KR20080093656A - 퇴행성 신경질환의 치료를 위한 카텝신 ｄ의 신규한 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 퇴행성 신경질환의 치료를 위한 카텝신 D의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 카텝신 D의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 카텝신 D의 발현을 조절하는 제제를 선별하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 비정상적으로 활성화된 소교세포로부터 분비된 카텝신 D 단백질의 활성을 억제하거나 카텝신 D 유전자의 발현을 억제함으로써 소교세포의 신경독성작용으로 인하여 유발되는 퇴행성 신경질환을 예방 및 치료할 수 있다. 또한, 카텝신 D는 퇴행성 신경질환의 치료제를 스크리닝하기 위한 타깃으로 사용될 수 있다.

카텝신 D, 소교세포, 퇴행성 신경질환

Description

퇴행성 신경질환의 치료를 위한 카텝신 Ｄ의 신규한 용도{Novel use of cathepsin D for treating neurodegenerative disease}

도 1a는 LPS 미처리 BV-2 세포의 용해물의 2-DE 분석 결과이다.

도 1b는 LPS 미처리 BV-2 세포의 조건화 배지(none) 및 LPS 처리 BV-2 세포의 조건화 배지(LPS)의 2-DE 분석 결과이다.

도 2는 BV-2 소교세포로부터 수득한 조건화 배지의 1차원 전기영동 분석결과 및 세포 생존율 평가 결과이다.

A: NMMA 존재 하에서 LPS 및 IFNγ로 혼합 처리한 BV-2 세포의 1차원 전기영동

B: MTT 분석에 의한 세포 생존율 평가

실험은 독립적으로 3회 반복실시하고 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냄.

*은 LPS/IFNγ 처리하지 않은 대조군 세포에 비해 통계적으로 유의적 차이를 나타냄(p<0.05)

도 3은 웨스턴 블롯 분석 또는 효소활성 분석에 의한 LC-MS/MS 데이터의 검증 결과이다.

A: LPS/IFNγ로 활성화된 BV-2 세포의 조건화 배지의 웨스턴 블롯

B: LPS/IFNγ로 활성화된 일차소교세포 배양의 조건화 배지의 웨스턴 블롯

C: 활성화된 소교세포의 조건화 배지의 효소활성 분석

*: 실험군 간의 유의적인 차이를 나타냄(p< 0.05)

도 4a는 LPS 및 INFγ 미처리 BV-2 세포, LPS 및 IFNγ 단독 또는 혼합 처리된 BV-2 소교세포와 B35-EGFP 세포의 공동 배양시 EGFP-양성 세포의 수를 나타낸 것이다.

도 4b는 LPS 미처리 BV-2 세포(None) 또는 LPS-처리 BV-2 세포와 B35-EGFP 세포의 공동배양을 사진으로 나타낸 것이다(x 200)

도 4c는 B35-EGFP 세포 생존율에 LPS 또는 INFγ가 미치는 영향을 MTT 분석으로 측정한 결과이다.

도 4d는 활성화된 BV-2 세포와 B35-EFGP 세포의 공동 배양시 카텝신 D에 대한 중화항체에 의한 카텝신 D의 고갈에 따른 B35-EFGP 세포 사멸의 감소를 나타낸 것이다.

도 4e는 활성화된 BV-2 세포와 B35-EFGP 세포의 공동 배양시 BV-2 소교세포에서 shRNA을 이용한 카텝신 D 유전자 발현의 녹다운에 따른 B35-EFGP 세포 사멸의 감소를 나타낸 것이다.

도 4f는 shRNs에 의한 카텝신 D 유전자 발현의 녹다운을 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과이다.

* 통계적으로 유의적인 차이가 있음을 의미함(p<0.05)

본 발명은 퇴행성 신경질환의 치료를 위한 카텝신 D의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 카텝신 D의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 카텝신 D의 활성 또는 발현을 조절하는 제제를 선별하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

퇴행성 신경질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 운동 및 감각기능의 손상, 기억, 학습, 연산 추리 등의 고차적원인 기능의 저해와 같은 여러 가지 증상을 유발하는 질환이다. 대표적인 질환으로는 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease) 및 기억장해 등이 있다. 퇴행성 신경질환은 급격히 혹은 천천히 진행되는 괴사(necrosis)나 아폽토시스(apoptosis)에 의한 신경세포의 사멸로 특징지어 진다. 따라서 신경세포의 사멸기전에 대한 이해는 중추신경계 질환의 예방, 조절 및 치료법 개발을 위하여 반드시 이루어져야 한다.

중추신경계는 신경세포와 신경교세포로 이루어져 있다. 신경교세포는 전체 뇌세포의 90%, 부피로는 뇌 전체의 50%를 차지하고 있다. 상기 신경교세포는 다시 성상세포(astrocytes), 소교세포(microglia) 및 희소돌기아교세포(oligodendroc ytes)의 세 종류로 구성되어 있다.

이들 중에서 소교세포(microglia)는 중추신경계(central nervous system, CNS)에 상재하는 면역세포로서(Stoll and Jander, Prog Neurobiol 58:233-247, 1999; Kim and de Vellis, J Neurosci Res 81:302-313, 2005) 전체 뇌 세포의 5-10%를 차지한다. 상기 소교세포는 CNS에서 일차 방어라인으로서 기능한다. 소교세포는 CNS에서 염증 매개자의 주요 세포 내 공급원이다. 소교세포는 일산화질소(NO), 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS), 전염증성 사이토카인 및 프로스타글란딘을 생산함으로써 신경염증에 관여한다. 활성화된 소교세포는 손상된 신경 조직 영역으로 이동하여 미생물 및 세포 파편(cell debris)을 포식하고 파괴한다(Gehrmann et al., Brain Res Rev 20:269-287, 1995). 그러나 염증세포로서의 소교세포의 역할은 항상 유익한 것만은 아니다. 현재, 조절되지 않은 소교세포의 활성화와 지속적인 과도한 신경염증은 퇴행성 신경질환(neurodegenerative diseases)을 포함하는 다양한 CNS 병리의 원인으로 여겨지고 있다(Gonzalez-Scarano and Baltuch, Annu Rev Neurosci 22:219-240, 1999). 즉, 기능적으로 활성화된 소교세포는 염증매개물질을 생성 및 분비하여 신경세포 사멸을 초래하는 것으로 알려져 있다. 따라서 소교세포의 활성화는 다양한 종류의 퇴행성 신경질환과 관련이 있다. 예를 들어, 알츠하이머 질환의 경우에도 노용균반점(senile plague)의 형성에 소교세포가 중요한 역할을 한다는 것은 매우 잘 알려져 있다 (Wegiel, J. et al., Acta Neuropathol (Berl), 100(4):356-64, 2000). 이브프로펜 등과 같 은 소염제가 노용균반점의 형성을 억제하며 치매 발병을 예방할 수 있다는 것이 중요한 예이다(Weggen, S. et al., Nature, 414:212-216, 2001; Wyss-Coray, T. and Mucke, L., Nat. Med., 6:973-974, 2000; Lim, G. P. et al., J. Neurosci 20:5709-5714, 2000).

