JP2022518504A - 閉端ｄｎａ（ｃｅｄｎａ）ならびに遺伝子療法または核酸療法に関連する免疫応答を低減させる方法における使用 - Google Patents

閉端ｄｎａ（ｃｅｄｎａ）ならびに遺伝子療法または核酸療法に関連する免疫応答を低減させる方法における使用 Download PDF

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Abstract

本明細書では、細胞への所望の導入遺伝子の投与が、ｃｅＤＮＡベクターの反復投与と導入遺伝子の送達によって達成される場合、免疫応答の阻害剤、特に自然免疫応答の阻害剤を使用して免疫応答を最小限にすることに関する方法および構築物が提供される。本発明の実施形態は、標的の細胞、組織、器官または生物への外因性ＤＮＡ配列の送達、ならびにそれらに対する免疫応答（例えば、自然免疫応答）を阻害するための修飾および方法を含む、遺伝子療法の分野に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０１９年１月２４日出願の米国仮出願第６２／７９６，４１７号、２０１９年２月１日出願の米国仮出願第６２／８００，３０３号、２０１９年１月２４日出願の米国仮出願第６２／７９６，４５０号、２０１９年２月１日出願の米国仮出願第６２／８００，２８５号、２０１９年３月６日出願の米国仮出願第６２／８１４，４１４号、２０１９年３月６日出願の米国仮出願第６２／８１４，４２４号、および２０１９年６月５日出願の米国仮出願第６２／８５７，５４２号に対して優先権を主張するものであり、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年１月２４日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、１３１６９８－０３３２０－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ－ＦＩＮＡＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは１１７，１２４バイトである。
本発明の実施形態は、標的の細胞、組織、器官または生物への外因性ＤＮＡ配列の送達、ならびにそれらに対する免疫応答（例えば、自然免疫応答）を阻害するための修飾および方法を含む、遺伝子療法の分野に関する。
遺伝子療法は、遺伝子発現プロファイルにおける異常によって引き起こされる遺伝子変異または後天性疾患のいずれかに罹患している患者の臨床転帰を改善することを目的とする。遺伝子療法は、欠陥遺伝子、または障害、疾患、悪性腫瘍等をもたらし得る異常な調節もしくは発現、例えば過小発現もしくは過剰発現に起因する医学的状態の治療または予防を含む。例えば、欠陥遺伝子によって引き起こされる疾患または障害は、修復遺伝物質を患者に送達することによって治療、予防、もしくは改善され得るか、または患者の体内で遺伝物質の治療的発現をもたらす、例えば患者への修復遺伝物質を用いて欠陥遺伝子を改変もしくはサイレンシングすることによって治療、予防、もしくは改善され得る。
遺伝子療法の基礎は、転写カセットに活性遺伝子産物（導入遺伝子と称される場合がある）を供給することであり、例えば、正の機能獲得効果、負の機能喪失効果、または別の結果をもたらし得る。そのような結果は、活性化抗体もしくは融合タンパク質または阻害性（中和）抗体もしくは融合タンパク質の発現に起因し得る。遺伝子療法を使用して、他の要因によって引き起こされる疾患または悪性腫瘍を治療することもできる。ヒト単一遺伝障害は、標的細胞への正常遺伝子の送達および発現によって治療され得る。患者の標的細胞中の修復遺伝子の送達および発現は、操作されたウイルスおよびウイルス遺伝子送達ベクターの使用を含む、多くの方法を介して実行され得る。使用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組み換えレトロウイルス、組み換えレンチウイルス、組み換えアデノウイルス等）の中で、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において多用途ベクターとして人気を集めている。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属し、より具体的にはディペンドパルボウイルス属を構成する。ＡＡＶ由来のベクター（すなわち、組み換えＡＡＶ（ｒＡＶＶ）またはＡＡＶベクター）は、（ｉ）それらが筋細胞およびニューロンを含む多種多様な非分裂および分裂細胞型に感染する（形質導入する）ことができるため、（ｉｉ）それらがウイルス構造遺伝子を欠いていることによって、ウイルス感染に対する宿主細胞反応、例えばインターフェロン媒介性反応を減少させるため、（ｉｉｉ）野生型ウイルスが、ヒトにおいて非病理的であるとみなされるため、（ｉｖ）宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる野生型ＡＡＶと対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子を欠き、一般にエピソームとして持続し、したがって挿入変異または遺伝毒性の危険性を制限するため、ならびに（ｖ）他のベクター系と比較して、ＡＡＶベクターは、一般に比較的不良な免疫原であるとみなされるため、著しい免疫応答を誘起せず（ｉｉを参照）、したがって治療導入遺伝子のベクターＤＮＡおよび潜在的に長期発現の持続を得るため、遺伝物質を送達するために魅力的である。
しかしながら、ＡＡＶ粒子を遺伝子送達ベクターとして使用することには、いくつかの重大な欠陥が存在する。ｒＡＡＶに関連する１つの重大な欠点は、約４．５ｋｂの異種ＤＮＡの制限されたウイルスパッケージング能力であり（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、結果として、ＡＡＶベクターの使用は、１５０，０００Ｄａ未満のタンパク質コーディング能力に制限されている。第２の欠点は、集団における野生型ＡＡＶ感染の流行の結果として、ｒＡＡＶ遺伝子療法の候補を、患者からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングする必要があることである。第３の欠点は、初回治療から排除されなかった患者への再投与を予防するカプシド免疫原性に関する。患者における免疫系は、「ブースター」ショットとして有効に作用するベクターに反応して、将来の治療を妨げる高力価抗ＡＡＶ抗体を生成する免疫系を刺激し得る。いくつかの最近の報告は、高用量状況における免疫原性との関係を示している。一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡが異種遺伝子発現前に二本鎖ＤＮＡに変換されなければならないことを考えると、別の顕著な欠点は、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現の始まりが比較的遅いことである。
追加として、カプシドを有する従来のＡＡＶビリオンは、ＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子を含有する１つ以上のプラスミドを導入することによって産生される（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。しかしながら、そのようなカプシド化ＡＡＶウイルスベクターは、ある特定の細胞および組織型を非効率的に形質導入し、カプシドはまた、免疫応答を誘導することもわかった。したがって、遺伝子療法のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用は、（患者免疫応答に起因する）患者への単回投与、最小ウイルスパッケージング能力（約４．５ｋｂ）に起因するＡＡＶベクター中の送達に好適な導入遺伝子遺伝物質の制限された範囲、および遅いＡＡＶ媒介性遺伝子発現に起因して制限される。
さらに、哺乳動物の免疫系は、侵入する病原体および異常な細胞の活動およびプロセスを検出し排除するための多くの機構を含み、これらは、ウイルスベクターまたは核酸を対象に投与すると誘発され得る。例えば、パターン認識受容体（ＰＲＲ）は、外来核酸、例えば、ウイルスＤＮＡおよびウイルスＲＮＡなどの保存された病原体関連分子を検出するためのセンサーとして機能し、自然免疫応答を誘起するように進化した分子のクラスである。トール様受容体（ＴＬＲ）は、エンドソームの状況で核酸を検出するＰＲＲ群であり、ＴＬＲ９（ｄｓＤＮＡ、優先的には非メチル化ＣｐＧ反復を検出する）、ＴＬＲ３（ｄｓＲＮＡを検出する）、およびＴＬＲ７（ｓｓＲＮＡを検出する）が含まれる。ＰＲＲの第２のシステムは、感染細胞内の外来核酸、特に二本鎖ＲＮＡを検出するためにサイトゾルに位置している。１「ＲＩＧ－Ｉ様受容体」またはＲＬＲと呼ばれるこれらのＰＲＲには、ＲＩＧ－ＩおよびＭＤＡ５が含まれる。これらのＰＲＲは、５’トリホスフェートおよびジホスフェート、ＲＮＡ複製中間体、および／または転写産物などのＲＮＡの構造特徴を検出し、Ｉ型インターフェロン応答の活性化を開始するヘリカーゼである。１、２ＰＲＲの第３のクラスは、細胞質ＤＮＡによって誘起され、主な細胞内ＤＮＡセンサーは、ｃＧＡＳ（環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ）であり、これはＤＮＡに結合し、インターフェロン遺伝子のＥＲ結合刺激因子（ＳＴＩＮＧ）を活性化し、Ｉ型インターフェロン応答の活性化、場合によっては、黒色腫で欠損（ＡＩＭ２）、ＩＦＮ－γ誘導性タンパク質１６（ＩＦＩ１６）、インターフェロン誘導性タンパク質Ｘ（ＩＦＩＸ）、ＬＲＲＦＩＰ１、ＤＨＸ９、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ４１、Ｋｕ７０、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＭＲＮ複合体（ＭＲＥ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１を含む）２、７およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ１０を含む他の提唱された細胞質ＤＮＡセンサー１、４、５の活性化をもたらす。ＡＩＭ２、ＩＦＩ１６、およびＩＦＩＸはピリンドメインおよびＨＩＮ２００ドメインタンパク質（ＰＹＨＩＮ）タンパク質である。２、６さらに、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）に由来する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のステムループ構造のように、短い塩基対のＤＮＡ区間に隣接する不対のＤＮＡヌクレオチドが、配列依存的な様式でＩ型インターフェロン誘導ＤＮＡセンサーｃＧＡＳを活性化したことが示された８、９。短い（１２～２０ｂｐ）ｄｓＤＮＡ（Ｙ型ＤＮＡ）に隣接する不対グアノシンを含むＤＮＡ構造は、非常に刺激性であり、ｃＧＡＳの酵素活性を特異的に増強した８、９。
最近では、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）を含む他の細胞内微生物センサーが同定されている。一部のＮＬＲは、非微生物の危険シグナルも感知し、インフラマソームと呼ばれる大きな細胞質タンパク質複合体を形成し、インフラマソームは、自然免疫および炎症の中心的な調節因子である（Ｍａｒｔｉｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９ ２７：２２９－６５）。
インフラマソームは、ＮＬＲまたはＡＩＭ２ファミリー受容体およびプロカスパーゼ－１で構成されている。カスパーゼ動員ドメイン（ＡＳＣ）を含むアポトーシス関連斑点様タンパク質はアダプタータンパク質であり、ＮＬＲファミリーのメンバーをプロカスパーゼ１に結び付ける。ＮＬＲファミリーのメンバーは、インフラマソーム複合体をＡＳＣと組み立て、次に、カスパーゼ１が動員され、活性化される。ＮＬＲファミリータンパク質のいくつかのメンバーは、ＮＬＲファミリーピリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３、クリオピリンまたはＮＡＬＰ３としても知られる）、ＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有４（ＮＬＲＣ４、ＩＰＡＦとしても知られる）およびＮＬＲＰ１など、異なるインフラマソームの形成に関与している。様々な刺激によって異なるインフラマソームが活性化される。例えば、ＮＬＲＰ１はＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓによって産生される致死毒素によって活性化される一方、ＮＬＲＣ４はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌種に感染した細胞では細胞質フラジェリンに応答する。ＮＬＲＰ３インフラマソームは、尿酸結晶、シリカ、アミロイド線維、およびＡＴＰなどの微生物産物および内因性シグナルを含む多種多様な刺激によって活性化される。
ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）センサー成分（すなわち、クリオピリン（ＮＬＲＰ３またはＮＡＬＰ３））は、組織損傷またはストレス（例えば、細胞外ＡＴＰ、尿酸結晶、β－アミロイド、細胞片）中に放出される損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）および病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）などの危険シグナルを認識する。インフラマソームは、これらの病原体感染または「危険」シグナルに応答して組み立てられ、クリオピリンのピリンドメインおよびアダプター成分ＡＳＣの相互作用を必要とし、（プロカスパーゼ－１から）カスパーゼ－１の動員および活性化、続いて、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、ＩＬ－１８、およびＩＬ－３３を含むいくつかの炎症誘発性サイトカインの成熟および放出につながる）。
ＮＬＲに加えて、ＡＩＭ２ファミリーメンバーはインフラマソームを活性化し得る。ＡＩＭ２は、ピリンドメインおよびＤＮＡ結合ＨＩＮドメインの存在を特徴とし、細胞質ＤＮＡを検出することによってカスパーゼ－１を活性化する（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ－Ａｌｎｅｍｒｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｎａｔｕｒｅ ４５８：５０９－５１３）．インフラマソームの組み立てには、第２のシグナルがインフラマソーム複合体形成を開始する前に、インフラマソーム受容体および基質プロＩＬ－１βの発現を上方調節するために必要なＴＬＲを介した先行のプライミングシグナルが必要である。（Ｂａｕｅｒｎｆｅｉｎｄ ＦＧ，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：７８７－７９１）。
概念的には明解だが、ヒト疾患を治療するための遺伝子療法に核酸分子を使用する見通しは依然として不確かである。この不確実性の主な原因は、核酸治療薬に対する宿主の自然免疫応答に関する明らかな有害事象であり、したがって、これらの材料が免疫応答の状況で目的とする標的の発現を調節する方法である。臨床応用に採用され得る核酸分子の作製、機能、挙動および最適化を取り巻く技術の現況は、特に次の点に焦点を当てている。（１）翻訳および遺伝子発現を直接調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび二本鎖ＲＮＡ、（２）長期的なエピジェネティック修飾をもたらす転写型遺伝子サイレンシングＲＮＡ、（３）遺伝子スプライシングパターンと相互作用して改変するアンチセンスオリゴヌクレオチド、（４）天然のＡＡＶまたはレンチウイルスゲノムの生理学的機能を模倣する合成ベクターまたはウイルスベクターの作製、ならびに（５）治療用オリゴヌクレオチドのインビボ送達。しかしながら、最近の臨床成果から明らかなように核酸治療薬の開発が進歩しているにもかかわらず、遺伝子療法の分野は、治療用核酸自体によって誘起されるレシピエントの望ましくない有害事象によって依然厳しく制限されている。
したがって、多種多様な疾患を治療するために、細胞、組織または対象における治療用タンパク質の発現を可能にするベクターまたは核酸を対象に投与する際に免疫応答を阻害（例えば、低減、改善、軽減、予防）する新しい技術の分野が必要である。
Ｍａｒｔｉｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９ ２７：２２９－６５ Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ－Ａｌｎｅｍｒｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｎａｔｕｒｅ ４５８：５０９－５１３ Ｂａｕｅｒｎｆｅｉｎｄ ＦＧ，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：７８７－７９１
本開示は、遺伝障害に罹患し、遺伝子療法または核酸療法（「核酸治療薬」または「治療用核酸」（ＴＮＡ））を受ける対象において免疫応答を阻害（すなわち、低減または抑制）するための方法および医薬組成物を提供する。本明細書で提供されるのは、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）および免疫応答（例えば、自然免疫応答）を阻害するための阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物および製剤は、ラパマイシンおよびそのラパマイシン類似体、ＴＬＲアンタゴニスト（例えば、ＴＬＲ９アンタゴニスト）、ｃＧＡＳアンタゴニストおよびインフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）などの１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を含み得る。
いくつかの態様によれば、本開示は、共有結合性閉端を有するカプシド不含（例えば、非ウイルス性）ＤＮＡベクター（本明細書では「閉端ＤＮＡベクター」または「ｃｅＤＮＡベクター」と呼ばれる）から自然免疫応答の阻害剤を発現させるため、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）を使用して、免疫応答（例えば、自然免疫応答）を阻害（すなわち、低減または抑制）するための組成物および方法を提供し、ｃｅＤＮＡベクターは、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の核酸配列またはそのコドン最適化版を含む。
いくつかの態様によれば、本開示は、共有結合性閉端を有するカプシド不含（例えば、非ウイルス性）ＤＮＡベクター（本明細書では「閉端ＤＮＡベクター」または「ｃｅＤＮＡベクター」と呼ばれる）からラパマイシンおよびそのラパマイシン類似体を発現させるため、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）を使用して、免疫応答（例えば、自然免疫応答）を阻害（すなわち、低減または抑制）するための組成物および方法を提供し、ｃｅＤＮＡベクターは、ラパマイシンおよびそのラパマイシン類似体の核酸配列またはそのコドン最適化版を含む。したがって、これらのｃｅＤＮＡベクターを使用して、免疫系（例えば、自然免疫系）を阻害するために、ラパマイシンおよびそのラパマイシン類似体を産生することができる。
いくつかの態様によれば、本開示は、共有結合性閉端を有するカプシド不含（例えば、非ウイルス性）ＤＮＡベクター（本明細書では「閉端ＤＮＡベクター」または「ｃｅＤＮＡベクター」と呼ばれる）からＴＬＲアンタゴニストを発現させるため、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）を使用して、免疫応答（例えば、自然免疫応答）を阻害（すなわち、低減または抑制）するための組成物および方法を提供し、ｃｅＤＮＡベクターは、ＴＬＲアンタゴニストの核酸配列またはそのコドン最適化版を含む。したがって、これらのｃｅＤＮＡベクターを使用して、免疫系（例えば、自然免疫系）を阻害するために、ＴＬＲアンタゴニストを産生することができる。
いくつかの態様によれば、本開示は、共有結合性閉端を有するカプシド不含（例えば、非ウイルス性）ＤＮＡベクター（本明細書では「閉端ＤＮＡベクター」または「ｃｅＤＮＡベクター」と呼ばれる）からｃＧＡＳアンタゴニストを発現させるため、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）を使用して、免疫応答（例えば、自然免疫応答）を阻害（すなわち、低減または抑制）するための組成物および方法を提供し、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃＧＡＳアンタゴニストの核酸配列またはそのコドン最適化版を含む。したがって、これらのｃｅＤＮＡベクターを使用して、免疫系（例えば、自然免疫系）を阻害するために、ｃＧＡＳアンタゴニストを産生することができる。
いくつかの態様によれば、本開示は、共有結合性閉端を有するカプシド不含（例えば、非ウイルス性）ＤＮＡベクター（本明細書では「閉端ＤＮＡベクター」または「ｃｅＤＮＡベクター」と呼ばれる）からＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、ＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせを発現させるために、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）を使用して、免疫応答（例えば、自然免疫応答）を阻害（すなわち、低減または抑制）するための組成物および方法を提供し、ｃｅＤＮＡベクターは、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせの核酸配列またはそのコドン最適化版を含む。したがって、免疫系（例えば、自然免疫系）を阻害するために、これらのｃｅＤＮＡベクターを使用して、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせを産生し得る。
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物および製剤は、本明細書に記載されるように、様々な種類の治療用核酸（ＴＮＡ）および担体（例えば、脂質ナノ粒子）と併用して、１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を含み得る。いくつかの実施形態によれば、組成物は賦形剤または担体をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。一実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰはポリエチレングリクロール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰはコレステロールを含む。
本明細書に記載の方法は、一般に、導入遺伝子（例えば、治療用核酸（ＴＮＡ））の投与に伴う免疫応答を予防、低減、弱毒化、またはさらに排除する１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤（例えば、ラパマイシンおよびその類似体、ＴＬＲアンタゴニスト、ｃＧＡＳアンタゴニスト）の使用を含む。上記を投与することを含む方法は、本明細書に記載されている。
一実施形態では、治療用核酸はＲＮＡ分子またはその誘導体である。一実施形態では、ＲＮＡ分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンスＲＮＡである。一実施形態では、ＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。
一実施形態では、治療用核酸はｍＲＮＡ分子である。
一実施形態では、治療用核酸は、ＤＮＡ分子またはその誘導体である。
一実施形態では、治療用核酸はＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドはモルホリノ系核酸である。一実施形態では、モルホリノ系核酸は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。
一実施形態では、治療用核酸は、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）である。一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、プロモーター配列および導入遺伝子を含む発現カセットを含む。一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、ポリアデニル化配列を含む発現カセットを含む。一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、発現カセットの５’または３’末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。一実施形態では、発現カセットは、２つのＩＴＲに隣接し、２つのＩＴＲは、１つの５’ＩＴＲおよび１つの３’ＩＴＲを含む。一実施形態では、発現カセットは、３’末端でＩＴＲ（３’ＩＴＲ）に連結される。一実施形態では、発現カセットは、５’末端でＩＴＲ（５’ＩＴＲ）に連結される。一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、５’ＩＴＲと発現カセットとの間にスペーサー配列をさらに含む。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、３’ＩＴＲと発現カセットとの間にスペーサー配列をさらに含む。一実施形態では、スペーサー配列は、長さが少なくとも５塩基対である。一実施形態では、スペーサー配列は、長さが５～２００塩基対である。一実施形態では、スペーサー配列は、長さが５～５００塩基対である。
一実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲである。一実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２からなる群から選択される。一実施形態では、ＩＴＲはガチョウウイルスのＩＴＲに由来する。一実施形態では、ＩＴＲは、Ｂ１９ウイルスＩＴＲに由来する。一実施形態では、ＩＴＲはパルボウイルス由来の野生型ＩＴＲである。一実施形態では、ＩＴＲは変異ＩＴＲである。一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、発現カセットの５’および３’の両末端に２つの変異ＩＴＲを含む。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡはニックまたはギャップを有する。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡは無細胞環境で合成的に産生される。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡは細胞内で産生される。一実施形態では、ｃｅＤＮＡは昆虫細胞で産生される。一実施形態では、昆虫細胞はＳｆ９である。一実施形態では、ｃｅＤＮＡは哺乳動物細胞で産生される。一実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞株である。
一実施形態では、治療用核酸は、発現カセットの５’および３’末端に少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列を含む閉端ＤＮＡである。
一実施形態では、治療用核酸は、発現カセットの５’および３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡである。
一実施形態では、治療用核酸は、ＤＮＡ系のミニサークルまたはＭＩＤＧＥである。
一実施形態では、治療用核酸は、直鎖状共有結合性閉端ＤＮＡベクターである。一実施形態では、直鎖状共有結合性閉端ＤＮＡベクターはミニストリングＤＮＡである。
一実施形態では、治療用核酸は、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡである。
一実施形態では、治療用核酸はミニ遺伝子である。
一実施形態では、治療用核酸はプラスミドである。
したがって、本明細書では、いくつかの態様では、細胞内で導入遺伝子を発現する場合の免疫応答を阻害または抑制する方法を提供し、本方法は、（１）共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）を含む組成物および（２）本明細書に記載の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を細胞に同時投与することを含む。ｃｅＤＮＡでは、ｃｅＤＮＡベクターの単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドが存在するように、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの異なるＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ＩＴＲの一方は、機能的ＡＡＶ末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、ＩＴＲの一方は、他方のＩＴＲと比べて欠失、挿入、または置換を含む。本明細書に示されるように、いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、ＷＯ２０１６／０７３７９９に記載されている合成ナノ担体を使用して同時投与され、公開内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターはナノ担体にも存在する。いくつかの実施形態によれば、１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、ラパマイシンおよびそのラパマイシン類似体、ＴＬＲアンタゴニスト（例えば、ＴＬＲ９アンタゴニスト）、ｃＧＡＳアンタゴニストおよびインフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）から選択される。いくつかの実施形態によれば、ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドは、ＩＴＲの少なくとも１つに存在する。いくつかの実施形態によれば、ｃＧＡＳの阻害剤は、ｃｅＤＮＡによってコードされ、誘導性プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結される。他の実施形態では、ｃＧＡＳの阻害剤はｃｅＤＮＡによってコードされない。
さらに、本明細書では、一態様では、（ｉ）共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）（ｃｅＤＮＡベクターは、２つの異なるＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ＩＴＲの一方は、機能的ＡＡＶ末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、ＩＴＲの一方は、他方のＩＴＲと比べて欠失、挿入、または置換を含み、ｃｅＤＮＡでは、ｃｅＤＮＡベクターの単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドが存在する）、ならびに（ｉｉ）免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を含む組成物が提供される。本明細書に示されるように、いくつかの実施形態では、組成物の成分は、別個の合成ナノ担体で製剤化される。一実施形態では、組成物の成分は、同じ合成ナノ担体で製剤化される。いくつかの実施形態によれば、１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、ラパマイシンおよびそのラパマイシン類似体、ＴＬＲアンタゴニスト（例えば、ＴＬＲ９アンタゴニスト）、ｃＧＡＳアンタゴニストおよびインフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）から選択される。
本明細書に記載の非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターは、許容宿主細胞において発現構築物（例えば、プラスミド、バクミド、バキュロウイルス、または組み込み細胞株）から産生することができる。例えば、２０１８年９月７日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号に開示された実施例を参照、または合成生成を使用して、例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号に開示された例を参照。各文献は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物において有用なｃｅＤＮＡベクターは、異種核酸、例えば２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられる導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）と比較して欠失、挿入、および／または置換によって修飾され、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能性末端分解部位（ＴＲＳ）およびＲｅｐ結合部位を含む。
別の態様によれば、本開示は、対象における遺伝障害を治療する方法を特徴とし、本方法は、本明細書に開示される医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。
図２の模式図に記載のプロセスにおけるｃｅＤＮＡベクターの産生に有用なバキュロ感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスの一実施形態を示す模式図である。ｉ）ナイーブ昆虫細胞の２つの集団に、Ｒｅｐタンパク質プラスミドまたはＤＮＡベクター産生プラスミドをトランスフェクションする。ｉｉ）ウイルス上清を採取し、昆虫細胞の２つの新しいナイーブ集団に感染させて、ＤＮＡベクター構築物のＢＩＩＣＳ－１およびＢＩＩＣＳ－２（ＲＥＰ）を生成するために使用する。ＢＩＩＣＳは、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞を指す。必要に応じて、ステップｉｉ）を１回以上繰り返して、より大量の組み換えバキュロウイルスを産生することができる。 本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターの産生の一実施形態を示す模式図である。 本明細書に記載のＤＮＡベクターの特性評価の一実施形態を示す模式図である（下流プロセス）。 本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの作製に有用な例示的なプラスミドおよびプラスミド構成要素を示す模式図である。図４Ａは、例示的なＲｅｐプラスミドを示し、図４Ｂは、ｃｅＤＮＡベクターテンプレートを含む例示的なプラスミドＴＴＸベクタープラスミドを示す。図４Ｃおよび図４Ｄは、本明細書で提供されるｃｅＤＮＡベクターを作製するのに有用なＤＮＡベクターテンプレートの例示的な機能的構成要素の模式図である。関心対象の核酸（例えば、ルシフェラーゼなどのレポーター核酸、または例えば、治療用核酸）とも呼ばれる導入遺伝子は、２つの異なるＩＴＲの間に位置付けられている。修飾型ＩＴＲは、テンプレート内で左側（図４Ｃ）または右側（図４Ｄ）のいずれかに配向することができる。さらに、関心対象の核酸は、プロモーター、エンハンサー、および終結要素に作動可能に連結することができる。代替的な実施形態では、左側（５’ＩＴＲ）または右側（３’ＩＴＲ）のＩＴＲは、任意のタイプであり得る。例示目的で、図４Ｃおよび図４Ｄならびに本明細書の実施例におけるｃｅＤＮＡ構築物のＩＴＲは、修飾型ＩＴＲ（ΔＩＴＲ）およびＷＴ ＩＴＲ（ＩＴＲ）を示し、非対称ＩＴＲ対の一例である。しかしながら、本明細書では、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた異種核酸配列（例えば、導入遺伝子）を含むｃｅＤＮＡベクターが包含され、これらの用語が本明細書に定義されるように、ＩＴＲ配列は、非対称ＩＴＲ対または対称もしくは実質的に対称のＩＴＲ対であり得る。本明細書に開示されるようなＮＬＰを含むｃｅＤＮＡベクターは、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含み得、本開示の方法は、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系をさらに含み得る。 同上。 同上。 同上。 本明細書に記載のＤＮＡベクターの存在を同定するための一実施形態を示す図である。図５Ａは、非連続構造を有するＤＮＡ（非閉鎖ＤＮＡ、例えば、開端を有するテンプレートＴＴＸベクターから単離された対照カセットＤＮＡ）および非連続ＤＮＡに単一の認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断された場合に産生される例示的な特徴的バンドを示し、例えば、変性条件下で予想される異なるサイズ（例えば、１ｋｂおよび２ｋｂ）の２つのＤＮＡ断片が観察される。図５Ｂは、閉端直鎖状連続構造を有するＤＮＡ、および直鎖状二重鎖連続ＤＮＡ上に単一の認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断された場合に産生される例示的な特徴的バンドを示し、例えば、変性条件下で異なるサイズ（例えば、２ｋｂおよび４ｋｂ）の２つのＤＮＡ断片が観察され、これはＤＮＡが非連続的である場合に予想されるよりも２倍多い。ＤＮＡは変性しているが、相補鎖は共有結合しており、結果として生じる変性産物は、対応する非連続産物の２倍の長さの一本鎖ＤＮＡである。 同上。 非変性ゲルの一例であり、安定性の高いＤＮＡベクターおよび特徴的なバンドの存在を示しており、安定性の高い閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡベクター）の存在を確認している。 本明細書に開示されるプロセスによって産生されたＤＮＡ材料を評価するためのゲルおよび定量化標準曲線である。 様々な構築物を含有するＨＥＫ２９３細胞から発現したＦＩＸタンパク質のウェスタンブロット分析であり、Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ抗体を使用して可視化されている。 実施例２４の結果のグラフ表示を提供する。流体力学的に投与された試料は、３日間の研究期間にわたって、非流体力学的に投与された試料と比較して、総流束（例えば、ルシフェラーゼ発現）の有意な上昇を示している。 ｃｅＤＮＡベクターおよび免疫阻害剤で処理した細胞におけるインターフェロン応答を評価する実施例に記載のＴＨＰ－１培養細胞実験からのデータを提供する。図１０Ａは、未処置のｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧおよびＴＬＲ９経路とともに、ＴＨＰ－１細胞でｃｅＤＮＡに応答するインターフェロン経路の活性化を示しているが、いずれかの経路が損なわれている同じ細胞では活性化されていない。これとは別に、阻害剤Ａ１５１またはＢＸ７９５のいずれかを含めると、このインターフェロン経路の活性化が同様に低減する。図１０Ｂは、Ａ１５１およびＡＳ１４１１によるインターフェロン誘導阻害の用量依存性を示す同様の実験である。バーの各分類では、２．５μＭ用量が左側にあり、１．２５μＭ用量が中央にあり、０．６２５μＭ用量が右側にある。 同上。 実施例２６で得られたデータのグラフを提供する。図１１Ａは、細胞への投与前にｃｅＤＮＡに存在するＣｐＧをメチル化した場合の、ｃｅＤＮＡ投与によるＮＦ－κＢ誘導の低減を示す。図１１Ｂはさらに、免疫阻害剤Ａ１５１の包含が、このアッセイにおいて、ＣｐＧのメチル化と同程度に、ｃｅＤＮＡ刺激性ＮＦ－κＢ誘導を低減させたことを示している。 同上。 実施例２６に記載される実験の結果を提供する。図１２Ａおよび図１２Ｂは、ｃｅＤＮＡベクター処置マウスまたはＬＮＰ－ポリＣ対照処置マウスから採取した血液試料に対して実施したサイトカイン誘導アッセイのそれぞれからのデータのグラフであり、特定のサイトカインが調査され、各グラフの上部に反映されている。図１２Ｃは、処置されたマウスにおけるｃｅＤＮＡ駆動ルシフェラーゼ発現アッセイからのデータを提供し、研究期間中のマウスの各群における総流束を示す。高レベルの非メチル化ＣｐＧは、マウスで観察された総流束の低下と相関していた。 同上。 同上。 新生仔８日目のマウスでの実施例２７に記載の実験から得られた総流束データを提供する。研究過程で、ｃｅＤＮＡ－高ＣｐＧはアッセイの過程で流束が減少した一方、低メチル化または非メチル化ＣｐＧを含むｃｅＤＮＡはルシフェラーゼ発現を維持した。ＣｐＧが最小化された試料またはＣｐＧが存在しない試料では、単回再投与により、観察された発現レベルが適度に増加したが、高ＣｐＧ試料群では、再投与によるこの持続的増加は観察されなかった。 実施例２８に記載の実験結果を提供する。図１４Ａおよび図１４Ｂは、変異型ＳＴＩＮＧ遺伝的バックグラウンドを有するｃｅＤＮＡベクター処置マウスまたはポリＣ対照処置試料から採取した血液試料に対して実施したサイトカイン誘導アッセイのそれぞれからのデータのグラフであり、特定のサイトカインが調査され、各グラフの上部に反映されている。ＩＬ－１８を除いて、低メチル化および非メチル化ＣｐＧ ｃｅＤＮＡの状況では、サイトカインの有意に少ない誘導が観察された。図１４Ｃは、処置された変異型ＳＴＩＮＧマウスにおけるｃｅＤＮＡ駆動ルシフェラーゼ発現アッセイからのデータを提供し、研究期間にわたるマウスの各群における総流束を示す。研究結果は、ｃｅＤＮＡの高レベルの非メチル化ＣｐＧと観察された低い総流束との間に相関関係があることを再び示した。 同上。 同上。 本明細書に開示される非常に安定なＤＮＡベクターからのＰａｄｕａ ＦＩＸおよびＦＩＸ導入遺伝子の発現を示す。プラスミドまたはベクターから発現したＦＩＸタンパク質レベルの定量分析も、製造元が提供するプロトコルに従って、ＶｉｓｕＬｉｚｅ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、＃ＦＩＸ－ＡＧ）を使用して評価された。 同上。 実施例１０に記載されるＲａｇ２マウスにおけるｃｅＤＮＡの持続および再投薬研究の結果を示す。図１６Ａは、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ－Ｌｕｃで処置した野生型ｃ５７ｂｌ／６マウスまたはＲａｇ２マウスで観察された経時的な全流束のグラフを示す。図１６Ｂは、Ｒａｇ２マウスにおけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現レベルに対する再用量の影響を示すグラフを提供し、結果として、再用量後に観察される安定した発現の増加をもたらす（矢印は、再用量投与の時間を示す）。 同上。 実施例２９に記載される処置されたマウスにおけるｃｅＤＮＡルシフェラーゼ発現研究からのデータを提供し、研究の期間にわたる各群のマウスにおける全流束を示す。高レベルの非メチル化ＣｐＧは、経時的にマウスで観察される全流束の低下と相関したが、肝臓特異的プロモーターの使用は、少なくとも７７日間にわたって、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の耐久性のある安定した発現と相関した。 ＮＬＲＰ３阻害剤（ＭＣＣ９５０）またはカスパーゼ１阻害剤（ＶＸ７６５）による薬理学的マクロファージ枯渇を伴うｃｅＤＮＡベクター投与後のサイトカインレベルを示した。図１８ＡはＩＦＮ－αレベルを示し、図１８ＢはＩＦＮ－γレベルを示し、ＮＬＲＰ３阻害剤ＭＣＣ９５０によるＩＦＮ－γの有意な低減を示し（矢印を参照）、図１８ＣはＩＬ－βレベルを示し、図１８ＤはＩＬ－１８レベルを示し、ＮＬＲＰ３阻害剤ＭＣＣ９５０によるＩＦＮ－γの有意な低減を示し（矢印を参照）、図１８ＥはＩＬ－６レベルを示し、図１８ＦはＩＰ－１０レベルを示し、図１８ＧはＭＣＰ－１レベルを示し、図１８ＨはＴＮＦαレベルを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
核酸伝達ベクターおよび治療剤は、遺伝子発現およびその調節など、様々な用途に有望な治療薬である。ウイルス伝達ベクターは、タンパク質または核酸をコードする導入遺伝子を含み得る。その例には、ＡＡＶベクター、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびメッセンジャーＲＮＡ（小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）など）の変異部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。残念ながら、これらの治療法の展望はまだ実現されておらず、その大部分は、ウイルス伝達ベクターに対する細胞性および体液性免疫応答に起因する。これらの免疫応答には、抗体、Ｂ細胞およびＴ細胞の応答が含まれ、多くの場合、ウイルスカプシドまたはその被覆タンパク質またはペプチドなどのウイルス導入ベクターのウイルス抗原に特異的である。
現在、多くの潜在的な患者は、ウイルス伝達ベクターの基礎となっているウイルスに対して、ある程度のレベルの既存の免疫を保有している。実際、ウイルスの核酸（ＤＮＡとＲＮＡの両方）またはタンパク質に対する抗体は、ヒト集団で非常に普及している。さらに、例えばウイルス導入ベクターの免疫原性が低いために既存の免疫のレベルが低い場合でも、そのような低いレベルが依然として形質導入の成功を妨げる可能性がある（例えば、Ｊｅｕｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４：５９－６７（２０１３））。したがって、既存の免疫のレベルが低くても、患者の特定のウイルス伝達ベクターの使用を妨げる可能性があり、臨床医は、それほど効果的ではない可能性のある異なる血清型のウイルスに基づいたウイルス伝達ベクターを選択する必要があるか、または、別のウイルス伝達ベクター療法が利用できない場合は、別の種類の療法を完全に免除することさえある。
さらに、アデノ随伴ベクターなどのウイルスベクターは、免疫原性が高く、特に再投与に関して有効性を損なう可能性のある体液性免疫および細胞性免疫を誘発し得る。実際、ウイルス伝達ベクターに対する細胞性および体液性免疫応答は、ウイルス伝達ベクターの単回投与後に発生する可能性がある。ウイルス伝達ベクターの投与後、中和抗体価は数年間増加して高いままであり、ウイルス伝達ベクターの再投与の有効性を低減する可能性がある。実際、ウイルス伝達ベクターを反復投与すると、一般に、望ましくない免疫応答が強化される。さらに、ウイルス導入ベクターに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が生じ、例えば、ウイルス抗原様ウイルス核酸またはカプシドタンパク質への再曝露時に、所望の導入遺伝子産物を発現する形質導入細胞を排除することができる。例えば、ＡＡＶ核酸またはカプシド抗原は、ＡＡＶウイルス導入ベクターで形質導入された肝細胞の免疫介在性破壊を誘起できることが示されている。多くの治療用途では、長期的な利益のために、ウイルス伝達ベクターの投与を複数回行う必要があると考えられている。しかしながら、特に再投与が必要な場合、本明細書で提供される方法および組成物がなければ、そうする能力は著しく制限されるだろう。
ウイルスまたは非ウイルス（合成）伝達ベクター、および治療用の他の核酸治療薬を含む、様々な核酸治療薬の効果的な使用に対する前述の障壁への解決策を提供する方法および組成物が提供される。本開示は、標的細胞、組織、器官または生物への外因性ＤＮＡ配列の送達、ならびにそれらに対する免疫応答（例えば、自然免疫応答）を阻害（すなわち、低減または抑制）するための修飾および方法に関する。免疫応答（例えば、自然免疫応答）を阻害（すなわち、低減または抑制）するためのそのような修飾および方法は、例えば、導入遺伝子発現の持続時間を増強するために使用することができる。
ＤＮＡ伝達ベクターに対する免疫応答（例えば、自然免疫応答）は、本明細書で提供される方法および関連する組成物を用いて弱毒化できることが予期せず発見された。したがって、本方法および組成物は、ウイルス伝達ベクターおよび他の治療用核酸分子による治療の有効性を潜在的に高め、ウイルス伝達ベクターまたは他の核酸治療薬の投与が繰り返された場合でも、長期的な治療効果を提供することができる。
Ｉ．定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関して使用される科学的および技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．，２０１１（ＩＳＢＮ９７８－０－９１１９１０－１９－３）、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２０１３），Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９９－２０１２（ＩＳＢＮ９７８３５２７６００９０８）、およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ１－５６０８１－５６９－８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ‘ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０１４（ＩＳＢＮ－１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ１９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出すことができ、これらの内容はすべて、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「投与」、「投与する」という用語およびその変形は、組成物または薬剤（例えば、本明細書に記載の治療用核酸または免疫抑制剤）を対象に導入することを指し、１つ以上の組成物または薬剤の同時導入および連続導入を含む。「投与」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、プラセボ、および実験方法を指し得る。「投与」には、インビトロおよびエクスビボ治療も含まれる。組成物または薬剤の対象への導入は、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、直腸、リンパ管内、腫瘍内、または局所を含む任意の好適な経路による。組成物または薬剤の対象への導入は、エレクトロポレーションによる。投与には、自己管理および他者による投与が含まれる。投与は、任意の好適な経路で実施することができる。好適な投与経路は、組成物または薬剤がその意図された機能を遂行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈に導入することによって投与される。
本明細書で使用される場合、「核酸治療薬」、「治療用核酸」および「ＴＮＡ」という句は交換可能に使用され、疾患または障害を治療するための治療剤の活性成分として核酸を使用する治療の任意のモダリティを指す。本明細書で使用される場合、これらの句は、ＲＮＡベースの治療剤およびＤＮＡベースの治療剤を指す。ＲＮＡ系治療薬の非限定的な例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ＤＮＡ系治療薬の非限定的な例としては、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶゲノム）もしくは非ウイルス合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡベクター、最小限度に免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、またはダンベル型ＤＮＡミニマルベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、活性剤または治療剤、例えば、免疫抑制剤および／または治療用核酸などの治療剤の「有効量」または「治療有効量」とは、治療用核酸および／または免疫抑制剤の不在下で検出された発現レベルと比較して、所望の効果、例えば、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の正常化または低減および標的配列の発現または発現阻害を生じるのに十分な量である。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するための好適なアッセイとしては、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能および当業者に既知の表現型アッセイなどの、当業者に既知の技術を使用するタンパク質またはＲＮＡレベルの検査が挙げられる。しかしながら、投与量レベルは、傷害のタイプ、年齢、体重、性別、患者の病状、病状の重症度、投与経路、用いられる特定の活性剤など、様々な要因に基づく。したがって、投与計画は大きく異なる可能性があるが、標準的な方法を使用して医師が常套的に決定することができる。さらに、「治療量」、「治療有効量」および「薬学的有効量」という用語は、記載された本発明の組成物の予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）量または予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）量を含む。記載された本発明の予防的適用または予防的適用において、医薬組成物または薬剤は、疾患、障害または病態に罹患しやすい患者、あるいはそのリスクがある患者に、リスクを排除または低減し、重症度を低減し、疾患、障害または病態の発症を遅らせるのに十分な量で投与され、疾患、障害または病態としては、疾患、障害または病態の生化学的、組織学的および／または行動症状、その合併症、ならびに疾患、障害または病態の発症中に現れる中間の病理学的表現型が挙げられる。いくつかの医学的判断によれば、最大用量、すなわち最高の安全用量を使用することが一般的に好ましい。「用量」および「投与量」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、治療の結果を指し、その結果は、望ましくかつ有益であると判断される。治療効果としては、直接的または間接的に、疾患症状の阻止、低減、または排除を挙げることができる。治療効果としてはまた、直接的または間接的に、疾患症状の進行の阻止、低減、または排除を挙げることができる。
本明細書に記載される任意の治療剤について、治療有効量は、予備的なインビトロ研究および／または動物モデルから最初に決定することができる。治療有効用量はまた、ヒトのデータから決定することができる。適用される用量は、投与される化合物の相対的な生物学的利用能および効力に基づいて調整することができる。上記の方法および他の周知の方法に基づいて最大の効力を達成するように用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（２００１）の第１章に見出され得る治療有効性を決定するための一般原則を以下に要約する。
薬物動態学的原理は、許容できない副作用を最小限に抑えながら、望ましい程度の治療効果を得るために投与計画を変更するための基礎を提供する。薬物の血漿濃度を測定でき、治療濃度域に関連している状況では、投与量の変更に関する追加のガイダンスを入手することができる。
本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」および「導入遺伝子」という用語は、交換可能に使用され、本明細書で開示されるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、それによって送達および発現され得る、関心対象の（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外の）核酸を指す。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」および「転写カセット」という用語は、交換可能に使用され、導入遺伝子の転写を配向するのに十分な１つ以上のプロモーターまたは他の調節配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含むが、カプシドをコードする配列、他のベクター配列、または逆位末端反復領域を含まない核酸の直鎖状ストレッチを指す。発現カセットは、追加として、１つ以上のシス作用性配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー）、１つ以上のイントロン、および１つ以上の転写後調節要素を含んでもよい。
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然、化学的修飾もしくは生化学的修飾、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、この開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離するか、または当該技術分野で既知である方法によって化学的に合成することができる。「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能であるように、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖、事前に凝縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらのグループの誘導体および組み合わせの形態であり得る。ＤＮＡは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤまたはｃｅＤＮＡ）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル型ＤＮＡ、ミニマル免疫学的定義遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター、または非ウイルスベクターの形態であり得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、およびそれらの組み合わせの形態であり得る。核酸としては、既知のヌクレオチド類似体または修飾型骨格残基もしくは連結を含む核酸が挙げられ、これらは、合成、天然に存在する、および天然に存在しないものであり、参照核酸と同様の結合特性を有する。そのような類似体および／または修飾残基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（モルホリノ）、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、限定されない。別途限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別途明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾型変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、相同分子腫、ＳＮＰ、および相補的配列、ならびに明示的に示された配列を暗黙的に包含する。
「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、およびリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を介してともに連結している。
「塩基」には、プリンおよびピリミジンが含まれ、プリンおよびピリミジンは、天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類似体、ならびにプリンおよびピリミジンの合成誘導体がさらに含まれ、該誘導体には、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、およびアルキルハライドなどであるがこれらに限定されない新しい反応基を配置する修飾が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「干渉ＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」という用語は、一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ、ｓｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、ｓｓＤＮＡｉオリゴヌクレオチド）、二本鎖ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、またはプレｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０７８９４１号を参照）、または干渉ＲＮＡが標的の遺伝子もしくは配列と同じ細胞に存在する場合、（例えば、分解を媒介するか、または干渉ＲＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって）標的の遺伝子もしくは配列の発現を低減もしくは阻害することができるＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／１０４１９９号を参照）を含む。したがって、干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列に相補的な一本鎖ＲＮＡ、または２つの相補鎖または単一の自己相補鎖によって形成される二本鎖ＲＮＡを指す。干渉ＲＮＡは、標的の遺伝子または配列に対して実質的なもしくは完全な同一性を有し得るか、またはミスマッチの領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含み得る。干渉ＲＮＡの配列は、全長の標的遺伝子またはその部分配列に対応し得る。好ましくは、干渉ＲＮＡ分子は化学合成される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
干渉ＲＮＡには、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」、例えば、長さ約１５～６０、１５～５０、または１５～４０（二重鎖）ヌクレオチド、より典型的には長さ約１５～３０、１５～２５、または１９～２５（二重鎖）ヌクレオチドの干渉ＲＮＡを含み、好ましくは長さ約２０～２４、２１～２２、または２１～２３（二重鎖）ヌクレオチドである（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、長さ１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、または１９～２５ヌクレオチドであり、好ましくは長さ約２０～２４、２１～２２、または２１～２３ヌクレオチドであり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、長さ約１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、または１９～２５塩基対であり、好ましくは長さ約１８～２２、１９～２０、または１９～２１塩基対である）。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１～約４ヌクレオチドまたは約２～約３ヌクレオチドの３’オーバーハングおよび５’ホスフェート末端を含み得る。ｓｉＲＮＡの例には、２つの別個の鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子（一方の鎖はセンス鎖であり、他方は相補的アンチセンス鎖である）、一本鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子（センスおよびアンチセンス領域が核酸系または非核酸系のリンカーによって連結される）、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子、ならびに２つ以上のループ構造および自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチド分子（環状ポリヌクレオチドはインビボまたはインビトロでプロセシングされ、活性な二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を生成し得る）が含まれるが、限定されない。本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ－ＲＮＡ二本鎖およびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０７８９４１号を参照）。
本明細書で使用される「核酸構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、またはそうでなければ天然に存在しないような様式で核酸のセグメントを含むように修飾されるか、または合成である、一本鎖または二本鎖の核酸分子を指す。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本開示のコード配列の発現に必要な制御配列を含む場合、「発現カセット」という用語と同義である。「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。
「ハイブリダイズ可能」または「相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ）が、非共有結合する、すなわち、ワトソン・クリック塩基対および／またはＧ／Ｕ塩基対を形成する、温度および溶液イオン強度の適切なインビトロおよび／またはインビボ条件下で配列特異的、逆平行な様式で別の核酸に「アニール」または「ハイブリダイズ」する（すなわち、核酸は、相補的核酸に特異的に結合する）のを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当該技術分野で既知であるように、標準的なワトソン・クリック塩基対合には、チミジン（Ｔ）とのアデニン（Ａ）対合、ウラシル（Ｕ）とのアデニン（Ａ）対合、およびシトシン（Ｃ）とのグアニン（Ｇ）対合が含まれる。さらに、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションのために、グアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）と対合することも当該技術分野で既知である。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡ中のコドンとのｔＲＮＡアンチコドン塩基対合の状況で、遺伝暗号の縮重（すなわち、冗長性）を部分的に担っている。この開示の文脈において、対象のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に相補的であるとみなされ、逆もまた同様である。したがって、対象のＤＮＡ標的ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置でＧ／Ｕ塩基対を作製できる場合、その位置は、非相補的であるとみなされないが、代わりに相補的であるとみなされる。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。
特定のインフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）を「コードする」ＤＮＡ配列は、特定のＲＮＡおよび／またはタンパク質に転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードし得るか、またはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはＤＮＡ標的ＲＮＡ、「非コード」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードし得る。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質からのタンパク質ドメインを含むポリペプチドを指す。例えば、融合タンパク質は、（ｉ）インフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）またはその断片、および（ｉｉ）少なくとも１つの非対象遺伝子（ＧＯＩ）タンパク質、または別のインフラマソームアンタゴニストタンパク質を含み得る。本明細書に包含される融合タンパク質には、インフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）、例えば、受容体の細胞外ドメイン、リガンド、酵素またはペプチドと融合した抗体、または抗体のＦｃもしくは抗原結合断片が含まれるが、これらに限定されない。融合タンパク質の一部であるインフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）またはその断片は、単一特異性抗体または二重特異性または多重特異性の抗体であり得る。
本明細書で使用される場合、「ゲノムセーフハーバー遺伝子」または「セーフハーバー遺伝子」という用語は、内因性遺伝子活性に重大な悪影響を及ぼすことなく、または癌を促進することなく、配列が予測可能な様式で統合および機能し得る（例えば、関心対象のタンパク質を発現する）ように、核酸配列を挿入することができる遺伝子または遺伝子座を指す。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子はまた、挿入された核酸配列が非セーフハーバー部位よりも効率的かつ高レベルで発現され得る遺伝子座または遺伝子である。
本明細書で使用される場合、「遺伝子送達」という用語は、外来ＤＮＡが遺伝子療法の適用のために宿主細胞に導入されるプロセスを意味する。
本明細書で使用される場合、「末端反復」または「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、および回文ヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端配列または合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「ＲＢＳ」）（ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合要素）とも称される）および末端分解部位（「ＴＲＳ」）は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳおよび少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補体であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」または「ＩＴＲ］と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、およびプロウイルスレスキューを媒介する。本明細書で本発明において予想外に見出されたように、全長にわたって逆相補体でないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を遂行することができ、したがって、ＩＴＲという用語は、本明細書において、ｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介することができるｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター中のＴＲを指すように使用される。複合ｃｅＤＮＡベクター構成中、３つ以上のＩＴＲまたは非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ ＩＴＲであり得るか、またはＡＡＶ ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ ＩＴＲに由来し得る。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルスおよびディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ－１９）を包含するパルボウイルス科に由来し得るか、またはＳＶ４０複製起点として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によってさらに修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。パルボウイルス科ウイルスは、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）および無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）の２つの亜科で構成されている。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、ヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルス科を含む。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
「野生型ＩＴＲ」または「ＷＴ－ＩＴＲ」は、例えば、Ｒｅｐ結合活性およびＲｅｐニッキング能力を保持する、ＡＡＶまたは他のディペンドウイルスにおける天然ＩＴＲ配列の配列を指す。任意のＡＡＶ血清型からのＷＴ－ＩＴＲのヌクレオチド配列は、遺伝コードの縮重または遺伝的浮動により、天然に存在するカノニカル配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるＷＴ－ＩＴＲ配列は、産生プロセス中に発生する天然の変化（例えば、複製エラー）の結果としてＷＴ－ＩＴＲ配列を含む。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ」または「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ対」という用語は、それらの全長にわたって逆相補配列を有する両野生型ＩＴＲである単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＷＴ－ＩＴＲの対を指す。例えば、変化が配列の特性および全体的な３次元構造に影響を及ぼさない限り、天然に存在するカノニカル配列から逸脱する１つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ＩＴＲが野生型の配列であるとみなすことができる。いくつかの態様では、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、カノニカル配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（例えば、デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のＷＴ－ＩＴＲに対して対称な３次元空間構成を有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、３次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、およびＢ－Ｂ’ループを有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、適切なＲｅｐタンパク質と対合する操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥまたはＲＢＥ’）および末端分解部位（ＴＲＳ）を有することを決定することによって、ＷＴとして機能的に確認することができる。任意選択的に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。
本明細書で使用される場合、「修飾型ＩＴＲ」または「ｍｏｄ－ＩＴＲ」または「変異ＩＴＲ」の語句は、本明細書で交換可能に使用され、同じ血清型からのＷＴ－ＩＴＲと比較して、少なくとも１つ以上のヌクレオチドに変異を有するＩＴＲを指す。変異は、同じ血清型のＷＴ－ＩＴＲの３次元空間構成と比較して、ＩＴＲのＡ、Ｃ、Ｃ’、Ｂ、Ｂ’領域のうちの１つ以上の変化をもたらし、３次元空間構成（すなわち、幾何学的空間におけるその３次元構造）の変化をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ対」とも呼ばれる「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆相補体ではない単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。非限定的な一例として、非対称ＩＴＲ対は、それらの３次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ＩＴＲに対して対称の３次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のＩＴＲ対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、３次元空間でのそれらのＡ、Ｃ－Ｃ’、およびＢ－Ｂ’ループの構成が異なる（例えば、同族ＩＴＲと比較して、１つのＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アームおよび／または短いＢ－Ｂ’アームを有し得る）。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、１つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、または点変異に起因し得る。一実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列であり得、他方のＩＴＲは、本明細書で定義される修飾型ＩＴＲ（例えば、非野生型または合成ＩＴＲ配列）であり得る。別の実施形態では、非対称ＩＴＲ対のどちらのＩＴＲも野生型ＡＡＶ配列ではなく、２つのＩＴＲは、幾何学的空間において異なる形状（すなわち、異なる全体的な幾何学的構造）を有する修飾型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のｍｏｄ－ＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アームを有することができ、他方のＩＴＲは、それらが同族の非対称ｍｏｄ－ＩＴＲと比較して、異なる３次元空間構成を有するように異なる修飾（例えば、単一アーム、または短いＢ－Ｂ’アーム等）を有し得る。
