CN114209716A

CN114209716A - 一种改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用

Info

Publication number: CN114209716A
Application number: CN202111425342.4A
Authority: CN
Inventors: 薛雪
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2021-11-26
Filing date: 2021-11-26
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2041-11-26
Also published as: CN114209716B; WO2023093599A1

Abstract

本发明属细胞修复领域，具体涉及一种改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用。其有益效果在于：提供了一种新的治疗蛋白错误折叠或加工类疾病的途径；靶向性更强；利用的细胞器不含有遗传物质，不会对受体产生不良影响；改性方法简单，成本低，无毒副作用。

Description

一种改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用

技术领域

本发明细胞修复领域，涉及改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用。

背景技术

神经系统的复杂性使很多药物无法进入大脑，而神经细胞的自我修复能力有限，这造成许多神经系统疾病的不可逆转和进行性，最终导致结果的严重性，造成巨大的经济损失和社会负担(Fernandes LF,Bruch GE,Massensini AR and Frézard F.RecentAdvances in the Therapeutic and Diagnostic Use of Liposomes and CarbonNanomaterials in Ischemic Stroke.Front Neurosci.2018；12:453.)。阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森综合征(Parkinson’s disease,PD)、亨廷顿氏症(Huntington’s disease,HD)都是高发病率的中枢神经系统疾病，这些疾病的病因都是蛋白异常折叠或加工，导致神经元死亡，病情发展后严重影响病人的生活和寿命。

AD是痴呆症最常见的一种形式，它的主要症状有两个：β-淀粉样蛋白在神经元细胞外异常沉积形成老年斑和Tau蛋白异常磷酸化形成神经元纤维缠结(Cheray M,Stratoulias V,Joseph B and Grabert K.The Rules of Engagement:Do MicrogliaSeal the Fate in the Inverse Relation of Glioma and Alzheimer'sDisease？FrontCell Neurosci.2019；13:522.)。

其致病原因在于：淀粉样蛋白(APP)作为I型跨膜蛋白，具有膜受体样结构，分子间可以进行反式二聚化，促进细胞黏附。但APP的降解产物β-淀粉样蛋白可以加速APP的聚集，引发细胞凋亡。Tau蛋白作为微管相关蛋白可促进微管蛋白聚合形成微管，维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束。而Tau蛋白异常过度磷酸化，会丧失维持微管稳定的作用，导致微管结构广泛破坏，正常轴突转运受损，引起突触丢失神经元功能损伤，发生脑神经退行性病变。伴随着脑内淀粉样前体蛋白和Tau蛋白的异常折叠与加工，AD患者神经突触变性，记忆力和其他认知功能逐渐下降。

现有技术中，包括抗炎药、他汀类药物、激素疗法和螯合剂等在内的治疗方法均未能取得成功；而降低神经变性速率或停止疾病进程的疾病缓解疗法仍然难以捉摸(WaiteLM.Treatment for Alzheimer’s disease:has anything changed？Aust Prescr.2015；38(2):60–63.)。

溶酶体是细胞中发挥降解作用的主要细胞器，其内部水解酶的降解功能对许多细胞过程至关重要，包括饥饿期间的营养消化、受损细胞成分的消除、有丝分裂信号的终止、细胞内和细胞外病原体的消除以及细胞和组织重塑(Perera RM and Zoncu R.TheLysosome as a Regulatory Hub.Annu Rev Cell Dev Biol.2016；32:2 23-253.)。在细胞内部，细胞内成分如错误折叠的蛋白、衰老及损伤的细胞器通过自噬传递到溶酶体被降解；在细胞外部，外源性物质通过内吞作用和吞噬作用被传递到溶酶体降解。

溶酶体表面的v-ATPase利用ATP水解产生的能量将氢离子泵入管腔，从而产生溶酶体的酸性pH，为水解酶提供水解脂质、多糖、核酸和蛋白质的酸性环境。其上的部分膜蛋白(溶酶体相关膜蛋白LAMP1和LAMP2、溶酶体整合膜蛋白2(LIMP2)及CD63等)在其腔侧被高度糖基化并形成糖萼，防止腔内的水解酶自消化膜结构。这些蛋白质对于溶酶体的生物发生、酸化、代谢物运输以及分子伴侣介导的自噬至关重要。

