WO2014084430A1 - 병용 항암요법 - Google Patents

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kadipsin
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하영술
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    • C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12Y304/23005—Cathepsin D (3.4.23.5)

Definitions

  • the present invention relates to chemotherapy, and more particularly, to a combination chemotherapy.
  • cancer is one of the leading causes of mortality in Korea as of 2010. The frequency of cancer is increasing due to environmental pollution, excessive stress, and westernized eating.
  • anticancer drugs there are many anticancer drugs on the market to treat such cancers, and recently, customized anticancer agents have been introduced to match the characteristics of cancer.
  • the biggest problem of such anticancer drugs is that cancer cells become resistant to anticancer drugs by the action of drug-resistant genes such as Mdr-1, thereby reducing the therapeutic effect of the anticancer drugs.
  • the present invention is to solve various problems including the above problems, to provide a combination therapy for chemotherapy.
  • these technical problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereto.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising a cathepsin D specific inhibitor and a free radical forming anticancer compound as an active ingredient.
  • the kadepsin D-specific inhibitor may be an expression inhibitor or an activity inhibitor of kadepsin D, and the expression inhibitor of kadepsin D may be an antisense nucleotide or siRNA that specifically binds to the mRNA of kadepsin D. It may be, shRNA or miRNA, the inhibitory activity of the Kadipsin D aptamers (peptide mimetics), antagonizing antibody (antagonizing antibody) or small compounds (small) compound).
  • the free radical forming anticancer compound may be doxorubicin, adriamycin, mitomycin C or diaziridinylbenzoquinone.
  • the cancer may be a cancer that is overexpressed with kadipsin D, and the cancer may include breast cancer, prostate cancer, glioblastoma, and colorectal cancer. Can be.
  • a method for treating cancer in a subject comprising administering to the subject a cancer an effective amount of a cathepsin D specific inhibitor and a free radical forming anticancer compound .
  • the Kadsin D-specific inhibitor may be an expression inhibitor or activity inhibitor of Kadipsin D, wherein the expression inhibitory of Kadipsin D specifically binds to antisense nucleotides, siRNA, It may be shRNA or miRNA, the deactivator of the kadipsin D is an aptamer, peptide mimetics, antagonizing antibody or small compound (inhibitor) that inhibits the action of kadipsin D May be).
  • the free radical-forming anticancer compound may be doxorubicin, adriamycin, mitomycin C or diaziridinylbenzoquinone.
  • the cancer may be a cancer that is overexpressed Kadipsin D, such cancer may include breast cancer, prostate cancer, glioblastoma and colorectal cancer have.
  • a combination of an anticancer agent such as doxorubicin that generates free radicals by targeting kadsin D overexpressed cancer and an inhibitor capable of specifically inhibiting the kadepsin D may be used.
  • an anticancer agent such as doxorubicin that generates free radicals by targeting kadsin D overexpressed cancer
  • an inhibitor capable of specifically inhibiting the kadepsin D may be used.
  • FIG. 1 shows 2-D electrophoresis results (A) for M059J and M095K cell lines, semi-quantitative RT-PCR (B) and Western blot analysis (C) for the two cell lines.
  • Figure 2 is a graph showing the results of analysis of the apoptosis after treatment with doxorubicin or etoposide for M059J and M059K cell line (A) and when the cells are treated with the combination of pepstatin A, doxorubicin or pepstatin A + doxorubicin ( B) and the cell viability at the time of pepstatin A, H 2 O 2 or pepstatin A + H 2 O 2 co-treatment.
  • Figure 3 is a Western blot analysis of the expression of CatD transfected cell line prepared by transfecting HeLa cells with the empty vector, CatD wt and CatD D295N (A), H 2 O 2 for the transfected cell line
  • a series of graphs showing the degree of apoptosis according to treatment (B, the top is a graph showing the apoptosis by flow cytometry, the bottom is a graph quantifying the percentage of cells in the apoptosis process from the above results)
  • CatD wt Western blot analysis C showing the level of CatD protein expression after transfection with shRNA (shRNA-CatD) targeting catD or the control group, transfected with shD and H 2 O 2 of the transfected cells
  • Flow cytometry results (D) comparing the degree of apoptosis with treatment.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising a cathepsin D specific inhibitor and a free radical forming anticancer compound as an active ingredient.
  • the kadepsin D-specific inhibitor may be an expression inhibitor or an activity inhibitor of kadepsin D, and the expression inhibitor of kadepsin D may be an antisense nucleotide or siRNA that specifically binds to the mRNA of kadepsin D. It may be, shRNA or miRNA, the inhibitory activity of the Kadipsin D aptamers (peptide mimetics), antagonizing antibody (antagonizing antibody) or small compounds (small) compound).
  • the free radical forming anticancer compound may be doxorubicin, adriamycin, mitomycin C or diaziridinylbenzoquinone.
  • the cancer may be a cancer that is overexpressed with kadipsin D, and the cancer may include breast cancer, prostate cancer, glioblastoma, and colorectal cancer. Can be.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment of the present invention can be administered orally or parenterally during clinical administration, and intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intrauterine dura It can be administered by injection, cerebrovascular irradiation, intratumoral or intrathoracic injection, and can be used in the form of general pharmaceutical formulations.
  • Each pharmaceutical composition according to one embodiment of the present invention further comprises an inert ingredient, including a pharmaceutically acceptable carrier.
  • compositions according to one embodiment of the present invention may be combined with pharmaceutical carriers according to conventional pharmaceutical preparation techniques.
  • the carrier can take a wide variety of forms depending on the preparation desired for parenteral administration, including, for example, oral or intravenous administration.
  • the tumor therapeutic agent according to an embodiment of the present invention may be administered at a dose of 0.1 mg / kg to 1 g / kg, more preferably at a dose of 0.1 mg / kg to 500 mg / kg.
  • the dosage may be appropriately adjusted according to the age, sex and condition of the patient.
