CN114796216A - 甲氟喹在防治全身代谢性炎症疾病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了制备甲氟喹在防治全身代谢性炎症疾病中的应用。甲氟喹在制备抑制NLRP3炎症小体相关炎性疾病的药物中的应用。甲氟喹在制备防治全身性炎症的药物中的应用。本发明筛选出的甲氟喹可以与NLRP3结合,施加LPS/ATP诱导小鼠骨髓源性巨噬细胞和星形胶质细胞发生NLRP3介导的炎症反应,给予甲氟喹后可使细胞胞浆和分泌至上清的cleaved caspase‑1、IL‑1β减少。甲氟喹可改善LPS模型小鼠的运动能力,逆转肝、肺炎性细胞浸润和肝功能损伤,抑制全身性炎症反应。以上结果提示甲氟喹可以显著抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应,可作为抗炎药物应用于全身性炎症的防治。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,提供一种甲氟喹的新应用,具体涉及甲氟喹在防治全身代谢性炎症疾病中的应用。
背景技术
NLRP3炎症小体介导的炎症反应属于人体的固有免疫反应。NLRP3炎症小体由三个部分组成,一是传感器蛋白,即模式识别受体NLRP3受体蛋白;二是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1);最后是包含CARD的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)。通过识别多种病原相关分子模式和损伤相关分子模式,如细菌内毒素、ATP和受损细胞释放的内源性蛋白质等,NLRP3炎症小体被激活,随后自切割caspase-1。活化的caspase-1进一步切割下游的GSDMD、pro-IL-1β和pro-IL-18,切割形成的GSDMD-N端可被运送至细胞膜形成孔道,导致细胞膜的通透性增加、细胞肿胀和膜破裂,最终导致细胞焦亡;而成熟的IL-1β、IL-18可以通过GSDMD孔道被释放到胞外,扩大炎症效应。机体炎症反应是机体自我保护的体现,然而过度的炎症会影响细胞的健康与存活,因此,抑制NLRP3炎症小体的过度激活对于延缓全身性炎症发生发展至关重要。
甲氟喹是一种抗疟药,可以抑制疟原虫色素的形成,杀灭血液中的裂殖体。我们首次发现前期研究筛选出的药物甲氟喹可以与NLRP3直接结合,然而,甲氟喹能否抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应及其机制尚不明确,同时,应用甲氟喹防治全身性炎症也尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足,提供甲氟喹的一种医药用途,可用于全身性炎症的防治。
本发明的目的可通过以下技术方案实现:
甲氟喹在制备抑制NLRP3炎症小体相关炎性疾病的药物中的应用。
甲氟喹在制备防治全身性炎症的药物中的应用。
甲氟喹可以逆转LPS引起的小鼠运动功能减弱、运动速度减缓。
甲氟喹可以逆转LPS引起的小鼠外周血IL-1β、TNF-α水平升高。
甲氟喹可以逆转LPS引起的小鼠骨髓源性巨噬细胞胞浆和分泌的IL-1β和TNF-α水平升高。
甲氟喹可以逆转LPS引起的小鼠外周血ALT水平升高、肝cleaved caspase-1、IL-1β水平升高和肝炎症细胞浸润。
甲氟喹可以逆转LPS引起的小鼠肺炎症细胞浸润。
有益效果:
本发明通过计算机虚拟筛选筛选出可以与NLRP3结合的甲氟喹。筛选出的甲氟喹可以与NLRP3结合,施加LPS/ATP诱导小鼠骨髓源性巨噬细胞和星形胶质细胞发生NLRP3介导的炎症反应,给予甲氟喹后可使细胞胞浆和分泌至上清的cleaved caspase-1、IL-1β减少。甲氟喹可改善LPS模型小鼠的运动能力,逆转肝、肺炎性细胞浸润和肝功能损伤,抑制全身性炎症反应。以上结果提示甲氟喹可以显著抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应,可作为抗炎药物应用于全身性炎症的防治。
附图说明
图1为甲氟喹的化学结构式。
图2为甲氟喹对LPS模型小鼠行为学的影响。*p<0.05,**p<0.01,同对照组比较;&p<0.05,,&&p<0.01,&&&p<0.005,同模型组比较。
图3小鼠血清IL-1β含量。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005,同模型组比较。
图4小鼠血清TNF-α含量。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005,同模型组比较。
图5小鼠血清ALT含量。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005,同模型组比较。
图6为小鼠肝Western Blot caspase-1和IL-1β的代表性图像。
图7为小鼠骨髓源性巨噬细胞Western Blot caspase-1和IL-1β的代表性图像。
图8为小鼠肝HE染色的代表性图像。
