマウスにおけるルシフェラーゼ発現を示す。ceDNAベクターの第2の投与(すなわち、再用量)は、発現を少なくとも7倍、最大で17倍まで増加させた。
B群の再用量投与におけるceDNAベクターの用量(すなわち、量)の3倍増加(すなわち、3mg/kgが再用量で投与される)は、ルシフェラーゼの発現の7倍増加をもたらした。また、予期せぬことに、C群の再用量投与(すなわち、10mg/kgの再用量が投与される)におけるceDNAベクターの量の10倍増加は、ルシフェラーゼの発現の17倍増加をもたらした。したがって、ceDNAの第2の投与(すなわち、再用量)は、発現を少なくとも7倍、最大で17倍まで増加させた。これは、再用量による導入遺伝子発現の増加が予想よりも大きく、再用量投与におけるceDNAベクターの用量または量に依存することを示し、0日目での初回プライミング投与からの初期導入遺伝子発現と相乗的であるように見える。すなわち、導入遺伝子発現の用量依存的増加は相加的ではなく、むしろ導入遺伝子の発現レベルは用量依存的であり、各時点で投与されるceDNAベクターの量の合計よりも大きい。
B群およびC群の両方は、第2の時点で、ceDNAベクターを再投与されなかった対照マウス(A群)と比較して、ルシフェラーゼの発現に有意な用量依存的増加を示した。まとめると、これらのデータは、ceDNAベクターからの導入遺伝子の発現が、少なくとも第2の時点でceDNAベクターの再用量(すなわち、再投与)によって、用量依存的に増加され得ることを示す。
まとめると、これらのデータは、ceDNAベクターからの導入遺伝子、例えば、インフラマソームアンタゴニストの発現レベルが少なくとも84日間にわたって持続レベルで維持され得、少なくとも第2の時点で投与されたceDNAベクターの再用量後にインビボで増加され得ることを実証する。
実施例9:過飽和量のラパマイシンを含む合成ナノ担体
ポリマーPLGA(3:1ラクチド:グリコリド、固有粘度0.39dL/g)およびPLA-PEG(5kDa PEGブロック、固有粘度0.36dL/g)、および薬剤ラパマイシン(RAPA)を含むナノ担体組成物を水中油型乳化蒸発法を使用して合成できる。ポリマーおよびRAPAをジクロロメタンに溶解して有機相を形成する。乳濁液は、界面活性剤のポリビニルアルコール(PVA)を含む水相中で有機相を均質化することによって形成される。次に、乳濁液を大量の水性緩衝液と合わせ、混合して溶媒を蒸発させる。異なる組成物のRAPA含量は、RAPA含量が増加するにつれて組成物がシステムのRAPA飽和限界を超えるように変化する。組成物の飽和限界におけるRAPA含量は、水相および分散ナノ担体相におけるRAPAの溶解度を使用して計算される。水相中の一次溶質としてPVAを含む組成物では、水相中のRAPAの溶解度は、RAPAが溶解したPVAに対して1:125の質量比で溶解するように、PVA濃度に比例することが見出される。記載のPLGAおよびPLA-PEGをナノ担体ポリマーとして含む組成物では、分散ナノ担体相におけるRAPAの溶解度は7.2%重量/重量であることが見出される。次の式を使用して、組成物の飽和限界でのRAPA含量を算出できる。
RAPA含量=V(0.008cPVA+0.072cpol)
ポリマーPLGA(3:1ラクチド:グリコリド、固有粘度0.39dL/g)およびPLA-PEG(5kDa PEGブロック、固有粘度0.36dL/g)、および薬剤ラパマイシン(RAPA)を含むナノ担体組成物を水中油型乳化蒸発法を使用して合成できる。ポリマーおよびRAPAをジクロロメタンに溶解して有機相を形成する。乳濁液は、界面活性剤のポリビニルアルコール(PVA)を含む水相中で有機相を均質化することによって形成される。次に、乳濁液を大量の水性緩衝液と合わせ、混合して溶媒を蒸発させる。異なる組成物のRAPA含量は、RAPA含量が増加するにつれて組成物がシステムのRAPA飽和限界を超えるように変化する。組成物の飽和限界におけるRAPA含量は、水相および分散ナノ担体相におけるRAPAの溶解度を使用して計算される。水相中の一次溶質としてPVAを含む組成物では、水相中のRAPAの溶解度は、RAPAが溶解したPVAに対して1:125の質量比で溶解するように、PVA濃度に比例することが見出される。記載のPLGAおよびPLA-PEGをナノ担体ポリマーとして含む組成物では、分散ナノ担体相におけるRAPAの溶解度は7.2%重量/重量であることが見出される。次の式を使用して、組成物の飽和限界でのRAPA含量を算出できる。
RAPA含量=V(0.008cPVA+0.072cpol)
1、2、および3では、一貫した60%のRAPAが回収されず、水相と有機相の間の飽和未満の平衡型を示している。より多量のRAPAを含む残りのナノ担体では、一貫した6.8mgのRAPAが回収されない。この一貫した絶対質量損失は、システムが過飽和型にあることを示している(つまり、1つ以上の相で過飽和である)。
実施例10:過飽和ラパマイシンを含む合成ナノ担体は、抗体の発生を排除または遅延させる
ポリマーPLGA(3:1ラクチド:グリコリド、固有粘度0.39dL/g)およびPLA-PEG(5kDa PEGブロック、固有粘度0.36dL/g)、および薬剤RAPAを含むナノ担体組成物を、実施例5に記載される水中油型乳化蒸発法を用いて合成される。異なる組成物のRAPA含量は、RAPA含量が増加するにつれて組成物がシステムのRAPA飽和限界を超えるように変化する。
ポリマーPLGA(3:1ラクチド:グリコリド、固有粘度0.39dL/g)およびPLA-PEG(5kDa PEGブロック、固有粘度0.36dL/g)、および薬剤RAPAを含むナノ担体組成物を、実施例5に記載される水中油型乳化蒸発法を用いて合成される。異なる組成物のRAPA含量は、RAPA含量が増加するにつれて組成物がシステムのRAPA飽和限界を超えるように変化する。
免疫寛容を誘導する組成物の能力を評価するために、同時投与されるナノ担体とキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)とをマウスに週3回静脈内注射し、その後KLHのみを毎週抗原投与する。次いで、マウスの血清は、KLH抗原投与後にKLHに対する抗体について分析される。過飽和状態で作製され、最終RAPA装填が8%以上の組成物は、飽和以下で作製され、最終RAPA装填が5%以下の組成物よりも大きな程度でKLHに対する抗体の発生の欠如または遅延を引き起こした。
実施例11:過飽和量のラパマイシンを含む合成ナノ担体
ポリマーPLA(固有粘度0.41dL/g)およびPLA-PEG(5kDa PEGブロック、固有粘度0.50dL/g)、および薬剤RAPAを含むナノ担体組成物を、実施例9に記載される水中油型乳化蒸発法を用いて合成された。異なる組成物のRAPA含量は、RAPA含量が増加したのにつれて組成物がシステムのRAPA飽和限界を超えるように変化した。組成物の飽和限界におけるRAPA含量は、実施例9に記載の方法を使用して計算した。記載のPLAおよびPLA-PEGをナノ担体ポリマーとして含む組成物では、分散ナノ担体相におけるRAPAの溶解度は8.4%重量/重量であることが見出された。次の式を使用して、組成物の飽和限界でのRAPA含量を算出した。
RAPA含量=V(0.008cPVA+0.084cpol)
ポリマーPLA(固有粘度0.41dL/g)およびPLA-PEG(5kDa PEGブロック、固有粘度0.50dL/g)、および薬剤RAPAを含むナノ担体組成物を、実施例9に記載される水中油型乳化蒸発法を用いて合成された。異なる組成物のRAPA含量は、RAPA含量が増加したのにつれて組成物がシステムのRAPA飽和限界を超えるように変化した。組成物の飽和限界におけるRAPA含量は、実施例9に記載の方法を使用して計算した。記載のPLAおよびPLA-PEGをナノ担体ポリマーとして含む組成物では、分散ナノ担体相におけるRAPAの溶解度は8.4%重量/重量であることが見出された。次の式を使用して、組成物の飽和限界でのRAPA含量を算出した。
RAPA含量=V(0.008cPVA+0.084cpol)
ナノ担体12~15へのRAPAの添加量の増加にもかかわらず、ナノ担体の最終RAPA含量は増加しなかったが、フィルター処理量は減少した。これは、組成物がRAPAで過飽和になっており、過剰なRAPAが洗浄および/または濾過中に除去されることを示している。
実施例12:ラパマイシンと同時投与された第IX因子または第VIII因子をコードするceDNAをもつ血友病Bについての第IX因子または第VIII因子
実験は、有害な変異(例えば、hF1Xの場合はR333Q)を有するhFIXまたはhFVIII配列のノックインを含む第IX因子または第VIII因子欠損マウスで行われる。雄の第IX因子または第FVIII因子ノックアウトマウスは、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体と同時投与されるLNP-ceDNA(脂質ナノ粒子ceDNA)の単回投与または反復投与を受け、LNP-ceDNAおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体は別個の組成物に含まれる。LNP-ceDNAベクターは、1.2mLの容量で0.3~5mg/kgの用量で、それぞれのマウスに同時投与され、ナノ担体ラパマイシン(実施例9~11に記載されるように、例えば、過飽和ラパマイシン(例えば、SVP-ラパマイシン))またはその類似体は、例えば、0.05mg/kgで、0.1mg/kgから5mg/kgまでで投与される。治療上有効な用量は、免疫応答の阻害の有効性をモニタリングし(例えば、単回投与および反復投与)、望ましい導入遺伝子の発現量を測定することによって決定される。各用量は、静脈内投与により投与することができる。SVP-Rapは、例えば、0日目と14日目に同時投与することができる。
実験は、有害な変異(例えば、hF1Xの場合はR333Q)を有するhFIXまたはhFVIII配列のノックインを含む第IX因子または第VIII因子欠損マウスで行われる。雄の第IX因子または第FVIII因子ノックアウトマウスは、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体と同時投与されるLNP-ceDNA(脂質ナノ粒子ceDNA)の単回投与または反復投与を受け、LNP-ceDNAおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体は別個の組成物に含まれる。LNP-ceDNAベクターは、1.2mLの容量で0.3~5mg/kgの用量で、それぞれのマウスに同時投与され、ナノ担体ラパマイシン(実施例9~11に記載されるように、例えば、過飽和ラパマイシン(例えば、SVP-ラパマイシン))またはその類似体は、例えば、0.05mg/kgで、0.1mg/kgから5mg/kgまでで投与される。治療上有効な用量は、免疫応答の阻害の有効性をモニタリングし(例えば、単回投与および反復投与)、望ましい導入遺伝子の発現量を測定することによって決定される。各用量は、静脈内投与により投与することができる。SVP-Rapは、例えば、0日目と14日目に同時投与することができる。
血漿中の第IX因子または第VIII因子の発現は、様々な時点、例えば10、20、30、40、50、1000および200日以上で、実施例4に記載されているELISAによって評価される。活性化部分トロンボプラスチン時間および出血時間は、第VIII因子または第IX因子の発現に対するラパマイシンまたは類似体の同時投与の有効性および効果の決定として測定することもできる。ラパマイシンと同時投与されたceDNAベクターを投与されたマウスは、ラパマイシンまたはその類似体を投与せずにceDNAベクターのみを投与されたマウスと比較して、より長期間にわたって第IX因子または第VIII因子の発現の増加および/または持続を示すことが期待される。再投与時に、ceDNAベクターおよびラパマイシンの再投与を受けたマウスは、ラパマイシンを投与されずceDNAベクターの再投与を受けたマウスと比較して、サイトカイン分泌の活性化が少なく、導入遺伝子発現期間および治療効果が増加することがさらに予想される。同時投与のタイミングは、0、1、2、3、4、5、6、7、8時間ずらしてもよい。
実施例13:第IX因子およびcGASアンタゴニストをコードするceDNAをもつ血友病Bの第IX因子
実験は、有害な変異(R333Q)をもつhFIX配列のノックインを含む第IX因子欠損マウスで行われる。雄の第IX因子ノックアウトマウスは、LNP-ceDNA(脂質ナノ粒子ceDNA)の単回投与または反復投与を受ける。2つのLNP-ceDNAベクターが使用される。1)ヒト第IX因子(天然のヒト配列またはPadua FIX変異型のいずれか)およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ORF52の両方をコードするLNP-ceDNA。比較ceDNAベクターとして、第IX因子のみをコードし、cGAS阻害剤をコードしないLNP-ceDNA。LNP-ceDNAベクターは、1.2mLの容量で0.3~5mg/kgの用量でそれぞれのマウスに投与される。各用量は、静脈内流体力学投与を介して投与されるべきである。血漿中の第IX因子の発現は、本明細書に記載のELISAによって、様々な時点、例えば10、20、30、40、50、1000および200日以上などで評価される。活性化部分トロンボプラスチン時間および出血時間は、有効性の決定としても測定される。hFIXとORF52の両方を発現するceDNAベクターを投与されたマウスは、ORF52、すなわち他のcGAS阻害剤を発現せずに第IX因子のみを発現するceDNAベクターを投与されたマウスと比較して、より長期間にわたって第IX因子の発現の増加および/または持続を示すことが予想される。さらに、再投与すると、ORF52と第IX因子の両方を含むceDNAベクターの再投与を受けたマウスは、第IX因子のみをコードするceDNAベクターの再投与を受けたマウスと比較して、サイトカイン分泌の活性化が少なく、導入遺伝子発現期間と治療効果が増加することがさらに予想される。cGAS阻害剤および第IX因子は異なるceDNAベクターで送達することができるが、好ましくは同じベクターによってコードされ、したがって、cGASの阻害は、第IX因子などの導入遺伝子をコードするceDNAベクターを受け取る同じ細胞で起こる。
実験は、有害な変異(R333Q)をもつhFIX配列のノックインを含む第IX因子欠損マウスで行われる。雄の第IX因子ノックアウトマウスは、LNP-ceDNA(脂質ナノ粒子ceDNA)の単回投与または反復投与を受ける。2つのLNP-ceDNAベクターが使用される。1)ヒト第IX因子(天然のヒト配列またはPadua FIX変異型のいずれか)およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ORF52の両方をコードするLNP-ceDNA。比較ceDNAベクターとして、第IX因子のみをコードし、cGAS阻害剤をコードしないLNP-ceDNA。LNP-ceDNAベクターは、1.2mLの容量で0.3~5mg/kgの用量でそれぞれのマウスに投与される。各用量は、静脈内流体力学投与を介して投与されるべきである。血漿中の第IX因子の発現は、本明細書に記載のELISAによって、様々な時点、例えば10、20、30、40、50、1000および200日以上などで評価される。活性化部分トロンボプラスチン時間および出血時間は、有効性の決定としても測定される。hFIXとORF52の両方を発現するceDNAベクターを投与されたマウスは、ORF52、すなわち他のcGAS阻害剤を発現せずに第IX因子のみを発現するceDNAベクターを投与されたマウスと比較して、より長期間にわたって第IX因子の発現の増加および/または持続を示すことが予想される。さらに、再投与すると、ORF52と第IX因子の両方を含むceDNAベクターの再投与を受けたマウスは、第IX因子のみをコードするceDNAベクターの再投与を受けたマウスと比較して、サイトカイン分泌の活性化が少なく、導入遺伝子発現期間と治療効果が増加することがさらに予想される。cGAS阻害剤および第IX因子は異なるceDNAベクターで送達することができるが、好ましくは同じベクターによってコードされ、したがって、cGASの阻害は、第IX因子などの導入遺伝子をコードするceDNAベクターを受け取る同じ細胞で起こる。
実施例14:自然免疫応答および第IX因子発現期間に及ぼすceDNAおよびcGASアンタゴニストの同時投与の効果の決定
関心対象のceDNAとcGASの阻害剤またはcGASアンタゴニストの同時投与がインビトロで免疫応答(例えば、自然免疫応答)に及ぼす影響を調べるために、cGAS活性化を調べる機能アッセイにレポーター株を使用できる。このようなインビトロアッセイに有用なcGASレポーター細胞株は、転写因子応答要素、例えばNF-κB結合部位、AP-1結合部位、またはそれらの組み合わせの転写制御下で、完全長のヒトcGASおよび分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。例えば、レポーター細胞は96ウェルプレートに播種される。16時間などの所定期間後、cGASの阻害剤を含む、または含まない、第IX因子を発現するceDNAを含む様々な量の組成物で細胞を刺激する。SEAPなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、cGASの阻害剤がある場合とない場合の関心対象のceDNAの存在下でcGAS活性化のレベルを比較することができる。cGASの阻害剤の存在下では、レポーター分子の活性化が少なくなることが予想される。