  • the inventors of the present invention have found that apoptosis caused by doxorubicin, an anticancer agent, in the case of cancer cells overexpressing cardioxin D in M059J glioblastoma cells lacking a catalytic subunit of DNA-PK, and cardiac D overexpressing
  • doxorubicin an anticancer agent
  • the degree of apoptosis was significantly increased when compared with M059K cells that did not overexpress kadipsin D.
  • the present invention has been completed.
  • a method for treating cancer in a subject comprising administering to the subject a cancer an effective amount of a cathepsin D specific inhibitor and a free radical forming anticancer compound .
  • the Kadsin D-specific inhibitor may be an expression inhibitor or activity inhibitor of Kadipsin D, wherein the expression inhibitory of Kadipsin D specifically binds to antisense nucleotides, siRNA, It may be shRNA or miRNA, the deactivator of the kadipsin D is an aptamer, peptide mimetics, antagonizing antibody or small compound (inhibitor) that inhibits the action of kadipsin D May be).
  • the free radical-forming anticancer compound may be doxorubicin, adriamycin, mitomycin C or diaziridinylbenzoquinone.
  • an "antisense nucleotide” binds (hybridizes) the complementary sequence of DNA, immature-mRNA, or mature mRNA, as defined by the Watson-click base pair, to disrupt the flow of genetic information as a protein in DNA. It is.
  • the nature of antisense nucleotides specific to the target sequence makes them exceptionally multifunctional. Since antisense nucleotides are long chains of monomeric units they can be easily synthesized for the target RNA sequence. Many recent studies have demonstrated the utility of antisense nucleotides as a biochemical means for studying target proteins (Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst. , 81: 1539-1544, 1999).
  • antisense nucleotides can be considered as a new type of inhibitor because of recent advances in nucleotide synthesis and in the field of nucleotide synthesis that exhibit improved cell adsorption, target binding affinity and nuclease resistance.
  • Peptide Mimetics as used herein is to inhibit the activity of a target protein as a peptide or nonpeptide that inhibits the binding domain of the target protein.
  • miRNA is a post expression regulator found in eukaryotic cells and is known to cause degradation and gene silencing of target mRNA by binding to complementary sequences on the target mRNA.
  • small interfering RNA refers to a nucleic acid sequence in which a sense RNA and an antisense RNA form a double-stranded RNA molecule, wherein the sense RNA is identical to the target sequence of the contiguous nucleotides of some of the mRNAs encoding the target protein. It is preferably an siRNA molecule comprising a.
  • the siRNA molecule is preferably composed of a sense sequence consisting of 10 to 30 bases selected from a nucleotide sequence of a gene encoding a target protein and an antisense sequence complementarily binding to the sense sequence, but is not limited thereto.
  • any double-stranded RNA molecule having a sense sequence capable of complementarily binding to a nucleotide sequence of a gene encoding a target protein can be used.
  • the antisense sequence has a sequence complementary to the sense sequence.
  • siRNA short hairpin RNA
  • siRNA short hairpin RNA
  • the term "antagonizing antibody” can be used, either prepared by injection of a target protein or purchased commercially.
  • the antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, fragments capable of binding epitopes, and the like.
  • Polyclonal antibodies can be produced by conventional methods of injecting the target protein into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum containing the antibody.
  • Such polyclonal antibodies can be purified by any method known in the art and can be made from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, cattle, dogs and the like.
  • Monoclonal antibodies can be prepared using any technique that provides for the production of antibody molecules through the culture of continuous cell lines.
  • Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B-cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (Kohler G et al., Nature 256: 495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81: 31-42, 1985; Cote RJ et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 80: 2026-2030, 1983; and Cole SP et al ., Mol. Cell Biol ., 62: 109-120, 1984).
  • antibody fragments containing specific binding sites for the target protein can be prepared.
  • F (ab ') 2 fragments can be prepared by digesting antibody molecules with pepsin, and Fab fragments can be prepared by reducing the disulfide bridges of F (ab') 2 fragments.
  • the Fab expression library can be made small to quickly and simply identify monoclonal Fab fragments with the desired specificity (Huse WD et al ., Science , 254: 1275-1281, 1989).
  • the antibody can be bound to a solid substrate to facilitate subsequent steps such as washing or separation of the complex.
  • Solid substrates include synthetic resins, nitrocellulose, glass substrates, metal substrates, glass fibers, microspheres and microbeads.
  • the synthetic resins include polyester, polyvinyl chloride, polystyrene, polypropylene, PVDF and nylon.
  • Aptamer is a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) or peptide that has its own stable tertiary structure and which is capable of binding to target molecules with high affinity and specificity. to be.
  • Aptamers have been developed since the first development of an aptamer excavation technology called Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (Ellington, AD and Szostak, JW., Nature , 346: 818-822, 1990). Many aptamers that have been able to bind to various target molecules have been discovered. Aptamers are often compared to single antibodies because of their inherent high affinity (usually pM levels) and their ability to bind to target molecules with high specificity, particularly as a "chemical antibody” and thus a high potential as an alternative antibody.
  • a “small compound” is a molecule that is small enough to cross cell membranes and has the activity of inhibiting the function of the target molecule. Such small compounds may be screened by high throughput screening from compound libraries, and computer-based structure-activity relationship analysis using the three-dimensional structure of the active site of the target molecule. structure and activity relationship analysis) can be devised (de novo) (Wendoloski et al ., Pharmacol. Ther ., 60 (2): 169-183, 1993).
  • pharmaceutically acceptable carrier is a term that refers to a composition, specifically an ingredient other than the active substance of the pharmaceutical composition.
  • pharmaceutically acceptable carriers include binders, disintegrants, diluents, fillers, glidants, solubilizers or emulsifiers and salts.
  • M059J catalytic subunit of DNA-PK
  • M059K DNA-PK is normally expressed
  • 2-D sample buffer 8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris
  • a protease inhibitor Calbiochem, USA
  • Total protein 50 ⁇ g was previously reported (Baek et al ., J. Proteomics 73: 721-732, 2010), isoelectric point electrophoresis (pH 3-10) and subsequent gradient SDS-polyacrylamide gels ( 7.5-17.5%) was developed by electrophoresis. The gel was then stained with silver nitrate and analyzed by image analysis software (PDQuest, Bio-Rad, USA), and isolated protein points were identified by mass spectrometry as previously reported (Baek et al ., J. Proteomics). 73: 721-732, 2010).