图9为小鼠脾HE染色的代表性图像。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面的实施例可使本专业技术人员全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
实施例1:甲氟喹抑制小鼠全身NLRP3介导的炎症反应。
一、材料
1.动物:
选用的C57BL/6遗传背景的野生型小鼠由南京医科大学实验动物中心提供,雄性,2~3月龄,体重20~25g。标准饲料喂养,自由饮水,室温24±2℃,湿度50~60%,通风良好,每日光照和黑暗时间各12h。
2.试剂及耗材
LPS,DMSO,anti-IL-1β购自西格玛公司;盐酸甲氟喹,PEG300,Tween-80购自Selleck公司;HE染色试剂盒购自索莱宝公司;IL-1βELISA检测试剂盒,TNF-αELISA检测试剂盒购自依科赛公司;ALT检测试剂盒购自南京建成公司;anti-caspase-1购自Adipogen公司;anti-β-actin购自Proteintech公司;RIPA裂解液购自索莱宝公司;蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂购自赛默飞公司;上样缓冲液购自碧云天公司。
二、实验方法
1.小鼠LPS模型的制备和甲氟喹注射
LPS用磷酸盐缓冲液稀释成1mg/ml的工作液,盐酸甲氟喹用5%DMSO+40%PEG300+5%Tween-80+50%双蒸水稀释成0.5mg/ml或2mg/ml的工作液。小鼠连续4天腹腔注射10ml/kg盐酸甲氟喹,一天一次,在最后一针后2hr腹腔注射10ml/kg LPS。对照组小鼠给予无菌生理盐水处理。磷酸盐缓冲液含2.9g/LNa2HPO4·12H2O,0.3g/LNaH2PO4·2H2O,8.5g/L NaCl,pH 7.2~7.6。
给完LPS后12hr内完成行为学检测,第12hr取材。小鼠经左心室灌注生理盐水5min后取材,按要求取部分液氮速冻后存于-80℃冰箱,用于后续组织匀浆;部分浸泡于4%多聚甲醛后固定48hr。
2.小鼠行为学检测
开场实验:用于评价小鼠的爬行速度和自主运动行为。小鼠在50cm×50cm×50cm的箱内适应15min后,由软件观察并记录小鼠5min内的运动轨迹及运动速度。
3.HE染色
组织后固定48hr后,依次过70%乙醇7-8hr、80%乙醇3-5hr、90%乙醇45min、95%乙醇Ⅰ45min、95%乙醇Ⅱ45min、100%乙醇Ⅰ45min、100%乙醇Ⅱ45min、100%乙醇Ⅲ1hr、酒精二甲苯45min、二甲苯15min、二甲苯石蜡45min、石蜡Ⅰ1hr、石蜡Ⅱ1hr,进行组织修剪和石蜡包埋。石蜡切片厚度为5μm。切片后37℃过夜烘片。临用前依次过二甲苯Ⅰ15min、二甲苯Ⅱ15min、100%乙醇2min、90%乙醇2min、80%乙醇2min、70%乙醇2min、双蒸水Ⅰ2min、双蒸水Ⅱ2min。苏木素染色5-10min,分化液分化1-5sec,反蓝液反蓝10sec-1min,伊红染色30sec-2min。封片时依次过70%乙醇30sec、80%乙醇30sec、95%酒精乙醇60sec、100%乙醇Ⅰ60sec、100%乙醇Ⅱ60sec、二甲苯Ⅰ120sec、二甲苯Ⅱ120sec,中性树胶封片。
4.ELISA实验
血清使用双抗体夹心法ELISA检测。小鼠眼眶采血后将全血室温静置4hr,3000g、4℃离心15min,吸取上清。将标准品与样品加入包被抗体的微板中,加入生物素化抗体后置于微孔板恒温振荡器37℃孵育1h,洗板5次。加入酶结合物工作液,37℃避光孵育30min,洗板5次。加入显色底物,37℃避光孵育15min。加入终止液,10min内于450nm波长处测量吸光度值,根据标准曲线计算样品浓度。
5.WesternBlot
(1)组织蛋白的制备:组织中加入蛋白裂解液,冷冻球磨机匀浆后置于冰上裂解40min,4℃12000rpm离心15min,吸取上清即为组织蛋白。取1μl用于BCA法测定蛋白浓度,余下蛋白原液按体积加入上样缓冲液,100℃金属浴变性10min后,置于-20℃保存。
(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳:依据目的蛋白分子量配制不同浓度的分离胶和浓缩胶。每孔上样量约为30μg。80V转120V恒压电泳约2h,至溴酚蓝跑到凝胶底端。电泳缓冲液含3g/L Tris,14.4g/L甘氨酸,1g/L SDS。
聚丙烯酰胺凝胶:
成分 | 8%分离胶 | 10%分离胶 | 15%分离胶 | 浓缩胶 |
去离子水 | 2.55ml | 1.95ml | 0.75ml | 2.8ml |
30%AA母液 | 1.95ml | 2.55ml | 3.75ml | 660μl |
1.5M Tris-HCl,pH 8.8 | 2.85ml | 2.85ml | 2.85ml | --- |
1M Tris-HCl,pH 6.8 | --- | --- | --- | 500μl |
10%SDS | 75μl | 75μl | 75μl | 40μl |
10%过硫酸铵 | 75μl | 75μl | 75μl | 40μl |
TEMED | 3μl | 3μl | 3μl | 4μl |
总体积 | 7.5ml | 7.5ml | 7.5ml | 4ml |
