KR102238520B1 - Fes 저해제를 포함하는 방사선 민감도 증진용 조성물 - Google Patents

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Abstract

FES 저해제를 포함한 방사선 민감도 증진용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

FES 저해제를 포함하는 방사선 민감도 증진용 조성물{Composition comprising FES inhibitor for enhancing radiation sensitivity}
FES 저해제를 포함하는 방사선 민감도 증진용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
방사선 치료는 암 치료의 초석으로, 이들이 적용되는 빈도는 방사선 치료 기술의 개발에 따라 증가하고 있다. 그러나, 방사선 치료에 의한 반응률은 여전히 만족스럽지 않으며, 국소 진행성 비-소 세포 폐암 또는 췌장암을 포함한 몇몇의 암들에서 상당한 독성을 나타낸다. 따라서, 암세포의 방사선 민감도는 주요한 이슈로서, 약물-방사선 치료의 병용을 위한 합리적인 접근을 위한 충족되지 않은 임상적 요구가 존재한다. 몇몇의 항암치료는 방사선 치료의 효능을 증가시키기 위해 사용되나, 이들 대부분은 비-선택적인 세포독성 제제로서 정상 조직에도 높은 독성을 나타낸다. 저산소 세포 방사선 증감제 또는 저산소 세포 독소는 독성으로 인한 부작용으로 인해 사용이 제한된다. 이상적인 방사선 감작제는 방사선을 받지 않을 때의 세포의 성장 및 생존에 영향을 미치지 않아야하고, 방사선으로 인한 세포 사멸을 최대화할 수 있어야 한다. 진보된 방사선 기술은 정상 조직에 대한 방사선 용량을 줄이는 반면 종양 조직에 대한 방사선 용량을 증가시킨 고도의 등각 방사선 치료(Conformal　Radiotherapy)를 가능하게 하였으나, 광자 방사선의 생물학적 효능은 개선되지 못하였다(KR101228148B1). 따라서, 방사선 치료의 생물학적 효과를 증가시킬 수 있는 신규한 방사선 증감제의 개발이 요구된다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 FES가 방사선 민감도 증진을 위한 새로운 타겟임을 발견하고, FES 저해에 따라 방사선 민감도가 증가됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 FES 저해제를 포함하는 방사선 민감도 증진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 조성물을 사용하여 암세포의 방사선 민감도를 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 FES의 발현 또는 이의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암세포에 대한 방사선 민감도 증진제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 FES 발현 또는 이의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 방사선 치료의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 FES 저해제를 포함하는 방사선 민감도 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "FES(Feline sarcoma oncogene)"는 "FPS"라고도 지칭될 수 있고, 티로신 특이적 단백질 키나아제 활성을 가진 효소로 알려져 있다. 상기 FES는 암이 발생할 수 있는 각종 동물 유래의 FES일 수 있으며, 특히 인간 유래의 FES일 수 있으며, 공지의 데이터베이스인 NCBI GenBank 등에서 그 서열 정보를 알 수 있다. 예를 들어, 상기 FES는 각각 GenBank Accession No. NM_002005.4, NM_001143783.1, NM_001143784.1, NM_001143785.1, XM_017022005.1, XM_017022006.1, XM_017022008.1, XM_017022007.1, XM_017022009.2, XM_005254880.1, XM_017022010.1, XM_005254882.2, XR_001751142.1, XR_001751143.1, XR_001751144.2, 또는 XR_243206.3을 포함하는 mRNA로부터 각각 NP_001996.1, NP_001137255.1, NP_001137256.1, NP_001137257.1, XP_016877494.1, XP_016877495.1, XP_016877497.1, XP_016877496.1, XP_016877498.1, XP_005254937.1, XP_016877499.1, 또는 XP_005254939.1로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있다. 상기 mRNA와 상기 단백질과 일부 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 FES의 mRNA 또는 FES 단백질로 간주될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "FES 저해제"는 세포 내에서 FES의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 의미하는 것으로, 예를 들어, FES에 직접적으로 작용하거나 또는 FES의 상위 조절자에 간접적으로 작용하여 FES의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나, 발현된 FES의 분해를 증가시키거나, 그 활성을 방해함으로써 FES의 발현 수준 또는 그 활성을 감소시키는 제제를 의미할 수 있으며, 세포 내 FES의 발현 또는 활성을 감소시켜 세포의 방사선 민감도를 증진시킬 수 있는 제제라면 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 FES 저해제는 FES 저해 활성을 가진 물질이라면, 특별히 제한되지 않으나, 당업계에 공지된 표준 기법을 통해 세포에 처리될 수 있는 핵산 또는 폴리펩티드 같은 생물학적 분자, 화합물, 세균이나 식물 또는 동물로부터 분리된 추출물일 수 있다.
상기 FES 저해제는 FES 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 용어 "항체"란 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 FES 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, FES 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 FES 유전자에 의해 코딩되는 FES 단백질을 얻고, 얻어진 FES 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위(결합 도메인)를 가져 항원 결합 기능을 보유하고 있는, 항체 분자의 기능적 단편 또한 포함한다.
상기 FES 저해제는 FES에 특이적인 siRNA, RAN 앱타머, 리보자임, FES를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 FES 저해제는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 FES에 특이적인 siRNA는 FES에 특이적으로 작용하여 FES를 발현하는 mRNA를 절단(cleavage)하여 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference)현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 말한다. 상기 siRNA는 FES 핵산 서열의 일부 또는 전부와 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥으로 구성되어 세포 내에서 FES mRNA에 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 FES에 특이적인 siRNA는 이들은 세포에 도입되었을 때, FES의 발현을 저해시킬 수 있으며, 내인성 뉴클레아제, 예를 들어 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 내성인 것일 수 있다. 상기 FES에 특이적인 siRNA는 FES 유전자로부터 전사된 mRNA에 상보적인 서열을 가지고 있으며, 해당 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하고, 기능을 저해시킬 수 있게 된다. 상기 FES에 특이적인 siRNA는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 증폭, 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.