  • DNA-PK-deficient M059J cells were found to be differentially expressed in comparison with DNA-PK expressing M059K cells, which are many proteins.
  • the protein point identified as Kadipsin D as a result of mass spectrometry was significantly down-regulated in cells with normal DNA-PK activity (FIG. 1A).
  • the PCR reaction was carried out using the reverse transcription reaction with the forward primer (SEQ ID NO: 1: 5'-GTG CCC TGC CAG TCA GCG TCG TCA G-3 ') and reverse primer (SEQ ID NO: 2: 5'-CCT GCT CAG GTA) GAA GGA GAA GAT G-3 '), forward primer (SEQ ID NO: 3: 5'-AAT GCA TCC TGC ACC ACC AA-3') and reverse for internal control glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) After dilution with a reaction mixture comprising a primer (SEQ ID NO 4: 5'-GTA GCC ATA TTC ATT GTC AT-3 '), heat denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, and 1 minute at 72 ° C.
  • a primer SEQ ID NO 4: 5'-GTA GCC ATA TTC ATT GTC AT-3 '
  • the mRNA level of kadipsin D of M059J cells was about 5 times higher than that of M059K cells.
  • the inventors performed Western blot analysis on the lysate of both cells to determine if cardioxin D expression of M059J cells is increased not only at the mRNA level but also at the protein level.
  • NP-40 lysis buffer (20 mM Tris, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v / v) Nonidet P-40, 5 M ⁇ AEBSF, 1.5 nM Aprotinin, 10 nM E-64, and 10 nM Leupeptin) for 30 minutes, followed by sonication and centrifugation at 12,000 xg for 10 minutes at 4 °C to remove the water-insoluble residue. 30 ⁇ g of total protein was electrophoresed on SDS-polyacrylamide gels and then transferred to the nitrocellulose membrane in a semi-dry manner.
  • the protein transcribed membrane was washed after reacting a goat polyclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) specific for kadepsin diluted 1: 200 with a blocking solution (2.5% nonfat dry milk dissolved in TBST).
  • the washed membrane was reacted with an HRP-binding anti-goat IgG rabbit secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) and observed using a chemiluminescence detection system using an ECL reagent (Pierce, USA) (FIG. 1).
  • HRP-binding anti-goat IgG rabbit secondary antibody Santa Cruz Biotechnology, USA
  • DNA-PK is required not only for DNA double strand repair but also for apoptosis by DNA damage by regulating the expression of apoptosis-associated proteins such as Bcl-2 and BAK / BAX (Bernstein et al ., Mutat. Res . 511: 145-178, 2002; Chen et al ., J. Cell. Physiol . 203: 127-132, 2005).
  • apoptosis-associated proteins such as Bcl-2 and BAK / BAX
  • the degree of apoptosis was performed as follows:
  • FIG. 2A apoptosis of two cancer cells was induced upon treatment with DNA damage inducers such as doxorubicin and etoposide.
  • DNA damage inducers such as doxorubicin and etoposide.
  • Annexin V-positive cells (cells induced apoptosis) of M059J cells were relatively higher than M059K cells when treated with DNA damage inducing agents (FIG. 2A).
  • the inventors further investigated by analyzing cell viability how pepstatin A, a potent inhibitor of cardiocin D, affects DNA damage-induced cell death.
  • MTT 3- (4,5-dimethyldiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliium bromide
  • M059J cells overexpressing Kadipsin D were sensitive to DNA damage when pretreated with pepstatin A.
  • M059K cells on the other hand, exhibited a similar degree of apoptosis regardless of the presence of doxorubicin. This suggests that DNA damage-induced apoptosis in M059J cells is the result of high expression of kadipsin D.
  • Doxorubicin a cell proliferation inhibitor, disrupts DNA function, induces DNA damage, and is widely used as a therapeutic for various types of cancers (Singal and Iliskovic, N. Engl. J. Med ., 339: 900-905, 1998 ).
  • doxorubicin produces reactive oxygen species (ROS) and doxorubicin-induced ROS are known to induce cytotoxicity against cancer cells (Ravid et al ., Cancer Res . 59: 862-867, 1999). .
  • ROS reactive oxygen species
  • M059J cells were more sensitive to H 2 O 2 in the presence of pepstatin A than M059K cells.
  • HeLa-CatD wt HeLa-CatD wt
  • HeLa-CatD D295N HeLa-CatD D295N
  • Wild type cardidin D and the enzymatically inactive mutant cardidin D (D295N) expression vector were provided by Dr. Stefanie Dimmeler of Frankfurt University. These CatD expression vectors or empty vectors pcDNA3.1 were transfected into HeLa cells using an electroporator (Gene Pulser Xcell electroporation system, Bio-Rad, USA). Stably transfected cells were selected by culturing the cells in DMEM medium containing G418 1 mg / ml for 2 weeks. Western blot analysis was performed on the transfected cells. As a result, wild-type CatD and mutant CatD (D295N) were normally expressed (FIG. 3A).
  • Example 2-1 For the transfected cells, as in Example 2-1, the degree of apoptosis was analyzed by propidium iodide insertion (FIG. 3).
  • the inventors performed a knockdown experiment on CatD using RNAi (RNA interfering) targeting CatD to confirm that the phenomenon is reversed by inhibition of expression of CatD.
  • the shRNA target DNA sequence SEQ ID NO: 5: 5′-AGC TGG TGG ACC AGA ACA TC-3 ′
  • the resulting siRNA-CatD or shRNA-control was transfected into HeLa cells stably expressing the wild-type CatD prepared above by electroporation.
  • Western blot analysis using an antibody that specifically binds CatD to the cells transfected with shRNA-CatD showed that knockdown of CatD was normally performed (FIG. 3C).
