KR102080223B1 - xCT 억제제 내성암의 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CISD2 단백질의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 xCT 억제제에 대한 감수성 증진용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 xCT 억제제 투여 여부 결정에 대한 정보의 제공 방법 또는 xCT 억제제의 감수성 증진용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 xCT 억제제에 의해 유발된 페롭토시스 세포사멸에 대한 내성을 효율적으로 극복할 수 있게 하여 항암제 또는 항암 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

xCT 억제제 내성암의 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating xCT inhibitor- resistant cancer}
본 발명은 CISD2(CDGSH iron sulfur domain 2) 억제제를 포함하는 xCT(system xc -cystine/glutamate antiporter) 억제제에 대한 감수성 증진용 조성물에 관한 것이다.
설파살라진(Sulfasalazine, SAS)은 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염 및 크론 병을 포함하는 염증성 관절염 및 장 질환 치료에 널리 사용된다(Pouillon L et al., 2017). 상기 약물은 단일 요법 또는 다른 화학 요법 약물이나 방사선 요법과 병행하여 치료 저항성 암 세포의 사멸을 유도하기 위해 재사용되고 있다(Sleire L et al., 2015; Lo M et al., 2010; Shitara K et al., 2017). SAS는 xCT(system xc --cystine/glutamate antiporter)를 억제하여 항염증 및 항암 효과를 나타낸다(Guan J et al.,2009). xCT는 주요 세포 항산화 물질인 글루타티온(GSH)의 공급원으로 세포 내 글루타메이트에 대한 세포 외 시스틴을 교환한다(Dixon SJ et al., 2014). SAS-유도된 시스틴 결핍은 심각한 독성없이 세포 내 GSH의 현저한 감소와 생체 내 종양 성장을 현저하게 억제시킨다(Doxsee DW et al., 2007). SAS-유도된 xCT의 저해는 암세포를 최근 철 의존, non-apototic 세포 사멸의 형태로 알려진 ferroptosis로 감작시킨다(Dixon SJ et al., 2012).
Ferroptosis는 세포 사멸(apoptosis), 괴사(necroptosis) 및 autophagic 세포 사멸과 구분되며, 철의 축적 및 지질 과산화를 통해 세포가 사멸되는 새로운 형태이다. Ferroptosis와 관련된 주요 분자에는 xCT와 지질 과산화를 억제하는 ferroptosis의 필수 조절자인 글루타티온 퍼옥시다아제(GPX4)가 포함된다(Yang WS et al., 2014). xCT와 GPX4의 억제는 기존 화학 요법이나 방사선 요법에 저항성이 있는 암세포를 근절시킬 수 있다(Xie Y et al., 2016). xCT의 억제는 시스틴 uptake를 차단함으로써 GSH 결핍을 유도하고 암세포를 화학 요법 제제에 민감하게 만든다(Yoshikawa M et al., 2013; Liu DS et al., 2017). GPX4 억제는 또한 중간엽 치료 저항성으로, 잘 치료되지 않는 암세포를 ferroptotic cancer cell death로 가도록 민감하게 만든다(Hangauer MJ et al., 2017).
NAF-1(Nutrient-deprivation autophagy factor-1)은 CISD2(CDGSH iron sulfur domain 2)에 의해 암호화 되는, iron-sulfur (FeS) protein family 중 하나이다(Tamir S et al., 2013). 이 단백질은 2Fe-2S 클러스터를 apo-acceptor 단백질로 옮기고 철을 미토콘드리아로 옮겨 신경 발달, 골격근 유지 및 수명 연장에 중요한 역할을 한다(Chen YF et al., 2010). NAF-1 또는 mitoNEET의 과발현은 다양한 인간 암의 공격적인 표현형 및 임상 결과와 관련이 있으며, 그 발현의 침묵은 종양 증식을 억제한다(Sohn YS et al., 2013; Wang L et al., 2016; Chen B et al., 2015; Yang L et al., 2016). mitoNEET은 최근 mitochondrial lipid peroxidation을 예방하는 ferroptotic cancer cell death의 음성 조절자로 보고되었다(Yuan H et al., 2016).