関心対象のceDNAとcGASの阻害剤またはcGASアンタゴニストの同時投与がインビトロで免疫応答(例えば、自然免疫応答)に及ぼす影響を調べるために、cGAS活性化を調べる機能アッセイにレポーター株を使用できる。このようなインビトロアッセイに有用なcGASレポーター細胞株は、転写因子応答要素、例えばNF-κB結合部位、AP-1結合部位、またはそれらの組み合わせの転写制御下で、完全長のヒトcGASおよび分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。例えば、レポーター細胞は96ウェルプレートに播種される。16時間などの所定期間後、cGASの阻害剤を含む、または含まない、第IX因子を発現するceDNAを含む様々な量の組成物で細胞を刺激する。SEAPなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、cGASの阻害剤がある場合とない場合の関心対象のceDNAの存在下でcGAS活性化のレベルを比較することができる。cGASの阻害剤の存在下では、レポーター分子の活性化が少なくなることが予想される。
さらに、cGASノックアウトレポーター株を使用でき、例えば、ヒトTHP-1単球に由来する株は、これまでに同定された細胞質DNAセンサーをすべて発現するため(DAIを除いて)、DNA感知経路を研究するために使用されることが多い細胞株である。このようなcGASノックアウトレポーター株は、ルシフェラーゼやおよびSEAP(分泌胚性アルカリホスファターゼ)などの1つ以上の誘導性分泌レポーター遺伝子を発現できる。レポーター遺伝子は、ISG54(インターフェロン刺激遺伝子)最小プロモーターの制御下にあり、1つ以上、例えば5つのIFN刺激応答要素と組み合わせることができる。レポーター遺伝子はまた、NF-κB応答要素などの応答要素の1つ以上、例えば5つのコピーに融合されたIFN-β最小プロモーターの制御下にあり得る。本明細書に記載のceDNAと組み合わせたcGASの阻害剤の存在下でのcGAS活性は、ノックアウト細胞株対親細胞株で比較することができる。
関心対象のceDNAとcGASの阻害剤またはcGASアンタゴニストの同時投与がエクスビボで免疫応答(例えば、自然免疫応答)のcGASおよびSTING活性化に及ぼす効果を調べるために、例えば、末梢血の勾配密度遠心分離および磁気分離により、ヒト単球を単離することができる。これらの単球は、cGASの阻害剤の有無にかかわらず、関心対象のceDNAとの接触および/または活性化の前後に、適切な対照を使用して調べることができる。治療後、血清および細胞上清を使用して、インターロイキン(IL)-1β、IL-6、IL-8、インターフェロン(IFN)-γ、単球走化性タンパク質(MCP)-1、および/または腫瘍壊死因子(TNF)-αなどのcGAS/STING経路の活性化の機能的読み出しとして、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を用いて、1つ以上のサイトカイン経路を測定する。さらに、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、NF-κBの活性化を検証することができる。cGASの阻害剤の存在下では、ceDNAの投与時にサイトカイン経路の活性化とサイトカイン分泌が減少し、導入遺伝子の発現期間と治療効果が増加すると予想される。
関心対象のceDNAとcGASの阻害剤またはcGASアンタゴニストの同時投与がインビボで免疫応答(例えば、自然免疫応答)のcGASおよびSTING活性化に及ぼす効果を調べるために、マウスモデルを使用することができる。マウスの血清またはリンパ球試料を、cGASの阻害剤の有無にかかわらず、第IX因子などの関心対象の導入遺伝子を発現するceDNAとの接触および/または活性化の前後に、適切な対照とともに検査する。治療後、血清および細胞上清を使用して、インターロイキン(IL)-1β、IL-6、IL-8、インターフェロン(IFN)-γ、単球走化性タンパク質(MCP)-1、および/または腫瘍壊死因子(TNF)-αなどのcGAS/STING経路の活性化の機能的読み出しとして、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を用いて、1つ以上のサイトカイン経路を測定する。さらに、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、NF-κBの活性化を検証することができる。cGASの阻害剤の存在下では、ceDNAの投与時に活性化およびサイトカイン分泌が減少し、導入遺伝子の発現期間と治療効果が増加すると予想される。
実施例15:第IX因子およびTLR-9アンタゴニストをコードするceDNAをもつ血友病Bの第IX因子
実験は、有害な変異(R333Q)をもつhFIX配列のノックインを含む第IX因子欠損マウスで行われる。雄の第IX因子ノックアウトマウスは、LNP-ceDNA(脂質ナノ粒子ceDNA)の単回投与または反復投与を受ける。2つのLNP-ceDNAベクターが使用される。1)ヒト第IX因子(天然のヒト配列またはPadua FIX変異型のいずれか)およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ORF52の両方をコードするLNP-ceDNA。比較ceDNAベクターとして、第IX因子のみをコードし、cGAS阻害剤をコードしないLNP-ceDNA。LNP-ceDNAベクターは、1.2mLの容量で0.3~5mg/kgの用量でそれぞれのマウスに投与される。各用量は、静脈内流体力学投与を介して投与されるべきである。血漿中の第IX因子の発現は、実施例4に記載のELISAによって、様々な時点、例えば10、20、30、40、50、1000および200日以上などで評価される。活性化部分トロンボプラスチン時間および出血時間は、有効性の決定としても測定される。TLR-9アンタゴニストを含み、hFIXを発現するceDNAベクターを投与されたマウスは、第IX因子のみを発現しTLR-9阻害剤を発現しないceDNAベクターを投与されたマウスと比較して、より長期間にわたって第IX因子の発現の増加および/または持続を示すことが期待される。さらに、再投与すると、TLR-9阻害剤、例えばオリゴヘアピン配列および第IX因子を含むceDNAベクターの再投与を受けたマウスは、第IX因子のみをコードするceDNAベクターの再投与を受けたマウスと比較して、サイトカイン分泌の活性化が少なく、導入遺伝子発現期間と治療効果が増加することがさらに予想される。TLR-9阻害剤および第IX因子は異なるceDNAベクターで、トランスで送達することができるが、好ましくは同じベクターによってコードされ、したがって、TLR-9の阻害は、第IX因子などの導入遺伝子をコードするceDNAベクターを受け取る同じ細胞で起こる。
実験は、有害な変異(R333Q)をもつhFIX配列のノックインを含む第IX因子欠損マウスで行われる。雄の第IX因子ノックアウトマウスは、LNP-ceDNA(脂質ナノ粒子ceDNA)の単回投与または反復投与を受ける。2つのLNP-ceDNAベクターが使用される。1)ヒト第IX因子(天然のヒト配列またはPadua FIX変異型のいずれか)およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ORF52の両方をコードするLNP-ceDNA。比較ceDNAベクターとして、第IX因子のみをコードし、cGAS阻害剤をコードしないLNP-ceDNA。LNP-ceDNAベクターは、1.2mLの容量で0.3~5mg/kgの用量でそれぞれのマウスに投与される。各用量は、静脈内流体力学投与を介して投与されるべきである。血漿中の第IX因子の発現は、実施例4に記載のELISAによって、様々な時点、例えば10、20、30、40、50、1000および200日以上などで評価される。活性化部分トロンボプラスチン時間および出血時間は、有効性の決定としても測定される。TLR-9アンタゴニストを含み、hFIXを発現するceDNAベクターを投与されたマウスは、第IX因子のみを発現しTLR-9阻害剤を発現しないceDNAベクターを投与されたマウスと比較して、より長期間にわたって第IX因子の発現の増加および/または持続を示すことが期待される。さらに、再投与すると、TLR-9阻害剤、例えばオリゴヘアピン配列および第IX因子を含むceDNAベクターの再投与を受けたマウスは、第IX因子のみをコードするceDNAベクターの再投与を受けたマウスと比較して、サイトカイン分泌の活性化が少なく、導入遺伝子発現期間と治療効果が増加することがさらに予想される。TLR-9阻害剤および第IX因子は異なるceDNAベクターで、トランスで送達することができるが、好ましくは同じベクターによってコードされ、したがって、TLR-9の阻害は、第IX因子などの導入遺伝子をコードするceDNAベクターを受け取る同じ細胞で起こる。
実施例16:自然免疫応答および導入遺伝子発現期間に及ぼすceDNAおよびTLRアンタゴニストの効果の決定
関心対象のceDNAおよびTLR9の阻害剤またはTLR9アンタゴニストの同時投与がインビトロで自然免疫応答に及ぼす効果を調べるために、TLR9活性化の下流効果を調べるTLR9依存性機能アッセイ用にレポーター株を使用できる。TLR9レポーター細胞株は、NF-κB結合部位、AP-1結合部位、またはそれらの組み合わせなどの転写因子応答要素の転写制御下で、完全長のヒトトール様レポーター9(TLR9)および分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。例えば、レポーター細胞は96ウェルプレートに播種される。16時間などの所定期間後、TLR9アンタゴニストを含む、または含まない、関心対象の導入遺伝子を発現するceDNAを含む様々な量の組成物で細胞を刺激する。そのようなアンタゴニストは、TLR阻害オリゴヌクレオチドであり得る。SEAPなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、TLR9アンタゴニストがある場合とない場合の関心対象のceDNAの存在下でTLR9活性化のレベルを測定することができる。TLR9の阻害剤の存在下では、レポーター分子の活性化が少なくなることが予想される。
関心対象のceDNAおよびTLR9の阻害剤またはTLR9アンタゴニストの同時投与がインビトロで自然免疫応答に及ぼす効果を調べるために、TLR9活性化の下流効果を調べるTLR9依存性機能アッセイ用にレポーター株を使用できる。TLR9レポーター細胞株は、NF-κB結合部位、AP-1結合部位、またはそれらの組み合わせなどの転写因子応答要素の転写制御下で、完全長のヒトトール様レポーター9(TLR9)および分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。例えば、レポーター細胞は96ウェルプレートに播種される。16時間などの所定期間後、TLR9アンタゴニストを含む、または含まない、関心対象の導入遺伝子を発現するceDNAを含む様々な量の組成物で細胞を刺激する。そのようなアンタゴニストは、TLR阻害オリゴヌクレオチドであり得る。SEAPなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、TLR9アンタゴニストがある場合とない場合の関心対象のceDNAの存在下でTLR9活性化のレベルを測定することができる。TLR9の阻害剤の存在下では、レポーター分子の活性化が少なくなることが予想される。
関心対象のceDNAとTLR9の阻害剤またはTLR9アンタゴニストの同時投与がエクスビボで自然免疫応答のTLR9媒介性活性化に及ぼす効果を調べるために、例えば、末梢血の勾配密度遠心分離および磁気分離により、ヒト単球を単離することができる。これらの単球は、TLR9アンタゴニストの有無にかかわらず、関心対象のceDNAとの接触および/または活性化の前後に、適切な対照を使用して調べることができる。治療後、血清および細胞上清を使用して、インターロイキン(IL)-1β、IL-6、IL-8、インターフェロン(IFN)-γ、単球走化性タンパク質(MCP)-1、および/または腫瘍壊死因子(TNF)-αなどのTLR9活性化の機能的読み出しとして、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を用いて、1つ以上のサイトカイン経路を測定する。0914800の追加では、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、NF-κBの活性化を検証することができる。TLR9の阻害剤の存在下では、ceDNAの投与時にサイトカイン経路の活性化とサイトカイン分泌が減少し、導入遺伝子の発現期間と治療効果が増加すると予想される。
関心対象のceDNAおよびTLR9の阻害剤またはTLR9アンタゴニストの同時投与がインビボで自然免疫応答のTLR9媒介性活性化に及ぼす効果を調べるために、マウスモデルを使用できる。マウスの血清またはリンパ球試料を、TLR9の阻害剤の有無にかかわらず、第IX因子などの関心対象の導入遺伝子を発現するceDNAとの接触および/または活性化の前後に、適切な対照とともに検査する。治療後、血清および細胞上清を使用して、インターロイキン(IL)-1β、IL-6、IL-8、インターフェロン(IFN)-γ、単球走化性タンパク質(MCP)-1、および/または腫瘍壊死因子(TNF)-αなどのcGAS/STING経路の活性化の機能的読み出しとして、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を用いて、1つ以上のサイトカイン経路を測定する。さらに、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、NF-κBの活性化を検証することができる。TLR9の阻害剤の存在下では、ceDNAの投与時に活性化およびサイトカイン分泌が減少し、導入遺伝子の発現期間と治療効果が増加すると予想される。
実施例17:ceDNAとRAPAのLNPベクターへの合剤化
いくつかの実施形態では、ラパマイシンをceDNAベクターに直接パッケージすることが望ましい場合がある。このようなceDNAおよびRAPAの直接的合剤化の1つの非限定的な例は、次のとおりである。
脂質ナノ粒子(LNP)中のceDNAとラパマイシンの組み合わせは、ラパマイシンを含むアルコール脂質溶液とceDNA水溶液とを、マイクロ流体装置(例えば、NanoAssemblr(商標))を使用して1:3(体積/体積)の比率および総流量12ml/分で混合することにより調製できる。全脂質とceDNA重量の比は、約10:1~30:1であり得る。手短に言えば、イオン化脂質(例えば、MC3)、非カチオン性脂質(例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC))、膜融合性をもたらすための構成成分(ステロールなど、例えば、コレステロール)、および複合脂質分子(PEG-脂質など、例えば、1-(モノメトキシ-ポリエチレングリコール)-2,3-ジミリストイルグリセロール、2000(「PEG-DMG」)の平均PEG分子量を有する))を、50:10:38.5:1.5のモル比でアルコール(例えば、エタノール)に可溶化する。ラパマイシン次に、ラパマイシンを脂質溶液に溶解して所望の濃度にする。ceDNAを25mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4)で0.2mg/mLに希釈する。LNPが(例えば、NanoAssemblr(商標)を使用して)形成された後、アルコールを除去し、透析によって酢酸ナトリウム緩衝液をPBSに置き換える。アルコール除去および同時緩衝液交換は、例えば、透析またはタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションによって達成され得る。得られた脂質ナノ粒子は、0.2μm孔の滅菌フィルターを通して濾過され、上記のceDNA LNPベクターと同様に保存される。
いくつかの実施形態では、ラパマイシンをceDNAベクターに直接パッケージすることが望ましい場合がある。このようなceDNAおよびRAPAの直接的合剤化の1つの非限定的な例は、次のとおりである。
脂質ナノ粒子(LNP)中のceDNAとラパマイシンの組み合わせは、ラパマイシンを含むアルコール脂質溶液とceDNA水溶液とを、マイクロ流体装置(例えば、NanoAssemblr(商標))を使用して1:3(体積/体積)の比率および総流量12ml/分で混合することにより調製できる。全脂質とceDNA重量の比は、約10:1~30:1であり得る。手短に言えば、イオン化脂質(例えば、MC3)、非カチオン性脂質(例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC))、膜融合性をもたらすための構成成分(ステロールなど、例えば、コレステロール)、および複合脂質分子(PEG-脂質など、例えば、1-(モノメトキシ-ポリエチレングリコール)-2,3-ジミリストイルグリセロール、2000(「PEG-DMG」)の平均PEG分子量を有する))を、50:10:38.5:1.5のモル比でアルコール(例えば、エタノール)に可溶化する。ラパマイシン次に、ラパマイシンを脂質溶液に溶解して所望の濃度にする。ceDNAを25mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4)で0.2mg/mLに希釈する。LNPが(例えば、NanoAssemblr(商標)を使用して)形成された後、アルコールを除去し、透析によって酢酸ナトリウム緩衝液をPBSに置き換える。アルコール除去および同時緩衝液交換は、例えば、透析またはタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションによって達成され得る。得られた脂質ナノ粒子は、0.2μm孔の滅菌フィルターを通して濾過され、上記のceDNA LNPベクターと同様に保存される。
実施例18:自然免疫応答および第IX因子発現期間に及ぼすceDNAベクターおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体の同時投与の効果の決定