상기 FES에 특이적인 RNA 앱타머는 특정의 3차원 입체형태를 채택하는 능력에 의해 FES mRNA와 결합하여 이에 대해 길항 효과를 갖는 핵산 리간드 분자를 의미한다. 전형적으로 앱타머는 규정된 이차 및 삼차 구조, 예컨대 스템-루프구조로 접혀지는 15-50 염기 길이의 작은 핵산일 수 있다. 앱타머는 10-6, 10-8, 10-10, 또는 10-12 보다 적은 kd로 표적 분자와 결합하는 것일 수 있다. 앱타머는 매우 고도의 특이성을 가지는 표적 분자와 결합할 수 있다. 또한, 앱타머는 다수의 리보뉴클레오티드 단위, 데옥시리보뉴클레오티드 단위, 또는 두 가지 유형의 뉴클레오티드 잔기의 혼합물로 구성될 수 있다. 앱타머는 하나 이상의 변형된 염기, 당 또는 포스페이트 주쇄 단위를 추가로 포함할 수 있다.
상기 FES에 특이적인 리보자임은 화학적 반응을 분자 내적으로나 또는 분자 사이에서 촉매할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 상기 리보자임은 천연 시스템에서 발견되는 리보자임을 토대로 한 뉴클레아제나 핵산 중합효소 타입 반응을 촉매하는 리보자임의 상이한 유형들 모두 가능하며, 예를 들면 햄머헤드 리보자임, 헤어핀 리보자임 및 테트라히메나 리보자임일 수 있다. 또한, 천연 시스템에서는 발견되지 않지만, 생체내 특이한 반응을 촉매하기 위해 공학적으로 처리되는 리보자임도 이용가능하다. 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단할 수 있으며, 바람직하게는 RNA 기질을 절단한다. 리보자임은 전형적으로 표적 기질의 인식 및 결합과 이어지는 절단을 통하여 핵산 기질을 절단하게 되는데, 이러한 인식은 대부분 염기쌍 상호작용을 토대로 하므로, 표적 특이적 절단이 가능한 특징을 가질 수 있다.
상기 FES를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 세포 내의 FES mRNA 분자의 단일 가닥 단편에 상보적으로 결합하여 FES mRNA의 프로세스 효율을 감소시킴으로써, 이들의 발현을 억제하고, 기능을 저해시킬 수 있다. 상기 안티센스 핵산 분자는 RNA-RNA, RNA-DNA, RNA-PNA(단백질 핵산) 상호작용에 의해 FES mRNA 분자에 결합하여 이들의 활성을 변이시키는 비효소적 핵산 화합물이며, 이들은 하나의 연속서열이 FES 염기서열에 상보적일 수 있다.
상기 안티센스 핵산 분자는 안티올리고뉴클레오티드 형태일 수 있다. 이들은 세포에 도입되었을 때, FES의 발현을 저해시킬 수 있으며, 내인성 뉴클레아제, 예를 들어 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 내성이며, 생체 내에서 안정적인 선택적으로 변형된 올리고뉴클레오티드이다.
상기 용어 "올리고뉴클레오티드"는 자연 발생적인 염기, 당 및 당간(intersugar) 연결로 이루어진 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단량체의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 또한, 이 용어는 유사하게 기능하는 비-자연 발생적인 단량체 또는 그의 부분을 포함하는 변형된 또는 치환된 올리고머를 포함할 수 있다. 치환된 올리고머의 혼입은 세포 흡수 증대 또는 뉴클레아제 내성 증가를 비롯한 인자에 기초하며, 당업계에 공지된 바와 같이 선택될 수 있다. 전체 올리고뉴클레오티드 또는 그의 일부분이 치환된 올리고머를 함유할 수 있다. 또한, 상기 안티올리고뉴클레오티드는 이들의 표적에 대한 친화성을 증가시키고 표적 서열의 미스매치(mismatch)에 대한 내성을 제공하도록 당업계에 공지된 방법으로 변형된 올리고머 모방체, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA) 및 고정(locked) 핵산(LNA)을 포함할 수 있다. 또한, 상기 안티올리고뉴클레오티드는 천연형 올리고뉴클레오티드, 포스포로티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포로디티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 메틸포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포르아미데이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, H-포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 트리에스테르형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 알파-아노머형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 펩티드 핵산, 그외 인조 핵산 및 핵산-변형된 화합물을 포함한, 변형된 올리고뉴클레오티드 형태일 수 있다.
상기 안티올리고뉴클레오티드는 FES 단일 가닥 염기서열에 상보적인 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형될 수 있으며, 이들 변형은 당업계에 알려져 있고, 올리고뉴클레오티드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함할 수 있다. 당 변형의 예로는, 1-6 포화 또는 불포화 탄소 원자를 포함하는 -O-저급 알킬기, 또는 2-6 탄소 원자를 포함하는 -O-아릴, 또는 알릴기로 2'-O-치환된 것을 포함하는, 리보스 모이어티의 2' 위치에 변형이 있으며, 상기 -O-알킬, 아릴 또는 알릴기는 아미노 또는 할로기(예, 할로, 하이드록시, 트리플루오로메틸 시아노, 니트로 아실 아실옥시, 알콕시, 카르복시, 카르브알콕실 또는 아미노기)로 비치환 또는 치환될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 예로는, 3', 5' 또는 3' 및 5' 말단에 2'-O-알킬화된 리보뉴클레오티드를 가지며, 적어도 4개 또는 5개의 연속 뉴클레오티드가 그렇게 변형된다. 2'-O-알킬화된 기의 예로는, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필 및 2'-0-부틸이 있다.
상기 FES 저해제가 핵산으로 이루어지는 경우, 세포 내 전달을 위해 발현벡터에 포함되어 제공될 수 있다. 이러한 경우, FES에 특이적인 shRNA 등을 발현하는 벡터일 수 있다. 각종 핵산들은 당업계에 알려진 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입시킬 수 있는데, 이를 위해 상기 siRNA는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 벡터(viral vector)로서 예를 들면, 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있다.