  • an anticancer agent eg, doxorubicin or mitomycin C, etc.
  • an anticancer agent eg, doxorubicin or mitomycin C, etc.
  • an inhibitor specific for kadipsin D eg, pepstatin.
  • SEQ ID NOs: 1 and 2 are nucleic acid sequences of primer pairs for the detection of kadipsin D.
  • SEQ ID Nos: 3 and 4 are nucleic acid sequences of primer pairs for detection of GAPDH, which is an internal control.
  • SEQ ID NO: 5 is the target DNA sequence for Kadipsin D.

Abstract

본 발명은 보다 효율적인 암치료를 위해, 카뎁신 D(cathepsin D) 특이적 저해제 및 유리 라디컬 형성 항암 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

병용 항암요법
본 발명은 항암요법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 병용 항암요법에 관한 것에 관한 것이다.
여러 가지 원인에 의해 세포의 조절 기능에 문제가 생기면 정상적으로는 사멸해야 할 비정상 세포들이 과다 증식하게 되며, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴(덩어리)를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는데, 이러한 상태를 암 또는 악성종양이라고 정의한다. 암은 대표적인 난치병으로서 2010년 현재 한국인의 사망원인 중 1위를 기록하고 있으며, 환경오염, 과도한 스트레스, 서구화된 식생활로 인하여 그 발생빈도가 점점 더 증가하고 있는 추세이다.
이러한 암을 치료하기 위해 시장에 출시된 항암제는 매우 많으며, 최근에는 암의 특성에 맞는 맞춤형 항암제도 등장하고 있고 있다. 그러나, 이러한 항암제의 가장 큰 문제점은 암세포가 Mdr-1 등의 약제내성 유전자의 작용에 의하여 항암제에 대한 내성을 갖게 됨으로써, 항암제에 의한 치료효과가 반감된다는 점이다.
따라서, 종래의 항암제에 의해 치료가 어려운 난치성 암의 치료를 위한 항암제의 개발이 절실한 실정이다.
다제내성 종양을 치료하기 위한 다양한 접근법이 연구되고 있는데, 주로 다제내성과 관련된 표적 단백질을 탐색하고 이들의 기능을 저해하는 방법이 연구되고 있다. 이러한 방법으로는 다제내성 백혈병을 대상으로 한 p-글리코단백질 ATP-결합 카세트 수송체(p-glycoprotein ATP-binding cassette transporter, PUP)를 표적으로 하는 항암치료방법에 관한 US2010-0204263A1, US6703400B2, US6372780B2 등 많은 선행기술이 존재한다.
그러나, 상기와 같은 항암치료방법의 경우 치료효과가 제한적이라는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 항암치료를 위한 병용요법을 제공하고자 한다. 그러나 이러한 기술적 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 카뎁신 D(cathepsin D) 특이적 저해제 및 유리 라디컬 형성 항암 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 카뎁신 D 특이적 저해제는 카뎁신 D의 발현 저해제 또는 활성 저해제일 수 있고, 상기 카뎁신 D의 발현 저해제는 카뎁신 D의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 miRNA일 수 있으며, 상기 카뎁신 D의 활성저해제는 카뎁신 D의 작용을 저해하는 앱타머(aptamer), 펩티드 미메틱스(peptide mimetics), 길항 항체(antagonizing antibody) 또는 작은 화합물(small compound)일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 유리 라디컬 형성 항암 화합물은 독소루비신(doxorubicin), 아드리아마이신(adriamycin), 미토마이신 C(mitomycin C) 또는 디아지리디닐벤조퀴논(diaziridinylbenzoquinone)일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 암은 카뎁신 D가 과발현된 암일 수 있고, 이러한 암에는 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 신경교아세포종(glioblastoma) 및 대장직장암(colorectal cancer)이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 카뎁신 D(cathepsin D) 특이적 저해제 및 유리 라디컬 형성 항암 화합물의 유효양을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료방법이 제공된다.
상기 치료방법에 있어서, 카뎁신 D 특이적 저해제는 카뎁신 D의 발현 저해제 또는 활성 저해제일 수 있고, 상기 카뎁신 D의 발현 저해제는 카뎁신 D의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 miRNA일 수 있으며, 상기 카뎁신 D의 활성저해제는 카뎁신 D의 작용을 저해하는 앱타머(aptamer), 펩티드 미메틱스(peptide mimetics), 길항 항체(antagonizing antibody) 또는 작은 화합물(small compound)일 수 있다.
상기 치료방법에 있어서, 상기 유리 라디컬 형성 항암 화합물은 독소루비신(doxorubicin), 아드리아마이신(adriamycin), 미토마이신 C(mitomycin C) 또는 디아지리디닐벤조퀴논(diaziridinylbenzoquinone)일 수 있다.
상기 치료방법에 있어서, 상기 암은 카뎁신 D가 과발현된 암일 수 있고, 이러한 암에는 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 신경교아세포종(glioblastoma) 및 대장직장암(colorectal cancer)이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 카뎁신 D가 과발현된 암을 표적으로 하여, 유리 라디컬을 생성하는 독소루비신과 같은 항암제와 상기 카뎁신 D를 특이적으로 억제할 수 있는 저해제를 병용하여, 상기 암의 세포사멸 저항성을 제거함으로써, 효율적인 항암 치료가 가능하다. 다만, 이러한 효과는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 M059J 및 M095K 세포주에 대한 2-D 전기영동 결과(A), 상기 두 세포주에 대한 반정량 RT-PCR(B) 및 웨스턴 블랏 분석(C) 결과이다.