由于溶酶体在维持细胞稳态中发挥关键作用，因此溶酶体蛋白的异常与多种疾病的发生紧密相关，如ATP酶(ATPase)的异常促进帕金森综合征的发生发展；氯化物电压门控通道7(CLC-7)的异常促进骨硬化病的发生发展；胱氨酸蛋白酶(Cystinosin)的异常促进胱氨酸病的发生发展；溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)的异常促进糖原储存病的发生发展；粘蛋白TRP阳离子通道(Mucolipin)的异常促进粘脂沉积症IV的发生发展；NPC细胞内胆固醇转运蛋白1(NPC1)的异常会促进尼曼氏病的发生发展；溶质载体家族蛋白的异常会导致唾液酸尿症的发生发展。

本发明的发明人在此前的研究工作中，发现了溶酶体对于包括阿尔茨海默症、帕金森综合征和亨廷顿病在内的多种神经退行性疾病有治疗作用。参见CN202010294396.0一种溶酶体作为制备治疗阿尔兹海默症及延缓老年智力衰退药物领域的应用。

目前进入临床阶段的AD药物未能达到令人满意的疗效的主要原因包括药物脱靶、干预时间延迟及脑内药物作用强度较低等。药物脱靶和干预时间延迟是抗体药物自身特性所导致，然而，脑内药物作用强度较低主要是由于血脑屏障的存在使药物到达脑内浓度过低。因此，药物的入脑效率是决定药物对疾病治疗效果的重要因素。

本发明是基于CN202010294396.0一种溶酶体作为制备治疗阿尔兹海默症及延缓老年智力衰退药物领域的应用的进一步研究和改进。

目的是通过改造天然溶酶体及人工合成具有溶酶体功能的材料，提升它们的入脑率，使疗效最大化。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是选择出效果最好的天然溶酶体种类，并对其进行进一步改性，以得到更高的脑靶向性、酶活性、安全性及稳定性，延长其在动物体内的血液循环时间及在体外环境中的保存时间，并赋予其载药性能。

本发明公开了一种改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用，所述改性溶酶体来自经外界刺激改性的脑部小胶质细胞。

进一步的，所述外界刺激包括物理方式刺激、生物方式刺激、化学方式刺激、环境方式刺激中至少一种。

进一步的，所述物理方式刺激包括热刺激、力刺激、光刺激、电刺激；

所述生物方式刺激包括利用补体因子或趋化因子刺激、利用多肽刺激、基因编辑；

所述化学方式刺激包括炎症诱导因子刺激、自噬激活剂刺激、聚合物修饰表面修饰、多空有机框架材料封装；

所述环境刺激包括乏氧环境刺激、乏糖环境刺激、乏氨基酸环境刺激。

优选的，所述补体因子采用C5a，所述趋化因子采用CXC。

优选的，所述基因编辑，采用过表达溶酶体主要功能蛋白的方式实施，过表达的蛋白包括ATP酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、酸性酰胺酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶、透明质酸酶、氯化物电压门控通道CLC-7、胱氨酸蛋白酶Cystinosin、溶酶体相关膜蛋白LAMP1和/或LAMP2、多功能转运内在膜蛋白LIMO-2、粘蛋白TRP阳离子通道Mucolipin、NPC细胞内胆固醇转运蛋白NPC1、溶质载体家族11和/或17。

优选的，所述炎症诱导因子采用LPS。

优选的，所述自噬激活剂刺激，是采用雷帕霉素靶向蛋白mTOR的激活剂和/或转录因子EB的激活剂；其中，激活剂包括糖类化合物、苷类化合物、酮类化合物、抗生素类化合物。