関心対象のceDNAおよびラパマイシンまたは類似体の同時投与がインビトロで自然免疫応答に及ぼす効果を調べるために、TLRおよびmTORC1の活性化の下流効果を調べる機能アッセイ用にレポーター株を使用できる。TLR9レポーター細胞株は、NF-κB結合部位、AP-1結合部位、またはそれらの組み合わせなどの転写因子応答要素の転写制御下で、完全長のヒトトール様レポーター9(TLR9)および分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。例えば、レポーター細胞は96ウェルプレートに播種される。16時間などの所定期間後、ラパマイシンまたはその類似体を含む、または含まない、関心対象の導入遺伝子を発現するceDNAを含む様々な量の組成物で細胞を刺激する。SEAPなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、ラパマイシンまたはその類似体がある場合とない場合の関心対象のceDNAの存在下でmTORC1活性化のレベルを測定することができる。ラパマイシンの存在下では、レポーター分子のより多くの活性化が見られ、サイトカインIL-10および他のサイトカインのSTAT3誘導が減少すると予想される。
関心対象のceDNAおよびラパマイシンまたは類似体の同時投与がインビトロで自然免疫応答に及ぼす効果を調べるために、TLRおよびmTORC1の活性化の下流効果を調べる機能アッセイ用にレポーター株を使用できる。TLR9レポーター細胞株は、NF-κB結合部位、AP-1結合部位、またはそれらの組み合わせなどの転写因子応答要素の転写制御下で、完全長のヒトトール様レポーター9(TLR9)および分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。例えば、レポーター細胞は96ウェルプレートに播種される。16時間などの所定期間後、ラパマイシンまたはその類似体を含む、または含まない、関心対象の導入遺伝子を発現するceDNAを含む様々な量の組成物で細胞を刺激する。SEAPなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、ラパマイシンまたはその類似体がある場合とない場合の関心対象のceDNAの存在下でmTORC1活性化のレベルを測定することができる。ラパマイシンの存在下では、レポーター分子のより多くの活性化が見られ、サイトカインIL-10および他のサイトカインのSTAT3誘導が減少すると予想される。
関心対象のceDNAとラパマイシンの同時投与がエクスビボで自然免疫応答の活性化に及ぼす効果を調べるために、例えば、末梢血の勾配密度遠心分離および磁気分離により、ヒト単球を単離することができる。これらの単球は、ラパマイシンまたはその類似体の有無にかかわらず、関心対象のceDNAとの接触および/または活性化の前後に、適切な対照を使用して調べることができる。処理後、血清および細胞上清を使用して、当業者に公知の任意のアッセイまたは方法を使用して、mTORC1活性化および/またはIL-10などの機能的読み出しとして1つ以上のサイトカイン経路を測定する。さらに、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、NF-KBの活性化を検証することができる。ラパマイシンまたはその類似体の存在下では、ceDNAの投与時に、サイトカイン経路の活性化とサイトカイン分泌、例えばIL-10およびI型IFNが減少し、導入遺伝子の発現期間と治療効果が増加すると予想される。
実施例19:第IX因子およびTLR-9阻害剤を共発現するceDNAベクターの調製
(TCCTGGCGGGGAAGT、配列番号889)、ODN-2114(TCCTGGAGGGGAAGT、配列番号890)、ポリ-G(GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、配列番号891)、ODN-A151(TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、配列番号892)、G-ODN(CTCC-TATTGGGGGTTTCCTAT、配列番号893)、IRS-869(TCCTGGAGGGGTTGT、配列番号894)、INH-1(CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG、配列番号895)、INH-4(TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA、配列番号896)、(IRS-661 TGCTTGCAAGCTT-GCAAGCA、配列番号897)、4024(TCCTGGATGGGAAGT、配列番号898)、4084F(CCTGGATGGGAA、配列番号:899)、INH-13(CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA、配列番号900)、INH-18(CCTGGATGGGAACTTACCGCTGCA、配列番号901)、およびIRS-954 TGCTCCTGGAGGGGTTGT、配列番号902)などの以下の配列を含むヘアピン構造を形成できるオリゴヌクレオチドは、実施例1および実施例4に記述されているとおり、例えば、R5または第IX因子導入遺伝子をコードするTTX9もしくはTTX10プラスミドの他の部位など、事前に選択された制限クローニング部位にライゲーションによって挿入できるように、5’から3’鎖と相補的な3’から5’鎖のアニーリング後、付着末端を有するように設計される。
(TCCTGGCGGGGAAGT、配列番号889)、ODN-2114(TCCTGGAGGGGAAGT、配列番号890)、ポリ-G(GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、配列番号891)、ODN-A151(TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、配列番号892)、G-ODN(CTCC-TATTGGGGGTTTCCTAT、配列番号893)、IRS-869(TCCTGGAGGGGTTGT、配列番号894)、INH-1(CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG、配列番号895)、INH-4(TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA、配列番号896)、(IRS-661 TGCTTGCAAGCTT-GCAAGCA、配列番号897)、4024(TCCTGGATGGGAAGT、配列番号898)、4084F(CCTGGATGGGAA、配列番号:899)、INH-13(CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA、配列番号900)、INH-18(CCTGGATGGGAACTTACCGCTGCA、配列番号901)、およびIRS-954 TGCTCCTGGAGGGGTTGT、配列番号902)などの以下の配列を含むヘアピン構造を形成できるオリゴヌクレオチドは、実施例1および実施例4に記述されているとおり、例えば、R5または第IX因子導入遺伝子をコードするTTX9もしくはTTX10プラスミドの他の部位など、事前に選択された制限クローニング部位にライゲーションによって挿入できるように、5’から3’鎖と相補的な3’から5’鎖のアニーリング後、付着末端を有するように設計される。
例えば、適切な制限部位をもつオリゴは、各鎖を好適な緩衝液(例えば、100mM酢酸カリウム、30mM HEPES、pH7.5)で等モル量で混合することによりアニーリングし、94℃で2分間加熱し、徐々に冷却する。多くの二次構造を有すると予測されるオリゴの場合、より緩やかな冷却/アニーリングステップが有益である。これは、オリゴ溶液を水浴またはヒートブロックに入れ、機械のプラグを抜く/電源を切ることによって行われる。アニーリングされたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼを含まない緩衝液中で希釈され、4℃で二本鎖のアニーリングされた形態で保存され得る。次に、TLR-9阻害性オリゴ配列を有するceDNAベクターを精製し(例えば、ゲル電気泳動またはカラムにより)、cDNAベクターを作製するために使用する。実施例2~3に記載されるように、第IX因子をコードし、TLR-9アンタゴニストを含むceDNAベクターを調製することができる。TLR-9阻害剤およびラパマイシンまたはラパマイシン類似体を発現するceDNAベクターの同時投与の効果を決定する方法が本明細書に記載されている。
実施例20:第IX因子およびcGAS阻害剤を共発現するceDNAベクターの調製
cGASを阻害するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ORF52(配列番号882)もしくはその変異型、または配列番号883のアミノ酸161~1162を欠く切断された細胞質LANAイソ型(LANAΔ161または配列番号884)は、実施例1および実施例4に記載されているように、プロモーターに作動可能に連結され、第IX因子導入遺伝子をコードするTTX9またはTTX10プラスミドの制限クローニング部位R5に挿入される。したがって、実施例2~3に記載されるように、第IX因子およびcGAS阻害剤の両方をコードするceDNAベクターが調製される。cGAS阻害剤およびラパマイシンまたはラパマイシン類似体を発現するceDNAベクターの同時投与の効果を決定する方法は本明細書にある。
cGASを阻害するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ORF52(配列番号882)もしくはその変異型、または配列番号883のアミノ酸161~1162を欠く切断された細胞質LANAイソ型(LANAΔ161または配列番号884)は、実施例1および実施例4に記載されているように、プロモーターに作動可能に連結され、第IX因子導入遺伝子をコードするTTX9またはTTX10プラスミドの制限クローニング部位R5に挿入される。したがって、実施例2~3に記載されるように、第IX因子およびcGAS阻害剤の両方をコードするceDNAベクターが調製される。cGAS阻害剤およびラパマイシンまたはラパマイシン類似体を発現するceDNAベクターの同時投与の効果を決定する方法は本明細書にある。
実施例21:LNP製剤化ceDNAベクターのインビボでの持続的導入遺伝子発現
異なる脂質ナノ粒子を用いた実施例7の結果の再現性を、マウスにおいてインビボで評価した。0日目に、実施例6で使用したものとは異なるLNPに封入されたCAGプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ導入遺伝子を含むceDNAベクター、またはポリCを含むがceDNAまたはルシフェラーゼ遺伝子を欠いている同じLNPのいずれかをマウスに投与した。具体的には、およそ4週齢の雄CD-1(登録商標)マウスを、0.5mg/kgのLNP-TTX-ルシフェラーゼまたは対照LNP-ポリCの単回注入で治療し、0日目に側尾静脈から静脈内投与した。14日目に動物にルシフェリン150mg/kgを2.5mL/kgの腹腔内注入により全身投与した。ルシフェリン投与後およそ15分で、各動物をインビボ撮像システム(「IVIS」)を使用して撮像した。
異なる脂質ナノ粒子を用いた実施例7の結果の再現性を、マウスにおいてインビボで評価した。0日目に、実施例6で使用したものとは異なるLNPに封入されたCAGプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ導入遺伝子を含むceDNAベクター、またはポリCを含むがceDNAまたはルシフェラーゼ遺伝子を欠いている同じLNPのいずれかをマウスに投与した。具体的には、およそ4週齢の雄CD-1(登録商標)マウスを、0.5mg/kgのLNP-TTX-ルシフェラーゼまたは対照LNP-ポリCの単回注入で治療し、0日目に側尾静脈から静脈内投与した。14日目に動物にルシフェリン150mg/kgを2.5mL/kgの腹腔内注入により全身投与した。ルシフェリン投与後およそ15分で、各動物をインビボ撮像システム(「IVIS」)を使用して撮像した。
4匹のceDNA治療されたマウスすべてにおいて肝臓の有意な蛍光が観察され、注入部位以外では動物において他の蛍光はほとんど観察されなかったことから、LNPがceDNA構築物の肝臓特異的送達を媒介したこと、および送達されたceDNAベクターが、投与後少なくとも2週間にわたって、その導入遺伝子の持続的発現を制御可能であったことを示す。
実施例22:ceDNAベクター投与によるインビボでの肝臓における持続的導入遺伝子発現
別の実験では、治療された動物の肝臓内のLNP送達されたceDNAの局在を評価した。関心対象の機能的導入遺伝子を含むceDNAベクターを、実施例17で使用したものと同じLNPに封入し、静脈内注入により0.5mg/kgの用量レベルでインビボでマウスに投与した。6時間後、マウスを終了させ、肝臓試料を採取し、標準的なプロトコルを使用してホルマリン固定し、パラフィン包埋した。RNAscope(登録商標)インサイチュハイブリダイゼーションアッセイを実施して、ceDNA導入遺伝子に特異的なプローブを使用して、組織内のceDNAベクターを可視化し、発色反応およびヘマトキシリン染色(Advanced Cell Diagnostics)を使用して検出した。画像解析により、処置したマウスから採取した肝細胞試料にceDNAが存在することが確認された。当業者は、ルシフェラーゼがceDNAベクターで表5から選択される任意の核酸配列と置換できることを理解するであろう。
別の実験では、治療された動物の肝臓内のLNP送達されたceDNAの局在を評価した。関心対象の機能的導入遺伝子を含むceDNAベクターを、実施例17で使用したものと同じLNPに封入し、静脈内注入により0.5mg/kgの用量レベルでインビボでマウスに投与した。6時間後、マウスを終了させ、肝臓試料を採取し、標準的なプロトコルを使用してホルマリン固定し、パラフィン包埋した。RNAscope(登録商標)インサイチュハイブリダイゼーションアッセイを実施して、ceDNA導入遺伝子に特異的なプローブを使用して、組織内のceDNAベクターを可視化し、発色反応およびヘマトキシリン染色(Advanced Cell Diagnostics)を使用して検出した。画像解析により、処置したマウスから採取した肝細胞試料にceDNAが存在することが確認された。当業者は、ルシフェラーゼがceDNAベクターで表5から選択される任意の核酸配列と置換できることを理解するであろう。
実施例23:インビボでのceDNAの持続的眼導入遺伝子発現
肝臓以外の組織でのceDNAベクター導入遺伝子発現の持続可能性を評価して、インビボでの眼内投与後のceDNAベクターの耐性および発現を決定した。ルシフェラーゼを例示的な導入遺伝子として使用したが、当業者は、ルシフェラーゼ導入遺伝子を、表5A~5Fに列挙されたもののいずれかからのインフラマソームアンタゴニスト配列で容易に置換することができる。
肝臓以外の組織でのceDNAベクター導入遺伝子発現の持続可能性を評価して、インビボでの眼内投与後のceDNAベクターの耐性および発現を決定した。ルシフェラーゼを例示的な導入遺伝子として使用したが、当業者は、ルシフェラーゼ導入遺伝子を、表5A~5Fに列挙されたもののいずれかからのインフラマソームアンタゴニスト配列で容易に置換することができる。
0日目に、およそ9週齢の雄のSprague Dawleyラットに、5μLのjetPEI(登録商標)トランスフェクション試薬(Polyplus)で製剤化されたルシフェラーゼ導入遺伝子を含むceDNAベクターまたはJetPEI(登録商標)で製剤化されたルシフェラーゼをコードするプラスミドDNAのいずれかを、いずれも0.25μg/μLの濃度で網膜下注入した。各群において4匹のラットを試験した。動物を鎮静させ、33ゲージ針を使用して、被験物質を右眼に網膜下注入した。各動物の左眼は未治療であった。注入直後、網膜下ブレブの存在を確認するために、光干渉トモグラフィーまたは眼底撮像で眼を確認した。標準的な手順に従って、ラットをブプレノルフィンおよび局所抗生物質軟膏で治療した。
7、14、21、28、および35日目に、両方の群の動物に、作りたてのルシフェリン150mg/kgを、2.5mL/kgの腹腔内注入を介して全身投与した。ルシフェリン投与後5~15分で、イソフルラン麻酔下でIVISを使用して、すべての動物を撮像した。眼を含む関心対象の領域の全流束[p/s]および平均流束[p/s/sr/cm2)は、5分間の曝露で得られた。結果は、未治療の眼(「注入されていない」)の各治療群の平均放射輝度に対する、治療された眼(「注入された」)の各治療群の平均輝度としてグラフ化した。有意な蛍光は、ceDNAベクターで治療された眼において容易に検出可能であったが、プラスミドで治療された眼でははるかに弱かった。35日後、プラスミドを注入したラットは終了したが、ceDNAで治療されたラットについて研究を継続し、42、49、56、63、70、および99日目にルシフェリン注入およびIVIS撮像を行った。結果は、ラットの眼に単回注入で導入されたceDNAベクターが、インビボでの導入遺伝子発現を媒介し、その発現が少なくとも注入後99日まで高レベルで持続されたことを実証する。
実施例24:ceDNAの流体力学的送達
げっ歯類の肝臓に核酸を導入する周知の方法は、流体力学的尾静脈注射によるものである。このシステムでは、カプセル化されていない核酸を大量に加圧注入すると、細胞透過性が一過性に増加し、組織や細胞に直接送達される。これは、マクロファージ送達など、宿主の免疫系の多くを迂回する実験的なメカニズムを提供する。したがって、裸のceDNAベクターの流体力学的注射後に観察されたルシフェラーゼ発現を、LNPカプセル化ceDNAのより伝統的な静脈内注射後に観察されたものと比較した。この実験では、ceDNAベクターは、野生型AAV2左ITRおよび変異型右ITRを利用した。
げっ歯類の肝臓に核酸を導入する周知の方法は、流体力学的尾静脈注射によるものである。このシステムでは、カプセル化されていない核酸を大量に加圧注入すると、細胞透過性が一過性に増加し、組織や細胞に直接送達される。これは、マクロファージ送達など、宿主の免疫系の多くを迂回する実験的なメカニズムを提供する。したがって、裸のceDNAベクターの流体力学的注射後に観察されたルシフェラーゼ発現を、LNPカプセル化ceDNAのより伝統的な静脈内注射後に観察されたものと比較した。この実験では、ceDNAベクターは、野生型AAV2左ITRおよび変異型右ITRを利用した。
