CN114869886B - 他尼氟酯在帕金森病防治中的应用 - Google Patents

他尼氟酯在帕金森病防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了他尼氟酯在帕金森病防治中的应用。他尼氟酯在制备预防和/或治疗帕金森病的药物中的应用。本发明筛选出的他尼氟酯可以与ASCT2结合。同样的，他尼氟酯可以抑制小鼠星形胶质细胞摄取谷氨酰胺，降低LPS/ATP诱导后caspase‑1、IL‑1β的表达水平。他尼氟酯可改善亚急性MPTP帕金森病模型小鼠的运动能力，逆转小鼠中脑黑质致密部多巴胺能神经元丢失、抑制星形胶质细胞的过度增殖与活化。以上结果提示他尼氟酯可作为治疗药物应用于帕金森病的预防和治疗。

Description

他尼氟酯在帕金森病防治中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，提供一种他尼氟酯的新应用，具体涉及他尼氟酯在预治帕金森病中的应用。
背景技术
帕金森病是继阿尔兹海默症之后的世界第二大神经退行性疾病，其典型的运动症状为静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势障碍。此外，患者可伴发其他非运动症状，如感觉障碍、自主神经功能障碍、焦虑、抑郁、认知功能障碍等。目前通过药物或手术治疗只能改善帕金森病的症状，无法阻止病情的发展，更无法治愈疾病，给患者及其家庭带来了巨大的心理压力和经济负担。
帕金森病的发病机制涉及路易小体形成、线粒体功能障碍、蛋白质清除障碍、神经炎症和氧化应激等，最后导致黑质-纹状体通路的多巴胺能神经元变性、死亡和丢失。ASCT2由SLC1A5基因编码，定位于细胞膜，是一种谷氨酰胺转运蛋白，主要负责谷氨酰胺的摄取。测序结果表明，ASCT2在帕金森病患者中脑的表达增加。
虽然帕金森的发病机制涉及神经炎症，但是由于无法穿透血脑屏障或者无法使有效剂量的药物到达中枢系统，很多外周抗炎药都不具备中枢抗炎作用。因此，我们无法预料一个非甾体抗炎药是否能够用于帕金森的治疗。他尼氟酯是一种粘蛋白调节剂，属于非甾体抗炎镇痛药，可用于治疗囊肿性纤维化、慢性阻塞性肺病和哮喘。现有技术表明他尼氟酯主要是通过外周发挥作用，但未报导其是否能透过血脑屏障在中枢神经系统发挥作用。他尼氟酯是否在帕金森病中发挥神经保护作用及其作用机制尚不明确，同时，他尼氟酯是否可以预防或治疗帕金森病也尚未报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供他尼氟酯的一种医药用途，可用于帕金森病的防治。
本发明的目的可通过以下技术方案实现:
他尼氟酯在制备预防和/或治疗帕金森病的药物中的应用。
有益效果：
本发明筛选出的他尼氟酯可以与ASCT2结合。施加LPS/ATP诱导小鼠骨髓源性巨噬细胞发生NLRP3介导的炎症反应，给予他尼氟酯可使细胞表达caspase-1、IL-1β水平下降，分泌至上清的IL-1β减少。同样的，他尼氟酯可以抑制小鼠星形胶质细胞摄取谷氨酰胺，降低LPS/ATP诱导后caspase-1、IL-1β的表达水平。他尼氟酯可改善亚急性MPTP帕金森病模型小鼠的运动能力，逆转小鼠中脑黑质致密部多巴胺能神经元丢失、抑制星形胶质细胞的过度增殖与活化。以上结果提示他尼氟酯可作为治疗药物应用于帕金森病的预防和治疗。
附图说明
图1为他尼氟酯的化学结构式。
图2是通过计算机虚拟筛选出的能与ASCT2结合的化合物他尼氟酯。
图3是通过MST测定的他尼氟酯与ASCT2的结合能力。
图4为小鼠原代骨髓源性巨噬细胞给予LPS和ATP刺激以及他尼氟酯保护后，收集上清，用酶联免疫吸附(ELISA)实验检测分泌至上清的IL-1β的表达。###p＜0.005，同对照组比较；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005，同模型组比较。
图5为小鼠原代骨髓源性巨噬细胞给予LPS和ATP刺激以及他尼氟酯保护后，收集细胞总蛋白，通过蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测胞浆pro-IL-1β、IL-1β、pro-caspase-1和caspase-1的表达。
图6为小鼠星形胶质细胞在给予他尼氟酯后谷氨酰胺的摄取率。**p＜0.01，同对照组比较。