更优选的，所述自噬激活剂刺激的所述激活剂中，糖类化合物包括蔗糖、海藻糖；苷类化合物包括地高辛；酮类化合物包括Torinl、抗生素类化合物包括雷帕霉素。

本发明的有益效果在于：

1、提供了一种新的治疗蛋白错误折叠或加工类疾病的途径；

2、靶向性更强；

3、利用的细胞器不含有遗传物质，不会对受体产生不良影响；

4、改性方法简单，成本低，无毒副作用。

附图说明

图1不同细胞来源的溶酶体在脑部靶向性聚集测试图；

图2脑部小胶质细胞溶酶体在不同器官中的靶向性聚集测试图；

图3脑部小胶质细胞溶酶体在不同样本脑部中的靶向聚集测试图；

图4脑部小胶质细胞溶酶体细胞毒性测定表；

图5脑部小胶质细胞溶酶体对细胞外环境的影响表；

图6脑部小胶质细胞溶酶体对脑部海马的毒性蛋白的降解测试表；

图7脑部小胶质细胞溶酶体对皮层的毒性蛋白的降解测试表；

图8大浓度脑部小胶质细胞溶酶体对脑部海马的毒性蛋白的降解作用。

图9溶酶体水解酶过表达的细胞荧光图

图10溶酶体改善阿尔兹海默症小鼠对事物的识别能力数据表；

图11溶酶体改善阿尔兹海默症小鼠对事物的记忆能力数据表；

图12溶酶体改善阿尔兹海默症小鼠筑巢能力数据表；

图13LPS改性的脑部小胶质细胞溶酶体在脑部靶向性聚集测试图；

图14C5a改性的脑部小胶质细胞溶酶体在脑部靶向性聚集测试图.

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术实施例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

作为实验动物的C57BL/6J小鼠(3月龄)购自维通利华有限公司(北京，中国)。实验期间小鼠在南开大学实验动物中心饲养；作为实验动物的C57BL/6J-APP/PS1阿尔茨海默症小鼠(12月龄)和C57BL/6J野生型小鼠(6月龄、12月龄)购自华阜康有限公司(北京，中国)。实验期间小鼠在中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心饲养。

需要说明的，本发明所述实施例均使用下述改性溶酶体提取方法，根据市售溶酶体提取试剂盒说明书进行。具体步骤如下：

步骤1、离心洗涤。0.25％胰蛋白酶消化收集2-5×10⁷个细胞，用PBS离心洗涤；

步骤2、细胞破壁。离心后弃上清，将细胞沉淀置于冰上，加入400μL细胞胀破缓冲液，在冰上静置10min；利用匀浆器匀浆30-40下，收集匀浆产物至一新离心管中；

步骤3、离心分离改性溶酶体。按下述顺序梯次离心，每次离心后均取上清液，并移至新离心管中进行下一步：1000×g下离心5min——3000×g下离心10min——5000×g下离心10min——20000×g下离心30min；最后一次离心后取沉淀，并用洗涤缓冲液悬起，再次20000×g下离心30min，得到沉淀称重后利用储存液悬起，即为改性溶酶体。置于冰箱中4℃保存。

改性溶酶体的标记：

为了方便进一步测试改性溶酶体的作用机理与效果，通过如下步骤对改性溶酶体进行标记：向步骤3得到的产物中加入溶酶体标记探针(Lysotracker，Red)，以体积份数计，标记探针：溶酶体悬液＝1:20000，2h后取5μL溶酶体悬液，即为标记后的改性溶酶体。将其滴于载玻片上，盖上盖玻片，封片后在共聚焦显微镜下鉴定。