簡潔に述べれば、CAGプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼをコードするceDNAベクターを調製し、LNPにカプセル化するか、カプセル化しないままにした。雄の成体CD-1マウスに、尾静脈注射により、(i)LNPカプセル化ceDNAベクターを0.5mg/kgの用量で5mL/kgの総量で投与するか、または(ii)同じだがカプセル化していないベクターを0.01mg/kgの用量で1.2mLの総量で投与した。各治療群には3匹のマウスがいた。体重は1、2、および3日目に記録された。生存中の撮像は、インビボイメージングシステム(IVIS)を使用して1日目および3日目に実施された。撮像のために、各マウスに、2.5mL/kgの腹腔内注入を介して150mg/kgのルシフェリンを注入した。15分後、各マウスを麻酔し、撮像した。
50倍低い用量で投与しても、ルシフェラーゼ発現は、流体力学的に注射したマウスで観察され、非流体力学的に注射されたマウス(約107最大全流束)よりも(約1010最大全流束)はるかに高かった(図9)。先の研究で、ceDNAベクターカーゴなしでLNP単独を投与しても免疫応答が引き起こされなかったため(データは示していない)、2つの用量群間の差異は、1つ以上の宿主免疫系のLNPカプセル化ceDNAの関与、および流体力学的投与による該系の回避に起因し得ることが見出された。
実施例25:培養細胞における免疫経路の調節およびceDNAベクター発現への影響
細胞系アッセイは、ceDNA投与に対する宿主応答への様々な免疫経路の寄与の照合を容易にするために確立された。このアッセイでは、THP-1細胞(急性単球性白血病細胞株)をいくつかのバリエーションで使用する。NF-κB活性化(TLR9経路、Quanti-Blue(商標)を用いたSEAP検出による)およびIRF経路の活性化(Quanti-Luc(商標)を用いた分泌型ルシフェラーゼによる)の両方を検出するためのレポーター構築物を安定して組み込んだTHP-1 Dual(商標)細胞(Invitrogen)、cGAS免疫経路の構成的ノックアウトをもつTHP-1細胞、ならびにSTING免疫経路の構成的ノックアウトをもつTHP-1細胞。特定経路の既知阻害剤を使用すると、特定の刺激に対する観察された免疫応答への内因性免疫経路の相対的な寄与をよりよく理解することが可能である。
細胞系アッセイは、ceDNA投与に対する宿主応答への様々な免疫経路の寄与の照合を容易にするために確立された。このアッセイでは、THP-1細胞(急性単球性白血病細胞株)をいくつかのバリエーションで使用する。NF-κB活性化(TLR9経路、Quanti-Blue(商標)を用いたSEAP検出による)およびIRF経路の活性化(Quanti-Luc(商標)を用いた分泌型ルシフェラーゼによる)の両方を検出するためのレポーター構築物を安定して組み込んだTHP-1 Dual(商標)細胞(Invitrogen)、cGAS免疫経路の構成的ノックアウトをもつTHP-1細胞、ならびにSTING免疫経路の構成的ノックアウトをもつTHP-1細胞。特定経路の既知阻害剤を使用すると、特定の刺激に対する観察された免疫応答への内因性免疫経路の相対的な寄与をよりよく理解することが可能である。
簡潔に述べると、培養中のTHP-1細胞をOpti-MEM(商標)培地(ThermoFisher)で0.5x106/mLに希釈し、150μLを96ウェルプレートの各ウェルに加えた。細胞を阻害剤で前処理した。所望の阻害剤をOpti-MEM(商標)で希釈し、指定された試料ウェルに加えた。この実験では、A151(オリゴヌクレオチドTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(配列番号892)およびBX795(N-[3-[[5-ヨード-4-[[3-[(2-チエニルカルボニル)アミノ]プロピル]アミノ]-2-ピリミジニル]アミノ]フェニル]-1-ピロリジンカルボキサミド、CAS702675-74-9)は、各試料ウェルに0μM、0.625μM、1.25μM、または2.5μMの最終濃度で使用された。プレートを37℃で2時間インキュベーションした。200ngの所望のceDNAベクターをLipofectamine(商標)3000で1:3に希釈し、室温で5~10分間インキュベーションした。次に、ceDNAベクター-リポフェクタミン複合体を試料ウェルに加えた。プレートを37℃で24時間インキュベーションした。NF-κB活性化およびIRF2活性化の量は、製造元の指示に従って、Quanti-Blue(商標)キットおよびQuanti-Luc(商標)キットによってそれぞれ定量化された。
ceDNAベクターの2つの異なる調製物をTHP-1二重レポーター細胞に投与することにより、両方ともインターフェロンの有意な誘導をもたらし、少なくとも1つの免疫経路の活性化を示している図10A)。特に、2つのTHP-1ノックアウト株のいずれかを同じ濃度のceDNAで処理した場合、インターフェロンの誘導は観察されず(図10A)、cGAS/STING経路がceDNA投与に応答したサイトカイン誘導に関与していることを示している。同様の結果は、THP-1二重レポーター細胞をceDNAとBX795の両方で処理した場合にも見られ、BX795はSTING経路に特異的な阻害剤であり、ceDNA誘導性インターフェロン誘導の抑止は、STING経路が関与していることを再び示唆している(図10A)。A151は、cGAS/STING経路、TLR9経路、およびインフラマソーム媒介性免疫経路も阻害することが知られている。BX795処理で観察されたものと同様の効果を有した(図10A)。
第2の実験では、ceDNA投与による保護効果が認められるのに必要な阻害剤の濃度をアッセイした(図10B)。A151およびAS1411の両方について、認められたインターフェロン誘導の阻害は濃度依存性であり、最大阻害は2.5μMの濃度で認められた(図10B)。
実施例26:免疫応答に及ぼすceDNA非メチル化CpG含量の調節の影響
遺伝子配列のCpGモチーフは、TLR9 DNA感知経路を刺激することが知られている。したがって、インビボでその配列を導入した場合に自然免疫経路の活性化に及ぼすceDNA構築配列のCpGモチーフの減少の影響を調べた。
遺伝子配列のCpGモチーフは、TLR9 DNA感知経路を刺激することが知られている。したがって、インビボでその配列を導入した場合に自然免疫経路の活性化に及ぼすceDNA構築配列のCpGモチーフの減少の影響を調べた。
A.ceDNA非メチル化CpGの最小化の影響を試験する細胞系アッセイ
(i)ceDNA投与に応答したTLR9経路の活性化、および(ii)そのような活性化に及ぼすCpGの存在/メチル化状態の調節の効果を評価するために研究を実施した。この特定の研究では、緑色蛍光タンパク質を発現し、野生型左ITRおよび変異型右ITRを含むceDNAベクターが使用された。
(i)ceDNA投与に応答したTLR9経路の活性化、および(ii)そのような活性化に及ぼすCpGの存在/メチル化状態の調節の効果を評価するために研究を実施した。この特定の研究では、緑色蛍光タンパク質を発現し、野生型左ITRおよび変異型右ITRを含むceDNAベクターが使用された。
ヒトTLR9を発現するHEK-293細胞(HEK-BLUE.hTLR9細胞、InvivoGen)を96ウェルプレートに1ウェルあたり50,000細胞で播種した。プレートを37℃で一晩インキュベーションした。メチル化前処理を受けるceDNA試料の場合、ceDNAベクター、緩衝液、S-アデノシルメチオニン、CpGメチルトランスフェラーゼ、および水を、当技術分野で既知の方法に従って50μLの総反応体積にする。反応を37℃で1時間インキュベーションし、次に65℃で20分間加熱することにより停止した。反応混合物から市販の精製キット(PCR clean kit、Qiagen(登録商標))を用いてceDNAを精製し、得られたDNA濃度を測定した。
細胞を任意の所望阻害剤で3時間前処理した-この実験では、A151をウェルあたり10μMの最終濃度で使用した。前処理後、Opti-MEM(商標)で希釈したLipofectamine 3000、またはTLR9経路を刺激することが知られている陽性対照ODN2006を使用して、300ngのceDNAを1:3の比率で細胞にトランスフェクションした。細胞を37℃、5%CO2で24時間インキュベーションした。次に、Seap発現(TLR9経路の構成要素)をQuanti-BLUE(商標)(InvivoGen)を使用して測定した。
図11Aに示すように、ODN2006は強力なNF-κB応答を誘導し、ceDNA構築物はより少ない応答を誘導し、事前にメチル化された場合、応答はバックグラウンドレベルまで低下した。A151(TLR9経路を阻害することが知られている)と組み合わせると、ceDNAで処理した試料も最小限レベルのNF-κB誘導を示した(図11B)。これは、TLR9経路がceDNA投与に対する宿主の免疫応答に寄与することを最初に示している。さらに、メチル化によるCpG含量の最小化は、ceDNAによるTLR9活性化の大部分を排除し、この効果は、CpG含量またはメチル化状態を変更することなく、A151で細胞を前処理することによって模倣できた。
B.ceDNA非メチル化CpG最小化の影響を評価するマウス研究
ceDNAベクターにおけるCpG最小化の影響は、マウスでも評価された。マウスにceDNAベクターを投与した場合のサイトカイン応答およびceDNAにコードされた遺伝子の発現を測定した。
ceDNAベクターにおけるCpG最小化の影響は、マウスでも評価された。マウスにceDNAベクターを投与した場合のサイトカイン応答およびceDNAにコードされた遺伝子の発現を測定した。
各々が導入遺伝子としてルシフェラーゼをコードする、3つの異なるceDNAベクターを使用した。第1のceDNAベクターは、多数の非メチル化CpG(約350)(「ceDNA高CpG」)を有し、構成的CAGプロモーターを含んでいた。第2は、中程度数の非メチル化CpG(約60)(「ceDNA低CpG」)を有し、肝臓特異的hAATプロモーターを含んでいた。第3は、非メチル化CpGを含まず(「ceDNA無CpG」)、またhAATプロモーターを含むように、第2のメチル化形態であった。他の点では、ceDNAベクターは同一であった。上記のようにベクターを調製した。
およそ4週齢の4匹の雄CD-1マウスの4つの群を、LNPに封入されたceDNAベクターまたはポリC対照のうちの1つで治療した。0日目に、各マウスに0.5mg/kgのceDNAベクターを5mL/kgの容量で単回静脈内尾静脈注入で投与した。-1、-、1、2、3、7日目、およびその後マウスが絶命するまで毎週、体重を記録した。全血試料および血清試料は、0、1、および35日目に採取した。生存中の撮像は、7、14、21、28、および35日目、その後は毎週、インビボ撮像システム(IVIS)を使用して実施した。撮像のために、各マウスに、2.5mL/kgの腹腔内注入を介して150mg/kgのルシフェリンを注入した。15分後、各マウスを麻酔し、撮像した。マウスは93日目に絶命し、肝臓および脾臓を含む終末組織を収集した。サイトカイン測定は、0日目の投与の6時間後に行った。
同様の体重減少がceDNA処理マウス群(5~7%)のそれぞれで観察され、その後7日目までに急速に回復した。0日目の試料のサイトカイン分析は、評価されたサイトカインの多くがすべての治療群で同様に上昇した一方、インターフェロンアルファ、腫瘍壊死因子アルファ、およびMIP-1アルファはすべて、高CpG試料と比較して、低CpG試料または無CpG試料で減少したことを示した(図12Aおよび図12B)。
低CpGおよび高CpG ceDNAで処置された両マウスは、7日目および14日目に有意な蛍光を示したが、蛍光は、高CpGマウスでは14日後に急速に減少し、残りの研究では着実に減少した。対照的に、低CpGおよび無CpG ceDNAで処置されたマウスの全流束は、安定した高レベルを維持し(図12C)、ceDNAベクターにおける非メチル化CpGの存在をある閾値未満に維持し、それによってTLR9経路を誘起しないことを示唆しており、この経路は、この研究でceDNAにコードされたタンパク質の発現(したがって、蛍光)の他の方法で観察されたより急速な低減を回避するのに役立つ。
実施例27:新生仔マウスにおける発現および宿主応答
先の実験では、cGAS/STING経路が、細胞へのceDNAベクター投与時に観察されるサイトカイン誘導応答に少なくとも部分的に関係していることが示された。この経路は、未熟な免疫系をもつ新生仔マウスが活性のcGAS/STING経路を欠いているように、発生の後期に活性になることが知られている。したがって、ceDNAベクターの発現および持続性に及ぼす経路不在の影響を調べるために、新生仔マウスの実験が行われた。
先の実験では、cGAS/STING経路が、細胞へのceDNAベクター投与時に観察されるサイトカイン誘導応答に少なくとも部分的に関係していることが示された。この経路は、未熟な免疫系をもつ新生仔マウスが活性のcGAS/STING経路を欠いているように、発生の後期に活性になることが知られている。したがって、ceDNAベクターの発現および持続性に及ぼす経路不在の影響を調べるために、新生仔マウスの実験が行われた。
野生型AAV2左ITRおよび変異体右ITRおよびCAGプロモーターを備えた、導入遺伝子としてルシフェラーゼをコードするceDNAベクターを使用した。上記のようにceDNAベクターを調製した。ceDNAベクター試料またはポリCコントロールを、新生仔(8日齢)の雄CD-1マウスに、最大5mL/kgの容量で0.1または0.5mg/kgの用量レベルで尾静脈注射により静脈内投与した。各試料群には5つの複製物が含まれていた。体重は、1日目とおよび3日後に記録された。生存中の撮像は、7、14、および21日目に、インビボ撮像システム(IVIS)を使用して実施した。撮像のために、各マウスに、2.5mL/kgの腹腔内注入を介して150mg/kgのルシフェリンを注入した。15分後、各マウスを麻酔し、撮像した。
注目すべきことに、ゼロ日注射後、どの治療群でも体重減少は観察されなかった。高レベルの総流束(導入されたceDNAベクターからのルシフェラーゼ発現を表す)がすべてのceDNA投与動物で観察され、0.5mg/kgの投与量は、最初の14日間にわたって0.1mg/kgの投与量よりも約1log高い発現レベルをもたらした(図13)。その後、発現レベルは安定し、両方の用量群で同じレベルで持続した。成体CD-1マウスでの同様の研究と比較して、新生仔マウスのceDNAベクター発現レベルは、14日後でも少なくとも2対数多かった(データは示していない)。この結果は、cGAS/STING経路の活性化の回避が、ceDNAベクターの発現および持続性の促進に有益であることを示唆している。
実施例28:ceDNAの持続性、発現、およびサイトカイン誘導に及ぼす複数の免疫経路の調節の影響
先の研究では、培養細胞とマウスの両系でTLR9経路調節の効果を評価した。しかしながら、複数の分子経路が外来DNAに対する宿主応答に関与することが知られており、1つ以上の他の経路がceDNA投与によって引き続き関与している場合、TLR9経路の誘起を回避する影響は容易に観察されない可能性がある。これを試験するために、STING機能を抑止する変異をもつゴールデンチケットマウス株に即して、CpGを最小化したceDNAベクターを試験した。したがって、本実験により、cGAS/STING経路の活性を混乱させることなく、TLR9経路を照合することができた。
先の研究では、培養細胞とマウスの両系でTLR9経路調節の効果を評価した。しかしながら、複数の分子経路が外来DNAに対する宿主応答に関与することが知られており、1つ以上の他の経路がceDNA投与によって引き続き関与している場合、TLR9経路の誘起を回避する影響は容易に観察されない可能性がある。これを試験するために、STING機能を抑止する変異をもつゴールデンチケットマウス株に即して、CpGを最小化したceDNAベクターを試験した。したがって、本実験により、cGAS/STING経路の活性を混乱させることなく、TLR9経路を照合することができた。
各々が導入遺伝子としてルシフェラーゼをコードする、3つの異なるceDNAベクターを使用した。第1のceDNAベクターは多数の非メチル化CpG(約350)を有し(「ceDNA高CpG」)、構成的プロモーター(cET)を含み、第2は中程度数の非メチル化CpG(約60)を有し(「ceDNA低CpG」)、第3は少数のCpG(約36)を有したが、非メチル化CpGを含まないようにメチル化された(「ceDNA無CpG」)。第2および第3の両構築物は、肝臓特異的hAATプロモーターを含んでいた。他の点では、ceDNAベクターは同一であった。上記のようにベクターを調製した。
ceDNAベクター試料またはポリC対照のそれぞれを、雄ゴールデンチケットマウス(Tmem173gt)に尾静脈注射により、5mL/kgの容量で0.5mg/kgの用量レベルで静脈内投与した。場合によっては、ceDNAベクター試料の第2の用量が22日目にマウスに投与された。各試料群には4つの複製物が含まれていた。体重は、投与日とおよび3日後に記録された。全血および血清試料は、0日目(投与6時間後)および22日目(投与6時間後)に採取された。生存中の撮像は、7、14、22、29、36、および43日目に、インビボ撮像システム(IVIS)を使用して実施した。撮像のために、各マウスに、2.5mL/kgの腹腔内注入を介して150mg/kgのルシフェリンを注入した。15分後、各マウスを麻酔し、撮像した。マウスは43日目に絶命し、肝臓および脾臓を含む終末組織を収集した。サイトカインの測定値は、0日目と22日目に採血から採取された。