(3)转膜:电泳完毕后,切去浓缩胶和底端多余的溴酚蓝,用湿转的方法将蛋白条带转移至PVDF膜上,300mA恒流转移120min。转移缓冲液含3g/L Tris,14.4g/L甘氨酸,20%甲醇,用前预冷。
(4)封闭:转膜结束后,取下PVDF膜,过TBST后将膜浸于含5%脱脂奶粉的TBST中2h。
(5)一抗孵育:封闭结束后用TBST洗膜5min×3遍,将PVDF膜转移密封于塑料薄膜中,加入按比例稀释的抗体,4℃摇动下过夜。
(6)二抗结合:TBST洗膜10min×3遍,加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体,室温下孵育2h。孵育结束后TBST洗膜10min×3遍。TBST含2.42g/L Tris,8g/L NaCl,1‰吐温-20,pH 7.2~7.6。
(7)ECL显色:新鲜配置ECL化学发光底物,均匀滴加至膜表面,避光曝片显色。
三、实验结果
相较于对照组,小鼠的运动速度减缓、血清IL-1β、TNF-α和ALT水平升高、肝cleaved caspase-1和IL-1β表达上调、肝功能损伤、肝和肺炎性细胞浸润,给予甲氟喹后可以显著抑制/逆转上述炎症损害,说明甲氟喹对全身性炎症具有预防和治疗作用。
实施例2:甲氟喹抑制小鼠骨髓源性巨噬细胞NLRP3介导的炎症反应。
一、材料
1.试剂及耗材
细胞培养基DMEM,胎牛血清购自Gibco公司;GM-CSF购买自Peprotech公司;青霉素,链霉素购自新赛美公司;LPS,ATP,DMSO购自Sigma公司;盐酸甲氟喹购自Selleck公司anti-IL-1β购自西格玛公司;anti-caspase-1购自Adipogen公司;anti-β-actin购自Proteintech公司;RIPA裂解液购自索莱宝公司;蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂购自赛默飞公司;上样缓冲液购自碧云天公司。
2.小鼠原代骨髓源性巨噬细胞的分离和培养
对小鼠进行二氧化碳安乐死,75%乙醇消毒后分离小鼠后肢,除去皮肤和肌肉组织,取出胫骨。减去两端骨质后,借助注射器使用DMEM冲洗出骨髓细胞,DMEM补充有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。将细胞吹打混匀后收集于离心管,1000g室温离心5min,弃上清,向细胞沉淀中加入完全培养基,重悬后按照6×106的密度接种于12孔板,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。完全培养基含有90%DMEM、10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和20ng/mlGM-CSF。处于对数生长期的小鼠原代骨髓源性巨噬细胞将用于实验。
二、实验方法
1.小鼠原代骨髓源性巨噬细胞的处理方法
小鼠原代骨髓源性巨噬细胞细胞用100ng/ml LPS处理4h后,吸弃培养基,给予10μM甲氟喹预处理1.5h,之后给予5mM ATP刺激后收取上清和细胞。药物处理时使用补充有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM。以不加入甲氟喹、LPS/ATP的细胞为空白对照。
2.WesternBlot
收集细胞上清,用磷酸盐缓冲液漂洗细胞两次,加入蛋白裂解液,快速刮下细胞并收集,置于冰上裂解40min后,4℃12000rpm离心15min,吸取上清即为细胞总蛋白。。取1μl用于BCA法测定蛋白浓度,余下蛋白原液按体积加入上样缓冲液,100℃金属浴变性10min后,置于-20℃保存。
细胞上清蛋白的制备:收集细胞上清,4℃1000g离心5min转13000g离心5min除去死细胞,吸取上清,加入预冷的等体积甲醇和预冷的1/4体积氯仿,上下颠倒数次萃取,4℃13000g离心10min,吸弃上清,加入500μl甲醇,涡旋振荡以洗去氯仿,4℃13000g离心5min,吸去上清,置于烘箱37℃5min挥发甲醇,加入2.5×上样缓冲液50μl,100℃金属浴变性10min后,置于-20℃保存。
剩余步骤同实施例1。
三、实验结果
LPS/ATP刺激引起小鼠骨髓源性巨噬细胞胞浆和分泌至上清的cleaved caspase-1、IL-1β水平升高,甲氟喹可以显著降低其水平,说明甲氟喹可以抑制小鼠骨髓源性巨噬细胞NLRP3炎症小体介导的炎症反应。
通过以上实施例证明,甲氟喹可与NLRP3结合,抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应,减轻组织器官炎性细胞浸润。提示本发明所述甲氟喹具有治疗全身性炎症的潜力,可应用于全身性炎症的防治。
Claims (3)
1.甲氟喹在制备预防和/或治疗全身性炎症疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于甲氟喹在制备预防和/或治疗全身代谢性炎症疾病的药物中的应用。
3.甲氟喹在制备抑制NLRP3炎症小体相关炎性疾病的药物中的应用。
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