도 2는 M059J 및 M059K 세포주에 대하여 독소루비신 또는 에토포사이드 처리 후 세포사멸정도를 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프(A) 및 상기 세포에 펩스타틴 A, 독소루비신 또는 펩스타틴 A + 독소루비신 병용 처리시(B) 및 펩스타틴 A, H2O2 또는 펩스타틴 A + H2O2 병용 처리시의 세포생존도를 MTT 분석으로 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 HeLa 세포를 공벡터, CatD wt 및 CatD D295N으로 각각 형질감염시켜 제조한 형질감염 세포주의 CatD의 발현 여부를 웨스턴 블랏으로 분석한 결과(A), 상기 형질감염 세포주에 대하여 H2O2 처리 여부에 따른 세포사멸 정도를 보여주는 일련의 그래프(B, 상단은 세포사멸정도를 유세포분석으로 조사한 그래프이고, 하단은 상기 결과로부터 세포사멸 과정의 세포의 비율을 정량화한 그래프임), CatD wt으로 형질감염된 세포에 대하여 CatD를 표적화하는 shRNA(shRNA-CatD) 또는 대조군인 shRNA-luc으로 형질감염시킨 후 CatD 단백질 발현 정도를 보여주는 웨스턴 블랏 분석(C) 및 상기 shRNA로 형질감염된 세포의 H2O2 처리에 따른 세포사멸 정도를 비교한 유세포분석 결과(D)이다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 카뎁신 D(cathepsin D) 특이적 저해제 및 유리 라디컬 형성 항암 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 카뎁신 D 특이적 저해제는 카뎁신 D의 발현 저해제 또는 활성 저해제일 수 있고, 상기 카뎁신 D의 발현 저해제는 카뎁신 D의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 miRNA일 수 있으며, 상기 카뎁신 D의 활성저해제는 카뎁신 D의 작용을 저해하는 앱타머(aptamer), 펩티드 미메틱스(peptide mimetics), 길항 항체(antagonizing antibody) 또는 작은 화합물(small compound)일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 유리 라디컬 형성 항암 화합물은 독소루비신(doxorubicin), 아드리아마이신(adriamycin), 미토마이신 C(mitomycin C) 또는 디아지리디닐벤조퀴논(diaziridinylbenzoquinone)일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 암은 카뎁신 D가 과발현된 암일 수 있고, 이러한 암에는 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 신경교아세포종(glioblastoma) 및 대장직장암(colorectal cancer)이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 비경구 투여시 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 조사, 종양내(intratumoral) 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 각각의 약학적 조성물은 약제약상 허용되는 담체를 비롯한 불활성 성분을 추가로 포함한다.
실제 사용에 있어서, 본 발명의 일실시예에 따른 약학적 조성물은 통상적인 제약 조제 기술에 따른 제약 담체와 조합될 수 있다. 담체는, 예를 들어 경구 또는 정맥내 투여를 비롯한 비경구 투여에 바람직한 제조에 따라 광범위하게 다양한 형태를 지닐 수 있다.
아울러, 본 발명의 일실시예에 따른 종양 치료제는 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
종래의 연구 결과에 의하면, 카뎁신 D는 유방암에서 과발현되어 있고, 유방암의 안좋은 예후와 관련되어 있으며, 전립선암과 대장직장암에서도 과발현되어 있다고 보고된 바 있다(Choi et al., Theraostics 2(2):156-178, 2012). 그러나 그 역할에 대하여는 암의 발생과 나쁜 예후와 관련하여 상관관계가 있다는 의견가 없다는 의견이 서로 충돌하고 있는 등 논란이 있는 실정이다(Nicotra et al., Cancer Biomark., 7(1):47-64, 2010).
본 발명자들은 카뎁신 D가 DNA-PK의 촉매소단위(catalytic subunit)이 결핍된 M059J 신경교아세포종 세포에서 카뎁신 D가 과발현되어 있고, 카뎁신 D가 과별현된 암세포의 경우 항암제인 독소루비신에 의한 세포사멸이 억제되는 반면, 독소루비신과 카뎁신 D의 특이적 억제제인 펩스타틴 A(pepstatin A)를 병용처리할 경우 카뎁신 D가 과발현되지 않은 M059K 세포와 비교시 세포사멸 정도가 유의하게 증가함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 카뎁신 D(cathepsin D) 특이적 저해제 및 유리 라디컬 형성 항암 화합물의 유효양을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료방법이 제공된다.
상기 치료방법에 있어서, 카뎁신 D 특이적 저해제는 카뎁신 D의 발현 저해제 또는 활성 저해제일 수 있고, 상기 카뎁신 D의 발현 저해제는 카뎁신 D의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 miRNA일 수 있으며, 상기 카뎁신 D의 활성저해제는 카뎁신 D의 작용을 저해하는 앱타머(aptamer), 펩티드 미메틱스(peptide mimetics), 길항 항체(antagonizing antibody) 또는 작은 화합물(small compound)일 수 있다.
상기 치료방법에 있어서, 상기 유리 라디컬 형성 항암 화합물은 독소루비신(doxorubicin), 아드리아마이신(adriamycin), 미토마이신 C(mitomycin C) 또는 디아지리디닐벤조퀴논(diaziridinylbenzoquinone)일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 "안티센스 뉴클레오티드"는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "펩티드 미메틱스(Peptide Mimetics)"는 표적 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드로서 표적 단백질의 활성을 억제하는 것이다.
본 문서에서 사용되는 "miRNA(microRNA)"는 진핵생물의 세포 내에서 발견되는 전 사후 발현조절자로서 표적 mRNA 상에 상보 서열에 결합함으로써 표적 mRNA의 분해 및 유전자침묵을 유발하는 것으로 알려져 있다.
본 문서에서 사용되는 "siRNA(small interfering RNA)"는 센스 RNA와 안티센스 RNA가 이중가닥 RNA 분자를 형성하고, 이때 센스 RNA가 표적 단백질을 암호화하는 mRNA 중 일부의 연속 뉴클레오티드의 표적 서열과 동일한 핵산 서열을 포함하는 siRNA 분자인 것이 바람직하다. 상기 siRNA 분자는 표적 단백질을 암호화하는 유전자의 염기서열 내에서 선택되는 10개 내지 30개의 염기로 구성되는 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정된 것은 아니며, 표적 단백질을 암호화하는 유전자의 염기서열을 대상으로 상보적으로 결합할 수 있는 센스 서열을 가진 이중가닥 RNA 분자라면 모두 사용 가능하다. 상기 안티센스 서열은 센스 서열과 상보적인 서열을 가지는 것이 가장 바람직하다.