ceDNA投与による体重減少は5%未満であり、3日目までに全事例で基本的に回復した。22日目に再投与すると、処置マウスは再び体重の5%未満減少し、数日で急速に回復した。サイトカイン誘導は、0日目の血液試料から評価された(図14A)。IL-18を除いて、アッセイされた各サイトカインのレベルは、ceDNA構築物のCpGの存在度と相関し(図14A)、IFN-アルファ、IFN-ガンマ、IL-6、IP-10、MCP-1、MIP-1アルファ、MIP-1ベータおよびRANTESのceDNA無CpG処置マウスでは、誘導が低いか、またはまったく観察されなかった。再投与されたマウスでは、すべての試料が、0日目の読み取りと比較してすべてのサイトカインレベルの増加を示した(図14B)が、再びIL-18を除く全事例で、活性化の程度は、投与されたceDNAベクターに存在するCpG量と相関した。
異なる治療群におけるルシフェラーゼの発現は、22日目まで同様であった(図14C)。その後、単回投与および再投与された両ceDNA高CpG試料で総流束が急激に減少した一方、低CpG群および無CpG群は一貫した総流束測定値を維持するか、高CpG群と比較してシグナル損失が減弱した。組み合わせた結果により、投与されたceDNAベクターのCpG含量の最小化(拡大すれば、TLR9自然免疫経路への関与の回避)が、処置されたゴールデンチケットマウスにおけるサイトカイン誘導の著しい低下およびceDNAからの遺伝子発現のより強力な持続に寄与したことが示される。
実施例29:Rag2マウスにおけるceDNAベクターの持続投与および再投与。
ceDNAベクターの遺伝子発現カセットにコードされている導入遺伝子のうちの1つ以上が、発現したタンパク質が外来であると認識される宿主環境(例えば、細胞または対象)で発現される状況では、宿主が発現産物の望ましくない枯渇をもたらし得る適応免疫反応を開始する可能性が存在し、これは、発現の欠如と混同される可能性がある。場合によっては、これは、通常の宿主環境に対して異種であるレポーター分子で起こり得る。したがって、ceDNAベクター導入遺伝子の発現は、B細胞およびT細胞を欠くRag2マウスモデルにおいてインビボで評価されたため、ルシフェラーゼなどの非天然マウスタンパク質に対する適応免疫反応を開始しない。簡単に言うと、0日目に、c57bl/6およびRag2ノックアウトマウスに、0.5mg/kgの、ルシフェラーゼを発現するLNP封入されたceDNAベクターまたはポリC対照を尾静脈注入により静脈内投与し、21日目に、ある特定のマウスに同じLNP封入されたceDNAベクターを同じ用量レベルで再投与した。すべての試験群は、各々4匹のマウスで構成された。ルシフェリン注入後に週間隔でIVIS撮像を実施した。
ceDNAベクターの遺伝子発現カセットにコードされている導入遺伝子のうちの1つ以上が、発現したタンパク質が外来であると認識される宿主環境(例えば、細胞または対象)で発現される状況では、宿主が発現産物の望ましくない枯渇をもたらし得る適応免疫反応を開始する可能性が存在し、これは、発現の欠如と混同される可能性がある。場合によっては、これは、通常の宿主環境に対して異種であるレポーター分子で起こり得る。したがって、ceDNAベクター導入遺伝子の発現は、B細胞およびT細胞を欠くRag2マウスモデルにおいてインビボで評価されたため、ルシフェラーゼなどの非天然マウスタンパク質に対する適応免疫反応を開始しない。簡単に言うと、0日目に、c57bl/6およびRag2ノックアウトマウスに、0.5mg/kgの、ルシフェラーゼを発現するLNP封入されたceDNAベクターまたはポリC対照を尾静脈注入により静脈内投与し、21日目に、ある特定のマウスに同じLNP封入されたceDNAベクターを同じ用量レベルで再投与した。すべての試験群は、各々4匹のマウスで構成された。ルシフェリン注入後に週間隔でIVIS撮像を実施した。
IVIS分析から観察された全流束を比較すると、LNP-ceDNAベクター-Lucを投与した野生型マウス(発現されたルシフェラーゼの存在の間接的測定)で観察された蛍光は、21日後に徐々に減少したが、同じ治療を施したRag2マウスは、42日の実験にわたってルシフェラーゼの比較的一定の持続的発現を示した(図16A)。野生型マウスで観察された減少のおよそ21日の時点は、適応免疫反応がもたらされると予想される時間枠に対応する。Rag2マウスにおけるLNP-ceDNAベクターの再投与は、発現の顕著な増加をもたらし、これは、この研究で追跡された少なくとも21日間にわたって持続した(図16B)。結果は、非天然タンパク質が、宿主においてceDNAベクターから発現されるときに適応免疫が役割を果たすことができ、初回投与から20日以上の時間枠で観察された発現の減少が、発現の低下ではなく(またはそれに加えて)、発現された分子に対して交絡する適応免疫反応を知らせることができることを示唆する。注目すべきことに、宿主が発現された分子を自己として適切に認識し、そのような免疫反応を起こさないことが予想される宿主において未変性タンパク質を発現する場合、この反応は低いと予想される。
実施例30:持続的発現に対する肝臓特異的発現およびCpG調節の影響
実施例29に記載されているように、望ましくない宿主免疫反応は、場合によっては、導入されたceDNAベクターからの1つ以上の所望の導入遺伝子の持続的発現であるものを人工的に弱めることがある。ceDNAベクターからの持続的発現に対する潜在的な宿主免疫反応の回避および/または抑制の影響を評価するために、2つのアプローチが取られた。第1に、前の実施例で使用されたceDNA-Lucベクターは構成的CAGプロモーターの制御下にあったため、肝臓特異的プロモーター(hAAT)または異なる構成的プロモーター(hEF-1)を使用して同様の構築物を作製して、骨髄細胞または非肝臓組織への長期曝露を回避することで、観察された免疫効果が低減したかどうかを判断した。第2に、ある特定のceDNA-ルシフェラーゼ構築物は、宿主免疫反応の既知のトリガーであるCpG含有量が低減するように操作された。そのような操作され、プロモーターが切り替えられたceDNAベクターをマウスに投与した際のceDNAコード化ルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した。
実施例29に記載されているように、望ましくない宿主免疫反応は、場合によっては、導入されたceDNAベクターからの1つ以上の所望の導入遺伝子の持続的発現であるものを人工的に弱めることがある。ceDNAベクターからの持続的発現に対する潜在的な宿主免疫反応の回避および/または抑制の影響を評価するために、2つのアプローチが取られた。第1に、前の実施例で使用されたceDNA-Lucベクターは構成的CAGプロモーターの制御下にあったため、肝臓特異的プロモーター(hAAT)または異なる構成的プロモーター(hEF-1)を使用して同様の構築物を作製して、骨髄細胞または非肝臓組織への長期曝露を回避することで、観察された免疫効果が低減したかどうかを判断した。第2に、ある特定のceDNA-ルシフェラーゼ構築物は、宿主免疫反応の既知のトリガーであるCpG含有量が低減するように操作された。そのような操作され、プロモーターが切り替えられたceDNAベクターをマウスに投与した際のceDNAコード化ルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した。
各々が導入遺伝子としてルシフェラーゼをコードする、3つの異なるceDNAベクターを使用した。1つ目のceDNAベクターは、多数の非メチル化CpG(約350)を有し、構成的CAGプロモーター(「ceDNA CAG」)を含んでいた。2つ目は、中程度の数の非メチル化CpG(約60)を有し、肝臓特異的hAATプロモーター(「ceDNA hAAT低CpG」)を含んでいた。また3つ目は、非メチル化CpGを含まず、hAATプロモーター(「ceDNA hAAT無CpG」)を含むように、2つ目のメチル化形態であった。他の点では、ceDNAベクターは同一であった。上記のようにベクターを調製した。
およそ4週齢の4匹の雄CD-1(登録商標)マウスの4つの群を、LNPに封入されたceDNAベクターまたはポリC対照のうちの1つで治療した。0日目に、各マウスに0.5mg/kgのceDNAベクターを5mL/kgの容量で単回静脈内尾静脈注入で投与した。-1、-、1、2、3、7日目、およびその後マウスが絶命するまで毎週、体重を記録した。全血試料および血清試料は、0、1、および35日目に採取した。生存中の撮像は、7、14、21、28、および35日目、その後は毎週、インビボ撮像システム(IVIS)を使用して実施した。撮像のために、各マウスに、2.5mL/kgの腹腔内注入を介して150mg/kgのルシフェリンを注入した。15分後、各マウスを麻酔し、撮像した。マウスは93日目に絶命し、肝臓および脾臓を含む終末組織を収集した。サイトカイン測定は、0日目の投与の6時間後に行った。
すべてのceDNA治療マウスは、7日目および14日目に有意な蛍光を示したが、蛍光は、ceDNA CAGマウスでは14日後に急速に減少し、残りの研究では徐々に減少した。対照的に、ceDNA hAAT低CpGおよび無CpG治療マウスの全流束は、安定した高レベルのままであった(図17)。これは、ceDNAベクターの送達を特異的に肝臓に向けることで、単回注入後、少なくとも77日間にわたってベクターからの持続的で耐久性のある導入遺伝子発現がもたらされたことを示唆していた。CpGが最小化されているか、またはCpG含有量が完全に存在しない構築物は、同様の耐久性のある持続的発現プロファイルを有していたが、高CpG構成的プロモーター構築物は、経時的に発現の低下を呈し、ceDNAベクターの導入による宿主免疫活性化が、対象におけるそのようなベクターから観察された発現の減少において役割を果たし得ることを示唆している。これらの結果は、組織の制限されたプロモーターを選択すること、および/または宿主の免疫反応(潜在的に導入遺伝子特異的な反応)が観察された場合にceDNAベクターのCpG含有量を変更することによって、反応の持続時間を所望のレベルに調整する代替的な方法を提供する。
実施例31:インフラマソームアンタゴニストのインビボ発現
適切なタンパク質発現およびインビトロでの受容細胞の機能が確認されたら、インビボでの発現およびタンパク質機能を検証するため、インフラマソームアンタゴニストをコードする配列を有するceDNAベクターを脂質ナノ粒子で製剤化し、様々な時点で(子宮内、新生児、4週齢および8週齢)各タンパク質産生の機能的発現を欠損するマウスに投与される。
適切なタンパク質発現およびインビトロでの受容細胞の機能が確認されたら、インビボでの発現およびタンパク質機能を検証するため、インフラマソームアンタゴニストをコードする配列を有するceDNAベクターを脂質ナノ粒子で製剤化し、様々な時点で(子宮内、新生児、4週齢および8週齢)各タンパク質産生の機能的発現を欠損するマウスに投与される。
LNP-ceDNAベクターは、1.2mLの容量で0.3~5mg/kgの用量でそれぞれのマウスに投与される。各用量は、静脈内流体力学的投与を介して投与されるか、または例えば腹腔内注入によって投与される。正常なマウスへの投与は、対照として機能し、また、治療用タンパク質の存在および量を検出するためにも使用され得る。
LNP-ceDNAの急性投与、例えば、単回投与に続いて、レシピエントマウスの肝臓組織における発現は、例えば10、20、30、40、50、1000および200日以上などの様々な時点で測定される。具体的には、マウスの肝臓および胆管の試料が得られ、組織切片の免疫染色を用いてタンパク質の存在が分析される。タンパク質の存在は、定量的に評価され、組織およびその中の細胞内の適切な局在化についても評価される。肝臓(例えば、肝および上皮)および胆管(例えば、胆管細胞)の細胞は、タンパク質発現について評価される。
実施例32:治療遺伝子(例えば、第IX因子)およびNLRP3インフラマソーム経路の阻害剤を同時発現するceDNAの調製。
A151(配列番号892)またはAIM2を阻害するその変異体は、プロモーターに作動可能に連結され、実施例1に記載されているceDNAベクターの制限クローニング部位R5に挿入される。このようにして、第IX因子およびAIM2阻害剤の両方をコードするceDNAが調製される。
A151(配列番号892)またはAIM2を阻害するその変異体は、プロモーターに作動可能に連結され、実施例1に記載されているceDNAベクターの制限クローニング部位R5に挿入される。このようにして、第IX因子およびAIM2阻害剤の両方をコードするceDNAが調製される。
実施例33:ceDNAによって発現されるNLRP3インフラマソーム阻害剤の発現の確認
A151(配列番号892)などのceDNAによって同時発現される、望ましいNLRP3またはAIM2またはカスパーゼ-1阻害剤の発現は、HeLa細胞および阻害剤に特異的な抗体を使用して確認することができる。例えば、HeLa細胞を培養し、第IX因子および所望のNLRP3またはAIM2またはカスパーゼ1阻害剤を同時発現する構築物の一過性トランスフェクションを、例えばFusegene6トランスフェクション試薬(3:1;fusgene6:DNA)を使用して実施する。当業者に知られているウェスタンブロット技術および/またはフローサイトメトリーを使用して、NLRP3またはAIM2またはカスパーゼ-1阻害剤の発現を検出する。
A151(配列番号892)などのceDNAによって同時発現される、望ましいNLRP3またはAIM2またはカスパーゼ-1阻害剤の発現は、HeLa細胞および阻害剤に特異的な抗体を使用して確認することができる。例えば、HeLa細胞を培養し、第IX因子および所望のNLRP3またはAIM2またはカスパーゼ1阻害剤を同時発現する構築物の一過性トランスフェクションを、例えばFusegene6トランスフェクション試薬(3:1;fusgene6:DNA)を使用して実施する。当業者に知られているウェスタンブロット技術および/またはフローサイトメトリーを使用して、NLRP3またはAIM2またはカスパーゼ-1阻害剤の発現を検出する。
実施例34:第IX因子およびNLRP3インフラマソーム経路の阻害剤をコードするceDNAをもつ血友病Bの第IX因子。
実験は、有害な変異(R333Q)をもつhFIX配列のノックインを含む第IX因子欠損マウスで行われる。雄の第IX因子ノックアウトマウスは、LNP-ceDNA(脂質ナノ粒子ceDNA)の単回投与または反復投与を受ける。2つのLNP-ceDNAベクターが使用される。1)ヒト第IX因子(天然のヒト配列またはPadua FIX変異型のいずれか)およびA151(配列番号892)の両方をコードするLNP-ceDNA。比較ceDNAベクターとして、第IX因子のみをコードし、cGAS阻害剤をコードしないLNP-ceDNA。LNP-ceDNAベクターは、1.2mLの容量で0.3~5mg/kgの用量でそれぞれのマウスに投与される。各用量は、静脈内流体力学投与を介して投与されるべきである。血漿中の第IX因子の発現は、ELISAによって、様々な時点、例えば7、14および21日以上などで評価される。活性化部分トロンボプラスチン時間および出血時間は、有効性の決定としても測定される。hFIXとA151の両方を発現するceDNAベクターを投与されたマウスは、A151、または他のNLRP3もしくはAIM2もしくはカスパーゼ-1阻害剤を発現せずに第IX因子のみを発現するceDNAベクターを投与されたマウスと比較して、より長期間にわたって第IX因子の発現の増加および/または持続を示すことが予想される。さらに、再投与すると、A151と第IX因子の両方を含むceDNAベクターの再投与を受けたマウスは、第IX因子のみをコードするceDNAベクターの再投与を受けたマウスと比較して、サイトカイン分泌の活性化が少なく、導入遺伝子発現期間と治療効果が増加することがさらに予想される。NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤および第IX因子は、異なるceDNAベクターで送達することができるが、それらは同じベクターによってコードされることが好ましく、したがって、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤の阻害は、第IX因子などの導入遺伝子をコードするceDNAベクターを受け取る同一細胞で生じる。
実験は、有害な変異(R333Q)をもつhFIX配列のノックインを含む第IX因子欠損マウスで行われる。雄の第IX因子ノックアウトマウスは、LNP-ceDNA(脂質ナノ粒子ceDNA)の単回投与または反復投与を受ける。2つのLNP-ceDNAベクターが使用される。1)ヒト第IX因子(天然のヒト配列またはPadua FIX変異型のいずれか)およびA151(配列番号892)の両方をコードするLNP-ceDNA。比較ceDNAベクターとして、第IX因子のみをコードし、cGAS阻害剤をコードしないLNP-ceDNA。LNP-ceDNAベクターは、1.2mLの容量で0.3~5mg/kgの用量でそれぞれのマウスに投与される。各用量は、静脈内流体力学投与を介して投与されるべきである。血漿中の第IX因子の発現は、ELISAによって、様々な時点、例えば7、14および21日以上などで評価される。活性化部分トロンボプラスチン時間および出血時間は、有効性の決定としても測定される。hFIXとA151の両方を発現するceDNAベクターを投与されたマウスは、A151、または他のNLRP3もしくはAIM2もしくはカスパーゼ-1阻害剤を発現せずに第IX因子のみを発現するceDNAベクターを投与されたマウスと比較して、より長期間にわたって第IX因子の発現の増加および/または持続を示すことが予想される。さらに、再投与すると、A151と第IX因子の両方を含むceDNAベクターの再投与を受けたマウスは、第IX因子のみをコードするceDNAベクターの再投与を受けたマウスと比較して、サイトカイン分泌の活性化が少なく、導入遺伝子発現期間と治療効果が増加することがさらに予想される。NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤および第IX因子は、異なるceDNAベクターで送達することができるが、それらは同じベクターによってコードされることが好ましく、したがって、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤の阻害は、第IX因子などの導入遺伝子をコードするceDNAベクターを受け取る同一細胞で生じる。