本明細書で使用される場合、「対称ＩＴＲ」という用語は、野生型ディペンドウイルスＩＴＲ配列に対して変異または修飾され、それらの全長にわたって逆相補である単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の一対のＩＴＲを指す。どちらのＩＴＲも野生型ＩＴＲ ＡＡＶ２配列ではなく（すなわち、それらは修飾型ＩＴＲであり、変異ＩＴＲとも呼ばれる）、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、または点変異により、野生型ＩＴＲとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称の修飾型ＩＴＲ」または「実質的に対称のｍｏｄ－ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の修飾型ＩＴＲの対を指す。例えば、修飾型ＩＴＲは、変化が特性および全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆相補配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称とみなすことができる。非限定的な一例として、配列は、カノニカル配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ＩＴＲに対して対称な３次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、３次元空間に構成された同じＡ、Ｃ－Ｃ’、およびＢ－Ｂ’ループを有する。いくつかの実施形態では、ｍｏｄ－ＩＴＲ対からのＩＴＲは、異なる逆相補ヌクレオチド配列を有し得るが、依然として同じ対称な３次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ全体的な３次元形状をもたらす変異を有する。例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ対の１つのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、１つの血清型に由来し得、他方のＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、異なる血清型に由来し得るが、両方が同じ対応する変異を有し得（例えば、５’ＩＴＲがＣ領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型３’ＩＴＲは、Ｃ’領域の対応する位置に欠失を有する）、それにより修飾型ＩＴＲ対が同じ対称な３次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ＩＴＲ対の各ＩＴＲは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６の組み合わせなどの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２）に由来し得、１つのＩＴＲの修飾は、異なる血清型の同族のＩＴＲの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、ＩＴＲ間のヌクレオチド配列の相違が特性または全体的な形状に影響を与えず、それらが３次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）を指す。非限定的な例として、ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）またはデフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなどの当該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、カノニカルｍｏｄ－ＩＴＲに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称な３次元空間構成を有する。実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対は、３次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’およびＢ－Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡおよびＢ－Ｂ’ループの同様の３次元構造を有する。
「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指す。一般に、配列ＡＢＣでは、Ｂの両側にＡおよびＣが隣接している。配置ＡｘＢｘＣについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前または後に続くが、隣接される配列と連続している、またはすぐ隣である必要はない。一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状二重鎖ｃｅＤＮＡベクターの各末端の末端反復を指す。本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、および／または「治療」という用語は、病態の進行を抑止する、実質的に阻害する、遅らせる、もしくは逆転させる、病態の臨床症状を実質的に改善する、または病態の臨床症状の出現を実質的に防止する、有益なもしくは所望の臨床結果を得ることを含む。さらに、治療することは、（ａ）障害の重症度を軽減すること、（ｂ）治療中の障害（複数可）に特徴的な症状の発症を制限すること、（ｃ）治療中の障害（複数可）に特徴的な症状の悪化を制限すること、（ｄ）以前に障害（複数可）を有していた患者における障害（複数可）の再発を制限すること、および（ｅ）以前は障害（複数可）に関して無症候性であった患者の症状の再発を制限することのうちの１つ以上を達成することを指す。薬理学的および／または生理学的効果などの有益なまたは所望の臨床結果としては、疾患、障害または病態の素因を有する可能性があるが、当該障害の症状をまだ経験していない、もしくは呈していない対象において疾患、障害または病態が発生するのを防ぐこと（予防的治療）、疾患、障害または病態の症状を緩和させること、疾患、障害または病態の程度を減少させること、疾患、障害または病態を安定化させる（すなわち、悪化させない）こと、疾患、障害または病態の蔓延を防止すること、疾患、障害または病態の進行を遅らせるまたは遅くすること、疾患、障害または病態の改善または軽減させること、およびそれらの組み合わせ、ならびに治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「増加する」、「増強する」、「上昇させる」という用語（および同様の用語）は、一般に、天然、予測もしくは平均に対して、または対照条件に対して、直接的または間接的に、濃度、レベル、機能、活性、または挙動を増加させる作用を指す。
本明細書で使用される場合、「抑制する」、「減少する」、「妨害する」、「阻害する」および／または「低減する」という用語（ならびに同様の用語）は、一般に、天然、予想もしくは平均に対して、または対照条件に対して、直接的または間接的に、濃度、レベル、機能、活性、または挙動を低減する行為を指す。免疫抑制剤による免疫応答（例えば、免疫応答（例えば、自然免疫応答））が「低下」、「低下すること」、「低減」、または「低減すること」とは、所与の免疫抑制剤に対する検出可能な免疫応答の減少を意味することを意図する。免疫抑制剤による免疫応答の低下量は、免疫抑制剤の存在下における免疫応答のレベルと比較して決定され得る。検出可能な低下は、免疫抑制剤の存在下で検出された免疫応答よりも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％以下であり得る。
本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含むがこれらに限定されない有機化合物群を指し、水に不溶であるが、多くの有機溶媒に可溶であることを特徴とする。脂質は通常、少なくとも３つのクラスに分類される。（１）脂肪および油ならびにワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」、（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。
本明細書で使用される場合、「脂質粒子」という用語は、核酸治療薬および／または免疫抑制剤などの治療剤を関心対象の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するために使用され得る脂質製剤を含む。好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は核酸含有脂質粒子であり、これは典型的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および任意選択的に粒子の凝集を防止する複合脂質から形成される。他の好ましい実施形態では、治療用核酸などの治療剤を粒子の脂質部分にカプセル化し、それにより酵素分解から保護することができる。他の好ましい実施形態では、免疫抑制剤は、脂質粒子を含む核酸に任意選択的に含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「脂質でカプセル化する」という用語は、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）などの活性剤または治療剤を、完全カプセル化、部分カプセル化、またはその両方で提供する脂質粒子を指し得る。好ましい実施形態では、核酸は脂質粒子内に完全にカプセル化される（例えば、核酸を含有する脂質粒子を形成するため）。
本明細書で使用される「脂質複合体」という用語は、脂質粒子の凝集を阻害する複合脂質を指す。そのような脂質複合体には、例えば、ジアルキルオキシプロピルと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体）、ジアシルグリセロールと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧ複合体）、コレステロールと共役したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンと共役したＰＥＧ、およびセラミドと共役したＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照）などのＰＥＧ－脂質複合体、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質複合体（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡ複合体、例えば、２０１０年１月１３日出願の米国仮出願第６１／２９４，８２８号、および２０１０年１月１４日出願の米国仮出願第６１／２９５，１４０号を参照）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質複合体）、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ＰＯＺ－脂質複合体の追加例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質に直接結合するか、リンカー部分を介して脂質に結合することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧまたはＰＯＺを脂質に結合するのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、アミドまたはカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
リン脂質の代表的な例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ－アシルオキシ酸など、リンを欠く他の化合物も両親媒性脂質と呼ばれる群に含まれる。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含む他の脂質と混合することができる。
本明細書で使用される場合、「中性脂質」という用語は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種のいずれかを指す。生理学的ｐＨでは、そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、およびジアシルグリセロールが含まれる。
本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質、および任意の他の中性脂質またはアニオン性脂質を指す。
本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで負に荷電するあらゆる脂質を指す。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、および中性脂質と結合した他のアニオン性修飾基が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「疎水性脂質」という用語は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式基で任意に置換された基を含むがこれらに限定されない無極性基を有する化合物を指す。適切な例には、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ－Ｎ－ジアルキルアミノ、１，２－ジアシルオキシ－３－アミノプロパン、および１，２－ジアルキル－３－アミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「水溶液」という用語は、全体または一部に水を含む組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「有機脂質溶液」という用語は、全体または一部に脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「全身送達」という用語は、生物内での干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの活性剤の広範な生体内分布をもたらす脂質粒子の送達を指す。投与技術によっては、特定の薬剤の全身送達にいたることもあれば、そうでないものもある。全身送達とは、有用な量、好ましくは治療量の薬剤が身体のほとんどの部分にさらされることを意味する。広範な生体内分布を得るには、一般に、薬剤が、投与部位より遠位の疾患部位に到達する前に（初回通過器官（肝臓、肺など）によって、または急速な非特異的細胞結合によって）急速に分解または排出されないような血液寿命が必要である。脂質粒子の全身送達は、例えば静脈内、皮下、および腹腔内を含む、当技術分野で既知の任意の手段によることができる。好ましい実施形態では、脂質粒子の全身送達は静脈内送達による。
本明細書で使用される場合、「局所送達」という用語は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの活性剤の、生物内の標的部位への直接の送達を指す。例えば、薬剤は、腫瘍などの疾患部位、または炎症部位などの他の標的部位、または肝臓、心臓、膵臓、腎臓などの標的器官への直接注射によって局所的に送達することができる。
本明細書で使用される場合、「末端反復」または「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、および回文ヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端配列または合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「ＲＢＳ」）（ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合要素）とも称される）および末端分解部位（「ＴＲＳ」）は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳおよび少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補体であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」または「ＩＴＲ］と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、およびプロウイルスレスキューを媒介する。本明細書で本発明において予想外に見出されたように、全長にわたって逆相補体でないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を遂行することができ、したがって、ＩＴＲという用語は、本明細書において、ｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介することができるｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター中のＴＲを指すように使用される。複合ｃｅＤＮＡベクター構成中、３つ以上のＩＴＲまたは非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ ＩＴＲであり得るか、またはＡＡＶ ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ ＩＴＲに由来し得る。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルスおよびディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ－１９）を包含するパルボウイルス科に由来し得るか、またはＳＶ４０複製起点として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によってさらに修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。パルボウイルス科ウイルスは、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）および無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）の２つの亜科で構成されている。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、ヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーを含む。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
「野生型ＩＴＲ」または「ＷＴ－ＩＴＲ」は、例えば、Ｒｅｐ結合活性およびＲｅｐニッキング能力を保持する、ＡＡＶまたは他のディペンドウイルスにおける天然ＩＴＲ配列の配列を指す。任意のＡＡＶ血清型からのＷＴ－ＩＴＲのヌクレオチド配列は、遺伝コードの縮重または遺伝的浮動により、天然に存在するカノニカル配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるＷＴ－ＩＴＲ配列は、産生プロセス中に発生する天然の変化（例えば、複製エラー）の結果としてＷＴ－ＩＴＲ配列を含む。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ」または「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ対」という用語は、それらの全長にわたって逆相補配列を有する両野生型ＩＴＲである単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＷＴ－ＩＴＲの対を指す。例えば、変化が配列の特性および全体的な３次元構造に影響を及ぼさない限り、天然に存在するカノニカル配列から逸脱する１つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ＩＴＲが野生型の配列であるとみなすことができる。いくつかの態様では、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、カノニカル配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（例えば、デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のＷＴ－ＩＴＲに対して対称な３次元空間構成を有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、３次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、およびＢ－Ｂ’ループを有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、適切なＲｅｐタンパク質と対合する操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥまたはＲＢＥ’）および末端分解部位（ＴＲＳ）を有することを決定することによって、ＷＴとして機能的に確認することができる。任意選択的に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。
本明細書で使用される場合、「修飾型ＩＴＲ」または「ｍｏｄ－ＩＴＲ」または「変異ＩＴＲ」の語句は、本明細書で交換可能に使用され、同じ血清型からのＷＴ－ＩＴＲと比較して、少なくとも１つ以上のヌクレオチドに変異を有するＩＴＲを指す。変異は、同じ血清型のＷＴ－ＩＴＲの３次元空間構成と比較して、ＩＴＲのＡ、Ｃ、Ｃ’、Ｂ、Ｂ’領域のうちの１つ以上の変化をもたらし、３次元空間構成（すなわち、幾何学的空間におけるその３次元構造）の変化をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ対」とも呼ばれる「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆相補体ではない単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。非限定的な一例として、非対称ＩＴＲ対は、それらの３次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ＩＴＲに対して対称の３次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のＩＴＲ対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、３次元空間でのそれらのＡ、Ｃ－Ｃ’、およびＢ－Ｂ’ループの構成が異なる（例えば、同族ＩＴＲと比較して、１つのＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アームおよび／または短いＢ－Ｂ’アームを有し得る）。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、１つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、または点変異に起因し得る。一実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列であり得、他方のＩＴＲは、本明細書で定義される修飾型ＩＴＲ（例えば、非野生型または合成ＩＴＲ配列）であり得る。別の実施形態では、非対称ＩＴＲ対のどちらのＩＴＲも野生型ＡＡＶ配列ではなく、２つのＩＴＲは、幾何学的空間において異なる形状（すなわち、異なる全体的な幾何学的構造）を有する修飾型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のｍｏｄ－ＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アームを有することができ、他方のＩＴＲは、それらが同族の非対称ｍｏｄ－ＩＴＲと比較して、異なる３次元空間構成を有するように異なる修飾（例えば、単一アーム、または短いＢ－Ｂ’アーム等）を有し得る。
本明細書で使用される場合、「対称ＩＴＲ」という用語は、野生型または変異型（例えば、野生型に対して修飾された）ディペンドウイルスＩＴＲ配列であり、かつそれらの全長にわたって逆相補である、単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の一対のＩＴＲを指す。非限定的な一例において、両ＩＴＲは、ＡＡＶ２からの野生型ＩＴＲ配列である。別の例では、いずれのＩＴＲも野生型ＩＴＲ ＡＡＶ２配列ではなく（すなわち、修飾型ＩＴＲであり、変異ＩＴＲとも称される）、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、または点変異により、野生型ＩＴＲとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称の修飾型ＩＴＲ」または「実質的に対称のｍｏｄ－ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の修飾型ＩＴＲの対を指す。例えば、修飾型ＩＴＲは、変化が特性および全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆相補配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称とみなすことができる。非限定的な一例として、配列は、カノニカル配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ＩＴＲに対して対称な３次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、３次元空間に構成された同じＡ、Ｃ－Ｃ’、およびＢ－Ｂ’ループを有する。いくつかの実施形態では、ｍｏｄ－ＩＴＲ対からのＩＴＲは、異なる逆相補ヌクレオチド配列を有し得るが、依然として同じ対称な３次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ全体的な３次元形状をもたらす変異を有する。例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ対の１つのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、１つの血清型に由来し得、他方のＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、異なる血清型に由来し得るが、両方が同じ対応する変異を有し得（例えば、５’ＩＴＲがＣ領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型３’ＩＴＲは、Ｃ’領域の対応する位置に欠失を有する）、それにより修飾型ＩＴＲ対が同じ対称な３次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ＩＴＲ対の各ＩＴＲは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６の組み合わせなどの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２）に由来し得、１つのＩＴＲの修飾は、異なる血清型の同族のＩＴＲの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、ＩＴＲ間のヌクレオチド配列の相違が特性または全体的な形状に影響を与えず、それらが３次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）を指す。非限定的な例として、ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）またはデフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなどの当該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、カノニカルｍｏｄ－ＩＴＲに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称な３次元空間構成を有する。実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対は、３次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’およびＢ－Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡおよびＢ－Ｂ’ループの同様の３次元構造を有する。
「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指す。一般に、配列ＡＢＣでは、Ｂの両側にＡおよびＣが隣接している。配置ＡｘＢｘＣについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前または後に続くが、隣接される配列と連続している、またはすぐ隣である必要はない。一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状二重鎖ｃｅＤＮＡベクターの各末端における末端反復を指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域をさらに組み込む発現カセットを指す。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミドまたはウイルスゲノムに組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡスペーサー領域」という用語は、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡゲノム中の機能的要素を分離する介在配列を指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、最適機能性のため所望の距離で２つの機能要素を保持する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、例えば、プラスミドまたはバキュロウイルス内のｃｅＤＮＡゲノムの遺伝的安定性を提供する、または増大させる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、クローニング部位などに便利な位置を提供することによって、ｃｅＤＮＡゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」、または既知のタンパク質（例えば、転写因子）結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をｃｅＤＮＡゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、末端分解部位と、上流転写調節要素との間に６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒなどを挿入する。同様に、スペーサーを、ポリアデニル化シグナル配列と３’末端分解部位との間に組み込むことができる。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」という用語は、分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして操作し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス感染昆虫細胞」および「ｃｅＤＮＡ－ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指す。
本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」という用語は、少なくとも１つの共有結合性閉端を有し、ベクターの少なくとも一部が分子内二重鎖構造を有する、カプシド不含ＤＮＡベクターを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ」という用語は、合成またはその他の非ウイルス遺伝子導入のためのカプシド不含閉端直鎖状二本鎖（ｄｓ）二重鎖ＤＮＡを指す。ｃｅＤＮＡの詳細な説明は、２０１７年３月３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２０８２８の国際出願に記載されており、その全容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。細胞ベースの方法を使用して様々な逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および構成を含むｃｅＤＮＡベクターの産生のためのある特定の方法は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号および２０１８年１２月６日に出願された同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の実施例１に記載されており、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。様々なＩＴＲ配列および構成を含む合成ｃｅＤＮＡベクターの産生のためのある特定の方法は、例えば、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／１４１２２号に記載されており、その全容は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡベクター」および「ｃｅＤＮＡ」という用語は、交換可能に使用され、少なくとも１つの末端パリンドロームを含む閉端ＤＮＡベクターを指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの共有結合性閉端を含む。
本明細書で使用される場合、「ｎｅＤＮＡ」または「ニックの入ったｃｅＤＮＡ」という用語は、オープンリーディングフレーム（例えば、発現されるプロモーターおよび導入遺伝子）の５’上流のステム領域またはスペーサー領域に１～１００塩基対のニックまたはギャップを有する閉端ＤＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、「ギャップ」および「ニック」という用語は交換可能に使用され、本発明の合成ＤＮＡベクターの中断された部分を指し、その他の二本鎖ｃｅＤＮＡには一本鎖ＤＮＡ部分のストレッチが作成される。ギャップは、二重鎖ＤＮＡの一本鎖の長さが１塩基対～１００塩基対の長さであり得る。本明細書に記載される方法によって設計および作成された典型的なギャップ、ならびに該方法によって生成された合成ベクターは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ｂｐの長さであり得る。本開示における例示的なギャップは、１ｂｐ～１０ｂｐの長さ、１～２０ｂｐの長さ、１～３０ｂｐの長さであり得る。
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」、「Ｒｅｐ結合要素」、「ＲＢＥ」、および「ＲＢＳ」は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８またはＡＡＶ Ｒｅｐ６８）の結合部位を指し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実施することを可能にする。ＲＢＳ配列およびその逆相補体は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２で同定されたＲＢＳ配列である５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号３９）を含む。任意の既知のＲＢＳ配列は、他の既知のＡＡＶ ＲＢＳ配列および他の天然に既知のまたは合成ＲＢＳ配列を含む、本発明の実施形態において使用され得る。理論に束縛されるものではないが、Ｒｅｐタンパク質のヌクレアーゼドメインは、二重鎖ヌクレオチド配列ＧＣＴＣに結合し、したがって２つの既知のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、二重鎖オリゴヌクレオチド、５’－（ＧＣＧＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）－３’（配列番号３９）に直接結合し、安定に組み立てられると考えられる。さらに、可溶性凝集配座異性体（すなわち、不定数の相互関連Ｒｅｐタンパク質）は解離し、Ｒｅｐ結合部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合する。各Ｒｅｐタンパク質は、各鎖上の窒素塩基およびホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は、配列特異性を提供するが、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非配列特異性または低配列特異性であり、タンパク質－ＤＮＡ複合体を安定させる。
本明細書で使用される場合、「末端分解部位」および「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ ｐｏｌデルタまたはＤＮＡ ｐｏｌイプシロンを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン－ホスホジエステル結合を形成する領域を指す。代替的に、Ｒｅｐ－チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、最小限で非塩基対チミジンを包含する。いくつかの実施形態では、ＴＲＳのニッキング効率は、ＲＢＳからの同じ分子内のその距離によって少なくとも部分的に制御され得る。アクセプター基質が相補的ＩＴＲであるとき、得られる産物は、分子間二重鎖である。ＴＲＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において同定されたヘキサヌクレオチド配列である５’－ＧＧＴＴＧＡ－３’（配列番号８０４）を含む。他の既知のＡＡＶ ＴＲＳ配列、ＡＧＴＴ（配列番号０８５）、ＧＧＴＴＧＧ（配列番号８０６）、ＡＧＴＴＧＧ（配列番号８０７）、ＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０８）などの他の天然の既知ＴＲＳ配列または合成ＴＲＳ配列、およびＲＲＴＴＲＲ（配列番号８０９）などの他のモチーフを含む、任意の既知のＴＲＳ配列を、本発明の実施形態で使用することができる。
本明細書で使用される場合、「センス」および「アンチセンス」という用語は、ポリヌクレオチド上の構造要素の配向を指す。要素のセンスバージョンおよびアンチセンスバージョンは、互いの逆相補体である。
本明細書で使用される場合、「合成ＡＡＶベクター」および「ＡＡＶベクターの合成産生」という用語は、完全に無細胞環境でのＡＡＶベクターおよびその合成産生方法を指す。
本明細書で使用される場合、「レポーター」は、検出可能な読み出しを提供するために使用することができるタンパク質を指す。レポーターは、一般に、蛍光、色、または発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞または生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定波長の光で励起されたときに細胞を蛍光させ、ルシフェラーゼは、細胞に光を産生する反応を触媒させ、β－ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産物に変換する。実験または診断目的のために有用な例示的なレポーターポリペプチドとしては、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および他の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ならびに当該技術分野において周知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」という用語は、例えば、レポーターポリペプチドとして、あるいはより適切には、細胞を殺傷するポリペプチド、例えば毒素、または選択された薬剤もしくはその欠失で細胞を殺傷しやすくする薬剤として、検出可能な読み出しを提供するポリペプチドを指す。エフェクタータンパク質は、宿主細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを直接標的または損傷する任意のタンパク質またはペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質としては、宿主細胞ＤＮＡ配列を標的とする制限エンドヌクレアーゼ（ゲノム因子であるか染色体外因子であるかにかかわらず）、細胞生存に必要なポリペプチドを標的とするプロテアーゼ、ＤＮＡギラーゼ阻害剤、およびリボヌクレアーゼ型毒素が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成生物的回路によって制御されるエフェクタータンパク質の発現は、別の合成生物的回路における因子として関与し得、それによって生物的回路系の反応性の範囲および複雑性を拡張する。
転写調節因子は、関心対象の遺伝子、例えば、インフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の１つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤）の転写を活性化または抑制する、転写アクチベーターおよびリプレッサーを指す。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸の領域である。転写アクチベーターは、典型的に、転写プロモーターの近くに結合し、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を直接開始する。リプレッサーは、転写プロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨害する。他の転写調節因子は、それらが結合する場所、ならびに細胞条件および環境条件に応じて、アクチベーターまたはリプレッサーのいずれかとして役立ち得る。転写調節因子クラスの非限定例としては、ホメオドメインタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、翼状らせん（フォークヘッド）タンパク質、およびロイシン－ジッパータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「リプレッサータンパク質」または「誘導因子タンパク質」は、調節配列要素に結合するタンパク質であり、調節配列要素に作動可能に連結した配列の転写をそれぞれ抑制または活性化する。本明細書に記載される好ましいリプレッサーおよび誘導因子タンパク質は、少なくとも１つの入力剤または環境入力の存在または不在に敏感である。本明細書に記載される好ましいタンパク質は、例えば、分離可能なＤＮＡ結合および入力剤結合、または反応性要素もしくはドメインを含む形態のモジュールである。
本明細書で使用される場合、「担体」としては、ありとあらゆる溶媒、分散媒質、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが挙げられる。医薬活性物質に対するそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されたときに、毒性反応、アレルギー性反応、または同様の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「入力剤反応性ドメイン」は、条件または入力剤に結合するか、またはそうでなければ連結ＤＮＡ結合融合ドメインをその条件もしくは入力の存在に対して反応性にするように、条件または入力剤に反応する転写因子のドメインである。一実施形態では、条件または入力の存在は、入力剤反応性ドメインまたはそれが融合するタンパク質の立体構造変化をもたらし、それが転写因子の転写調節活性を修飾する。
「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中または生物内で起こるアッセイまたはプロセスを指す。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法または使用は、細菌などの単細胞生物が使用されるときに「インビボ」で起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物または植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞および細胞株を含む）、形質転換細胞株、および抽出組織または細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実施される方法および使用を指す。「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイおよび方法を指し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞または細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、タンパク質またはＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指す。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る、遺伝子要素を含有し得る。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーター自体の発現を調節する転写因子の発現を駆動することができる。プロモーター配列内では、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合され、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むように上流（５’配向）に伸びる。
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、１つ以上のタンパク質（例えば、活性因子タンパク質または転写因子）に結合して、核酸配列の転写活性化を増加させるシス作用性調節配列（例えば、５０～１，５００塩基対）を指す。エンハンサーは、それらが調節する遺伝子開始部位の上流または遺伝子開始部位の下流で最大１，０００，０００塩基対に位置付けられ得る。エンハンサーは、非関連遺伝子のイントロン領域内またはエクソン領域内に位置付けられ得る。
プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、または転写を駆動すると言うことができる。「作動可能に連結された」、「作動可能に位置付けられた」、「作動可能に連結された）、「制御下」、および「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置および／または配向にあり、その配列の転写開始および／または発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節する。さらに、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。
プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子または配列と天然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、いくつかの実施形態では、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。
いくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組み換えプロモーター」または「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方が、その自然環境において作動可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。組み換えまたは異種エンハンサーは、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス性、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しない合成プロモーターまたはエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なる要素、および／または当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を改変する変異を含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路およびモジュールに関して、ＰＣＲを含む組み換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたく、各々は参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ミトコンドリア、クロロプラストなどの非核性細胞小器官内の配列の転写および／または発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。
本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子または誘導剤の存在下、それによって影響されるとき、またはそれによって接触されるときに、転写活性を開始または増強することによって特徴付けられるものである。本明細書に定義される場合、「誘導因子」または「誘導剤」は、内因性であり得るか、または誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方式で投与される、通常は外因性の化合物またはタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、誘導因子または誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、またはタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写または発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の構成要素またはモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が誘導性プロモーターの制御下であり得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサーなどのある特定の薬剤の不在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、およびマウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ））、ならびに他のステロイド反応性プロモーター、ラパマイシン反応性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で交換可能に使用される「ＤＮＡ調節配列」、「制御要素」、および「調節要素」という用語は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写および翻訳制御配列を指し、これらは非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）またはコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチドもしくはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供および／もしくは調節し、かつ／またはコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。
「作動可能に連結された」という語句は、そのように記載された構成要素が、それらが意図された様式で機能することを許可する関係にある並列を指す。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。「発現カセット」は、ｃｅＤＮＡベクターにおける導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモーターまたは他の調節配列に作動可能に連結されている異種ＤＮＡ配列を含む。好適なプロモーターには、例えば、組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、ＡＡＶ起源でもあり得る。
本明細書で使用される「対象」という用語は、本発明によるｃｅＤＮＡベクターでの予防的治療を含む治療が提供される、ヒトまたは動物を指す。通常、動物は、限定されないが、霊長類、げっ歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。飼育動物および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚、例えば、トラウト、ナマズ、およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類またはヒトである。対象は、男性または女性であり得る。追加として、対象は、幼児または子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児または胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患および障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。さらに、本明細書に記載される方法および組成物は、飼育動物および／またはペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、または民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、ラテンアメリカ系、中東系などであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者または他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、既に治療を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、胚、胎児、新生児、幼児、子供、青年、または成人である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胎児、ヒト新生児、ヒト幼児、ヒト子供、ヒト青年、またはヒト成人である。いくつかの実施形態では、対象は、動物胚、または非ヒト胚もしくは非ヒト霊長類胚である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胚である。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸構築物またはｃｅＤＮＡ発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けやすい任意の細胞型を含む。非限定的な例として、宿主細胞は、単離された初代細胞、多能性幹細胞、ＣＤ３４＋細胞）、人工多能性幹細胞、またはいくつかの不死化細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）のいずれかであり得る。代替的に、宿主細胞は、組織、器官、または生物における原位置またはインビボの細胞であり得る。
「外因性」という用語は、その天然源以外の細胞中に存在する物質を指す。本明細書で使用される「外因性」という用語は、通常見られず、核酸またはポリペプチドをそのような細胞または生物に導入することが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）またはポリペプチドを指し得る。代替的に、「外因性」とは、それが比較的少量で見られ、細胞または生物における核酸またはポリペプチドの量を増加させること、例えば、異所性発現またはレベルをもたらすことが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸またはポリペプチドを指し得る。これとは対照的に、「内因性」という用語は、生物系または細胞に対して天然である物質を指す。
「配列同一性」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の関連性を指す。本開示の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，上記）、好ましくはバージョン３．０．０以降において実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，上記）を使用して決定される。使用される任意のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたＮｅｅｄｌｅの出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得される）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／アラインメントの長さ－アラインメントにおけるギャップの総数）。アラインメントの長さは、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。
本明細書で使用される「相同性」または「相同」という用語は、必要に応じて配列を整列させ、ギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、標的染色体上の対応する配列のヌクレオチド残基と同一であるヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。ヌクレオチド配列相同性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当該技術分野の範囲内である様々な方式で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。いくつかの実施形態では、例えば相同性アームの核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）は、配列が、宿主細胞の対応する未変性または未編集の核酸配列（例えば、ゲノム配列）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上同一である場合、「相同」とみなされる。
本明細書で使用される「異種」という用語は、それぞれ天然の核酸またはタンパク質には見られないヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列（またはその変異体）に（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。異種核酸配列は、変異体ポリペプチドに（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、融合変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成し得る。
「ベクター」または「発現ベクター」は、細胞において結合されたセグメントの複製をもたらすために別のＤＮＡセグメント、すなわち「挿入」が結合され得る、プラスミド、バクミド、ファージ、ウイルス、ビリオン、またはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、宿主細胞への送達のために、または異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物であり得る。本明細書で使用される場合、ベクターは、起源および／または最終形態でウイルス性または非ウイルス性であり得るが、本開示の目的のために、「ベクター」は、その用語が本明細書で使用されるとき、一般にｃｅＤＮＡベクターを指す。「ベクター」という用語は、適切な制御要素と関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝的要素を包含する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたは組み換えベクターであり得る。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡまたはポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現される配列は、必ずしもそうではないが、細胞にとって異種であることが多い。発現ベクターは、追加の要素を含むことができ、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるため、それを２つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、ならびにクローニングおよび増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。「発現」という用語は、ＲＮＡおよびタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写プロセシング、翻訳およびタンパク質の折りたたみ、修飾およびプロセシングを含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドが含まれる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に作動可能に連結された場合に、インビトロまたはインビボでＲＮＡに転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子には、コード領域の前後の領域、例えば、５’未翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる場合と含まれない場合がある。
「組み換えベクター」とは、異種核酸配列を含むベクター、またはインビボで発現することができる「導入遺伝子」を意味する。本明細書に記載されるベクターは、いくつかの実施形態では、他の好適な組成物および療法と組み合わせることができることを理解されたい。いくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、対象における関心対象のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡに維持し、それによって染色体組み込みの潜在的な影響を排除する手段を提供する。
本明細書で使用される「遺伝性疾患」という語句は、ゲノムの１つ以上の異常、特に出生時から存在する状態によって部分的または完全に、直接的または間接的に引き起こされる疾患を指す。異常は、変異、挿入、または欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を与える可能性がある。遺伝性疾患は、ＤＭＤ、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性疾患、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコーニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、およびテイ・サックス病であり得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「阻害ポリヌクレオチド」は、第２の（標的）ポリヌクレオチドの発現（転写または翻訳）を低減または防止するＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。阻害ポリヌクレオチドには、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、および外部ガイド配列が含まれる。「阻害ポリヌクレオチド」という用語はさらに、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子、例えばリボザイムをコードするＤＮＡ分子などの実際の阻害種をコードするＲＮＡｉを含む。
本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ分子、例えばｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの活性に関する「遺伝子サイレンシング」または「遺伝子サイレンシングされた」とは、細胞における標的遺伝子（例えばＮＬＲＰ３、ＡＩＭ２またはカスパーゼ－１ｍＲＮＡ）のｍＲＮＡレベルにおいて、ｍｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉分子が存在しない細胞で見られるｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％の低下を指す。好ましい一実施形態では、ｍＲＮＡレベルは、少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％低下する。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ」という用語は、ｓｉＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、内因性マイクロＲＮＡ、および人工マイクロＲＮＡを含むがこれらに限定されない、あらゆるタイプの干渉ＲＮＡを指す。例えば、ＲＮＡの下流プロセシングのメカニズムに関係なく、以前にｓｉＲＮＡとして同定された配列が含まれる（すなわち、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断をもたらす特定のインビボプロセシング方法を有すると考えられているが、そのような配列を本明細書に記載の隣接配列の状況におけるベクターに組み込むことができる）。「ＲＮＡｉ」という用語は、遺伝子サイレンシングＲＮＡｉ分子、および遺伝子の発現を活性化するＲＮＡｉエフェクター分子の両方を含み得る。単なる一例として、いくつかの実施形態では、阻害する働きをする、または遺伝子サイレンシングのＲＮＡｉ剤は、本明細書に開示される方法、キットおよび組成物において、例えば免疫応答（例えば、自然免疫応答）を阻害するために有用である。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、方法または組成物に必須であるが、必須であるか否かにかかわらず、不特定要素の包含に対して開かれている、その組成物、方法、およびそれぞれの構成要素（複数可）に関して使用される。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されてない任意の要素を除いて、本明細書に記載される組成物、方法、およびそれらのそれぞれの構成要素を指す。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、本発明の実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載される、および／または本開示などを読むことにより当業者に明らかとなるであろうタイプの１つ以上の方法、および／またはステップを含む。同様に、「または」という語は、文脈が別途明らかに示されない限り、「および」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記で説明される。省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を示すように使用される。したがって、省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。
作動例または別途示される場合を除いて、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。パーセンテージに関連して使用される「約」という用語は、±１％を意味する場合がある。本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、本発明の範囲は、それに限定されるべきではない。
本明細書に開示される本発明の代替的な要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーまたは本明細書で見られる他の要素との任意の組み合わせで参照および主張することができる。グループの１つ以上のメンバーは、利便性および／または特許性の理由から、グループに含める、またはグループから削除することができる。そのような任意の包含または削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修飾されたグループを含むとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されているすべてのマーカッシュグループの記述を満たす。
いずれかの態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される開示は、人間のクローン化プロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を修正するプロセス、産業もしくは商業目的でのヒト胚の使用、または人もしくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく苦しみを引き起こす可能性が高い動物、およびそのようなプロセスから生じる動物の遺伝的同一性を修飾するためのプロセスに関係しない。
本明細書では、本発明の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。
ＩＩ．核酸
核酸は大きく、高電荷であり、急速に分解されて身体から排出され、一般に薬理学的特性は低い。なぜなら、身体にとって異物として認識され、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の標的になるためである。したがって、治療用核酸または研究目的に使用される核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはウイルスベクター）などの特定の核酸は、インビボで免疫応答を誘起することが多い。本開示は、対象レシピエントの低減した免疫応答状態で核酸の持続性を最大化することを通して発現レベルを増加させることにより、そのような免疫応答を改善、低減または排除し、核酸の効力を増強し得る医薬組成物および方法を提供する。これにより、遺伝子療法の過程で臓器損傷または他の毒性につながり得る潜在的な有害事象を最小限に抑えることができる。本明細書で提供される組成物および方法の多くは、核酸（例えば、治療用核酸または研究目的に使用される核酸）と併用した免疫応答（例えば、自然免疫応答）の特異的阻害剤の投与に関し、これにより、核酸の存在によって誘起される免疫応答（例えば、自然免疫応答）が低減される。
免疫原性／免疫刺激性核酸は、デオキシリボ核酸およびリボ核酸の両方を含むことができる。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の場合、特定の配列またはモチーフが哺乳動物の免疫刺激を誘導することが示されている。これらの配列またはモチーフには、ＣｐＧモチーフ、ピリミジンリッチ配列、およびパリンドローム配列が含まれるが、これらに限定されない。デオキシリボ核酸のＣｐＧモチーフは、エンドソームのトール様受容体９（ＴＬＲ－９）によって認識されることが多く、これが次に自然免疫刺激経路および獲得免疫刺激経路の両方を誘起する。特定の免疫刺激性リボ核酸（ＲＮＡ）配列は、トール様受容体６および７（ＴＬＲ－６およびＴＬＲ－７）に結合し、免疫応答（例えば、自然免疫応答）を通じて炎症誘発性応答を活性化すると考えられている。さらに、二本鎖ＲＮＡはＴＬＲ－３に結合するため、免疫刺激性であることが多い。したがって、外来核酸分子は、その起源が病原体由来であるか、または治療用であるかのいずれかであり、インビボで免疫原性が高い可能性がある。
免疫応答（例えば、自然免疫応答）のアンタゴニストと併用した潜在的な治療用途の核酸分子の特性評価および開発が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、必要に応じて、インビボ特性（送達、安定性、寿命、フォールディング、標的特異性）の改変および改善を目的としたオリゴヌクレオチドの化学修飾、ならびに治療適用と直接相関するそれらの生物学的機能およびメカニズムが、記載されている。
免疫刺激性であり得、かつ本明細書に開示される免疫抑制剤の使用を必要とし得る、本開示の例示的な治療用核酸としては、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、閉端二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ、ＣＥＬｉＤ、直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡ（「ミニストリング」）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、プロテロメア閉端ＤＮＡ、またはダンベル直鎖状ＤＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、ならびにそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを通じて特定のタンパク質の細胞内レベルを下方調節することができるｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡもまた、本発明によって核酸治療薬であると企図される。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが宿主細胞の細胞質に導入された後、これらの二本鎖ＲＮＡ構築物はＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に結合することができる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのセンス鎖はＲＩＳＣ複合体によって除去される。ＲＩＳＣ複合体は、相補的ｍＲＮＡと結合すると、ｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を放出する。ＲＮＡｉは、対応するタンパク質の下方調節をもたらすｍＲＮＡの特異的破壊を誘発することによるものである。
タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）およびリボザイムは、核酸治療薬となり得る。アンチセンス構築物の場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を有し、ワトソンは、クリック塩基対合によってｍＲＮＡに結合することができる。この結合は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぎ、かつ／またはｍＲＮＡ転写産物のＲＮａｓｅＨ分解を誘起する。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドは作用の特異性（すなわち、特定の疾患関連タンパク質の下方調節）を高めた。
本明細書で提供される方法のいずれにおいても、治療用核酸は治療用ＲＮＡであり得る。治療用ＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳の阻害剤、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の薬剤、触媒的に活性なＲＮＡ分子（リボザイム）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはｍＲＮＡ転写物（ＡＳＯ）、タンパク質もしくは他の分子リガンドに結合するＲＮＡ（アプタマー）であり得る。本明細書で提供される方法のいずれにおいても、ＲＮＡｉの薬剤は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、または三重らせん形成オリゴヌクレオチドであり得る。
いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は、閉端二本鎖ＤＮＡ、例えば、ｃｅＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、細胞における治療用タンパク質の発現および／または産生は、非ウイルス性ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクターに由来する。従来のＡＡＶベクター、さらにはレンチウイルスベクターを超える、治療用タンパク質の発現に対するｃｅＤＮＡベクターの明確な利点は、所望のタンパク質をコードする異種核酸配列にサイズの制約がないことである。したがって、大きな治療用タンパク質でさえ、単一のｃｅＤＮＡベクターから発現することができる。したがって、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、それを必要とする対象において治療用タンパク質を発現させることができる。