图7为小鼠星形胶质细胞在给予LPS和ATP刺激以及他尼氟酯保护后，收集细胞总蛋白和上清蛋白，通过Western Blot检测胞浆pro-IL-1β和pro-caspase-1、上清IL-1β和caspase-1的表达。
图8为他尼氟酯对亚急性MPTP帕金森病模型小鼠行为学的影响。*p＜0.05，**p＜0.01，同对照组比较；&p＜0.05，&&p＜0.01，&&&p＜0.005，同模型组比较。
图9为他尼氟酯对亚急性MPTP帕金森病模型小鼠中脑黑质区酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的影响。
图10他尼氟酯对亚急性MPTP帕金森病模型小鼠中脑胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性星形胶质细胞的影响。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面的实施例可使本专业技术人员全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：通过计算机虚拟筛选和MST筛选出可以与ASCT2结合的他尼氟酯。
一、材料
1.试剂及耗材
His-tagged ASCT2蛋白购自百普赛斯公司；蛋白标记试剂盒购自NanoTemper公司。
二、实验方法
1.使用MST进行蛋白结合实验
(1)染料与目的蛋白结合
用PBST将染料稀释至5μM，共需200μl。准备16个离心管，2～16号管中分别加入10μl PBST。在1号管中加入20μl His-tagged ASCT2，吸取10μl加入2号管，轻轻吹打混匀后吸取10μl加入3号管，依次对半稀释直至16号管，最后16号管弃去10μl。在1～16号管中每管加入10μl 50nM染料，轻轻吹打混匀。室温避光孵育30min，测量解离常数Kd值。
(2)按照Kd值结合染料与目的蛋白
如果Kd≤10nM，将90μl 200nM His-tagged ASCT2和90μl 100nM染料均匀混合，室温避光孵育30min。4℃12000rpm离心10min，吸取上清。如果Kd＞10nM，用PBST以20×Kd调整His-tagged ASCT2浓度，将90μl调整浓度后的His-tagged ASCT2和90μl 100nM染料均匀混合，室温避光孵育30min。4℃12000rpm离心10min，吸取上清。
(3)蛋白结合实验
准备25μl浓度为2倍终浓度的他尼氟酯。准备16个离心管，2～16号管中分别加入10μl PBST。在1号管中加入20μl他尼氟酯，吸取10μl加入2号管，轻轻吹打混匀后吸取10μl加入3号管，依次对半稀释直至16号管，最后16号管弃去10μl。在1～16号管中每管加入10μlHis-tagged ASCT2，轻轻吹打混匀。用毛细管吸取液体上样，MST自动检测。
PBST含2.9g/L Na2HPO4·12H2O，0.3g/L NaH2PO4·2H2O，8.5g/L NaCl，1‰吐温-20，pH 7.2～7.6。
三、实验结果
通过计算机虚拟筛选出的能与ASCT2结合的化合物他尼氟酯，结合能量为-9.6kcal/mol。通过MST实验确证他尼氟酯能与ASCT2产生结合，解离常数Kd＝119nM。
实施例2：他尼氟酯抑制小鼠骨髓源性巨噬细胞NLRP3介导的炎症反应。
一、材料
1.试剂及耗材
细胞培养基DMEM，胎牛血清购自Invitrogen公司；GM-CSF购买自Peprotech公司；青霉素，链霉素，抗体稀释液购自新赛美公司；LPS，ATP，DMSO，anti-IL-1β购自Sigma公司；IL-1βELISA检测试剂盒购自ExCell Bio公司；BCA蛋白定量试剂盒购自凯基公司；anti-NLRP3，anti-caspase-1购自AidpoGen公司；anti-GAPDH购自Proteintech公司；药物他尼氟酯购自Selleck公司；蛋白裂解液购自索莱宝公司；蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自Thermo公司；上样缓冲液购自碧云天公司；ECL化学发光底物试剂盒购自Tanon公司。
2.小鼠原代骨髓源性巨噬细胞的分离和培养