만성 신경염증은 퇴행성 신경질환에 영향을 주기 때문에, 신경염증반응을 주도하는 소교세포에 많은 관심이 기울어져 왔다. 퇴행성 신경질환의 병리생리학에 있어서 소교세포의 역할을 좀 더 잘 일해하기 위하여, 최근에 시스템 생물학적 접근이 사용되었다(Suk, Expert Opin. Ther. Patents 2006, 16, 237-247). 소교세포의 유전자전사적(Transcriptomic) 또는 프로테오믹 분석은 이전에 입수할 수 없었던 상당량의 정보를 생성하였다. 한편, 전체 전사체 또는 단백질의 단일 단계 분석은 그 자체로 한계를 갖는다. 예를 들어, 미량 존재하는(low abundance) 전사체 또는 단백질은 다량 존재하는 전사체 또는 단백질에 의해 차폐되어 검출되지 않는다. 또한, 전사체 또는 프로테옴의 복잡성이 한계의 또 다른 이유가 된다. 보다 더 최근에는 세포에 포함된(subcellular) 또는 표적이 되는 프로테오믹스(서브프로테오믹스)가 대안으로 출현하였다(Wu et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2005, 288, L585-595; Dreger, Mass Spectrom Rev 2003, 22, 27-56; Jung et al., Electrophoresis 2000, 21,3369-3377). 세크로톰 분석(소위 세크레토믹스)이 하나의 예이다. 소교세포 및 뉴런은 분비 단백질을 매개로 하여 서로 상호 작용하기 때문에, 소교세포 세크로톰의 분석은 소교세포가 뉴런의 기능에 어떻게 영향을 주 는지에 대한 통찰을 제공할 수 있다(Suk, Expert Opin. Ther. Patents 2006, 16, 237-247). 그럼에도 불구하고, 지금까지 소교세포의 세크레토믹 분석은 수행된 바 없다.

분비 단백질은 다수의 생리적 프로세스 및 질병 프로세스를 제어 및 조절하는데 있어서 직접적인 역할을 수행한다(Grimmond et al., Genome Res 2003, 13, 1350-1359; Greenbaum et al., Genome Res 2001, 11, 1463-1468). 분비 단백질은 다세포 내에서 세포 내 신호로서 세포 성장, 분할, 분화 및 아폽토시스를 조절할 수 있다. 또한, 분비 단백질은 암, 면역 질환, 심혈관 질환 및 퇴행성 신경질환의 발병기전에 있어서 핵심 프로세스를 조절할 수 있다. 분비된 프로테옴(세크레톰)은 질환의 진단 및 예후를 위한 가장 가능성이 높은 바이오마커이므로, 최근 들어 세크로톰 연구는 많은 관심을 받고 있다. 게놈의 컴퓨터 분석이 아미노산 서열 정보를 기초로 한 세크로톰의 간접적인 동정에 사용되어 왔으나(Grimmond et al., Genome Res 2003, 13, 1350-1359), 프로테오믹 접근은 광범위한 세포 타입 및 조직에 있어서 분비된 단백질을 직접적으로 실험할 수 있도록 한다(Thouvenot et al., Proteomics 2006, 6, 5941-5952; Khwaja et al., Oncogene 2006, 25, 7650-7661; Pellitteri-Hahn et al., J Proteome Res 2006, 5, 2861-2864; Zvonic et al., Mol Cell Proteomics 2007, 6, 18-28; Dupont et al., Proteomics 2005, 5, 585-596; Dupont et al., Proteomics 2004, 4, 1761-1778; Lafon-Cazal et al., J Biol Chem 2003, 278, 24438-24448; Delcourt et al., Mol Cell Proteomics 2005,4, 1085- 1094).

이에 본 발명자들은 소교세포의 신경독성 기작을 규명하기 위해 소교세포로부터 분비되는 단백체를 분석한 결과, 소교세포로부터 카텝신 D가 분비되어 신경독성을 매개함을 다양한 실험을 통해 확증함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 퇴행성 신경질환의 치료를 위한 카텝신 D의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카텝신 D의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 카텝신 D의 발현을 조절하는 제제를 선별하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 카텝신 D가 활성화된 소교세포로부터 분비되어 소교세포의 신경독 성을 매개한다는 사실을 규명한 것에 기초로 한다.

카텝신 패밀리의 프로테아제는 산성 pH에서 라이소좀 내 펩타이드 및 단백질을 분해하는 라이소좀 가수분해효소이다. 카텝신은 그들의 활성 부위 아미노산에 따라 3개의 서브그룹으로 나뉜다; 즉, 시스테인 카텝신(B, C, H, F, K, L, O, S, V 및 W), 아스파르트산 카텝신(D 및 E) 또는 세린 카텝신(G). 아스파르트산 프로테아제로서 카텝신 D는 활성 부위의 깊은 틈새 내에 2개의 아스파르트산 잔기를 갖는다. 카텝신 D의 주요 기능은 라이소좀 구획 내 세포 내 이화작용이지만, 호르몬, 항원 및 신경펩타이드의 프로세싱 뿐 만 아니라 프로그램화 된 세포 사멸(Liaudet-Coopman, Cancer Lett 2006, 237, 167-179; Fusek et al., Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 2005, 149, 43-50), 알츠하이머 질환(AD) 및 간질과 같은 CNS 장애에도 관여한다(Dreyer et al., Eur J Biochem 1994, 224, 265-271; Hetman et al., Exp Neurol 1995, 136,53-63). 또한, 카텝신 D 및 이의 전구-효소(pro-enzyme)가 병리적 상태 하에서 리간드 유사 기능을 갖는다는 연구 결과가 증가하고 있다. 촉매적으로 불활성 카텝신 D 전구체는 상피성 유방암 세포에 분비되어 그 증식을 촉진하는 것으로 나타난 바 있다(Laurent-Matha et al., J Cell Biol 2005, 168, 489-499). 또한, 다른 종류의 암 진행과정 및 전이에 있어서 분비된 카텝신 D의 작용이 보고 된 바 있다(Sebzda et al., J Exp Ther Oncol 2005, 5, 145-150; Merseburger et al., Eur Urol 2005, 48, 519-526; Losch et al., Gynecol Oncol 2004, 92, 545-552). 문헌에는 카텝신 D의 비정상적인 분비가 세포 내 기관의 결손 산성화로 인한 것이라고 보고 되어 있다(Kokkonen et al., J Biol Chem 2004, 279, 39982-39988). 이는 아직까지 규명되지 않은 세포 표면 수용체가 카텝신 D의 세포 외 작용을 매개하는 것으로 추정할 수 있다.

소교세포 조절 염증 반응은 중추신경계 내에서 신경보호 및 신경독성 효과를 모두 가진다. 한편, 소교세포의 과도하고 만성적인 활성은 신경독성 효과 쪽으로 균형이 이동될 수 있다. 이와 같은 관점에서, 활성화된 소교세포로부터 분비된 단백질들은 신경독성 효과에 있어서 중요한 역할을 수행할 것으로 사료되며, 이러한 단백질들은 염증 매개 퇴행성 신경질환의 진단 및 치료에 적용할 수 있는 가능성을 갖는다.

이에 본 발명의 일 실시예에서는 활성화된 소교세포의 분비된 단백질(세크로톰)의 특성을 규명하기 위하여, BV-2 마우스 소교세포 또는 일차소교세포 배양물로부터 수득한 조건화 배지(conditioned media)를 2차원 겔 전기영동 또는 탠덤 질량분석기와 결합된 액체 크로마토그래피에 의해 분석하였다(실시예 1 참조).

세크레톰(secretome)은 액틴 및 락테이트 디하이드로게나제와 같은 단백질을 포함하며 리더 서열 또는 트랜스멤브레인 도메인을 나타내지 않고 기관 내에서 "세포질(cytoplasmic)"로 분류된다. 이전에, 세크레톰은 고전적인 분비 경로를 통해 분비된 단백질의 집합(subset)으로 간주되었다. 현재, 보다 넒은 의미에서 세크레톰은 고전적 분비, 비고전적 분비 경로 및 엑소좀(exosome)을 통한 분비와 같은 다양한 기작을 통해 분비된 단백질을 포함한다. 엑소좀은 B 세포 및 수지상 세포와 같은 전문적인 항원 제시 세포 내에서 처음으로 언급된 분비 멤브레인 소포체이다. 최근, 소교세포는 엑소좀의 거처를 제공하는 것으로 보여 지고 있다(Potolicchio, J Immunol 2005, 175, 2237-2243). 소교세포 엑소좀의 LC-MS/MS 분석은 세포골격(cytoskeleton), 세포골격 관련 단백질, 샤페론 및 몇몇의 다른 세포질 단백질들이 엑소좀을 구성하는 것으로 나타났다. 따라서 소교세포 세크레톰에서 세포질 기원의 단백질이 발견될 수 있다. 또한, 무혈청 조건 하에서 LPS/IFNγ로 BV-2 세포를 8시간 이상 처리하는 것은 세포 생존율의 유의적인 감소를 유도하기 때문에 세포 내 단백질은 괴사 세포로부터 유래된 것일 수 있다(도 2의 B).