一般に、本明細書に開示されるような治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載されるような発現カセット）、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ＩＴＲ配列は、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾されたＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択される。
ＩＩＩ．ｃｅＤＮＡベクター
いくつかの態様によれば、本開示は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体と併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）を提供する。いくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、ＷＯ２０１６／０７３７９９に記載されているように、合成ナノ担体中に過飽和量で存在する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターも同じナノ担体中に存在する。
いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上のＴＬＲ９アンタゴニストと併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）を提供する。１つ以上のＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドを部分的にコードする配列を含むｃｅＤＮＡ構築物も本明細書で提供される。
いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上のｃＧＡＳアンタゴニストと併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）を提供する。１つ以上のｃＧＡＳ阻害性ＲＮＡまたはタンパク質を部分的にコードする配列を含むｃｅＤＮＡ構築物も本明細書に提供される。
いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上のインフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）と併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）を提供する。１つ以上のインフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせ）を部分的にコードする配列を含むｃｅＤＮＡ構築物も本明細書に提供される。
理解されるように、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター技術は、任意のレベルの複雑さに適合させることができるか、モジュール方式で使用することができ、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の異なる成分、例えば、本明細書に記載される成分の発現が独立した様式で制御され得る。例えば、本明細書で設計されたｃｅＤＮＡベクター技術は、単一のｃｅＤＮＡベクターを使用して単一の異種遺伝子配列（例えば、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の単一阻害剤、例えば、本明細書に記載されるものなど）を発現させるような単純なものであり得るか、または複数のｃｅＤＮＡベクター（各ベクターは、複数の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤、例えば、本明細書に記載されるものなどを発現する）、もしくは１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤、例えば、本明細書に記載されるものなど、および例えば、異なるプロモーターによってそれぞれ独立して制御される関連補因子もしくはアクセサリータンパク質をコードする核酸配列を使用するような複雑なものであることが特に意図される。
一実施形態では、単一のｃｅＤＮＡベクターを使用して、インフラマソームアンタゴニストの単一成分（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）を発現することができる。代替的に、単一のｃｅＤＮＡベクターを使用して、複数の成分（例えば、少なくとも２つ）を発現することができ、例えば、２つ以上のＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、および／または２つ以上のＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、および／または２つ以上のカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせ）を、各成分、例えば、補因子またはアクセサリータンパク質の適切な発現を保証するために任意でＩＲＥＳ配列（複数可）を使用して、単一のプロモーター（例えば、強力なプロモーター）の制御下で発現できる。
別の実施形態では、少なくとも２つの挿入物を含む単一のｃｅＤＮＡベクターも本明細書に企図され、各挿入物の発現はそれ自体のプロモーターの制御下にある。プロモーターは、同じプロモーターの複数のコピー、複数の異なるプロモーター、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。当業者が理解するように、多くの場合、複数のインフラマソームアンタゴニストを異なる発現レベルで発現させることが望ましく、したがって、発現される個々の成分の化学量論を制御して、細胞における効率的な発現、ならびにタンパク質の場合、タンパク質の折りたたみおよび組み合わせを確実にする。
いくつかの実施形態によれば、合成ｃｅＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ分子からの切除を介して産生される。ｃｅＤＮＡベクターの合成産生は、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の実施例２～６に記載される。二本鎖ＤＮＡ分子の切除を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する１つの例示的な方法。手短に言えば、ｃｅＤＮＡベクターは、二本鎖ＤＮＡ構築物を使用して生成され得る。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図７Ａ～８Ｅを参照されたい。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物はｃｅＤＮＡプラスミドであり、例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図６を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを作製するための構築物は、本明細書に記載される調節スイッチを含む。
様々なオリゴヌクレオチドの集成を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の実施例３に提供されており、ｃｅＤＮＡベクターは、５´オリゴヌクレオチドおよび３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって産生される。ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図１１Ｂは、５´ＩＴＲオリゴヌクレオチドおよび３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする例示的な方法を示す。
合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する例示的な方法は、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の実施例４において提供され、センス発現カセット配列に隣接する２つのセンスＩＴＲを含む一本鎖の直鎖状ＤＮＡを使用し、アンチセンス発現カセットに隣接する２つのアンチセンスＩＴＲに共有結合し、次いで、この一本鎖の直鎖状ＤＮＡの末端をライゲーションして、閉端一本鎖分子を形成する。非限定的な一例は、一本鎖ＤＮＡ分子を合成および／または産生し、分子の一部をアニーリングして、二次構造の１つ以上の塩基対合領域を有する単一の直鎖状ＤＮＡ分子を形成し、次いで遊離５´および３´末端を互いにライゲーションして、閉じた一本鎖分子を形成する。
ｃｅＤＮＡベクター技術のさらなるバリエーションは、当業者によって想定され得るか、または従来のベクターを使用するタンパク質産生方法から適合され得る。
非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターは、許容宿主細胞において発現構築物（例えば、プラスミド、バクミド、バキュロウイルス、または組み込み細胞株）から産生することができる。例えば、２０１８年９月７日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号に開示された実施例を参照、または合成産生を使用して、例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号に開示された例を参照。各文献は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物において有用なｃｅＤＮＡベクターは、異種核酸、例えば２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられる導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）と比較した欠失、挿入、および／または置換によって修飾され、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能性末端分解部位（ＴＲＳ）およびＲｅｐ結合部位を含む。一実施形態では、ＩＴＲの少なくとも１つは、対応するＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、野生型ＡＡＶ２の場合、配列番号１、または配列番号５１）に対して少なくとも１つのポリヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を有し、Ｒｅｐタンパク質の存在下で宿主細胞におけるＤＮＡベクターの複製を誘導する。上記で論じたように、任意のＩＴＲを使用できる。例として、表１ＡにおけるｃｅＤＮＡ構築物のＩＴＲは、修飾ＩＴＲおよびＷＴ ＩＴＲである。しかしながら、本明細書では、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた異種核酸配列（例えば、導入遺伝子）を含むｃｅＤＮＡベクターが包含され、これらの用語が本明細書に定義されるように、ＩＴＲ配列は、非対称ＩＴＲ対または対称もしくは実質的に対称のＩＴＲ対であり得る。本明細書に開示されるようなＮＬＳを含むｃｅＤＮＡベクターは、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含み得、本開示の方法は、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、２０１８年９月７日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号（例えば、実施例１～４を参照）に開示される非対称ＩＴＲＳを含むｃｅＤＮＡベクター、２０１８年１２月６日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／６４２４２号（例えば、実施例１～７を参照）に開示される遺伝子編集用ｃｅＤＮＡベクター、または２０１９年２月１４日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１８０１６号（例えば、実施例１～４を参照）に開示される抗体もしくは融合タンパク質産生用ｃｅＤＮＡベクター、または２０１９年２月２２日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１８９２７号に開示される制御された導入遺伝子発現用ｃｅＤＮＡベクターを含むがこれに限定されない任意のｃｅＤＮＡベクターと同時投与するための本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の使用に関し、各文献は全体として参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を使用する本明細書に記載の方法および組成物は、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター、例えば、２０１９年１月１８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号（参照により全体として本明細書に組み込まれる）に開示されている、ｃｅＤＮＡ産生の無細胞または無昆虫システムで産生されるｃｅＤＮＡベクターとともに使用され得ることも想定される。
ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、分子、例えば導入遺伝子の少なくとも一部にわたって二重鎖または自己相補的である。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、３７℃で１時間超エキソヌクレアーゼ消化（例えば、ＥｘｏＩまたはＥｘｏＩＩＩ）に対して耐性であることが好ましい。宿主細胞（例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞）におけるＲｅｐタンパク質の存在は、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターの産生を誘導する修飾型ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターポリヌクレオチドテンプレートの複製を促進する。共有結合性閉端分子は、複製中、許容細胞で蓄積し続け、Ｒｅｐタンパク質の存在下、標準複製条件下で、経時的に十分に安定であることが好ましく、例えば、少なくとも１ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも２ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも３ｐｇ／細胞、より好ましくは少なくとも４ｐｇ／細胞、さらにより好ましくは少なくとも５ｐｇ／細胞の量で蓄積する。
特に、一実施形態では、ＤＮＡベクターは、２つの異なるＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）、およびＩＴＲ間に位置付けられた関心対象のヌクレオチド配列（異種核酸、発現カセット）を含むポリヌクレオチドベクターテンプレート（例えば、発現構築物）を保有する細胞（例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞、例えば、２９３細胞など）を提供することにより産生され、ＩＴＲの少なくとも１つは、他のＩＴＲと比べて挿入、置換、または欠失を含む修飾型ＩＴＲである。本明細書に記載のポリヌクレオチドベクターテンプレートは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；ＡＡＶ２の場合、例えば、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’）および機能的末端分解部位（ＴＲＳ；例えば、５’－ＡＧＴＴ）を含む少なくとも１つの機能的ＩＴＲを含む。細胞は、ウイルスカプシドタンパク質を発現せず、ポリヌクレオチドベクターテンプレートは、ウイルスカプシドをコードする配列を欠いている。
Ｒｅｐの存在下で、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドテンプレートが複製して、ｃｅＤＮＡベクターを産生する。ｃｅＤＮＡベクターの産生は、２つのステップを経る。第１に、Ｒｅｐタンパク質を介したベクターバックボーン（例えば、プラスミド、バクミド、ゲノムなど）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、および第２に、切除されたベクターゲノムのＲｅｐ媒介複製である。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐタンパク質およびＲｅｐ結合部位は、当業者に周知である。当業者は、機能的ＩＴＲに結合して複製する血清型からＲｅｐタンパク質を選択することを理解する。
ベクターポリヌクレオチドを保有する細胞は、Ｒｅｐを既に含むか（例えば、誘導性ｒｅｐを有する細胞株）、Ｒｅｐを含むベクターで形質導入後、ｃｅＤＮＡベクターの複製および放出を可能にする条件下で増殖する。次いで、ｃｅＤＮＡベクターのＤＮＡは、細胞から採取され、単離される。カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡのｃｅＤＮＡベクターの存在は、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で細胞から単離されたベクターＤＮＡを消化することと、消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することとによって確認され得る。例えば、図６は、実施例に記載のこれらのベクターを産生するための一実施形態を使用して、複数のＴＴＸプラスミド構築物からのｃｅＤＮＡベクターの産生を確認するゲルである。ｃｅＤＮＡベクターは、図４Ｄに関して考察されるように、ゲルの特徴的なバンドパターンによって確認される。図５Ａおよび図５Ｂは、本明細書のプロセスによって産生された閉端ｃｅＤＮＡベクターの存在を同定するための一実施形態を示す図である。
ベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（例えば、ＴＴＸ－プラスミド、バクミドなど）、および／またはｉｉ）Ｒｅｐをコードするポリヌクレオチドは、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウム、ナノ粒子、またはリポソーム）、またはウイルスベクター、例えばＨＳＶもしくはバキュロウイルスによる導入を含むが、これらに限定されない当業者に周知の任意の手段を用いて細胞に導入され得る。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートは、プラスミド（例えば、ＴＴＸ－プラスミド、例えば、図４Ｂを参照）、バクミド（例えば、ＴＴＸ－バクミド）、および／またはバキュロウイルス（例えば、ＴＴＸ－バキュロウイルス）であり得る。一実施形態では、ＴＴＸ－プラスミドは、異種核酸（例えば、レポーター遺伝子または治療用核酸を含む発現カセット）を挿入できるＩＴＲ間に作動可能に位置付けられた制限クローニング部位（例えば、配列番号７）を含む。
好ましい一実施形態では、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターを作製するために使用される宿主細胞は昆虫細胞である。別の好ましい実施形態では、バキュロウイルスを使用して、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ｃｅＤＮＡベクター用の非ウイルス性ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築テンプレートの両方を送達する。ｃｅＤＮＡベクターを入手し単離するためのプロセスの例は、図１～３３に記載されている。
さらに別の態様では、本発明は、非ウイルスＤＮＡベクターの産生に使用するため、本明細書に記載のＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡベクターテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株を提供する。そのような細胞株を産生する方法は、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ８（８）：ｅ６９８７９に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。好ましくは、Ｒｅｐタンパク質（例えば、実施例１に記載されているとおり）は、ＭＯＩ３で宿主細胞に添加される。一実施形態では、宿主細胞株は無脊椎動物の細胞株、好ましくは昆虫Ｓｆ９細胞である。宿主細胞株が哺乳動物細胞株、好ましくは２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し、ヘルペスウイルスなどの第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐの存在下でのｃｅＤＮＡベクターの切除および増幅を可能にする。
好ましくは、ｃｅＤＮＡは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；ＡＡＶ２の５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’、配列番号３９）および末端分解部位（ＴＲＳ；５’－ＡＧＴＴ）を含む１つ以上の機能的ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含む。
カプシド不含ｃｅＤＮＡベクターは、ＷＨＰ転写後調節要素（ＷＰＲＥ）およびＢＧＨポリＡなどのシス調節要素の特定の組み合わせをさらに含む発現構築物（例えば、ＴＴＸ－プラスミド、ＴＴＸ－バクミド、ＴＴＸ－バキュロウイルス）から産生できる。発現構築物における使用のための好適な発現カセットは、ウイルスカプシドによって課されるパッケージング制約によって制限されない。本開示の発現カセットは、全体発現レベルならびに細胞特異性に影響を及ぼし得る、プロモーターを含む。導入遺伝子発現の場合、それらは、非常に活発なウイルス由来の最初期プロモーターを含み得る。発現カセットは、導入遺伝子発現を特定の細胞型に制限し、無秩序な異所性発現から生じる毒性効果および免疫応答を低減するために、組織特異的真核細胞プロモーターを含有し得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、ＣＡＧプロモーター（配列番号３）などの合成調節要素を含有し得る。ＣＡＧプロモーターは、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素（例えば、配列番号３０９）、（ｉｉ）プロモーター、ニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１のエクソンおよび第１のイントロン、ならびに（ｉｉｉ）ウサギベータ－グロブリン遺伝子のスプライスアクセプターを含む。代替的に、例えば、発現カセットは、アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター（例えば、配列番号４）、肝臓特異的（ＬＰ１）プロモーター（例えば、配列番号５）、またはＨＡＡＴプロモーター（例えば、配列番号１３５）またはヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ１－α）プロモーター（配列番号６）またはＥＦ１－α断片（配列番号６６）、またはＭＮＤプロモーター（配列番号７０）を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１つ以上の構成的プロモーター、例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター（任意選択的にＣＭＶエンハンサーを有する）などを含む。代替的に、誘導性プロモーター、導入遺伝子の未変性プロモーター、組織特異的プロモーター、または当該技術分野において既知の様々なプロモーターを使用することができる。一実施形態では、遺伝子コード配列の内因性または天然のプロモーターが発現カセットで使用される。
ｃｅＤＮＡベクターを使用する誘導性遺伝子編集は、例えば、Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３：３９０－３９４（２０１５）、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３：１３９－４２（２０１５）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １１：３１６－３１８（２０１５）、Ｐｏｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １１：１９８－２００（２０１５）、および／またはＫａｗａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６：６２５６（２０１５）に記載される方法を使用して実施でき、文献の各内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。発現カセットは、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後要素、特にウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節要素（ＷＰＲＥ）（配列番号７２）も含み得る。他の転写後プロセシング要素、例えば、単純ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後要素が使用され得る。発現カセットは、当該技術分野において既知のポリアデニル化配列またはその変形、例えば、ウシＢＧＨｐＡもしくはウイルスＳＶ４０ｐＡ（例えば、配列番号１０）から単離された天然、または合成を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含み得る。ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡまたは異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。
本明細書に記載されるＤＮＡベクターを細胞から採取および収集するための時間は、ＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖などを考慮して選択され得る。通常、細胞は、ＤＮＡ－ベクター（例えば、ＴＴＸ－ベクター）を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大半がウイルス毒性のために死滅し始める前に採取され得る。ＤＮＡ－ベクターは、例えば、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅ（商標）プラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法はまた、ＤＮＡ－ベクターに対して適合され得る。一般に、当該技術分野において既知の任意の核酸精製方法が採用され得る。
調節配列およびエフェクター
実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、治療用タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に加えて、第２のヌクレオチド配列（例えば、調節配列）を含む。実施形態では、遺伝子調節配列は、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。実施形態では、調節配列は、宿主細胞における治療用タンパク質の発現を制御するのに適している。実施形態では、調節配列は、本開示の治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列などのプロモーター配列に操作可能に連結された遺伝子の転写を指示することができる、好適なプロモーター配列を含む。実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結されたイントロン配列を含む。実施形態では、エンハンサー配列がプロモーターの上流に提供されて、プロモーターの効力を増大させる。実施形態では、調節配列は、エンハンサーおよびプロモーターを含み、第２のヌクレオチド配列は、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン配列を含み、イントロンは、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含み、プロモーターは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている。実施形態では、使用される調節配列は、ベクター内のコード配列に固有のものである。
プロモーター：上記のものを含む好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得、したがってウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは、原核生物または真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩ、ｐｏｌＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端配列（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６、例えば、配列番号１８（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７－５００（２００２））、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）（例えば、配列番号１９）、ＣＡＧプロモーター、ヒトα１－抗トリプシン（ＨＡＡＴ）プロモーター（例えば、配列番号１３５）などが挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、これらのプロモーターは、それらの下流イントロン含有端で改変されて、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位（複数可）を含有するＤＮＡは、プロモーターＤＮＡに対して外来である。
プロモーターは、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことにより、発現をさらに増強する、および／またはその空間的発現および／または時間的発現を改変することができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素を含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織または器官に関して、または発現が起こる発達段階に関して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、または誘導剤などの外部刺激に応答して、構成的または示差的に遺伝子成分の発現を調節し得る。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーターおよびＣＭＶ ＩＥプロモーター、ならびに以下に列挙されるプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用して、関心対象の任意の遺伝子、例えば、遺伝子編集用分子、ドナー配列、治療用タンパク質など）を発現させることができる。例えば、ベクターは、治療用タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されるプロモーターを含み得る。治療用タンパク質コード配列に操作可能に連結されたプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然または合成の、組織特異的プロモーター、例えば、肝臓特異的プロモーター、例えば、ヒトα１－アンチタイプシン（ＨＡＡＴ）であり得る。一実施形態では、肝臓への送達は、肝細胞の表面上に存在する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を介して、肝細胞へのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の内因性ＡｐｏＥ特異的標的を使用して達成され得る。
一実施形態では、使用されるプロモーターは、治療用タンパク質をコードする遺伝子の未変性プロモーターである。治療用タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子のプロモーターおよび他の調節配列は既知であり、特徴付けられている。使用されるプロモーター領域は、１つ以上の追加の調節配列（例えば、未変性）、例えば、エンハンサーをさらに含み得る。
本発明に従って使用するための好適なプロモーターの非限定例としては、例えば、（配列番号３）のＣＡＧプロモーター、ＨＡＡＴプロモーター（配列番号１３５）、ヒトＥＦ１－αプロモーター（配列番号６）、またはＥＦ１－αプロモーター（配列番号６６）およびラットＥＦ１－αプロモーター（配列番号３１０）の断片が挙げられる。
エンハンサー：いくつかの実施形態では、インフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の１つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤）を発現するｃｅＤＮＡは、１つ以上のエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、プロモーター配列の５’に位置する。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、プロモーター配列の３’に位置する。例示的なエンハンサーは、本明細書の表１に列挙される。
Figure 2022518504000001
Figure 2022518504000002
Figure 2022518504000003
５’ＵＴＲ配列およびイントロン配列：いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’ＵＴＲ配列および／または５’ＩＴＲ配列の３’に位置するイントロン配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、導入遺伝子、例えば、インフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の１つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤）をコードする配列の５’に位置する。表２Ａに列挙される例示的な５’ＵＴＲ配列。
Figure 2022518504000004
Figure 2022518504000005
Figure 2022518504000006
Figure 2022518504000007
Figure 2022518504000008
３’ＵＴＲ配列：いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、３’ＩＴＲ配列の５’に位置する３’ＵＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、導入遺伝子、例えば、インフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の１つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ１阻害剤）をコードする配列の３’に位置する。表２Ｂに列挙される例示的な３’ＵＴＲ配列。
Figure 2022518504000009
Figure 2022518504000010
Figure 2022518504000011
ポリアデニル化配列：ポリアデニル化配列をコードする配列は、本明細書に記載される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用にｃｅＤＮＡベクターに含まれ、ｃｅＤＮＡベクターから発現するｍＲＮＡを安定化し、ならびに核輸送および翻訳を援助し得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、インフラマソームアンタゴニストの発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０以上のアデニンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約４３ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約４０～５５ヌクレオチド、約４５～５０ヌクレオチド、約３５～５０ヌクレオチド、またはその間の任意の範囲を含む。
発現カセットは、当技術分野で既知の任意のポリアデニル化配列またはその変形を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化（ポリＡ）配列は、表３に列挙されたもののいずれかから選択される。当技術分野で一般的に知られている他のポリＡ配列も使用することができ、例えば、ウシＢＧＨｐＡ（例えば、配列番号９）またはウイルスＳＶ４０ｐＡ（例えば、配列番号１０）から単離された天然に存在する配列、または合成配列を含むが、これらに限定されない。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＳＥ配列は、ＳＶ４０ｐＡまたは異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。ポリＡ配列は、インフラマソームアンタゴニストをコードする導入遺伝子の３’に位置している。
発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後要素を含み得る。いくつかの実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節要素（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号７２）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後プロセシング要素、例えば、単純ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後要素を使用することができる。分泌配列は、導入遺伝子、例えば、ＶＨ－０２およびＶＫ－Ａ２６配列、例えば、配列番号９５０および配列番号９５１に連結され得る。
Figure 2022518504000012
Figure 2022518504000013
Figure 2022518504000014
一実施形態では、ベクターポリヌクレオチド（ｃｅＤＮＡベクター）は、配列番号１および配列番号５２、ならびに配列番号２および配列番号５１からなる群から選択される１対の２つの異なるＩＴＲを含む。これらの態様のそれぞれの一実施形態では、ベクターポリヌクレオチドまたは共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターは、配列番号１０１および配列番号１０２；配列番号１０３、および配列番号１０４、配列番号１０５、および配列番号１０６；配列番号１０７、および配列番号１０８；配列番号１０９、および配列番号１１０；配列番号１１１、および配列番号１１２；配列番号１１３および配列番号１１４；および配列番号１１５および配列番号１１６からなる群から選択される１対のＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５００～５２９から選択される任意の配列を含むＩＴＲを有しない。
本明細書に記載されるＤＮＡベクターを細胞から採取および収集するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖などを考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、ＤＮＡ－ベクター（例えば、ＴＴＸ－ベクター）を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大半がウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡ－ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅプラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。
ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
一実施形態では、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターは、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、外因性ＤＮＡの発現カセット）および修飾ＡＡＶ ＩＴＲをこの順で含むポリヌクレオチドテンプレートを含むプラスミドを含むか、またはそれから得られ、テンプレート核酸分子は、ＡＡＶカプシドタンパク質コードを欠いている。さらなる実施形態では、本発明の核酸テンプレートは、ウイルスカプシドタンパク質をコードする配列を欠いている（すなわち、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。さらに、特定の実施形態では、テンプレート核酸分子はまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、本発明の核酸分子は、機能的なＡＡＶキャップおよびＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の両方を欠いている。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲに関して変異のＩＴＲ構造を含み得るが、依然として操作可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、およびＲＢＥ’部分を保持する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５００～５２９から選択される任意の配列を含むＩＴＲを有しない。
いくつかの実施形態では、インフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）をコードする導入遺伝子は、インフラマソームアンタゴニストがゴルジ体および小胞体に向かうように、分泌配列もコードし、そこから、インフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）は、ＥＲを通過し細胞の外に出る場合に、シャペロン分子によって正しい立体構造に折りたたまれるであろう。例示的な分泌配列には、ＶＨ－０２（配列番号９５０）およびＶＫ－Ａ２６（配列番号９５１）およびＩｇκシグナル配列、ならびにタグ付きタンパク質が細胞質から分泌されるのを可能にするＧｌｕｃ分泌シグナル、タグ付きタンパク質をゴルジ体に向けるＴＭＤ－ＳＴ分泌配列が含まれるが、これらに限定されない。
核局在化配列：いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用のｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、アミノ末端またはその近く、カルボキシ末端またはその近く、またはこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端における１つ以上のＮＬＳおよび／またはカルボキシ末端における１つ以上のＮＬＳ）に位置する。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、各々を他のＮＬＳから独立して選択することができ、それにより、単一のＮＬＳが２つ以上のコピーに、および／または１つ以上のコピーに存在する１つ以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在する。ＮＬＳの非限定的な例を表４に示す。
Figure 2022518504000015
調節スイッチ：分子調節スイッチは、シグナルに応答して、状態の測定可能な変化を生成するものである。免疫応答の阻害剤が、所望するとおりに発現するように（所望の発現レベルまたは発現量での免疫応答の阻害剤の発現を含む、または代わりに、特定のシグナルの有無に関わらず、細胞シグナル伝達事象を含むがこれらに限定されない）、調節スイッチを使用して、本明細書に記載されるように、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現を微調整することもできる。例えば、本明細書に記載されるように、特定の状態が発生した場合、ｃｅＤＮＡベクターからの免疫応答の阻害剤の発現をオンまたはオフにすることができる。いくつかの実施形態では、スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターにおける免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現を制御可能かつ調節可能な様式で開始または停止（すなわち、シャットダウン）するように設計された「オン／オフ」スイッチである。いくつかの実施形態では、スイッチは、一旦スイッチが起動されると、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞がプログラム細胞死を受けるよう指示することができる「キルスイッチ」を含み得る。免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターでの使用に含まれる例示的な調節スイッチは、導入遺伝子の発現を調節するために使用することができ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）においてより詳細に論じられている。
（ｉ）バイナリ調節スイッチ
いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターは、インフラマソームアンタゴニストの発現を制御可能に調整するのに役立ち得る調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲ間に位置する発現カセットは、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤をコードする核酸配列に作動可能に連結された調節領域、例えば、プロモーター、シス要素、リプレッサー、エンハンサーなどを追加で含み、この調節領域は、１つ以上の補因子または外因性薬剤によって調節される。単なる例として、調節領域は、小分子スイッチまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターによって調節され得る。誘導性プロモーターの非限定的な例は、ホルモン誘導性または金属誘導性プロモーターである。他の例示的な誘導性プロモーター／エンハンサー要素としては、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
（ｉｉ）小分子調節スイッチ
様々な技術で知られる小分子系調節スイッチは、当技術分野において既知であり、本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤と組み合わせて、調節スイッチによって制御されるｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、直交リガンド／核受容体対、例えば、レチノイド受容体変異体／ＬＧ３３５およびＧＲＱＣＩＭＦＩ（Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０（２０１０）：１５に開示されているものなどの、操作可能に連結された導入遺伝子の発現を制御する人工プロモーターとともに）；操作されたステロイド受容体、例えば、プロゲステロンに結合することはできないが、ＲＵ４８６（ミフェプリストン）には結合するＣ末端切断を有する修飾型プロゲステロン受容体（米国特許第５，３６４，７９１号）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａからのエクジソン受容体およびそれらのエクジステロイドリガンド（Ｓａｅｚ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７（２６）（２０００），１４５１２－１４５１７）、またはＳａｎｄｏ Ｒ ３ｒｄ；Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３，１０（１１）：１０８５－８に開示されるような抗生物質トリメトプリム（ＴＭＰ）によって制御されるスイッチのうちのいずれか１つまたは組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、米国特許第８，７７１，６７９号および同第６，３３９，０７０号に開示されるものなどのプロドラッグ活性化スイッチである。
（ｉｉｉ）「パスコード」調節スイッチ
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、「パスコードスイッチ」または「パスコード回路」であり得る。パスコードスイッチは、特定の条件が起こったときに、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現の制御の微調整を可能にする。すなわち、導入遺伝子の発現および／または抑制が起こるためには、条件の組み合わせが存在する必要がある。例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも条件ＡおよびＢが起こらなければならない。パスコード調節スイッチは、任意の数の条件であり得、例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７つ以上の条件が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの条件（例えば、Ａ、Ｂ条件）が起こる必要があり、いくつかの実施形態では、少なくとも３つの条件が起こる必要がある（例えば、Ａ、Ｂ、およびＣまたはＡ、Ｂ、およびＤ）。単なる例として、パスコード「ＡＢＣ」調節スイッチを有するｃｅＤＮＡからの遺伝子発現が起こるためには、条件Ａ、Ｂ、およびＣが存在しなければならない。条件Ａ、Ｂ、およびＣは、以下のとおりであり得る。条件Ａは、病態または疾患の存在であり、条件Ｂは、ホルモン反応であり、条件Ｃは、導入遺伝子の発現に対する反応である。例えば、導入遺伝子が欠陥ＥＰＯ遺伝子を編集する場合、条件Ａは、慢性腎疾患（ＣＫＤ）の存在であり、条件Ｂは、対象が腎臓中に低酸素状態を有する場合に起こり、条件Ｃは、腎臓中のエリスロポエチン産生細胞（ＥＰＣ）動員が不全であるか、または代替的に、ＨＩＦ－２活性化が不全である。一旦酸素レベルが増加するか、または所望のＥＰＯレベルに達すると、導入遺伝子は、３つの条件が起こるまで再度オフになり、オンに戻る。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために包含されるパスコード調節スイッチまたは「パスコード回路」は、生物学的封じ込め条件を定義するために使用される環境シグナルの範囲および複雑性を拡張するために、ハイブリッド転写因子（ＴＦ）を含む。既定条件の存在下で細胞死を誘起するデッドマンスイッチとは対照的に、「パスコード回路」は、特定の「パスコード」の存在下での細胞生存または導入遺伝子発現を可能にし、所定の環境条件またはパスコードが存在する場合にのみ導入遺伝子発現および／または細胞生存を可能にするように容易に再プログラムされ得る。
本明細書に開示される調節スイッチ、例えば、小分子スイッチ、核酸系スイッチ、小分子－核酸ハイブリッドスイッチ、転写後導入遺伝子調節スイッチ、翻訳後調節放射線制御スイッチ、低酸素媒介性スイッチ、および本明細書に開示される当業者に既知の他の調節スイッチのうちのいずれかおよびすべての組み合わせを、本明細書に開示されるパスコード調節スイッチにおいて使用することができる。使用のために包含される調節スイッチはまた、レビュー論文Ｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．１２：２０１４１０００（２０１５）において考察され、Ｋｉｓの表１に要約されている。いくつかの実施形態では、パスコードシステムで使用するための調節スイッチは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表１１に開示されるスイッチのうちのいずれかまたはそれらの組み合わせから選択することができる。
（ｉｖ）．導入遺伝子発現を制御するための核酸系調節スイッチ
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡによる免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現を制御するための調節スイッチは、核酸系制御機序に基づく。例示的な核酸制御機序は、当該技術分野において既知であり、使用が想定される。例えば、そのような機序としては、リボスイッチ、例えば、ＵＳ２００９／０３０５２５３、ＵＳ２００８／０２６９２５８、ＵＳ２０１７／０２０４４７７、ＷＯ２０１８／０２６７６２Ａ１、米国特許第９，２２２，０９３号、および欧州特許出願第ＥＰ２８８０７１号に開示されるもの、またＶｉｌｌａ ＪＫ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ．２０１８ Ｍａｙ；６（３）によるレビューに開示されるものなどが挙げられる。ＷＯ２０１８／０７５４８６およびＷＯ２０１７／１４７５８５に開示されるものなどの、代謝物反応性転写バイオセンサーもまた含まれる。使用が想定される他の当該技術分野において既知の機序としては、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子（例えば、ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ）による導入遺伝子のサイレンシングが挙げられる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子の一部に対して相補的であるＲＮＡｉ分子をコードする調節スイッチを含み得る。導入遺伝子（例えば、インフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の１つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤））が、ｃｅＤＮＡベクターによって発現されたとしても、そのようなＲＮＡｉが発現する場合、相補的ＲＮＡｉ分子によってサイレンシングされ、導入遺伝子がｃｅＤＮＡベクターによって発現する際にＲＮＡｉが発現しない場合、導入遺伝子は、ＲＮＡｉによってサイレンシングされない。
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、ＵＳ２００２／００２２０１８に開示されるような組織特異的自己不活化調節スイッチであり、これにより調節スイッチは、そうでなければ導入遺伝子発現が不利益となり得る部位において、導入遺伝子（例えば、インフラマソームアンタゴニスト）を意図的にスイッチオフする。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、ＵＳ２０１４／０１２７１６２および米国特許第８，３２４，４３６号に開示されるリコンビナーゼ可逆的遺伝子発現系である。
（ｖ）．転写後および翻訳後調節スイッチ。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによる免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現を制御する調節スイッチは、転写後修飾システムである。例えば、そのような調節スイッチは、ＵＳ２０１８／０１１９１５６、ＧＢ２０１１／０７７６８、ＷＯ２００１／０６４９５６Ａ３、欧州特許第２７０７４８７号、およびＢｅｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，４（５），ｐｐ５２６－５３４、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１６ Ｎｏｖ ２；５．ｐｉｉ：ｅ１８８５８に開示されているように、テトラサイクリンまたはテオフィリンに感受性であるアプタザイムリボスイッチであり得る。いくつかの実施形態では、当業者であれば、導入遺伝子、およびリガンド感受性（オフスイッチ）アプタマーを含有し、その最終結果がリガンド感受性オンスイッチである、阻害性ｓｉＲＮＡの両方をコードすることができると想定される。
（ｖｉ）．他の例示的な調節スイッチ
任意の既知の調節スイッチをｃｅＤＮＡベクターで使用して、環境変化によって誘起されるものを含む、ｃｅＤＮＡベクターによって免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現を制御することができる。追加の例としては、Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８；１００５１（２０１８）のＢＯＣ方法、遺伝子コード拡張および非生理的アミノ酸、放射線制御型または超音波制御型オン／オフスイッチが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｃｏｔｔ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００ Ｊｕｌ；７（１３）：１１２１－５、米国特許第５，６１２，３１８号、同第５，５７１，７９７号、同第５，７７０，５８１号、同第５，８１７，６３６号、およびＷＯ１９９９／０２５３８５Ａ１を参照）。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許第７，８４０，２６３号、ＵＳ２００７／０１９００２８Ａ１に開示される、埋め込み可能な系によって制御され、遺伝子発現は、ｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを活性化する電磁エネルギーを含む、１つ以上のエネルギー形態によって制御される。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用が想定される調節スイッチは、低酸素媒介性またはストレス活性化スイッチ、例えば、ＷＯ１９９９／０６０１４２Ａ２、米国特許第５，８３４，３０６号、同第６，２１８，１７９号、同第６，７０９，８５８号、ＵＳ２０１５／０３２２４１０、Ｇｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ９，Ｓ３６８に開示されるものなど、ならびにＦＲＯＧ、ＴＯＡＤ、およびＮＲＳＥ要素、および条件的に誘導可能なサイレンス要素（例えば、米国特許第９，３９４，５２６号に開示される、低酸素反応要素（ＨＲＥ）、炎症反応要素（ＩＲＥ）、および剪断応力活性化要素（ＳＳＡＥ）を含む）である。そのような実施形態は、虚血後、または虚血性組織および／もしくは腫瘍において、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現をオンにするために有用である。
（ｖｉｉ）．キルスイッチ
本明細書に記載の他の実施形態は、キルスイッチを含む、本明細書に記載の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターに関する。本明細書に開示されるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞が殺傷されるか、または導入されたｃｅＤＮＡベクターを対象の系から永久に除去する手段としてプログラム細胞死を受けるようにすることができる。免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現に対するｃｅＤＮＡベクターにおけるキルスイッチの使用が、対象が許容可能に喪失し得る限定数の細胞、またはアポトーシスが望ましい細胞型（例えば、癌細胞）へのｃｅＤＮＡベクターの標的化と典型的に結びつけられ得ることは、当業者によって理解されるであろう。すべての態様では、本明細書に開示される「キルスイッチ」は、入力生存シグナルまたは他の指定条件の不在下でｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の急速かつ強固な細胞殺傷をもたらすように設計される。言い換えれば、本明細書に記載されるようなインフラマソームアンタゴニストの発現のためのｃｅＤＮＡベクターによりコードされるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の細胞生存を、特定の入力シグナルによって定義される環境に制限し得る。生物学的封じ込め機能として役立つようなキルスイッチは、対象のインフラマソームアンタゴニストのｃｅＤＮＡベクター発現を除去すること、またはコードされたインフラマソームアンタゴニストを発現しないことを保証することが望ましいはずである。
当業者に既知である他のキルスイッチは、本明細書に開示されるような、例えば、ＵＳ２０１０／０１７５１４１、ＵＳ２０１３／０００９７９９、ＵＳ２０１１／０１７２８２６、ＵＳ２０１３／０１０９５６８に開示されるような免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクター、ならびにＪｕｓｉａｋ ｅｔ ａｌ，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；２０１４；１－５６、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００４；１０１；８４１９－９、Ｍａｒｃｈｉｓｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０１１；４３；３１０－３１９、およびＲｅｉｎｓｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８，１１に開示されるキルスイッチでの使用に包含される。
したがって、いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターは、エフェクター毒素またはレポータータンパク質をコードする核酸を含むキルスイッチ核酸構築物を含むことができ、エフェクター毒素（例えば、細胞死タンパク質）またはレポータータンパク質の発現は、所定の条件によって制御される。例えば、所定の条件は、例えば外因性物質などの環境物質の存在であり得、それがなければ、細胞はデフォルトでエフェクター毒素（例えば、細胞死タンパク質）の発現を起こして殺傷される。代替的な実施形態では、所定の条件は、２つ以上の環境物質の存在であり、例えば、細胞は、２つ以上の必要な外因性物質が供給された場合のみに生き残り、いずれもなければ、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞が殺傷される。
いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を破壊するキルスイッチを組み込むように修飾され、ｃｅＤＮＡベクターによって発現する導入遺伝子のインビボ発現（例えば、インフラマソームアンタゴニストの発現）を効果的に終了させる。具体的には、ｃｅＤＮＡベクターは、通常の生理学的条件下で哺乳動物細胞では機能しないスイッチタンパク質を発現するようにさらに遺伝子操作される。このスイッチタンパク質を特異的に標的とする薬物または環境条件を投与したときのみ、スイッチタンパク質を発現する細胞が破壊され、それにより治療用タンパク質またはペプチドの発現を終了させる。例えば、ＨＳＶ－チミジンキナーゼを発現する細胞は、ガンシクロビルおよびシトシンデアミナーゼなどの薬物を投与すると殺傷される可能性があると報告された。例えば、Ｄｅｙ ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ－１ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＨＳＶ－ＴＫ），ｉｎ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｙｏｕ（２０１１）、およびＢｅｌｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６（１５）：８６９９－８７０４（１９９９）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＩＳＥ（生存遺伝子排除によって誘導される死）と称されるｓｉＲＮＡキルスイッチを含むことができる（Ｍｕｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７；８：８４６４３－８４６５８．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＩＳＥ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ）。
別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターから発現する免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、蛍光、酵素活性、分泌シグナル、または免疫細胞活性化因子などの追加の機能をさらに含む。
いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤をコードするｃｅＤＮＡは、例えば、リンカードメインをさらに含むことができる。本明細書で使用される場合、「リンカードメイン」は、本明細書に記載されるようなインフラマソームアンタゴニストのドメイン／領域のうちのいずれかを一緒に連結する、長さが約２～１００アミノ酸のオリゴまたはポリペプチド領域を指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して自由に移動できるように、グリシンおよびセリンなどの柔軟な残基を含むか、またはそれらから構成され得る。２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないようにすることが望ましい場合は、より長いリンカーを使用することができる。リンカーは、切断可能であるか、または切断不可能であり得る。切断可能なリンカーの例には、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカーまたはそれらの機能的同等物、およびそれらの組み合わせが含まれる。リンカーは、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルスに由来するＴ２Ａであるリンカー領域であり得る。
ＩＶ．ｃｅＤＮＡベクターの産生の方法
Ａ．一般的な産生
本明細書で定義されるような非対称ＩＴＲ対または対称ＩＴＲ対を含む、例えば、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターを産生するための特定の方法は、２０１８年９月７日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の第ＩＶ章に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるインフラマソームアンタゴニストの発現用ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に記載されるように、昆虫細胞を使用して産生され得る。代替的な実施形態では、本明細書に開示されるようなインフラマソームアンタゴニストの発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、２０１９年１月１８日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるように、合成的に、またいくつかの実施形態では無細胞法で産生することができる。
本明細書に記載されるように、一実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）を保有する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含むプロセスによって取得され得る。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。しかしながら、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ＡＡＶまたは他のウイルス系ベクターにおいて天然に課されるものなどのサイズ制限はない。
宿主細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡをｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化することと、消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することとによって確認され得る。
さらに別の態様では、本発明は、例えば、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ８（８）：ｅ６９８７９に記載されるように、非ウイルスＤＮＡベクターの産生において、ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株の使用を提供する。好ましくは、Ｒｅｐは、約３のＭＯＩで宿主細胞に付加される。宿主細胞株が哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し得、ヘルペスウイルスなどの第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐおよびヘルパーウイルスの存在下でのｃｅＤＮＡの切除および増幅を可能にする。
一実施形態では、例えば、本明細書に記載される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターを作製するために使用される宿主細胞は、昆虫細胞であり、バキュロウイルスは、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、例えば、図４Ａ～４Ｄおよび実施例１に記載される、ｃｅＤＮＡの非ウイルス性ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートとを両方送達するために使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｒｅｐタンパク質を発現するために操作される。
次いで、ｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞から採取され、単離される。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取および収集するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖などを考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、ｃｅＤＮＡベクターを産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大半がバキュロウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡ－ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅプラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡ－ベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。
ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターの存在は、細胞から単離されたベクターＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化することと、消化されたＤＮＡ材料および未消化のＤＮＡ材料の両方をゲル電気泳動を使用して分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することとによって確認され得る。図４Ｃおよび図４Ｄは、本明細書におけるプロセスによって産生された閉端ｃｅＤＮＡベクターの存在を同定するための一実施形態を示す。
Ｂ．ｃｅＤＮＡプラスミド
ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターを後に産生するために使用されるプラスミドである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、転写方向の作動可能に連結された構成要素として、少なくとも（１）修飾型５’ＩＴＲ配列、（２）シス調節要素を含有する発現カセット、例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、調節スイッチ、エンハンサーなど、および（３）修飾型３’ＩＴＲ配列（３’ＩＴＲ配列は、５’ＩＴＲ配列に対して非対称である）を提供する既知の技術を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲによって隣接された発現カセットは、外因性配列を導入するためのクローニング部位を含む。発現カセットは、ＡＡＶゲノムのｒｅｐおよびｃａｐコード領域を置き換える。
一態様では、免疫反応（例えば、自然免疫反応）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターは、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、導入遺伝子を含む発現カセット、および変異型または修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードする「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」と本明細書において称されるプラスミドから取得され、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いている。代替的な実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、第１の（または５’）修飾型または変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、および第２の（または３’）修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’および３’ＩＴＲは、互いに対して対称である。代替的な実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、第１の（または５’）修飾型または変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、および第２の（または３’）変異型または修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’および３’修飾型ＩＴＲは、同じ修飾を有する（すなわち、それらは互いに対して逆相補または対称である）。
さらなる実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド系は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている（すなわち、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。さらに、特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドはまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、機能的ＡＡＶ ｃａｐおよびＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（ＡＡＶ２の場合ＧＧ－３’）に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列を欠いている。
本発明のｃｅＤＮＡ－プラスミドは、当該技術分野において周知の任意のＡＡＶ血清型のゲノムの天然ヌクレオチド配列を使用して生成され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、およびＡＡＶ－ＤＪ８ゲノムに由来する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７、ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ００６２６０、ＮＣ００６２６１、Ｓｐｒｉｎｇｅｒによって維持されるＵＲＬで入手可能なＫｏｔｉｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｈｅ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ（ｗｗｗウェブアドレス：ｏｅｓｙｓ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｄｅ／ｖｉｒｕｓｅｓ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｍｋｃｈａｐｔｅｒ．ａｓｐ？ｖｉｒＩＤ＝４２．０４）（注記－ＵＲＬまたはデータベースに対する参照は、本出願の有効な出願日現在のＵＲＬまたはデータベースの内容を指す）。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、ＡＡＶ２ゲノムに由来する。別の特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、これらのＡＡＶゲノムのうちの１つに由来する５’および３’ＩＴＲに含まれるように遺伝子操作された合成骨格である。
ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクター産生細胞株の確立における使用のための選択可能または選択マーカーを任意選択的に含み得る。一実施形態では、選択マーカーは、３’ＩＴＲ配列の下流（すなわち、３’）に挿入され得る。別の実施形態では、選択マーカーは、５’ＩＴＲ配列の上流（すなわち、５’）に挿入され得る。適切な選択マーカーは、例えば、薬物耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、例えば、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子、カナマイシン、ゲネチシンなどであり得る。好ましい実施形態では、薬物選択マーカーは、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子である。
インフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の１つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ１阻害剤）の発現のための例示的なｃｅＤＮＡ（例えば、ｒＡＡＶ０）ベクターは、ｒＡＡＶプラスミドから産生される。ｒＡＡＶベクターの産生のための方法は、（ａ）宿主細胞に上記のようなｒＡＡＶプラスミドを提供することであって、宿主細胞およびプラスミドの両方が、カプシドタンパク質コード遺伝子を欠いている、提供することと、（ｂ）ｃｅＤＮＡゲノムの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、（ｃ）細胞を採取し、当該細胞から産生されたＡＡＶゲノムを単離することと、を含み得る。
Ｃ．ｃｅＤＮＡプラスミドからｃｅＤＮＡベクターを作製する例示的な方法
免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用カプシド不含ｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、特にインビボ実験に十分なベクターを提供するために十分に高い収率を有する方法もまた、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、免疫反応（例えば、自然免疫反応）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターを産生するための方法は、（１）発現カセットおよび２つの対称ＩＴＲ配列を含む核酸構築物を宿主細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中に導入するステップと、（２）任意選択的に、例えば、プラスミド上に存在する選択マーカーを使用することによってクローン細胞株を確立するステップと、（３）Ｒｅｐコード遺伝子を（当該遺伝子を担持するバキュロウイルスでのトランスフェクションまたは感染のいずれかによって）当該昆虫細胞中に導入するステップと、（４）細胞を採取し、ｃｅＤＮＡベクターを精製するステップと、を含む。ｃｅＤＮＡベクターの産生のために上記の発現カセットおよび２つのＩＴＲ配列を含む核酸構築物は、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、または下記のようにｃｅＤＮＡプラスミドで生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスの形態であり得る。核酸構築物は、トランスフェクション、ウイルス形質導入、安定した組み込み、または当該技術分野において既知の他の方法によって宿主細胞中に導入され得る。
Ｄ．細胞株：
免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターの産生において使用される宿主細胞株は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１などのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａもしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞に由来する昆虫細胞株、または他の無脊椎動物、脊椎動物、または哺乳動物細胞を含む他の真核細胞株を含み得る。当業者に既知の他の細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ－７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１１８０、単球、ならびに成熟および未成熟樹状細胞を使用することもできる。宿主細胞株は、高収率のｃｅＤＮＡベクター産生のために、ｃｅＤＮＡ－プラスミドの安定した発現のためにトランスフェクトされ得る。
ＣｅＤＮＡ－プラスミドは、当該技術分野において既知の試薬（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム）または物理的手段（例えば、電気穿孔）を使用し、一時的なトランスフェクションによってＳｆ９細胞中に導入され得る。代替的に、ｃｅＤＮＡ－プラスミドをそれらのゲノム中に安定して組み込んでいる安定したＳｆ９細胞株が確立され得る。そのような安定した細胞株は、選択マーカーを上記のｃｅＤＮＡ－プラスミド中に組み込むことによって確立され得る。細胞株をトランスフェクトするために使用されるｃｅＤＮＡ－プラスミドが、抗生物質などの選択マーカーを含む場合、ｃｅＤＮＡ－プラスミドでトランスフェクトされ、ｃｅＤＮＡ－プラスミドＤＮＡをそれらのゲノム中に組み込んでいる細胞は、細胞増殖培地への抗生物質の添加によって選択され得る。次いで、細胞の耐性クローンは、単一細胞希釈またはコロニー移動技術によって単離され、伝播され得る。
Ｅ．ｃｅＤＮＡベクターを単離し、精製する
ｃｅＤＮＡベクターを入手し、単離するためのプロセスの例は、図１～７および下記の特定の実施例に記載される。例えば、本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡ－ベクターは、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（複数可）を発現するプロデューサー細胞から得られ、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、またはｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスでさらに形質転換され得る。ｃｅＤＮＡベクターの産生に有用なプラスミドには、インフラマソームアンタゴニストをコードするプラスミド、または１つ以上のＲｅｐタンパク質をコードするプラスミドが含まれる。
一態様では、ポリヌクレオチドは、プラスミド（Ｒｅｐ－プラスミド）、バクミド（Ｒｅｐ－バクミド）、またはバキュロウイルス（Ｒｅｐ－バキュロウイルス）中のプロデューサー細胞に送達されたＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８もしくは６８）をコードする。Ｒｅｐ－プラスミド、Ｒｅｐ－バクミド、およびＲｅｐ－バキュロウイルスは、上記の方法によって生成され得る。
免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターを産生する方法は、例えば、本明細書に記載されている。本明細書に記載される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用される発現構築物は、プラスミド（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド）、バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ－バクミド）、および／またはバキュロウイルス（例えば、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）であり得る。単なる例として、ｃｅＤＮＡ－ベクターは、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスおよびＲｅｐ－バキュロウイルスに共感染した細胞から生成され得る。Ｒｅｐ－バキュロウイルスから産生されたＲｅｐタンパク質は、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを複製して、ｃｅＤＮＡ－ベクターを生成する。代替として、インフラマソームアンタゴニストの発現用のｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ－プラスミド、Ｒｅｐ－バクミド、またはＲｅｐ－バキュロウイルスで送達されるＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８／５２）をコードする配列を含む構築物で安定してトランスフェクトされた細胞から生成され得る。ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスは、細胞に一過性にトランスフェクトされ、Ｒｅｐタンパク質によって複製され、ｃｅＤＮＡベクターを産生し得る。
バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ－バクミド）は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎｉ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞などの許容昆虫細胞中にトランスフェクトされ得、対称ＩＴＲおよび発現カセットを含む配列を含む組み換えバキュロウイルスである、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを生成し得る。ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを昆虫細胞中に再度感染させて、次世代の組み換えバキュロウイルスを取得することができる。任意選択的に、このステップを一回または複数回繰り返して、より多い量の組み換えバキュロウイルスを産生することができる。
本明細書に記載される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取および収集するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖などを考慮して選択され得る。通常、細胞は、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大半がウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取され得る。ｃｅＤＮＡ－ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ ＥＮＤＯ－ＦＲＥＥ ＰＬＡＳＭＩＤ（登録商標）キットなどのプラスミド精製キットを使用して、Ｓｆ９細胞から単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ｃｅＤＮＡベクターに対して適合され得る。一般に、任意の当該技術分野において既知の核酸精製方法、ならびに市販のＤＮＡ抽出キットが採用され得る。
代替的に、細胞ペレットをアルカリ溶解プロセスに供し、得られた溶解物を遠心分離し、クロマトグラフィー分離を実施することによって、精製が実装され得る。１つの非限定例として、このプロセスは、核酸を保持するイオン交換カラム（例えば、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ Ｑ（登録商標））上に上清を装填し、次いで溶出し（例えば、１．２Ｍ ＮａＣｌ溶液で）、ゲル濾過カラム（例えば、６高速流ＧＥ）上でさらなるクロマトグラフィー精製を実施することによって実施され得る。次いで、カプシド不含ＡＡＶベクターは、例えば、沈殿によって回収される。
いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターはまた、エキソソームまたは微粒子の形態で精製され得る。多くの細胞型が、膜微小胞の脱落を介して、可溶性タンパク質だけでなく、複合タンパク質／核酸カーゴも放出することは、当該技術分野において既知である（Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ，２００９、ＥＰ１０３０６２２６．１）。そのような小胞は、微小胞（微粒子とも称される）およびエキソソーム（ナノ小胞とも称される）を含み、それらの両方が、タンパク質およびＲＮＡをカーゴとして含む。微小胞は、形質膜の直接出芽から生成され、エキソソームは、多小胞エンドソームと形質膜との融合時に細胞外環境に放出される。したがって、ｃｅＤＮＡベクターを含有する微小胞および／またはエキソソームは、ｃｅＤＮＡプラスミド、またはｃｅＤＮＡプラスミドで生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスで形質導入された細胞から単離され得る。
微小胞は、培養培地を２０，０００ｘｇでの濾過または超遠心分離、および１００，０００ｘｇでのエキソソームに供することによって単離され得る。超遠心分離の最適な期間は、実験的に決定することができ、小胞が単離される特定の細胞型に依存するであろう。好ましくは、培養培地は、最初に低速遠心分離（例えば、２０００×ｇで５～２０分間）によって一掃され、例えば、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標登録），Ｗａｔｆｏｒｄ，ＵＫ）を使用し、スピン濃度に供される。微小胞およびエキソソームは、微小胞およびエキソソーム上に存在する特定の表面抗原を認識する特定の抗体を使用することによって、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを介してさらに精製され得る。他の微小胞およびエキソソーム精製方法としては、免疫沈殿、親和性クロマトグラフィー、濾過、および特定の抗体またはアプタマーでコーティングされた磁気ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。精製時に、小胞を、例えば、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。ｃｅＤＮＡ含有小胞を送達するために微小胞またはエキソソームを使用する１つの利点は、これらの小胞が、それぞれの細胞型上の特定の受容体によって認識されるそれらの膜タンパク質上に含めることによって、様々な細胞型に標的化され得ることである。（ＥＰ１０３０６２２６も参照）
本明細書における本発明の別の態様は、ｃｅＤＮＡ構築物をそれら自体のゲノム中に安定して組み込んでいる宿主細胞株からｃｅＤＮＡベクターを精製する方法に関する。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の図５は、実施例に記載される方法を使用して、複数のｃｅＤＮＡプラスミド構築物からｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルを示す。ｃｅＤＮＡは、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される（図５Ａを参照）。
Ｖ．医薬組成物および製剤
本発明は、治療用核酸および本明細書に記載の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の１つ以上の阻害剤を含む医薬組成物および製剤を意図する。いくつかの実施形態では、治療用核酸および免疫応答（例えば、自然免疫応答）の１つ以上の阻害剤を含む医薬組成物は薬学的に許容される賦形剤または担体を含み得る。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、閉端ＤＮＡベクター、例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、閉端ＤＮＡベクター、例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターおよびＴＬＲ阻害剤（例えば、ＴＬＲ９阻害剤）、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、本明細書に記載される閉端ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクター、およびｃＧＡＳ阻害剤、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、閉端ＤＮＡベクター、例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター、およびインフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
本明細書に開示されるＤＮＡベクターは、対象の細胞、組織、または器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な医薬組成物に組み込むことができ、いくつかの実施形態では、該組成物は、本明細書に記載する免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を含む医薬組成物を含む。典型的に、医薬組成物は、本明細書に開示されるＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。例えば、本発明のＴＴＸ－ベクターは、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に好適な医薬組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。治療目的のための医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ＴＴＸ－ベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のＴＴＸ－ベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせと組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。
ＴＴＸ－ベクターを含む薬学的に活性な組成物は、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化され得、その中の導入遺伝子の治療的発現をもたらす。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
本明細書に提供される組成物およびベクターを使用して、様々な目的のために導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産生物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳動物対象における疾患状態の治療または予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で患者に導入され得る（例えば、発現され得る）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子編集分子（例えば、ヌクレアーゼ）である。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓヌクレアーゼ）である。
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の薬学的に活性な組成物は、抗ヒスタミン剤またはステロイドと併用して投与することができる。いくつかの実施形態によれば、抗ヒスタミン剤またはステロイドは、本明細書に記載の薬学的に活性な組成物と同じ組成物で投与される。いくつかの実施形態によれば、抗ヒスタミン剤またはステロイドは、本明細書に記載の薬学的に活性な組成物として別個の組成物で投与される。いくつかの実施形態によれば、抗ヒスタミン剤またはステロイドは、薬学的に活性な組成物と同時に投与される。いくつかの実施形態によれば、抗ヒスタミン剤またはステロイドは、薬学的に活性な組成物と連続して投与される。当技術分野で知られている任意の抗ヒスタミン剤を本明細書の実施形態で使用することができる。いくつかの実施形態によれば、抗ヒスタミン剤は、オンフェニラミン、ブクリジン、クロルフェニラミン、シンナリジン、クレマスチン、シクリジン、シプロヘプタジン、ジフェンヒドラミン、ジフェニルピラリン、ドキシラミン、メクロジン、フェニラミン、プロメタジン、トリプロリジン、アクリバスチン、アステミゾール、セチリジン、デスロラタジン、フェキソフェナジン、レボセチリジン、ロラタジン、ミゾラスチン、テルフェナジン、その薬学的に許容される塩、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上である。当技術分野で知られている任意のステロイドを本明細書の実施形態で使用することができる。いくつかの実施形態によれば、ステロイドは、フルオキシメステロン、メステロロン、メタンドロステノロン、ナンドロロン－ウンデカノエート、ナンドロロン－シプロネート、オキサンドロロン、オキシメトロン、ナンドロロン－ヘキシルオキシフェニルプロピオネート、テストステロン、プレドニゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン、デオキシコルチコステロン、アルドステロン、およびスタノゾロールのうちの１つ以上である。
治療目的のための医薬組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせと組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。
単位投与量
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、単位剤形で提示され得る。単位剤形は、典型的に、医薬組成物の１つ以上の投与経路に適合されるであろう。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、または舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内または脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と複合され得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となるであろう。
ＩＶ．投与および投薬
本明細書で提供される開示では、本明細書に記載される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の少なくとも１つの阻害剤および核酸（例えば、治療用核酸、研究目的で使用される核酸）を対象に投与することにより、対象（例えば、ヒト対象）の望ましくない免疫応答（例えば、自然免疫応答）を防止、低減または排除するための方法が記載され、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の投与および核酸の投与は、２剤の投与が併用して提供される場合、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の調節を提供するために時間内に相関している。これらの２剤は、合剤で同時に、異なる製剤で同時に投与することも、または別個に異なる時間で投与することもできる。
一実施形態では、本明細書に開示される発現された免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、免疫系反応を引き起こさず、むしろ、阻害剤を発現するｃｅＤＮＡベクターの投与がない場合と比較して、対象の自然免疫系を少なくとも１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％、または９５％、または９８％、または９９％、または１００％抑制する。
本明細書に記載の技術は、一般に、閉端ＤＮＡベクターを、１つ以上の免疫応答の阻害剤、例えば自然免疫応答）とともに対象に同時投与する方法を対象とし、阻害剤は、本明細書に記載するように、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、ＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ９）の阻害剤、ｃＧＡＳの阻害剤、および１つ以上のインフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）の１つ以上、またはこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、閉端ＤＮＡベクターには、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター、およびｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルス性ＤＮＡ（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶゲノム）または非ウイルス性合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルス性ミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、またはダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が含まれるが、これらに限定されない。（例えば、ＷＯ２０１０／００８６６２６を参照。その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態によれば、自然免疫応答の阻害剤および核酸は、任意の組み合わせで対象または患者に投与することができる。例えば、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の１つ以上の阻害剤を投与することができる。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、本明細書に記載の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤、および核酸（例えば、ミニサークル、ミニ遺伝子、ミニストリング共有結合性閉鎖ＤＮＡ、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル型ＤＮＡ、直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡおよびＣＥＬｉＤ）、プラスミド系環状ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）が投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、１つ以上のＴＬＲ９阻害剤および核酸を投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、１つ以上のｃＧＡＳ阻害剤および核酸を投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、１つ以上のインフラマソームアンタゴニスト、および核酸を投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、１つ以上のＴＬＲ９阻害剤、１つ以上のｃＧＡＳ阻害剤および核酸を投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、１つ以上のＴＬＲ９阻害剤、１つ以上のインフラマソームアンタゴニスト、および核酸を投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、１つ以上のＴＬＲ９阻害剤、１つ以上のｃＧＡＳ阻害剤、および核酸を含むｃｅＤＮＡベクターを投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者には、１つ以上のＴＬＲ９阻害剤、１つ以上のｃＧＡＳ阻害剤、１つ以上のインフラマソームアンタゴニスト、および核酸が投与される。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体、１つ以上のＴＬＲ９阻害剤、１つ以上のｃＧＡＳ阻害剤、１つ以上のインフラマソームアンタゴニストおよび核酸を投与される。
いくつかの実施形態では、対象は、１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤および１つ以上の核酸（例えば、ミニサークル、ミニ遺伝子、ミニストリング共有結合性閉鎖ＤＮＡ、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル型ＤＮＡ、直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡおよびＣＥＬｉＤ）、プラスミド系環状ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）を同時に投与され得る。例えば、本方法は、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤および核酸治療薬を、２つの別個の製剤としてだが同時に、対象に投与することを含み得る。別の例では、本方法は、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤および治療用核酸を１つの製剤で同時に対象に同時投与することを含み得る。
いくつかの実施形態では、対象は、１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤および１つ以上の核酸（例えば、ミニサークル、ミニ遺伝子、ミニストリング共有結合性閉鎖ＤＮＡ、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル型ＤＮＡ、直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡおよびＣＥＬｉＤ）、プラスミド系環状ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）を連続して投与され得る。例えば、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、治療用核酸の投与前に投与され得る。
連続投与の場合、１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤とＴＮＡの投与間に遅延期間があってもよい。例えば、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、ＴＮＡ投与の数時間、数日、または数週間前に（例えば、核酸投与の少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間前、および少なくとも約４週間前）投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、ＴＮＡ投与の約３０分前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約１時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約２時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約３時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約４時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約５時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約６時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約７時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約８時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約９時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約１０時間前に投与され得る。
一実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または２４時間以下前に投与される。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約１日、約２日、約３日、約４日、約６日、または約７日以下前に投与することができる。
いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または２４時間後に投与することができる。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約１日、約２日、約３日、約４日、約６日、または約７日後に投与することができる。
一実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または２４時間以下後に投与される。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸投与の約１日、約２日、約３日、約４日、約６日、または約７日以下後に投与することができる。
いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の１つ以上の阻害剤を、核酸投与の前、同時、および／または後に複数回投与することができる。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）は、単回投与または複数回投与として投与され得る。いくつかの実施形態によれば、２回用量以上を対象に投与することができる。ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシドの不在に起因して、抗カプシド宿主免疫応答を誘起しないため、複数の用量を必要に応じて投与することができる。いくつかの実施形態によれば、投与される用量の数は、例えば、２～１０以上の用量、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に開示される１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤と併せて、複数回、投与および再投与することができる。例えば、治療用核酸は、初回投薬計画における核酸投与の前、後、または同時に投与される、１つ以上の免疫応答の阻害剤とともに、０日目に投与することができる。０日目の初回治療に続いて、核酸、好ましくは本明細書に開示される１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を用いた初回治療の約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、または約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、または約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年、約１１年、約１２年、約１３年、約１４年、約１５年、約１６年、約１７年、約１８年、約１９年、約２０年、約２１年、約２２年、約２３年、約２４年、約２５年、約２６年、約２７年、約２８年、約２９年、約３０年、約３１年、約３２年、約３３年、約３４年、約３５年、約３６年、約３７年、約３８年、約３９年、約４０年、約４１歳、約４２年、約４３年、約４４年、約４５年、約４６年、約４７年、約４８年、約４９年または約５０年後に、２回目の投薬（再投与）を実施することができる。
いくつかの実施形態によれば、核酸の再投与は、核酸の発現の増加をもたらす。いくつかの実施形態によれば、初回投与後の核酸の発現と比較して、再投与後の核酸の発現の増加は、核酸の再投与後、約０．５倍～約１０倍、約１倍～約５倍、約１倍～約２倍、または約０．５倍、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、または約１０倍高い。
一般に、投与量は、ｃｅＤＮＡベクターの特定の特性、発現効率、ならびに患者の年齢、状態、および性別によって異なるだろう。投与量は、当業者が決定でき、ｃｅＤＮＡベクターは反復投与を防止する免疫活性化カプシドタンパク質を含まないため、従来のＡＡＶベクターとは異なって、合併症の場合には個々の医師により調整することもできる。
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示されるタンパク質の産生のための核酸（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の２回以上の投与（例えば、２、３、または４回以上の投与）を用いて、様々な間隔の期間にわたって、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年など、所望の遺伝子発現レベルを達成することができる。
本明細書に開示される実施形態のいずれかによれば、核酸は治療用核酸であり得る。
治療効果
自然免疫系を抑制または低減するための、本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を発現するｃｅＤＮＡベクターの有効性は、熟練医師によって決定され得る。しかしながら、自然免疫応答の兆候または症状のいずれか１つまたはすべてが有益な方法で低減および／または改変される場合、または他の臨床的に許容される疾患の症状またはマーカーが、例えば、本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤をコードするｃｅＤＮＡベクターを用いた治療後に少なくとも１０％向上または改善される場合、「有効な治療」という用語が本明細書で使用されるように、治療は「有効な治療」とみなされる。例示的なマーカーおよび症状は、本明細書の実施例で考察されている。有効性はまた、疾患の安定化、または医療介入の必要性（すなわち、疾患の進行が停止するか、少なくとも遅くなる）によって評価される個人の悪化の失敗によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、かつ／または本明細書に記載されている。治療は、個人または動物（いくつかの非限定的な例としては、ヒトまたは哺乳動物が挙げられる）における疾患の任意の治療を含み、以下：（１）疾患を阻害すること、例えば、疾患もしくは障害の進行を停止もしくは遅延させること、または（２）疾患を緩和すること、例えば、症状の軽減を引き起こすこと、および（３）疾患の発症の可能性を防止もしくは低減すること、または疾患に関連する二次的疾患／障害、例えば、肝不全または腎不全を防止することを含む。疾患の治療のための有効量とは、それを必要とする哺乳動物に投与したとき、その用語が本明細書で定義されているように、その疾患に対して有効な治療をもたらすのに十分である量を意味する。
薬剤の有効性は、所与の疾患に特有の物理的指標を評価することによって決定することができる。疾患指標の標準的な分析方法は、当技術分野で知られている。例えば、自然免疫系の物的指標には、例えば、血漿または血液中の可溶性ＣＤ１４（ｓＣＤ１４）およびＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＣＳＦまたは血液中のＡＩＭ２、ＮＬＲＰ３、ＮＬＲＰ１、ＡＳＣおよびカスパーゼ１などのインフラマソームタンパク質が含まれるが、これらに限定されず、サイトカイン経路の活性化は、ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の活性化、またはカスパーゼ１活性化の機能的な読み出しとして使用でき、インターロイキン（ＩＬ）－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１８、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、インターフェロン（ＩＦＮ）－α、単球化学誘因タンパク質（ＭＣＰ）－１、および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αなどのバイオマーカーが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される、例えば、自然免疫系の抑制に機能的である免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を発現する核酸配列を含む。好ましい実施形態では、本明細書に開示される、例えば本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、免疫系反応を引き起こさず、むしろ、対象の免疫系を抑制または低減する。
治療目的のための医薬組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高濃度の閉端ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクターに好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクターを、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせと組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。
本明細書に開示されるような、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および免疫反応（例えば、自然免疫反応）の阻害剤は、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内）、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、房内、および硝子体内）、蝸牛内、ならびに粘膜（例えば、経口、直腸、経鼻）投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。
いくつかの態様では、本明細書で提供される方法は、ｃｅＤＮＡベクターを含む１つ以上の閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を宿主細胞に送達することを含む。本明細書ではまた、そのような方法によって産生される細胞、およびそのような細胞を含むかまたはそのような細胞から産生される生物（動物、植物、または真菌など）も提供される。核酸の送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、およびＤＮＡでの薬剤強化取り込みが含まれ得る。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。送達は、細胞（例えば、インビトロもしくはエクスビボ投与）または標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであり得る。
核酸を細胞に送達するための様々な技術および方法が、当該技術分野において既知である。例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、およびラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、またはコアシェルナノ粒子に製剤化され得る。典型的に、ＬＮＰは、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）分子、１つ以上のイオン化またはカチオン性脂質（もしくはそれらの塩）、１つ以上の非イオン性または中性脂質（例えば、リン脂質）、凝集を防ぐ分子（例えば、ＰＥＧもしくはＰＥＧ－脂質複合体）、および任意選択的にステロール（例えば、コレステロール）で構成される。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を細胞に送達するための別の方法は、細胞により内在化されるリガンドと核酸を結合させることによる。例えば、リガンドは、細胞表面上の受容体に結合し、エンドサイトーシスを介して内在化され得る。リガンドは、核酸中のヌクレオチドに共有結合され得る。核酸を細胞中に送達するための例示的な複合体は、例えば、ＷＯ２０１５／００６７４０、ＷＯ２０１４／０２５８０５、ＷＯ２０１２／０３７２５４、ＷＯ２００９／０８２６０６、ＷＯ２００９／０７３８０９、ＷＯ２００９／０１８３３２、ＷＯ２００６／１１２８７２、ＷＯ２００４／０９０１０８、ＷＯ２００４／０９１５１５、およびＷＯ２０１７／１７７３２６に記載されている。
核酸、および本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターはまた、トランスフェクションによって細胞に送達され得る。有用なトランスフェクション方法としては、脂質媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー媒介性トランスフェクション、またはリン酸カルシウム沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクション試薬は、当該技術分野において周知であり、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、Ｐｒｏ－Ｊｅｃｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（商標）Ｐタンパク質トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）タンパク質送達試薬（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ（商標）タンパク質トランスフェクション試薬（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））、２９３フェクチン、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＤＭＲＩＥ－Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）（Ｒｏｃｈｅ（登録商標），Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＴＦＸ－１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））、ＴＦＸ－２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））、ＴＦＸ－５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ（登録商標），Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標））、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標），Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ－ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標），Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ １（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標），Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標））、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標））、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標））、ＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ（登録商標），Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、およびＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）が挙げられるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡなどの核酸もまた、当業者に既知のマイクロフルイディクス方法を介して細胞に送達され得る。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものであり、注入、注射、局所適用、および電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって使用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時であり、効果的な反応をもたらし得る。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および自然免疫応答の阻害剤の導入のための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に記載されている方法により、例えば、造血幹細胞に送達することができる。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターおよび免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、対象の細胞または標的器官への送達のためにリポソームに付加することができる。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。例示的なリポソームおよびリポソーム製剤は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号および２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号に開示されている。例えば、「薬学的製剤」と題されるセクションを参照されたい。
当該技術分野で既知の様々な送達方法またはその修正を使用して、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤をインビトロまたはインビボで送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、機械的、電気的、超音波、流体力学的、またはレーザー系エネルギーによって細胞膜に一時的な貫通を作製することによって送達され、それにより標的化細胞へのＤＮＡ進入が促進される。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、サイズ制限されたチャネルを通して細胞を圧搾することによるか、または当該技術分野において既知の他の手段によって細胞膜を一時的に崩壊させることにより送達され得る。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは単独で、裸のＤＮＡとして皮膚、甲状腺、心筋、骨格筋、または肝臓細胞中に直接注入される。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子銃によって送達される。カプシド不含ＡＡＶベクターでコーティングされた金またはタングステン球状粒子（１～３μｍ径）は、加圧ガスによって高速に加速され、標的組織細胞中に貫通することができる。
ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載されるラパマイシンまたはラパマイシン類似体、および薬学的に許容される担体を含む組成物は、本明細書で具体的に企図される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、脂質送達系、例えば、本明細書に記載されるリポソームで製剤化される。いくつかの実施形態では、そのような組成物は、熟練した開業医によって望まれる任意の経路によって投与される。組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介した、口腔内投与を介した、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせを含む異なる経路によって対象に投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学的慣習に従って適切に許容される製剤として投与され得る。獣医師は、特定の動物に最も適切な投薬計画および投与経路を容易に決定することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「マイクロプロジェクタイルボンバードメント遺伝子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与することができる。
場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載される１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、内臓および肢全体の骨格筋への、任意の水溶性化合物および粒子の直接細胞内送達のための単純かつ非常に効率的な方法である流体力学注射によって送達される。
場合によっては、閉端ＤＮＡのサイズおよび濃度は、この系の効率性において大きな役割を果たすため、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載される１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、膜にナノスケールの孔を作製することにより、超音波によって送達され、内臓または腫瘍の細胞へのＤＮＡ粒子の細胞内送達を促進する。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載される１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、磁場を使用してマグネトフェクションによって送達され、核酸を含む粒子を標的細胞に濃縮する。
場合によっては、化学送達系は、例えば、カチオン性リポソーム／ミセルまたはカチオン性ポリマーに属するポリカチオン性ナノマー粒子による負電荷核酸の圧縮を含むナノマー複合体を使用することによって使用され得る。送達方法に使用されるカチオン性脂質としては、一価カチオン性脂質、多価カチオン性脂質、グアニジン含有化合物、コレステロール誘導体化合物、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（エチレンイミン）、ポリ－Ｌ－リジン、プロタミン、他のカチオン性ポリマー）、および脂質－ポリマーハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
Ａ．エキソソーム：
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載される１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、エキソソームにパッケージされることによって送達される。エキソソームは、多胞体と形質膜との融合に続いて、細胞外環境中に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二層からなり、それらは、エキソソームを産生した細胞からのサイトゾルを含有し、表面上の親細胞からの膜タンパク質を呈する。エキソソームは、上皮細胞、ＢおよびＴリンパ球、マスト細胞（ＭＣ）、ならびに樹状細胞（ＤＣ）を含む様々な細胞型によって産生される。いくつかの実施形態では、１０ｎｍ～１μｍ、２０ｎｍ～５００ｎｍ、３０ｎｍ～２５０ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍの直径を有するエキソソームが、使用のために想定される。エキソソームは、それらのドナー細胞を使用するか、または特定の核酸をそれらに導入するかのいずれかによって、標的細胞への送達のために単離され得る。当該技術分野において既知の様々なアプローチを使用して、本発明のカプシド不含ＡＡＶベクターを含有するエキソソームを産生することができる。
Ｂ．微粒子／ナノ粒子：
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載されるラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、脂質ナノ粒子によって送達される。一般に、脂質ナノ粒子は、例えば、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ５（３）：４９８－５０７によって開示されているイオン化アミノ脂質（例えば、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ホスファチジルコリン（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＳＰＣ）、コレステロール、およびコート脂質（ポリエチレングリコール－ジミリストールグリセロール、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～約１０００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～約３００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２５～約２００ｎｍの直径を有する。いくつかの他の実施形態では、治療用核酸および／または免疫抑制剤を含む脂質粒子は、効果的な送達を保証するため、典型的には、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、または１５０ｎｍの平均径を有する。核酸含有脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１８／５００４２、米国特許公開第２００４／０１４２０２５号および同第２００７／００４２０３１号に開示されており、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子調製物（例えば、複数の脂質ナノ粒子を含む組成物）は、サイズ分布を有し、平均サイズ（例えば、直径）は、約７０ｎｍ～約２００ｎｍであり、より典型的に、平均サイズは、約１００ｎｍ以下である。
いくつかの実施形態によれば、核酸（例えば、治療用核酸、研究目的に使用される核酸）および／または本発明の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を含む液体医薬組成物は、脂質粒子で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、核酸を含む脂質粒子は、カチオン性脂質から形成することができる。いくつかの他の実施形態では、核酸を含む脂質粒子は、非カチオン性脂質から形成され得る。好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸を含有する脂質粒子であり、これは、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルス性ＤＮＡ（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶゲノム）または非ウイルス性合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルス性ミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、またはダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）からなる群から選択される核酸を含むカチオン性脂質から形成される。
当該技術分野で既知の様々な脂質ナノ粒子を使用して、本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターを含む、閉端ＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、脂質ナノ粒子を使用する様々な送達方法は、米国特許第９，４０４，１２７号、同第９，００６，４１７号、および同第９，５１８，２７２号に記載される。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載される１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、金ナノ粒子によって送達される。一般に、核酸は、例えば、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２（６）；１０７５－１０８３によって記載されるように、金ナノ粒子に共有結合され得るか、または金ナノ粒子に非共有結合され得る（例えば、電荷－電荷相互作用によって結合される）。いくつかの実施形態では、金ナノ粒子－核酸複合体は、例えば、米国特許第６，８１２，３３４号に記載される方法を使用して産生される。
Ｃ．複合体
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に開示される１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、本明細書に開示されるように、結合する（例えば、細胞取り込みを増加させる薬剤と共有結合する。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を通した核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物（例えば、コレステロール、トコフェロールなど）、細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）（例えば、ペネトラチン、ＴＡＴ、Ｓｙｎ１Ｂなど）、およびポリアミン（例えば、スペルミン）に複合され得る。細胞取り込みを増加させる薬剤のさらなる例は、例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ（２０１３）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４（７）；７９１－８０９に開示されている。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載される１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、本明細書に開示されるように、ポリマー（例えば、ポリマー分子）または葉酸塩分子（例えば、葉酸分子）に複合される。一般に、ポリマーに複合された核酸の送達は、例えば、ＷＯ２０００／３４３４３およびＷＯ２００８／０２２３０９に記載されるように、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，９８７，３７７号によって記載されるように、ポリ（アミド）ポリマーに複合される。いくつかの実施形態では、本開示によって記載される核酸は、米国特許第８，５０７，４５５号に記載されるように、葉酸分子に複合される。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載されるラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、本明細書に開示されるように、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号に記載されるように、炭水化物と結合する。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、凝集を防止するために他の部分と結合してもよい。そのような脂質複合体には、例えば、ジアルキルオキシプロピルと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体）、ジアシルグリセロールと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧ複合体）、コレステロールと共役したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンと共役したＰＥＧ、およびセラミドと共役したＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照）などのＰＥＧ－脂質複合体、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質複合体（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡ複合体、例えば、２０１０年１月１３日出願の米国仮出願第６１／２９４，８２８号、および２０１０年１月１４日出願の米国仮出願第６１／２９５，１４０号）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質複合体）、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ＰＯＺ－脂質複合体の追加例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質に直接結合するか、リンカー部分を介して脂質に結合することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧまたはＰＯＺを脂質に結合するのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、アミドまたはカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｄ．ナノカプセル
代替的に、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載されるラパマイシンまたはラパマイシン類似体のナノカプセル製剤は、本明細書に開示されるように使用することができる。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方式で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過装填に起因する副作用を避けるために、そのような微細粒子（およそ０．１μｍのサイズ）は、ポリマーを使用して、インビボで分解され得るように設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。
Ｅ．リポソーム
ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載される１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、対象の細胞または標的器官への送達のためにリポソームに追加することができる。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に既知である。改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号、および同第５，７９５，５８７号）。
Ｆ．例示的なリポソームおよび脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物
ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載される１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、細胞、例えば、導入遺伝子の発現を必要としている細胞への送達のためにリポソームに追加することができる。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
ｃｅＤＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号および２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号に開示されており、各々が参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に開示される方法および組成物での使用が想定されている。
いくつかの態様では、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物（複数可）に対する親水性および疎水性を提供し、投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を有する１つ以上の化合物（いわゆる「ＰＥＧ化化合物」）を含む、リポソーム製剤を提供する。または、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを追加の構成要素として含む。そのような態様では、ＰＥＧまたはＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ～約５，０００Ｄａであり得る。
いくつかの態様では、本開示は、延長放出または制御放出プロファイルを有するＡＰＩを、数時間～数週間の期間にわたって送達するであろうリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間～数週間の期間にわたってＡＰＩを放出する、高温で物理的移行を経る構成要素を有するＡＰＩを封入する。
いくつかの態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリンおよび本明細書に開示される１つ以上の脂質を含む。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、Ｏｐｔｉｓｏｍｅを含む。
いくつかの態様では、本開示は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）複合脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＤＳＰＥ（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）；ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）；ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）；ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）；ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）；ＳＭ（スフィンゴミエリン）；ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）；ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＥ（ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、硫酸コレステリル（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスファチジルコリン）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、２～１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を含む脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基およびコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－２０００－ＤＳＰＥである。いくつかの態様では、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質複合体、およびコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１つ以上の脂質、およびエタノールアミン官能基を含有する１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ、およびＤＯＰＥを含む。
いくつかの態様では、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロースおよび／またはグリシンをさらに含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０～２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。
いくつかの態様では、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱塩基を付加することにより、本明細書に開示または記載されるｃｅＤＮＡベクターで作製され、装填されたリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３まで増加させ、ＡＰＩをリポソーム中に送る。いくつかの態様では、本開示は、リポソームの内側で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、ｐＨ４～６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマーまたは非ポリマー高電荷アニオンおよびリポソーム内捕捉剤、例えばポリリン酸塩またはオクタ硫酸スクロースが利用される。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターと、イオン化脂質とを含む、脂質ナノ粒子を提供する。例えば、プロセスにより得られたｃｅＤＮＡを用いて作製および装填された脂質ナノ粒子製剤は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、本明細書に組み込まれる。これは、イオン化脂質をプロトン化し、粒子のｃｅＤＮＡ／脂質会合および核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低ｐＨでのエタノール脂質と水性ｃｅＤＮＡとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈および有機溶媒の除去によってさらに安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。
一般に、脂質粒子は、約１０：１～３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ（質量または重量）比で調製される。いくつかの実施形態では、脂質対ｃｅＤＮＡ比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、または約６：１～約９：１の範囲内であり得る。本明細書の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約１５：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する。本明細書の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する。本明細書の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約４０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する。本明細書の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約５０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する。脂質およびｃｅＤＮＡの量を調整して、所望のＮ／Ｐ比、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮ／Ｐ比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
イオン化脂質は、典型的に、核酸カーゴ、例えばｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、および膜会合および膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、イオン化脂質は、正に電荷される、または例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。イオン化脂質はまた、本明細書ではカチオン性脂質と称される。