상기 핵산으로 이루어지는 FES 저해제는 세포 내로 도입시켜 암세포의 방사선 민감도를 증진시킬 수 있는데, 여기서 "도입"은 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "방사선 민감도 증진"이란 방사선을 이용한 질병 치료에 있어서, 방사선에 대한 세포의 민감도를 증진시키는 것을 의미한다. 이를 통해 방사선 치료효율을 상승시킬 수 있는데, 특히, 암 치료시 병행처리 되면 암세포의 방사선 민감도가 증진되어 암세포의 사멸 효과 및 증식 억제 효과를 나타낼 수 있다.
상기 FES 저해제는 세포 내에서 FES mRNA 등에 작용하여 이들의 발현율을 감소시키는 등, FES 기능을 저해함으로써 세포의 방사선 저항성을 낮추어 방사선에 대한 민감도를 증진시킬 수 있다. 상기 FES 저해제를 포함하는 방사선 민감도 증진용 조성물은 방사선 치료를 적용할 수 있는 모든 세포에 적용이 가능하며, 특히 암세포의 방사선 민감도를 증진시키는 데 이용할 수 있다. 또한, 상기 방사선 민감도 증진용 조성물은 방사선 저항성이 증가된 모든 암세포, 특히 FES의 발현에 기인하여 방사선 저항성이 증가된 경우에 적용될 수 있다.
상기 FES 저해제를 포함하는 조성물은 세포 주기의 조절을 통해 세포의 방사선 민감도를 증진시킬 수 있다. 일 구체예에서, 암세포에서 FES 넉다운 및 방사선 조사의 조합에 의해 sub-G1 분획 및 G2/M기 정지가 증가됨을 확인하고, 이러한 세포 주기 정지가 방사선 조사 후의 주요한 세포-사멸 메커니즘인 유사분열 카타스트로피를 확인한 결과, 대조군 세포와 비교하여 FES 넉다운 세포는 방사선 조사 후의 유사분열 카타스트로피가 유의적으로 증가됨을 확인하였다(도 10).
상기 FES 저해제를 포함하는 조성물은 방사선 유도-DNA 손상의 증가를 통해 세포의 방사선 민감도를 증진시킬 수 있다. 일 구체예에서, 세포 내 DNA 손상에 의한 주요 반응인 인산화된 히스톤 H2AX(γH2AX)의 수준을 방사선 조사 후 다양한 시간대에서 분석한 결과, 대조군 세포와 비교하여 FES 넉다운 세포에서 γH2AX 양성 세포의 수가 유의적으로 증가됨을 확인하였다(도 12).
상기 FES 저해제를 포함하는 조성물은 방사선 유도-활성 산소(ROS: Reactive Oxygen species) 생산의 조절을 통해 세포의 방사선 민감도를 증진시킬 수 있다. 일 구체예에서, 방사선 조사 후에 생성되는 ROS의 양은 FES-넉아웃(FES-KO) 세포에서 유의적으로 증가되고, 방사선 조사의 용량이 증가될수록, ROS 생산량 역시 더 증가됨을 확인하였다(도 15).
본 명세서에서 용어, "암"은 "종양"과 동일한 의미로 사용될 수 있으며, 뇌척수암, 두경부암, 흉선종, 취암, 다발성 골수종, 급성 백혈병, 폐암, 간암, 식도암, 위암, 대장암, 소장암, 췌장암, 구강암, 뇌종양, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 고환암, 혈액암, 림프종, 피부암, 건선 및 섬유선종으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 암은 췌장암 또는 폐암일 수 있다.
상기 FES 저해제를 포함하는 방사선 민감도 증진용 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 FES 저해제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있으며, 투여의 용이성과 투여량의 균일화를 위해 단위 투여 형태로 제형화할 수 있다. 상기 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥 내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로 펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
다른 양상은 FES 저해제를 포함하는 방사선 민감도 증진용 조성물을 사용하여 암세포의 방사선 민감도를 증진시키는 방법을 제공한다. 또한, 상기 방사선 민감도 증진용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료를 위한 방사선 요법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 상기의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, FES 저해제, 예를 들어 안티센스 핵산 분자의 바이러스성 또는 비바이러스성 기술에 의한 운반을 포함할 수 있다. 상기 조성물이 암세포 내로 도입되면, FES의 발현 수준을 낮추거나 활성을 저해함으로써, 방사선 민감도를 증진시킬 수 있다.
상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 해당 조직에 국소 투여한다.
상기 암 치료를 위한 방사선 요법은 상기 방사선 민감도 증진용 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 치료적 유효량은 방사선에 대해 암세포 내의 종양의 민감도를 효과적으로 증진시키는 양을 의미한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 및 조사되는 방사선량을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 목적에 적합한 방사선 민감도 증진용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정할 수 있다. 또한, 경우에 따라, 상기 방사선 민감도 증진용 조성물과 함께 공지의 항암제를 병용 투여하여 방사선 치료 효과를 포함한 항암 효과를 증대시킬 수 있다.
상기 방사선 요법은 방사선 저항성이 증가될 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 특히, FES의 발현에 기인하여 방사선 저항성이 증가될 수 있는 경우에 적용가능하다. 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다. 또한, 상기 방사선 요법은 방사선 저항성이 증가된 모든 암 치료에 이용할 수 있으며, 특히 FES의 발현에 기인하여 방사선 저항성이 증가된 모든 암 치료에 이용할 수 있다.
상기 방사선 요법은 암세포에 상기 방사선 민감도 증진용 조성물을 투여하고, 방사선을 조사하는 것을 포함하는데, 여기에서 "방사선 조사"란 이온화 방사선, 특히, 통상 사용되는 선형 가속기(linear accelerators) 또는 방사핵종(radionuclides)에 의해 방사된 감마 방사선을 의미할 수 있다. 방사핵종에 의한 종양에의 방사선 요법은 외부적 또는 내부적으로 이루어질 수 있다. 조성물 투여 시기는 예를 들어, 종양에 방사선을 조사하기 한 달 전까지, 예를 들어, 10일 또는 일주일 전까지 상기 조성물 투여를 시작할 수 있다.