実施例35:自然免疫応答および第IX因子発現期間に及ぼすceDNAおよびNLRP3インフラマソーム阻害剤の同時投与の効果の決定
関心対象のceDNAおよびNLRP3インフラマソーム経路の阻害剤の同時投与がインビトロで自然免疫応答に及ぼす効果を調べるために、NLRP3インフラマソームまたはカスパーゼ-1の活性化を調べる機能アッセイ用にレポーター株を使用できる。このようなインビトロアッセイに有用なNLRP3インフラマソームレポーター細胞株は、転写因子応答要素、例えばNF-κB結合部位、AP-1結合部位、またはそれらの組み合わせの転写制御下で、完全長のNLRP3および分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。例えば、レポーター細胞は96ウェルプレートに播種される。16時間などの所定期間後、NLRP3インフラマソームの阻害剤を含む、または含まない、第IX因子を発現するceDNAを含む様々な量の組成物で細胞を刺激する。SEAPなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤がある場合とない場合の関心対象のceDNAの存在下で、カスパーゼ-1活性化、またはNLRP3インフラマソーム活性化のレベルを比較することができる。NLRP3インフラマソームの阻害剤の存在下では、レポーター分子の活性化が少なくなることが予想される。同じレポーターアッセイを使用して、カスパーゼ-1の阻害剤を評価できる。
関心対象のceDNAおよびNLRP3インフラマソーム経路の阻害剤の同時投与がインビトロで自然免疫応答に及ぼす効果を調べるために、NLRP3インフラマソームまたはカスパーゼ-1の活性化を調べる機能アッセイ用にレポーター株を使用できる。このようなインビトロアッセイに有用なNLRP3インフラマソームレポーター細胞株は、転写因子応答要素、例えばNF-κB結合部位、AP-1結合部位、またはそれらの組み合わせの転写制御下で、完全長のNLRP3および分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。例えば、レポーター細胞は96ウェルプレートに播種される。16時間などの所定期間後、NLRP3インフラマソームの阻害剤を含む、または含まない、第IX因子を発現するceDNAを含む様々な量の組成物で細胞を刺激する。SEAPなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、NLRP3インフラマソーム経路の阻害剤がある場合とない場合の関心対象のceDNAの存在下で、カスパーゼ-1活性化、またはNLRP3インフラマソーム活性化のレベルを比較することができる。NLRP3インフラマソームの阻害剤の存在下では、レポーター分子の活性化が少なくなることが予想される。同じレポーターアッセイを使用して、カスパーゼ-1の阻害剤を評価できる。
同様に、関心対象のceDNAおよびAIM2インフラマソーム経路の阻害剤の同時投与がインビトロで自然免疫応答に及ぼす効果を調べるために、AIM2インフラマソームまたはカスパーゼ-1の活性化を調べる機能アッセイ用にレポーター株を使用できる。このようなインビトロアッセイに有用なAIM2インフラマソームレポーター細胞株は、転写因子応答要素、例えばNF-κB結合部位、AP-1結合部位、またはそれらの組み合わせの転写制御下で、完全長のヒトAIM2および分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。アッセイは、NLRP3インフラマソームレポーターアッセイのように行うことができ、例えば96ウェルプレートに播種されたレポーター細胞は、所定期間後、AIM2インフラマソームの阻害剤を含む、または含まない、第IX因子を発現するceDNAを含む様々な量の組成物で刺激される。SEAPなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、AIM2インフラマソーム経路の阻害剤がある場合とない場合の関心対象のceDNAの存在下で、カスパーゼ-1活性化、またはAIM2インフラマソーム活性化のレベルを比較することができる。AIM2インフラマソームの阻害剤の存在下では、レポーター分子の活性化が少なくなることが予想される。同じレポーターアッセイを使用して、カスパーゼ-1の阻害剤を評価できる。
さらに、NLRP3インフラマソームまたはAIM2インフラマソームのノックアウトレポーター株を使用でき、例えば、THP1-defNLRP3細胞(InvivoGen)またはTRIM11を過剰発現するTHP-1細胞は、AIM2インフラマソームを抑制し(Liu et al.,Cell Reports(2016)16:1988-2002)、当技術分野で他の細胞株が知られている。このようなAIM2またはNLRP3ノックアウトレポーター株は、ルシフェラーゼやおよびSEAP(分泌胚性アルカリホスファターゼ)などの1つ以上の誘導性分泌レポーター遺伝子を発現できる。レポーター遺伝子は、ISG54(インターフェロン刺激遺伝子)最小プロモーターの制御下にあり、1つ以上、例えば5つのIFN刺激応答要素と組み合わせることができる。レポーター遺伝子はまた、NF-κB応答要素などの応答要素の1つ以上、例えば5つのコピーに融合されたIFN-β最小プロモーターの制御下にあり得る。本明細書に記載のceDNAと組み合わせたNLRP3またはAIM2またはカスパーゼ-1の少なくとも1つの阻害剤の存在下におけるNLRP3またはAIM2またはカスパーゼ-1の活性は、ノックアウト細胞株対親細胞株で比較することができる。
エクスビボでNLRP3および/もしくはAIM2インフラマソーム経路の活性化に及ぼす関心対象のceDNAとNLRP3インフラマソームの阻害剤および/もしくはAIM2インフラマソームの阻害剤、またはNLRP3アンタゴニストもしくはAIM2アンタゴニストの同時投与の効果を調べるために、例えば、末梢血の勾配密度遠心分離および磁気分離により、ヒト単球を単離することができる。これらの単球は、NLRP3インフラマソームの阻害剤および/またはAIM2インフラマソームの阻害剤、またはNLRP3アンタゴニストまたはAIM2アンタゴニスト、またはカスパーゼ-1阻害剤の有無にかかわらず、適切な対照を用いて、関心対象のceDNAとの接触および/または活性化の前後に調べることができる。治療後、血清および細胞上清を使用して、当業者に知られるいずれかのアッセイまたは方法を用いて、NLRP3インフラマソーム経路の活性化および/またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤の機能的読み出しとして1つ以上のサイトカイン経路、例えば、インターロイキン(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-18、インターフェロン(IFN)-γ、インターフェロン(IFN)-α、単球化学誘引タンパク質(MCP)-1、IP-10、および/または腫瘍壊死因子(TNF)-αを測定する。さらに、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、NF-κBの活性化を検証することができる。NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1阻害剤の存在下では、ceDNAの投与時にサイトカイン経路の活性化とサイトカイン分泌が減少し、導入遺伝子の発現期間および治療効果の増加を促進すると予想される。
NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の活性化、またはインビボでのカスパーゼ1活性化に及ぼす関心対象のceDNAと、NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1阻害剤の同時投与の効果を調べるために、マウスモデルを使用できる。NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1阻害剤の有無にかかわらず、第IX因子などの関心対象の導入遺伝子を発現するceDNAとの接触および/または活性化の前後に、マウスの血清またはリンパ球試料を適切な対照を用いて調査する。治療後、血清および細胞上清を使用して、当業者に知られるいずれかのアッセイまたは方法を用いて、NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の活性化、またはカスパーゼ1活性化の機能的読み出しとして1つ以上のサイトカイン経路、例えば、インターロイキン(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-18、インターフェロン(IFN)-γ、インターフェロン(IFN)-α、単球化学誘引タンパク質(MCP)-1、および/または腫瘍壊死因子(TNF)-αを測定する。さらに、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、NF-κBの活性化を検証することができる。NLRP3および/またはAIM2インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ1阻害剤の存在下では、ceDNAの投与時に免疫活性化とサイトカイン分泌が減少し、導入遺伝子の発現期間および治療効果の増加を促進すると予想される。
プラスミドTTX-9から産生されたヒト第IX因子を発現する関心対象のceDNAと、NLRP3インフラマソームの阻害剤およびカスパーゼ-1の同時投与が評価された。C57bLマウス群(n=8)は、表11に示すように評価された。
簡潔に述べれば、表12に示す群に従って、動物をマクロファージ活性化の阻害剤または対照で前処置した。0.5mg/kg ceDNA(TTX9-LNP)(群1)またはLNP-siRNA(陰性対照)(群1)を外側尾静脈を介した静脈内投与する12~16時間前、および1時間前にも、動物にMCC950(NLRP2阻害剤)(群5)またはVX765(ベルナカサン;選択的カスパーゼ-1阻害剤)(群4)を腹腔内投与した。前処置対照群には、クロドロネート単独を投与した(溶媒対照)(群3)。全血は、0、1、7、および21日目に各群から尾静脈または顔面静脈または眼窩出血を介して採取された。
サイトカインレベルは、Luminexの技術基盤を用いて種々のサイトカインおよびケモカインのレベルを測定するための定量的多重ビーズ系免疫アッセイである、ProcartaPlex Multiplex Immunoassay(Invitrogen)を使用して、製造元の指示に従って定量および評価された。実験マウスから得た試料を、あらかじめ混合されたカスタムマウスサイトカイン8プレックスキット、磁気ビーズと混合し、IFN-α、IFN-γ、IL-6、IP-10、IL-18、IL-1β、MCP-1、およびTNF-アルファのレベルについてアッセイした。図18A~18Hでは、NLRP3阻害剤(MCC950)またはカスパーゼ1阻害剤(VX765)による薬理学的マクロファージ枯渇を伴うTTX-9投与後のサイトカインレベルを評価した。IFNγおよびIL-18のレベルは、MCC950(NLRP3阻害剤)処置により有意に低減し(図18Bおよび図18D)、MCC950によりIP-10のレベルは低減した(図18F)。IL-18のレベルもVX765(カスパーゼ-1阻害剤)により低減した(図18D)。
参照文献
1.Intracellular Nucleic Acid Detection in Autoimmunity.J.T.Crowl et al.,Annu.Rev.Immunol.2017,35:313-336
2.Innate Immune Recognition of DNA:a recent history.A.Dempsey and A.G.Bowie,Virology 2015 May,0:146-152
3.Cutting Edge:Antimalarial Drugs Inhibit IFN-β Production through Blockade of Cyclic GMP-AMP Synthase-DNA Interaction.J.An et al.,J.Immunol.March 27,2015
4.Small molecule inhibition of cGAS reduces interferon expression in primary macrophages from autoimmune mice.J.Vincent et al.,Nature Communications,8:750
5.Discovery of PF-06928215 as a high affinity inhibitor of cGAS enabled by a novel fluorescence polarization assay.PLOS ONE.September 21,2017
6.The functional interactome of PYHIN immune regulators reveals IFIX is a sensor of viral DNA.B.A.Diner et al.,Molecular Systems Biology,2015,11:787
7.Activation and Regulation of DNA-Driven Immune Responses.S.R.Paluden.Microbiology and Molecular Biology Reviews.2015.79(2):225
8.Viral Evasion of DNA-stimulated innate immune responses.M.H.Christnesen and S.R.Paluden.Cellular and Molecular Immunology.2017.14:4-13
9.Sequence-specific activation of the DNA sensor cGAS by Y-form DNA structures as found in primary HIV-1 cDNA.A-M Herzner et al.,2015.Nature Immunology
10.RNA Polymerase III Detects Cytosolic DNA and Induces Type-I Interferons Through the RIG-I Pathway.Y-H Chiu et.al.2009.Cell.138(3):576-591
11.Mi-R-25/93 mediates hypoxia-induced immunosuppression by repressing cGAS.M.Z.Wu et al.2017.Nat.Cell Biol.19(10):1286-1296
12.Cytoplasmic isoforms of Kaposi sarcoma herpesvirus LANA recruit and antagonize the innate immune DNA sensor cGAS.Zhang G.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2016 Feb 23;113(8):E1034-43.
13.Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus inhibitor of cGAS(KicGAS)Encoded by ORF52,is an Abundant Tegument protein and Is Required for Production of Infectious Progeny Viruses.W.Li,et al.,J.Virol.2016,90(11):5329
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3.Cutting Edge:Antimalarial Drugs Inhibit IFN-β Production through Blockade of Cyclic GMP-AMP Synthase-DNA Interaction.J.An et al.,J.Immunol.March 27,2015
4.Small molecule inhibition of cGAS reduces interferon expression in primary macrophages from autoimmune mice.J.Vincent et al.,Nature Communications,8:750
5.Discovery of PF-06928215 as a high affinity inhibitor of cGAS enabled by a novel fluorescence polarization assay.PLOS ONE.September 21,2017
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Claims (156)
- 導入遺伝子が細胞で発現したときに免疫応答を阻害するための方法であって、
共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)を含む組成物を前記細胞に投与することであって、前記ceDNAベクターが、2つの隣接する逆位末端反復配列(ITR)の間に作動可能に位置付けられた少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列を含む、投与することと、
前記免疫応答の少なくとも1つの阻害剤を前記細胞に投与することと、を含む、方法。 - 前記免疫応答が、自然免疫応答である、請求項1に記載の方法。