한편, 상대적으로 긴 기간의 자극은 조건화 배지 내 분비된 단백질의 최적의 축적을 위해 요구되어 진다. 따라서 소교세포의 세크로톰 분석은 3개의 각기 다른 시점(4, 12 및 18시간)에 수행되었다(표 1). 소교세포의 자극이 길수록 검출되는 세포 내 유래 단백질의 수가 증가하였다. 긴 기간 배양 후 조건화 배지 내 세포질 단백질 수준이 유의적으로 증가됨이 이전에 보고 된 바 있다(Zwickl, Electrophoresis 2005, 26, 2779-2785). 세척에 의한 혈청 알부민의 제거는 세포 생존율과 반비례하는데, 이는 엄격한 세척이 세크로톰 분석 전에 세포에 손상을 줄 수 있기 때문이다. 분비된 단백질의 최적의 회수를 위하여, 최소 세포 용해를 위한 배양 및 세척 조건이 확립되었다(Pellitteri-Hahn, J Proteome Res 2006, 5, 2861-2864). LPS/IFNγ-활성화된 BV-2 소교세포 배양물의 세크로톰 분석을 위해 적어도 12시간 이하의 자극 및 엄격한 세척이 최적인 것으로 나타났다.

BV-2 세포를 무혈청 조건 하에서 LPS/IFNγ를 처리 또는 미처리하고 4 내지 18시간 동안 배양한 다음 배양액의 조건화 배지를 LC-MS/MS 분석을 위해 회수하였 다. LPS 및 IFNγ의 혼합은 소교세포의 활성화를 극대화하기 위해 사용하였다. LPS/IFNγ 처리가 산화질소(NO)의 생성을 매개로 하여 소교세포의 활성화 및 아폽토시스를 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에, 소교세포 사멸을 최소화하기 위해 NO 합성효소 (NOS) 억제제 NMMA를 LPS/IFNγ와 함께 배양액 내에 첨가하였다. NMMA는 활성화된 소교세포에서 유도성 NOS(iNOS)-유래 NO 생성을 차단함으로써 NO 효과의 가능성을 배제할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서는 LC-MS/MS에 의해 수득된 결과를 기초로 하여 활성화된 소교세포에서 상향조절되는 몇몇의 단백질을 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석 또는 효소활성분석에 의해 검증하였다(실시예 2 참조).

그 결과, 카텝신 D 전구체 및 햅토글로빈 전구체의 수준은 LPS/IFNγ 비자극 세포에 비해 LPS/IFNγ 자극된 BV-2 소교세포 또는 일차 소교세포 배양물의 조건화 배지 내에서 증가하는 것으로 나타났다(도 3의 A 및 B).

또한, LPS/IFNγ로 자극된 BV-2 세포의 조건화 배지 및 일차 소교세포 배양물 내에서 아미노펩티다아제 B 활성이 증가됨이 관찰되었다(도 3의 C).

헵토글로빈은 급성기 단백질이다. 이는 광범위한 항-염증 활성을 나타내고 유리 헤모글로빈과 결합함으로써 정균제 및 항산화제로서 작용한다(Lim, Redox Rep 2001, 6, 219-227). 적혈구로부터 방출된 유리 헤모글로빈은 철 침전을 유도하고 이는 산화 및 염증을 증가시킬 수 있다. 헵토글로빈 헤모글로빈 복합체는 세망내 피 시스템(reticuloendothelial system)에 의해 제거됨으로써 유리 헤모글로빈의 산화 및 전염증 효과가 억제된다. 다양한 면역조절 효과는 헵토글로빈의 속성이다. 헵토글로빈은 인간 및 쥐의 면역 시스템에 있어서 Th1/Th2 균형의 조절인자로서 간주되고 있다(Guetta et al., Atherosclerosis 2006; Arredouani et al., Redox Rep 2001, 6, 369-371). 헵토글로빈의 특이적인 표현형은 다양한 공통 질병과 관련이 있다(예컨대, 심혈관계 질환, 자가면역 질환 및 악성 종양)(Wassell, Clin Lab 2000, 46, 547-552). 헵토글로빈이 간세포에 의해 일차적으로 생성되나, 최근 연구에서 과립구(granulocytes)도 상기 단백질을 생성하는 것으로 나타났다(Theilgaard-Monch et al., Blood 2006, 108, 353-361). 현재, 본 발명에서는 상기 단백질이 활성화된 소교세포에 의해 생성됨을 보여준다. 활성화된 소교세포에 의해 생성된 헵토글로빈은 신경염증의 조절에 있어서 중요한 역할을 수행할 것으로 추정된다. 최근, 헵토글로빈 단백질 수준의 증가가 AD 환자의 CSF에서 검출되었다(Zhang et al., J Alzheimers Dis 2005, 7, 125-133; discussion 173-180). 소교세포의 만성적인 활성이 AD 및 다른 종류의 신경변성 질환의 질병 프로세스와 연관되어 있기 때문에, 이러한 실험 결과는 활성화된 소교세포가 환자에서 상향조절된 헵토글로빈의 공급원일 수 있음을 뒷받침해 준다.

아미노펩티다아제는 펩타이드 또는 단백질의 N-말단으로부터 아미노산 잔기의 가수분해를 촉진하는 엑소펩티다아제이다. 아미노펩티다아제의 기능 및 조절의 변화는 암 및 심혈관 질환과 관련이 있다. 패밀리의 12개 이상의 일원 중 펩타이드 로부터 N-말단 Arg 또는 Lys 잔기를 특이적으로 절단하는 아미노펩티다아제 B(EC 3.4.11.6)는 염증 프로세스 및 종양 진행과 관련이 있다(Diaz-Perales et al, J Biol Chem 2005, 280, 14310-14317; Fukasawa et al., Biochemistry 2006, 45, 11425-11431). 효소 분석에서 제시한 바와 같이, 아미노펩티다아제 B의 활성이 LPS/IFNγ 자극된 소교세포의 조건화 배지에서 증가하였다. 이러한 결과는 아미노펩티다아제 B의 분비가 소교세포의 염증 활성 후 증가되어 소교세포-조절 신경 염증에 있어서 중요한 역할을 수행함을 의미한다.

나아가, 본 발명자들은 본 발명의 다른 실시예에서 활성화된 소교세포의 조건화 배지 내에서 상대적으로 증가된 단백질 중 하나인 카텝신 D가 소교세포의 신경독성을 매개하는지 여부를 소교세포와 신경모세포종의 공동배양 실험을 통해 확인하였다(실시예 3 참조). 그 결과, 중화 항체를 이용한 카텝신 D의 고갈 및 소교세포 내 카텝신 D 유전자 발현의 녹다운으로 인해 활성화된 소교세포의 신경모세포종에 대한 신경독성이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 4의 D, E 및 F 참조).