추가적으로, 종양의 방사선 조사를 분별하고, 최초와 최후의 방사선 조사 기간 사이에 조성물의 투여를 지속하는 것이 유리할 수 있다. 투여되는 FES 저해제의 양, 방사선 조사량 및 방사선 조사량의 간헐성은 암의 종류, 그것의 위치, 화학 요법 또는 방사선 요법에 대한 환자의 반응과 같은 일련의 파라미터에 따라 달라진다. 또한, 상기 방사선 요법은 근접치료, 방사성 핵종 치료, 외부 빛살 방사선요법(external-beam radiation therapy), 온열치료(냉동절제 치료, 고열치료), 방사선 외과, 하전입자 방사선치료(charged-particle radiotherapy), 중성자 방사선 요법 및 광역동치료 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 FES의 발현 또는 이의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암세포에 대한 방사선 민감도 증진제의 스크리닝 방법을 제공 한다. 상기 FES, 암, 방사선 민감도 증진 등에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 방법은 암세포에 시험물질을 가하는 단계; 상기 암세포에서 FES의 발현 또는 이의 활성 수준을 측정하는 단계; 및 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 암세포에서 FES 발현 또는 이의 활성 수준을 감소시킨 시험물질을 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "시험물질"은 FES 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, FES 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다.
본 명세서 용어, "측정"은 시료 중 존재하는 특정 단백질 또는 뉴클레오티드를 탐지하여 수치화하는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 FES 단백질 또는 FES를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적인 결합체에 따라 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 또는 단백질 칩 중에 선택된 어느 하나 이상, RT-PCR, RNase 보호분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블롯팅, 및 DNA 칩 중 선택된 어느 하나 이상 또는 이들의 조합을 이용하여 수치화하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 키놈(kinome) siRNA 스크리닝을 수행한 결과, FES siRNA은 방사선 조사 후의 세포 생존율을 현저히 감소시킴을 확인하고, 방사선 조사 후 암세포에서는 FES 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다(도 1).
또 다른 양상은 FES 발현 또는 이의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 방사선 치료의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 FES, 측정, 방사선 치료 등에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 방법은 개체로부터 분리된 시료에서 FES 발현 또는 이의 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 시료로부터 측정된 발현 또는 이의 활성 수준을 정상 대조군에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 시료로부터 측정된 발현 또는 활성 수준이 정상 대조군에 비해 낮은 경우, 상기 개체의 방사선 치료의 예후가 좋은 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "개체로부터 분리된 시료"는 암으로 진단된 대상 개체로부터 유래되어 상기 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 의미하는 것으로, 예를 들어, 세포, 기관, 세포 용해물, 전혈, 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 세포 외액, 체액, 소변, 분변, 조직, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "예후 예측"은 질환의 경과 및 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후 예측이란 질환의 치료 후 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 예후 예측은 암 환자의 방사선 치료 후, 질환의 경과 및 완치여부를 미리 예상하여 암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 방사선 치료 후 암 환자의 무병생존율 또는 생존율이 높은 수준을 나타내어, 암 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 방사선 치료 후 암 환자의 무병생존율 또는 생존율이 낮은 수준을 나타내어, 암 환자로부터 암이 재발하거나 또는 암으로 인하여 사망할 가능성이 높다는 것을 의미할 수 있다.
일 양상에 따른 FES 저해제를 포함하는 방사선 민감도 증진용 조성물은 암세포의 방사선 민감도를 증진시킴으로써, 방사선 저항성이 증가되어 있는 다양한 암 치료시 방사선 치료법의 효과를 증대시킬 수 있다.
도 1은 키놈 siRNA 스크리닝에서 역 형질주입(reverse transfection), 방사선 조사 및 CCK-8 분석의 개요를 나타낸 것이다.
도 2는 A549 세포를 이용한 1차 스크리닝에서 잠재적인 방사선 증감제의 후보물질을 동정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 1차 스크리닝에서 동정된 후보물질의 개개의 siRNA를 이용한 2차 스크리닝 결과를 나타낸 것이다(빨간색 점, A549 세포; 검은색 점, MiaPaCa2 세포).
도 4는 MiaPaCa2 및 A549 세포에서 6시간의 방사선 조사 후, FES 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다(γH2AX: 양성 대조군).
도 5는 FES-siRNA 또는 대조군 siRNA가 형질주입된 세포에 방사선을 조사한 후, 방사선 조사하지 않은 세포의 각각의 siRNA로 정규화시킨 세포 생존율을 나타낸 것이다(A, A549 세포; B, MiaPaCa2 세포; C, Panc1).
도 6은 방사선 조사된 세포의 집락형성 생존 분석 결과를 나타낸 것이다(A, A549 세포; B, MiaPaCa2 세포; C, Panc1).
도 7은 FES-siRNA 또는 대조군 siRNA가 형질주입된 암세포의 세포사멸 분석 결과(A) 및 패널 E에서 사멸된 세포의 비율을 정량화한 결과(B)를 나타낸 것이다(모든 값은 세번의 독립적인 실험으로부터의 평균±표준오차; 별표는 대조군 siRNA 및 FES-siRNA 사이의 통계적 유의성을 나타냄, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
도 8은 세포사멸-관련 인자의 웨스턴 블로팅 분석 결과를 나타낸 것이다. .
도 9는 방사선 조사 후 FES 넉아웃 및 저해의 효과를 나타낸 결과로서, 유효한 FES 넉아웃(FES-KO)을 단백질 수준에서 확인한 결과(A); 방사선 조사되지 않은 A549 세포에서 인 비트로 세포 생존율에 대한 FES-KO의 효과를 확인한 결과(B, ns: 유의적이지 않음); 각각의 유전자형에서 방사선 조사되지 않은 세포에 대해 정규화된 방사선 조사 후의 FES-WT 또는 FES-KO A549 세포의 세포 생존율을 확인한 결과(C); 방사선 조사된 FES-KO 및 -WT 세포의 집락형성 생존 분석 결과(D); 및 방사선 조사된 암세포의 세포 생존율에 대한 TAE684에 의한 FES 저해의 효과(E)를 나타낸 것이다.