xCT 억제에 대한 내성은 치료 저항성 암세포가 ferroptosis를 포함한 세포사를 회피할 수 있게 한다. NAF-1은 mitoNEET과 상호 작용하는 단백질로서 ferroptotic cancer cell death에 대한 내성 메커니즘에 관여할 가능성이 있다. ferroptosis에 대한 내성의 기전에 대한 더 깊은 이해는 암 저항을 극복하기 위한 새로운 접근법의 실행을 용이하게 할 것이다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
1. Pouillon L, Bossuyt P, Vanderstukken J, Moulin D, Netter P, Danese S, et al.Management of patients with inflammatory bowel disease and spondyloarthritis. Expert review of clinical pharmacology 2017;10:1363-74 Sleire L, Skeie BS, Netland IA, Forde HE, Dodoo E, Selheim F, et al.Drug repurposing: sulfasalazine sensitizes gliomas to gamma knife radiosurgery by blocking cystine uptake through system Xc-, leading to glutathione depletion. Oncogene 2015;34:5951-9 Lo M, Ling V, Low C, Wang YZ, Gout PW. Potential use of the anti-inflammatory drug, sulfasalazine, for targeted therapy of pancreatic cancer. Current oncology (Toronto, Ont) 2010;17:9-16 Shitara K, Doi T, Nagano O, Fukutani M, Hasegawa H, Nomura S, et al.Phase 1 study of sulfasalazine and cisplatin for patients with CD44v-positive gastric cancer refractory to cisplatin (EPOC1407). Gastric cancer : official journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association 2017;20:1004-9 Guan J, Lo M, Dockery P, Mahon S, Karp CM, Buckley AR, et al.The xc- cystine/glutamate antiporter as a potential therapeutic target for small-cell lung cancer: use of sulfasalazine. Cancer chemotherapy and pharmacology 2009;64:463-72 Dixon SJ, Patel DN, Welsch M, Skouta R, Lee ED, Hayano M, et al.Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis. eLife 2014;3:e02523 Doxsee DW, Gout PW, Kurita T, Lo M, Buckley AR, Wang Y, et al.Sulfasalazine-induced cystine starvation: potential use for prostate cancer therapy. The Prostate 2007;67:162-71 Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, et al.Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell 2012;149:1060-72 Yang WS, SriRamaratnam R, Welsch ME, Shimada K, Skouta R, Viswanathan VS, et al.Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell 2014;156:317-31 Xie Y, Hou W, Song X, Yu Y, Huang J, Sun X, et al.Ferroptosis: process and function. Cell death and differentiation 2016;23:369-79 Yoshikawa M, Tsuchihashi K, Ishimoto T, Yae T, Motohara T, Sugihara E, et al.xCT inhibition depletes CD44v-expressing tumor cells that are resistant to EGFR-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer research 2013;73:1855-66 Liu DS, Duong CP, Haupt S, Montgomery KG, House CM, Azar WJ, et al.Inhibiting the system xC(-)/glutathione axis selectively targets cancers with mutant-p53 accumulation. Nature communications 2017;8:14844 Hangauer MJ, Viswanathan VS, Ryan MJ, Bole D, Eaton JK, Matov A, et al.Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition. Nature 2017;551:247-50 Tamir S, Zuris JA, Agranat L, Lipper CH, Conlan AR, Michaeli D, et al.Nutrient-deprivation autophagy factor-1 (NAF-1): biochemical properties of a novel cellular target for anti-diabetic drugs. PloS one 2013;8:e61202 Chen YF, Wu CY, Kirby R, Kao CH, Tsai TF. A role for the CISD2 gene in lifespan control and human disease. Annals of the New York Academy of Sciences 2010;1201:58-64 Sohn YS, Tamir S, Song L, Michaeli D, Matouk