例示的なイオン化脂質は、国際ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１５／０９５３４０号、同第ＷＯ２０１５／１９９９５２号、同第ＷＯ２０１８／０１１６３３号、同第ＷＯ２０１７／０４９２４５号、同第ＷＯ２０１５／０６１４６７号、同第ＷＯ２０１２／０４０１８４号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１５／０７４０８５号、同第ＷＯ２０１６／０８１０２９号、同第ＷＯ２０１７／００４１４３号、同第ＷＯ２０１７／０７５５３１号、同第ＷＯ２０１７／１１７５２８号、同第ＷＯ２０１１／０２２４６０号、同第ＷＯ２０１３／１４８５４１号、同第ＷＯ２０１３／１１６１２６号、同第ＷＯ２０１１／１５３１２０号、同第ＷＯ２０１２／０４４６３８号、同第ＷＯ２０１２／０５４３６５号、同第ＷＯ２０１１／０９０９６５号、同第ＷＯ２０１３／０１６０５８号、同第ＷＯ２０１２／１６２２１０号、同第ＷＯ２００８／０４２９７３号、同第ＷＯ２０１０／１２９７０９号、同第ＷＯ２０１０／１４４７４０号、同第ＷＯ２０１２／０９９７５５号、同第ＷＯ２０１３／０４９３２８号、同第ＷＯ２０１３／０８６３２２号、同第ＷＯ２０１３／０８６３７３号、同第ＷＯ２０１１／０７１８６０号、同第ＷＯ２００９／１３２１３１号、同第ＷＯ２０１０／０４８５３６号、同第ＷＯ２０１０／０８８５３７号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０１号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０６号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０５号、同第ＷＯ２０１０／０５４３８４号、同第ＷＯ２０１２／０１６１８４号、同第ＷＯ２００９／０８６５５８号、同第ＷＯ２０１０／０４２８７７号、同第ＷＯ２０１１／０００１０６号、同第ＷＯ２０１１／０００１０７号、同第ＷＯ２００５／１２０１５２号、同第ＷＯ２０１１／１４１７０５号、同第ＷＯ２０１３／１２６８０３号、同第ＷＯ２００６／００７７１２号、同第ＷＯ２０１１／０３８１６０号、同第ＷＯ２００５／１２１３４８号、同第ＷＯ２０１１／０６６６５１号、同第ＷＯ２００９／１２７０６０号、同第ＷＯ２０１１／１４１７０４号、同第ＷＯ２００６／０６９７８２号、同第ＷＯ２０１２／０３１０４３号、同第ＷＯ２０１３／００６８２５号、同第ＷＯ２０１３／０３３５６３号、同第ＷＯ２０１３／０８９１５１号、同第ＷＯ２０１７／０９９８２３号、同第ＷＯ２０１５／０９５３４６号、および同第ＷＯ２０１３／０８６３５４号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１６／０３１１７５９号、同第ＵＳ２０１５／０３７６１１５号、同第ＵＳ２０１６／０１５１２８４号、同第ＵＳ２０１７／０２１０６９７号、同第ＵＳ２０１５／０１４００７０号、同第ＵＳ２０１３／０１７８５４１号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１５／０１４１６７８号、同第ＵＳ２０１５／０２３９９２６号、同第ＵＳ２０１６／０３７６２２４号、同第ＵＳ２０１７／０１１９９０４号、同第ＵＳ２０１２／０１４９８９４号、同第ＵＳ２０１５／００５７３７３号、同第ＵＳ２０１３／００９０３７２号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５２３号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、同第ＵＳ２００９／００２３６７３号、同第ＵＳ２０１２／０１２８７６０号、同第ＵＳ２０１０／０３２４１２０号、同第ＵＳ２０１４／０２００２５７号、同第ＵＳ２０１５／０２０３４４６号、同第ＵＳ２０１８／０００５３６３号、同第ＵＳ２０１４／０３０８３０４号、同第ＵＳ２０１３／０３３８２１０号、同第ＵＳ２０１２／０１０１１４８号、同第ＵＳ２０１２／００２７７９６号、同第ＵＳ２０１２／００５８１４４号、同第ＵＳ２０１３／０３２３２６９号、同第ＵＳ２０１１／０１１７１２５号、同第ＵＳ２０１１／０２５６１７５号、同第ＵＳ２０１２／０２０２８７１号、同第ＵＳ２０１１／００７６３３５号、同第ＵＳ２００６／００８３７８０号、同第ＵＳ２０１３／０１２３３３８号、同第ＵＳ２０１５／００６４２４２号、同第ＵＳ２００６／００５１４０５号、同第ＵＳ２０１３／００６５９３９号、同第ＵＳ２００６／０００８９１０号、同第ＵＳ２００３／００２２６４９号、同第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号、同第ＵＳ２０１３／０１１６３０７号、同第ＵＳ２０１０／００６２９６７号、同第ＵＳ２０１３／０２０２６８４号、同第ＵＳ２０１４／０１４１０７０号、同第ＵＳ２０１４／０２５５４７２号、同第ＵＳ２０１４／００３９０３２号、同第ＵＳ２０１８／００２８６６４号、同第ＵＳ２０１６／０３１７４５８号、同第ＵＳ２０１３／０１９５９２０号に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡまたはＭＣ３）である：
Figure 2022518504000016
脂質ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９－８５３３に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１５／０７４０８５（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、脂質ＡＴＸ－００２である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１２／０４０１８４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（化合物３２）である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１５／１９９９５２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、化合物６または化合物２２である。
無制限に、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の２０～９０％（ｍｏｌ）を構成し得る。例えば、イオン化脂質モル含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）、または４０～５０％（ｍｏｌ）であり得る。いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％を含む。
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、非カチオン性脂質をさらに含み得る。非イオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、およびアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、またはアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を増強するために用いられる。
本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターを含む、ＤＮＡベクターを含む方法および組成物での使用が想定される例示的な非カチオン性脂質は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号、および２０１８年１２月６日に出願された同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号（これはその全体が本明細書に取り込まれる）に記載されている。
例示的な非カチオン性脂質は、国際出願公開第ＷＯ２０１７／０９９８２３号および米国特許公開第ＵＳ２０１８／００２８６６４号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０～３０％（ｍｏｌ）を構成し得る。例えば、非カチオン性脂質含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の５～２０％（ｍｏｌ）または１０～１５％（ｍｏｌ）である。様々な実施形態では、イオン化脂質対中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を全く含まない。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、膜統合性を提供するために、ステロールなどの構成要素をさらに含み得る。
脂質ナノ粒子中で使用され得る１つの例示的なステロールは、コレステロールおよびその誘導体である。例示的なコレステロール誘導体は、国際出願第ＷＯ２００９／１２７０６０号および米国特許公開第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
ステロールなどの膜統合性を提供する構成要素は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０～５０％（ｍｏｌ）を構成し得る。いくつかの実施形態では、そのような構成要素は、脂質ナノ粒子の全脂質含有量の２０～５０％（ｍｏｌ）、３０～４０％（ｍｏｌ）である。
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または複合脂質分子をさらに含み得る。一般に、これらを使用して、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、かつ／または立体安定化を提供する。例示的な複合脂質としては、ＰＥＧ－脂質複合体、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質複合体、ポリアミド－脂質複合体（ＡＴＴＡ－脂質複合体など）、カチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）複合体、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、複合脂質分子は、ＰＥＧ－脂質複合体、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）－複合脂質である。例示的なＰＥＧ－脂質複合体としては、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ））、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ－脂質複合体は、例えば、ＵＳ５，８８５，６１３、ＵＳ６，２８７，５９１、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００５／０１７５６８２、ＵＳ２００８／００２００５８、ＵＳ２０１１／０１１７１２５、ＵＳ２０１０／０１３０５８８、ＵＳ２０１６／０３７６２２４、およびＵＳ２０１７／０１１９９０４に記載されており、これらのすべての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＵＳ２０１８／００２８６６４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている化合物である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＵＳ２０１５／０３７６１１５またはＵＳ２０１６／０３７６２２４（これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスト－５－エン－３［β］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、および１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］のうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施例では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］からなる群から選択され得る。
ＰＥＧ以外の分子と複合した脂質は、ＰＥＧ－脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質複合体、ポリアミド－脂質複合体（ＡＴＴＡ－脂質複合体など）、およびカチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）複合体を、ＰＥＧ－脂質の代わりに、またはそれに加えて使用することができる。例示的な複合脂質、すなわち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質複合体、ＡＴＴＡ－脂質複合体、およびカチオン性ポリマー－脂質は、国際特許出願公開第ＷＯ１９９６／０１０３９２号、同第ＷＯ１９９８／０５１２７８号、同第ＷＯ２００２／０８７５４１号、同第ＷＯ２００５／０２６３７２号、同第ＷＯ２００８／１４７４３８号、同第ＷＯ２００９／０８６５５８号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１７／１１７５２８号、同第ＷＯ２０１７／０９９８２３号、同第ＷＯ２０１５／１９９９５２号、同第ＷＯ２０１７／００４１４３号、同第ＷＯ２０１５／０９５３４６号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、および同第ＷＯ２０１０／００６２８２号、米国特許出願公開第ＵＳ２００３／００７７８２９号、同第ＵＳ２００５／０１７５６８２号、同第ＵＳ２００８／００２００５８号、同第ＵＳ２０１１／０１１７１２５号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１８／００２８６６４号、同第ＵＳ２０１５／０３７６１１５号、同第ＵＳ２０１６／０３７６２２４号、同第ＵＳ２０１６／０３１７４５８号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、および同第ＵＳ２０１１／０１２３４５３号、ならびに米国特許第ＵＳ５，８８５，６１３号、同第ＵＳ６，２８７，５９１号、同第ＵＳ６，３２０，０１７号、および同第ＵＳ６，５８６，５５９号に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、所望の治療目的および生物作用に従って選択され得る。例えば、ＬＮＰ内のｃｅＤＮＡが、癌を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗癌剤（例えば、化学療法剤、標的癌療法（小分子、抗体、または抗体－薬物複合体を含むが、これらに限定されない）であり得る。別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗菌剤（例えば、抗生物質または抗ウイルス化合物）であり得る。さらに別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、免疫疾患または障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫応答を調節する化合物（例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、または１つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物）であり得る。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質または異なる化合物（治療剤など）をコードするｃｅＤＮＡなどの、異なる化合物を含有する異なる脂質ナノ粒子の異なるカクテルを、本発明の組成物および方法で使用することができる。
いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激剤である。
本明細書では、脂質ナノ粒子に封入されたｃｅＤＮＡベクター、および本明細書に記載のラパマイシンまたはラパマイシン類似体および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物も提供される。脂質ナノ粒子に封入されたｃｅＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物も本明細書に提供され、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、本明細書に記載の異なる組成物で対象に同時投与される。
いくつかの態様では、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤をさらに含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、および／またはグリシンをさらに含む。
ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および任意で本明細書に記載される１つ以上の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、粒子の脂質部分と結合するか、脂質ナノ粒子の脂質位置に封入することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡを含むＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子の脂質位置に完全に封入され得、それによって、例えば、水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子において本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、または６０分間のヌクレアーゼへの脂質ナノ粒子の曝露後に実質的に分解されない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、４５、もしくは６０分、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子製剤は、凍結乾燥粉末である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、非二層構造、すなわち非ラメラ（すなわち、非二層）形態を有する。制限なしに、非二重層の形態には、例えば、３次元のチューブ、ロッド、立方対称等が含まれ得る。例えば、脂質ナノ粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、ＵＳ２０１０／０１３０５８８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＣｒｙｏ－ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特性化され得る。
いくつかのさらなる実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質ナノ粒子は、高電子密度である。いくつかの態様では、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかである脂質ナノ粒子を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含む脂質ナノ粒子を提供する。
脂質構成要素の組成物および濃度を制御することによって、脂質複合体が脂質粒子外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。さらに、例えば、ｐＨ、温度、またはイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を変化および／または制御することができる。脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質複合体の組成物および濃度を制御することによって、脂質粒径を制御することができることも明らかとなるであろう。製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１７２－１７６（２０１０）を参照。それらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ｐＫａの好ましい範囲は、約５～約７である。カチオン性脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で決定され得る。
ＶＩ．免疫応答の阻害剤
本明細書では、阻害剤または免疫応答が提供される。実施形態によれば、免疫応答の阻害剤は、自然免疫応答の阻害剤である。
ラパマイシンまたはラパマイシン類似体
いくつかの態様によれば、本開示は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体と併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）を提供する。いくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、ＷＯ２０１６／０７３７９９に記載されているように、合成ナノ担体中に過飽和量で存在する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターも同じナノ担体中に存在する。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、対象にｃｅＤＮＡベクターと同時投与される。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、単一の製剤で一緒に同時投与される。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、ＷＯ２０１６／０７３７９９に記載の合成ナノ担体に過飽和濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターも同じナノ担体中に存在する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子に製剤化されたｃｅＤＮＡベクターは、同じナノ担体にも存在する。
いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、当技術分野で既知のラパマイシン類似体のいずれかであり、例えば、米国特許第５，１３８，０５１号、またはＷＯ２０１７／０４０３４１に記載されているラパマイシン類似体のいずれかであり、それぞれの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、以下に示す式Ｉの化合物である。
Figure 2022518504000017
いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、式ＩのＣ－３３上の置換基の配置が以下に示すＲ配置である式ＩＩの化合物である。
Figure 2022518504000018
いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、以下に示す式ＩＩＩの化合物、
Figure 2022518504000019
 またはその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒ１はＯＨまたはＯＣＨ３であり、Ｒ２はＨまたはＦであり、Ｒ３はＨ、ＯＨ、またはＯＣＨ３であり、Ｒ４は、ＯＨまたはＯＣＨ３である。
いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、以下に示すように、式ＩＶの単一ジアステレオマーとしての純粋なキラル型の式ＩＩＩの化合物である。
Figure 2022518504000020
いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、以下に示すように、式Ｖの単一ジアステレオマーとしての純粋なキラル型の式ＩＩＩの化合物である。
Figure 2022518504000021
いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、以下に示すように、式ＶＩの単一ジアステレオマーとしての純粋なキラル型の式ＩＩＩの化合物である。
Figure 2022518504000022
いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、以下に示すように、式ＶＩＩの単一ジアステレオマーとしての純粋なキラル型の式ＩＩＩの化合物である。
Figure 2022518504000023
いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、以下に示すように、式ＶＩＩＩの単一ジアステレオマーとしての純粋なキラル型の式ＩＩＩの化合物である。
Figure 2022518504000024
いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、以下に示す式ＩＸの化合物、
Figure 2022518504000025
 またはその薬学的に許容される塩であり、Ｒ２はＨまたはＦであり、Ｒ３はＯＨまたはＯＣＨ３であり、Ｒ４はＯＣＨ３またはＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｒ４はＯＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ４はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＦであり、Ｒ３はＯＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ４はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＯＨである。ある特定の実施形態では、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＯＨである。様々な実施形態では、式ＩＸの化合物はラセミ混合物として存在する。
したがって、いくつかの実施形態では、ラパマイシン類似体は、式Ｉ～ＩＸのうちのいずれか１つまたはその誘導体から選択される。
いくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、ＷＯ２０１６／０７３７９９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される合成ナノ担体を使用して送達または投与される。
ＷＯ２０１６／０７３７９９に記載されているように、合成ナノ担体形成中の製剤のラパマイシンの濃度は、当該製剤のラパマイシンの溶解限度と比較して、結果として生じる合成ナノ担体の免疫寛容を誘導する能力に大きな影響を与える可能性がある。さらに、そのようなラパマイシンが合成ナノ担体を通してどのように分散されるかは、結果として得られる合成ナノ担体が最初は滅菌濾過可能であるか否かに影響を及ぼす可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、形成されたナノ担体懸濁液の溶解度を超えるラパマイシンの濃度をもたらす条件下で生成された合成ナノ担体が、本明細書に記載の組成物および方法で使用される。そのような合成ナノ担体は、より持続的な免疫寛容を提供し、最初は滅菌濾過可能である。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、疎水性ポリエステル担体材料およびラパマイシンまたはラパマイシン類似体を含む合成ナノ担体を含む組成物と同時投与され、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、安定で、疎水性ポリエステル担体材料の重量に対してラパマイシンまたはラパマイシン類似体の重量に基づいて５０重量％未満が提供される過飽和量で、合成ナノ担体中に存在する。
本明細書で提供される組成物または方法のいずれか１つの一実施形態では、重量は、合成ナノ担体の製剤中に組み合わされる材料の処方重量である。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか１つの一実施形態では、重量は、結果として得られる合成ナノ担体組成物の材料の重量である。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つのいくつかの実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、４５重量％未満の安定な過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、４０重量％未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、３５重量％未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、３０重量％未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、２５重量％未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、２０重量％未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、１５重量％未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、１０重量％未満の安定な超飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、７重量％超の安定な超飽和量で存在する。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、疎水性ポリエステル担体材料は、ＰＬＡ、ＰＬＧ、ＰＬＧＡまたはポリカプロラクトンを含む。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、疎水性ポリエステル担体材料は、ＰＬＡ－ＰＥＧ、ＰＬＧＡ－ＰＥＧまたはＰＣＬ－ＰＥＧをさらに含む。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、合成ナノ担体の疎水性ポリエステル担体材料の量は、５～９５重量％の疎水性ポリエステル担体材料／全固形分である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、合成ナノ担体の疎水性ポリエステル担体材料の量は、６０～９５重量％の疎水性ポリエステル担体材料／全固形分である。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、合成ナノ担体は、ＨＬＢ値が１０以下である非イオン性界面活性剤をさらに含む。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ＨＬＢ値が１０以下である非イオン性界面活性剤は、ソルビタンエステル、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、エトキシル化脂肪アルコール、ポロクサマー、脂肪酸、コレステロール、コレステロール誘導体、または胆汁酸または塩を含む。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、１０以下のＨＬＢ値を有する非イオン性界面活性剤は、ＳＰＡＮ（登録商標）４０、ＳＰＡＮ（登録商標）２０、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、パルミチン酸イソプロピル、グリセロールモノステアレート、ＢＲＩＪ５２、ＢＲＩＪ９３、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｐ－１２３、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｌ－３１、パルミチン酸、ドデカン酸、グリセリルトリパルミテートまたはトリリノール酸グリセリルを含む。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ＨＬＢ値が１０以下である非イオン性界面活性剤はＳＰＡＮ（登録商標）４０である。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、１０以下のＨＬＢ値を有する非イオン性界面活性剤は、合成ナノ担体にカプセル化され、合成ナノ担体の表面に存在し、またはその両方である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ＨＬＢ値が１０以下である非イオン性界面活性剤の量は、０．１重量％超であるが１５重量％未満のＨＬＢ値が１０以下である非イオン性界面活性剤／疎水性ポリエステル担体材料である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ＨＬＢ値が１０以下である非イオン性界面活性剤の量は、１重量％超であるが１３重量％未満のＨＬＢ値が１０以下である非イオン性界面活性剤／疎水性ポリエステル担体材料である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ＨＬＢ値が１０以下である非イオン性界面活性剤の量は、１重量％超であるが９重量％未満のＨＬＢ値が１０以下である非イオン性界面活性剤／疎水性ポリエステル担体材料である。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、組成物は、最初は０．２２μｍフィルターを通して滅菌濾過可能である。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、合成ナノ担体の動的光散乱を使用して得られる粒径分布の平均は、１２０ｎｍ超の直径である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、直径は１５０ｎｍよりも大きい。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、直径は２００ｎｍよりも大きい。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、直径は２５０ｎｍより大きい。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、直径は３００ｎｍ未満である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、直径は２５０ｎｍ未満である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、直径は２００ｎｍ未満である。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、合成ナノ担体にカプセル化される。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つの一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
本明細書で提供される組成物または方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも１％超える過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも５％超える過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも１０％超える過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも１５％超える過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも２０％超える過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも２５％超える過飽和量で存在する。本明細書で提供される組成物または方法のいずれか１つの一実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、疎水性ポリエステル担体材料中のラパマイシンまたはラパマイシン類似体の飽和限界を少なくとも３０％超える過飽和量で存在する。
本明細書で提供される組成物または方法のいずれか１つの別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも１％超える。別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも５％超える。別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも１０％超える。別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも１５％超える。別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも２０％超える。別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも２５％超える。別の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体の量は、飽和限界を少なくとも３０％超える。
ｃＧＡＳの阻害剤
いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上のｃＧＡＳアンタゴニストと併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）を提供する。１つ以上のｃＧＡＳ阻害性ＲＮＡまたはタンパク質を部分的にコードする配列を含むｃｅＤＮＡ構築物も本明細書に提供される。
ｃＧＡＳは、細胞質ＤＮＡによって誘起されるＰＲＲの別のクラスであり、細胞質ＤＮＡはＤＮＡに結合し、ＥＲに結合したインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）を活性化する。これにより、Ｉ型インターフェロン応答が活性化され、場合によっては、黒色腫で欠損（ＡＩＭ２）、ＩＦＮ－γ誘導性タンパク質１６（ＩＦＩ１６）、インターフェロン誘導性タンパク質Ｘ（ＩＦＩＸ）、ＬＲＲＦＩＰ１、ＤＨＸ９、ＤＨＸ３６、ＤＤＸ４１、Ｋｕ７０、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＭＲＮ複合体（ＭＲＥ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１を含む）およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩを含む他の提案された細胞質ＤＮＡセンサーが活性化される。ＡＩＭ２、ＩＦＩ１６、およびＩＦＩＸは、パイリンおよびＨＩＮ２００ドメインタンパク質（ＰＹＨＩＮ）タンパク質である。さらに、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）に由来する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のステムループ構造のように、短い塩基対のＤＮＡ区間に隣接する不対のＤＮＡヌクレオチドが、配列依存的な様式でＩ型インターフェロン誘導ＤＮＡセンサーｃＧＡＳを活性化したことが示された。短い（１２～２０ｂｐ）ｄｓＤＮＡ（Ｙ型ＤＮＡ）に隣接する不対グアノシンを含むＤＮＡ構造は、非常に刺激性であり、ｃＧＡＳの酵素活性を特異的に増強した。
ｃＧＡＳは、両ＤＮＡ鎖の糖リン酸骨格と相互作用することにより、ＤＮＡに直接結合する（Ｓ．Ｒ．Ｐａｌｕｄｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ．２０１５．７９（２）：２２５）．これにより、酵素の構造変化が起こり、ヌクレオチド基質であるＡＴＰおよびＧＴＰが活性部位にアクセスできるようになり、ｃＧＡＭＰが合成される（Ａ．Ｄｅｍｐｓｅｙ ａｎｄ Ａ．Ｇ．Ｂｏｗｉｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１５ Ｍａｙ，０：１４６－１５２）。次にｃＧＡＭＰがＳＴＩＮＧに結合するため、Ｉ型インターフェロンの産生につながる（Ａ．Ｄｅｍｐｓｅｙ ａｎｄ Ａ．Ｇ．Ｂｏｗｉｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１５ Ｍａｙ，０：１４６－１５２）。重要なことに、ｃＧＡＳはＤＮＡリン酸骨格を介してのみｄｓＤＮＡと接触し、ヌクレオチド配列に依存しないセンシングをもたらす（Ａ．Ｄｅｍｐｓｅｙ ａｎｄ Ａ．Ｇ．Ｂｏｗｉｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１５ Ｍａｙ，０：１４６－１５２）。また、ｃＧＡＳは、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）に由来する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のステムループ構造のように、１２～２０ｂｐの短い塩基対のＤＮＡ区間に隣接する不対のＤＮＡヌクレオチド、特にグアノシンによって活性化できることも示されている（Ｍ．Ｈ．Ｃｈｒｉｓｔｎｅｓｅｎ ａｎｄ Ｓ．Ｒ．Ｐａｌｕｄｅｎ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１７．１４：４－１３；Ａ－Ｍ Ｈｅｒｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）。
したがって、ＰＲＲによる自然免疫活性化に重要なｃｅＤＮＡの構造的特徴には、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ＴＲＳ）を含む、修飾ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、ＩＴＲのヘアピン配列、ＲＢＳのＣＧリッチ性、ＤＮＡメチル化の欠如、および例えば、一本鎖のループＤＮＡを有し得る隣接ＩＴＲをもつ直鎖状二重鎖ＤＮＡ構造が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｃＧＡＳの阻害剤は、ｃｅＤＮＡとともに対象に同時投与される。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｃＧＡＳの阻害剤がＲＮＡまたはタンパク質配列であり、ｃｅＤＮＡは、ｃＧＡＳのＲＮＡまたはタンパク質阻害剤をコードする。
いくつかの実施形態では、ｃＧＡＳの阻害剤は、抗マラリア薬である（Ｊ．Ａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍａｒｃｈ２７，２０１５）。いくつかの実施形態では、抗マラリア薬は、アミノキノリン系またはアミノアクリジン系の抗マラリア薬である（Ｊ．Ａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍａｒｃｈ２７，２０１５）。いくつかの実施形態では、抗マラリア薬は、キナクリン（ＱＣ）、９－アミノ－６－クロロ－２－メトキシアクリジン（ＡＭＣＡ）、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）、およびクロロキン（ＣＱ）から選択される（Ｊ．Ａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍａｒｃｈ２７，２０１５）。
いくつかの実施形態では、ｃＧＡＳの阻害剤は、ｃＧＡＳの触媒ポケットに結合する小分子化合物である（Ｊ．Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７５０）。いくつかの実施形態では、ｃＧＡＳの触媒ポケットに結合する小分子化合物は、ＲＵ１６６３６５、ＲＵ２８１３３２、ＲＵ３２０５２１、ＲＵ３２０５１９、ＲＵ３２０４６１、ＲＵ３２０４６２、ＲＵ３２０５２０、ＲＵ３２０４６７、およびＲＵ３２０５８２から選択される（Ｊ．Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７５０）。いくつかの実施形態では、ｃＧＡＳの触媒ポケットに結合する小分子化合物はＲＵ３２０５２１である（Ｊ．Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７５０）。いくつかの実施形態では、ｃＧＡＳの触媒ポケットに結合する小分子化合物は、化合物１５、化合物１６、化合物１７、化合物１８、化合物１９、およびＰＦ－０６９２８２１５から選択される（Ｊ．Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：７５０；ＰＬＯＳ ＯＮＥ．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２１，２０１７）。いくつかの実施形態では、ｃＧＡＳの触媒ポケットに結合する小分子化合物は、ＰＦ－０６９２８２１５である（ＰＬＯＳ ＯＮＥ．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２１，２０１７）
いくつかの実施形態では、ｃＧＡＳの阻害剤は、ＵＳ２０１６／００６８５６０に記載されている小分子化合物のいずれかであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｃＧＡＳの阻害剤は、対象に投与されるｃｅＤＮＡによってコードされる（例えば、ｃｅＤＮＡのその後の送達を含む）。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、対象に投与されるｃｅＤＮＡによってコードされるｃＧＡＳの阻害剤は、ｃＧＡＳを阻害するＭＡＡＰＲＧＲＰＫＫＤＬＴＭＥＤＬＴＡＫＩＳＱＬＴＶＥＮＲＥＬＲＫＡＬＧＳＴＡＤＰＲＤＲＰＬＴＡＴＥＫＥＡＱＬＴＡＴＶＧＡＬＳＡＡＡＡＫＫＩＥＡＲＶＲＴＩＦＳＫＶＶＴＱＫＱＶＤＤＡＬＫＧＬＳＬＲＩＤＶＣＭＳＤＧＧＴＡＫＰＰＰＧＡＮＮＲＲＲＲＧＡＳＴＴＲＡＧＶＤＤのアミノ酸配列（配列番号８８２）を有するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ＯＲＦ５２またはその変異体である（Ｍ．Ｈ．Ｃｈｒｉｓｔｎｅｓｅｎ ａｎｄ Ｓ．Ｒ．Ｐａｌｕｄｅｎ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１７．１４：４－１３）。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、対象に投与されるｃｅＤＮＡによってコードされるｃＧＡＳの阻害剤は、ＯＲＦ５２のガンマヘルペスウイルス相同分子腫である。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、対象に投与されるｃｅＤＮＡによってコードされるｃＧＡＳの阻害剤は、本明細書では「細胞質ＬＡＮＡイソ型」とも呼ばれ、ｃＧＡＳを阻害するカポジ肉腫ヘルプレスウイルスＬＡＮＡ（潜伏期関連核抗原）の細胞質イソ型、またはその変異体である（Ｚｈａｎｇ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１６ Ｆｅｂ ２３；１１３（８）：Ｅ１０３４－４３）。ＬＡＮＡまたはＯＲＦ７３は、以下の１１２９個のアミノ酸の配列を有する：ＭＡＰＰＧＭＲＬＲＳＧＲＳＴＧＡＰＬＴＲＧＳＣＲＫＲＮＲＳＰＥＲＣＤＬＧＤＤＬＨＬＱＰＲＲＫＨＶＡＤＳＶＤＧＲＥＣＧＰＨＴＬＰＩＰＧＳＰＴＶＦＴＳＧＬＰＡＦＶＳＳＰＴＬＰＶＡＰＩＰＳＰＡＰＡＴＰＬＰＰＰＡＬＬＰＰＶＴＴＳＳＳＰＩＰＰＳＨＰＶＳＰＧＴＴＤＴＨＳＰＳＰＡＬＰＰＴＱＳＰＥＳＳＱＲＰＰＬＳＳＰＴＧＲＰＤＳＳＴＰＭＲＰＰＰＳＱＱＴＴＰＰＨＳＰＴＴＰＰＰＥＰＰＳＫＳＳＰＤＳＬＡＰＳＴＬＲＳＬＲＫＲＲＬＳＳＰＱＧＰＳＴＬＮＰＩＣＱＳＰＰＶＳＰＰＲＣＤＦＡＮＲＳＶＹＰＰＷＡＴＥＳＰＩＹＶＧＳＳＳＤＧＤＴＰＰＲＱＰＰＴＳＰＩＳＩＧＳＳＳＰＳＥＧＳＷＧＤＤＴＡＭＬＶＬＬＡＥＩＡＥＥＡＳＫＮＥＫＥＣＳＥＮＮＱＡＧＥＤＮＧＤＮＥＩＳＫＥＳＱＶＤＫＤＤＮＤＮＫＤＤＥＥＥＱＥＴＤＥＥＤＥＥＤＤＥＥＤＤＥＥＤＤＥＥＤＤＥＥＤＤＥＥＤＤＥＥＤＤＥＥＥＤＥＥＥＤＥＥＥＤＥＥＥＤＥＥＥＥＥＤＥＥＤＤＤＤＥＤＮＥＤＥＥＤＤＥＥＥＤＫＫＥＤＥＥＤＧＧＤＧＮＫＴＬＳＩＱＳＳＱＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＲＥＰＱＱＲＥＰＱＱＲＥＰＱＱＲＥＰＱＱＲＥＰＱＱＲＥＰＱＱＲＥＰＱＱＲＥＰＱＱＲＥＰＱＱＲＥＰＱＱＲＥＰＱＱＲＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＥＰＱＱＱＤＥＱＱＱＤＥＱＱＱＤＥＱＱＱＤＥＱＱＱＤＥＱＱＱＤＥＱＱＱＤＥＱＱＱＤＥＱＥＱＱＤＥＱＱＱＤＥＱＱＱＱＤＥＱＥＱＱＥＥＱＥＱＱＥＥＱＱＱＤＥＱＱＱＤＥＱＱＱＤＥＱＱＱＤＥＱＥＱＱＤＥＱＱＱＤＥＱＱＱＱＤＥＱＥＱＱＥＥＱＥＱＱＥＥＱＥＱＱＥＥＱＥＱＱＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＬＥＥＱＥＱＥＱＥＬＥＥＶＥＥＱＥＱＥＱＥＥＱＥＬＥＥＶＥＥＱＥＱＥＱＥＥＱＥＥＱＥＬＥＥＶＥＥＱＥＥＱＥＬＥＥＶＥＥＱＥＥＱＥＬＥＥＶＥＥＱＥＱＱＧＶＥＱＱＥＱＥＴＶＥＥＰＩＩＬＨＧＳＳＳＥＤＥＭＥＶＤＹＰＶＶＳＴＨＥＱＩＡＳＳＰＰＧＤＮＴＰＤＤＤＰＱＰＧＰＳＲＥＹＲＹＶＬＲＴＳＰＰＨＲＰＧＶＲＭＲＲＶＰＶＴＨＰＫＫＰＨＰＲＹＱＱＰＰＶＰＹＲＱＩＤＤＣＰＡＫＡＲＰＱＨＩＦＹＲＲＦＬＧＫＤＧＲＲＤＰＫＣＱＷＫＦＡＶＩＦＷＧＮＤＰＹＧＬＫＫＬＳＱＡＦＱＦＧＧＶＫＡＧＰＶＳＣＬＰＨＰＧＰＤＱＳＰＩＴＹＣＶＹＶＹＣＱＮＫＤＴＳＫＫＶＱＭＡＲＬＡＷＥＡＳＨＰＬＡＧＮＬＱＳＳＩＶＫＦＫＫＰＬＰＬＴＱＰＧＥＮＱＧＰＧＤＳＰＱＥＭＴ（配列番号８８３）。
本明細書に記載のｃｅＤＮＡとともに使用するための切断された細胞質ＬＡＮＡイソ型の非限定的な例は、ＬＡＮＡΔ１６１または配列番号５３２（配列番号８８４のアミノ酸１６１～１１６２を欠く）である。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｃＧＡＳの阻害剤は、ｃＧＡＳに結合する抗体または抗原結合断片である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｃＧＡＳに結合する抗体または抗原結合断片は、ｃｅＤＮＡによってコードされる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｃＧＡＳの阻害剤は、ｃＧＡＳに特異的なｓｉＲＮＡなどのｃＧＡＳのＲＮＡ阻害剤である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｃＧＡＳのＲＮＡ阻害剤はｃｅＤＮＡによってコードされる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｃＧＡＳの阻害剤は、ｍｉＲ－２５（ＧＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＣＴＴＧＧＧＣＡＡＴＴＧＣＴＧＧＡＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＴＣＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＣＧＧＣＣ、配列番号８８５）およびｍｉＲ－９３（ＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧＣＡＧＧＴＡＧＴＧＴＧＡＴＴＡＣＣＣＡＡＣＣＴＡＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＡＧＣＡＣＴＴＣＣＣＧＡＧＣＣＣＣＣＧＧ、配列番号８８６）などのｃＧＡＳのｍｉＲＮＡ阻害剤である１１。ｍｉＲ－２５およびｍｉＲ－９３は、ｃＧＡＳの抑制につながるｃＧＡＳ発現の基底レベルを維持するエピジェネティック因子である核内受容体コアクチベーター３（ＮＣＯＡ３）を標的にすると考えられている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９（１０）：１２８６－１２９６）。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｃＧＡＳのｍｉＲＮＡ阻害剤は、ｃｅＤＮＡによってコードされる。
ＴＬＲの阻害剤
いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上のＴＬＲアンタゴニストと併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）を提供する。１つ以上のＴＬＲ阻害オリゴヌクレオチドを部分的にコードする配列を含むｃｅＤＮＡ構築物も本明細書で提供される。いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上のＴＬＲ９アンタゴニストと併せて投与される、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）を提供する。１つ以上のＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドを部分的にコードする配列を含むｃｅＤＮＡ構築物も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態によれば、ＴＬＲ９阻害剤は小分子アンタゴニストである。別の実施形態では、ＴＬＲ９阻害剤は、ＴＬＲ９に対する抗体である。いくつかの実施形態によれば、ＴＬＲ９抗体はモノクローナル抗体である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列などのｃｅＤＮＡの１つ以上の末端構造要素は、ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドの配列を含む。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドは、以下の特徴のうちの１つ以上を有する。（ｉ）３’末端の３つの連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）５’末端のＣＣ（Ｔ）トリプレット、および（ｉｉｉ）最適には３～５ヌクレオチドの長さである、５’ＣＣ（Ｔ）と下流のＧＧＧトリプレットとの間の距離。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドは、５’ＣＣＴＮ（３－５）Ｇ（３－５）ＲＲ３’（配列番号８８７）の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドは、隣接するＧ間に鎖内および／または鎖間のフーグスティーン水素結合を有しない。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドは、Ｇ４スタッキング特性を有するクラスＧ ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドであり、ＴＴＡＧＧＧｎ（配列番号８８８）を含む阻害オリゴヌクレオチドなど、複数のＧ３トリプレットまたはＧ４テトラドを含む。そのようなクラスＧ ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドの非限定的な例には、ＯＤＮ－２０８８（ＴＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８８９）、ＯＤＮ－２１１４（ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８９０）、ポリＧ（ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、配列番号８９１）、ＯＤＮ－Ａ１５１（ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ、配列番号８９２）、Ｇ－ＯＤＮ（ＣＴＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＧＴＴＴＣＣＴＡＴ、配列番号８９３）、およびＩＲＳ－８６９（ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ、配列番号８９４）、およびＡＳ１４１１（ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ、配列番号９０３）が含まれる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドは、パリンドロームであるおよび／または短い５’または３’オーバーハングを有するなどの特徴を有するクラスＲ ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチド、例えばＩＮＨ－１阻害オリゴヌクレオチドである。このようなクラスＲ ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドの非限定的な例には、ＩＮＨ－１（ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧ、配列番号８９５）、ＩＮＨ－４（ＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ、配列番号８９６）、およびＩＲＳ－６６１（ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ、配列番号８９７）が含まれる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドは、直鎖状特性および５’ＣＣ（Ｔ）→ＧＧＧ－３’モチーフを有するクラスＢ ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチド、例えばＩＮＨ－１８阻害オリゴヌクレオチドである。このようなクラスＢ ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドの非限定的な例には、ＯＤＮ－２０８８（ＴＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８８９）、ＯＤＮ－２１１４（ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８９０）、４０２４（ＴＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８９８）、４０８４Ｆ（ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ、配列番号８９９）、ＩＮＨ－１３（ＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ、配列番号９００）、ＩＮＨ－１８（ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＡ、配列番号９０１）、Ｇ－ＯＤＮ（ＣＴＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＧＴＴＴＣＣＴＡＴ、配列番号８９３）、ＩＲＳ－８６９（ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ、配列番号８６４）、ＩＲＳ－９５４ ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ、配列番号９０２）、およびＡＳ１４１１（ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ、配列番号９０３）が含まれる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、導入遺伝子配列などのｃｅＤＮＡによってコードされるコード配列は、選択されたアミノ酸のコドントリプレット内に割り当てられたＣｐＧジヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドを欠く同じアミノ酸のコドントリプレットに変更されるように修飾される。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９の阻害剤がＲＮＡまたはタンパク質配列であり、ｃｅＤＮＡは、ＴＬＲ９のＲＮＡまたはタンパク質阻害剤をコードする。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９の阻害剤は、ＴＬＲ９に結合する抗体または抗原結合断片である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９に結合する抗体または抗原結合断片は、ｃｅＤＮＡによってコードされる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９の阻害剤は、ｃｅＤＮＡとともに対象に同時投与される。ＴＬＲ９の阻害剤の非限定的な例は、「Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｔｏｌｌ－Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＴＬＲ）７ ａｎｄ ９」、Ｐ．Ｓ．Ｌｅｎｅｒｔ，Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２０１０，９８６５９６、ＵＳ２０１５／０２０３８５０、およびＵＳ２０１７／０２６８００に見出すことができ、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
したがって、本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９の阻害剤は、ｃｅＤＮＡとともに対象に同時投与される。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９の阻害剤は、対象に投与されるｃｅＤＮＡによってシス位でコードされる（例えば、ｃｅＤＮＡのその後の送達を含む）。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９の阻害剤は、対象に投与されるｃｅＤＮＡによってトランスで投与される。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９の阻害剤は、ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドである。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドは、以下の特徴のうちの１つ以上を有する。（ｉ）３’末端の３つの連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）５’末端のＣＣ（Ｔ）トリプレット、および（ｉｉｉ）５’ＣＣ（Ｔ）と下流のＧＧＧトリプレットの間の距離が、最適には３～５ヌクレオチドの長さであること。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドは、５’ＣＣＴＮ（３－５）Ｇ（３－５）ＲＲ３’（配列番号８８７）の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドは、隣接するＧ間に鎖内および／または鎖間のフーグスティーン水素結合を有さない。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９の阻害剤は、ＴＬＲ９に結合する抗体または抗原結合断片である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９に結合する抗体または抗原結合断片は、ｃｅＤＮＡによってコードされる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＴＬＲ９阻害剤は、エンドソーム酸性化の阻害剤、例えばクロロキンである。
インフラマソームアンタゴニスト
ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤：
いくつかの実施形態では、インフラマソームアンタゴニストはＮＬＲＰ３を阻害する。「ＮＬＲＰ３」という用語は、クリオピリンとも呼ばれ、ＮＯＤ様受容体ファミリー、ピリンドメインを含有する３）インフラマソームまたはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメインを含むタンパク質３（ＮＡＬＰ３）（クリオピリンとしても知られる）、低温誘導性自己炎症性症候群１（ＣＩＡＳ１）、毛虫様受容体１．１（ＣＬＲ１．１）またはピリンドメイン含有Ａｐａｆｌ様タンパク質１（ＰＹＰＡＦ１）を指す。ＮＡＬＰ３は、別名、すなわちＮＬＲＰ３ ＰＹＤ－ＮＡＣＨＴ－ＮＡＤ－ＬＲＲ ＮＡＬＰ３ Ｃｉａｓ１、Ｐｙｐａｆ１、Ｍｍｉｇ１ ＰＹＤ－ＮＡＣＨＴ－ＮＡＤ－ＬＲＲ．）でも知られている。ＮＬＲＰ３は、ＮＬＲＰ３タンパク質、ＡＳＣ（ＣＡＲＤを含むアポトーシス関連斑点様タンパク質）およびプロカスパーゼ１からなる多タンパク質オリゴマーの構成要素である。
本明細書の方法および組成物での使用に包含されるＮＬＲＰ３阻害剤は、Ｓｈａｏ，Ｂｏ－Ｚｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．“ＮＬＲＰ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．” Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６（２０１５）：２６２、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２０１７，９７；９２２－９３４に開示されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤は、ＭＣＣ９５０またはその機能的誘導体である。ＭＣＣ９５０は、次式を有し、
Figure 2022518504000026
 ＮＬＲＰ３の強力で選択的な阻害剤である。ＭＣＣ９５０は、インフラマソームアダプタータンパク質ＡＳＣ（ＣＡＲＤを含むアポトーシス関連斑点様タンパク質）のオリゴマー形成を防止することにより、ＡＴＰ、ＭＳＵ、およびニゲリシンなどのＮＬＲＰ３アクチベーターによって誘導されるＩＬ－１βの放出を遮断する（Ｃｏｌｌ ＲＣ．ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ａ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ＮＬＲＰ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ２１（３），２４８－２５５、Ｇｕｏ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ，ｒｏｌｅ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２１（７）：６７７－８７、Ｒｅｎ，Ｈｏｎｇｌｅｉ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＮＬＲＰ３（Ｐｙｒｉｎ Ｄｏｍａｉｎ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３）Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｊｕｒｙ Ａｆｔｅｒ Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ．” Ｓｔｒｏｋｅ（２０１７）：ＳＴＲＯＫＥＡＨＡ－１１７．）。
いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤は、以下の構造を有するＢａｙ１１－７０８２である。
Figure 2022518504000027
 ＮＦ－κＢ活性に及ぼす阻害効果とは無関係にマクロファージのＮＬＲＰ３インフラマソーム活性を、選択的に阻害することも報告された（Ｊｕｌｉａｎａ Ｃ．ｅｔ ａｌ，２０１０．Ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅ ａｎｄ Ｂａｙ１１－７０８２ Ａｒｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８５（１３）：９７９２－９８０２］。
いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤は、以下の構造を有するグリベンクラミド（グリブリドとしても知られる）である。
Figure 2022518504000028
 これは、Ｋ＋排出を阻害することにより、カスパーゼ－１およびプロＩＬ－１βの成熟を遮断する（Ｌａｌｉｂｅｒｔｅ ＲＥ．ｅｔ ａｌ．，１９９９．ＡＴＰ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃａｓｐａｓｅ－１ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７４（５２）：３６９４４－５１）。グリベンクラミドは、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰ、および結晶性物質によって誘導されるＮＲＬＰ３インフラマソームの活性化も強力に遮断する（Ｌａｍｋａｎｆｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ Ｃｒｙｏｐｙｒｉｎ／Ｎａｌｐ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１８７：６１－７０、Ｄｏｓｔｅｒｔ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｍａｌａｒｉａｌ ｈｅｍｏｚｏｉｎ ｉｓ ａ Ｎａｌｐ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｄａｎｇｅｒ ｓｉｇｎａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．４（８）：ｅ６５１０）。
いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤は、以下の構造を有するイソリキリチゲニン（ＩＬＧとしても知られる）である。
Figure 2022518504000029
 これは、カンゾウ根（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）から単離されたカルコン型フラボノイドであり、ＮＬＲＰ３活性化ＡＳＣオリゴマー形成を阻害することが報告された（Ｈｏｎｄａ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ｉｓｏｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＮＬＲＰ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｅｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．９６（６）：１０８７－１００．）。ＮＬＲＰ３依存性のＩＬ－１β産生は、低濃度のイソリキリチゲニン（１～１０μＭ）で阻害され、イソリキリチゲニンがプライミングステップと活性化ステップの両方でＮＬＲＰ３インフラマソームを遮断できることを示している。
いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤は、６６７３－３４－０（５－クロロ－２－メトキシ－Ｎ－［２－（４－スルファモイルフェニル）－エチル］－ベンズアミド））であり、これは、米国出願第ＵＳ２０１６／００５２８７６号に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤は、ＵＳ２０１６／００５２８７６に記載されている小分子化合物のいずれかであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤は、Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｃｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｈａｅｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９ ａｎｄ 米国特許第７，４９８，４６０号に開示されているシステイニルロイコトリエン受容体アンタゴニストであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。システイニルロイコトリエン受容体アンタゴニストは、ＡＳＣのオリゴマー形成を防止することによって、ＮＬＲＰ３とＡＩＭ２の両インフラマソーム誘発性ＩＬ－１プロセシングを阻害することが報告されており、同様に、インフラマソーム形成のアダプターの役割とは異なり、自然免疫応答においてさらに役割を果たしているようである（Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３およびＡＩＭ２を標的とする小分子阻害剤が特徴付けられており、（Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）に広く記載されている。これらの大部分は、インフラマソームを標的とするために再利用された薬理学的阻害剤であり（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、パルテノライド（Ｊｕｌｉａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、Ｂａｙ １１－７０８（Ｊｕｌｉａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、ＣＲＩＤ３（Ｃｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、オーラノフィン（Ｉｓａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、イソリキリチゲニン（Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、３，４－メチレンジオキシ－＊－ニトロスチレン（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、シクロペンテノンプロスタグランジン１５ｄ－ＰＪ２（Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）および ２５－ヒドロキシコレステロール（２５－ＨＣ）（Ｒｅｂｏｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）が含まれる。さらに、Ｉ型インターフェロンは、ほとんど解明されていないメカニズムでインフラマソームの活性化を抑制することも示されている（Ｇｕａｒｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。しかしながら、最近、ＩＦＮ刺激遺伝子産物であるコレステロール２５－ヒドロキシラーゼ（Ｃｈ２５ｈ）がＩｌ１ｂ転写ならびにＮＬＲＰ３、ＮＬＲＣ４およびＡＩＭ２インフラマソーム活性化の両方と拮抗することが実証され、これはＣｈ２５ｈが複数のインフラマソームの広い阻害活性を有することを示している（Ｒｅｂｏｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
ＮＬＲＰ３は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００４８９５．１（配列番号５３０）、ＮＭ＿１８３３９５（配列番号５３１）、ＮＭ＿００１０７９８２１（配列番号５３２）、ＮＭ＿００１１２７４６１（配列番号５３３）およびＮＭ＿００１１２７４６２（配列番号５３４）によってコードされる。ここで、ＮＬＲＰ３の翻訳開始コドンは、これらのＮＣＢＩ受託番号のそれぞれに記載される翻訳開始コドンから６ヌクレオチド下流に位置するコドンであることが好ましい。変異型ＮＬＲＰ３遺伝子の例としては、翻訳開始コドンから数えて１７０９番目（ＮＣＢＩ受入番号で示されるコード領域の場合、翻訳開始コドンから数えて１７１５番目）のアデニンがグアニン、翻訳開始コドンから数えて１０４３番目（ＮＣＢＩ受入番号で示されるコード領域では１０４９番目）のシトシンがチミン、または翻訳開始コドンから数えて５８７番目（ＮＣＢＩ受入番号で示されるコード領域では５９３番目）のグアニンがアデニンであるＮＬＲＰ３遺伝子が挙げられる。ＮＬＲＰ３は、１０７９番目のヌクレオチドがグアニンに変異したものであることが好ましい。当業者が理解するように、機能的に同等のＮＬＲＰ３をコードし、少なくとも部分的にカスパーゼ－１を活性化し、および／またはインターロイキン１βおよびインターロイキン１８などの炎症性サイトカインの成熟を促進する機能を維持するＮＬＲＰ３遺伝子の変異体が存在し得る。したがって、そのような機能的に同等のＮＬＲＰ３は、活性を消失しないアミノ酸の置換、欠失、または付加を組み込んでもよい。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤は、ＮＬＲＰ３に特異的なｓｉＲＮＡなど、ＮＬＲＰ３のＲＮＡ阻害剤（ＲＮＡｉ）である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３のＲＮＡ阻害剤は、ｃｅＤＮＡによってコードされる。ＮＬＲＰ３ ｓｉＲＮＡは、例えば、ＳＩ０３０６０３２３（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））など、市販されている場合もある。
いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３の阻害剤は、ｃｅＤＮＡにコードされるＲＮＡｉである。疑義を回避するため、ヒトＮＬＲＰ３タンパク質のアミノ酸配列は、ＮＭ＿００４８９５．１（配列番号５３９）に対応し、以下のとおりである。
ＭＫＭＡＳＴＲＣＫＬＡＲＹＬＥＤＬＥＤＶＤＬＫＫＦＫＭＨＬＥＤＹＰＰＱＫＧＣＩＰＬＰＲＧ
ＱＴＥＫＡＤＨＶＤＬＡＴＬＭＩＤＦＮＧＥＥＫＡＷＡＭＡＶＷＩＦＡＡＩＮＲＲＤＬＹＥＫＡＫＲＤＥＰＫＷＧＳＤＮＡＲＶＳ
ＮＰＴＶＩＣＱＥＤＳＩＥＥＥＷＭＧＬＬＥＹＬＳＲＩＳＩＣＫＭＫＫＤＹＲＫＫＹＲＫＹＶＲＳＲＦＱＣＩＥＤＲＮＡＲＬＧＥ
ＳＶＳＬＮＫＲＹＴＲＬＲＬＩＫＥＨＲＳＱＱＥＲＥＱＥＬＬＡＩＧＫＴＫＴＣＥＳＰＶＳＰＩＫＭＥＬＬＦＤＰＤＤＥＨＳＥＰ
ＶＨＴＶＶＦＱＧＡＡＧＩＧＫＴＩＬＡＲＫＭＭＬＤＷＡＳＧＴＬＹＱＤＲＦＤＹＬＦＹＩＨＣＲＥＶＳＬＶＴＱＲＳＬＧＤＬＩ
ＭＳＣＣＰＤＰＮＰＰＩＨＫＩＶＲＫＰＳＲＩＬＦＬＭＤＧＦＤＥＬＱＧＡＦＤＥＨＩＧＰＬＣＴＤＷＱＫＡＥＲＧＤＩＬＬＳＳ
ＬＩＲＫＫＬＬＰＥＡＳＬＬＩＴＴＲＰＶＡＬＥＫＬＱＨＬＬＤＨＰＲＨＶＥＩＬＧＦＳＥＡＫＲＫＥＹＦＦＫＹＦＳＤＥＡＱＡ