도 10은 방사선 조사 48시간 후의 세포 주기의 각 단계에 있는 세포의 비율을 정량화한 결과(A); 및 유세포 분석에 의해 평가된 세포 주기 분포 분석 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 11은 방사선 조사 시간에 따른 유사분열 카타스트로피 세포의 수를 정량화한 결과(A); 및 4 Gy의 방사선 조사 48시간 후의 대조군 및 FES 넉다운 세포에서 면역형광 염색에 의해 평가된 유사분열 카타스트로피 결과(B, 스케일 바= 30 ㎛; 세포는 튜불린 항체(빨간색)로 염색됨; 핵은 DAPI(파란색)으로 염색됨)를 나타낸 것이다.
도 12는 방사선 조사 시간에 따른 γH2AX 양성 세포를 정량화한 결과(A); 및 4 Gy의 방사선 조사 6시간 후의 대조군 및 FES 넉다운(KD) 세포에서 γH2AX 병소(foci, 초록색) 및 DAPI(파란색)으로 면역형광 염색한 결과(B, 스케일 바= 30 ㎛)를 나타낸 것이다.
도 13은 방사선 조사된 암세포에서 코멧 테일 모멘트(comet tail moment)를 정량화한 결과(A); 및 4 Gy의 방사선 조사 6시간 후의 코멧 분석 결과(B, 스케일 바= 30 ㎛)를 나타낸 것이다.
도 14는 4 Gy의 방사선 조사 6시간 후의 대조군 및 FES 넉다운 세포에서 DNA 손상 복구 경로의 수행자(executor) 및 γH2AX의 단백질의 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 방사선 조사 4시간 후의 A549 세포에서 총 세포 ROS 함량의 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 S6K/MDM2/p53 경로의 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 FES-siRNA 형질주입 여부에 따라 PF-4708671에 의한 선택적 S6K 저해의 웨스턴 블로팅 결과; 및 FES-siRNA 형질주입에 따라 PF-4708671에 의한 선택적 S6K 저해(S6Ki)의 방사선 조사된 MiaPaCa2 세포의 세포 생존율에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 18은 FES-매개된 방사선 민감도 증진의 메커니즘을 나타낸 것이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 방사선 증감의 신규한 표적으로서 FES 선별
인간 키놈(kinome) siRNA 라이브러리(715 개의 siRNA 풀)에 폐암 세포주인 A549 세포를 도입함으로써 불편(Unbiased) RNAi 스크리닝을 수행하였다. 세포의 2개의 집단에 방사선을 조사하거나 4 Gy 방사선을 조사하였고, 세포 생존율을 4일 후에 셀 카운팅 키트-8(CCK-8: Cell Counting Kit-8) 분석을 이용하여 측정하였다. 상기 키놈 siRNA 스크리닝의 전체적인 과정은 도 1에 나타내었다.
siRNA 풀에서 4 Gy에서 생존 비율(SF4: 4 Gy 방사선 조사시 세포 생존율/0 Gy 방사선 조사시 세포 생존율)의 Z-점수가 -2’이하인 표적들을 잠재적 히트(potential hits)로 간주하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 잠재적인 방사선 증감제 후보로서 DMPK1, FRAP1, RIPK2, LCK, CDC2L2, MAP3K12, 및 FES가 선별되었다.
이후, 각각의 표적에 대한 3개 또는 4개의 개별적인 siRNA 및 2개의 암 세포주를 이용한 2차 스크리닝을 수행하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 폐암 세포주인 A549 세포 및 췌장암 세포주인 MiaPaCa2 세포 모두에서, 2개의 독립적인 FES siRNA는 SF4의 유의적인 감소를 유도하므로, FES는 방사선 민감도 증진제로 동정되었다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, A549 세포 및 MiaPaCa2 세포 모두에서 방사선 조사 후 FES의 총 수준이 증가함을 확인하였으며, 이러한 결과는 FES는 방사선에 대한 세포 반응과 기능적으로 연관됨을 나타내는 것이다.
실시예 2. FES 저해에 따른 방사선 민감도 증진 효과 확인
2-1. FES 넉다운에 의한 암세포의 방사선 민감도 증진 효과 확인
FES 넉다운에 의한 암세포의 방사선 민감도에 대한 효과를 확인하기 위해, 인간 췌장암-세포주인 Panc-1 및 MiaPaCa2, 및 폐암 세포주인 A549 세포에 2개의 FES-특이적 siRNA 또는 비-특이적 대조군 siRNA를 형질주입하였다.
구체적으로, ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구매한 A549, MiaPaCa2, 및 Panc-1 세포를 5% CO2 가습된 챔버에서 배양하였다. 세포는 세포주에 따라 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Welgene) 또는 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지(Welgene)에서 유지하였다. 감소된 혈청 배지(Opti-MEM, Gibco)에서 제조사의 역 형질주입(reverse transfection) 프로토콜에 따라, 세포에 리포펙타민 RNAiMAX 형질주입 시약(transfection reagent)을 이용하여 48시간 동안 20 nM에서 하기 표 1에 나타낸 FES-특이적 siRNA 또는 비-특이적 음성 대조군 siRNA(AllStars Negative Control siRNA, Qiagen)을 형질주입하였다.
siFES-1 CGAGGAUCCUGAAGCAGUA 서열번호 1
siFES-2 GAAAGUGGAUGGCCCAGCG 서열번호 2
이후, 세포 생존율을 평가하기 위해, CCK-8 분석을 수행하였다. 세포는 96-웰 플레이트에 시딩되어, 0, 2, 4, 또는 6 Gy으로 방사선을 조사하고, 3일 내지 7일 동안 인큐베이션하였다. 이후, CCK-8 시약을 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션 하였다. VERSAmax 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 각각의 세포주는 대조군 siRNA가 도입된 경우와 비교하여, FES-특이적 siRNA가 도입된 경우, 다양한 용량으로 방사선을 조사한 후의 세포 생존율이 유의적으로 감소됨을 확인하였다.