- 前記免疫応答の前記阻害剤が、前記自然免疫応答の阻害剤である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ceDNAベクターが、前記免疫応答の前記少なくとも1つの阻害剤をさらにコードする、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫応答の前記阻害剤が、前記ceDNAベクターとは別個に投与される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫応答の前記阻害剤が、NLRP3インフラマソームの阻害剤、AIM2インフラマソームの阻害剤、またはカスパーゼ-1阻害剤である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫応答の前記阻害剤が、環状GMP-AMPシンターゼ(cGAS)の阻害剤である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫応答の前記阻害剤が、トール様受容体(TLR)の阻害剤である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TLR阻害剤が、TLR9阻害剤である、請求項8に記載の方法。
- 前記免疫応答の前記阻害剤が、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体である、請求項1~3または5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ceDNAによってコードされる前記AIM2インフラマソームの前記阻害剤が、前記AIM2インフラマソームまたはカスパーゼ-1を阻害する配列番号602のA151またはその変異体である、請求項6に記載の方法。
- 前記ceDNAによってコードされる前記NLRP3インフラマソームの前記阻害剤、または前記AIM2インフラマソームの阻害剤、またはカスパーゼ-1阻害剤が、前記NLRP3インフラマソーム、前記AIM2インフラマソームまたはカスパーゼ-1のうちのいずれかに特異的なmiRNAである、請求項6に記載の方法。
- 前記ceDNAによってコードされる前記NLRP3インフラマソームの前記阻害剤、または前記AIM2インフラマソームの阻害剤、またはカスパーゼ-1阻害剤が、前記NLRP3インフラマソーム、前記AIM2インフラマソームまたはカスパーゼ-1のうちのいずれかに特異的なsiRNAである、請求項6に記載の方法。
- 前記ceDNAによってコードされる前記NLRP3インフラマソームの前記阻害剤、または前記AIM2インフラマソームの阻害剤、またはカスパーゼ-1阻害剤が、前記NLRP3インフラマソーム、前記AIM2インフラマソームまたはカスパーゼ-1のうちのいずれかに結合する抗体または抗原結合断片である、請求項6に記載の方法。
- 前記ceDNAによってコードされる前記NLRP3インフラマソームの前記阻害剤、または前記AIM2インフラマソームの阻害剤、またはカスパーゼ-1阻害剤が、前記NLRP3インフラマソーム、前記AIM2インフラマソームまたはカスパーゼ-1のうちのいずれかに結合する抗体または抗原結合断片である、請求項6に記載の方法。
- 前記NLRP3インフラマソームの前記阻害剤が、MCC950、16673-34-0、Bay11-7082、グリベンクラミドまたはイソリキリチゲニンのうちのいずれかから選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記AIM2インフラマソームの前記阻害剤が、A151(配列番号602)、miR-223、または抗ヒトASCモノクローナル抗体のうちのいずれかから選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記カスパーゼ-1の阻害剤が、ベルナカサン、シコニン、アセチルシコニン、プラルナカサン、Z-VAD-FMK、Z-WEHD-FMK、Ac-YVAD-cmk、Ac-YVAD-CHOまたはパルテノライドのうちのいずれかから選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記cGASの阻害剤が、cGASを阻害する配列番号882のカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ORF52もしくはその変異体、またはORF52のガンマヘルペスウイルス相同分子腫である、請求項7に記載の方法。
- 前記cGASの阻害剤が、配列番号883のカポジ肉腫ヘルプレスウイルスLANA(潜伏期関連核抗原)の細胞質イソ型である、請求項7に記載の方法。
- 前記カポジ肉腫ヘルプレスウイルスLANAの細胞質イソ型が、LANAΔ161(配列番号884)である、請求項20に記載の方法。
- 前記cGASの阻害剤が、cGASに特異的なmiRNAである、請求項7に記載の方法。
- 前記cGASに特異的なmiRNAが、miR-25(配列番号885)およびmiR-93(配列番号886)から選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記cGASの阻害剤が、cGASに特異的なsiRNAである、請求項7に記載の方法。
- 前記cGASの阻害剤が、cGASに結合する抗体または抗原結合断片である、請求項7に記載の方法。
- 前記cGASの阻害剤が、抗マラリア薬である、請求項7に記載の方法。
- 前記抗マラリア薬が、アミノキノリン系またはアミノアクリジン系の抗マラリア薬である、請求項26に記載の方法。
- 前記抗マラリア薬が、キナクリン(QC)、9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン(AMCA)、ヒドロキシクロロキン(HCQ)、およびクロロキン(CQ)から選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記cGASの阻害剤が、前記cGASの触媒ポケットに結合する小分子化合物である、請求項7に記載の方法。
- 前記cGASの触媒ポケットに結合する前記小分子化合物が、RU166365、RU281332、RU320521、RU320519、RU320461、RU320462、RU320520、RU320467、およびRU320582から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記cGASの触媒ポケットに結合する前記小分子化合物が、RU320521である、請求項30に記載の方法。
- 前記cGASの触媒ポケットに結合する前記小分子化合物が、化合物15、化合物16、化合物17、化合物18、化合物19、およびPF-06928215から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記cGASの触媒ポケットに結合する前記小分子化合物が、PF-06928215である、請求項32に記載の方法。
- 前記TLR9阻害剤が、TLR9阻害オリゴヌクレオチドである、請求項9に記載の方法。
- 前記TLR9阻害オリゴヌクレオチド配列が、以下の特徴、(i)前記3’末端の3つの連続したGヌクレオチド、(ii)前記5’末端のCC(T)トリプレット、および(iii)前記5’CC(T)と下流のGGGトリプレットとの間の距離が、最適には3~5ヌクレオチドの長さであること、のうちの1つ以上を有する、請求項34に記載の方法。
- 前記TLR9阻害オリゴヌクレオチド配列が、TTAGGGn(配列番号888)の配列を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記TLR9阻害オリゴヌクレオチド配列が、ODN-2088(TCCTGGCGGGGAAGT、配列番号889)、ODN-2114(TCCTGGAGGGGAAGT、配列番号890)、ポリ-G(GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG、配列番号891)、ODN-A151(TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、配列番号892)、G-ODN(CTCC-TATTGGGGGTTTCCTAT、配列番号893)、IRS-869(TCCTGGAGGGGTTGT、配列番号894)、INH-1(CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG、配列番号895)、INH-4(TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA、配列番号896)、IRS-661(TGCTTGCAAGCTT-GCAAGCA、配列番号897)、4024(TCCTGGATGGGAAGT、配列番号898)、4084F(CCTGGATGGGAA、配列番号899)、INH-13(CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA、配列番号900)、INH-18(CCTGGATGGGAACTTACCGCTGCA、配列番号901)、およびIRS-954 TGCTCCTGGAGGGGTTGT配列番号902)、およびAS1411(GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG、配列番号903)から選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記TLR9阻害剤が、TLR9に特異的なmiRNAである、請求項9に記載の方法。
- 前記TLR9阻害剤が、TLR9に特異的なsiRNAである、請求項9に記載の方法。
- 前記TLR9阻害剤が、TLR9に結合する抗体または抗原結合断片である、請求項9に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、2つの隣接する野生型逆位末端反復配列(WT-ITR)の間に作動可能に位置付けられている、請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、2つの隣接する変異型逆位末端反復配列(変異ITR)の間に作動可能に位置付けられている、請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、2つの隣接する逆位末端反復配列の間に作動可能に位置付けられ、1つのITRが、WT-ITRであり、1つのITRが、変異ITRである、請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ITRが、対称ITRである、請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ITRが、非対称ITRである、請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)から選択されるウイルスに由来する、請求項1~45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記隣接するITRが、対称または非対称である、請求項1~46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記隣接するITRが、対称または実質的に対称である、請求項47に記載の方法。
- 前記隣接するITRが、非対称である、請求項47に記載の方法。
- 前記ITRの一方もしくは両方が野生型であるか、または前記ITRの両方が野生型である、請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記隣接するITRが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ITRの少なくとも一方が、前記ITRの全体的な3次元立体構造に影響を及ぼす欠失、付加、または置換によって野生型AAV ITR配列から改変されている、請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、およびAAV12から選択されるAAV血清型に由来する、請求項52に記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、合成である、請求項1~53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ITRの一方もしくは両方が野生型ITRでないか、または前記ITRの両方が野生型でない、請求項53または54に記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、A、A’、B、B’、C、C’、D、およびD’から選択される前記ITR領域のうちの少なくとも1つにおいて欠失、挿入、および/または置換によって修飾されている、請求項1~53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記欠失、挿入、および/または置換が、通常は前記A、A’、B、B’、C、またはC’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、請求項56に記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および/または置換によって修飾されている、請求項56に記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記CおよびC’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および/または置換によって修飾されている、請求項56に記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成されるステムループ構造の一部、ならびに/または通常は前記CおよびC’領域によって形成されるステムループ構造の一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および/または置換によって修飾されている、請求項56に記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成される第1のステムループ構造と、前記CおよびC’領域によって形成される第2のステムループ構造とを含む前記領域に、単一のステムループ構造を含む、請求項1~53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成される第1のステムループ構造と、前記CおよびC’領域によって形成される第2のステムループ構造とを含む前記領域に、単一のステムおよび2つのループを含む、請求項1~53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成される第1のステムループ構造と、前記CおよびC’領域によって形成される第2のステムループ構造とを含む前記領域に、単一のステムおよび単一のループを含む、請求項1~53のいずれか一項に記載の方法。
- 両方のITRが、前記ITRが互いに対して反転された場合に全体的な3次元対称性をもたらす様式で改変されている、請求項1~63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの調節スイッチの制御下にある、請求項1~64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの調節スイッチが、バイナリ調節スイッチ、小分子調節スイッチ、パスコード調節スイッチ、核酸系調節スイッチ、転写後調節スイッチ、放射線制御または超音波制御の調節スイッチ、低酸素媒介調節スイッチ、炎症反応調節スイッチ、剪断活性化調節スイッチ、およびキルスイッチから選択される、請求項65に記載の方法。
- 前記ceDNAベクターおよび/または前記免疫応答の前記阻害剤が、カプセル化されている、請求項1~66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ceDNAベクターおよび/または前記免疫応答の前記阻害剤が、ナノ担体中にある、請求項1~66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ナノ担体が、脂質ナノ粒子(LNP)を含む、請求項67に記載の方法。
- 前記ceDNAが、前記ceDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なDNA対照と比較して、直鎖状かつ連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ceDNAベクターが、前記免疫応答の前記少なくとも1つの阻害剤に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項1~4および5~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロモーターが、表1のいずれかから選択される、請求項71に記載の方法。