ＲＡＡＦＳＬＩＱＥＮＥＶＬＦＴＭＣＦＩＰＬＶＣＷＩＶＣＴＧＬＫＱＱＭＥＳＧＫＳＬＡＱＴＳＫＴＴＴＡＶＹＶＦＦＬＳＳＬ
ＬＱＰＲＧＧＳＱＥＨＧＬＣＡＨＬＷＧＬＣＳＬＡＡＤＧＩＷＮＱＫＩＬＦＥＥＳＤＬＲＮＨＧＬＱＫＡＤＶＳＡＦＬＲＭＮＬＦ
ＱＫＥＶＤＣＥＫＦＹＳＦＩＨＭＴＦＱＥＦＦＡＡＭＹＹＬＬＥＥＥＫＥＧＲＴＮＶＰＧＳＲＬＫＬＰＳＲＤＶＴＶＬＬＥＮＹＧ
ＫＦＥＫＧＹＬＩＦＶＶＲＦＬＦＧＬＶＮＱＥＲＴＳＹＬＥＫＫＬＳＣＫＩＳＱＱＩＲＬＥＬＬＫＷＩＥＶＫＡＫＡＫＫＬＱＩＱ
ＰＳＱＬＥＬＦＹＣＬＹＥＭＱＥＥＤＦＶＱＲＡＭＤＹＦＰＫＩＥＩＮＬＳＴＲＭＤＨＭＶＳＳＦＣＩＥＮＣＨＲＶＥＳＬＳＬＧ
ＦＬＨＮＭＰＫＥＥＥＥＥＥＫＥＧＲＨＬＤＭＶＱＣＶＬＰＳＳＳＨＡＡＣＳＨＧＬＶＮＳＨＬＴＳＳＦＣＲＧＬＦＳＶＬＳＴＳ
ＱＳＬＴＥＬＤＬＳＤＮＳＬＧＤＰＧＭＲＶＬＣＥＴＬＱＨＰＧＣＮＩＲＲＬＷＬＧＲＣＧＬＳＨＥＣＣＦＤＩＳＬＶＬＳＳＮＱ
ＫＬＶＥＬＤＬＳＤＮＡＬＧＤＦＧＩＲＬＬＣＶＧＬＫＨＬＬＣＮＬＫＫＬＷＬＶＳＣＣＬＴＳＡＣＣＱＤＬＡＳＶＬＳＴＳＨＳ
ＬＴＲＬＹＶＧＥＮＡＬＧＤＳＧＶＡＩＬＣＥＫＡＫＮＰＱＣＮＬＱＫＬＧＬＶＮＳＧＬＴＳＶＣＣＳＡＬＳＳＶＬＳＴＮＱＮＬ
ＴＨＬＹＬＲＧＮＴＬＧＤＫＧＩＫＬＬＣＥＧＬＬＨＰＤＣＫＬＱＶＬＥＬＤＮＣＮＬＴＳＨＣＣＷＤＬＳＴＬＬＴＳＳＱＳＬＲ
ＫＬＳＬＧＮＮＤＬＧＤＬＧＶＭＭＦＣＥＶＬＫＱＱＳＣＬＬＱＮＬＧＬＳＥＭＹＦＮＹＥＴＫＳＡＬＥＴＬＱＥＥＫＰＥＬＴＶ
ＶＦＥＰＳＷ（配列番号５３９）
ヒトＮＬＲＰ３タンパク質は、核酸配列ＮＭ＿００４８９５．１（配列番号５３０）、ＮＭ＿１８３３９５（配列番号５３１）、ＮＭ＿００１０７９８２１（配列番号５３２）、ＮＭ＿００１１２７４６１（配列番号５３３）およびＮＭ＿００１１２７４６２（配列番号５３４）を含むＮＬＲＰ３遺伝子によってコードされ、ヒトＮＬＲＰ３タンパク質は、ＮＭ＿００４８９５（配列番号５３９）のアミノ酸を有する。
ＮＬＲＰ３阻害剤はアンチセンスポリヌクレオチドをさらに含み、これを使用して、ＮＬＲＰ３遺伝子転写を阻害し、それによりＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を阻害することができる。ＮＬＲＰ３をコードするポリヌクレオチドのセグメント（例えば、配列番号５３０～５３４に記載のポリヌクレオチド）に相補的なポリヌクレオチドは、ＮＬＲＰ３をコードするｍＲＮＡに結合し、そのようなｍＲＮＡの翻訳を阻害するように設計されている。アンチセンスポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターによってコードされ、任意で、本明細書に開示される組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結され得る。
ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡの阻害は、当業者に一般的に知られている方法に従って、ＲＮＡｉ分子を遺伝子サイレンシングすることによるものであり得る。例えば、ヒトＮＬＲＰ３（ＮＭ＿００４８９５．１）を特異的に標的とする遺伝子サイレンシングｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二本鎖は、ＮＬＲＰ３発現をノックダウンするために容易に使用できる。ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを使用して首尾よく標的化することができ、標的ｍＲＮＡの既知の配列に基づいて、当業者は他のｓｉＲＮＡ分子を容易に調製することができる。したがって、疑義を回避するために、当業者は、以下のようなＮＭ＿００４８９５．１の核酸配列に対するＲＮＡｉ（ＲＮＡサイレンシング）剤などの核酸阻害剤を設計することができる。
Figure 2022518504000030
Figure 2022518504000031
いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤はｓｉＲＮＡであり、それによりＮＬＲＰ３インフラマソームのｍＲＮＡを阻害する。いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤は、ヒトＮＬＲＰ３発現を阻害するＧＵＧＣＡＵＵＧＡＡＧＡＣＡＧＧＡＡＵＴＴ（配列番号５４０）（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔ．（２０１７）９７：９２２－９３４、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、またはその断片またはそれと少なくとも５０％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％同一な相同体である。いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソーム阻害剤は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（登録商標）（カタログ番号ｓｃ－４０３２７）から入手可能なものなど、市販のｓｉＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソーム阻害剤は、ヒトＮＭ＿００１０７９８２１．２、ＮＣＢＩ遺伝子１１４５４８（ＮＬＲＰ３）におけるＲＮＡｉ標的配列に相補的なＲＮＡｉである。ＮＬＲＰ３を阻害するＲＮＡｉ剤は、表５Ａに示す配列番号５４１～５５１の１７～２１個の連続した塩基に相補的な核酸であり得る。
Figure 2022518504000032
いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソーム阻害剤はｓｉＲＮＡ剤であり、ＮＬＲＰ３を阻害する例示的なｓｉＲＮＡ配列を表５Ｂに示す。
Figure 2022518504000033
Figure 2022518504000034
いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソーム阻害剤は、ＮＬＲＰ３の発現を阻害するｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）、またはＮＬＲＰ３の発現を阻害するｍｉＲのアゴニストである。ＮＬＲＰ３を阻害する例示的なｍｉＲは、ｍｉＲ－９およびｍｉＲ－２２３である。
ｍｉＲ－９は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を阻害する（Ｗａｎｇ，Ｙｕｅ，ｅｔ ａｌ．“ＭｉｃｒｏＲＮＡ－９ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＮＬＲＰ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．” Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１．４（２０１７）：１５５５－１５７１．）。したがって、プレｍｉＲ－９（ＭｉＲ－９前駆体）またはｍｉＲ－９を使用して、ＮＬＲＰ３を阻害することができる。成熟ｍｉＲ－９（ＭＩＭＡＴ００００４４１）の配列は、５’－ＵＣＵ ＵＵＧ ＧＵＵ ＡＵＣ Ｕ ＡＧ ＣＵＧ ＵＡＵ ＧＡ－３’（配列番号５８７）である。 ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ（ＵＣＵＵＵＧＧＵＵＡＵＣＵＡＧＣＵＧＵＡＵＧＡ）（配列番号５８８）。いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソーム阻害剤は、ｍｉＲ－９アゴニストＳＱ２２５３８（ＳＱ；９－（テトラヒドロ－２－フラニル）－９Ｈ－プリン－６－アミン）であり、これはｍｉＲ－９の発現を増加させることが報告された（Ｈａｍ，Ｏｎｊｕ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ－９ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｏｉｎｔｉｍａ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｂａｌｌｏｏｎ ｉｎｊｕｒｙ．” Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８．５５（２０１７）：９３３６０．）。ＳＱ２２５３８の式は、次のとおりである。
Figure 2022518504000035
ｍｉＲ－２２３は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性を阻害する（Ｂａｕｅｒｎｆｅｉｎｄ，Ｆｒａｎｚ，ｅｔ ａｌ．“ＮＬＲＰ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｍｉＲ－２２３．” Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８９．８（２０１２）：４１７５－４１８１、Ｆｅｎｇ，Ｚｕｎｙｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｌｙ６Ｇ＋ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉＲ－２２３ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ＮＬＲＰ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＡＭＰ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ．” Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ＆ｄｉｓｅａｓｅ ８．１１（２０１７）：ｅ３１７０）。ｍｉＲ－２２３はｍｍｕ－ｍｉＲ－２２３として合成できる。ｍｉＲ－２２３（５’－ＴＧＧＧＧＴＡＴＴＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＡＣＡ－３’（配列番号５８９）に相補的な配列の少なくとも１つ、または２つまたは３つまたは４つの区間を使用して、ＮＬＲＰ３を阻害することができる。ｃｂｎ－ｍｉｒ－２３３ ＭＩ００２４８９０は、ＵＣＧＣＣＣＡＵＣＣＣＧＵＵＧＵＵＣＣＡＡＵＡＵＵＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＵＧＡＵＵＡＵＵＧＡＧＣＡＡＵＧＣＧＣＡＵＧＵＧＣＧＧ（配列番号５９０）の配列を有し、ｃｂｒ－ｍｉｒ－２３３ ＭＩ００００５３０は、ＡＡＧＣＡＵＵＵＵＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＧＣＡＵＣＣＣＵＵＵＧＵＵＣＣＡＡＵＡＵＵＣＡＡＡＣＣＡＧＵＡＧＡＡＡＧＡＵＵＡＵＵＧＡＧＣＡＡＵＧＣＧＣＡＵＧＵＧＣＧＧＧＡＣＡＧＡＵＵＧＡＡＵＡＧＣＵＧ（配列番号５９１）の配列を有し、ｃｅｌ－ｍｉｒ－２３３ ＭＩ００００３０８は、ＡＵＡＵＡＧＣＡＵＣＵＵＵＣＵＧＵＣＵＣＧＣＣＣＡＵＣＣＣＧＵＵＧＣＵＣＣＡＡＵＡＵＵＣＵＡＡＣＡＡＣＡＡＧＵＧＡＵＵＡＵＵＧＡＧＣＡＡＵＧＣＧＣＡＵＧＵＧＣＧＧＧＡＵＡＧＡＣＵＧＡＵＧＧＣＵＧＣ（配列番号５９２）の配列を有し、ｃｒｍ－ｍｉｒ－２３３ ＭＩ００１１０５９は、ＵＧＡＡＧＣＧＵＣＵＣＵＣＵＧＵＣＣＣＧＣＵＣＡＵＣＣＵＧＵＵＧＵＵＣＣＡＡＵＡＵＵＣＣＡＡＣＡＧＣＣＣＡＧＵＧＡＵＵＡＵＵＧＡＧＣＡＡＵＧＣＧＣＡＵＧＵＧＣＧＧＧＡＣＡＧＡＵＵＧＵＡＵＧＣＵＧＣＣＡＵ（配列番号５９３）の配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソーム阻害剤は、ＮＬＲＰ３の発現または機能を抑制するｍｉＲの発現を阻害する抗ｍｉＲＮＡ（抗ｍｉＲ）である。例示的な抗ｍｉＲは、抗ｍｉＲ－２２および抗ｍｉＲ－３３である。ｍｉＲ２２はＮＬＲＰ３の発現を維持することが実証されている（Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，“ＭｉＲ－２２ ｓｕｓｔａｉｎｓ ＮＬＲＰ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．”Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３７．７（２０１８）：８８４．）。ｍｉＲ－２２の成熟配列は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２（ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－５ｐ ＭＩＭＡＴ０００４４９）であり、ＡＧＵＵＣＵＵＣＡＧＵＧＧＣＡＡＧＣＵＵＵＡ（配列番号５９４）であり、下記のとおりのステムループ配列をもつ。ｈｓａ－ｍｉｒ－２２ ＭＩ０００００７８は、ＧＧＣＵＧＡＧＣＣＧＣＡＧＵＡＧＵＵＣＵＵＣＡＧＵＧＧＣＡＡＧＣＵＵＵＡＵＧＵＣＣＵＧＡＣＣＣＡＧＣＵＡＡＡＧＣＵＧＣＣＡＧＵＵＧＡＡＧＡＡＣＵＧＵＵＧＣＣＣＵＣＵＧＣＣ（配列番号５９５）の配列を有する。
ｍｉＲ－３３は、初代マクロファージにおけるＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現、ならびにカスパーゼ－１活性を上方調節することが報告されている（Ｘｉｅ，Ｑｉｎｇｙｕｎ，ｅｔ ａｌ．“ＭｉｃｒｏＲＮＡ－３３ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ＮＬＲＰ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｒｅｐｏｒｔｓ １７．２（２０１８）：３３１８－３３２７）．ｍｉＲ－３３の成熟配列は、ｍｍｕ－ｍｉＲ－３３－５ｐまたはＭＩＭＡＴ００００６６７であり、ＧＵＧＣＡＵＵＧＵＡＧＵＵＧＣＡＵＵＧＣＡ（配列番号５９６）であり、下記のとおりのステムループ配列をもつ。ｍｍｕ－ｍｉｒ－３３ ＭＩ００００７０７：ＣＵＧＵＧＧＵＧＣＡＵＵＧＵＡＧＵＵＧＣＡＵＵＧＣＡＵＧＵＵＣＵＧＧＣＡＡＵＡＣＣＵＧＵＧＣＡＡＵＧＵＵＵＣＣＡＣＡＧＵＧＣＡＵＣＡＣＧＧ（配列番号５９７）
したがって、いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３の阻害剤は、配列番号５９４もしくは配列番号５９５の少なくとも一部、例えば１５～２５塩基長に相補的な抗ｍｉＲ－２２であり、または、例えば、配列番号５９６もしくは配列番号５９７の１５～２１塩基長の少なくとも一部に相補的な抗ｍｉＲ－３３である。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）の抗ヒトＮＬＲＰ３（カタログ番号ＡＦ６７８９）である。いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３の抗体阻害剤は、ｃｅＤＮＡによってコードされる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３の阻害剤は、ＮＬＲＰ３に結合する抗体または抗原結合断片である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３に結合する抗体または抗原結合断片は、ｃｅＤＮＡによってコードされる。
ＮＬＲＰ３インフラマソーム阻害剤とは、インフラマソームの活性を阻害または少なくとも低減させる化合物を指し、グリブリドおよび機能的に同等なその前駆体または誘導体、カスパーゼ－１阻害剤、アデノシンモノホスフェート活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）活性化因子およびＰ２Ｘ７阻害剤を含む。ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害は、インフラマソームまたはカスパーゼ－１を阻害する単一の化合物または化合物の組み合わせによって達成できるが、ｃｙｐイソ型、３Ａ４、２Ｃ９および２Ｃ１９などのチトクロームＰ４５０（ｃｙｐ）酵素活性に変化をもたらさず、スタチンの代謝に悪影響を及ぼし、スタチンの生物学的利用能を低下させるだろう。
ＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤
いくつかの実施形態では、インフラマソームアンタゴニストはＡＩＭ２を阻害する。代わりにＰＩＳＡとして知られるＡＩＭ２は、３４３アミノ酸のポリペプチドである（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ０２４７１４．１、ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＮＰ＿００４８２４．１を参照）（配列番号５９８）。ＡＩＭ２はＩＦＩ２０Ｘ／ＩＦ１１６ファミリーの一員であり、脾臓、小腸、末梢血白血球、および精巣で発現することが知られている。ＡＩＭ２には、ＡＳＣとの相互作用に関与するＰＹＤドメインと、ｄｓＤＮＡとの相互作用に関与するＨＩＮ２００ドメインが含まれている。ＡＩＭ２は、腫瘍形成性の復帰において推定上の役割を果たし、細胞増殖を制御する可能性がある。ＡＩＭ２の発現は、インターフェロン－ガンマによって誘導される。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＡＩＭ２の阻害剤は、ＡＩＭ２に結合する抗体または抗原結合断片である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３に結合する抗体または抗原結合断片は、ｃｅＤＮＡによってコードされる。ＡＩＭ２の阻害剤は、Ｆａｒｓｈｃｈｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１７；８（２８）；４５８２５－４５８３６に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤は、ＡＳＣのＰＹＤに干渉することが報告されている抗ヒトＡＳＣモノクローナル抗体（クローン２３－４、ＭＢＬ、名古屋、日本）である。いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤は、抗ヒトＡＩＭ２（カタログ番号８０５５）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）（マサチューセッツ州ビバリー）である。いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤は、最近（Ｋｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４、ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）によって記載されたピリン含有タンパク質、またはＳｃｈａｕｂｅｒと同僚によって報告された（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）抗菌性カテリシジンペプチドなどの内因性ＡＩＭ２阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤は、Ｍｉｒｉａｍ Ｃａｎａｖａｓｅによるミニレビュー「ｔｈｅ ｄｕａｌｉｔｙ ｏｆ ＡＩＭ２ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ：Ａ ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ Ｓｋｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ＆Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ；２０１６」に開示された任意の化合物である。
いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤はＰ２０２であり、これはｐ２０２四量体であり、ＡＩＭ２活性化を低下させ、ＡＳＣおよびＡＩＭ２インフラマソーム活性化のｄｓＤＮＡ依存性クラスタリングを防止したことが報告されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ－Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｔｅｒｅｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ＡＩＭ２ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ．” Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１．５（２０１０）：３８５、Ｙｉｎ，Ｑｉａｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｐ２０２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＡＩＭ２ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．” Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ ４．２（２０１３）：３２７－３３９）。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、Ｐ２０２は、ｃｅＤＮＡによってコードされる。
いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤は、ＷＯ２０１７／１３８５８６ＡまたはＵＳ２０１３／０１５８１００Ａ１に記載されている小分子化合物のいずれかであり、各内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＡＩＭ２の阻害剤は、ＡＩＭ２に特異的なｓｉＲＮＡなどのＡＩＭ２のＲＮＡ阻害剤である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＡＩＭ２のＲＮＡ阻害剤は、ｃｅＤＮＡによってコードされる。ヒトＡＩＭ２タンパク質は、核酸配列ＮＭ＿００４８３３．２（配列番号６００）を含むＡＩＭ２遺伝子によってコードされ、ヒトＡＩＭ２タンパク質は、ＮＰ＿００４８２４．１（配列番号５９８）のアミノ酸を有する。ＡＩＭ２阻害剤は、ＡＩＭ２遺伝子転写を阻害し、それによりＡＩＭ２インフラマソーム活性化を阻害するために使用できるアンチセンスポリヌクレオチドをさらに含む。ＡＩＭ２をコードするポリヌクレオチドのセグメント（例えば、配列番号６００に記載のポリヌクレオチド）に相補的なポリヌクレオチドは、ＡＩＭ２をコードするｍＲＮＡに結合し、そのようなｍＲＮＡの翻訳を阻害するように設計されている。アンチセンスポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターによってコードされ、任意で、本明細書に開示される組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結され得る。ＡＩＭ２ ｍＲＮＡの阻害は、当業者に一般的に知られている方法に従って、ＲＮＡｉ分子を遺伝子サイレンシングすることによるものであり得る。例えば、ヒトＡＩＭ２（ＮＭ＿００４８３３．２）を特異的に標的とする遺伝子サイレンシングｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二本鎖は、ＡＩＭ２発現をノックダウンするために容易に使用できる。ＡＩＭ２ ｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを使用して首尾よく標的化することができ、標的ｍＲＮＡの既知の配列に基づいて、当業者は他のｓｉＲＮＡ分子を容易に調製することができる。したがって、疑義を回避するために、当業者は、以下のようなＮＭ＿００４８３３．２の核酸配列に対するＲＮＡｉ（ＲＮＡサイレンシング）剤などの核酸阻害剤を設計することができる。
Figure 2022518504000036
 いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソーム阻害剤はｓｉＲＮＡであり、それによりＡＩＭ２インフラマソームのｍＲＮＡを阻害する。いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤は、ヒトＡＩＭ２の発現を阻害する５’－ＣＣＣＧＡＡＧＡＴＣＡＡＣＡＣＧＣＴＴＣＡ－３’（配列番号６０１）または５’－ＡＡＡＧＧＴＴＡＡＴＧＴＣＣＣＧＣＴＧＡＡ－３’（配列番号６６５）（両方ともＦａｒｓｈｃｈｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１７）８：４５８２５－４５８３６）、またはその断片またはそれと少なくとも５０％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％同一な相同体である。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤は、ＡＩＭ２に特異的なｓｉＲＮＡなど、ＡＩＭ２のＲＮＡ阻害剤である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＡＩＭ２のＲＮＡ阻害剤は、ｃｅＤＮＡによってコードされる。ＡＩＭ２ ｓｉＲＮＡは、例えば、ＳＩ０４２６１４３２（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））、または、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）（アラバマ州ハンツビル）のＲＣＮ０００００９６１０４（＃１）、ＴＲＣＮ０００００９６１０５（＃２）、ＴＲＣＮ０００００９６１０６（＃３）など、市販されている。
いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤は、ホスホロチオエート（ＰＯ）骨格を用いて合成されるＡ１５１（５’－ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ－３’（配列番号６０２）またはＣ１５１（５’－ＴＴＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡ－３’）（配列番号６０３）である。Ａ１５１（ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧとも呼ばれる）は、哺乳動物のテロメアＤＮＡに一般的に見られる免疫抑制性ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６０４）モチーフの４反復を含む合成オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）である（Ｓｔｅｉｎｈａｇｅｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＴＴＡＧＧＧ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｃＧＡＳ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ）。Ａ１５１は、細胞質ｄｓＤＮＡに応答してＡＩＭ２インフラマソーム活性化を遮断するが、ホスホチオエート（ＰＯ）骨格を要する（Ｋａｍｉｎｓｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１３；１９１：３８７６－３８８３，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ＴＴＡＧＧＧ Ｍｏｔｉｆｓ Ｉｎｈｉｂｉｔ ＡＩＭ２ Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｅｉｃｈｈｏｌｚ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，２０１６．Ｉｍｍｕｎｅ－Ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｉｎｄｕｃｅ ＡＩＭ２－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１２（９）：ｅ１００５８７１）。いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤は、Ａ１５１（５’－ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ－３’（配列番号６０２）またはＴＴＡＧＧＧの少なくとも１つの反復（配列番号６０４）であり、それぞれホスホチオエート（ＰＯ）骨格を有する。いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤は、ホスホジエステル（ＰＥ）骨格を有しないＡ１５１（５’－ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ－３’（配列番号６０２）またはＴＴＡＧＧＧの少なくとも１つの反復（配列番号６０４）である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤は、対象に投与されるｃｅＤＮＡによってコードされる（例えば、ｃｅＤＮＡのその後の送達を含む）。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、対象に投与されるｃｅＤＮＡによってコードされるＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤はＡ１５１（配列番号６０２）である。
いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソーム阻害剤は、ヒトＮＭ＿００１３４８２４７．１（配列番号５６６）、ＮＣＢＩ遺伝子９４４７（ＡＩＭ２）におけるＲＮＡｉ標的配列に相補的なＲＮＡｉである。ＡＩＭ２を阻害するＲＮＡｉ剤は、表５Ｃに示す配列番号６０５～６１０の１７～２１個の連続した塩基に相補的な核酸であり得る。
Figure 2022518504000037
いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソーム阻害剤はｓｉＲＮＡ剤であり、ＡＩＭ２を阻害する例示的なｓｉＲＮＡ配列を表５Ｄに示す。
Figure 2022518504000038
Figure 2022518504000039
Figure 2022518504000040
Figure 2022518504000041
Figure 2022518504000042
Figure 2022518504000043
Figure 2022518504000044
Figure 2022518504000045
いくつかの実施形態では、ＡＩＭ２インフラマソーム阻害剤は、ＡＩＭ２の発現を阻害するｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）、またはＡＩＭ２の発現を阻害するｍｉＲのアゴニストである。ＡＩＭ２を阻害する例示的なｍｉＲは、ｍｉＲ－２２３である（Ｙａｎｇ，Ｆａｎ，ｅｔ ａｌ．“ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２２３ ａｃｔｓ ａｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｔｏ Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｏｆ Ｃｏｎ Ａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｉｖｅｒ ｆａｉｌｕｒｅ ｖｉａ ＡＩＭ２ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．” Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４．６（２０１４）：２１３７－２１５２）。したがって、本明細書で使用するＡＩＭ２阻害剤は、配列番号５８９～５９３のいずれか１つに対応するｍｉＲ－２２３である。
無細胞系で再構成されたインビトロＡＩＭ２インフラマソームは、Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５に開示されている方法、または米国出願第ＵＳ２０１３／０１５８１００Ａ１号に開示されている方法に従って、ＡＩＭ２インフラマソーム阻害剤をスクリーニングするためのツールとして使用でき、文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
カスパーゼ－１の阻害剤
いくつかの実施形態では、インフラマソームアンタゴニストはカスパーゼ－１を阻害する。いくつかの実施形態では、本方法および組成物で使用するためのカスパーゼ－１の阻害剤は、ベルナカサン（ＶＸ－７６５）である。ＶＸ－７６５は、ＩＣＥ／カスパーゼ－１サブファミリーに属するカスパーゼの強力かつ選択的な阻害剤であるＶＲＴ－０４３１９８の経口吸収プロドラッグであり、次の式を有する。
Figure 2022518504000046
 （Ｗａｎｎａｍａｋｅｒ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２００７．（Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－｛［１－（４－ａｍｉｎｏ－３－ｃｈｌｏｒｏ－ｐｈｅｎｙｌ）－ｍｅｔｈａｎｏｙｌ］－ａｍｉｎｏ｝－３，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｂｕｔａｎｏｙｌ）－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ（（２Ｒ，３Ｓ）－２－ｅｔｈｏｘｙ－５－ｏｘｏ－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－ｆｕｒａｎ－３－ｙｌ）－ａｍｉｄｅ（ＶＸ－７６５），ａｎ ｏｒａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ／ｃａｓｐａｓｅ－１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ＩＬ－１ｂｅｔａ ａｎｄ ＩＬ－１８．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．３２１（２）：５０９－１６を参照）。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、以下の構造を有するＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫであり、
Figure 2022518504000047
 細胞透過性汎カスパーゼ阻害剤であり、ＮＬＲＰ３誘導性細胞におけるカスパーゼ１活性化の強力な阻害剤である（Ｄｏｓｔｅｒｔ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｍａｌａｒｉａｌ ｈｅｍｏｚｏｉｎ ｉｓ ａ Ｎａｌｐ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｄａｎｇｅｒ ｓｉｇｎａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．４（８）：ｅ６５１０．）。Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫは、カスパーゼプロテアーゼの触媒部位に不可逆的に結合する（Ｓｌｅｅ ＥＡ．ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｓｐ（ＯＭｅ）ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ（Ｚ－ＶＡＤ．ＦＭＫ）ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ＣＰＰ３２．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３１５（Ｐｔ１）：２１－４）。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、以下の構造を有するＡｃ－ＹＶＡＤ－ｃｍｋであり、
Figure 2022518504000048
 カスパーゼ１阻害剤であり、ｐｒｏＩＬ－１β（ＹＶＨＤ）の標的配列に基づくクロロメチルケトンテトラペプチドである。Ａｃ－ＹＶＡＤ ｃｍｋはインフラマソームの活性化を遮断し、故に抗炎症、抗アポトーシス、および抗パイロトーシスの効果を示すことが報告された。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、以下の構造を有するＡｃ－ＹＶＡＤ－ＣＨＯである。
Figure 2022518504000049
 （Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．５：２９－３７．ＰＭＩＤ：１０２００４４３）カスパーゼ－１基質（ＣＡＳ１４３３０５－１１－７）
いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、以下の構造を有するパルテノライドである。
Figure 2022518504000050
ナツシロギク由来のセスキテルペンラクトンであるパルテノライドは、ＮＦ－κＢ活性化の既知の阻害剤であり、カスパーゼ－１ならびにＮＬＲＰ３およびＮＬＲＰ１インフラマソームを含む複数のインフラマソームの直接阻害剤でもある（Ｊｕｌｉａｎａ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅ ａｎｄ Ｂａｙ １１－７０８２ ａｒｅ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８５（１３）：９７９２－８０２）。パルテノライドは、ＮＬＲＰ３ ＡＴＰアーゼ活性に干渉することにより、ＮＬＲＰ３インフラマソームを直接阻害する。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、以下の構造を有するプラルナカサン（ＶＸ－７４０）のいずれか１つまたは組み合わせである。
Figure 2022518504000051
Ｚ－ＷＥＨＤ－ＦＭＫ（ベンジルオキシカルボニル－Ｖ－Ａ－Ｄ－Ｏ－メチルフルオロメチルケトンとしても知られる）。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、シコニンまたはアセチルシコニンであり、シコニンは、
Figure 2022518504000052
 であり、アセチルシコニンは、
Figure 2022518504000053
 である。シコニンは、伝統的な漢方薬で多面発現効果に使用されるＬｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎの根に見出される親油性の高いナフトキノンであり、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を抑制する（Ｚｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，２０１６；１１（７）；ｅ０１５９８２６）。
一部の実施形態では、当業者が理解するように、カスパーゼ－１の阻害剤は小分子阻害剤であり得る。非限定的な例には、（Ｓ）－３－（（Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－（４－アミノ－３－クロロベンズアミド）－３，３－ジメチルブタノイル）ピロリジン－２－カルボキサミド）－３－シアノ－プロパン酸などのシアノプロパネート含有分子、および（Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－｛［１－（４－アミノ－３－クロロ－フェニル）－メタノイル］－アミノ｝－３，３－ジメチル－ブタノイル）－ピロリジン－２－カルボン酸（（２Ｒ，３Ｓ）－２－エトキシ－５－オキソ－テトラヒドロ－フラン－３－イル）－アミドが含まれる）などの他の小分子カスパーゼ－１阻害剤が含まれる。そのような阻害剤は、化学的に合成することができる。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、カスパーゼ－１酵素活性の直接的な阻害剤であり得るか、またはインフラマソーム会合またはインフラマソームシグナル伝搬の開始を阻害する間接的な阻害剤であり得る。本発明で使用するカスパーゼ－１阻害剤は、活性酸素種（ＲＯＳ）阻害剤を含む抗酸化剤であり得る。このようなカスパーゼ－１阻害剤の例には、アピゲニン、ルテオリン、およびジオスミンなどのフラボン、ミリセチン、フィセチン、およびケルセチンなどのフラボノール、カテキン、ガロカテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、エピガロカテキン－３－ガレートおよびテアフラビンなどのフラバノールおよびそのポリマー、イソフラボン植物エストロゲン、ならびにレスベラトロールなどのスチルベノイドを含むフラボノイドが含まれるが、これらに限定されない。没食子酸およびサリチル酸などのフェノール酸およびそれらのエステル、アンドログラホリドおよびパルテノライドなどのテルペノイドまたはイソプレノイド、ビタミンＡ、Ｃ、Ｅなどのビタミン類、補酵素Ｑ１０、マンガン、およびヨウ化物などのビタミン補因子、クエン酸、シュウ酸、フィチン酸、およびアルファ－リポ酸などの他の有機抗酸化剤、ならびにＲｈｕｓ ｖｅｒｎｉｃｉｆｌｕａ ｓｔｏｋｅｓ抽出物も含まれる。カスパーゼ－１阻害剤は、これらの化合物の組み合わせ、例えば、ａ－リポ酸、補酵素Ｑ１０およびビタミンＥの組み合わせ、またはカスパーゼ１阻害剤とグリブリドなどの他のインフラマソーム阻害剤との組み合わせ、またはその機能的に同等の前駆体または誘導体であり得る。
いくつかのインフラマソーム阻害剤の投与量の例は次のとおりである。アピゲニン（約０．１～１０ｍｇ／ｋｇ）、ルテオリン（約１～１００ｍｇ）、ジオスミン（約１００～９００ｍｇ）、ミリセチン（約１０～３００ｍｇ）、ケルセチン（約１０～１０００ｍｇ）、フィセチン（１～２００ｍｇ／ｋｇ）、Ｒｈｕｓ ｖｅｒｎｉｃｉｆｌｕａ ｓｔｏｋｅｓ抽出物（１～１００ｍｇ／ｋｇ）、カテキン（約５０～５００ｍｇ）、ガロカテキン（約１００～１０００ｍｇ）、エピカテキン（約０．１～１０ｍｇ／ｋｇ）、エピガロカテキン（約１００～１０００ｍｇ）、エピガロカテキン－３－ガレート（約１００～１０００ｍｇ）、テアフラビン（約７５～７５０ｍｇ）、イソフラボン植物エストロゲン（約２５～２５０ｍｇ）、レスベラトロール（約１００～１０００ｍｇ）、アンドログラホリド（約１００～５００ｍｇ）、パルテノライド（約０．１～５０ｍｇ）、ビタミンＡ（約５０００～２００００ＩＵ）、ビタミンＣ（約１００～２０００ｍｇ）、補酵素Ｑ１０（約３０～５００ｍｇ）、ビタミンＥ（約１０～１０００ＩＵ）、ａ－リポ酸（約１０～１０００ｍｇ）、補酵素Ｑ１０（３０～５００ｍｇ）、マンガン（約１～１００ｍｇ）、ａ－リポ酸、補酵素Ｑ１０およびビタミンＥ（それぞれ約１０～１０００ｍｇ、３０～５００ｍｇ、１０～１０００ＩＵ）、グリブリド（約１～２０ｍｇ）、ならびにシクロヘキシル尿素部分を欠くグリブリド誘導体（約１～２００ｍｇ）。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、米国特許第６，３５５，６１８号、同第６，６３２，９６２号、同第５，７５６，４６６号または国際出願第ＷＯ２００１／０４２，２１６号、同第ＷＯ２００４／０６４，７１３号、同第ＷＯ９８／１６５０２号、同第ＷＯ９７／２４３３９号、ＥＰ６２３５９２、およびＤｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９，２４３８（１９９６）、Ｄｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０，１９４１（１９９７）に記載されている小分子化合物のいずれかであり、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、米国特許（Ｂｅｍｉｓ ｅｔ ａｌ．）でも報告されたカスパーゼ－１の非ペプチド阻害剤である。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、以下の構造を有するＩＣＥ（カスパーゼ－１）阻害剤であり、
Figure 2022518504000054
 式中、Ｒ１は、とりわけ、Ｒ３ＣＯ－であり、Ｒ３は、とりわけ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、－（ＣＨＲ）ｎ－アリール、および－（ＣＨＲ）ｎ－ヘテロアリールであり、Ｒ２は様々な群から選択される。いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、以下の構造を有するＩＣＥ（カスパーゼ－１）阻害剤であり、
Figure 2022518504000055
 式中、Ｒ１にはアリールおよびヘテロアリールが含まれ、Ａはアミノ酸であり、ｎは０～４であり、ｍは０または１であり、Ｒ２はアリールである。いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、以下の構造を有するＩＣＥ（カスパーゼ－１）阻害剤であり、
Figure 2022518504000056
 式中、Ｒ１にはアリールおよびヘテロアリールが含まれ、ＡＡ１およびＡＡ２は単結合またはアミノ酸残基であり、Ｔｅｔはテトラゾール環を表し、Ｚは、アルキレン、アルケニレン、Ｏ、Ｓなどを表し、ＥはＨ、アルキルなどを表す。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、カスパーゼ－１に特異的なｓｉＲＮＡなどのカスパーゼ－１のＲＮＡ阻害剤である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ＡＩＭ２のＲＮＡ阻害剤は、ｃｅＤＮＡによってコードされる。
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、カスパーゼ－１に特異的なｓｉＲＮＡなどのカスパーゼ－１のＲＮＡ阻害剤である。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、カスパーゼ－１のＲＮＡ阻害剤は、ｃｅＤＮＡによってコードされる。本明細書のキットおよび組成物での使用に包含されるカスパーゼ－１ｓｉＲＮＡ配列の例は、ＷＯ２００８／０３３，２８５、Ｋｅｌｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２００８；１３２（５）：８１８－８３１、Ａｒｔｌｅｔｔ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ．２０１１ Ｊｕｌ；６３（１１）：３５６３－３５７４、Ｂｕｒｄｅｔｔｅ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１２，９３：２３５－２４６に開示されており、これらはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。カスパーゼ－１に対するｓｉＲＮＡ配列も市販されており、当業者に知られている。
ヒトカスパーゼ－１タンパク質は、核酸配列ＮＭ＿０３３２９２．３（配列番号６１１）を含むＣＡＳＰ１遺伝子によってコードされ、ヒトカスパーゼ－１タンパク質はＮＰ＿１５０６３４．１（配列番号６１２）のアミノ酸を有する。カスパーゼ－１阻害剤には、カスパーゼ－１遺伝子の転写を阻害し、それによってカスパーゼ－１ならびにＮＬＲＰ３インフラマソームおよびＡＩＭ２インフラマソームの下流経路を阻害するために使用できるアンチセンスポリヌクレオチドがさらに含まれる。カスパーゼ－１をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号６１１に記載のポリヌクレオチド）のセグメントに相補的なポリヌクレオチドは、カスパーゼ－１をコードするｍＲＮＡに結合し、そのようなｍＲＮＡの翻訳を阻害するように設計されている。アンチセンスポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターによってコードされ、任意で、本明細書に開示される組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結され得る。
カスパーゼ－１またはプロカスパーゼ－１ｍＲＮＡの阻害は、当業者に一般的に知られている方法に従って、ＲＮＡｉ分子を遺伝子サイレンシングすることによるものであり得る。例えば、ヒトカスパーゼ－１（ＮＭ＿０３３２９２．３）を特異的に標的とする遺伝子サイレンシングｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二本鎖は、プロカスパーゼ－１発現をノックダウンするために容易に使用できる。カスパーゼ－１ｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを使用して首尾よく標的化することができ、標的ｍＲＮＡの既知の配列に基づいて、当業者は他のｓｉＲＮＡ分子を容易に調製することができる。したがって、疑義を回避するために、当業者は、以下のようなＮＭ＿０３３２９２．３の核酸配列に対するＲＮＡｉ（ＲＮＡサイレンシング）剤などの核酸阻害剤を設計することができる。
Figure 2022518504000057
いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１阻害剤は、ＮＭ＿０３３２９２．３（配列番号６１１）のＲＮＡｉ標的配列に相補的なＲＮＡｉであり、ＮＣＢＩ遺伝子８３４（ＣＡＳＰ１）とも呼ばれる。カスパーゼ－１の現在の野生型転写産物には、ＮＭ＿００１２２３．４、ＮＭ＿００１２５７１１８．２、ＮＭ＿００１２５７１１９．２、ＮＭ＿０３３２９２．３（配列番号６１１）、ＮＭ＿０３３２９３．３、ＮＭ＿０３３２９４．３、ＮＭ＿０３３２９５．３、ＸＭ＿０１７０１８３９３．１、ＸＭ＿０１７０１８３９４．１、ＸＭ＿０１７０１８３９５．１、ＸＭ＿０１７０１８３９６．１が含まれる。カスパーゼ－１を阻害するＲＮＡｉ剤は、表５Ｅに示す配列番号６１３～６１９の１７～２１個の連続した塩基間に相補的な核酸であり得る。
Figure 2022518504000058
いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１阻害剤はｓｉＲＮＡ剤であり、カスパーゼ－１を阻害する例示的なｓｉＲＮＡ配列を表５Ｆに示す。
Figure 2022518504000059
Figure 2022518504000060
Figure 2022518504000061
いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１阻害剤はｓｉＲＮＡであり、それによりカスパーゼ－１（またはプロカスパーゼ－１プロタンパク質）のｍＲＮＡを阻害し、それによってＮＬＲＰ３インフラマソームおよび／またはＡＩＭ２インフラマソームの下流経路を阻害する。いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１阻害剤は、ヒトカスパーゼ－１の発現を阻害するＧＡＡ ＧＧＣ ＣＣＡ ＵＡＵ ＡＧＡ ＧＡＡ Ａ（配列番号９０４、センス鎖の配列が示されている）またはその断片またはそれと少なくとも５０％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％同一な相同体である。本明細書のキットおよび組成物での使用に包含されるカスパーゼ－１ｓｉＲＮＡ配列の例は、ＷＯ２００８／０３３２８５、または米国出願第ＵＳ２００９／０２８００５８号、Ｋｅｌｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２００８；１３２（５）：８１８－８３１、Ａｒｔｌｅｔｔ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ．２０１１ Ｊｕｌ；６３（１１）：３５６３－３５７４、Ｂｕｒｄｅｔｔｅ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１２，９３：２３５－２４６に開示されており、これらはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＮＬＲＰ３、ＡＩＭ２、およびカスパーゼ－１に対するカスタムｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（コロラド州ラファイエット）に発注して生成できる。カスタムｓｉＲＮＡ調製の他の供給源には、アラバマ州ハンツビルのＸｅｒａｇｏｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓおよびテキサス州オースティンのＡｍｂｉｏｎが含まれる。代わりに、ｓｉＲＮＡはリボヌクレオシドホスホラミダイトおよびＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学合成できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡであるＮＬＲＰ３、ＡＩＭ２およびカスパーゼ－１を、ｃｅＤＮＡにコードすることができる。
いくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、以下の構造を有するカスパーゼ－１基質（ＣＡＳ１４３３０５－１１－７）であり、
Figure 2022518504000062
 これは、次の配列を有する。Ａｓｎ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｎ（配列番号５３８）。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、カスパーゼ－１の阻害剤は、対象に投与されるｃｅＤＮＡによってコードされる（例えば、ｃｅＤＮＡのその後の送達を含む）。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態では、対象に投与されるｃｅＤＮＡによってコードされるカスパーゼ－１の阻害剤は、カスパーゼ－１基質（配列番号５３８）である。
ＲＮＡｉは、様々なｍＲＮＡを標的とするように設計できる。ＲＮＡｉ、例えばｓｉＲＮＡを設計するための一般的な戦略は、ＡＵＧ終止コドンで開始し、次にＡＡジヌクレオチド配列について所望のｃＤＮＡ標的の長さをスキャンすることを含む。ＡＡ配列に隣接する３’の１９ヌクレオチドは、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録された。次に、潜在的な標的部位を適切なゲノムデータベースと比較し、非標的遺伝子と有意な相同性を有する標的配列を破棄できるようにした。遺伝子の長さに沿った複数の標的配列が位置し、標的配列はｍＲＮＡの３’、５’および中間部分に由来した。陰性対照ｓｉＲＮＡは、対象ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を使用して生成されたが、トランスフェクトされる細胞の任意の遺伝子に対する配列相同性を欠くように混ぜて確認した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４－４９８；Ａｍｂｉｏｎ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ａｔ ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ）。
標的配列は１７～２５塩基の長さであり、最適にはＡＡで始まる２１塩基の長さであり得る。標的配列に結合するＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡは、一方の鎖の５つのＣ６炭素でチオール基で修飾された。
ＶＩＩ．使用の方法
本明細書に開示される、例えば免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、自然免疫応答の阻害剤をコードする）を標的細胞（例えば、宿主細胞）に送達するための方法においても使用できる。本方法は、特に、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤をそれを必要とする対象の細胞に送達し、免疫障害を治療するための方法、または自然免疫系を低減もしくは抑制するための方法であり得る。本発明は、インフラマソームアンタゴニストの発現の治療効果が生じるように、対象の細胞におけるｃｅＤＮＡベクターにコードされる免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤のインビボ発現を可能にする。これらの結果は、ｃｅＤＮＡベクター送達のインビボおよびインビトロの両様式で見られる。
さらに、本発明は、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を、例えば、それを必要とする対象の細胞に送達するための方法を提供し、本方法は、インフラマソームアンタゴニストをコードする本発明のｃｅＤＮＡベクターの複数回投与を含む。本発明のｃｅＤＮＡベクターは、カプシド形成されたウイルスベクターに対して典型的に観察されるような免疫応答を誘導しないため、そのような複数回投与戦略は、ｃｅＤＮＡベースの系においてより大きな成功を収めるであろう。ｃｅＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、例えば、過度の副作用なしに、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の十分なレベルの遺伝子導入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路には、網膜投与（例えば、網膜下注射、脈絡膜上注射または硝子体内注射）、静脈内（例えば、リポソーム製剤で）、選択された器官への直接送達（例えば、肝臓、腎臓、胆嚢、前立腺、副腎、心臓、腸、肺、および胃から選択される任意の１つ以上の組織）、筋肉内、および他の親投与経路が含まれるが、これらに限定されない。所望される場合、投与経路を組み合わせることができる。
本明細書に記載の、例えば免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターの送達は、発現された阻害剤の送達に限定されない。例えば、従来の方法で産生された（例えば、細胞ベースの産生方法（例えば、昆虫細胞産生方法）を使用して）または合成的に産生された本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子療法の一部を提供するために提供される他の送達系とともに使用され得る。本開示に従ってｃｅＤＮＡベクターと組み合わされ得る系の１つの非限定的な例は、阻害剤を発現するｃｅＤＮＡベクターの効果的な遺伝子発現のために１つ以上の補因子または免疫抑制因子を別個に送達する系を含む。
本発明はまた、治療有効量のｃｅＤＮＡベクターを、任意に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（特に筋細胞または組織）に導入することを含む、対象における免疫反応、例えば、自然免疫反応を抑制する方法も提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。選択されたｃｅＤＮＡベクターは、例えば、免疫系の治療または抑制に有用な免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤をコードするヌクレオチド配列を含む。特に、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入された場合に、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のインフラマソームアンタゴニストの転写を指示することができる制御要素に作動可能に連結された所望のインフラマソームアンタゴニストを含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
本明細書で提供される組成物およびベクターは、例えば様々な目的で、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を送達するために使用することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の機能を研究するために使用されることが意図される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤をコードする。別の例では、導入遺伝子は、抑制された免疫系または免疫不全の対象の動物モデルを作成するために使用されることを意図した免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤をコードする。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）のコードされた阻害剤は、対象における、例えば、遺伝子療法などに応答して、哺乳動物の対象における増強された免疫応答または増強された自然免疫状態の治療または予防に有用である。免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、対象における増強された免疫応答を低減または予防するのに十分な量で患者に移行（例えば、発現）することができる。
ｃｅＤＮＡベクターは、１種のｃｅＤＮＡベクターに限定されない。そのようなものとして、別の態様では、異なるタンパク質、または例えば異なるプロモーターもしくはシス調節要素に作動可能に連結されるが同じ免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を発現する複数のｃｅＤＮＡベクターは、標的細胞、組織、器官、または対象に同時にまたは順次に送達され得る。したがって、この戦略では、複数のインフラマソームアンタゴニストの遺伝子療法または遺伝子送達を同時に行うことができる。阻害剤の異なる部分を別々のｃｅＤＮＡベクターに分離することも可能であり（例えば、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の機能に必要な異なるドメインおよび／または補因子）、例えば、同時にまたは異なる時間に投与することができ、別々に調節可能であり、それによって１つ以上の阻害剤の発現制御の追加レベルを付加する。送達はまた、複数回、および重要なことに、ウイルスカプシドの不在に起因する抗カプシド宿主免疫反応の欠失を仮定して、後に増加または減少する用量で臨床状況において遺伝子療法のために実施され得る。カプシドが存在しないため、抗カプシド反応は起こらないと予想される。
本発明はまた、治療有効量の本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターを、任意に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（特に筋細胞または組織）に導入することを含む、対象における免疫反応、例えば、自然免疫反応を抑制する方法も提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるｃｅＤＮＡベクターは、関心対象のヌクレオチド配列、例えば、対象における自然免疫系の抑制、または増強された免疫状態の低減に有用な免疫応答の阻害剤を含む。特に、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御要素に操作可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
エクスビボ治療
いくつかの実施形態では、細胞を対象から除去し、例えば、本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターをその中に導入した後、細胞を対象に戻す。エクスビボでの治療のために対象から細胞を除去し、続いて対象に戻す方法は、当該技術分野において既知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたく、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。代替的に、ｃｅＤＮＡベクターは、別の対象からの細胞中に、培養細胞中に、または任意の他の好適な源からの細胞中に導入され、これらの細胞は、それを必要とする対象に投与される。
例えば、本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターで形質導入された細胞は、好ましくは薬学的担体と組み合わせて、「治療有効量」で対象に投与される。当業者であれば、いくらかの利益が対象にもたらされる限り、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞内で産生される、本明細書に記載されるインフラマソームアンタゴニスト（導入遺伝子または異種ヌクレオチド配列と呼ばれることもある）をコードすることができる。例えば、本明細書で論じられる治療方法における本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターの使用とは対照的に、いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターを培養細胞に導入し、発現したインフラマソームアンタゴニストを、例えば、抗体および融合タンパク質の産生のために細胞から単離することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターを含む培養細胞は、抗体または融合タンパク質の商業的産生に使用することができ、例えば、抗体または融合タンパク質の小規模または大規模バイオ製造の細胞源として役立つ。代替的な実施形態では、本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターは、小規模な産生を含む抗体または融合タンパク質のインビボ産生ならびにインフラマソームアンタゴニストの商業的な大規模産生のために、宿主非ヒト対象の細胞に導入される。
本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤の発現用ｃｅＤＮＡベクターは、獣医学的および医学的適用の両方で使用することができる。上記のエクスビボ遺伝子送達方法に好適な対象としては、鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、七面鳥、およびキジ）および哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、およびウサギ類）が挙げられ、哺乳動物が好ましい。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は、新生児、幼児、年少者、および成人を含む。
文献参照、発行済み特許、公開済みの特許出願、および係属中の特許出願を含む、本出願を通して引用されるすべての特許および他の出版物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を説明および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行発明のおかげで、またはいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関するすべての記述またはこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態および実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップまたは機能は、所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、または機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照文献および出願の構成、機能、および概念を用いて本開示のさらなる実施形態を提供するように修正することができる。さらに、生物学的機能の同等性の考慮により、種類または量の生物学的または化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更および他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正はすべて、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
前述の実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせるか、または置き換えることができる。さらに、本開示のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、すべての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
本明細書に記載される技術は、以下の実施例によってさらに説明されており、決してこれらをさらに限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例１：ＴＴＸプラスミドの構築
図４Ｃ（ＴＴＸ－Ｒ）または図４Ｄ（ＴＴＸ－Ｌ）に示す構造スキームを有するＴＴＸフォーマットプラスミドを調製した。ＴＴＸ－ＲおよびＴＴＸ－Ｌプラスミドの例は、以下の表６Ａに記載されている。ＴＴＸ－ＲおよびＴＴＸ－Ｌプラスミドは、図４Ｃおよび図４Ｄに示すように、変異したＡＡＶ２ ＩＴＲ配列の位置がそれぞれ異なる。ＴＴＸ－Ｒプラスミド（ＴＴＸ－プラスミド１、３、５、および７）は、ＴＴＸ－ベクターを産生するために、本明細書に開示される分子クローニングによって生成された。ＴＴＸ－ベクター（ＴＴＸ－ベクター２、４、６、８）の産生に使用するためのＴＴＸ－Ｌプラスミド（ＴＴＸ－プラスミド２、４、６、および８）。各ＴＴＸ－Ｒプラスミドは、図４Ｄに示すように、（ａ）ＡＡＶ２の野生型逆位末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）発現カセットおよび（ｃ）ＡＡＶ２の修飾逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。
ｃｅＤＮＡプラスミド（すなわち、ｃｅＤＮＡベクターを後で産生するために使用されるｃｅＤＮＡベクターテンプレートを含むプラスミド）は、既知の技術を使用して構築することができ、少なくとも好ましくは、転写方向に作動可能に連結された成分として次のものを提供する。５’ＩＴＲ（変異型またはＡＡＶ野生型）、プロモーター、関心対象の外因性ＤＮＡ配列を含む制御要素、転写終結領域、および３’ＩＴＲ（対応するＡＡＶ ＩＴＲの変異型または野生型）。特に、ＩＴＲ内のヌクレオチド配列は、実質的にｒｅｐおよびｃａｐコード領域を置き換える。ｒｅｐ配列は、理想的にはヘルパープラスミドまたはベクターによってコードされるが、代わりにベクタープラスミド自体によって運ばれることもできる。このような場合、ｒｅｐ配列は、ＩＴＲに挟まれた領域の外側に位置することが好ましいが、ＩＴＲに挟まれた領域内に位置することもできる。所望の外因性ＤＮＡ配列は、細胞、組織、器官、または対象（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）におけるコードされたポリペプチド、タンパク質、またはそれらのオリゴヌクレオチドの転写または発現を指示する制御要素に作動可能に連結されている。そのような制御要素は、通常、選択された遺伝子に関連する制御配列を含むことができる。代わりに、異種制御配列を使用することができる。有用な異種制御配列には、一般に、哺乳動物またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものが含まれる。
ｃｅＤＮＡベクターの望ましい外因性ＤＮＡ配列は、細胞、組織、器官、または対象（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）におけるコードされたポリペプチド、タンパク質、またはそれらのオリゴヌクレオチドの転写または発現を指示する制御要素に作動可能に連結することができる。そのような制御要素は、通常、選択された遺伝子に関連する制御配列を含むことができる。代わりに、異種制御配列を使用することができる。有用な異種制御配列には、一般に、哺乳動物またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものが含まれる。例として、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどのプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子に由来する配列も、本明細書で使用される。多くのＡＡＶ血清型のＩＴＲ配列が知られている。
各ＴＴＸプラスミド（ＴＴＸ－ＲとＴＴＸ－Ｌの両方）の発現カセットには、ＩＴＲ配列間に次のものが含まれる。（ｉ）エンハンサー／プロモーター、（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位、（ｉｉｉ）ＷＨＰ転写後応答要素（ＷＰＲＥ）、および（ｉｖ）ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨｐＡ）からのポリアデニル化シグナル。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１～６）（例えば、図４Ｃおよび図４Ｄを参照）もまた、各構成要素の間に導入されて、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成要素の導入を促進した。Ｒ３およびＲ４酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位に設計される。これらの配列を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得したｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ Ｂプラスミドにクローニングした。
すべてのＴＴＸプラスミドは外因性配列をさらに含み、導入遺伝子（ホタルルシフェラーゼ、または「Ｌｕｃ」またはヒト因子ＩＸ、または「ＦＩＸ」）のオープンリーディングフレームも、外因性配列をクローニング部位に挿入することによって生成された。表６Ａに提供されるＴＴＸプラスミドの複数例の構造は、それぞれ、図４Ｄ（右側変異ＡＡＶ ＩＴＲ）または図４Ｃ（左側変異ＩＴＲ）のパターンで構築された。各ＴＴＸプラスミドには、（ａ）発現カセットの左側（Ｌ）または右側（Ｒ）のいずれかでプラスミドにコードされた変異ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）ポリヌクレオチド配列、および（ｂ）発現カセットの反対端にある野生型（未変異）ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に隣接しているエンハンサー／プロモーターおよび導入遺伝子（例えば、様々なプロモーターをもつルシフェラーゼまたはＣＡＧプロモーターをもつＦＩＸ）、翻訳後調節要素（ＷＰＲＥ）、およびポリアデニル化終結シグナル（ＢＧＨポリＡ）が含まれた。
表６ＡのＴＴＸプラスミドは、ルシフェラーゼ導入遺伝子と右側ＩＴＲとの間の構成要素として、配列番号８を含むＷＰＲＥおよび配列番号９を含むＢＧＨｐＡを用いて構築された。さらに、各ＴＴＸプラスミド（ＴＴＸ－１からＴＴＸ－１０）は、ルシフェラーゼまたは第ＩＸ因子（配列番号１２のＰａｄｕａ ＦＩＸまたは配列番号１１のＦＩＸ）ＯＲＦレポーター配列の両側にＲ３／Ｒ４クローニング部位（配列番号７）も含んだ。
表６Ａを参照。
●「ｗｔ－Ｌ」は、発現カセット（配列番号５１のポリヌクレオチド配列を含む）の左側でプラスミドにコードされる野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲを指す。
●「ｗｔ－Ｒ」は、発現カセット（配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む）の右側でプラスミドにコードされる野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲを指す。
●「変異型－Ｌ」は、配列番号５２で提供される変異ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を指す。
●「変異型－Ｒ」は、配列番号２で提供される変異ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を指す。
●「ＣＡＧ」とは、配列番号３の（Ｃ）サイトメガロウイルス前初期エンハンサーおよびプロモーター要素、（Ａ）ニワトリベータアクチン遺伝子の第１エクソンおよび第１イントロン、（Ｇ）ウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターから構成される合成プロモーターを指す。
●「ＡＡＴ ｗ／ＳＶ４０ ｉｎｔｒ」は、配列番号４のＳＶ４０大型Ｔ抗原イントロンを有する（ヒトアルファ１－アンチトリプシン）ＡＡＴを指す。そして
●「ｈＥＦ１－α」は、配列番号６のヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１アルファ）を指す。
Figure 2022518504000063
Figure 2022518504000064
表６Ｂの各構築物は、導入遺伝子と変異型－ＲＩＴＲの間の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置する、修飾されたＳＶ４０ポリＡ配列（配列番号１０）を含む。
「ＬＰ－１ β」は、ＬＰ－１ βプロモーター（配列番号１６）を指し、これは、２つの追加の制限酵素部位を有するＬＰ－１プロモーター（配列番号５）と同じである。