따라서 활성화된 소교세포의 세크로톰 내에서 동정된 다수의 단백질 중 아스파르트산 엔도프로테아제 카텝신 D가 다음의 결과를 기초로 하여 소교세포 세포독성을 매개하는 것으로 나타났다: 1) 조건화 배지의 웨스턴 블롯 분석에 의해 LPS(lipopolysaccharide)/IFNγ(interferon-γ) 자극된 소교세포 내에서 자극받지 않은 소교세포에 비해 카텝신 D의 발현이 현저하게 증가됨(실시예 <2-1> 참조); 2) 중화항체를 이용한 카텝신 D의 고갈에 의해 BV-2 소교세포와 B35 신경모세포종의 공동 배양에 있어서 소교세포의 신경독성이 감소됨(실시예 <3-2> 참조); 3) shRNA를 이용한 소교세포 내 카텝신 D 발현의 녹다운은 BV-2 소교세포와 B35 신경모세포종의 공동 배양에서 신경독성을 제거함(실시예 <3-3> 참조).

결론적으로, 카텝신 D는 소교세포 신경독성에 있어서 중추적인 역할을 수행하며 이는 과도한 소교세포 활성화와 관련된 퇴행성 신경질환 및 속발성 신경독성 염증의 진단 및 치료를 위한 바이오마커 또는 약제 타깃이 될 수 있다.

따라서 본 발명은 카텝신 D의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 카텝신 D의 활성 억제제로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 펩타이드 모조물, 화합물 및 생물제제일 수 있다. 바람직하게는 카텝신 D의 활성을 중화시킬 수 있는 항-카텝신 D 항체일 수 있다.

본 발명에서 항-카텝신 D 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 카텝신 D 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.

다클론 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 랫트와 같은 여러 온혈 동물로부터 당해 분야의 통상적인 기술 중의 하나를 사용할 수 있다. 즉, 항원을 복막 내, 근육 내, 안내 또는 피하 주사를 통해 동물을 면역시 킨다. 상기 항원에 대한 면역성은 보조제, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 사용하여 증가시킬 수 있다. 부스터(booster) 면역처리에 따른 다음, 혈청의 소형 샘플을 수집하고 목적하는 항원에 대한 반응성을 시험한다. 동물의 역가가 일단 항원에 대한 이의 반응성의 관점으로 정체 상태에 도달하면, 다량의 다클론 면역혈청을 1주 마다의 출혈 또는 동물을 방혈시킴으로써 수득할 수 있다.

단클론 항체도 공지된 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다(Kennettm McKearn and Bechtol(eds.), Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, 1980). 단클론 항체는 카텝신 D 단백질을 면역원으로 하여 동물을 면역화시키고, 면역화된 동물의 비장세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생성하고, 카텝신 D 단백질을 선택적으로 인식하는 하이브리도마를 선별하며, 선별한 하이브리도마를 배양하고, 하이브리도마의 배양액으로부터 항체를 분리함으로써 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 단클론 항체는 카텝신 D 단백질을 선택적으로 인식하는 항-카텝신 D 항체를 생산하는 상기의 하이브리도마를 동물에 주입하고, 주입 후 일정기간이 지난 다음 회수한 동물의 복수로부터 분리함으로써 제조할 수 있다.

본 발명에서 "유전자의 발현 억제"에는 유전자 전사의 억제 및 단백질로의 번역 억제가 포함된다. 또한, 유전자 발현이 완전히 정지된 것 뿐 만 아니라 발현이 감소된 것도 포함된다.

유전자의 발현을 억제하는 방법으로는 안티센스 분자를 이용하는 것이 가장 보편적이다. 안티센스 분자가 표적 유전자의 발현을 억제하는 작용으로는 삼중쇄 형성에 의한 전사개시 저해, RNA 폴리머라제에 의해 국부적인 개상 루프 구조가 만들어진 부위에서 하이브리드 형성에 의한 전사 억제, 합성이 진행되고 있는 RNA에서 하이브리드 형성에 의한 전사 저해, 인트론과 엑손과의 접합접에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, 스플라이소좀 형성 부위에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, mRNA와의 하이브리드 형성에 의한 핵으로부터 세포질로의 이행 억제, 번역 개시인자 결합 부위에서 하이브리드 형성에 의한 번역개시 억제 등이 있다. 이들은 전사, 스플라이싱 또는 번역 과정을 저해하여 표적 유전자의 발현을 억제한다.

본 발명에 사용되는 안티센스 분자는 상기의 어느 작용으로든지 표적 유전자의 발현을 억제해도 좋다. 대표적인 안티센스 분자로는 3중제, 리보자임(ribozyme), RNAi, 또는 안티센스 핵산 등이 포함된다. 3중제는 이중 나선 DNA 주변을 감아 3 본쇄 나선을 형성하도록 함으로써 전사 개시가 억제되도록 한다(Maher et al., Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991).

리보자임은 1 본쇄 RNA를 특이적으로 절단하는 능력을 보유한 RNA 효소이다. 리보자임은 표적 RNA 분자 내 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하여 부위특이적으로 절단시킴으로써 표적 유저자의 단백질 발현을 억제한다(Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1998; Sarver et al., Science 247:1222-1225, 1990).

RNAi(RNA interference)는 염기서열 특이적으로 작용하는 헤어핀 형태의 소분자의 RNA를 사용하여 전사 수준 혹은 전사 후 수준에서 유전자 발현을 억제시키는 방법이다(Mette et al., EMBO J., 19: 5194-5201, 2000). 상기 RNAi 방법에 사용되는 소분자 RNA는 표적 유전자와 상동성을 가지는 이중가닥 RNA 분자이다.

상기에서 RNA 분자를 제조하는 방법으로는 공지된 화학적 합성 방법 및 효소적 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, RNA 분자의 화학적 합성은 문헌에 개시되어 있는 방법을 사용할 수 있으며(Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67, 99-134, 1999), RNA 분자의 효소적 합성은 T7, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제와 같은 파아지 RNA 폴리머라제를 이용하는 방법이 문헌에 개시되어 있다(Milligan and Uhlenbeck, Methods Enzymol. 180:51-62, 1989).

안티센스 핵산은 표적 mRNA 분자와 적어도 일부분이 상보적인 DNA 또는 RNA 분자를 말한다(Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990). 세포 내에서, 안티센스 핵산은 이에 상응하는 mRNA와 혼성화되어 2본쇄 분자를 형성함으로써 표적 유전자의 mRNA 해독을 저해하여 단백질 발현을 억제한다(Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988). 상기 안티센스 핵산은 특히 본 발명의 카텝신 D의 발현을 억제하는 억제제로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 형태로서 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 화학 합성법, 예를 들어 문헌(Tetrahedron Lett., 1991, 32, 30005-30008)에 기재된 바와 같이 아세토니트릴 중에서 테트라에틸티우람 디술파이드로 황화시키는 포스포아미다이트 화학과 같 은 방법에 의해 매우 용이하게 제조할 수 있다.

바람직하게는, RNAi에 의해 카텝신 D 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 포유동물에서 RNAi를 유도할 수 있는 방법으로는 크게 siRNA 형질전환 및 shRNA 벡터 형질전환이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 카텝신 D 유전자에 특이적인 shRNA (short hairpin RNA) 벡터를 제조하고 이를 소교세포에 형질전환함으로써 카텝신 D 유전자를 녹아웃하였다.

본 발명에서 사용할 수 있는 바람직한 shRNA는 단일 가닥으로 대략 길이가 10 내지 30 염기쌍 부분이 포함되며 선택적으로 한 개 이상의 자유 또는 루프형 말단을 가질 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 shRNA는 카텝신 D cDNA의 660-678번 뉴클레오타이드에 상응하는 염기를 가질 수 있다.

한편, shRNA 벡터를 형질전환시키기 위한 shRNA 벡터에는 H1 프로모터나 U6 프로모터 등의 RNA pol Ⅲ 프로모터가 주로 사용되며, 이때 shRNA가 세포 내에서 siRNA로 전환될 수 있도록 고안되어 있다. 플라스미드를 기초로 한 shRNA 벡터와 PCR 발현 카세트 등이 여기 속하며, 바이러스를 기초로 한 shRNA 벡터도 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 카텝신 D cDNA의 뉴클레오타이드 660-678번에 상응하는 shRNA, 9 염기 루프 및 역반복 부위를 siExpress^TM 벡터(Mirus; Madison, WI)에 클로닝하여 shRNA 벡터를 제조하였다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.