实施例1

改性溶酶体的预处理

39-42℃条件下加热BV2细胞30min；后置于37℃环境下培养24h，后提取溶酶体。

实施例2-19

改性溶酶体的预处理：

参见表1。

提取改性溶酶体：

改性溶酶体提取方法与实施例1相同。

表1溶酶体的预处理参数

应用例1

随机选取C57BL/6J-APP/PS1阿尔茨海默症小鼠(12月龄)，并向其尾静脉注射30mg/kg实施例6制备得到的标记改性溶酶体。

应用例2

随机选取C57BL/6J-APP/PS1阿尔茨海默症小鼠(12月龄)，并向其尾静脉注射30mg/kg实施例7制备得到的标记改性溶酶体。

应用例3

随机选取C57BL/6J-APP/PS1阿尔茨海默症小鼠(12月龄)，并向其尾静脉注射30mg/kg实施例14制备得到的标记改性溶酶体。

应用例4

随机选取C57BL/6J-APP/PS1野生小鼠(12月龄)，并向其尾静脉注射30mg/kg实施例6制备得到的标记改性溶酶体。

应用例5

随机选取C57BL/6J-APP/PS1野生小鼠(12月龄)，并向其尾静脉注射30mg/kg实施例7制备得到的标记改性溶酶体。

应用例6

随机选取C57BL/6J-APP/PS1野生小鼠(12月龄)，并向其尾静脉注射30mg/kg实施例14制备得到的标记改性溶酶体。

为了充分说明本发明的有益效果，注射标记改性溶酶体后2h使用生理盐水灌流，并取出鼠脑进行检测，并设置对比例。应用例与对比例的实验参数如下：

特设置如下对比例：

表2测试参数汇总表

注：1、患病情况中“是”表示患有阿尔茨海默症小鼠；“否”表示普通野生小鼠；

2、患病小鼠选用C57BL/6J-APP/PS1阿尔茨海默症小鼠；无病小鼠选用C57BL/6J野生型小鼠。

测试结果及分析如下：

一、不同部位细胞来源的溶酶体对于脑部的靶向性

将对比例1-5进行如下操作：随机选取规定要求的小鼠，分别向其尾静脉注射30mg/kg溶酶体标记探针标记后的不同来源的溶酶体(空白对比例注入等量的PBS)，2h后使用生理盐水灌流，剖出小鼠脑部。使用小动物成像系统进行荧光成像，酶联免疫检测仪测定吸光度。

如附图1所示，由左向右依次分别为对比例1-5。

观察发现：对比例2脑部小胶质细胞来源的溶酶体对于脑部的靶向性最强。

二、脑部小胶质细胞来源的溶酶体对于不同部位的靶向性

将对比例6-8进行如下操作：随机选取规定要求的小鼠，向其尾静脉注射30mg/kg溶酶体标记探针标记后的溶酶体(空白对比例注入等量的PBS)，2h后使用生理盐水灌流，剖出小鼠相应部位。使用小动物成像系统进行荧光成像，酶联免疫检测仪测定吸光度。

如附图2所示，由上到下依次为脑、心、肺、肝、肾，其中肝的右侧较小的为脾，由左向右依次分别为对比例7,6,8。

观察发现：

脑部小胶质细胞来源溶酶体会在阿尔兹海默症小鼠脑部(对比例6)靶向性富集；

三、脑部小胶质细胞来源的溶酶体对于不同状态的鼠脑部靶向性

将对比例6、9、10、11进行如下操作：随机选取规定要求的小鼠，向其尾静脉注射30mg/kg溶酶体标记探针标记后的溶酶体(空白对比例注入等量的PBS)，2h后使用生理盐水灌流，剖出小鼠脑部。使用小动物成像系统进行荧光成像，酶联免疫检测仪测定吸光度。

如附图3所示，由上到下依次为对比例9、对比例10、对比例6、对比例11。实验数据如表3：

表3溶酶体对于不同状态的鼠脑部靶向性实验数据表

观察发现：

脑部小胶质细胞来源溶酶体会在阿尔兹海默症小鼠脑部(对比例6)富集；

脑部小胶质细胞来源溶酶体会在老年无病小鼠脑部(对比例10)富集；

脑部小胶质细胞来源溶酶体不会在青年无病小鼠脑部(对比例11)富集；

结合老年小鼠和患病小鼠都会在脑部产生异常蛋白和糖缀合物，可得到如下结论：

脑部小胶质细胞来源溶酶体可以靶向进入患病小鼠病灶部位；溶酶体可能会对延缓老年记忆力衰退产生作用。

四、脑部小胶质细胞来源溶酶体对原代神经元细胞毒性测试

首先按常规方法提取新生鼠原代神经元，将原代神经元按5×10⁶/孔密度接种于96孔板中，每孔100μL，在37℃的CO₂培养箱孵育。

每2-3天换半液，第7天时向96孔板中加入不同浓度的溶酶体(100、200、300、400、500μg/mL)。

24小时后，吸弃培养基，向每孔加入1mg/mL的MTT溶液100μL，在37℃的CO₂培养箱避光孵育4小时。

吸弃MTT，向每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，在摇床上避光溶解10分钟。

使用酶联免疫检测仪在490nm波长下测定吸光度，计算细胞存活率。如附图4所示，应用graph pad软件进行统计学分析，组间比较采用t-test比较，无显著性差异。