- 前記ceDNAベクターが、表2のいずれかから選択されるエンハンサーをさらに含む、請求項1~72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ceDNAベクターが、表2Aのいずれかから選択される5’UTRおよび/またはイントロン配列を含む、請求項1~73のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ceDNAベクターが、表2Bのいずれかから選択される3’UTRを含む、請求項1~74のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ceDNAベクターが、表3のいずれかから選択される少なくとも1つのポリA配列を含む、請求項1~75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ceDNAベクターが、前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む、請求項1~76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ceDNAベクターを含む組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1~77のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞に投与される前記ceDNAベクターの量を増加させることにより、前記細胞における前記導入遺伝子の発現が増加する、請求項1~78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異種核酸配列が、治療用導入遺伝子をコードし、前記導入遺伝子の所望の発現レベルが、治療有効量である、請求項1~79のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、転写または翻訳されると、対象における内因性タンパク質の異常な量を補正する、請求項1~80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、転写または翻訳されると、対象における内因性タンパク質または経路の異常な機能または活性を補正する、請求項1~81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、治療を必要とするヒト患者である、請求項81または82に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、RNAi、siRNA、miRNA、lncRNA、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチド分子をコードするかまたはそれを含む、請求項1~83のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、タンパク質をコードする、請求項1~84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、マーカータンパク質(例えば、レポータータンパク質)である、請求項85に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、前記疾患または障害に関連する内因性タンパク質または経路のアゴニストまたはアンタゴニストをコードする、請求項1~84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、抗体をコードする、請求項1~84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫応答の追加阻害剤の同時投与をさらに含む、請求項1~88のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ceDNAベクターが、(a)少なくとも1つのRepタンパク質の存在下でceDNA発現構築物を保有する昆虫細胞の集団を、前記昆虫細胞内で前記ceDNAベクターの産生を誘導するのに効果的な条件下かつ十分な時間、インキュベートするステップであって、前記ceDNA発現構築物が、前記ceDNAベクターをコードするステップと、(b)前記昆虫細胞から前記ceDNAベクターを単離するステップと、を含むプロセスから得られる、請求項1~89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ceDNA発現構築物が、ceDNAプラスミド、ceDNAバクミド、およびceDNAバキュロウイルスから選択される、請求項90に記載の方法。
- 前記昆虫細胞が、少なくとも1つのRepタンパク質を発現する、請求項90に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのRepタンパク質が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)から選択されるウイルスに由来する、請求項92に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのRepタンパク質が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、およびAAV12から選択されるAAV血清型に由来する、請求項93に記載の方法。
- 請求項90に記載の方法により産生された前記ceDNAベクターをコードするceDNA発現構築物。
- ceDNAプラスミド、ceDNAバクミド、またはceDNAバキュロウイルスである、請求項95に記載のceDNA発現構築物。
- 請求項95または請求項96に記載のceDNA発現構築物を含む宿主細胞。
- 少なくとも1つのRepタンパク質を発現する、請求項97に記載の宿主細胞。
- 前記少なくとも1つのRepタンパク質が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)から選択されるウイルスに由来する、請求項98に記載の宿主細胞。
- 前記少なくとも1つのRepタンパク質が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、およびAAV12から選択されるAAV血清型に由来する、請求項99に記載の宿主細胞。
- 昆虫細胞である、請求項97~100のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記昆虫細胞が、Sf9細胞である、請求項101に記載の宿主細胞。
- ceDNAベクターを産生する方法であって、(a)前記ceDNAベクターの産生を誘導するのに効果的な条件下かつ十分な時間、請求項97~102のいずれか一項に記載の宿主細胞をインキュベートすることと、(b)前記宿主細胞から前記ceDNAを単離することと、を含む、方法。
- 共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNAベクター)を含む組成物であって、前記ceDNAベクターが、2つの隣接する逆位末端反復配列(ITR)の間に作動可能に位置付けられた少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列を含む、組成物。
- 前記ceDNAベクターが、前記免疫応答の前記少なくとも1つの阻害剤をさらにコードする、請求項104に記載の組成物。
- 前記免疫応答が、自然免疫応答である、請求項104または105に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、2つの隣接する野生型逆位末端反復配列(WT-ITR)の間に作動可能に位置付けられている、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、2つの隣接する変異型逆位末端反復配列(変異ITR)の間に作動可能に位置付けられている、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、2つの隣接する逆位末端反復配列の間に作動可能に位置付けられ、1つのITRが、WT-ITRであり、1つのITRが、変異ITRである、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRが、対称ITRである、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRが、非対称ITRである、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRの一方または両方が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)から選択されるウイルスに由来する、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記隣接するITRが、対称または非対称である、請求項112に記載の組成物。
- 前記ITRの両方が野生型である、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記隣接するITRが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRの少なくとも一方が、前記ITRの全体的な3次元立体構造に影響を及ぼす欠失、付加、または置換によって野生型AAV ITR配列から改変されている、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRの一方または両方が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、およびAAV12から選択されるAAV血清型に由来する、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRの一方または両方が、合成である、請求項104~117のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRの両方が野生型ではない、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRの一方または両方が、A、A’、B、B’、C、C’、D、およびD’から選択される前記ITR領域のうちの少なくとも1つにおける欠失、挿入、および/または置換によって修飾されている、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記欠失、挿入、および/または置換が、通常は前記A、A’、B、B’、C、またはC’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、請求項120に記載の組成物。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および/または置換によって修飾されている、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記CおよびC’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および/または置換によって修飾されている、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成されるステムループ構造の一部、ならびに/または通常は前記CおよびC’領域によって形成されるステムループ構造の一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および/または置換によって修飾されている、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成される第1のステムループ構造と、前記CおよびC’領域によって形成される第2のステムループ構造とを含む前記領域に、単一のステムループ構造を含む、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成される第1のステムループ構造と、前記CおよびC’領域によって形成される第2のステムループ構造とを含む前記領域に、単一のステムおよび2つのループを含む、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成される第1のステムループ構造と、前記CおよびC’領域によって形成される第2のステムループ構造とを含む前記領域に、単一のステムおよび単一のループを含む、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 両方のITRが、前記ITRが互いに対して反転された場合に全体的な3次元対称性をもたらすような様式で改変されている、請求項104~106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ITRが、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)から選択されるウイルス由来の配列に基づくものである、請求項104~128のいずれか一項に記載の組成物。
- 少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの調節スイッチの制御下にある、請求項104~129のいずれか一項に記載の組成物。
- 少なくとも1つの調節スイッチが、バイナリ調節スイッチ、小分子調節スイッチ、パスコード調節スイッチ、核酸系調節スイッチ、転写後調節スイッチ、放射線制御または超音波制御の調節スイッチ、低酸素媒介調節スイッチ、炎症反応調節スイッチ、剪断活性化調節スイッチ、およびキルスイッチから選択される、請求項130に記載の組成物。
- 前記ceDNAベクターが、カプセル化されている、請求項104~131のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ceDNAベクターが、ナノ担体内にある、請求項104~132のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ナノ担体が、脂質ナノ粒子(LNP)を含む、請求項133に記載の組成物。
- 前記ceDNAが、前記ceDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なDNA対照と比較して、直鎖状かつ連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を有する、請求項104~134のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ceDNAベクターが、前記免疫応答の前記少なくとも1つの阻害剤に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項104~135のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ceDNAベクターが、表2のいずれかから選択されるエンハンサーを含む、請求項104~136のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ceDNAベクターが、表2Aのいずれかから選択される5’UTRおよび/またはイントロン配列を含む、請求項104~137のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ceDNAベクターが、表2Bのいずれかから選択される3’UTRを含む、請求項104~138のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ceDNAベクターが、表3のいずれかから選択される少なくとも1つのポリA配列を含む、請求項104~139のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ceDNAベクターが、前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む、請求項104~140のいずれか一項に記載の組成物。
- 少なくとも1つのITRが、機能的末端分解部位およびRep結合部位を含み、前記ITRの1つが前記他のITRと比べて欠失、挿入または置換を含む、請求項104~141のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、真核細胞での発現のためにコドン最適化される、請求項104~142のいずれか一項に記載の組成物。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項104~143のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記免疫応答の前記阻害剤が、前記NLRP3インフラマソームの阻害剤、前記AIM2インフラマソームの阻害剤、またはカスパーゼ-1阻害剤である、請求項104~144のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記免疫応答の前記阻害剤が、環状GMP-AMPシンターゼ(cGAS)の阻害剤である、請求項104~144のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記免疫応答の前記阻害剤が、トール様受容体(TLR)の阻害剤である、請求項104~144のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記TLR阻害剤が、TLR9阻害剤である、請求項147に記載の組成物。
- 前記免疫応答の前記阻害剤が、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体である、請求項104~144のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞で免疫応答の阻害剤を発現させる方法であって、前記細胞を請求項104~149のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
- 前記細胞が、インビトロまたはインビボである、請求項150に記載の方法。
- 請求項104~149のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物。
- 前記自然免疫応答の阻害剤をさらに含む、請求項152に記載の医薬組成物。
- 前記自然免疫応答の前記阻害剤が、前記ceDNAベクターとは別個に製剤化される、請求項153に記載の医薬組成物。
- 請求項104~149のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞。
- 請求項104~149のいずれか一項に記載の組成物、請求項152~154のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項155に記載の細胞を含むキット。
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