对小鼠进行二氧化碳安乐死，75％乙醇消毒后分离小鼠后肢，除去皮肤和肌肉组织，取出胫骨。减去两端骨质后，借助注射器使用DMEM冲洗出骨髓细胞，DMEM补充有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。将细胞吹打混匀后收集于离心管，1000g室温离心5min，弃上清，向细胞沉淀中加入完全培养基，重悬后按照6×106的密度接种于12孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。完全培养基含有90％DMEM、10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和20ng/ml GM-CSF。处于对数生长期的小鼠原代骨髓源性巨噬细胞将用于实验。
二、实验方法
1.小鼠原代骨髓源性巨噬细胞的处理方法
细胞用100ng/ml LPS处理4h后，吸弃培养基，给予10μM他尼氟酯预处理1h，之后给予5mM ATP刺激后收取上清和细胞。药物处理时使用补充有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM。以不加入他尼氟酯、LPS/ATP的细胞为空白对照，多于三次的实验结果用于统计检验。
2.Western Blot
(1)细胞总蛋白的制备：收集细胞上清，用磷酸盐缓冲液漂洗细胞两次，加入蛋白裂解液，快速刮下细胞并收集，置于冰上裂解40min后，4℃16000g离心15min，吸取上清即为细胞总蛋白。取1μl用于BCA法测定蛋白浓度，余下蛋白原液按体积加入上样缓冲液，95℃金属浴变性5min后，置于-20℃保存。磷酸盐缓冲液含2.9g/L Na2HPO4·12H2O，0.3g/LNaH2PO4·2H2O，8.5g/L NaCl，pH 7.2～7.6。
(2)细胞上清蛋白的制备：收集细胞上清，4℃1000g离心5min转13000g离心5min除去死细胞，吸取上清，加入预冷的等体积甲醇和预冷的1/4体积氯仿，上下颠倒数次萃取，4℃13000g离心10min，吸弃上清，加入500μl甲醇，涡旋振荡以洗去氯仿，4℃p 13000g离心5min，吸去上清，置于烘箱37℃5min挥发甲醇，加入2.5×上样缓冲液50μl，95℃金属浴变性5min后，置于-20℃保存。
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳：依据目的蛋白分子量配制不同浓度的分离胶和浓缩胶。每孔上样量约为30μg。80V转120V恒压电泳约2h，至溴酚蓝跑到凝胶底端。电泳缓冲液含3g/L Tris，14.4g/L甘氨酸，1g/L SDS。
聚丙烯酰胺凝胶：
成分 8％分离胶 10％分离胶 15％分离胶 浓缩胶
去离子水 2.55ml 1.95ml 0.75ml 2.8ml
30％AA母液 1.95ml 2.55ml 3.75ml 660μl
1.5M Tris-HCl，pH 8.8 2.85ml 2.85ml 2.85ml ---
1M Tris-HCl，pH 6.8 --- --- --- 500μl
10％SDS 75μl 75μl 75μl 40μl
10％过硫酸铵 75μl 75μl 75μl 40μl
TEMED 3μl 3μl 3μl 4μl
总体积 7.5ml 7.5ml 7.5ml 4ml
(4)转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶和底端多余的溴酚蓝，用湿转的方法将蛋白条带转移至PVDF膜上，300mA恒流转移120min。转移缓冲液含3g/L Tris，14.4g/L甘氨酸，20％甲醇，用前预冷。
(5)封闭：转膜结束后，取下PVDF膜，过TBST后将膜浸于含5％脱脂奶粉的TBST中2h。
(6)一抗孵育：封闭结束后用TBST洗膜5min×3遍，将PVDF膜转移密封于塑料薄膜中，加入按比例稀释的抗体，4℃摇动下过夜。
(7)二抗结合：TBST洗膜10min×3遍，加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体，室温下孵育2h。孵育结束后TBST洗膜10min×3遍。TBST含2.42g/L Tris，8g/L NaCl，1‰吐温-20，pH 7.2～7.6。
(8)ECL显色：新鲜配置ECL化学发光底物，均匀滴加至膜表面，避光曝片显色。将目的蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值比较进行半定量分析。
3.ELISA实验