结果显示：

脑部小胶质细胞来源溶酶体溶酶体不会影响细胞的存活率，对原代神经元细胞无毒性。

五、脑部小胶质细胞来源溶酶体对细胞外环境的影响测试

将N2a细胞接种于6孔板中，在37℃的CO₂培养箱孵育。待细胞铺满孔板80-90％时，在第0、4、6、8、10、12h，分别用含50μg/mL溶酶体的培养基替换相对应的6孔板中的旧培养基培养，期间于37℃的CO₂培养箱中继续孵育。取各孔培养基至离心管中，用pH测试仪测定溶酶体作用不同时间(0、2、4、6、8、12h)培养基的pH值。(见表3及附图5，其中附图5横坐标表示溶酶体加入的时间长度，从左到右数值分别依次对应表4的加入溶酶体的时间点)

表4溶酶体对环境影响实验数据表

应用graph pad软件进行统计学分析，组间比较采用t-test，无显著性差异。

结果显示：

溶酶体不会影响细胞外环境的pH值。

六、脑部小胶质细胞来源溶酶体在患病脑部中降解毒性蛋白测试

取对比例7(老年有病空白组，WT组)、对比例10(老年无病给药组，APP/PS1组)、对比例12(老年有病给药组，APP/PS1 LY组)，尾静脉注射0.5mg/kg溶酶体(空白组注射等量PBS)，每3天注射一次，连续注射一个月。给药结束后，麻醉实验小鼠，用0.9％生理盐水灌流小鼠，提取脑部海马和皮层蛋白质。

分别使用APP抗体(Biolegend，#SIG-39320)、p62抗体(博尔迈生物技术，PM045)、LC3抗体(细胞信号科技，#2775)、Actin抗体(柏奥易杰，BE0021-100)和Tetramer抗体(即APP抗体，Biolegend，#SIG-39320)，通过蛋白质印迹分析不同组别样品蛋白质的变化。(如附图6-7)。

结果显示：

尾静脉注射脑部小胶质细胞来源溶酶体可促进阿尔兹海默症小鼠脑内表达的毒性蛋白的降解。

七、脑部小胶质细胞来源溶酶体有效剂量测试

大剂量测试组：按常规方法提取APP/PS1新生鼠原代神经元，将原代神经元按5×10⁶/孔密度接种于6孔板中，在37℃的CO2培养箱孵育。每2-3天换半液，7天后一次性给500μg/ml溶酶体，7天后提取蛋白质。

为了对比说明大浓度溶酶体对阿尔兹海默症小鼠原代神经元毒性蛋白的降解及自噬途径的作用，特设置如下对比组：

正常原代神经元组：按常规方法提取正常野生型新生鼠原代神经元，将原代神经元按5×10⁶/孔密度接种于6孔板中，在37℃的CO2培养箱孵育。每2-3天换半液，14天后提取蛋白质。

空白组：与大剂量测试组相似，区别在不使用溶酶体进行给药。

分别使用APP抗体(Biolegend，#SIG-39320)、p62抗体(博尔迈生物技术，PM045)、Actin抗体(柏奥易杰，BE0021-100)，通过蛋白质印迹分析不同组别样品蛋白质的变化。(如附图8，从左到右分别为正常原代神经元组、空白组、大剂量测试组)

结果显示：

一次性外源给予大量溶酶体无法有效降解APP蛋白。

八、溶酶体水解酶过表达测试

将293T细胞接种于24孔板中，在37℃的CO2培养箱孵育。待细胞铺满孔板80-90％时，用CathepsinB(CatB)-GFP质粒及CathepsinD(CatD)-GFP质粒转染细胞，将CathepsinB-GFP质粒及CathepsinD-GFP质粒与Lipofectamine 2000分别混匀，静置20min后分别加入至细胞中，6h后将细胞培养基换为新鲜的培养基，24h后观察细胞内部的溶酶体组织蛋白酶B及组织蛋白酶D的过表达情况，得到结果如图9所示。