상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 화합물 또는 추출물의 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

상기와 같이 제조된 본 발명의 약학적 조성물은 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 본 발명에서 "퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease)"이란 뇌의 일부분의 신경세포가 서서히 퇴화하면서 신경전달에 장애가 생겨 발생하는 질환을 모두 포함한다. 퇴행성 신경질환의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 다발성 경화증 등이 있다.

나아가, 본 발명은 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법은 (a) 시험물질을 활성화된 소교세포와 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 소교세포로부터 카텝신 D의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 (a) 단계의 시험물질이 카텝신 D의 발현을 촉진 또는 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명의 퇴행성 신경질환 체료제의 스크리닝 방법은 (a) 활성화된 소교세포와 신경모세포종에 시험물질을 처리하여 공동 배양하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 신경모세포종의 생존율을 측정하는 단계;

(c)상기 (a) 단계의 시험물질이 신경모세포종의 생존율을 감소 또는 증가시키는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 "시험물질(test agent)"은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.

본 발명의 방법으로 스크리닝되거나 동정될 수 있는 시험물질은 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제 핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 상기 시험물질은 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 시험물질은 펩타이드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약 5-20개, 보다 바람직하게는 약 7-15개의 아미노산을 가지는 펩타이드일 수 있다. 상기 펩타이드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스화(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.

또한 상기 시험물질은 "핵산"일 수 있다. 핵산 시험물질은 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스화" 랜덤 핵산일 수 있다.

또한 상기 시험물질은 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다.

상기에서 소교세포는 포유동물로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는 마우스로부터 유래된 것일 수 있다. 소교세포의 활성화는 LPS 및 IFNγ를 혼합 처리함으로써 극대화할 수 있다. 한편, LPS/IFNγ 처리가 산화질소(NO)의 생성을 매개로 하여 소교세포의 활성화 및 아폽토시스를 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에, 소교세포 사멸을 최소화하기 위해 NO 합성효소 (NOS) 억제제 NMMA를 LPS/IFNγ와 함께 배양액 내에 첨가할 수 있다.

상기에서 신경모세포종은 포유동물로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게 는 마우스로부터 유래된 것일 수 있다. 신경모세포종의 생존율은 당업계에 공지된 MTT 분석법에 의해 측정하거나, 상기 신경모세포종을 pEGFPN1 플라스미드로 형질전환시켜 EGFP 양성 세포의 수를 형광 현미경하에서 계수함으로써 측정할 수 있다.

상기에서 카텝신 D의 발현 정도는 단백질 및/또는 mRNA 수준에서 면역분석학적 방법, 하이브리드화 반응 및 증폭반응에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 웨스턴 블롯 분석, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoadsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법 등을 이용할 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

활성화된 소교세포로부터 분비된 단백질의 규명

2-DE(2-차원 겔 전기영동)에 이어 매트릭스-보조 레이저 탈착(matrix- assisted laser desorption) 및 이온화-경과시간(MALDI-TOF) 분석을 이용하여 BV-2 마우스 소교세포 배양의 조건화 배지 내에서 분비된 단백질을 규명하였다.

<1-1> 시료의 준비

BV-2 마우스 소교 세포주(Blasi et al., J Neuroimmunol 1990, 27, 229-237)는 5% FBS(fetal bovine serum), 2mM 글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Gaithersburg, MD)을 함유한 DMEM에서 배양하였다.

마우스 소교세포의 일차 배양물은 이전에 공지된 방법을 약간 변형하여 마일드 트립신 처리(mild trypsinization)에 의해 제조하였다(Saura, Glia 2003, 44, 183-189). 즉, 갓 태어난 ICR 쥐의 전뇌를 잘게 썬 다음 나일론 메쉬를 이용한 기계적 파열에 의해 잘게 썰고 분해하였다. 상기 세포를 폴리-L-리신이 코팅된 플라스크에 접종하였다. 10~14일간 시험관 내(in vitro)에서 배양한 후, 마일드 트립신처리에 의해 소교세포를 아교세포 혼합 배양물로부터 분리하였다. 아교세포 혼합 배양물을 1mM CaCl₂를 함유한 PBS로 1:4의 비율로 희석된 트립신 용액(HBSS에 용해된 0.25% 트립신, 1 mM EDTA)에서 30~60분간 배양하였다. 상기 배양에 의해 성상세포(astrocyte)는 상층으로 분리되고 소교세포는 배양 플라스크의 바닥에 부착되게 된다. 따라서 성상세포 층을 흡입하여 제거하고 남아있는 소교세포를 실험에 사용하였다. 소교세포 배양물의 순도는 이소렉틴 B4 염색으로 측정한 결과 95% 이상이었다.

소교세포-조건화 배지 또는 세포 추출물은 이전에 공지된 방법을 약간 변형하여 제조하였다(Lafon-Cazal et al., J Biol Chem 2003, 278, 24438-24448). 즉, 100-mm 배양 접시에서 배양된 소교세포를 무혈청 배양 배지로 5회 세척하여 모든 혈청 단백질을 제거하였다. 그 다음 세포를 최소 부피의 무혈청 배지로 채우고 N-모노메틸 L-아르기닌(NMMA; 0.5mM)의 존재 하에서 LPS (100ng/ml) 단독 또는 LPS와 IFNγ(재조합 마우스 interferon-γ, R&D Systems, Minneapolis, MN)(50units/ml)로 37℃에서 4 내지 8시간 동안 처리하였다. 조건화 배지를 회수하고 연속하여 2,000×g(5분) 및 15,600×g(10분)로 원심분리하여 부착되지 않은 세포 및 파편을 제거하였다. 그 다음 시료를 트리클로로아세트산 (TCA) 및 아세톤 혼합물(아세톤에 용해되어 있는 10% TCA 및 10mM DTT)로 -20℃에서 하룻밤 동안 침전시켰다. 조건화 배지를 제거한 후, 잔류 세포들을 PBS 내에서 긁어내어 2,000×g (10 분)에서 원심분리하였다. 그런 다음 세포를 프로테아제 억제제 혼합물(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 함유한 차가운 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.02% 소디움 아자이드, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% 소디움 데옥시콜레이트)에 재현탁하였다. 세포 용해 후, 시료를 13,400×g(10분)에서 원심분리하고 상층액을 분석에 사용하였다. 조건화 배지 및 세포 추출물 내 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 분석 킷트를 사용하여 측정하였다.

<1-2> 2 차원 겔 전기영동 (2-DE) 및 단백질 동정

실시예 <1-1>에서 제조한 BV-2 세포 용해물 또는 무혈청 조건 하에서 세포 배양의 조건화 배지를 2-DE 및 MALDI-TOF로 분석하여 세포 용해물 및 배양 배지의 프로테옴을 비교하였다.