细胞上清使用双抗体夹心法ELISA检测。细胞上清4℃1500g离心10min后收集上清即可用于实验。将标准品与样品加入包被抗体的微板中，加入生物素化抗体后置于微孔板恒温振荡器37℃孵育1h，洗板5次。加入酶结合物工作液，37℃避光孵育30min，洗板5次。加入显色底物，37℃避光孵育15min。加入终止液，10min内于450nm波长处测量吸光度值，根据标准曲线计算样品浓度。
三、实验结果
LPS/ATP刺激引起小鼠骨髓源性巨噬细胞胞浆IL-1β和caspase-1、分泌至上清的IL-1β水平升高，他尼氟酯可以显著降低上述指标的水平，说明他尼氟酯抑制小鼠骨髓源性巨噬细胞NLRP3介导的炎症反应。
实施例3：他尼氟酯在调节小鼠星形胶质细胞摄取谷氨酰胺中的应用。
一、材料
1.试剂及耗材
放射性谷氨酰胺购自珀金埃尔默公司。
2.小鼠原代星形胶质细胞的分离和培养
将出生1～3天的新生小鼠用75％乙醇消毒后取出全脑，置于预冷的DMEM中，DMEM补充有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。显微镜下剥除脑膜及血管，分离出皮层组织，用DMEM冲洗组织，换用含0.25％胰酶的DMEM，置于37℃、5％CO2培养箱中消化5min。吸弃消化液，加入完全培养基终止消化，将组织轻轻吹散成单细胞悬液，过200目筛网过滤，收集滤液，1000g室温离心5min，弃上清，向细胞沉淀中加入完全培养基，重悬后接种于T75瓶，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。之后每3.5天换液一次，培养至第7天时拍打除去多余的小胶质细胞后，用含0.25％胰酶的DMEM，置于37℃、5％CO2培养箱中消化5min，吸弃消化液，加入完全培养基终止消化，吹下并收集贴壁的细胞，1000g室温离心5min，弃上清，向细胞沉淀中加入完全培养基，重悬后均匀接种于六孔板或24孔板中，待细胞生长2～3天伸展为连续单层后即可用于实验。完全培养基含有90％DMEM、10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
二、实验方法
1.小鼠星形胶质细胞的处理方法
小鼠星形胶质细胞接种于24孔板，给予10μM他尼氟酯24h后用于谷氨酰胺摄取测定。
2.小鼠星形胶质细胞谷氨酰胺摄取的测定
(1)同位素的摄取
MEM培养基配置同位素溶液5μCi/ml[3H]-L-glutamine，加入细胞中，37℃精确孵育15min，完成孵育后将同位素溶液去除。用磷酸盐缓冲液洗板3遍，洗第1遍时严格控制磷酸盐缓冲液加入和去除的时间，第2、3遍不需要控制时间。磷酸盐缓冲液含2.9g/LNa2HPO4·12H2O，0.3g/L NaH2PO4·2H2O，8.5g/L NaCl，pH 7.2～7.6。
(2)检测放射性
每孔加入220μl 1N氢氧化钠，裂解细胞30min，裂解完成后从每孔中取出20μl用于BCA定量，剩余每孔中加入200μl 1N盐酸进行中和。中和完毕后每孔加入2ml闪烁液，充分混匀之后转移至96孔板中，进行放射性检测，即可得到谷氨酰胺摄取的绝对值。
(3)BCA蛋白定量和谷氨酰胺摄取相对值的计算
使用BCA法测定蛋白浓度。最终放射性绝对值/蛋白浓度即可得到各个样品的谷氨酰胺摄取的相对值。
三、实验结果
他尼氟酯可以抑制小鼠星形胶质细胞通过ASCT2摄取谷氨酰胺。
实施例4：他尼氟酯抑制小鼠星形胶质细胞NLRP3介导的炎症反应。
一、材料
1.试剂及耗材
细胞培养基DMEM，胎牛血清购自Gibco公司；青霉素，链霉素，抗体稀释液购自新赛美公司；LPS，ATP，DMSO，anti-IL-1β购自Sigma公司；IL-1βELISA检测试剂盒购自ExCellBio公司；BCA蛋白定量试剂盒购自凯基公司；anti-NLRP3，anti-caspase-1购自AidpoGen公司；anti-GAPDH购自Proteintech公司；药物他尼氟酯购自Selleck公司；蛋白裂解液购自索莱宝公司；蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自Thermo公司；上样缓冲液购自碧云天公司；ECL化学发光底物试剂盒购自Tanon公司。
2.小鼠原代星形胶质细胞的分离和培养同实施例3。
二、实验方法
小鼠星形胶质细胞的处理方法同实施例2中小鼠骨髓源性巨噬细胞的处理方法。Western Blot操作步骤同实施例2。
三、实验结果