본 문서에서 사용되는 "shRNA(short hairpin RNA)"는 siRNA의 일종으로서 분자내의 상보적인 서열 사이에 형성된 줄기(stem)과 루프(loop) 구조로 이루어진 단일 가닥 RNA 분자로서 표적 mRNA의 분해와 유전자침묵을 유발하는 점에서 miRNA 그리고 siRNA와 유사하다.
본 문서에서 사용되는 "길항 항체(antagonizing antibody)"는 표적 단백질의주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 다클론 항체는 상기 표적 단백질을 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol. Cell. Biol., 62: 109-120, 1984). 또한, 상기 표적 단백질에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게 하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al., Science, 254: 1275-1281, 1989). 상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.
본 문서에서 사용되는 "앱타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산) 또는 펩타이드이다. 앱타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 앱타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후(Ellington, AD and Szostak, JW., Nature, 346: 818-822, 1990), 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 앱타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체항체로서의 높은 가능성이 있다.
본 문서에서 사용된 "작은 화합물(small compound)"은 세포막을 통과할 수 있을 정도로 작은 크기를 가지며 표적 분자의 기능을 저해할 수 있는 활성을 가진 분자이다. 이러한 작은 화합물은 화합물 라이브러리(compound library)로부터 대용량 스크리닝(high throughput screening)을 통해 선별될 수도 있고, 표적분자의 활성부위(active site)의 3차원 구조를 이용한 컴퓨터-기반 구조-활성 관계 분석(computorial structure and activity relationship analysis)를 통해 새롭게(de novo) 고안될 수 있다(Wendoloski et al., Pharmacol. Ther., 60(2): 169-183, 1993).
본 문서에서 사용된 "약제약상 허용된 담체"란 조성물, 구체적으로 의약 조성물의 활성 물질을 제외한 성분을 지칭하는 용어이다. 제약상 허용되는 담체의 예로는 결합제, 붕해제, 희석제, 충진제, 활택제, 가용화제 또는 유화제 및 염이 포함된다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: M059J 세포에서의 카뎁신 D의 상향조절
1-1: 2-D 겔을 이용한 차등 발현 분석
본 발명자들은 DNA-PK(DNA-dependent serine/threonine protein kinase)의 존재 또는 부존재시의 총 세포 단백질의 차등 발현(differential expression)을 분석하기 위해 두 가지 동유전형 세포주인 M059J(DNA-PK의 촉매소단위가 결핍됨)와 M059K(DNA-PK가 정상적으로 발현됨)에 대하여 전형적인 비교 방법인 이차원 겔 전기영동을 수행하였다. 구체적으로 M059J 세포와 M059K 세포를 얼음으로 냉각시킨 PBS로 세척한 후 역시 얼음으로 냉각시킨 프로테아제 저해제(Calbiochem, USA)를 포함하고 있는 2-D 시료 완충액(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris, 100 mM DTT, 0.5% immobilized pH gradient buffer)로 용해시켰다. 총 단백질(50 μg)을 종래에 보고된 바 대로(Baek et al., J. Proteomics 73:721-732, 2010), 등전점전기영동(pH 3-10) 및 후속 구배 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(7.5-17.5%) 전기영동을 통해 전개하였다. 그런 다음 겔을 질산은으로 염색한 후 이미지 분석 소프트웨어(PDQuest, Bio-Rad, USA)로 분석하였으며, 분리된 단백질 점은 종전에 보고된 바 대로 질량분석기로 동정하였다(Baek et al., J. Proteomics 73:721-732, 2010).
그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, DNA-PK-결핍 M059J 세포에서 많은 단백질들인 DNA-PK 발현 M059K 세포와 비교시 차별적으로 발현되고 있음을 발견하였다. 특히, 질량분석 결과 카뎁신 D로 동정된 단백질 점은 정상적인 DNA-PK 활성을 가진 세포에서 유의하게 하향 조절되어 있었다(도 1의 A).
1-2: 반정량적 RT-PCR
본 발명자들은 2-D 겔 분석으로 얻은 이러한 결과를 확증하기 위해, 이들 두 세포주로부터 추출한 총RNA을 이용하여 반-정량적 RT-PCR을 수행하였다.
구체적인 방법은 하기와 같다:
2.5 mM L-글루타민 및 10% FBS를 보충한 DMEM 및 Ham's F12 medium의 1:1 혼합배지에서 배양한 M059J 및 M059K 세포주(ATCC, USA)로부터 총RNA를 Trizol 시약(Invitrogen, USA)를 이용하여 추출하였다. 역전사 반응을 위해, 5 μg의 총RNA, oligo(dT)12-18 5 pmol, dNTP 각각 1 mM, 역전사효소(Supercript Ⅲ, Invitrogen, USA) 200 U이 포함된 반응 혼합액 20 μl을 60분간 50℃에서 반응시킨 다음 15분간 70℃에서 반응시키고, 신속하게 냉각시켰다. PCR 반응은 상기 역전사 반응물을 카뎁신 D에 대하여는 정방향 프라이머(서열번호 1: 5'-GTG CCC TGC CAG TCA GCG TCG TCA G-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 2: 5'-CCT GCT CAG GTA GAA GGA GAA GAT G-3'), 내부 대조군인 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)에 대하여는 정방향 프라이머(서열번호 3: 5'-AAT GCA TCC TGC ACC ACC AA-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 4: 5'-GTA GCC ATA TTC ATT GTC AT-3')를 포함하는 반응 혼합물로 희석한 후, 30초간 94℃에서 열변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 연장을 25주기 반복함으로써 수행하였다. 반응이 종료된 후 PCR 산물 5 μl를 0.5X TAE 완충용액 하의 1.5% 아가로스 겔 상에서 전기영동하였으며, 브롬화이티디움(ethidium bromide)로 염색하여 UV 조사하에 관찰하였다(도 1의 B).