이전에 공지된 방법을 약간 수정하여 20℃에서 IPGphor/IsoDalt 시스템(Amersham Biosciences)을 이용하여 IEF(Isoelectirc focusing)를 수행하였다(West, K. A et al., Exp Eye Res 2001, 73, 479-491). IPG 겔 스트립(Amersham Biosciences)을 100~500μg 단백질을 함유한 팽윤 용액(7M 우레아, 2M 티오우레아, 2% CHAPS, 100mM DTT, 0.5% IPG 버퍼 및 브로모페놀 블루)에서 12시간 동안 20℃로 재수화시켰다. IEF는 200V에서 1시간, 500V에서 1시간, 1000V에서 1시간 1000V에서 1시간, 8000V에서 30분 및 45000Vhr로 수행하였다. 그 다음, 상기 IPG 스트립을 50mM 트리스-HCl(pH 8.8), 6M 우레아, 30% 글리세롤, 2% SDS, 10mg/ml DTT 및 브로모페놀 블루에서 15분간, 그 다음 50mM 트리스-HCl(pH 8.8, 6M 우레아, 30% 글리세롤, 2% SDS, 2% 요오드아세트아미드 및 브로모페놀 블루에서 15분간 평형화하였다. 2차원 분석을 위하여, 수직 겔(12% SDS PAGE) 1.5 mm를 준비하고 평형화된 IPG 겔 스트립을 0.5% 아가로스 용액으로 충진된 겔의 상부에 놓았다. 겔 전기영동을 16℃, 5mA/cm에서 1시간 동안 그리고 10mA/cm에서 브로모페놀 블루가 겔의 바닥에 도달할 때까지 수행하였다. 겔을 50% 메탄올 및 12% 아세트산으로 1.5 시간동안 고정하였다. 이전에 공지된 방법에 따라 은-염색에 의해 단백질을 검출하였다. 스캔된 겔 이미지를 PDQuest 소프트웨어(Bio-Rad, Hercules, CA)용 표준 프로토콜을 사용하여 분석하였다. 단백질 동정은 Voyager-DE™STR 바이오스펙트로미트 리 워크스테이션(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization- Time of)에 의해 수행하였다.

BV-2 세포 용해액의 2-DE 분석 결과, 다수의 스팟이 MALDI-TOF 분광계에 의해 확인되었다(도 1a). 이로 부터 실시예 <1-2>에서 준비한 시료가 완전함을 확인할 수 있었다. 한편, 세포 용해물 및 조건화 배지 사이에 스팟 패턴이 유사하지 않은 것으로 나타났다(도 1a 및 도 1b). 이는 조건화 배지가 괴사성 세포로부터 분리된 단백질에 의해 유의적으로 오염되지 않음을 나타낸다.

세포 용해액과 조건화 배지 간 스팟 패턴이 유사하지 않으므로, LPS 처리하지 않은 BV-2 세포 및 LPS 처리 세포로부터 수득된 조건화 배지들의 스팟 패턴을 비교하였다. LPS는 소교세포의 염증 활성화를 유도하는 물질로 잘 알려져 있다. 그러나 2 종의 시료 간 스팟 패턴 또는 강도는 현저한 차이를 나타내지 않았으며 미세한 차이만을 나타냈다(도 1b). 또한, 분석된 단백질이 소량이기 때문에 미세한 차이를 보이는 몇몇 스팟을 동정하지는 못하였다. 이와 같은 제한으로 인하여, 본 발명자들은 보다 감도 높은 방법으로서 LC-MS/MS 분석을 수행하였다.

<1-3> 1차원 전기영동 (1-DE) 및 쿠마시 염색

LC-MS/MS 분석을 위해 먼저 1-DE를 수행함으로써 단백질들을 분리하였다. 상기 실시예 <1-2>의 조건화 배지를 환원 SDS 시료 버퍼 (63mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% 글리세롤, 0.005% 브로모페놀 블루 및 1:20 (v/v) β-메르캅토에탄올) 에서 5분간 끓인 다음 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동에 의해 분리하였다. 전기영동 후 단백질들을 쿠마시 브릴란트 블루 G-250 염색 용액에 의해 가시화하였다. 그 다음 전체 겔 레인을 동일한 크기로 1~15개의 조각으로 절단하였다.

조건화 배지로부터 수득한 단백질을 1-DE로 분석한 결과, 주요 혈청 단백질인 소 혈청 알부민(BSA)이 검출되지 않았다(도 2의 A). 이로부터 배양된 세포들은 조건화 배지의 제조 과정에서 모든 FBS(fetal bovine serum) 성분이 제거되도록 충분히 세척된 것을 확인할 수 있었다.

<1-4> 세포 생존율 분석

상기 실시예 <1-1>의 LPS/IFNγ 처리한 소교세포 및 미처리 세포의 시간의 경과에 따른 생존율을 MTT 분석법으로 측정하였다. MTT 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 세포(5×10⁴ cells in 200 ㎕/well)를 96-웰 플레이트에 접종하고 LPS 및/또는 IFNγ로 처리하였다. 처리 후, 배지를 제거하고 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT; 0.5 mg/ml)를 첨가한 다음 CO₂ 배양기에서 37℃로 2시간동안 배양하였다. 불용성 결정을 DMSO에 완전히 용해시킨 다음 마이크로플레이트 리더(Antos Labtec Instruments GmbH, Salzburg, Austria)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 독립적으로 3회 반복실시하고 실험 결과를 평균±표준편차로 나타내었다. 다른 그룹간의 통계적 비교는 GraphPad Prism 프로그램(GraphPad Software, Inc.)을 이용한 던칸 다중 비교 시험과 함께 스튜던트 T 테스트 또는 원-웨이 아노바 테스트를 수행하였다. p값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의적인 차이가 있는 것으로 간주하였다.

실험 결과, LPS/IFNγ를 12시간 처리한 경우 세포 생존율이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다(도 2의 B).

<1-5> 인-겔 트립신 소화

상기 실시예 <1-3>에서 절단한 겔 조각을 0.1M 암모늄 바이카르보네이트 및 0.1M 암모늄 바이카르보네이트에 용해되어 있는 50%(v/v) 아세토니트릴를 이용하여 잔여 SDS 및 쿠마시 블루 염료가 완전히 제거될 때 까지 세척하였다. 그 다음 탈염된 겔 조각을 아세토니트릴 내에서 탈수시켜 수축시키고 진공 원심분리기 내에서 건조시켰다. 수축된 겔 조각 내 단백질을 25mM 암모늄 바이카르보네이트(pH 8.0) 내 에서 10:1(wt/wt)의 기질 대 효소 비율로 하룻밤 동안 트립신으로 소화시켰다. 상기 효소 반응은 물에 용해되어 있는 0.1% 포름산을 첨가하여 종결시켰다. 겔 조각 유래 펩타이드를 10분간 소니케이션(sonication)하여 추출하고 펩타이드를 함유한 상등액을 새로운 튜브로 옮겼다.

<1-6> 액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량 분광기(μLC-ESI-MS/MS) 분석

조건화 배지 내 단백질을 1-DE 분리 후 LC-MS/MS로 분석하였다. 역상 액체 크로마토그래피(RP-LC)가 장착된 2D-LC-MS/MS 시스템이 프로테옴 분석을 위해 사용되었다. 상기 시스템은 서베이어 MS 펌프(Thermo Electron, San Jose, CA), 스파크 자동 샘플러(EMMEN, The Netherlands) 및 나노 스프레이 이온화(NSI) 소스가 구비된 피니간 LTQ 리니어 이온 트랩 질량 분석기(Thermo Electron, San Jose, CA)로 이루어져 있다. 0.1% 포름산 12㎕에 용해되어 있는 트립신 소화된 펩타이드를 LC-MS/MS 분석을 위해 주입하였다. 소화된 시료를 우선 펩타이드 농도 및 탈염을 위해 펩타이드 CapTrap 카트리지에 주입하고, 그 소수성에 따라 펩타이드 분리를 위하여 5㎛, 300Å 기공 사이즈 C18 실리카겔로 충진된 역상(RP) 컬럼에 적용하였다. 전기 분사를 위해 상기 RP 컬럼을 이온 트랜스퍼 튜브 바로 정면에 설치하였다. 이동상으로 이용된 용액은 각각 A(H₂O) 및 B(아세토니트릴, ACN)였고, 이들은 모두 0.1%(v/v) 포름산을 함유하였다. 유속은 200nl/분으로 유지하였다. 용매 구배는 5% B에서 시작하여 43분 65% B 까지 선형 구배에 도달한 다음 7분 내에 80% B까지 상승시킨 후 그 다음 10분 내에 100% A가 되도록 하였다. 질량 분광기는 각각의 전체 MS 스캔에 이어 5개의 MS/MS 스캔이 뒤 따르며, 상기 5개의 가장 많은 펩타이드 분자 이온이 표준화된 충돌 에너지 35%를 이용한 충돌-유도 분해(CID)에 대하여 이전의 스캔으로부터 동적으로 선택되는 데이터-의존 모드(m/z 300~1800)로 작동되었다. 가열된 모세관의 온도 및 전기 분무 전압은 각각 195℃ 및 2.0kV였다. 상대적 존재비(Relative abundance)는 LPS/IFNγ 미처리 세포 및 처리 세포 내에 일치되는 펩타이드의 수를 기초로 하였다.