또한, 세포 생존율을 평가하기 위해 집락형성 생존 분석법(Clonogenic survival assays)을 수행하였다. 구체적으로, siRNA가 도입된 세포를 48시간 후에 0, 2, 4, 또는 6 Gy의 용량으로 방사선 조사를 하였다. 이후 6-웰 배양 플레이트 내에서 배양하였다. 10일 내지 14일의 인큐베이션 후에, 생성된 콜로니를 메탄올/아세트산으로 고정시키고, 1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 50개 이상의 세포를 함유한 콜로니들의 수를 ImageJ 소프트웨어(버전 1.50, NIH)를 이용하여 세었다. 생존 비율(SF: surviving fraction)은 선형-2차 모델에 피팅하고 생존 곡선을 그렸다. 생존율 10%에서의 증가된 증감제 증강비(SER0.1: sensitizer enhancement ratio at 0.1)는 FES 넉다운이 없는 SF 0.1에서의 용량과 FES 넉다운이 있는 SF 0.1에서의 용량의 비율로 정의되었다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, SER0.1 값 측정을 통해(A549 세포에 siFES-1가 도입된 경우 1.34, siFES-2가 도입된 경우 1.30; MiaPaCa2 세포에 siFES-1가 도입된 경우 1.27, siFES-2가 도입된 경우 1.27; 및 Panc1 세포에 siFES-1가 도입된 경우 1.45, siFES-2가 도입된 경우 1.30), FES 넉다운에 의해 방사선-유도 사멸이 증가됨을 확인하였다.
또한, FES 저해에 의한 방사선 민감도 증진 효과가 세포사멸 촉진과 관련됨을 확인하기 위해 유세포 분석법에 기초한 세포사멸 분석을 수행하였다. 구체적으로, 플루오레세인 이소티오시안산염-아넥신 V 세포사멸 검출 키트(BD Biosciences)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포사멸 수준을 측정하였다. 세포를 수득하고, 10 μl PI(2.5 mg/ml) 및 5 μl 아넥신 V로 염색하였다. 세포를 15분 동안 인큐베이션한 후, 유세포 분석기(BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. 초기/말기 세포 사멸을 나타내는 양성 아넥신 V-세포를 세포사멸 세포의 비율을 계산하는데 사용하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 방사선 조사 24시간 후, 대조군과 비교하여, Panc1 세포 및 MiaPaCa2 세포는 FES 저해에 의해 세포 사멸 비율이 증가됨을 확인하였다.
또한, 세포사멸-관련 인자인 PARP 및 카스파제-3(CASP3) 의 웨스턴 블로팅을 추가로 수행하였다. 구체적으로, PARP 항체(1:1000, #9542, Cell signaling), 절단된 PARP 항체(1:1000, #5625, Cell signaling) 또는 절단된 CASP3 항체(1:1000, #9664, Cell signaling)를 이용하였다. FES-siRNA가 도입되거나 도입되지 않은 세포를 4 Gy의 방사선을 조사한 후, 방사선 조사 6시간 후에 단백질을 추출하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포와 비교하여, FES-저해된 세포는 방사선 조사 후 세포사멸 인자인 PARP 및 카스파제-3의 절단이 증가됨을 확인하였다.
종합하면, 상기 결과로부터 FES 저해에 의해, 방사선-유도 세포사멸 세포사(ACD: apoptotic cell death)를 촉진시킴을 확인할 수 있다.
2-2. FES 넉아웃 세포(FES-KO)를 이용한 방사선 민감도 증진 효과 확인
FES 저해에 의한 효과를 확인하기 위해, CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 FES-넉아웃(FES-KO) A549 세포를 제작하였다. 구체적으로, FES 엑손 5에 특이적인 sgRNA(서열: 5’-GGTACTTGCGCTTGGCTTGG-3)를 발현하는 pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 플라스미드 벡터(#62988, Addgene) (pSpCas9(BB)-2A-Puro-FES)를 공지된 프로토콜에 따라 제작하였다. 제조자의 정방향 트랜스펙션 프로토콜에 따라, 리포펙타민 LTX 및 PLUS 시약(Invitrogen)을 이용하여 플라스미드 트랜스펙션을 수행하였다. FES-KO 세포주를 제작하기 위해, A549 야생형 세포에 pSpCas9(BB)-2A-Puro-FES를 도입하고, 3일 동안 3 μg/mL 퓨로마이신으로 선별하였다. 이후, FES 유전자의 2개 복제본 모두에서 프레임 쉬프트 돌연변이를 갖는 단일 콜로니를 추가로 선별하였다. 시퀀싱 프라이머의 서열은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
시퀀싱 프라이머, 정방향 CTGACGACAGGACCTTTCCAG 서열번호 3
시퀀싱 프라이머, 역방향 AGGCTGCGCACATACTTGTC 서열번호 4
그 결과, 도 9A에 나타낸 바와 같이, FES의 웨스턴 블로팅를 통해, FES-KO 세포가 성공적으로 제작되었음을 확인하였다. 이후, FES 저해가 방사선 조사 후의 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해, 상기 제작된 FES-KO 세포를 이용하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 CCK-8 분석 및 집락형성 생존 분석법을 수행하였다.
그 결과, 도 9B에 나타낸 바와 같이, FES-야생형 A549 세포(FES-WT)와 비교하여, FES-KO A549 세포의 생존율 및 증식율의 유의적인 차이를 보이지는 않았으나, 도 9C에 나타낸 바와 같이, FES-WT 세포에 비해 FES-KO 세포의 방사선 민감도가 유의적으로 증가됨을 확인하였다. 또한, 도 9D에 나타낸 바와 같이, 집락형성 생존 분석법 결과, SER0.1값이 2.23으로, FES 불활성화에 의한 매우 유의적인 방사선 민감도 증진 효과를 확인할 수 있다.
또한, FES를 억제하는 것으로 알려진, 멀티-키나아제 저해제인 TAE684(Selleckchem)를 이용하여, 방사선 조사 후의 세포 생존율에 대한 FES 저해의 효과를 확인하였다. 구체적으로, A549 세포 및 MiaPaCa2 세포에 30 nM TAE684 또는 0.1%(v/v) DMSO를 12시간 동안 처리하고, 4 Gy의 방사선을 조사하였다. 3일 후, CCK-8 분석을 통해 세포 생존율을 분석하였다.