그 결과, 도 1의 B에서 나타난 것과 같이, M059J 세포의 카뎁신 D의 mRNA 수준은 M059K 세포 보다 5배 정도 높은 것으로 나타났다.
1-3: 웨스턴 블랏 분석
본 발명자들은 M059J 세포의 카뎁신 D 발현이 mRNA 수준 뿐만 아니라 단백질 수준에서도 증가하는 것인지 확인하기 위해, 두 세포의 파쇄액에 대하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
구체적인 방법은 하기와 같다:
세포를 NP-40 용해 완충액(20 mM Tris, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1%(v/v) Nonidet P-40, 5 M μAEBSF, 1.5 nM Aprotinin, 10 nM E-64, 및 10 nM Leupeptin)에서 30분간 반응시킨 후, 초음파처리를 하고 4℃에서 12,000 xg로 10분간 원심분리하여 비수용성 잔존물을 제거하였다. 총 단백질 30 μg을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 상에서 전기영동한 후, 반-건조 방식으로 니트로셀룰로오스 막에 전사시켰다. 단백질이 전사된 막에 대하여 차단용액(TBST에 용해된 2.5% 무지방 분유)으로 1:200으로 희석된 카뎁신에 특이적인 염소 다클론 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 반응시킨 후 세척하였고, 세척된 막에 대하여 HRP-결합 항-염소 IgG 토끼 2차항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)로 반응시킨 후 ECL 시약(Pierce, USA)을 이용하여 화학발광 검출시스템을 이용하여 관찰하였다(도 1의 C).
그 결과, 도 1의 C에 나타난 바와 같이, 단백질 수준에서도 M059J 세포의 카뎁신 D 발현 수준이 M059K 세포에 비해 매우 높게 나타났다. 한편, 전구체 단백질을 포함한 모든 유형의 카뎁신 D는 M059K 세포에서는 하향조절되었다.
실시예 2: 카뎁신 D의 저해에 따른 산화 스트레스에 대한 암세포의 반응 분석
2-1: 세포사멸 분석
DNA-PK는 DNA 이중가닥 복구 뿐만 아니라 Bcl-2 및 BAK/BAX와 같은 세포사멸-연관 단백질의 발현을 조절함으로써 DNA 손상에 의한 세포사멸에도 필요하다(Bernstein et al., Mutat. Res. 511:145-178, 2002; Chen et al., J. Cell. Physiol. 203:127-132, 2005). 이에, 본 발명자들은 DNA-PK 활성이 어떻게 세포생존도에 영향을 미치는지 확인하기 위해서, DNA 손상 유발 화합물인 독소루비신(doxorubicin) 및 에토포사이드(etoposide)의 존재시 두 동질유전자형(isogenic) 세포인 M059J와 M059K 세포의 세포사멸 정도를 직접적으로 비교하였다.
세포사멸 정도는 하기와 같이 수행하였다:
세포를 독소루비신(doxorubicin), 에토포사이드(etoposide) 또는 과산화수소(H2O2)로 처리한 후, 냉각된 1X PBS로 세척하였다. 그런 다음 FITC-표지 아넥신-V(Annexin-V) 염색 및 요오드화 프로피디움(propidium iodide) 삽입 정도를 제조자의 지시에 따라 조사하였다. 세포사멸 세는 유세포 분석기(flow cytometer, FACSCaliber, BD Biosciences, USA)로 분석하였다(도 2의 A).
그 결과, 그 결과, 도 2의 A에서 나타난 바와 같이, 독소루비신과 에토포사이드와 같은 DNA 손상 유도제 처리시 두 암세포의 세포사멸이 유도되었다. 그러나, M059J 세포의 Annexin V-양성 세포(세포사멸이 유도된 세포)는 DNA 손상 유도제 처리시 M059K 세포 보다 상대적으로 높았다(도 2의 A).
2-2: 세포생존도 분석
본 발명자들은 더 나아가, 카뎁신 D의 강력한 저해제인 펩스타틴 A(pepstatin A)가 DNA 손상-유도 세포 사멸에 어떻게 영향을 미치는지 세포생존도를 분석함으로써 조사하였다.
세포생존도는 3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliium bromide, MTT)의 대사를 측정함으로써 측정하였다. 구체적으로 24-웰 평판배양용기의 각 웰에 MTT 용액(5 mg/ml) 300 μl를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 세포를 정치시켰다. 그런 다음, 100 μl의 안정화 용액[50% DMF(dimethylformamide) 및 20% SDS(sodium dodecyl sulfate), pH 4.8]을 각 웰에 가한 후 마이크로플레이트 판독기로 570 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다(도 2의 B).
그 결과 도 2의 B에서 나타난 바와 같이, 흥미롭게도 카뎁신 D를 과발현하는 M059J 세포는 펩스타틴 A로 전처리하였을 때, DNA 손상에 민감하였다. 반면, M059K 세포는 독소루비신의 존재와 무관하게 유사한 정도의 세포사멸율을 나타냈다. 이는, M059J 세포에서의 DNA 손상-유도 세포사멸이 카뎁신 D의 높은 발현의 결과인 인것임을 시사하는 것이다.
세포증식 억제제인 독소루비신은 DNA 기능을 교란하고 DNA 손상을 유도하며, 다양한 종류의 암에 대하여 치료제로 널리 이용되고 있다(Singal and Iliskovic, N. Engl. J. Med., 339:900-905, 1998). 아울러, 독소루비신은 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)를 생산하고 독소루비신-유도 ROS는 암세포에 대하여 세포독성을 유발하는 것으로 알려져 있다(Ravid et al., Cancer Res. 59:862-867, 1999).
이에, 본 발명자들은 카뎁신 D의 저해가 M059J 세포의 H2O2-의존적 세포사멸에 어떻게 영향을 미치는지 직접 조사하였다. 독소루비신 대신에 세포에 산화적 스트레스를 주기 위한 물질로 1 mM의 과산화수소(H2O2)를 처리한 후, 상기와 같이 세포생존도를 분석하였다(도 2의 C).