<1-7> 바이오인포메틱스

모든 MS/MS 데이터를 바이오워크스 소프트웨어(version 3.2)에 편입되어 있는 SEQUEST 알고리즘(Thermo Electron, San Jose, CA)을 이용하여 IPI 마우스 단백질 데이터베이스에 대비하여 검색하였다. 상기 데이터베이스 검색은 시스테인 잔기(57 Da) 상의 카르복시아미도메틸레이션의 다양한 변형과 메티오닌 잔기(16 Da)의 산화, 2 Da에 대한 펩타이드 질량 허용한계 및 1 Da에 대한 단편 질량 허용한계를 허용한다. 상기 데이터베이스 검색은 트립신 절단에 의해 생성된 펩타이드로만 제한된다. SEQUEST 결과는 전하 상태에 대한 Xcorr에 의해 필터링되었다. Xcorr 값은 단일 전하 이온에 대해서는 1.9, 이중 전하 이온에 대해서는 2.2 삼중 전하 이온에 대해서는 3.75로 사용되었다. 델타 Cn≥0.1, Rsp ≤ 4 및 확률 점수 ≥ 1.0E-3으로 셋팅하였다. 단백질 동정은 펩타이드 동정을 기초로 하여 수행되었다. 2개 이상의 펩타이드 동정을 가지는 단백질을 양성 동정으로 간주하였다. 단백질 동정 후, 인-하우스 분석 프로그램(in-house analytic program)인 ProtAn을 사용하여 각 데이터 세트에 대한 감산 프로테옴 분석을 수행하였다. 단백질의 세포 내 위치는 ExPASy 프로테오믹스 서버(http://www.expasy.org) 또는 바이오인포메이션 하베스터(http://harvester. embl.de)를 기초로 하였다. 단백질의 동정 결과는 표 1에 나타낸 바와 같다.

a: SWISS-PROT, TrEMBL 또는 IPI 승인 번호

b: 무혈청 조건 하에서 NMMA(0.5mM) 존재 하에 4, 12 또는 18시간 동안 LPS(100ng/ml) 및 IFNγ(50uints/ml)로 처리한 BV-2 세포

c: LPS/IFNγ 미처리 세포에서 일치되는 펩타이드 수(U)에 대한 LPS/IFNγ 처리 세포에서 일치되는 펩타이드 수(T)의 비율; T/U

d: www.expasy.org 및 http://harvester.embl.de의 웹 사이트를 기초로 한 세포 내 위치

e: 검출되지 않음

f: 적용되지 않음

<실시예 2>

LC-MS/MS 결과의 검증

소교세포의 고효율 세크로톰 분석에 의해 신경염증 및 다른 세포 반응과 관련된 다수의 단백질이 동정되었다. 한편, 이러한 단백질들은 잠재적인 바이오마커 또는 약제 타겟으로 추가 연구가 수행되기 전에 검증을 필요로 한다. LC-MS/MS에 의해 수득된 결과를 기초로 하여 활성화된 소교세포에서 상향조절되는 몇몇의 단백질을 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석 또는 효소활성분석에 의해 검증하였다. 표 1에 나타낸 단백질을 모두 검증하는 것은 불가능하므로, 신경 염증과 잠재적인 관련성에 따라 하나의 단백질 서브세트를 분석을 위해 선택하였다.

<2-1> 웨스턴 블롯 분석

소교세포 조건화 배지 내 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 분석 키트를 이용하여 결정하였다. 각 시료별로 동량의 단백질을 12% SDS-PAGE에 의해 분리하고, 하이본드 ECL 니트로셀룰로오스 멤브레인(Amersham Biosciences)으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 5% 스킴 밀크로 차단시키고, 일차 항체들[염소 항-카텝신 D 다클론 항체 (Santa Cruz Biotech; Santa Cruz, CA), 양 항-햅토글로빈 다클론 항체 (Abcam; Cambridge, UK)] 및 HRP-컨쥬게이트된 이차 항체 (항-염소, 또는 -양 IgG; Amersham Biosciences)와 함께 순차적으로 배양한 다음 LAS를 사용하여 ECL 검출(Amersham Biosciences)을 수행하였다. α-튜블린에 대한 단클론 항체(클론 B-5-1-2; Sigma)를 카텝신 D 중화를 위한 대조군으로 사용하였다.

실험 결과, 카텝신 D 전구체 및 햅토글로빈 전구체의 수준은 LPS/IFNγ 비자극 세포에 비해 LPS/IFNγ 자극된 BV-2 소교세포 또는 일차 소교세포 배양물의 조건화 배지 내에서 증가하는 것으로 나타났다(도 3의 A 및 B).

<2-2> 아미노펩티다아제 B 활성 분석

조건화 배지의 아미노펩티다아제 B 효소 활성은 이전에 공지된 방법에 따라 AMC-결합된 아르기닌을 이용하여 분석하였다(Diaz-Perales J Biol Chem 2005, 280, 14310-14317). 분석은 50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 및 150mM NaCl을 함유한 버퍼 내에서 기질 농도를 5μM로 하고 37℃에서 수행하였다. 상기 혼합물을 30분간 인큐베이션하고 반응 내의 형광발광을 460nm에서 측정하였다. 여기 파장(excitation wavelength)은 360nm이었다. 형광발광 신호를 알고 있는 AMC 농도를 이용하여 계산하였다. 실험은 독립적으로 3회 반복실시하고 실험 결과를 평균±표준편차로 나타내었다. 다른 그룹간의 통계적 비교는 GraphPad Prism 프로그램(GraphPad Software, Inc.)을 이용한 던칸 다중 비교 시험과 함께 스튜던트 T 테스트 또는 원-웨이 아노바 테스트를 수행하였다. p값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의적인 차이가 있는 것으로 간주하였다.

실험 결과, LPS/IFNγ로 자극된 BV-2 세포의 조건화 배지 및 일차 소교세포 배양물 내에서 아미노펩티다아제 B 활성이 증가됨이 관찰되었다(도 3의 C). 이러한 결과는 아미노펩티다아제 B의 분비가 소교세포의 염증 활성 후 증가되어 소교세포-조절 신경 염증에 있어서 중요한 역할을 수행할 수 있음을 의미한다.

<실시예 3>

소교세포 신경독성의 매개자로서 카텝신 D의 역할 규명

카텝신 D는 활성화된 소교세포의 조건화 배지 내에서 상대적으로 증가된 단백질 중 하나이다. 카텝신 D는 분비되어 세포 성장 및 생존/아폽토시스를 조절한다는 사실이 공지되어 있으므로, 소교세포 및 뉴런의 공동배양을 이용하여 카텝신 D가 소교세포의 신경독성을 매개하는지를 조사하였다. 소교세포/뉴런 공동배양의 모델로서 BV-2 소교세포 및 B35 신경모세포종(neuroblastoma)의 공동배양 시스템을 사용하였다. EGFP를 안정적으로 발현하는 B35 세포의 서브클론(B35-EGFP)을 공동배양 내 소교세포 유래 신경모세포종의 단순 분화를 위해 사용하였다. 본 발명자들은 활성화된 소교세포로부터 분비된 카텝신 D가 뉴런에 대한 세포독성을 발휘하는 것으로 가정하였다. 상기 가정은 공동배양 시스템 내 중화 항체를 이용한 카텝신 D의 고갈 실험 또는 공동배양 전에 소교세포 내 카텝신 D 유전자 발현의 녹다운을 실험을 통해 확인하였다.