그 결과, 도 9E에 나타낸 바와 같이, FES 저해제인 TAE684를 처리한 경우, A549 세포 및 MiaPaCa2 세포 모두에서 4 Gy 용량의 방사선 조사에 따른 방사선-유도 세포 사멸이 유의적으로 증가됨을 확인하였다. 상기 결과로부터 FES 저해는 방사선 치료의 효능을 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
2-3. FES 저해에 의한 방사선-매개 세포 주기 정지 촉진, 및 증가된 DNA 손상에 의한 유사분열 카타스트로피(mitotic catastrophe) 확인
FES 저해에 의해, 방사선 조사 후 세포 사멸 메커니즘과 연관된 세포 주기 정지(Cell cycle arrest)를 확인하기 위해, 세포 주기 분포 분석을 수행하였다. 구체적으로, 4 Gy의 방사선 조사 전에, 48시간 동안 세포를 FES-siRNA 또는 대조군-siRNA를 도입하였다. 방사선 조사 24시간 후, 세포를 수득하고, 차가운 70% 에탄올로 2시간 동안 고정시켰다. 세포를 PI 2 mg/ml으로 라벨링하고, 어두운 상태에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 유세포 분석을 통해 분석하고, 데이터를 FlowJo V10 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, A549 세포 및 MiaCaPa2 세포에서 FES 넉다운 및 방사선 조사의 조합에 의해, sub-G1 분획, 및 G2/M기 정지가 증가됨을 확인하였다.
이후, 상기 결과에서 확인된 세포 주기 정지가 방사선 조사 후의 주요한 세포-사멸 메커니즘인 유사분열 카타스트로피를 일으키는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 세포를 8-웰 Lab-Tek 챔버 슬라이드(Nunc)에서 성장시키고, 방사선 조사하고, 4% 파라포름알데하이드로 8분 동안 고정시켰다. PBS로 고정액을 제거하고 세포를 헹군 후, 세포를 블로킹 용액(5% FBS, 0.02% 소듐 아지드, 및 0.3% Trixon-X-100)으로 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 1시간 동안 실온에서 세포를 1차 항체와 함께 인큐베이션하고, 그 다음 1시간 동안 Alexa Fluor 488- 또는 594-컨쥬게이트된 2차 항체(Thermofisher)와 함께 인큐베이션하였다. 형광 현미경 이미지를 위해, 0.5 μg/ml DAPI(4, 6,-diamidino-2-phenylinidole)를 함유한 마운팅 용액(75%(v/v) glycerol, 20 nM Tris, and 0.02%(w/v) NaN3)을 이용하여 세포를 커버하였다. Olympus IX70 도립 현미경이 구비된 DeltaVision Spectris 이미징 시스템(Applied Precision)을 면역 형광 이미지 수득을 위해 사용하였다. α-튜불린 항체(1:10000, T6047, Sigma)를 이용하여 시각화하여, 비정상적인 유사분열이 있는 세포 및 여러 덩어리로 되어있는(multilobulated) 거대 핵을 가진 세포를 유사분열 카타스트로피로 특징지었다. 그룹 당 적어도 100개의 세포에 대하여 계산하였고, 3번의 독립적인 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포와 비교하여, FES 넉다운 세포는 방사선 조사 후의 유사분열 카타스트로피가 유의적으로 증가됨을 확인하였다.
또한, FES 저해의 방사선-유도된 DNA 손상에 대한 효과를 확인하기 위해, 세포 내 DNA 이중가닥 절단에 의해 초기에 일어나는 주요 반응인, 인산화된 히스톤 H2AX(γH2AX)의 수준을 분석하였다. γH2AX 항체(1:800, #2577, Cell signaling)를 이용하여 시각화하여, 각각의 조건에서 적어도 100개의 세포에서 병소(foci)를 세었고, 방사선 조사 후 다양한 시간대에서 γH2AX 양성 세포를 정량화 하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포와 비교하여, FES 넉다운된 세포는 4 Gy의 방사선 조사 6시간 후, γH2AX 양성 세포의 수가 유의적으로 증가됨을 확인하였다. 상기 결과를 통해, FES 저해에 의해 방사선-유도 DNA 손상이 증가됨을 확인할 수 있다.
추가로, FES 저해의 방사선-유도된 DNA 손상에 대한 효과를 확인하기 위해, 단일세포 전기영동법(SCGE: single cell gel electrophoresis assay; Comet assay)을 수행하였다. 구체적으로, Oxiselect Comet Assay Kit(Cell Biolabs)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 DNA 손상을 평가하였다. 방사선 조사 6시간 후에 세포를 수득하고, Comet 아가로스와 1:10 비율로 혼합하고, 즉시 OxiSelect comet 슬라이드 상으로 옮겼다. 용해 완충액 및 알칼리성 용액으로 4℃에서 계단식 인큐베이션 후, 30분 동안 30V를 적용하여 알칼리성 전기영동을 수행하였다. 슬라이드를 중화 및 건조시킨 후, DNA를 VistaGreen DNA Dye로 15분 동안 염색하고, 형광 현미경으로 관찰하였다. OpenComet v1.3.1 open-source 소프트웨어를 사용하여 그룹 당 최소 50개의 comet들을 분석하고, DNA 손상의 표지로서 테일 모멘트(tail moment, tail의 길이에 대한 tail DNA 함량의 백분율)를 계산하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, A549 및 MiaPaCa2 세포주 모두에서, 대조군 세포와 비교하여 FES 넉다운에 의해 방사선에 의해 유도된 DNA 손상이 증가됨을 확인하였다.
종합하면, 상기 결과들을 통해 FES가 인간 암세포의 방사선-유도 DNA 손상 반응을 조절하는 역할을 수행함을 확인할 수 있다.