一実施形態では、ベクターポリヌクレオチド（ｃｅＤＮＡベクター）は、配列番号１および配列番号５２、ならびに配列番号２および配列番号５１からなる群から選択される２つの異なるＩＴＲ対を含む。これらの態様のそれぞれの一実施形態では、ベクターポリヌクレオチドまたは共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターは、配列番号１０１および配列番号１０２、配列番号１０３、および配列番号１０４、配列番号１０５、および配列番号１０６、配列番号１０７、および配列番号１０８、配列番号１０９、および配列番号１１０、配列番号１１１、および配列番号１１２、配列番号１１３および配列番号１１４、および配列番号１１５および配列番号１１６からなる群から選択される１対のＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５００～５２９から選択される任意の配列を含むＩＴＲを有しない。
実施例２：直鎖状、連続的、および非カプセル化ＤＮＡベクターを生成するためのバクミドおよびバキュロウイルス
ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０３６１０１２）は、製造元により提供されウェブサイトで入手できるプロトコルに従って、ＴＴＸまたは対照プラスミドのいずれかで形質転換された（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／１０３６１０１２のワールドワイドウェブで見出される）。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えバクミド（「ＴＴＸ－バクミド」）を生成した。Ｘ－ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）に基づく正の選択によって、組み換えバクミドを選択した。白いコロニーを採取し、１０ｍｌの培地で培養した。
組み換えバクミド（「ＴＴＸ－バクミド」）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤ（商標）を使用してＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着したＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、２５℃のＴ２５フラスコ中の５０ｍＬの培地で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含む）を細胞から除去し、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性組み換えバキュロウイルス粒子（「ＴＴＸ－バキュロウイルス」または「比較バキュロウイルス」）は、バキュロウイルスを培養中の細胞から分離した。
任意選択的に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０～５００ｍＬの培地中で増幅させた。細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で培養し、細胞が（１４～１５ｎｍのナイーブ直径から）１８～１９ｎｍの直径に到達するまで、細胞直径および生存性、ならびに約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度を監視した。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に収集し、細胞および残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。
ＴＴＸ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を判定した。具体的には、２．５Ｅ＋６細胞／ｍｌで４×２０ｍｌのＳｆ９細胞培養物を、以下の希釈：１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日判定した。
Ｒｅｐ７８配列（配列番号１３）は、Ｒｅｐ７８配列が、３’末端のＨＳＶ ＴＫポリＡ配列に連結されるように、ＩＥ１プロモーター断片（配列番号１５）に作動可能に連結され、次にｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）－二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号：１０７１２０２４）のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ制限部位に挿入された。次に、Ｒｅｐ５２配列（配列番号１４）をベクターのＳａｌＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングして、Ｒｅｐ５２配列を５’上のｐＰＨプロモーターおよび３’上のＳＶ４０ポリＡ配列に作動可能に連結させた。得られた構築物は、本明細書では「Ｒｅｐ－プラスミド」と呼ばれる。
Ｒｅｐ－プラスミドを、製造元によって提供され、ウェブサイト（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標）、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／１０３６１０１２）で入手できるプロトコルに従って、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０３６１０１２）に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ－プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えバクミド（「Ｒｅｐ－バクミド」）を生成した。Ｘ－ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）に基づく正の選択によって、組み換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍＬの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラシクリン）中に播種した。組み換えバクミド（Ｒｅｐ－バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ－バクミドをＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。
Ｓｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍＬの培地中で４日間培養し、感染性組み換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ－バキュロウイルス）を、培養物から単離した。任意選択的に、第１世代のＲｅｐ－バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０～５００ｍＬの培地中で培養した。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、または濾過もしくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を判定した。具体的には、２．５×１０６細胞／ｍｌの４×２０ｍｌ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日判定した。
次いで、（１）ＴＴＸもしくはα（アルファ）－バキュロウイルス、または（２）上記のＲｅｐ－バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬ、２０ｍＬ）の新鮮な培養物に、１：１０００および１：１０，０００の比でそれぞれ添加した。次いで、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。同時感染の４～５日後に、細胞の直径および生存率が検出される。生存率が約７０～８０％で細胞直径が１８～２０ｎｍに到達したとき、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを収集した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水または緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ＴＴＸまたはα（アルファ）－ベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ Ｐｌｕｓ精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ カタログ番号１２９４５、カラムあたり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。
Ｓｆ９昆虫細胞から産生および精製されるＤＮＡベクター（例えば、ＴＴＸベクター）の収率は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定した。ＵＶ吸光度に基づいて判定された様々なＴＴＸ－ＤＮＡベクターの収率を表７に提供する。
Figure 2022518504000065
実施例３：ｃｅＤＮＡベクターの産生を同定するための変性ゲル電気泳動
したがって、定義によって必要とされるように、単離されたＤＮＡベクター材料が共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、単一制限部位を有するとＤＮＡベクター配列によって同定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ（例えば、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐ）の２つの切断産物をもたらす。変性ゲル（２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する）上の消化および電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的に閉じたＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖が連結され、展開されて２倍の長さであるとき（但し、一本鎖である）、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐのサイズで溶解するが、共有結合的に閉じたＤＮＡは、２倍サイズ（２０００ｂｐおよび４０００ｂｐ）で溶解するであろう。さらに、ＤＮＡベクターの単量体、二量体、およびｎ量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片としてすべて溶解するであろう（図５Ｂを参照）。
本明細書で使用される場合、「未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡベクターの同定のためのアッセイ」という句は、以下のアッセイを指す。制限エンドヌクレアーゼの場合、ＤＮＡベクターの長さの約１／３倍および２／３倍の製品を生成するシングルカット酵素を選択する。これは、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ カタログ番号２８１０４）または脱塩「スピンカラム」、例えば、ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ Ｉｌｕｓｔｒａ（商標）ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（商標）Ｇ－２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ カタログ番号２７５３２５０１）は、エンドヌクレアーゼ消化でうまく機能する。
１．適切な制限エンドヌクレアーゼ（複数可）でＤＮＡを消化する
２．Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｃｌｅａｎ－ｕｐキットに適用し、ｄＨ２Ｏ（３０ｕｌ）で溶出する
３．４ｕｌの１０倍変性溶液（１０ｘ＝０．５Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を追加する
４．６ｕｌの１０倍ゲルローディング溶液を追加する（色素とグリセロールまたはフィコール、緩衝化していない）
５．ＤＮＡラダーは、Ｑｉａｇｅｎキットを使用せずに、１０倍の変性溶液を追加することで４倍の最終濃度に調製できる。
６．０．８～１．０％のゲルをＨ２Ｏで電子レンジで沸騰するまで調製し、周囲温度で数分間静置する。
７．コームを備えたゲルトレーに注ぎ、低温室に置いて重合を促進する（２時間）
８．トレーを電気泳動ボックスに入れ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび２００ｍＭ ＮａＯＨで２時間平衡化し、時折撹拌して、ゲルとゲルボックスのＮａＯＨ濃度が均一になるようにする。
９．１Ｌの１倍変性溶液（５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を作製する。
１０．ゲルが０．５ｃｍ超の深さまで浸るように、十分な量をゲルボックスに注ぐ。
１１．大きなゲル（１５～２０ｃｍ）－２５Ｖで一晩ゲルを泳動する。中程度のゲル（８～１１ｃｍ）は、２０Ｖで一晩泳動する。
ゲル泳動後
１２．ゲルをトレーに移し、ｄＨ２Ｏで洗浄する
１３．排出し、１ｘＴＢＥまたはＴＡＥでゲルを中和する（穏やかに撹拌しながら２０分）
１４．ゲルを１ｘＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを含むｄＨ２Ｏ（または１ｘＴＢＥ／ＴＡＥ）に移す（穏やかに撹拌しながら２０分）
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（ＤＭＳＯで１０，０００倍濃縮）カタログ番号Ｓ１１４９４
１５．落射蛍光（青）またはＵＶ（３１２ｎｍ）による画像ゲル
単離されたＤＮＡベクター－ベクターは、図５および図６に示すように、未変性または変性条件下でアガロースゲル電気泳動によって同定される。ＤＮＡベクターは、図５Ａに提示されるように、変性ゲルに複数のバンドを生成する。各バンドは、未変性状態で異なるコンフォメーションを有するベクター、例えば連続、非連続、単量体、二量体などを表し得る。
単離されたＤＮＡベクターの構造を、共感染Ｓｆ９細胞から得られたＤＮＡ（本明細書に記載されるように）を、ａ）ＤＮＡベクター内の単一切断部位のみの存在、およびｂ）０．８％変性アガロースゲル（＞８００ｂｐ）上で分画した場合に明らかに見えるほど十分に大きい、得られる断片について選択された、制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、さらに分析した。
具体的には、等量（ＯＤ２６０に基づいて２μｇ）のＴＴＸ－プラスミドおよびＴＴＸ－ベクターを、制限エンドヌクレアーゼを用いて３７℃で１時間消化した。消化後、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを使用してＤＮＡベクター材料を単離し、水で溶出した。水中で作成した０．８％アガロースゲルを２時間平衡緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＯＨ）で前平衡化しながら、試料を変性溶液（０．０５Ｍ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で変性させた。次に、１倍変性溶液（５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に漬けたゲルに試料を４℃で一晩泳動した。翌日、ゲルを洗浄し、ＴＢＥで２０分間中和し、１ｘＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ水溶液に１時間浸漬し、ＵＶ／青照明の下で画像化した。
ＤＮＡベクターの存在は、最初に未変性ゲルで特徴的な複数バンドのパターン（一次バンドと二次バンドでは間隔が空いており、二次バンドが一次バンドの質量の約２倍の物質を表すことが示される）によって同定され、その後、図５Ａの右側に示される特徴的な複数バンドのパターンにより変性ゲルで確認される。図５Ｂに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状ＤＮＡベクターおよび直鎖状かつ連続的な構造を有するＴＴＸ－ベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するＤＮＡベクターは、１ｋｂおよび２ｋｂ断片を産生することが期待されるが、連続的な構造を有する非カプシド化ベクターは、２ｋｂおよび４ｋｂ断片を産生することが期待される。
図６は、ＴＴＸベクター１および２、３および４、５および６および７および８（すべて上記の表１Ａに記載）を有する実際の変性ゲルの例示的な写真であり、エンドヌクレアーゼ消化あり（＋）またはなし（－）である。各ＴＴＸベクターは、エンドヌクレアーゼ反応後に２つのバンド（＊）を産生した。サイズマーカーに基づいて決定された２つのバンドのサイズは、写真の下に表示される。バンドのサイズは、各ＴＴＸベクトルが連続構造を有することを確認する。
ＵＶ吸収に対するＴＴＸプラスミドの寄与は、ＴＴＸベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定された。例えば、ＵＶ吸光度に基づいて、４μｇのＴＴＸベクターをゲルに装填し、ＴＴＸベクターの蛍光強度が、１μｇであることが知られている２ｋｂバンドに相当する場合、１μｇのＴＴＸベクターが存在する。したがって、ＴＴＸベクターは、総ＵＶ吸収材料の２５％である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全ＴＴＸ－ベクターが８ｋｂであり、切除された比較バンドが２ｋｂである場合、バンド強度は、全インプットの２５％としてプロットされ、この場合、１．０μｇのインプットに対して０．２５μｇとなる。ＴＴＸプラスミド滴定を使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、ＴＴＸベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、ＴＴＸベクターにより表される全インプットのパーセント、または純度パーセントを判定することができる（図７）。
実施例４：ＤＮＡベクターは、インビトロで導入遺伝子によってコードされたタンパク質を発現する。
ヒト因子ＩＸ ｍＲＮＡのＳＡ野生型ｃＤＮＡ配列（「ｗｔＦＩＸ」、配列番号１１）またはｃＤＮＡ配列のＰａｄｕａ変異型（「ＰａｄｕａＦＩＸ」、配列番号１２）は、ＴＴＸプラスミド１のクローニング部位に導入され、ＴＴＸ－プラスミド１－ｗｔＦＩＸおよびＴＴＸ－プラスミド１－ＰａｄｕａＦＩＸをそれぞれ生成した。本明細書に記載の方法を用いて、これらのプラスミドをＳｆ９昆虫細胞に導入し、使用して、ＴＴＸ－バクミド１－ｗｔＦＩＸおよびＴＴＸ－バクミド１－ＰａｄｕａＦＩＸ、ならびにＴＴＸ－バキュロウイルス１－ｗｔＦＩＸおよびＴＴＸ－バキュロウイルス１－ＰａｄｕａＦＩＸをそれぞれ生成した。ＴＴＸプラスミドおよびＴＴＸベクターからのインビトロのタンパク質発現は、Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（３：１ Ｆｕｇｅｎｅ６：ＤＮＡ）を使用して、２５０ｎｇ／ウェルの（１）ＴＴＸ－プラスミド１－ｗｔＦＩＸ、（２）ＴＴＸ－プラスミド１－ＰａｄｕａＦＩＸ、（３）ＴＴＸ－ベクター１－ｗｔＦＩＸ、（４）ＴＴＸ－ベクター１－ＰａｄｕａＦＩＸ、（５）β（ベータ）－プラスミド１－ｗｔＦＩＸ、または（６）β（ベータ）－ベクター１－ｗｔＦＩＸでＨＥＫ２９３細胞（２Ｅ＋５細胞／ウェル、９６ウェルプレート）をトランスフェクションすることにより試験した。ウェスタンブロット分析の結果を図８に示す。ＦＩＸ抗体反応により、産生されたＦＩＸタンパク質の質量に対応する５５ｋＤａのバンドが明らかになった。β（ベータ）－プラスミド１－ｗｔＦＩＸまたはβ（ベータ）－ベクター１－ｗｔＦＩＸでトランスフェクションされた陰性対照溶解物は、検出可能な量のＦＩＸタンパク質を産生しなかった。この結果は、ＴＴＸ－ベクター１が、ヒト第ＩＸ因子をコードする遺伝子などの治療遺伝子の効果的な導入および発現に使用できることを確認している。
ＥＬＩＳＡ：簡潔に述べれば、トランスフェクションされた細胞からの培養培地を抗ＦＩＸ抗体処理ウェルに２連で加え、１時間インキュベーションし、続いて洗浄し、室温で１時間検出抗体とインキュベーションした。試料を再度洗浄し、ＴＭＢ基質を添加して１０分間展開し、停止し、試料の４５０ｎｍでの吸光度を即時に読み取った。ＴＭＢ基質反応後の試料の例を図１５Ａに示し、４５０ｎｍでの試料の吸光度に基づいて決定された各試料中のＦＩＸ濃度を図１５Ａに示す。ＴＴＸ－プラスミド１およびＴＴＸ－ベクター１からはＦＩＸタンパク質の高レベルの発現が検出されたが、β（比較）－プラスミドまたはβ（比較）ベクターからはＦＩＸの有意な発現は検出されなかった。
これにより、５’から３’のＷＴ複製ポリヌクレオチド配列（配列番号５１）、ＣＡＧプロモーター（配列番号３）、Ｒ３／Ｒ４クローニング部位（配列番号７）、ＷＰＲＥ（配列番号８）、ＢＧＨｐＡ（配列番号９）、および修飾複製ポリヌクレオチド配列（配列番号２）を含むＴＴＸ－プラスミド１から産生されたＴＴＸ－ベクター１を、ＷＰＲＥ（配列番号８）およびＢＧＨｐＡ（配列番号９）を含まないα（アルファ）－プラスミド１から産生されたα（アルファ）－ベクター１と比較すると、導入遺伝子の発現を誘導するのに有意に効果的であることが再度確認される。
実施例５：第ＩＸ因子およびｃＧＡＳ阻害剤を共発現するｃｅＤＮＡの調製
ｃＧＡＳを阻害するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ＯＲＦ５２（配列番号８８２）もしくはその変異型、または配列番号８８２のアミノ酸１６１～１１６２を欠く切断された細胞質ＬＡＮＡイソ型（ＬＡＮＡΔ１６１または配列番号８８４）は、実施例１および実施例４に記載されているように、プロモーターに作動可能に連結され、第ＩＸ因子導入遺伝子をコードするＴＴＸ９またはＴＴＸ１０プラスミドの制限クローニング部位Ｒ５に挿入される。したがって、実施例２～３に記載されるように、第ＩＸ因子およびｃＧＡＳ阻害剤の両方をコードするｃｅＤＮＡが調製される。
実施例６：ｃｅＤＮＡによって発現されるｃＧＡＳ阻害剤の発現の確認
ｃＧＡＳを阻害するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ＯＲＦ５２（配列番号８８２）もしくはその変異型、または切断された細胞質ＬＡＮＡイソ型（配列番号８８４）などのｃｅＤＮＡによって共発現する所望のｃＧＡＳ阻害剤の発現は、ＨｅＬａ細胞およびｃＧＡＳ阻害剤に特異的な抗体、例えばＬｉらに記載されているＯＲＦ５２に対する抗体を使用して確認できる。（“Ｋａｐｏｓｉ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｃＧＡＳ（ＫｉｃＧＡＳ）Ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ＯＲＦ５２，ｉｓ ａｎ Ａｂｕｎｄａｎｔ Ｔｅｇｕｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｐｒｏｇｅｎｙ Ｖｉｒｕｓｅｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１６，９０（１１）：５３２９）。例えば、ＨｅＬＡ細胞を培養し、例えば、Ｆｕｓｅｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（３：１；ｆｕｓｇｅｎｅ６：ＤＮＡ）を使用して、第ＩＸ因子および所望のｃＧＡＳ阻害剤を共発現する構築物の一過性トランスフェクションを実施する。当業者に知られているウェスタンブロット技術および／またはフローサイトメトリーは、ｃＧＡＳ阻害剤の発現を検出するために使用される。第ＩＸ因子の発現は、実施例４で説明されているように確認される。
実施例７：第ＩＸ因子およびＴＬＲ－９阻害剤を共発現するｃｅＤＮＡの調製
（ＴＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８８９）、ＯＤＮ－２１１４（ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８９０）、ポリ－Ｇ（ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、配列番号８９１）、ＯＤＮ－Ａ１５１（ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ、配列番号８９２）、Ｇ－ＯＤＮ（ＣＴＣＣ－ＴＡＴＴＧＧＧＧＧＴＴＴＣＣＴＡＴ、配列番号８９３）、ＩＲＳ－８６９（ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ、配列番号８９４）、ＩＮＨ－１（ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧ、配列番号８９５）、ＩＮＨ－４（ＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ、配列番号８９６）、（ＩＲＳ－６６１ ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴ－ＧＣＡＡＧＣＡ、配列番号８９７）、４０２４（ＴＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８９８）、４０８４Ｆ（ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ、配列番号：８９９）、ＩＮＨ－１３（ＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ、配列番号９００）、ＩＮＨ－１８（ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＡ、配列番号９０１）、およびＩＲＳ－９５４ ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ、配列番号９０２）などの以下の配列を含むヘアピン構造を形成できるオリゴヌクレオチドは、実施例１および実施例４に記述されているとおり、例えば、Ｒ５または第ＩＸ因子導入遺伝子をコードするＴＴＸ９もしくはＴＴＸ１０プラスミドの他の部位など、事前に選択された制限クローニング部位にライゲーションによって挿入できるように、５’から３’鎖と相補的な３’から５’鎖のアニーリング後、付着末端を有するように設計される。
例えば、適切な制限部位をもつオリゴは、各鎖を好適な緩衝液（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）で等モル量で混合することによりアニーリングし、９４℃で２分間加熱し、徐々に冷却する。多くの二次構造を有すると予測されるオリゴの場合、より緩やかな冷却／アニーリングステップが有益である。これは、オリゴ溶液を水浴またはヒートブロックに入れ、機械のプラグを抜く／電源を切ることによって行われる。アニーリングされたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼを含まない緩衝液中で希釈され、４℃で二本鎖のアニーリングされた形態で保存され得る。次に、ＴＬＲ－９阻害性オリゴ配列を有するｃｅＤＮＡプラスミドを精製し（例えば、ゲル電気泳動またはカラムにより）、ｃＤＮＡベクターを作製するために使用する。第ＩＸ因子をコードし、ＴＬＲ－９アンタゴニストを含むｃｅＤＮＡを調製することができる。
実施例８：ｃｅＤＮＡからの制御された導入遺伝子発現：インビボでのｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子発現は、再用量投与によって持続および／または増加させることができる。
ｃｅＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーター（配列番号３）、および非対称ＩＴＲ（例えば、５´ＷＴ－ＩＴＲ（配列番号１）と３´ｍｏｄ－ＩＴＲ（配列番号２））の間に隣接したインフラマソームアンタゴニストとして使用されるルシフェラーゼ導入遺伝子（配列番号７１）を含むｃｅＤＮＡプラスミドを使用して、上記の実施例１に記載される方法に従って産生され、異なる治療パラグラムにおいてインビボで評価された。このｃｅＤＮＡベクターは、実施例６～１０に記載されているすべての後続の実験で使用された。実施例６では、ｃｅＤＮＡベクターを精製し、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ ｃｅＤＮＡ）で製剤化し、各ＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳマウスの尾静脈に注入した。リポソームは、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、およびＰＥＧ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）リポソームを形成するための４つの構成成分を含む適切な脂質ブレンドで製剤化された。
ｃｅＤＮＡベクターからのインビボでの導入遺伝子の持続的な発現を長期間にわたって評価するために、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡをおよそ５～７週齢のＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳマウスに尾静脈内注入によって滅菌ＰＢＳで投与した。３つの異なる投与量群：０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、および１．０ｍｇ／ｋｇを、群あたり１０匹のマウス（群あたり１５匹のマウスを有していた１．０ｍｇ／ｋｇを除く）を評価した。注入は、０日目に投与された。各群からの５匹のマウスに、２８日目に追加の同一用量を注入した。ルシフェラーゼ発現は、ＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＷＴマウス）への静脈内投与後のＩＶＩＳ撮像によって測定された。ルシフェラーゼ発現は、３、４、７、１４、２１、２８、３１、３５、および４２日目、ならびに定期的に（例えば、毎週、隔週、または１０日毎、または２週間毎）、４２～１１０日に１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン基質を腹腔内注入した後、ＩＶＩＳ撮像によって評価した。３つの異なる投与プロトコル後、少なくとも１３２日間ＩＶＩＳ撮像によって測定された例示的インフラマソームアンタゴニストとしてのルシフェラーゼ導入遺伝子の発現（データは示していない）。
再用量、例えばＬＮＰ－ｃｅＤＮＡで治療した対象のＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ発現ルシフェラーゼの再投与の効果を調査するために、延長研究を実施した。特に、ｃｅＤＮＡベクターの１回以上の追加投与によって発現レベルが増加され得るかどうかを決定するために評価した。
この研究では、ｃｅＤＮＡベクターからのルシフェラーゼ発現の生体内分布を、０日目および２８日目（群Ａ）における、１．０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、プライミング用量）の初回静脈内投与後にＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳマウスにおけるＩＶＩＳによって評価した。ｃｅＤＮＡベクターの第２の投与は、８４日目に、１．２ｍＬの３ｍｇ／ｋｇ（Ｂ群）または１０ｍｇ／ｋｇ（Ｃ群）の尾静脈注入によって投与した。この研究では、群Ａ、Ｂ、およびＣの各々における５匹のＣＤ－１（登録商標）マウスを使用した。上記のような４９、５６、６３、および７０日目の追加投与前、ならびに８４日目と９１、９８、１０５、１１２、および１３２日目の再用量後に、ルシフェラーゼ発現についてのマウスのＩＶＩＳ撮像を実施した。ルシフェラーゼ発現は、少なくとも１１０日（評価された最長期間）まで、群Ａ、Ｂ、およびＣの３つすべてにおいて評価され、検出された。
ルシフェリンの存在下でのルシフェラーゼ活性の評価によって決定されるように、ルシフェラーゼの発現レベルは、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ－Ｌｕｃの再用量（すなわち、ｃｅＤＮＡ組成物の再投与）によって増加することが示された。３つの異なる投与プロトコル後、少なくとも１１０日間ＩＶＩＳ撮像によって測定された例示的インフラマソームアンタゴニストとしてのルシフェラーゼ導入遺伝子の発現（Ａ、ＢおよびＣ群）。追加の再用量（１ｍｇ／ｋｇプライミング用量（すなわち、群Ａ）治療を受けなかったマウスは、研究の期間にわたって安定したルシフェラーゼ発現が観察された。３ｍｇ／ｋｇの再用量のｃｅＤＮＡベクターを投与されたＢ群のマウスは、Ｃ群のマウスと比較して、観察された放射輝度のおよそ７倍の増加を示した。驚いたことに、１０ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクターは、いかなる再用量も受けていないマウス（Ａ群）と比較して、観察されたルシフェラーゼ放射輝度が１７倍増加した。
Ａ群は、０日目および２８日目での尾静脈への１ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクターの静脈内投与後の、ＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳマウスにおけるルシフェラーゼ発現を示す。Ｂ群およびＣ群は、第１の時点（０日目）で１ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクターを投与され、８４日目の第２の時点でｃｅＤＮＡベクターの投与により再投与されたＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳマウスにおけるルシフェラーゼ発現を示す。ｃｅＤＮＡベクターの第２の投与（すなわち、再用量）は、発現を少なくとも７倍、最大で１７倍まで増加させた。
Ｂ群の再用量投与におけるｃｅＤＮＡベクターの用量（すなわち、量）の３倍増加（すなわち、３ｍｇ／ｋｇが再用量で投与される）は、ルシフェラーゼの発現の７倍増加をもたらした。また、予期せぬことに、Ｃ群の再用量投与（すなわち、１０ｍｇ／ｋｇの再用量が投与される）におけるｃｅＤＮＡベクターの量の１０倍増加は、ルシフェラーゼの発現の１７倍増加をもたらした。したがって、ｃｅＤＮＡの第２の投与（すなわち、再用量）は、発現を少なくとも７倍、最大で１７倍まで増加させた。これは、再用量による導入遺伝子発現の増加が予想よりも大きく、再用量投与におけるｃｅＤＮＡベクターの用量または量に依存することを示し、０日目での初回プライミング投与からの初期導入遺伝子発現と相乗的であるように見える。すなわち、導入遺伝子発現の用量依存的増加は相加的ではなく、むしろ導入遺伝子の発現レベルは用量依存的であり、各時点で投与されるｃｅＤＮＡベクターの量の合計よりも大きい。
Ｂ群およびＣ群の両方は、第２の時点で、ｃｅＤＮＡベクターを再投与されなかった対照マウス（Ａ群）と比較して、ルシフェラーゼの発現に有意な用量依存的増加を示した。まとめると、これらのデータは、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現が、少なくとも第２の時点でｃｅＤＮＡベクターの再用量（すなわち、再投与）によって、用量依存的に増加され得ることを示す。
まとめると、これらのデータは、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子、例えば、インフラマソームアンタゴニストの発現レベルが少なくとも８４日間にわたって持続レベルで維持され得、少なくとも第２の時点で投与されたｃｅＤＮＡベクターの再用量後にインビボで増加され得ることを実証する。
実施例９：過飽和量のラパマイシンを含む合成ナノ担体
ポリマーＰＬＧＡ（３：１ラクチド：グリコリド、固有粘度０．３９ｄＬ／ｇ）およびＰＬＡ－ＰＥＧ（５ｋＤａ ＰＥＧブロック、固有粘度０．３６ｄＬ／ｇ）、および薬剤ラパマイシン（ＲＡＰＡ）を含むナノ担体組成物を水中油型乳化蒸発法を使用して合成できる。ポリマーおよびＲＡＰＡをジクロロメタンに溶解して有機相を形成する。乳濁液は、界面活性剤のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含む水相中で有機相を均質化することによって形成される。次に、乳濁液を大量の水性緩衝液と合わせ、混合して溶媒を蒸発させる。異なる組成物のＲＡＰＡ含量は、ＲＡＰＡ含量が増加するにつれて組成物がシステムのＲＡＰＡ飽和限界を超えるように変化する。組成物の飽和限界におけるＲＡＰＡ含量は、水相および分散ナノ担体相におけるＲＡＰＡの溶解度を使用して計算される。水相中の一次溶質としてＰＶＡを含む組成物では、水相中のＲＡＰＡの溶解度は、ＲＡＰＡが溶解したＰＶＡに対して１：１２５の質量比で溶解するように、ＰＶＡ濃度に比例することが見出される。記載のＰＬＧＡおよびＰＬＡ－ＰＥＧをナノ担体ポリマーとして含む組成物では、分散ナノ担体相におけるＲＡＰＡの溶解度は７．２％重量／重量であることが見出される。次の式を使用して、組成物の飽和限界でのＲＡＰＡ含量を算出できる。
ＲＡＰＡ含量＝Ｖ（０．００８ｃＰＶＡ＋０．０７２ｃｐｏｌ）
式中、ｃＰＶＡはＰＶＡの質量濃度、ｃｐｏｌはポリマーの合計質量濃度、Ｖは蒸発終了時のナノ担体懸濁液の体積である。
Figure 2022518504000066
１、２、および３では、一貫した６０％のＲＡＰＡが回収されず、水相と有機相の間の飽和未満の平衡型を示している。より多量のＲＡＰＡを含む残りのナノ担体では、一貫した６．８ｍｇのＲＡＰＡが回収されない。この一貫した絶対質量損失は、システムが過飽和型にあることを示している（つまり、１つ以上の相で過飽和である）。
実施例１０：過飽和ラパマイシンを含む合成ナノ担体は、抗体の発生を排除または遅延させる
ポリマーＰＬＧＡ（３：１ラクチド：グリコリド、固有粘度０．３９ｄＬ／ｇ）およびＰＬＡ－ＰＥＧ（５ｋＤａ ＰＥＧブロック、固有粘度０．３６ｄＬ／ｇ）、および薬剤ＲＡＰＡを含むナノ担体組成物を、実施例５に記載される水中油型乳化蒸発法を用いて合成される。異なる組成物のＲＡＰＡ含量は、ＲＡＰＡ含量が増加するにつれて組成物がシステムのＲＡＰＡ飽和限界を超えるように変化する。
Figure 2022518504000067
免疫寛容を誘導する組成物の能力を評価するために、同時投与されるナノ担体とキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とをマウスに週３回静脈内注射し、その後ＫＬＨのみを毎週抗原投与する。次いで、マウスの血清は、ＫＬＨ抗原投与後にＫＬＨに対する抗体について分析される。過飽和状態で作製され、最終ＲＡＰＡ装填が８％以上の組成物は、飽和以下で作製され、最終ＲＡＰＡ装填が５％以下の組成物よりも大きな程度でＫＬＨに対する抗体の発生の欠如または遅延を引き起こした。
実施例１１：過飽和量のラパマイシンを含む合成ナノ担体
ポリマーＰＬＡ（固有粘度０．４１ｄＬ／ｇ）およびＰＬＡ－ＰＥＧ（５ｋＤａ ＰＥＧブロック、固有粘度０．５０ｄＬ／ｇ）、および薬剤ＲＡＰＡを含むナノ担体組成物を、実施例９に記載される水中油型乳化蒸発法を用いて合成された。異なる組成物のＲＡＰＡ含量は、ＲＡＰＡ含量が増加したのにつれて組成物がシステムのＲＡＰＡ飽和限界を超えるように変化した。組成物の飽和限界におけるＲＡＰＡ含量は、実施例９に記載の方法を使用して計算した。記載のＰＬＡおよびＰＬＡ－ＰＥＧをナノ担体ポリマーとして含む組成物では、分散ナノ担体相におけるＲＡＰＡの溶解度は８．４％重量／重量であることが見出された。次の式を使用して、組成物の飽和限界でのＲＡＰＡ含量を算出した。
ＲＡＰＡ含量＝Ｖ（０．００８ｃＰＶＡ＋０．０８４ｃｐｏｌ）
式中、ｃＰＶＡはＰＶＡの質量濃度、ｃｐｏｌはポリマーの合計質量濃度、Ｖは蒸発終了時のナノ担体懸濁液の体積である。すべてのナノ担体ロットは、形成の最後に０．２２μｍフィルターで濾過される。
Figure 2022518504000068
ナノ担体１２～１５へのＲＡＰＡの添加量の増加にもかかわらず、ナノ担体の最終ＲＡＰＡ含量は増加しなかったが、フィルター処理量は減少した。これは、組成物がＲＡＰＡで過飽和になっており、過剰なＲＡＰＡが洗浄および／または濾過中に除去されることを示している。
実施例１２：ラパマイシンと同時投与された第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子をコードするｃｅＤＮＡをもつ血友病Ｂについての第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子
実験は、有害な変異（例えば、ｈＦ１Ｘの場合はＲ３３３Ｑ）を有するｈＦＩＸまたはｈＦＶＩＩＩ配列のノックインを含む第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子欠損マウスで行われる。雄の第ＩＸ因子または第ＦＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスは、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体と同時投与されるＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ（脂質ナノ粒子ｃｅＤＮＡ）の単回投与または反復投与を受け、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体は別個の組成物に含まれる。ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡベクターは、１．２ｍＬの容量で０．３～５ｍｇ／ｋｇの用量で、それぞれのマウスに同時投与され、ナノ担体ラパマイシン（実施例９～１１に記載されるように、例えば、過飽和ラパマイシン（例えば、ＳＶＰ－ラパマイシン））またはその類似体は、例えば、０．０５ｍｇ／ｋｇで、０．１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇまでで投与される。治療上有効な用量は、免疫応答の阻害の有効性をモニタリングし（例えば、単回投与および反復投与）、望ましい導入遺伝子の発現量を測定することによって決定される。各用量は、静脈内投与により投与することができる。ＳＶＰ－Ｒａｐは、例えば、０日目と１４日目に同時投与することができる。
血漿中の第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子の発現は、様々な時点、例えば１０、２０、３０、４０、５０、１０００および２００日以上で、実施例４に記載されているＥＬＩＳＡによって評価される。活性化部分トロンボプラスチン時間および出血時間は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の発現に対するラパマイシンまたは類似体の同時投与の有効性および効果の決定として測定することもできる。ラパマイシンと同時投与されたｃｅＤＮＡベクターを投与されたマウスは、ラパマイシンまたはその類似体を投与せずにｃｅＤＮＡベクターのみを投与されたマウスと比較して、より長期間にわたって第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子の発現の増加および／または持続を示すことが期待される。再投与時に、ｃｅＤＮＡベクターおよびラパマイシンの再投与を受けたマウスは、ラパマイシンを投与されずｃｅＤＮＡベクターの再投与を受けたマウスと比較して、サイトカイン分泌の活性化が少なく、導入遺伝子発現期間および治療効果が増加することがさらに予想される。同時投与のタイミングは、０、１、２、３、４、５、６、７、８時間ずらしてもよい。
実施例１３：第ＩＸ因子およびｃＧＡＳアンタゴニストをコードするｃｅＤＮＡをもつ血友病Ｂの第ＩＸ因子
実験は、有害な変異（Ｒ３３３Ｑ）をもつｈＦＩＸ配列のノックインを含む第ＩＸ因子欠損マウスで行われる。雄の第ＩＸ因子ノックアウトマウスは、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ（脂質ナノ粒子ｃｅＤＮＡ）の単回投与または反復投与を受ける。２つのＬＮＰ－ｃｅＤＮＡベクターが使用される。１）ヒト第ＩＸ因子（天然のヒト配列またはＰａｄｕａ ＦＩＸ変異型のいずれか）およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ＯＲＦ５２の両方をコードするＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ。比較ｃｅＤＮＡベクターとして、第ＩＸ因子のみをコードし、ｃＧＡＳ阻害剤をコードしないＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ。ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡベクターは、１．２ｍＬの容量で０．３～５ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれのマウスに投与される。各用量は、静脈内流体力学投与を介して投与されるべきである。血漿中の第ＩＸ因子の発現は、本明細書に記載のＥＬＩＳＡによって、様々な時点、例えば１０、２０、３０、４０、５０、１０００および２００日以上などで評価される。活性化部分トロンボプラスチン時間および出血時間は、有効性の決定としても測定される。ｈＦＩＸとＯＲＦ５２の両方を発現するｃｅＤＮＡベクターを投与されたマウスは、ＯＲＦ５２、すなわち他のｃＧＡＳ阻害剤を発現せずに第ＩＸ因子のみを発現するｃｅＤＮＡベクターを投与されたマウスと比較して、より長期間にわたって第ＩＸ因子の発現の増加および／または持続を示すことが予想される。さらに、再投与すると、ＯＲＦ５２と第ＩＸ因子の両方を含むｃｅＤＮＡベクターの再投与を受けたマウスは、第ＩＸ因子のみをコードするｃｅＤＮＡベクターの再投与を受けたマウスと比較して、サイトカイン分泌の活性化が少なく、導入遺伝子発現期間と治療効果が増加することがさらに予想される。ｃＧＡＳ阻害剤および第ＩＸ因子は異なるｃｅＤＮＡベクターで送達することができるが、好ましくは同じベクターによってコードされ、したがって、ｃＧＡＳの阻害は、第ＩＸ因子などの導入遺伝子をコードするｃｅＤＮＡベクターを受け取る同じ細胞で起こる。
実施例１４：自然免疫応答および第ＩＸ因子発現期間に及ぼすｃｅＤＮＡおよびｃＧＡＳアンタゴニストの同時投与の効果の決定
関心対象のｃｅＤＮＡとｃＧＡＳの阻害剤またはｃＧＡＳアンタゴニストの同時投与がインビトロで免疫応答（例えば、自然免疫応答）に及ぼす影響を調べるために、ｃＧＡＳ活性化を調べる機能アッセイにレポーター株を使用できる。このようなインビトロアッセイに有用なｃＧＡＳレポーター細胞株は、転写因子応答要素、例えばＮＦ－κＢ結合部位、ＡＰ－１結合部位、またはそれらの組み合わせの転写制御下で、完全長のヒトｃＧＡＳおよび分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。例えば、レポーター細胞は９６ウェルプレートに播種される。１６時間などの所定期間後、ｃＧＡＳの阻害剤を含む、または含まない、第ＩＸ因子を発現するｃｅＤＮＡを含む様々な量の組成物で細胞を刺激する。ＳＥＡＰなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、ｃＧＡＳの阻害剤がある場合とない場合の関心対象のｃｅＤＮＡの存在下でｃＧＡＳ活性化のレベルを比較することができる。ｃＧＡＳの阻害剤の存在下では、レポーター分子の活性化が少なくなることが予想される。
さらに、ｃＧＡＳノックアウトレポーター株を使用でき、例えば、ヒトＴＨＰ－１単球に由来する株は、これまでに同定された細胞質ＤＮＡセンサーをすべて発現するため（ＤＡＩを除いて）、ＤＮＡ感知経路を研究するために使用されることが多い細胞株である。このようなｃＧＡＳノックアウトレポーター株は、ルシフェラーゼやおよびＳＥＡＰ（分泌胚性アルカリホスファターゼ）などの１つ以上の誘導性分泌レポーター遺伝子を発現できる。レポーター遺伝子は、ＩＳＧ５４（インターフェロン刺激遺伝子）最小プロモーターの制御下にあり、１つ以上、例えば５つのＩＦＮ刺激応答要素と組み合わせることができる。レポーター遺伝子はまた、ＮＦ－κＢ応答要素などの応答要素の１つ以上、例えば５つのコピーに融合されたＩＦＮ－β最小プロモーターの制御下にあり得る。本明細書に記載のｃｅＤＮＡと組み合わせたｃＧＡＳの阻害剤の存在下でのｃＧＡＳ活性は、ノックアウト細胞株対親細胞株で比較することができる。
関心対象のｃｅＤＮＡとｃＧＡＳの阻害剤またはｃＧＡＳアンタゴニストの同時投与がエクスビボで免疫応答（例えば、自然免疫応答）のｃＧＡＳおよびＳＴＩＮＧ活性化に及ぼす効果を調べるために、例えば、末梢血の勾配密度遠心分離および磁気分離により、ヒト単球を単離することができる。これらの単球は、ｃＧＡＳの阻害剤の有無にかかわらず、関心対象のｃｅＤＮＡとの接触および／または活性化の前後に、適切な対照を使用して調べることができる。治療後、血清および細胞上清を使用して、インターロイキン（ＩＬ）－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）－１、および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αなどのｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の活性化の機能的読み出しとして、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を用いて、１つ以上のサイトカイン経路を測定する。さらに、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、ＮＦ－κＢの活性化を検証することができる。ｃＧＡＳの阻害剤の存在下では、ｃｅＤＮＡの投与時にサイトカイン経路の活性化とサイトカイン分泌が減少し、導入遺伝子の発現期間と治療効果が増加すると予想される。
関心対象のｃｅＤＮＡとｃＧＡＳの阻害剤またはｃＧＡＳアンタゴニストの同時投与がインビボで免疫応答（例えば、自然免疫応答）のｃＧＡＳおよびＳＴＩＮＧ活性化に及ぼす効果を調べるために、マウスモデルを使用することができる。マウスの血清またはリンパ球試料を、ｃＧＡＳの阻害剤の有無にかかわらず、第ＩＸ因子などの関心対象の導入遺伝子を発現するｃｅＤＮＡとの接触および／または活性化の前後に、適切な対照とともに検査する。治療後、血清および細胞上清を使用して、インターロイキン（ＩＬ）－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）－１、および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αなどのｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の活性化の機能的読み出しとして、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を用いて、１つ以上のサイトカイン経路を測定する。さらに、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、ＮＦ－κＢの活性化を検証することができる。ｃＧＡＳの阻害剤の存在下では、ｃｅＤＮＡの投与時に活性化およびサイトカイン分泌が減少し、導入遺伝子の発現期間と治療効果が増加すると予想される。
実施例１５：第ＩＸ因子およびＴＬＲ－９アンタゴニストをコードするｃｅＤＮＡをもつ血友病Ｂの第ＩＸ因子
実験は、有害な変異（Ｒ３３３Ｑ）をもつｈＦＩＸ配列のノックインを含む第ＩＸ因子欠損マウスで行われる。雄の第ＩＸ因子ノックアウトマウスは、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ（脂質ナノ粒子ｃｅＤＮＡ）の単回投与または反復投与を受ける。２つのＬＮＰ－ｃｅＤＮＡベクターが使用される。１）ヒト第ＩＸ因子（天然のヒト配列またはＰａｄｕａ ＦＩＸ変異型のいずれか）およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ＯＲＦ５２の両方をコードするＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ。比較ｃｅＤＮＡベクターとして、第ＩＸ因子のみをコードし、ｃＧＡＳ阻害剤をコードしないＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ。ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡベクターは、１．２ｍＬの容量で０．３～５ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれのマウスに投与される。各用量は、静脈内流体力学投与を介して投与されるべきである。血漿中の第ＩＸ因子の発現は、実施例４に記載のＥＬＩＳＡによって、様々な時点、例えば１０、２０、３０、４０、５０、１０００および２００日以上などで評価される。活性化部分トロンボプラスチン時間および出血時間は、有効性の決定としても測定される。ＴＬＲ－９アンタゴニストを含み、ｈＦＩＸを発現するｃｅＤＮＡベクターを投与されたマウスは、第ＩＸ因子のみを発現しＴＬＲ－９阻害剤を発現しないｃｅＤＮＡベクターを投与されたマウスと比較して、より長期間にわたって第ＩＸ因子の発現の増加および／または持続を示すことが期待される。さらに、再投与すると、ＴＬＲ－９阻害剤、例えばオリゴヘアピン配列および第ＩＸ因子を含むｃｅＤＮＡベクターの再投与を受けたマウスは、第ＩＸ因子のみをコードするｃｅＤＮＡベクターの再投与を受けたマウスと比較して、サイトカイン分泌の活性化が少なく、導入遺伝子発現期間と治療効果が増加することがさらに予想される。ＴＬＲ－９阻害剤および第ＩＸ因子は異なるｃｅＤＮＡベクターで、トランスで送達することができるが、好ましくは同じベクターによってコードされ、したがって、ＴＬＲ－９の阻害は、第ＩＸ因子などの導入遺伝子をコードするｃｅＤＮＡベクターを受け取る同じ細胞で起こる。
実施例１６：自然免疫応答および導入遺伝子発現期間に及ぼすｃｅＤＮＡおよびＴＬＲアンタゴニストの効果の決定
関心対象のｃｅＤＮＡおよびＴＬＲ９の阻害剤またはＴＬＲ９アンタゴニストの同時投与がインビトロで自然免疫応答に及ぼす効果を調べるために、ＴＬＲ９活性化の下流効果を調べるＴＬＲ９依存性機能アッセイ用にレポーター株を使用できる。ＴＬＲ９レポーター細胞株は、ＮＦ－κＢ結合部位、ＡＰ－１結合部位、またはそれらの組み合わせなどの転写因子応答要素の転写制御下で、完全長のヒトトール様レポーター９（ＴＬＲ９）および分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。例えば、レポーター細胞は９６ウェルプレートに播種される。１６時間などの所定期間後、ＴＬＲ９アンタゴニストを含む、または含まない、関心対象の導入遺伝子を発現するｃｅＤＮＡを含む様々な量の組成物で細胞を刺激する。そのようなアンタゴニストは、ＴＬＲ阻害オリゴヌクレオチドであり得る。ＳＥＡＰなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、ＴＬＲ９アンタゴニストがある場合とない場合の関心対象のｃｅＤＮＡの存在下でＴＬＲ９活性化のレベルを測定することができる。ＴＬＲ９の阻害剤の存在下では、レポーター分子の活性化が少なくなることが予想される。
関心対象のｃｅＤＮＡとＴＬＲ９の阻害剤またはＴＬＲ９アンタゴニストの同時投与がエクスビボで自然免疫応答のＴＬＲ９媒介性活性化に及ぼす効果を調べるために、例えば、末梢血の勾配密度遠心分離および磁気分離により、ヒト単球を単離することができる。これらの単球は、ＴＬＲ９アンタゴニストの有無にかかわらず、関心対象のｃｅＤＮＡとの接触および／または活性化の前後に、適切な対照を使用して調べることができる。治療後、血清および細胞上清を使用して、インターロイキン（ＩＬ）－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）－１、および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αなどのＴＬＲ９活性化の機能的読み出しとして、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を用いて、１つ以上のサイトカイン経路を測定する。０９１４８００の追加では、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、ＮＦ－κＢの活性化を検証することができる。ＴＬＲ９の阻害剤の存在下では、ｃｅＤＮＡの投与時にサイトカイン経路の活性化とサイトカイン分泌が減少し、導入遺伝子の発現期間と治療効果が増加すると予想される。
関心対象のｃｅＤＮＡおよびＴＬＲ９の阻害剤またはＴＬＲ９アンタゴニストの同時投与がインビボで自然免疫応答のＴＬＲ９媒介性活性化に及ぼす効果を調べるために、マウスモデルを使用できる。マウスの血清またはリンパ球試料を、ＴＬＲ９の阻害剤の有無にかかわらず、第ＩＸ因子などの関心対象の導入遺伝子を発現するｃｅＤＮＡとの接触および／または活性化の前後に、適切な対照とともに検査する。治療後、血清および細胞上清を使用して、インターロイキン（ＩＬ）－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）－１、および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αなどのｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の活性化の機能的読み出しとして、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を用いて、１つ以上のサイトカイン経路を測定する。さらに、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、ＮＦ－κＢの活性化を検証することができる。ＴＬＲ９の阻害剤の存在下では、ｃｅＤＮＡの投与時に活性化およびサイトカイン分泌が減少し、導入遺伝子の発現期間と治療効果が増加すると予想される。
実施例１７：ｃｅＤＮＡとＲＡＰＡのＬＮＰベクターへの合剤化
いくつかの実施形態では、ラパマイシンをｃｅＤＮＡベクターに直接パッケージすることが望ましい場合がある。このようなｃｅＤＮＡおよびＲＡＰＡの直接的合剤化の１つの非限定的な例は、次のとおりである。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のｃｅＤＮＡとラパマイシンの組み合わせは、ラパマイシンを含むアルコール脂質溶液とｃｅＤＮＡ水溶液とを、マイクロ流体装置（例えば、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標））を使用して１：３（体積／体積）の比率および総流量１２ｍｌ／分で混合することにより調製できる。全脂質とｃｅＤＮＡ重量の比は、約１０：１～３０：１であり得る。手短に言えば、イオン化脂質（例えば、ＭＣ３）、非カチオン性脂質（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ））、膜融合性をもたらすための構成成分（ステロールなど、例えば、コレステロール）、および複合脂質分子（ＰＥＧ－脂質など、例えば、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール、２０００（「ＰＥＧ－ＤＭＧ」）の平均ＰＥＧ分子量を有する））を、５０：１０：３８．５：１．５のモル比でアルコール（例えば、エタノール）に可溶化する。ラパマイシン次に、ラパマイシンを脂質溶液に溶解して所望の濃度にする。ｃｅＤＮＡを２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈する。ＬＮＰが（例えば、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）を使用して）形成された後、アルコールを除去し、透析によって酢酸ナトリウム緩衝液をＰＢＳに置き換える。アルコール除去および同時緩衝液交換は、例えば、透析またはタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションによって達成され得る。得られた脂質ナノ粒子は、０．２μｍ孔の滅菌フィルターを通して濾過され、上記のｃｅＤＮＡ ＬＮＰベクターと同様に保存される。
実施例１８：自然免疫応答および第ＩＸ因子発現期間に及ぼすｃｅＤＮＡベクターおよびラパマイシンまたはラパマイシン類似体の同時投与の効果の決定
関心対象のｃｅＤＮＡおよびラパマイシンまたは類似体の同時投与がインビトロで自然免疫応答に及ぼす効果を調べるために、ＴＬＲおよびｍＴＯＲＣ１の活性化の下流効果を調べる機能アッセイ用にレポーター株を使用できる。ＴＬＲ９レポーター細胞株は、ＮＦ－κＢ結合部位、ＡＰ－１結合部位、またはそれらの組み合わせなどの転写因子応答要素の転写制御下で、完全長のヒトトール様レポーター９（ＴＬＲ９）および分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。例えば、レポーター細胞は９６ウェルプレートに播種される。１６時間などの所定期間後、ラパマイシンまたはその類似体を含む、または含まない、関心対象の導入遺伝子を発現するｃｅＤＮＡを含む様々な量の組成物で細胞を刺激する。ＳＥＡＰなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、ラパマイシンまたはその類似体がある場合とない場合の関心対象のｃｅＤＮＡの存在下でｍＴＯＲＣ１活性化のレベルを測定することができる。ラパマイシンの存在下では、レポーター分子のより多くの活性化が見られ、サイトカインＩＬ－１０および他のサイトカインのＳＴＡＴ３誘導が減少すると予想される。
関心対象のｃｅＤＮＡとラパマイシンの同時投与がエクスビボで自然免疫応答の活性化に及ぼす効果を調べるために、例えば、末梢血の勾配密度遠心分離および磁気分離により、ヒト単球を単離することができる。これらの単球は、ラパマイシンまたはその類似体の有無にかかわらず、関心対象のｃｅＤＮＡとの接触および／または活性化の前後に、適切な対照を使用して調べることができる。処理後、血清および細胞上清を使用して、当業者に公知の任意のアッセイまたは方法を使用して、ｍＴＯＲＣ１活性化および／またはＩＬ－１０などの機能的読み出しとして１つ以上のサイトカイン経路を測定する。さらに、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、ＮＦ－ＫＢの活性化を検証することができる。ラパマイシンまたはその類似体の存在下では、ｃｅＤＮＡの投与時に、サイトカイン経路の活性化とサイトカイン分泌、例えばＩＬ－１０およびＩ型ＩＦＮが減少し、導入遺伝子の発現期間と治療効果が増加すると予想される。
実施例１９：第ＩＸ因子およびＴＬＲ－９阻害剤を共発現するｃｅＤＮＡベクターの調製
（ＴＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８８９）、ＯＤＮ－２１１４（ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８９０）、ポリ－Ｇ（ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、配列番号８９１）、ＯＤＮ－Ａ１５１（ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ、配列番号８９２）、Ｇ－ＯＤＮ（ＣＴＣＣ－ＴＡＴＴＧＧＧＧＧＴＴＴＣＣＴＡＴ、配列番号８９３）、ＩＲＳ－８６９（ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ、配列番号８９４）、ＩＮＨ－１（ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧ、配列番号８９５）、ＩＮＨ－４（ＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ、配列番号８９６）、（ＩＲＳ－６６１ ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴ－ＧＣＡＡＧＣＡ、配列番号８９７）、４０２４（ＴＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８９８）、４０８４Ｆ（ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ、配列番号：８９９）、ＩＮＨ－１３（ＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ、配列番号９００）、ＩＮＨ－１８（ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＡ、配列番号９０１）、およびＩＲＳ－９５４ ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ、配列番号９０２）などの以下の配列を含むヘアピン構造を形成できるオリゴヌクレオチドは、実施例１および実施例４に記述されているとおり、例えば、Ｒ５または第ＩＸ因子導入遺伝子をコードするＴＴＸ９もしくはＴＴＸ１０プラスミドの他の部位など、事前に選択された制限クローニング部位にライゲーションによって挿入できるように、５’から３’鎖と相補的な３’から５’鎖のアニーリング後、付着末端を有するように設計される。
例えば、適切な制限部位をもつオリゴは、各鎖を好適な緩衝液（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）で等モル量で混合することによりアニーリングし、９４℃で２分間加熱し、徐々に冷却する。多くの二次構造を有すると予測されるオリゴの場合、より緩やかな冷却／アニーリングステップが有益である。これは、オリゴ溶液を水浴またはヒートブロックに入れ、機械のプラグを抜く／電源を切ることによって行われる。アニーリングされたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼを含まない緩衝液中で希釈され、４℃で二本鎖のアニーリングされた形態で保存され得る。次に、ＴＬＲ－９阻害性オリゴ配列を有するｃｅＤＮＡベクターを精製し（例えば、ゲル電気泳動またはカラムにより）、ｃＤＮＡベクターを作製するために使用する。実施例２～３に記載されるように、第ＩＸ因子をコードし、ＴＬＲ－９アンタゴニストを含むｃｅＤＮＡベクターを調製することができる。ＴＬＲ－９阻害剤およびラパマイシンまたはラパマイシン類似体を発現するｃｅＤＮＡベクターの同時投与の効果を決定する方法が本明細書に記載されている。
実施例２０：第ＩＸ因子およびｃＧＡＳ阻害剤を共発現するｃｅＤＮＡベクターの調製
ｃＧＡＳを阻害するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ＯＲＦ５２（配列番号８８２）もしくはその変異型、または配列番号８８３のアミノ酸１６１～１１６２を欠く切断された細胞質ＬＡＮＡイソ型（ＬＡＮＡΔ１６１または配列番号８８４）は、実施例１および実施例４に記載されているように、プロモーターに作動可能に連結され、第ＩＸ因子導入遺伝子をコードするＴＴＸ９またはＴＴＸ１０プラスミドの制限クローニング部位Ｒ５に挿入される。したがって、実施例２～３に記載されるように、第ＩＸ因子およびｃＧＡＳ阻害剤の両方をコードするｃｅＤＮＡベクターが調製される。ｃＧＡＳ阻害剤およびラパマイシンまたはラパマイシン類似体を発現するｃｅＤＮＡベクターの同時投与の効果を決定する方法は本明細書にある。
実施例２１：ＬＮＰ製剤化ｃｅＤＮＡベクターのインビボでの持続的導入遺伝子発現
異なる脂質ナノ粒子を用いた実施例７の結果の再現性を、マウスにおいてインビボで評価した。０日目に、実施例６で使用したものとは異なるＬＮＰに封入されたＣＡＧプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ導入遺伝子を含むｃｅＤＮＡベクター、またはポリＣを含むがｃｅＤＮＡまたはルシフェラーゼ遺伝子を欠いている同じＬＮＰのいずれかをマウスに投与した。具体的には、およそ４週齢の雄ＣＤ－１（登録商標）マウスを、０．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ－ＴＴＸ－ルシフェラーゼまたは対照ＬＮＰ－ポリＣの単回注入で治療し、０日目に側尾静脈から静脈内投与した。１４日目に動物にルシフェリン１５０ｍｇ／ｋｇを２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内注入により全身投与した。ルシフェリン投与後およそ１５分で、各動物をインビボ撮像システム（「ＩＶＩＳ」）を使用して撮像した。
４匹のｃｅＤＮＡ治療されたマウスすべてにおいて肝臓の有意な蛍光が観察され、注入部位以外では動物において他の蛍光はほとんど観察されなかったことから、ＬＮＰがｃｅＤＮＡ構築物の肝臓特異的送達を媒介したこと、および送達されたｃｅＤＮＡベクターが、投与後少なくとも２週間にわたって、その導入遺伝子の持続的発現を制御可能であったことを示す。
実施例２２：ｃｅＤＮＡベクター投与によるインビボでの肝臓における持続的導入遺伝子発現
別の実験では、治療された動物の肝臓内のＬＮＰ送達されたｃｅＤＮＡの局在を評価した。関心対象の機能的導入遺伝子を含むｃｅＤＮＡベクターを、実施例１７で使用したものと同じＬＮＰに封入し、静脈内注入により０．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルでインビボでマウスに投与した。６時間後、マウスを終了させ、肝臓試料を採取し、標準的なプロトコルを使用してホルマリン固定し、パラフィン包埋した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）インサイチュハイブリダイゼーションアッセイを実施して、ｃｅＤＮＡ導入遺伝子に特異的なプローブを使用して、組織内のｃｅＤＮＡベクターを可視化し、発色反応およびヘマトキシリン染色（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して検出した。画像解析により、処置したマウスから採取した肝細胞試料にｃｅＤＮＡが存在することが確認された。当業者は、ルシフェラーゼがｃｅＤＮＡベクターで表５から選択される任意の核酸配列と置換できることを理解するであろう。
実施例２３：インビボでのｃｅＤＮＡの持続的眼導入遺伝子発現
肝臓以外の組織でのｃｅＤＮＡベクター導入遺伝子発現の持続可能性を評価して、インビボでの眼内投与後のｃｅＤＮＡベクターの耐性および発現を決定した。ルシフェラーゼを例示的な導入遺伝子として使用したが、当業者は、ルシフェラーゼ導入遺伝子を、表５Ａ～５Ｆに列挙されたもののいずれかからのインフラマソームアンタゴニスト配列で容易に置換することができる。
０日目に、およそ９週齢の雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、５μＬのｊｅｔＰＥＩ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）で製剤化されたルシフェラーゼ導入遺伝子を含むｃｅＤＮＡベクターまたはＪｅｔＰＥＩ（登録商標）で製剤化されたルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡのいずれかを、いずれも０．２５μｇ／μＬの濃度で網膜下注入した。各群において４匹のラットを試験した。動物を鎮静させ、３３ゲージ針を使用して、被験物質を右眼に網膜下注入した。各動物の左眼は未治療であった。注入直後、網膜下ブレブの存在を確認するために、光干渉トモグラフィーまたは眼底撮像で眼を確認した。標準的な手順に従って、ラットをブプレノルフィンおよび局所抗生物質軟膏で治療した。
７、１４、２１、２８、および３５日目に、両方の群の動物に、作りたてのルシフェリン１５０ｍｇ／ｋｇを、２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内注入を介して全身投与した。ルシフェリン投与後５～１５分で、イソフルラン麻酔下でＩＶＩＳを使用して、すべての動物を撮像した。眼を含む関心対象の領域の全流束［ｐ／ｓ］および平均流束［ｐ／ｓ／ｓｒ／ｃｍ２）は、５分間の曝露で得られた。結果は、未治療の眼（「注入されていない」）の各治療群の平均放射輝度に対する、治療された眼（「注入された」）の各治療群の平均輝度としてグラフ化した。有意な蛍光は、ｃｅＤＮＡベクターで治療された眼において容易に検出可能であったが、プラスミドで治療された眼でははるかに弱かった。３５日後、プラスミドを注入したラットは終了したが、ｃｅＤＮＡで治療されたラットについて研究を継続し、４２、４９、５６、６３、７０、および９９日目にルシフェリン注入およびＩＶＩＳ撮像を行った。結果は、ラットの眼に単回注入で導入されたｃｅＤＮＡベクターが、インビボでの導入遺伝子発現を媒介し、その発現が少なくとも注入後９９日まで高レベルで持続されたことを実証する。
実施例２４：ｃｅＤＮＡの流体力学的送達
げっ歯類の肝臓に核酸を導入する周知の方法は、流体力学的尾静脈注射によるものである。このシステムでは、カプセル化されていない核酸を大量に加圧注入すると、細胞透過性が一過性に増加し、組織や細胞に直接送達される。これは、マクロファージ送達など、宿主の免疫系の多くを迂回する実験的なメカニズムを提供する。したがって、裸のｃｅＤＮＡベクターの流体力学的注射後に観察されたルシフェラーゼ発現を、ＬＮＰカプセル化ｃｅＤＮＡのより伝統的な静脈内注射後に観察されたものと比較した。この実験では、ｃｅＤＮＡベクターは、野生型ＡＡＶ２左ＩＴＲおよび変異型右ＩＴＲを利用した。
簡潔に述べれば、ＣＡＧプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼをコードするｃｅＤＮＡベクターを調製し、ＬＮＰにカプセル化するか、カプセル化しないままにした。雄の成体ＣＤ－１マウスに、尾静脈注射により、（ｉ）ＬＮＰカプセル化ｃｅＤＮＡベクターを０．５ｍｇ／ｋｇの用量で５ｍＬ／ｋｇの総量で投与するか、または（ｉｉ）同じだがカプセル化していないベクターを０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で１．２ｍＬの総量で投与した。各治療群には３匹のマウスがいた。体重は１、２、および３日目に記録された。生存中の撮像は、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を使用して１日目および３日目に実施された。撮像のために、各マウスに、２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内注入を介して１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを注入した。１５分後、各マウスを麻酔し、撮像した。
５０倍低い用量で投与しても、ルシフェラーゼ発現は、流体力学的に注射したマウスで観察され、非流体力学的に注射されたマウス（約１０７最大全流束）よりも（約１０１０最大全流束）はるかに高かった（図９）。先の研究で、ｃｅＤＮＡベクターカーゴなしでＬＮＰ単独を投与しても免疫応答が引き起こされなかったため（データは示していない）、２つの用量群間の差異は、１つ以上の宿主免疫系のＬＮＰカプセル化ｃｅＤＮＡの関与、および流体力学的投与による該系の回避に起因し得ることが見出された。
実施例２５：培養細胞における免疫経路の調節およびｃｅＤＮＡベクター発現への影響
細胞系アッセイは、ｃｅＤＮＡ投与に対する宿主応答への様々な免疫経路の寄与の照合を容易にするために確立された。このアッセイでは、ＴＨＰ－１細胞（急性単球性白血病細胞株）をいくつかのバリエーションで使用する。ＮＦ－κＢ活性化（ＴＬＲ９経路、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）を用いたＳＥＡＰ検出による）およびＩＲＦ経路の活性化（Ｑｕａｎｔｉ－Ｌｕｃ（商標）を用いた分泌型ルシフェラーゼによる）の両方を検出するためのレポーター構築物を安定して組み込んだＴＨＰ－１ Ｄｕａｌ（商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｃＧＡＳ免疫経路の構成的ノックアウトをもつＴＨＰ－１細胞、ならびにＳＴＩＮＧ免疫経路の構成的ノックアウトをもつＴＨＰ－１細胞。特定経路の既知阻害剤を使用すると、特定の刺激に対する観察された免疫応答への内因性免疫経路の相対的な寄与をよりよく理解することが可能である。
簡潔に述べると、培養中のＴＨＰ－１細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で０．５ｘ１０６／ｍＬに希釈し、１５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。細胞を阻害剤で前処理した。所望の阻害剤をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）で希釈し、指定された試料ウェルに加えた。この実験では、Ａ１５１（オリゴヌクレオチドＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号８９２）およびＢＸ７９５（Ｎ－［３－［［５－ヨード－４－［［３－［（２－チエニルカルボニル）アミノ］プロピル］アミノ］－２－ピリミジニル］アミノ］フェニル］－１－ピロリジンカルボキサミド、ＣＡＳ７０２６７５－７４－９）は、各試料ウェルに０μＭ、０．６２５μＭ、１．２５μＭ、または２．５μＭの最終濃度で使用された。プレートを３７℃で２時間インキュベーションした。２００ｎｇの所望のｃｅＤＮＡベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００で１：３に希釈し、室温で５～１０分間インキュベーションした。次に、ｃｅＤＮＡベクター－リポフェクタミン複合体を試料ウェルに加えた。プレートを３７℃で２４時間インキュベーションした。ＮＦ－κＢ活性化およびＩＲＦ２活性化の量は、製造元の指示に従って、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）キットおよびＱｕａｎｔｉ－Ｌｕｃ（商標）キットによってそれぞれ定量化された。