九、阿尔兹海默症鼠行为学-NOR测试

取对比例6(老年有病、给药)、对比例7(老年无病，不给药)、对比例9(老年无病，不给药)进行测试。

随机选取对比例6(老年有病、给药)小鼠，并根据小鼠体重向其尾静脉注射0.5mg/kg的溶酶体标记探针标记后的溶酶体，每3天注射一次，连续注射一个月。

随机选取对比例7(老年无病，不给药)，并根据小鼠体重向其尾静脉注射与取对比例6(老年有病、给药)等体积的PBS，其他条件与对比例6(老年有病、给药)相同。

随机选取9(老年无病，不给药)，并根据小鼠体重向其尾静脉注射与实施例3等体积的PBS，其他条件与对比例6(老年有病、给药)相同。

连续注射一个月后，进行如下测试：

新事物识别实验(NOR)

应用旷场测试箱，利用啮齿类动物喜欢接触和探索新奇事物的天性检测动物非空间记忆能力。实验分为三步：

①适应阶段：将小鼠依次放入没有任何物体的测试箱中，适应实验环境，连续2天，每天2次。

②熟悉阶段：在距侧壁10cm处放入两个相同物体(A和B)，将小鼠以背对物体方向放入，自由探索10min后将小鼠取出，记录小鼠物体探索时间及嗅探物体次数，连续3天，每天2次。

③测试阶段：24h后进行测试，将两个相同物体中B替换成另一物体C，即熟悉物体(A)和新奇物体(C)，记录小鼠10min对两物体的探索时间及嗅探次数。A和C的位置随机置换，以避免位置偏倚。

探索活动定义为：小鼠鼻子在≤5cm范围内直指向物体或直接接触物体时的行为，小鼠转头或坐在物体上时不被认为是对物体的探索。应用graph pad软件进行统计学分析，组间比较采用one-way。P<0.05为差异有统计学意义。

结果如附图10-11所示：

尾静脉注射溶酶体可改善阿尔兹海默症小鼠对事物的识别能力，改善海马相关学习记忆功能。

筑巢实验：

小鼠夜节律前2h，在鼠笼内放一些2cm×2cm的正方形纸巾(共三张厨房用纸)，24h后统计鼠的筑巢情况并拍照记录。

评分标准如下：

纸巾均匀铺展且未形成团簇为1分；

纸巾均匀铺展且形成松散团簇为2分；

纸巾均匀铺展在笼内1/2且形成团簇为3分；

纸巾均匀铺展在笼内1/3且形成团簇为4分；

纸巾均匀铺展在笼内1/4且形成团簇为5分。

应用graph pad软件进行统计学分析，组间比较采用one-way。

结果如附图12所示：

给药组筑巢评分较高，证明尾静脉注射溶酶体会改善阿尔兹海默症小鼠的社会性行为。

综合上述测试，可以得出如下结论：

1、外源溶酶体对于阿尔兹海默症为代表的治疗蛋白错误折叠或加工类疾病有治疗作用；

2、该治疗作用无毒副作用；

3、各种细胞来源的溶酶体中，脑部小胶质细胞来源效果最佳；

为了追求治疗效果的最优化，发明人进一步对溶酶体进行了改进，以增强药物的入脑效率和靶向性。并对进行了如下测试：

LPS预处理的脑部小胶质细胞来源的溶酶体靶向性测试

取应用例1(改性给药)、对比例6(未改性给药)、对比例7(空白对照)进行如下测试：

随机取应用例1，向其侧脑室注射LPS，在注射后6h向其尾静脉注射30mg/kg溶酶体标记探针标记后的LPS处理过的脑部小胶质细胞来源的溶酶体(细胞提取溶酶体前12h按1:1000的比例向培养基中加入0.1μg/mL的LPS，其余步骤同正常溶酶体提取步骤)，2h后使用生理盐水灌流，剖出小鼠脑部。