그 결과 도 2의 C에 나타난 바와 같이, M059J 세포는 M059K 세포보다 펩스타틴 A 존재시에 H2O2에 보다 더 민감하였다.
실시예 3: 카뎁신 D 발현에 의해 조절되는 산화적 스트레스-유도 세포 사멸
본 발명자들은 H2O2-유도 세포사멸에서 카뎁신 D의 기능적 역할을 조사하기 위하여, 야생형 카뎁신 D 또는 효소적으로 불활성인 돌연변이 카뎁신 D를 각각 안정적으로 발현하는 HeLa 세포주(HeLa-CatD wt 및 HeLa-CatD D295N)를 제조하였다. 상기 HeLa 세포주는 10% FBS를 보충한 DMEM에서 배양하였고, 상기 형질감염 세포주는 하기와 같은 과정을 거쳐 제조하였다:
야생형 카뎁신 D 및 효소적으로 불활성인 돌연변이 카뎁신 D(D295N) 발현벡터는 프랑크후르트 대학교의 Stefanie Dimmeler 박사에 의해 제공받았다. 이들 CatD 발현벡터 또는 공벡터인 pcDNA3.1을 HeLa 세포에 전기천공기(Gene Pulser Xcell electroporation system, Bio-Rad, USA)를 이용하여 형질감염시켰다. 세포를 G418 1 mg/ml이 포함된 DMEM 배지에서 2주간 배양함으로써 안정적으로 형질감염된 세포를 선별하였다. 상기 형질감염 세포를 대상으로 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과 정상적을 야생형 CatD 및 돌연변이형 CatD(D295N)이 발현됨을 확인할 수 있었다(도 3의 A).
상기 형질감염된 세포들에 대하여 상기 실시예 2-1에서와 같이, 세포사멸 정도를 요오드화 프로피디움 삽입에 의해 분석하였다(도 3).
그 결과, 도 3의 B에 나타난 바와 같이, 유의한 양의 H2O2 처리된 HeLa 세포가 세포사멸되었고 야생형 CatD를 과발현하는 HeLa 세포는 H2O2 의존적 세포사멸을 저해하였다. 그러나, 효소적으로 불활성화 형태의 CatD(D295N)을 발현하는 HeLa 세포는 여전히 공벡터로 형질감염시킨 세포와 유사한 수준으로 산화적 스트레스에 대하여 민감하였다.
이에, 본 발명자들은 CatD의 발현 저해에 의해 상기 현상이 역전되는지 확인하기 위해, CatD에 대한 넉다운 실험을 CatD를 표적으로 하는 RNAi(RNA interfering)을 이용하여 수행하였다. 구체적으로, 상기 안정적으로 형질감염된 세포에 카뎁신 D에 대한 shRNA 표적 DNA 서열(서열번호 5: 5'-AGC TGG TGG ACC AGA ACA TC-3')를 pMIR-mU6 헤어핀 siRNA 발현벡터(Mirus Bio, USA)에 삽입하였다. 생성된 siRNA-CatD 또는 shRNA-control(pMIR-mU6-luc)을 상기에서 제조한 야생형 CatD를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포에 전기천공법에 의해 형질감염시켰다. 상기 shRNA-CatD로 형질감염된 세포에 대하여 CatD에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석 결과, CatD의 넉다운이 정상적으로 이루어짐을 확인할 수 있었다(도 3의 C).
상기와 마찬가지로 세포 사멸 정도를 유세포 분석기로 분석한 결과, 예상한 바와 같이, CatD 넉다운시 HeLa-CatD wt 세포의 H2O2 유도 세포사멸을 현격하게 증가시키는 것으로 나타났다(도 3의 D).
이러한 결과는 CatD가 H2O2-유도 세포사멸에서 세포보호 역할을 수행함을 시사하는 것이다.
상술한 결과를 검토하건대, 암세포에 산화적 스트레스를 가함과 동시에 CatD 유전자의 발현 또는 효소적 활성을 저해할 경우 암세포의 세포사멸을 유의하게 증가시킬 수 있기 때문에, 항암 치료에 있어서 중요한 진전을 가져올 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 유리 라디컬을 생성함으로써 암세포에 산화적 스트레스를 야기할 수 있는 항암제(예컨대, 독소루비신이나 미토마이신 C 등)를 카뎁신 D에 특이적인 저해제(예컨대, 펩스타틴 A 또는 카뎁신 D에 특이적인 siRNA 등)를 병용처리함으로써 보다 효율적인 항암치료 효과를 기대할 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 종래의 항암제로 치료효과를 기대하기 힘들었던 난치성 암의 효과적인 치료제를 개발할 있다.
서열번호 1 및 2는 카뎁신 D의 검출을 위한 프라이머쌍의 핵산서열이다.
서열번호 3 및 4는 내부 대조군인 GAPDH의 검출을 위한 프라이머쌍의 핵산서열이다.
서열번호 5는 카뎁신 D에 대한 표적 DNA 서열이다.

Claims (7)

  1. 카뎁신 D(cathepsin D) 특이적 저해제 및 유리 라디컬 형성 항암 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 카뎁신 D 특이적 저해제는 카뎁신 D의 발현 저해제 또는 활성 저해제인, 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 카뎁신 D의 발현 저해제는 카뎁신 D의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 miRNA인, 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 카뎁신 D의 활성저해제는 카뎁신 D의 작용을 저해하는 앱타머(aptamer), 펩티드 미메틱스(peptide mimetics), 길항 항체(antagonizing antibody) 또는 작은 화합물(small compound)인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 유리 라디컬 형성 항암 화합물은 독소루비신(doxorubicin), 아드리아마이신(adriamycin), 미토마이신 C(mitomycin C) 또는 디아지리디닐벤조퀴논(diaziridinylbenzoquinone)인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 암은 카뎁신 D가 과발현된 암인, 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 카뎁신 D가 과발현된 암은 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 신경교아세포종(glioblastoma) 또는 대장직장암(colorectal cancer)인, 약학적 조성물.
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