ｃｅＤＮＡベクターの２つの異なる調製物をＴＨＰ－１二重レポーター細胞に投与することにより、両方ともインターフェロンの有意な誘導をもたらし、少なくとも１つの免疫経路の活性化を示している図１０Ａ）。特に、２つのＴＨＰ－１ノックアウト株のいずれかを同じ濃度のｃｅＤＮＡで処理した場合、インターフェロンの誘導は観察されず（図１０Ａ）、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路がｃｅＤＮＡ投与に応答したサイトカイン誘導に関与していることを示している。同様の結果は、ＴＨＰ－１二重レポーター細胞をｃｅＤＮＡとＢＸ７９５の両方で処理した場合にも見られ、ＢＸ７９５はＳＴＩＮＧ経路に特異的な阻害剤であり、ｃｅＤＮＡ誘導性インターフェロン誘導の抑止は、ＳＴＩＮＧ経路が関与していることを再び示唆している（図１０Ａ）。Ａ１５１は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路、ＴＬＲ９経路、およびインフラマソーム媒介性免疫経路も阻害することが知られている。ＢＸ７９５処理で観察されたものと同様の効果を有した（図１０Ａ）。
第２の実験では、ｃｅＤＮＡ投与による保護効果が認められるのに必要な阻害剤の濃度をアッセイした（図１０Ｂ）。Ａ１５１およびＡＳ１４１１の両方について、認められたインターフェロン誘導の阻害は濃度依存性であり、最大阻害は２．５μＭの濃度で認められた（図１０Ｂ）。
実施例２６：免疫応答に及ぼすｃｅＤＮＡ非メチル化ＣｐＧ含量の調節の影響
遺伝子配列のＣｐＧモチーフは、ＴＬＲ９ ＤＮＡ感知経路を刺激することが知られている。したがって、インビボでその配列を導入した場合に自然免疫経路の活性化に及ぼすｃｅＤＮＡ構築配列のＣｐＧモチーフの減少の影響を調べた。
Ａ．ｃｅＤＮＡ非メチル化ＣｐＧの最小化の影響を試験する細胞系アッセイ
（ｉ）ｃｅＤＮＡ投与に応答したＴＬＲ９経路の活性化、および（ｉｉ）そのような活性化に及ぼすＣｐＧの存在／メチル化状態の調節の効果を評価するために研究を実施した。この特定の研究では、緑色蛍光タンパク質を発現し、野生型左ＩＴＲおよび変異型右ＩＴＲを含むｃｅＤＮＡベクターが使用された。
ヒトＴＬＲ９を発現するＨＥＫ－２９３細胞（ＨＥＫ－ＢＬＵＥ．ｈＴＬＲ９細胞、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０，０００細胞で播種した。プレートを３７℃で一晩インキュベーションした。メチル化前処理を受けるｃｅＤＮＡ試料の場合、ｃｅＤＮＡベクター、緩衝液、Ｓ－アデノシルメチオニン、ＣｐＧメチルトランスフェラーゼ、および水を、当技術分野で既知の方法に従って５０μＬの総反応体積にする。反応を３７℃で１時間インキュベーションし、次に６５℃で２０分間加熱することにより停止した。反応混合物から市販の精製キット（ＰＣＲ ｃｌｅａｎ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を用いてｃｅＤＮＡを精製し、得られたＤＮＡ濃度を測定した。
細胞を任意の所望阻害剤で３時間前処理した－この実験では、Ａ１５１をウェルあたり１０μＭの最終濃度で使用した。前処理後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）で希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、またはＴＬＲ９経路を刺激することが知られている陽性対照ＯＤＮ２００６を使用して、３００ｎｇのｃｅＤＮＡを１：３の比率で細胞にトランスフェクションした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした。次に、Ｓｅａｐ発現（ＴＬＲ９経路の構成要素）をＱｕａｎｔｉ－ＢＬＵＥ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して測定した。
図１１Ａに示すように、ＯＤＮ２００６は強力なＮＦ－κＢ応答を誘導し、ｃｅＤＮＡ構築物はより少ない応答を誘導し、事前にメチル化された場合、応答はバックグラウンドレベルまで低下した。Ａ１５１（ＴＬＲ９経路を阻害することが知られている）と組み合わせると、ｃｅＤＮＡで処理した試料も最小限レベルのＮＦ－κＢ誘導を示した（図１１Ｂ）。これは、ＴＬＲ９経路がｃｅＤＮＡ投与に対する宿主の免疫応答に寄与することを最初に示している。さらに、メチル化によるＣｐＧ含量の最小化は、ｃｅＤＮＡによるＴＬＲ９活性化の大部分を排除し、この効果は、ＣｐＧ含量またはメチル化状態を変更することなく、Ａ１５１で細胞を前処理することによって模倣できた。
Ｂ．ｃｅＤＮＡ非メチル化ＣｐＧ最小化の影響を評価するマウス研究
ｃｅＤＮＡベクターにおけるＣｐＧ最小化の影響は、マウスでも評価された。マウスにｃｅＤＮＡベクターを投与した場合のサイトカイン応答およびｃｅＤＮＡにコードされた遺伝子の発現を測定した。
各々が導入遺伝子としてルシフェラーゼをコードする、３つの異なるｃｅＤＮＡベクターを使用した。第１のｃｅＤＮＡベクターは、多数の非メチル化ＣｐＧ（約３５０）（「ｃｅＤＮＡ高ＣｐＧ」）を有し、構成的ＣＡＧプロモーターを含んでいた。第２は、中程度数の非メチル化ＣｐＧ（約６０）（「ｃｅＤＮＡ低ＣｐＧ」）を有し、肝臓特異的ｈＡＡＴプロモーターを含んでいた。第３は、非メチル化ＣｐＧを含まず（「ｃｅＤＮＡ無ＣｐＧ」）、またｈＡＡＴプロモーターを含むように、第２のメチル化形態であった。他の点では、ｃｅＤＮＡベクターは同一であった。上記のようにベクターを調製した。
およそ４週齢の４匹の雄ＣＤ－１マウスの４つの群を、ＬＮＰに封入されたｃｅＤＮＡベクターまたはポリＣ対照のうちの１つで治療した。０日目に、各マウスに０．５ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクターを５ｍＬ／ｋｇの容量で単回静脈内尾静脈注入で投与した。－１、－、１、２、３、７日目、およびその後マウスが絶命するまで毎週、体重を記録した。全血試料および血清試料は、０、１、および３５日目に採取した。生存中の撮像は、７、１４、２１、２８、および３５日目、その後は毎週、インビボ撮像システム（ＩＶＩＳ）を使用して実施した。撮像のために、各マウスに、２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内注入を介して１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを注入した。１５分後、各マウスを麻酔し、撮像した。マウスは９３日目に絶命し、肝臓および脾臓を含む終末組織を収集した。サイトカイン測定は、０日目の投与の６時間後に行った。
同様の体重減少がｃｅＤＮＡ処理マウス群（５～７％）のそれぞれで観察され、その後７日目までに急速に回復した。０日目の試料のサイトカイン分析は、評価されたサイトカインの多くがすべての治療群で同様に上昇した一方、インターフェロンアルファ、腫瘍壊死因子アルファ、およびＭＩＰ－１アルファはすべて、高ＣｐＧ試料と比較して、低ＣｐＧ試料または無ＣｐＧ試料で減少したことを示した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。
低ＣｐＧおよび高ＣｐＧ ｃｅＤＮＡで処置された両マウスは、７日目および１４日目に有意な蛍光を示したが、蛍光は、高ＣｐＧマウスでは１４日後に急速に減少し、残りの研究では着実に減少した。対照的に、低ＣｐＧおよび無ＣｐＧ ｃｅＤＮＡで処置されたマウスの全流束は、安定した高レベルを維持し（図１２Ｃ）、ｃｅＤＮＡベクターにおける非メチル化ＣｐＧの存在をある閾値未満に維持し、それによってＴＬＲ９経路を誘起しないことを示唆しており、この経路は、この研究でｃｅＤＮＡにコードされたタンパク質の発現（したがって、蛍光）の他の方法で観察されたより急速な低減を回避するのに役立つ。
実施例２７：新生仔マウスにおける発現および宿主応答
先の実験では、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路が、細胞へのｃｅＤＮＡベクター投与時に観察されるサイトカイン誘導応答に少なくとも部分的に関係していることが示された。この経路は、未熟な免疫系をもつ新生仔マウスが活性のｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路を欠いているように、発生の後期に活性になることが知られている。したがって、ｃｅＤＮＡベクターの発現および持続性に及ぼす経路不在の影響を調べるために、新生仔マウスの実験が行われた。
野生型ＡＡＶ２左ＩＴＲおよび変異体右ＩＴＲおよびＣＡＧプロモーターを備えた、導入遺伝子としてルシフェラーゼをコードするｃｅＤＮＡベクターを使用した。上記のようにｃｅＤＮＡベクターを調製した。ｃｅＤＮＡベクター試料またはポリＣコントロールを、新生仔（８日齢）の雄ＣＤ－１マウスに、最大５ｍＬ／ｋｇの容量で０．１または０．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで尾静脈注射により静脈内投与した。各試料群には５つの複製物が含まれていた。体重は、１日目とおよび３日後に記録された。生存中の撮像は、７、１４、および２１日目に、インビボ撮像システム（ＩＶＩＳ）を使用して実施した。撮像のために、各マウスに、２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内注入を介して１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを注入した。１５分後、各マウスを麻酔し、撮像した。
注目すべきことに、ゼロ日注射後、どの治療群でも体重減少は観察されなかった。高レベルの総流束（導入されたｃｅＤＮＡベクターからのルシフェラーゼ発現を表す）がすべてのｃｅＤＮＡ投与動物で観察され、０．５ｍｇ／ｋｇの投与量は、最初の１４日間にわたって０．１ｍｇ／ｋｇの投与量よりも約１ｌｏｇ高い発現レベルをもたらした（図１３）。その後、発現レベルは安定し、両方の用量群で同じレベルで持続した。成体ＣＤ－１マウスでの同様の研究と比較して、新生仔マウスのｃｅＤＮＡベクター発現レベルは、１４日後でも少なくとも２対数多かった（データは示していない）。この結果は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の活性化の回避が、ｃｅＤＮＡベクターの発現および持続性の促進に有益であることを示唆している。
実施例２８：ｃｅＤＮＡの持続性、発現、およびサイトカイン誘導に及ぼす複数の免疫経路の調節の影響
先の研究では、培養細胞とマウスの両系でＴＬＲ９経路調節の効果を評価した。しかしながら、複数の分子経路が外来ＤＮＡに対する宿主応答に関与することが知られており、１つ以上の他の経路がｃｅＤＮＡ投与によって引き続き関与している場合、ＴＬＲ９経路の誘起を回避する影響は容易に観察されない可能性がある。これを試験するために、ＳＴＩＮＧ機能を抑止する変異をもつゴールデンチケットマウス株に即して、ＣｐＧを最小化したｃｅＤＮＡベクターを試験した。したがって、本実験により、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の活性を混乱させることなく、ＴＬＲ９経路を照合することができた。
各々が導入遺伝子としてルシフェラーゼをコードする、３つの異なるｃｅＤＮＡベクターを使用した。第１のｃｅＤＮＡベクターは多数の非メチル化ＣｐＧ（約３５０）を有し（「ｃｅＤＮＡ高ＣｐＧ」）、構成的プロモーター（ｃＥＴ）を含み、第２は中程度数の非メチル化ＣｐＧ（約６０）を有し（「ｃｅＤＮＡ低ＣｐＧ」）、第３は少数のＣｐＧ（約３６）を有したが、非メチル化ＣｐＧを含まないようにメチル化された（「ｃｅＤＮＡ無ＣｐＧ」）。第２および第３の両構築物は、肝臓特異的ｈＡＡＴプロモーターを含んでいた。他の点では、ｃｅＤＮＡベクターは同一であった。上記のようにベクターを調製した。
ｃｅＤＮＡベクター試料またはポリＣ対照のそれぞれを、雄ゴールデンチケットマウス（Ｔｍｅｍ１７３ｇｔ）に尾静脈注射により、５ｍＬ／ｋｇの容量で０．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで静脈内投与した。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクター試料の第２の用量が２２日目にマウスに投与された。各試料群には４つの複製物が含まれていた。体重は、投与日とおよび３日後に記録された。全血および血清試料は、０日目（投与６時間後）および２２日目（投与６時間後）に採取された。生存中の撮像は、７、１４、２２、２９、３６、および４３日目に、インビボ撮像システム（ＩＶＩＳ）を使用して実施した。撮像のために、各マウスに、２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内注入を介して１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを注入した。１５分後、各マウスを麻酔し、撮像した。マウスは４３日目に絶命し、肝臓および脾臓を含む終末組織を収集した。サイトカインの測定値は、０日目と２２日目に採血から採取された。
ｃｅＤＮＡ投与による体重減少は５％未満であり、３日目までに全事例で基本的に回復した。２２日目に再投与すると、処置マウスは再び体重の５％未満減少し、数日で急速に回復した。サイトカイン誘導は、０日目の血液試料から評価された（図１４Ａ）。ＩＬ－１８を除いて、アッセイされた各サイトカインのレベルは、ｃｅＤＮＡ構築物のＣｐＧの存在度と相関し（図１４Ａ）、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－６、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１アルファ、ＭＩＰ－１ベータおよびＲＡＮＴＥＳのｃｅＤＮＡ無ＣｐＧ処置マウスでは、誘導が低いか、またはまったく観察されなかった。再投与されたマウスでは、すべての試料が、０日目の読み取りと比較してすべてのサイトカインレベルの増加を示した（図１４Ｂ）が、再びＩＬ－１８を除く全事例で、活性化の程度は、投与されたｃｅＤＮＡベクターに存在するＣｐＧ量と相関した。
異なる治療群におけるルシフェラーゼの発現は、２２日目まで同様であった（図１４Ｃ）。その後、単回投与および再投与された両ｃｅＤＮＡ高ＣｐＧ試料で総流束が急激に減少した一方、低ＣｐＧ群および無ＣｐＧ群は一貫した総流束測定値を維持するか、高ＣｐＧ群と比較してシグナル損失が減弱した。組み合わせた結果により、投与されたｃｅＤＮＡベクターのＣｐＧ含量の最小化（拡大すれば、ＴＬＲ９自然免疫経路への関与の回避）が、処置されたゴールデンチケットマウスにおけるサイトカイン誘導の著しい低下およびｃｅＤＮＡからの遺伝子発現のより強力な持続に寄与したことが示される。
実施例２９：Ｒａｇ２マウスにおけるｃｅＤＮＡベクターの持続投与および再投与。
ｃｅＤＮＡベクターの遺伝子発現カセットにコードされている導入遺伝子のうちの１つ以上が、発現したタンパク質が外来であると認識される宿主環境（例えば、細胞または対象）で発現される状況では、宿主が発現産物の望ましくない枯渇をもたらし得る適応免疫反応を開始する可能性が存在し、これは、発現の欠如と混同される可能性がある。場合によっては、これは、通常の宿主環境に対して異種であるレポーター分子で起こり得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクター導入遺伝子の発現は、Ｂ細胞およびＴ細胞を欠くＲａｇ２マウスモデルにおいてインビボで評価されたため、ルシフェラーゼなどの非天然マウスタンパク質に対する適応免疫反応を開始しない。簡単に言うと、０日目に、ｃ５７ｂｌ／６およびＲａｇ２ノックアウトマウスに、０．５ｍｇ／ｋｇの、ルシフェラーゼを発現するＬＮＰ封入されたｃｅＤＮＡベクターまたはポリＣ対照を尾静脈注入により静脈内投与し、２１日目に、ある特定のマウスに同じＬＮＰ封入されたｃｅＤＮＡベクターを同じ用量レベルで再投与した。すべての試験群は、各々４匹のマウスで構成された。ルシフェリン注入後に週間隔でＩＶＩＳ撮像を実施した。
ＩＶＩＳ分析から観察された全流束を比較すると、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡベクター－Ｌｕｃを投与した野生型マウス（発現されたルシフェラーゼの存在の間接的測定）で観察された蛍光は、２１日後に徐々に減少したが、同じ治療を施したＲａｇ２マウスは、４２日の実験にわたってルシフェラーゼの比較的一定の持続的発現を示した（図１６Ａ）。野生型マウスで観察された減少のおよそ２１日の時点は、適応免疫反応がもたらされると予想される時間枠に対応する。Ｒａｇ２マウスにおけるＬＮＰ－ｃｅＤＮＡベクターの再投与は、発現の顕著な増加をもたらし、これは、この研究で追跡された少なくとも２１日間にわたって持続した（図１６Ｂ）。結果は、非天然タンパク質が、宿主においてｃｅＤＮＡベクターから発現されるときに適応免疫が役割を果たすことができ、初回投与から２０日以上の時間枠で観察された発現の減少が、発現の低下ではなく（またはそれに加えて）、発現された分子に対して交絡する適応免疫反応を知らせることができることを示唆する。注目すべきことに、宿主が発現された分子を自己として適切に認識し、そのような免疫反応を起こさないことが予想される宿主において未変性タンパク質を発現する場合、この反応は低いと予想される。
実施例３０：持続的発現に対する肝臓特異的発現およびＣｐＧ調節の影響
実施例２９に記載されているように、望ましくない宿主免疫反応は、場合によっては、導入されたｃｅＤＮＡベクターからの１つ以上の所望の導入遺伝子の持続的発現であるものを人工的に弱めることがある。ｃｅＤＮＡベクターからの持続的発現に対する潜在的な宿主免疫反応の回避および／または抑制の影響を評価するために、２つのアプローチが取られた。第１に、前の実施例で使用されたｃｅＤＮＡ－Ｌｕｃベクターは構成的ＣＡＧプロモーターの制御下にあったため、肝臓特異的プロモーター（ｈＡＡＴ）または異なる構成的プロモーター（ｈＥＦ－１）を使用して同様の構築物を作製して、骨髄細胞または非肝臓組織への長期曝露を回避することで、観察された免疫効果が低減したかどうかを判断した。第２に、ある特定のｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ構築物は、宿主免疫反応の既知のトリガーであるＣｐＧ含有量が低減するように操作された。そのような操作され、プロモーターが切り替えられたｃｅＤＮＡベクターをマウスに投与した際のｃｅＤＮＡコード化ルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した。
各々が導入遺伝子としてルシフェラーゼをコードする、３つの異なるｃｅＤＮＡベクターを使用した。１つ目のｃｅＤＮＡベクターは、多数の非メチル化ＣｐＧ（約３５０）を有し、構成的ＣＡＧプロモーター（「ｃｅＤＮＡ ＣＡＧ」）を含んでいた。２つ目は、中程度の数の非メチル化ＣｐＧ（約６０）を有し、肝臓特異的ｈＡＡＴプロモーター（「ｃｅＤＮＡ ｈＡＡＴ低ＣｐＧ」）を含んでいた。また３つ目は、非メチル化ＣｐＧを含まず、ｈＡＡＴプロモーター（「ｃｅＤＮＡ ｈＡＡＴ無ＣｐＧ」）を含むように、２つ目のメチル化形態であった。他の点では、ｃｅＤＮＡベクターは同一であった。上記のようにベクターを調製した。
およそ４週齢の４匹の雄ＣＤ－１（登録商標）マウスの４つの群を、ＬＮＰに封入されたｃｅＤＮＡベクターまたはポリＣ対照のうちの１つで治療した。０日目に、各マウスに０．５ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクターを５ｍＬ／ｋｇの容量で単回静脈内尾静脈注入で投与した。－１、－、１、２、３、７日目、およびその後マウスが絶命するまで毎週、体重を記録した。全血試料および血清試料は、０、１、および３５日目に採取した。生存中の撮像は、７、１４、２１、２８、および３５日目、その後は毎週、インビボ撮像システム（ＩＶＩＳ）を使用して実施した。撮像のために、各マウスに、２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内注入を介して１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを注入した。１５分後、各マウスを麻酔し、撮像した。マウスは９３日目に絶命し、肝臓および脾臓を含む終末組織を収集した。サイトカイン測定は、０日目の投与の６時間後に行った。
すべてのｃｅＤＮＡ治療マウスは、７日目および１４日目に有意な蛍光を示したが、蛍光は、ｃｅＤＮＡ ＣＡＧマウスでは１４日後に急速に減少し、残りの研究では徐々に減少した。対照的に、ｃｅＤＮＡ ｈＡＡＴ低ＣｐＧおよび無ＣｐＧ治療マウスの全流束は、安定した高レベルのままであった（図１７）。これは、ｃｅＤＮＡベクターの送達を特異的に肝臓に向けることで、単回注入後、少なくとも７７日間にわたってベクターからの持続的で耐久性のある導入遺伝子発現がもたらされたことを示唆していた。ＣｐＧが最小化されているか、またはＣｐＧ含有量が完全に存在しない構築物は、同様の耐久性のある持続的発現プロファイルを有していたが、高ＣｐＧ構成的プロモーター構築物は、経時的に発現の低下を呈し、ｃｅＤＮＡベクターの導入による宿主免疫活性化が、対象におけるそのようなベクターから観察された発現の減少において役割を果たし得ることを示唆している。これらの結果は、組織の制限されたプロモーターを選択すること、および／または宿主の免疫反応（潜在的に導入遺伝子特異的な反応）が観察された場合にｃｅＤＮＡベクターのＣｐＧ含有量を変更することによって、反応の持続時間を所望のレベルに調整する代替的な方法を提供する。
実施例３１：インフラマソームアンタゴニストのインビボ発現
適切なタンパク質発現およびインビトロでの受容細胞の機能が確認されたら、インビボでの発現およびタンパク質機能を検証するため、インフラマソームアンタゴニストをコードする配列を有するｃｅＤＮＡベクターを脂質ナノ粒子で製剤化し、様々な時点で（子宮内、新生児、４週齢および８週齢）各タンパク質産生の機能的発現を欠損するマウスに投与される。
ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡベクターは、１．２ｍＬの容量で０．３～５ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれのマウスに投与される。各用量は、静脈内流体力学的投与を介して投与されるか、または例えば腹腔内注入によって投与される。正常なマウスへの投与は、対照として機能し、また、治療用タンパク質の存在および量を検出するためにも使用され得る。
ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡの急性投与、例えば、単回投与に続いて、レシピエントマウスの肝臓組織における発現は、例えば１０、２０、３０、４０、５０、１０００および２００日以上などの様々な時点で測定される。具体的には、マウスの肝臓および胆管の試料が得られ、組織切片の免疫染色を用いてタンパク質の存在が分析される。タンパク質の存在は、定量的に評価され、組織およびその中の細胞内の適切な局在化についても評価される。肝臓（例えば、肝および上皮）および胆管（例えば、胆管細胞）の細胞は、タンパク質発現について評価される。
実施例３２：治療遺伝子（例えば、第ＩＸ因子）およびＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤を同時発現するｃｅＤＮＡの調製。
Ａ１５１（配列番号８９２）またはＡＩＭ２を阻害するその変異体は、プロモーターに作動可能に連結され、実施例１に記載されているｃｅＤＮＡベクターの制限クローニング部位Ｒ５に挿入される。このようにして、第ＩＸ因子およびＡＩＭ２阻害剤の両方をコードするｃｅＤＮＡが調製される。
実施例３３：ｃｅＤＮＡによって発現されるＮＬＲＰ３インフラマソーム阻害剤の発現の確認
Ａ１５１（配列番号８９２）などのｃｅＤＮＡによって同時発現される、望ましいＮＬＲＰ３またはＡＩＭ２またはカスパーゼ－１阻害剤の発現は、ＨｅＬａ細胞および阻害剤に特異的な抗体を使用して確認することができる。例えば、ＨｅＬａ細胞を培養し、第ＩＸ因子および所望のＮＬＲＰ３またはＡＩＭ２またはカスパーゼ１阻害剤を同時発現する構築物の一過性トランスフェクションを、例えばＦｕｓｅｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（３：１；ｆｕｓｇｅｎｅ６：ＤＮＡ）を使用して実施する。当業者に知られているウェスタンブロット技術および／またはフローサイトメトリーを使用して、ＮＬＲＰ３またはＡＩＭ２またはカスパーゼ－１阻害剤の発現を検出する。
実施例３４：第ＩＸ因子およびＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤をコードするｃｅＤＮＡをもつ血友病Ｂの第ＩＸ因子。
実験は、有害な変異（Ｒ３３３Ｑ）をもつｈＦＩＸ配列のノックインを含む第ＩＸ因子欠損マウスで行われる。雄の第ＩＸ因子ノックアウトマウスは、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ（脂質ナノ粒子ｃｅＤＮＡ）の単回投与または反復投与を受ける。２つのＬＮＰ－ｃｅＤＮＡベクターが使用される。１）ヒト第ＩＸ因子（天然のヒト配列またはＰａｄｕａ ＦＩＸ変異型のいずれか）およびＡ１５１（配列番号８９２）の両方をコードするＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ。比較ｃｅＤＮＡベクターとして、第ＩＸ因子のみをコードし、ｃＧＡＳ阻害剤をコードしないＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ。ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡベクターは、１．２ｍＬの容量で０．３～５ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれのマウスに投与される。各用量は、静脈内流体力学投与を介して投与されるべきである。血漿中の第ＩＸ因子の発現は、ＥＬＩＳＡによって、様々な時点、例えば７、１４および２１日以上などで評価される。活性化部分トロンボプラスチン時間および出血時間は、有効性の決定としても測定される。ｈＦＩＸとＡ１５１の両方を発現するｃｅＤＮＡベクターを投与されたマウスは、Ａ１５１、または他のＮＬＲＰ３もしくはＡＩＭ２もしくはカスパーゼ－１阻害剤を発現せずに第ＩＸ因子のみを発現するｃｅＤＮＡベクターを投与されたマウスと比較して、より長期間にわたって第ＩＸ因子の発現の増加および／または持続を示すことが予想される。さらに、再投与すると、Ａ１５１と第ＩＸ因子の両方を含むｃｅＤＮＡベクターの再投与を受けたマウスは、第ＩＸ因子のみをコードするｃｅＤＮＡベクターの再投与を受けたマウスと比較して、サイトカイン分泌の活性化が少なく、導入遺伝子発現期間と治療効果が増加することがさらに予想される。ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤および第ＩＸ因子は、異なるｃｅＤＮＡベクターで送達することができるが、それらは同じベクターによってコードされることが好ましく、したがって、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤の阻害は、第ＩＸ因子などの導入遺伝子をコードするｃｅＤＮＡベクターを受け取る同一細胞で生じる。
実施例３５：自然免疫応答および第ＩＸ因子発現期間に及ぼすｃｅＤＮＡおよびＮＬＲＰ３インフラマソーム阻害剤の同時投与の効果の決定
関心対象のｃｅＤＮＡおよびＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤の同時投与がインビトロで自然免疫応答に及ぼす効果を調べるために、ＮＬＲＰ３インフラマソームまたはカスパーゼ－１の活性化を調べる機能アッセイ用にレポーター株を使用できる。このようなインビトロアッセイに有用なＮＬＲＰ３インフラマソームレポーター細胞株は、転写因子応答要素、例えばＮＦ－κＢ結合部位、ＡＰ－１結合部位、またはそれらの組み合わせの転写制御下で、完全長のＮＬＲＰ３および分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。例えば、レポーター細胞は９６ウェルプレートに播種される。１６時間などの所定期間後、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤を含む、または含まない、第ＩＸ因子を発現するｃｅＤＮＡを含む様々な量の組成物で細胞を刺激する。ＳＥＡＰなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤がある場合とない場合の関心対象のｃｅＤＮＡの存在下で、カスパーゼ－１活性化、またはＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化のレベルを比較することができる。ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤の存在下では、レポーター分子の活性化が少なくなることが予想される。同じレポーターアッセイを使用して、カスパーゼ－１の阻害剤を評価できる。
同様に、関心対象のｃｅＤＮＡおよびＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤の同時投与がインビトロで自然免疫応答に及ぼす効果を調べるために、ＡＩＭ２インフラマソームまたはカスパーゼ－１の活性化を調べる機能アッセイ用にレポーター株を使用できる。このようなインビトロアッセイに有用なＡＩＭ２インフラマソームレポーター細胞株は、転写因子応答要素、例えばＮＦ－κＢ結合部位、ＡＰ－１結合部位、またはそれらの組み合わせの転写制御下で、完全長のヒトＡＩＭ２および分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する、安定して同時トランスフェクションされた細胞株であり得る。アッセイは、ＮＬＲＰ３インフラマソームレポーターアッセイのように行うことができ、例えば９６ウェルプレートに播種されたレポーター細胞は、所定期間後、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤を含む、または含まない、第ＩＸ因子を発現するｃｅＤＮＡを含む様々な量の組成物で刺激される。ＳＥＡＰなどのレポーター遺伝子の活性は、当業者に知られている任意の方法またはアッセイを使用して分析し、ＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤がある場合とない場合の関心対象のｃｅＤＮＡの存在下で、カスパーゼ－１活性化、またはＡＩＭ２インフラマソーム活性化のレベルを比較することができる。ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤の存在下では、レポーター分子の活性化が少なくなることが予想される。同じレポーターアッセイを使用して、カスパーゼ－１の阻害剤を評価できる。
さらに、ＮＬＲＰ３インフラマソームまたはＡＩＭ２インフラマソームのノックアウトレポーター株を使用でき、例えば、ＴＨＰ１－ｄｅｆＮＬＲＰ３細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）またはＴＲＩＭ１１を過剰発現するＴＨＰ－１細胞は、ＡＩＭ２インフラマソームを抑制し（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１６）１６：１９８８－２００２）、当技術分野で他の細胞株が知られている。このようなＡＩＭ２またはＮＬＲＰ３ノックアウトレポーター株は、ルシフェラーゼやおよびＳＥＡＰ（分泌胚性アルカリホスファターゼ）などの１つ以上の誘導性分泌レポーター遺伝子を発現できる。レポーター遺伝子は、ＩＳＧ５４（インターフェロン刺激遺伝子）最小プロモーターの制御下にあり、１つ以上、例えば５つのＩＦＮ刺激応答要素と組み合わせることができる。レポーター遺伝子はまた、ＮＦ－κＢ応答要素などの応答要素の１つ以上、例えば５つのコピーに融合されたＩＦＮ－β最小プロモーターの制御下にあり得る。本明細書に記載のｃｅＤＮＡと組み合わせたＮＬＲＰ３またはＡＩＭ２またはカスパーゼ－１の少なくとも１つの阻害剤の存在下におけるＮＬＲＰ３またはＡＩＭ２またはカスパーゼ－１の活性は、ノックアウト細胞株対親細胞株で比較することができる。
エクスビボでＮＬＲＰ３および／もしくはＡＩＭ２インフラマソーム経路の活性化に及ぼす関心対象のｃｅＤＮＡとＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤および／もしくはＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤、またはＮＬＲＰ３アンタゴニストもしくはＡＩＭ２アンタゴニストの同時投与の効果を調べるために、例えば、末梢血の勾配密度遠心分離および磁気分離により、ヒト単球を単離することができる。これらの単球は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤および／またはＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤、またはＮＬＲＰ３アンタゴニストまたはＡＩＭ２アンタゴニスト、またはカスパーゼ－１阻害剤の有無にかかわらず、適切な対照を用いて、関心対象のｃｅＤＮＡとの接触および／または活性化の前後に調べることができる。治療後、血清および細胞上清を使用して、当業者に知られるいずれかのアッセイまたは方法を用いて、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の活性化および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤の機能的読み出しとして１つ以上のサイトカイン経路、例えば、インターロイキン（ＩＬ）－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１８、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、インターフェロン（ＩＦＮ）－α、単球化学誘引タンパク質（ＭＣＰ）－１、ＩＰ－１０、および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αを測定する。さらに、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、ＮＦ－κＢの活性化を検証することができる。ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１阻害剤の存在下では、ｃｅＤＮＡの投与時にサイトカイン経路の活性化とサイトカイン分泌が減少し、導入遺伝子の発現期間および治療効果の増加を促進すると予想される。
ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の活性化、またはインビボでのカスパーゼ１活性化に及ぼす関心対象のｃｅＤＮＡと、ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１阻害剤の同時投与の効果を調べるために、マウスモデルを使用できる。ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１阻害剤の有無にかかわらず、第ＩＸ因子などの関心対象の導入遺伝子を発現するｃｅＤＮＡとの接触および／または活性化の前後に、マウスの血清またはリンパ球試料を適切な対照を用いて調査する。治療後、血清および細胞上清を使用して、当業者に知られるいずれかのアッセイまたは方法を用いて、ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の活性化、またはカスパーゼ１活性化の機能的読み出しとして１つ以上のサイトカイン経路、例えば、インターロイキン（ＩＬ）－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１８、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、インターフェロン（ＩＦＮ）－α、単球化学誘引タンパク質（ＭＣＰ）－１、および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αを測定する。さらに、核抽出物を使用して、当業者に知られている任意のアッセイまたは方法を使用して、ＮＦ－κＢの活性化を検証することができる。ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１阻害剤の存在下では、ｃｅＤＮＡの投与時に免疫活性化とサイトカイン分泌が減少し、導入遺伝子の発現期間および治療効果の増加を促進すると予想される。
プラスミドＴＴＸ－９から産生されたヒト第ＩＸ因子を発現する関心対象のｃｅＤＮＡと、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤およびカスパーゼ－１の同時投与が評価された。Ｃ５７ｂＬマウス群（ｎ＝８）は、表１１に示すように評価された。
Figure 2022518504000069
簡潔に述べれば、表１２に示す群に従って、動物をマクロファージ活性化の阻害剤または対照で前処置した。０．５ｍｇ／ｋｇ ｃｅＤＮＡ（ＴＴＸ９－ＬＮＰ）（群１）またはＬＮＰ－ｓｉＲＮＡ（陰性対照）（群１）を外側尾静脈を介した静脈内投与する１２～１６時間前、および１時間前にも、動物にＭＣＣ９５０（ＮＬＲＰ２阻害剤）（群５）またはＶＸ７６５（ベルナカサン；選択的カスパーゼ－１阻害剤）（群４）を腹腔内投与した。前処置対照群には、クロドロネート単独を投与した（溶媒対照）（群３）。全血は、０、１、７、および２１日目に各群から尾静脈または顔面静脈または眼窩出血を介して採取された。
Figure 2022518504000070
サイトカインレベルは、Ｌｕｍｉｎｅｘの技術基盤を用いて種々のサイトカインおよびケモカインのレベルを測定するための定量的多重ビーズ系免疫アッセイである、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造元の指示に従って定量および評価された。実験マウスから得た試料を、あらかじめ混合されたカスタムマウスサイトカイン８プレックスキット、磁気ビーズと混合し、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＰ－１０、ＩＬ－１８、ＩＬ－１β、ＭＣＰ－１、およびＴＮＦ－アルファのレベルについてアッセイした。図１８Ａ～１８Ｈでは、ＮＬＲＰ３阻害剤（ＭＣＣ９５０）またはカスパーゼ１阻害剤（ＶＸ７６５）による薬理学的マクロファージ枯渇を伴うＴＴＸ－９投与後のサイトカインレベルを評価した。ＩＦＮγおよびＩＬ－１８のレベルは、ＭＣＣ９５０（ＮＬＲＰ３阻害剤）処置により有意に低減し（図１８Ｂおよび図１８Ｄ）、ＭＣＣ９５０によりＩＰ－１０のレベルは低減した（図１８Ｆ）。ＩＬ－１８のレベルもＶＸ７６５（カスパーゼ－１阻害剤）により低減した（図１８Ｄ）。
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 参照文献
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Claims (156)

  1. 導入遺伝子が細胞で発現したときに免疫応答を阻害するための方法であって、
    共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）を含む組成物を前記細胞に投与することであって、前記ｃｅＤＮＡベクターが、２つの隣接する逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含む、投与することと、
    前記免疫応答の少なくとも１つの阻害剤を前記細胞に投与することと、を含む、方法。
  2. 前記免疫応答が、自然免疫応答である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記免疫応答の前記阻害剤が、前記自然免疫応答の阻害剤である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、前記免疫応答の前記少なくとも１つの阻害剤をさらにコードする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記免疫応答の前記阻害剤が、前記ｃｅＤＮＡベクターとは別個に投与される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記免疫応答の前記阻害剤が、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤、ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤、またはカスパーゼ－１阻害剤である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記免疫応答の前記阻害剤が、環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の阻害剤である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記免疫応答の前記阻害剤が、トール様受容体（ＴＬＲ）の阻害剤である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ＴＬＲ阻害剤が、ＴＬＲ９阻害剤である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記免疫応答の前記阻害剤が、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体である、請求項１～３または５のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ｃｅＤＮＡによってコードされる前記ＡＩＭ２インフラマソームの前記阻害剤が、前記ＡＩＭ２インフラマソームまたはカスパーゼ－１を阻害する配列番号６０２のＡ１５１またはその変異体である、請求項６に記載の方法。
  12. 前記ｃｅＤＮＡによってコードされる前記ＮＬＲＰ３インフラマソームの前記阻害剤、または前記ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤、またはカスパーゼ－１阻害剤が、前記ＮＬＲＰ３インフラマソーム、前記ＡＩＭ２インフラマソームまたはカスパーゼ－１のうちのいずれかに特異的なｍｉＲＮＡである、請求項６に記載の方法。
  13. 前記ｃｅＤＮＡによってコードされる前記ＮＬＲＰ３インフラマソームの前記阻害剤、または前記ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤、またはカスパーゼ－１阻害剤が、前記ＮＬＲＰ３インフラマソーム、前記ＡＩＭ２インフラマソームまたはカスパーゼ－１のうちのいずれかに特異的なｓｉＲＮＡである、請求項６に記載の方法。
  14. 前記ｃｅＤＮＡによってコードされる前記ＮＬＲＰ３インフラマソームの前記阻害剤、または前記ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤、またはカスパーゼ－１阻害剤が、前記ＮＬＲＰ３インフラマソーム、前記ＡＩＭ２インフラマソームまたはカスパーゼ－１のうちのいずれかに結合する抗体または抗原結合断片である、請求項６に記載の方法。
  15. 前記ｃｅＤＮＡによってコードされる前記ＮＬＲＰ３インフラマソームの前記阻害剤、または前記ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤、またはカスパーゼ－１阻害剤が、前記ＮＬＲＰ３インフラマソーム、前記ＡＩＭ２インフラマソームまたはカスパーゼ－１のうちのいずれかに結合する抗体または抗原結合断片である、請求項６に記載の方法。
  16. 前記ＮＬＲＰ３インフラマソームの前記阻害剤が、ＭＣＣ９５０、１６６７３－３４－０、Ｂａｙ１１－７０８２、グリベンクラミドまたはイソリキリチゲニンのうちのいずれかから選択される、請求項６に記載の方法。
  17. 前記ＡＩＭ２インフラマソームの前記阻害剤が、Ａ１５１（配列番号６０２）、ｍｉＲ－２２３、または抗ヒトＡＳＣモノクローナル抗体のうちのいずれかから選択される、請求項６に記載の方法。
  18. 前記カスパーゼ－１の阻害剤が、ベルナカサン、シコニン、アセチルシコニン、プラルナカサン、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＷＥＨＤ－ＦＭＫ、Ａｃ－ＹＶＡＤ－ｃｍｋ、Ａｃ－ＹＶＡＤ－ＣＨＯまたはパルテノライドのうちのいずれかから選択される、請求項６に記載の方法。
  19. 前記ｃＧＡＳの阻害剤が、ｃＧＡＳを阻害する配列番号８８２のカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質ＯＲＦ５２もしくはその変異体、またはＯＲＦ５２のガンマヘルペスウイルス相同分子腫である、請求項７に記載の方法。
  20. 前記ｃＧＡＳの阻害剤が、配列番号８８３のカポジ肉腫ヘルプレスウイルスＬＡＮＡ（潜伏期関連核抗原）の細胞質イソ型である、請求項７に記載の方法。
  21. 前記カポジ肉腫ヘルプレスウイルスＬＡＮＡの細胞質イソ型が、ＬＡＮＡΔ１６１（配列番号８８４）である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ｃＧＡＳの阻害剤が、ｃＧＡＳに特異的なｍｉＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
  23. 前記ｃＧＡＳに特異的なｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－２５（配列番号８８５）およびｍｉＲ－９３（配列番号８８６）から選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ｃＧＡＳの阻害剤が、ｃＧＡＳに特異的なｓｉＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
  25. 前記ｃＧＡＳの阻害剤が、ｃＧＡＳに結合する抗体または抗原結合断片である、請求項７に記載の方法。
  26. 前記ｃＧＡＳの阻害剤が、抗マラリア薬である、請求項７に記載の方法。
  27. 前記抗マラリア薬が、アミノキノリン系またはアミノアクリジン系の抗マラリア薬である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記抗マラリア薬が、キナクリン（ＱＣ）、９－アミノ－６－クロロ－２－メトキシアクリジン（ＡＭＣＡ）、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）、およびクロロキン（ＣＱ）から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ｃＧＡＳの阻害剤が、前記ｃＧＡＳの触媒ポケットに結合する小分子化合物である、請求項７に記載の方法。
  30. 前記ｃＧＡＳの触媒ポケットに結合する前記小分子化合物が、ＲＵ１６６３６５、ＲＵ２８１３３２、ＲＵ３２０５２１、ＲＵ３２０５１９、ＲＵ３２０４６１、ＲＵ３２０４６２、ＲＵ３２０５２０、ＲＵ３２０４６７、およびＲＵ３２０５８２から選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ｃＧＡＳの触媒ポケットに結合する前記小分子化合物が、ＲＵ３２０５２１である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ｃＧＡＳの触媒ポケットに結合する前記小分子化合物が、化合物１５、化合物１６、化合物１７、化合物１８、化合物１９、およびＰＦ－０６９２８２１５から選択される、請求項２９に記載の方法。
  33. 前記ｃＧＡＳの触媒ポケットに結合する前記小分子化合物が、ＰＦ－０６９２８２１５である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記ＴＬＲ９阻害剤が、ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチドである、請求項９に記載の方法。
  35. 前記ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチド配列が、以下の特徴、（ｉ）前記３’末端の３つの連続したＧヌクレオチド、（ｉｉ）前記５’末端のＣＣ（Ｔ）トリプレット、および（ｉｉｉ）前記５’ＣＣ（Ｔ）と下流のＧＧＧトリプレットとの間の距離が、最適には３～５ヌクレオチドの長さであること、のうちの１つ以上を有する、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチド配列が、ＴＴＡＧＧＧｎ（配列番号８８８）の配列を含む、請求項３４に記載の方法。
  37. 前記ＴＬＲ９阻害オリゴヌクレオチド配列が、ＯＤＮ－２０８８（ＴＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８８９）、ＯＤＮ－２１１４（ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８９０）、ポリ－Ｇ（ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、配列番号８９１）、ＯＤＮ－Ａ１５１（ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ、配列番号８９２）、Ｇ－ＯＤＮ（ＣＴＣＣ－ＴＡＴＴＧＧＧＧＧＴＴＴＣＣＴＡＴ、配列番号８９３）、ＩＲＳ－８６９（ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ、配列番号８９４）、ＩＮＨ－１（ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧ、配列番号８９５）、ＩＮＨ－４（ＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ、配列番号８９６）、ＩＲＳ－６６１（ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴ－ＧＣＡＡＧＣＡ、配列番号８９７）、４０２４（ＴＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＴ、配列番号８９８）、４０８４Ｆ（ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ、配列番号８９９）、ＩＮＨ－１３（ＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ、配列番号９００）、ＩＮＨ－１８（ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＡ、配列番号９０１）、およびＩＲＳ－９５４ ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ配列番号９０２）、およびＡＳ１４１１（ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ、配列番号９０３）から選択される、請求項３４に記載の方法。
  38. 前記ＴＬＲ９阻害剤が、ＴＬＲ９に特異的なｍｉＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
  39. 前記ＴＬＲ９阻害剤が、ＴＬＲ９に特異的なｓｉＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
  40. 前記ＴＬＲ９阻害剤が、ＴＬＲ９に結合する抗体または抗原結合断片である、請求項９に記載の方法。
  41. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、２つの隣接する野生型逆位末端反復配列（ＷＴ－ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられている、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、２つの隣接する変異型逆位末端反復配列（変異ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられている、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、２つの隣接する逆位末端反復配列の間に作動可能に位置付けられ、１つのＩＴＲが、ＷＴ－ＩＴＲであり、１つのＩＴＲが、変異ＩＴＲである、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記ＩＴＲが、対称ＩＴＲである、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記ＩＴＲが、非対称ＩＴＲである、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ＩＴＲの一方または両方が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記隣接するＩＴＲが、対称または非対称である、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記隣接するＩＴＲが、対称または実質的に対称である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記隣接するＩＴＲが、非対称である、請求項４７に記載の方法。
  50. 前記ＩＴＲの一方もしくは両方が野生型であるか、または前記ＩＴＲの両方が野生型である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記隣接するＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記ＩＴＲの少なくとも一方が、前記ＩＴＲの全体的な３次元立体構造に影響を及ぼす欠失、付加、または置換によって野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列から改変されている、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記ＩＴＲの一方または両方が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ＩＴＲの一方または両方が、合成である、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記ＩＴＲの一方もしくは両方が野生型ＩＴＲでないか、または前記ＩＴＲの両方が野生型でない、請求項５３または５４に記載の方法。
  56. 前記ＩＴＲの一方または両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択される前記ＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおいて欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記欠失、挿入、および／または置換が、通常は前記Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、またはＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＣおよびＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項５６に記載の方法。
  60. 前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成されるステムループ構造の一部、ならびに／または通常は前記ＣおよびＣ’領域によって形成されるステムループ構造の一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項５６に記載の方法。
  61. 前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、前記ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む前記領域に、単一のステムループ構造を含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、前記ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む前記領域に、単一のステムおよび２つのループを含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、前記ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む前記領域に、単一のステムおよび単一のループを含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  64. 両方のＩＴＲが、前記ＩＴＲが互いに対して反転された場合に全体的な３次元対称性をもたらす様式で改変されている、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの調節スイッチの制御下にある、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記少なくとも１つの調節スイッチが、バイナリ調節スイッチ、小分子調節スイッチ、パスコード調節スイッチ、核酸系調節スイッチ、転写後調節スイッチ、放射線制御または超音波制御の調節スイッチ、低酸素媒介調節スイッチ、炎症反応調節スイッチ、剪断活性化調節スイッチ、およびキルスイッチから選択される、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記ｃｅＤＮＡベクターおよび／または前記免疫応答の前記阻害剤が、カプセル化されている、請求項１～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記ｃｅＤＮＡベクターおよび／または前記免疫応答の前記阻害剤が、ナノ担体中にある、請求項１～６６のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記ナノ担体が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、請求項６７に記載の方法。
  70. 前記ｃｅＤＮＡが、前記ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を有する、請求項１に記載の方法。
  71. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、前記免疫応答の前記少なくとも１つの阻害剤に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１～４および５～９のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記プロモーターが、表１のいずれかから選択される、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、表２のいずれかから選択されるエンハンサーをさらに含む、請求項１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、表２Ａのいずれかから選択される５’ＵＴＲおよび／またはイントロン配列を含む、請求項１～７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、表２Ｂのいずれかから選択される３’ＵＴＲを含む、請求項１～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、表３のいずれかから選択される少なくとも１つのポリＡ配列を含む、請求項１～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む、請求項１～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記ｃｅＤＮＡベクターを含む組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１～７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記細胞に投与される前記ｃｅＤＮＡベクターの量を増加させることにより、前記細胞における前記導入遺伝子の発現が増加する、請求項１～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記異種核酸配列が、治療用導入遺伝子をコードし、前記導入遺伝子の所望の発現レベルが、治療有効量である、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、転写または翻訳されると、対象における内因性タンパク質の異常な量を補正する、請求項１～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、転写または翻訳されると、対象における内因性タンパク質または経路の異常な機能または活性を補正する、請求項１～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記対象が、治療を必要とするヒト患者である、請求項８１または８２に記載の方法。
  84. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチド分子をコードするかまたはそれを含む、請求項１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、タンパク質をコードする、請求項１～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記タンパク質が、マーカータンパク質（例えば、レポータータンパク質）である、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、前記疾患または障害に関連する内因性タンパク質または経路のアゴニストまたはアンタゴニストをコードする、請求項１～８４のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、抗体をコードする、請求項１～８４のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記免疫応答の追加阻害剤の同時投与をさらに含む、請求項１～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、（ａ）少なくとも１つのＲｅｐタンパク質の存在下でｃｅＤＮＡ発現構築物を保有する昆虫細胞の集団を、前記昆虫細胞内で前記ｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するのに効果的な条件下かつ十分な時間、インキュベートするステップであって、前記ｃｅＤＮＡ発現構築物が、前記ｃｅＤＮＡベクターをコードするステップと、（ｂ）前記昆虫細胞から前記ｃｅＤＮＡベクターを単離するステップと、を含むプロセスから得られる、請求項１～８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記ｃｅＤＮＡ発現構築物が、ｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡバクミド、およびｃｅＤＮＡバキュロウイルスから選択される、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記昆虫細胞が、少なくとも１つのＲｅｐタンパク質を発現する、請求項９０に記載の方法。
  93. 前記少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項９３に記載の方法。
  95. 請求項９０に記載の方法により産生された前記ｃｅＤＮＡベクターをコードするｃｅＤＮＡ発現構築物。
  96. ｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡバクミド、またはｃｅＤＮＡバキュロウイルスである、請求項９５に記載のｃｅＤＮＡ発現構築物。
  97. 請求項９５または請求項９６に記載のｃｅＤＮＡ発現構築物を含む宿主細胞。
  98. 少なくとも１つのＲｅｐタンパク質を発現する、請求項９７に記載の宿主細胞。
  99. 前記少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項９８に記載の宿主細胞。
  100. 前記少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項９９に記載の宿主細胞。
  101. 昆虫細胞である、請求項９７～１００のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  102. 前記昆虫細胞が、Ｓｆ９細胞である、請求項１０１に記載の宿主細胞。
  103. ｃｅＤＮＡベクターを産生する方法であって、（ａ）前記ｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するのに効果的な条件下かつ十分な時間、請求項９７～１０２のいずれか一項に記載の宿主細胞をインキュベートすることと、（ｂ）前記宿主細胞から前記ｃｅＤＮＡを単離することと、を含む、方法。
  104. 共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）を含む組成物であって、前記ｃｅＤＮＡベクターが、２つの隣接する逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含む、組成物。
  105. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、前記免疫応答の前記少なくとも１つの阻害剤をさらにコードする、請求項１０４に記載の組成物。
  106. 前記免疫応答が、自然免疫応答である、請求項１０４または１０５に記載の組成物。
  107. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、２つの隣接する野生型逆位末端反復配列（ＷＴ－ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられている、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  108. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、２つの隣接する変異型逆位末端反復配列（変異ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられている、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  109. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、２つの隣接する逆位末端反復配列の間に作動可能に位置付けられ、１つのＩＴＲが、ＷＴ－ＩＴＲであり、１つのＩＴＲが、変異ＩＴＲである、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  110. 前記ＩＴＲが、対称ＩＴＲである、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  111. 前記ＩＴＲが、非対称ＩＴＲである、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  112. 前記ＩＴＲの一方または両方が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  113. 前記隣接するＩＴＲが、対称または非対称である、請求項１１２に記載の組成物。
  114. 前記ＩＴＲの両方が野生型である、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  115. 前記隣接するＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  116. 前記ＩＴＲの少なくとも一方が、前記ＩＴＲの全体的な３次元立体構造に影響を及ぼす欠失、付加、または置換によって野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列から改変されている、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  117. 前記ＩＴＲの一方または両方が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  118. 前記ＩＴＲの一方または両方が、合成である、請求項１０４～１１７のいずれか一項に記載の組成物。
  119. 前記ＩＴＲの両方が野生型ではない、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  120. 前記ＩＴＲの一方または両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択される前記ＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  121. 前記欠失、挿入、および／または置換が、通常は前記Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、またはＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、請求項１２０に記載の組成物。
  122. 前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  123. 前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＣおよびＣ’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  124. 前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成されるステムループ構造の一部、ならびに／または通常は前記ＣおよびＣ’領域によって形成されるステムループ構造の一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  125. 前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、前記ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む前記領域に、単一のステムループ構造を含む、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  126. 前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、前記ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む前記領域に、単一のステムおよび２つのループを含む、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  127. 前記ＩＴＲの一方または両方が、通常は前記ＢおよびＢ’領域によって形成される第１のステムループ構造と、前記ＣおよびＣ’領域によって形成される第２のステムループ構造とを含む前記領域に、単一のステムおよび単一のループを含む、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  128. 両方のＩＴＲが、前記ＩＴＲが互いに対して反転された場合に全体的な３次元対称性をもたらすような様式で改変されている、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  129. 前記ＩＴＲが、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルス由来の配列に基づくものである、請求項１０４～１２８のいずれか一項に記載の組成物。
  130. 少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの調節スイッチの制御下にある、請求項１０４～１２９のいずれか一項に記載の組成物。
  131. 少なくとも１つの調節スイッチが、バイナリ調節スイッチ、小分子調節スイッチ、パスコード調節スイッチ、核酸系調節スイッチ、転写後調節スイッチ、放射線制御または超音波制御の調節スイッチ、低酸素媒介調節スイッチ、炎症反応調節スイッチ、剪断活性化調節スイッチ、およびキルスイッチから選択される、請求項１３０に記載の組成物。
  132. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、カプセル化されている、請求項１０４～１３１のいずれか一項に記載の組成物。
  133. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、ナノ担体内にある、請求項１０４～１３２のいずれか一項に記載の組成物。
  134. 前記ナノ担体が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、請求項１３３に記載の組成物。
  135. 前記ｃｅＤＮＡが、前記ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を有する、請求項１０４～１３４のいずれか一項に記載の組成物。
  136. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、前記免疫応答の前記少なくとも１つの阻害剤に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１０４～１３５のいずれか一項に記載の組成物。
  137. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、表２のいずれかから選択されるエンハンサーを含む、請求項１０４～１３６のいずれか一項に記載の組成物。
  138. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、表２Ａのいずれかから選択される５’ＵＴＲおよび／またはイントロン配列を含む、請求項１０４～１３７のいずれか一項に記載の組成物。
  139. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、表２Ｂのいずれかから選択される３’ＵＴＲを含む、請求項１０４～１３８のいずれか一項に記載の組成物。
  140. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、表３のいずれかから選択される少なくとも１つのポリＡ配列を含む、請求項１０４～１３９のいずれか一項に記載の組成物。
  141. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む、請求項１０４～１４０のいずれか一項に記載の組成物。
  142. 少なくとも１つのＩＴＲが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、前記ＩＴＲの１つが前記他のＩＴＲと比べて欠失、挿入または置換を含む、請求項１０４～１４１のいずれか一項に記載の組成物。
  143. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、真核細胞での発現のためにコドン最適化される、請求項１０４～１４２のいずれか一項に記載の組成物。
  144. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１０４～１４３のいずれか一項に記載の組成物。
  145. 前記免疫応答の前記阻害剤が、前記ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤、前記ＡＩＭ２インフラマソームの阻害剤、またはカスパーゼ－１阻害剤である、請求項１０４～１４４のいずれか一項に記載の組成物。
  146. 前記免疫応答の前記阻害剤が、環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の阻害剤である、請求項１０４～１４４のいずれか一項に記載の組成物。
  147. 前記免疫応答の前記阻害剤が、トール様受容体（ＴＬＲ）の阻害剤である、請求項１０４～１４４のいずれか一項に記載の組成物。
  148. 前記ＴＬＲ阻害剤が、ＴＬＲ９阻害剤である、請求項１４７に記載の組成物。
  149. 前記免疫応答の前記阻害剤が、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体である、請求項１０４～１４４のいずれか一項に記載の組成物。
  150. 細胞で免疫応答の阻害剤を発現させる方法であって、前記細胞を請求項１０４～１４９のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
  151. 前記細胞が、インビトロまたはインビボである、請求項１５０に記載の方法。
  152. 請求項１０４～１４９のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物。
  153. 前記自然免疫応答の阻害剤をさらに含む、請求項１５２に記載の医薬組成物。
  154. 前記自然免疫応答の前記阻害剤が、前記ｃｅＤＮＡベクターとは別個に製剤化される、請求項１５３に記載の医薬組成物。
  155. 請求項１０４～１４９のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞。
  156. 請求項１０４～１４９のいずれか一項に記載の組成物、請求項１５２～１５４のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１５５に記載の細胞を含むキット。

JP2021542384A 2019-01-24 2020-01-24 閉端ｄｎａ（ｃｅｄｎａ）ならびに遺伝子療法または核酸療法に関連する免疫応答を低減させる方法における使用 Pending JP2022518504A (ja)

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