LPS/ATP刺激引起小鼠星形胶质细胞IL-1β和caspase-1、分泌至上清的IL-1β水平升高，他尼氟酯可以显著降低上述指标的水平，说明他尼氟酯抑制小鼠星形胶质细胞NLRP3介导的炎症反应。
实施例5：他尼氟酯在预防和治疗小鼠帕金森病中的应用。
一、材料
1.动物：选用的C57BL/6遗传背景的野生型小鼠由南京医科大学实验动物中心提供，雄性，2～3月龄，体重20～25g。标准饲料喂养，自由饮水，室温24±2℃，湿度50～60％，
通风良好，每日光照和黑暗时间各12h。
2.试剂及耗材
抗体稀释液购自新赛美公司；MPTP，DMSO购自Sigma公司；DAB显色试剂盒购自凯基公司；anti-TH，anti-GFAP购自Millipore公司；他尼氟酯购自Selleck公司。
二、实验方法
1.小鼠亚急性MPTP帕金森病模型的制备和他尼氟酯注射
MPTP用生理盐水稀释成2mg/ml的工作液。小鼠后颈皮下注射20mg/kg MPTP，一天一次，连续给药5天。对照组小鼠给予无菌生理盐水处理。
他尼氟酯用0.5％羧甲基纤维素钠稀释成5mg/ml的工作液。小鼠50mg/kg他尼氟酯灌胃，一天一次，在给MPTP前提前给药3天，连续给药11天。对照组小鼠给予无菌生理盐水处理。
末次给药后第2天进行行为学检测，第3天时处死小鼠取材。
2.小鼠行为学检测
(1)转棒实验：用于评价小鼠的运动协调能力。每天以15rpm的转速训练小鼠5min，连续训练3天，第4天时以5～25rpm的转速记录小鼠的停留时间。
(2)爬杆实验：用于评价小鼠的自主运动行为。将小鼠头向上置于直径1cm、高50cm的杆顶，杆顶有一直径1.2cm的木球，记录小鼠从开始运动到完全转为头向下的时间(T-Turn)和爬行至杆底的总时间(T-TLA)，实验过程中以最短时间记，未能完全翻转、掉落或滑落按120s计。每天训练2次，连续训练3天，第4天正式实验。
(3)开场实验：用于评价小鼠的爬行速度和自主运动行为。小鼠在50cm×50cm×50cm的箱内适应15min后，由软件观察并记录小鼠5min内的运动轨迹及运动速度。
3.蛋白质免疫印迹(Western Blot)
(1)组织蛋白的制备：用磷酸盐缓冲液漂洗组织两次，每1mg组织加入30μl蛋白裂解液，使用冷冻球磨机粉碎组织，置于冰上裂解40min后，4℃16000g离心15min，吸取上清即为组织蛋白。取1μl用于BCA法测定蛋白浓度，余下蛋白原液按体积加入上样缓冲液，95℃金属浴变性5min后，置于-20℃保存。
(2)电泳至ECL显色步骤同实施例1。
4.免疫组织化学
小鼠经左心室灌注生理盐水5min后关注4％多聚甲醛10min，取脑，浸泡于4％多聚甲醛固定24h。20％蔗糖溶液(磷酸盐缓冲液配置)脱水3天，30％蔗糖溶液(磷酸盐缓冲液配置)脱水3天，以OCT胶包埋组织，行冰冻切片，厚度20μm，收集黑质部位脑片，放入50％磷酸盐缓冲液+50％甘油中，-20℃保存。临用前按照隔三取一或隔六取一挑选脑片，漂片法进行免疫组织化学，具体步骤如下：磷酸盐缓冲液漂洗脑片10min×3遍，3％过氧化氢除辣根过氧化物酶15min，磷酸盐缓冲液清洗脑片10min×3遍，用含有10％山羊血清和0.3％曲拉通X-100的磷酸盐缓冲液室温封闭和破膜2h。用磷酸盐缓冲液按照1:1000的滴度稀释anti-TH和anti-GFAP，以此孵育脑片4℃过夜，第二日吸弃抗体后，磷酸盐缓冲液漂洗脑片10min×3遍，用磷酸盐缓冲液按照1:1000的滴度稀释辣根过氧化物酶标记的第二抗体，室温下孵育2h，吸弃抗体，磷酸盐缓冲液漂洗脑片10min×3遍，用DAB显色液避光显色，贴片、脱水、封片，用体视学显微镜拍照计数。
三、实验结果
相较于对照组，亚急性MPTP帕金森病模型小鼠的运动功能受损，中脑黑质区TH阳性神经元数目减少，GFAP阳性星形胶质细胞数目增加。给予他尼氟酯后帕金森病模型小鼠的运动功能受损有所缓解，TH阳性神经元丢失减少，GFAP阳性星形胶质细胞增殖与活化程度降低，说明他尼氟酯对帕金森病具有的治疗作用。通过以上实施例证明，他尼氟酯可与ASCT2结合，影响星形胶质细胞摄取谷氨酰胺，并抑制骨髓源性巨噬细胞和星形胶质细胞中NLRP3介导的炎症反应，并对小鼠亚急性MPTP帕金森病病理模型具有显著的治疗作用，提示本发明所述他尼氟酯具有治疗帕金森病的潜力，可应用于帕金森病的预防和治疗。

Claims (1)

1.他尼氟酯在制备预防和/或治疗帕金森病的药物中的应用。
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