2-4. FES 저해에 의한 ROS 생산 촉진, 및 S6K-MDM2-p53 경로 활성화 확인
FES 저해에 의한 RAD51 및 Ku80와 같은 DNA 손상 복구 경로의 수행자(executor), 및 γH2AX의 단백질 발현 변화를 확인하기 위해, RAD51 항체(1:500, PC130, Calbiochem), Ku80 항체(1:1000, #2180, Cell signaling) 또는 γH2AX 항체(1:1000, #2577, Cell signaling)를 이용하여 웨스턴 블로팅을 수행하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포와 비교하여, FES 저해에 의해 주요한 DNA-복구 경로의 수행자인 RAD51 및 Ku80 발현의 변화는 없으나, γH2AX의 단백질 발현 수준이 증가됨을 확인하였다.
FES 저해에 의한 ROS 생산 촉진 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 과산화물에 의해 산화된 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(H2-DCFDA: 2',7'-dichlorofluorescein diacetate)에 의해 형성되는 DCF의 형광을 측정함으로써 생성된 ROS를 측정하였다. A549 세포에 방사선을 조사하고, 4시간 동안 인큐베이션한 후 수득하였다. 원심분리 및 HBSS(Welgene)으로 세척한 후, 표적 세포를 37℃에서 15분 동안 5μM DCFDA를 함유한 예열된(pre-warmed) HBSS로 재부유시키고, PBS로 인큐베이션된 세포는 음성 비염색된 대조군으로 사용하였다. 이들 세포는 5분 동안 14000 rpm에서 PBS로 2회 세척하고, 즉시 FITC 채널을 가진 FACS(BD Biosciences)를 사용하여 측정하였다. 상대적 형광 강도의 히스토그램은 ROS 수준을 비교하기 위해 사용하였다. 데이터는 Flow Jo V10 소프트웨어에 의해 분석하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 방사선 조사 후에 생성되는 ROS의 양은 FES-KO 세포에서 유의적으로 증가됨을 확인하였다. 또한, 방사선 조사의 용량이 증가될수록, 증가된 ROS의 양이 더 증가됨을 확인하였다. 상기 결과를 통해 FES 저해는 방사선 조사에 의해 유도된 ROS 생성을 증가시킴으로써, DNA 손상을 증가시키는 것임을 확인할 수 있다.
ROS-유도 S6K 인산화는 방사선-유도 신호 전파(signal propagation)의 매개체로서, 도 16A에 나타낸 바와 같이, 과산화수소 처리에 의한 ROS 축적에 따라 A549 세포에서 인산화된-S6K의 수준이 증가함을 확인할 수 있다. 이에, S6K 및 이의 기질인 MDM2의 발현 변화가 FES 저해 후에 방사선 민감도 증진 효과와 연관되는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, S6K/MDM2/p53 경로의 웨스턴 블로팅을 수행하였다. FES-siRNA가 도입되거나 도입되지 않은 세포에 6시간 동안 4 Gy의 방사선을 조사한 후, 단백질을 추출하였다. 핵 분획(nuc: nuclear fractionations)은 24시간 방사선 조사 후에 사용하였다.
그 결과, 도 16B에 나타낸 바와 같이, FES 넉다운 및 방사선 조사의 조합은 S6K 및 MDM2의 인산화를 증가시킴을 확인하였다. MDM2의 인산화는 방사선 조사 후 세포사멸(apoptosis)의 실행에 주요한 역할을 하는 것으로 알려진 p53의 핵에서의 축적을 수반함을 확인하였다. 즉, 상기 결과로부터, S6K/MDM2/p53 경로의 증가된 활성이 FES 넉다운과 방사선 조사의 시너지 효과의 메커니즘 중 하나임을 확인할 수 있다.
이에, ROS-매개된 S6K의 활성화가 FES-저해된 세포의 방사선 민감도 증진에 기여함을 확인하기 위하여, S6K 저해의 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, FES-siRNA가 도입되거나 도입되지 않은 세포에 PF-4708671에 의해 S6K를 선택적으로 저해한 경우의 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 세포는 4 Gy의 방사선 조사하고, 6시간 후에 단백질 샘플을 추출하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, FES-저해 세포에 선택적 S6K 저해제인 PF-4708671을 처리한 경우, PARP 절단의 유도 및 γH2AX의 발현을 완화시키고, 방사선 조사된 MiaPaCa2 세포에서 세포 생존율이 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과는 FES 넉다운에 의한 방사선 민감도 증긴 효과는 S6K 활성의 저해에 의해 부분적으로 역전될 수 있음을 나타내는 것이다.
종합하면, 도 18에 나타낸 바와 같이, 상기 결과로부터 FES-매개된 방사선 민감도 증진 효과는 인산화된-S6K에 의한 MDM2 활성의 저해를 통한 핵에서 p53의 축적과 연관된 것임을 확인할 수 있다.
<110> Seoul National University Industry Foundation Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Composition comprising FES inhibitor for enhancing radiation sensitivity <130> PN126113 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siFES-1 <400> 1 cgaggauccu gaagcagua 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siFES-2 <400> 2 gaaaguggau ggcccagcg 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer, forward <400> 3 ctgacgacag gacctttcca g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer, backward <400> 4 aggctgcgca catacttgtc 20

Claims (11)

  1. FES(Feline sarcoma oncogene) 저해제를 포함하는 개체의 암세포 방사선 민감도 증진용 약학적 조성물로서,
    상기 FES 저해제는 FES에 특이적인 siRNA, RNA 앱타머, 리보자임 또는 FES를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자이고,
    상기 조성물은 암의 치료시 방사선 조사와 병용하여 투여되는 것인, 개체의 암세포 방사선 민감도 증진용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 FES 저해제는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 약학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 췌장암, 폐암, 뇌척수암, 두경부암, 흉선종, 다발성 골수종, 급성 백혈병, 간암, 식도암, 위암, 대장암, 소장암, 구강암, 뇌종양, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 고환암, 혈액암, 림프종, 피부암, 건선 및 섬유선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 FES 저해제는 세포 주기를 조절하는 것을 통해 세포의 방사선 민감도를 증진시키는 것인 약학적 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 저해제는 활성 산소(ROS: Reactive Oxygen species)의 생산을 조절하는 것을 통해 세포의 방사선 민감도를 증진시키는 것인 약학적 조성물.
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