为了证明改造后的溶酶体针对病灶部位的靶向性更强，特设置如下对比例：

取对比例6，向其侧脑室注射LPS，在注射后6h向其尾静脉注射等量正常脑部小胶质细胞来源的溶酶体；其他条件与应用例1相同；

取对比例7，向其侧脑室注射LPS，在注射后6h向其尾静脉注射等体积PBS；其他条件与应用例1相同。

使用小动物成像系统进行荧光成像，得到结果如图13所示(从左到右依次分别为对比例7、对比例6、应用例1)：

LPS改性后的脑部小胶质细胞来源的溶酶体在脑部的富集靶向性优于直接提取的脑部小胶质细胞来源的溶酶体。

C5a预处理的脑部小胶质细胞来源的溶酶体靶向性测试

取应用例2(改性给药5nM)、应用例3(改性给药10nM)、对比例6(未改性给药)进行如下测试：

随机取应用例2，向其侧脑室注射LPS，在注射后6h向其尾静脉注射30mg/kg溶酶体标记探针标记后的C5a处理过的脑部小胶质细胞来源的溶酶体(细胞提取溶酶体前0.5h，混合后C5a浓度为10nmol/L，其余步骤同正常溶酶体提取步骤)，2h后使用生理盐水灌流，剖出小鼠脑部。

取应用例3，向其侧脑室注射LPS，在注射后6h向其尾静脉注射等量溶酶体标记探针标记后的C5a处理过的脑部小胶质细胞来源的溶酶体，混合后C5a浓度为10nmol/L，其他条件与应用例2相同；

取应用例6，向其侧脑室注射LPS，在注射后6h向其尾静脉注射等量正常脑部小胶质细胞来源的溶酶体；其他条件与应用例2相同。

使用小动物成像系统进行荧光成像，得到结果如图14所示(从左到右依次分别为对比例6、应用例2、应用例3)：

C5a改性后的脑部小胶质细胞来源的溶酶体在脑部的富集靶向性优于直接提取的脑部小胶质细胞来源的溶酶体。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用，其特征在于，所述改性溶酶体来自经外界刺激改性的脑部小胶质细胞。

2.根据权利要求1所述的改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用，其特征在于，所述外界刺激包括物理方式刺激、生物方式刺激、化学方式刺激、环境方式刺激中至少一种。

3.根据权利要求2所述的改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用，其特征在于，所述物理方式刺激包括热刺激、力刺激、光刺激、电刺激。

4.根据权利要求2所述的改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用，其特征在于，所述生物方式刺激包括利用补体因子或趋化因子刺激、利用多肽刺激、基因编辑。

5.根据权利要求2所述的改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用，其特征在于，所述化学方式刺激包括炎症诱导因子刺激、自噬激活剂刺激、聚合物修饰表面、多孔有机框架材料封装。

6.根据权利要求2所述的改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用，其特征在于，所述环境刺激包括乏氧环境刺激、乏糖环境刺激、乏氨基酸环境刺激。

7.根据权利要求4所述的改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用，其特征在于，所述补体因子采用C5a，所述趋化因子采用CXC。

8.根据权利要求4所述的改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用，其特征在于，所述基因编辑，采用过表达溶酶体主要功能蛋白的方式实施，过表达的蛋白包括ATP酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、酸性酰胺酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶、透明质酸酶、氯化物电压门控通道CLC-7、胱氨酸蛋白酶Cystinosin、溶酶体相关膜蛋白LAMP1和/或LAMP2、多功能转运内在膜蛋白LIMP-2、粘蛋白TRP阳离子通道Mucolipin、NPC细胞内胆固醇转运蛋白NPC1、溶质载体家族11和/或17。

9.根据权利要求5所述的改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用，其特征在于，所述炎症诱导因子采用LPS。

10.根据权利要求5所述的改性溶酶体作为制备治疗蛋白错误折叠或加工类疾病药物的应用，其特征在于，所述自噬激活剂刺激，是采用雷帕霉素靶向蛋白mTOR的激活剂和/或转录因子EB的激活剂；其中，激活剂包括糖类化合物、苷类化合物、酮类化合物、抗生素类化合物。