I, Conlan AR, et al.NAF-1 and mitoNEET are central to human breast cancer proliferation by maintaining mitochondrial homeostasis and promoting tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2013;110:14676-81 Wang L, Ouyang F, Liu X, Wu S, Wu HM, Xu Y, et al.Overexpressed CISD2 has prognostic value in human gastric cancer and promotes gastric cancer cell proliferation and tumorigenesis via AKT signaling pathway. Oncotarget 2016;7:3791-805 Chen B, Shen S, Wu J, Hua Y, Kuang M, Li S, et al.CISD2 associated with proliferation indicates negative prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. International journal of clinical and experimental pathology 2015;8:13725-38 Yang L, Hong S, Wang Y, He Z, Liang S, Chen H, et al.A novel prognostic score model incorporating CDGSH iron sulfur domain2 (CISD2) predicts risk of disease progression in laryngeal squamous cell carcinoma. Oncotarget 2016;7:22720-32 Yuan H, Li X, Zhang X, Kang R, Tang D. CISD1 inhibits ferroptosis by protection against mitochondrial lipid peroxidation. Biochemical and biophysical research communications 2016;478:838-44
본 발명자들은 기존의 암 치료제로 유용한 xCT 억제제가 페롭토시스를 포함하는 세포사와 관련하여 내성을 획득하는 기전을 밝히고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, CISD2의 과발현은 xCT 억제제의 페롭토시스에 대한 내성을 부여하며, CISD2를 억제할 경우 상기 xCT 억제제에 의해 유발된 페롭토시스 내성을 극복할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 CISD2 단백질의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 xCT 억제제에 대한 감수성 증진용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 CISD2 단백질의 활성 억제제 또는 발현 억제제, 및 xCT 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 CISD2 단백질의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 xCT 억제제 내성암에 대한 항암 보조제를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 xCT 억제제 투여 여부 결정에 대한 정보의 제공 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 xCT 억제제의 감수성 증진용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 CISD2(CDGSH iron sulfur domain 2) 단백질의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 xCT(system xc -cystine/glutamate antiporter) 억제제에 대한 감수성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 xCT 억제제가 페롭토시스를 포함하는 세포사와 관련하여 내성을 획득하는 기전을 밝히던 중 CISD2의 과발현이 xCT 억제제의 페롭토시스에 대한 내성을 부여하며, CISD2를 억제할 경우 상기 xCT 억제제에 의해 유발된 페롭토시스 내성을 극복할 수 있음을 확인하였다.
상기 xCT 억제제는 제한되지 않으나, 바람직하게는 설파살라진(Sulfasalazine, SAS), 카르복시페닐글라이신(carboxyphenylglycine, CPG), 이라스틴(Erastin), 글루탐산모노나트륨(monosodium glutamate), 아미노아디페이트(aminoadipate), 아미노피멜레이트(aminopimelate), 호모시스테아트(homocysteate), L-세린-O-설페이트(L-serine-O-sulphate), 이보테네이트(ibotenate), 브로모호모이보테네이트(bromohomoibotenate) 및 퀴스퀄레이트(quisqualate)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
상기 CISD2 단백질의 활성 억제제 또는 발현 억제제는 xCT 억제제의 감수성을 증진시키는 것을 특징으로 한다.
상기 CISD2 단백질의 발현 억제제는 CISD2 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 및 miRNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 CISD2 단백질의 활성 억제제는 CISD2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체, 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 CISD2 단백질의 활성 억제제로서 CISD2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물은 바람직하게는 티아졸리딘디온(thiazolidinedione)이며, 보다 바람직하게는 피오글리타존(pioglitazone, PGZ) 또는 로지글리타존(rosiglitazone, RGZ)인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 xCT 억제제를 이용하여 암 질환을 치료할 때 사용되는 것이다.