<3-1> 세포 생존율 평가

BV-2 소교세포에 LPS(100ng/ml) 및 IFNγ(50units/ml) 단독 또는 함께 처리하여 자극시키고 B35-EGFP 세포와 공동배양 48시간 후에 EGFP-양성 세포 수의 감소에 의해 공동배양된 B35-EGFP 세포 생존율의 유의적인 감소를 유도하는지 확인하였다. B35 랫트 신경모세포종(경상대학교 의과대학 박재용 교수로부터 제공받음)은 10% FBS, 2mM 글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM에서 배양하였 다. B35 신경모세포종을 pEGFPN1 플라스미드(Clontech, Mountain View, CA)로 안정적으로 형질전환시켰다. 안정적인 형질전환체를 선별하고 G418의 존재 하에서 유지시켰다. 안정적인 형질전환체(B35-EGFP) 내에서 EGFP의 발현을 형광 현미경 하에서 세포를 조사함으로써 확인하였다. 99% 이상의 세포가 EGFP 양성으로 나타났다.

B35-EGFP 세포 및 BV-2 소교세포를 2.5:1의 비율로 공동 배양한 후, B35-EGFP 세포의 생존율을 형광 현미경하에서 EFGP 양성 세포를 계수함으로써 평가하였다. 세포 생존율의 평가를 위해 임의로 5개의 현미경 필드를 선택하고 세포 수의 퍼센트를 계산하였다.

또한, B35-EGFP 세포에 LPS 및 IFNγ 단독 또는 함께 처리하고 상기 세포의 사멸에 미치는 영향을 실시예 <1-4>와 동일한 방법으로 MTT 분석으로 조사하였다.

다른 그룹간의 통계적 비교는 GraphPad Prism 프로그램(GraphPad Software, Inc.)을 이용한 던칸 다중 비교 시험과 함께 스튜던트 T 테스트 또는 원-웨이 아노바 테스트를 수행하였다. p값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의적인 차이가 있는 것으로 간주하였다.

실험 결과, LPS 및 IFNγ 단독 또는 함께 처리함으로써 BV-2 소교세포를 활성화한 것은 공동 배양된 B35-EGFP 세포의 사멸을 유도하였다(도 4a 및 b). 한편, MTT 분석 결과, LPS 또는 IFNγ 자체는 B35-EGFP 세포 사멸에 영향을 주지 않았다 (도 4c). 이로부터 B35-EFGP 세포 생존율의 감소가 LPS 또는 IFNγ-활성화된 소교세포로 인한 것이고 LPS 또는 IFNγ 자체로 인한 것이 아님을 알 수 있었다. 또한, 순수한 B35-EFGP 세포에 대해 LPS/IFNγ이 독성을 나타내지 않음을 B35-EFGP 세포를 계수함으로써 확인하였다(결과 미도시).

<3-2> 중화항체를 이용한 카텝신 D의 고갈

BV-2 소교세포에 LPS(100ng/ml) 및 IFNγ(50units/ml) 단독 또는 함께 처리하여 자극시키고 B35-EGFP 세포와 공동배양시 카텝신 D에 대한 항체인 염소 항-카텝신 D 다클론 항체((Santa Cruz Biotech; Santa Cruz, CA)(20 μg/ml)를 처리하여 48시간 동안 배양 후 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 B35-EFGP 세포의 수를 계수하였다. 다른 그룹간의 통계적 비교는 GraphPad Prism 프로그램(GraphPad Software, Inc.)을 이용한 던칸 다중 비교 시험과 함께 스튜던트 T 테스트 또는 원-웨이 아노바 테스트를 수행하였다. p값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의적인 차이가 있는 것으로 간주하였다.

실험 결과, 카텝신 D의 항체 매개 중화는 공동 배양된 B35-EGFP 세포에 대한 활성화된 소교세포의 독성 효과를 감소시켰다(도 4d)

<3-3> shRNA를 이용한 카텝신 D 유전자 발현의 녹아웃

6-웰 플레이트 내의 BV-2 세포를 리포펙타민 시약(Invitrogen)을 이용하여 마우스 카텝신 D 특이적인 shRNA 구조물 2㎍으로 형질전환시켰다. 카텝신 D cDNA의 뉴클레오타이드 660-678번에 상응하는 shRNA, 9 염기 루프 및 역반복 부위를 siExpress^TM 벡터(Mirus; Madison, WI)에 클로닝하였다. shRNA의 서열은 서열번호 1에 나타낸 바와 같다. 스크램블 RNA(scrambled RNA)를 코딩하는 벡터를 카텝신 D 특이적 shRNA의 안정적인 발현에 대한 대조군으로서 사용하였다. 형질전환 2일 후 안정적인 형질전환체를 G418(400㎍/ml)의 존재 하에서 선별하였다. 안정적인 형질전환체 내에서 카텝신 D 단백질의 하향조절을 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다. 다른 그룹간의 통계적 비교는 GraphPad Prism 프로그램(GraphPad Software, Inc.)을 이용한 던칸 다중 비교 시험과 함께 스튜던트 T 테스트 또는 원-웨이 아노바 테스트를 수행하였다. p값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의적인 차이가 있는 것으로 간주하였다.

실험 결과, shRNA를 이용한 BV-2 세포 내에서 카텝신 D 발현의 녹아웃은 소교세포의 신경독성을 유의적으로 약독화시켰다(도 4e). shRNA에 의한 카텝신 D 발현의 녹아웃은 LPS/IFNγ 미처리 또는 처리 세포의 조건화 배지의 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다(도 4f). 스크램블 shRNA 형질전환된 세포에 비교해 보면, 카텝신 D-특이적 shRNA 형질전환체는 조건화 배지 내에서 카텝신 D 전구체의 수준이 유의적으로 더 낮은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 카텝신 D가 활성화된 소교세포의 신경독성 효과에 있어서 중추적인 역할을 수행함을 보여준다. 또한, 이 러한 결과는 생체 내 CNS에서 염증 조건 하의 활성화된 소교세포로부터 카텝신 D 전구체가 분비되고, 이것이 뉴런 또는 근처의 아교세포를 사멸시키거나 손상시켜 퇴행성 신경질환을 유발함을 제시해 준다.

이상 상기에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물은 비정상적으로 활성화된 소교세포로부터 분비된 카텝신 D 단백질의 활성을 억제하거나 카텝신 D 유전자의 발현을 억제함으로써 소교세포의 신경독성작용으로 인하여 유발되는 퇴행성 신경질환을 예방 및 치료할 수 있다. 또한, 카텝신 D는 퇴행성 신경질환의 치료제를 스크리닝하기 위한 타깃으로 사용될 수 있다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel use of cathepsin D for treating neurodegenerative disease <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 1 gctggtggac aagaacatc 19

Claims (7)

1. 카텝신 D의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 카텝신 D의 활성 억제제가 항-카텝신 D 항체임을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 카텝신 D의 발현 억제제가 카텝신 D에 대한 shRNA임을 특징으로 하는 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환이 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환 및 다발성 경화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임 을 특징으로 하는 조성물.
6. (a) 시험물질을 활성화된 소교세포와 접촉시키는 단계; 및

   (b) 상기 (a) 단계의 소교세포로부터 카텝신 D의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

   (c) 상기 (a) 단계의 시험물질이 카텝신 D의 발현을 촉진 또는 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법.
7. (a) 활성화된 소교세포와 신경모세포종을 시험물질을 처리하여 공동 배양하는 단계;

   (b) 상기 (a) 단계의 신경모세포종의 생존율을 측정하는 단계;

   (c)상기 (a) 단계의 시험물질이 신경모세포종의 생존율을 감소 또는 증가시키는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법.

Images