상기 암은 바람직하게는 두경부 암(head and neck cancer), 폐암, 난소암, 대장암, 결장암, 췌장암, 간암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 자궁암, 방광암 및 혈액암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며, 보다 바람직하게는 두경부 암, 폐암, 난소암 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
안티센스 뉴클레오티드
안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포주흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
펩티드 미메틱스 (Peptide Minetics )
상기 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)는 CISD2 활성을 이끄는 CISD2 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드이다. 비가수분해성 펩티드 유사체의 주요 잔기로는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al. Tetrahedron Lett 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al. J Med chem 29:295, 1986; 및 Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th AmeriCan Peptide Symposium) Pierce chemiCal co. Rockland, IL, 1985), 아제핀(Huffman et al. in Peptides: chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., EScOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 벤조디아제핀(Freidinger et al. in Peptides; chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., EScOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-아미노알콜(Gordon et al. Biochem Biophys Res commun 126:419 1985) 및 치환 감마 락탐환(Garvey et al. in Peptides: chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., EScOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988)을 사용하여 생성할 수 있다.
siRNA 분자
센스 RNA와 안티센스 RNA가 이중가닥 RNA 분자를 형성하고, 이때 센스 RNA가 CISD2 mRNA 중 일부의 연속 뉴클레오티드의 표적 서열과 동일한 핵산 서열을 포함하는 siRNA 분자인 것이 바람직하다. 상기 siRNA 분자는 CISD2 유전자의 염기서열 내에서 선택되는 10개 내지 30개의 염기로 구성되는 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정된 것은 아니며, CISD2 유전자의 염기서열을 대상으로 상보적으로 결합할 수 있는 센스 서열을 가진 이중가닥 RNA 분자라면 모두 사용 가능하다. 상기 안티센스 서열은 센스 서열과 상보적인 서열을 가지는 것이 가장 바람직하다.
항체
CISD2 항체는 CISD2 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다.
다클론 항체는 상기 CISD2를 동물에 주사하고, 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개, 닭 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.
단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포주 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; cote RJ et al., Proc Natl ACad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 cole SP et al., Mol cell Biol 62:109-120, 1984).
또한, 상기 CISD2에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게 하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al., Science 254: 1275-1281, 1989).
상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.
앱타머 ( Aptamer )
앱타머(Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 앱타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 앱타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후(Ellington, AD and Szostak, JW., Nature 346:818-822, 1990), 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 앱타머들이 계속해서 발굴되었다. 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체 항체로서의 높은 가능성이 있다.
본 발명의 일 실시예에서, xCT 억제제에 내성을 보이는 대장암 세포주에 CISD2 siRNA를 처리하였을 때 세포사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 더욱이, 종양을 이식한 마우스에서 CISD2 억제제와 xCT 억제제를 주입하였을 때, 생체 내 종양의 성장이 유의하게 억제되었다. 따라서, CISD2 단백질 발현 또는 활성 억제제는 xCT 억제제에 대한 감수성 증진용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 조성물은 CISD2 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.
상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여 시 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사, 자궁 내 경막주사, 뇌혈관 내 주사 또는 흉부 내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 CISD2(CDGSH iron sulfur domain 2) 단백질의 활성 억제제 또는 발현 억제제, 및 xCT(system xc -cystine/glutamate antiporter) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 CISD2(CDGSH iron sulfur domain 2) 단백질의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 xCT(system xc -cystine/glutamate antiporter) 억제제 내성암에 대한 항암 보조제를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 CISD2 단백질의 활성 억제제 또는 발현 억제제, 및 xCT 억제제에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 기재를 생략한다.
상기 항암 보조제는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사, 자궁 내 경막주사, 뇌혈관 내 주사 또는 흉부 내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 항암 보조제는 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 항암 보조제의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 항암 보조제는 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항암 보조제를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 CISD2 발현 또는 활성 억제제를 xCT 억제제와 함께 처리하였을 때, xCT 억제제에 내성을 갖고 있는 두경부암 세포주의 암 특이적인 세포사멸이 증가하였다. 또한, 본 발명에 따른 CISD2 발현 또는 활성 억제제의 암 특이적인 세포 사멸의 생체 내(in vivo) 효과가 종양을 이식한 마우스모델에서 관찰되었다.
따라서, 본 발명에 따른 CISD2 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 항암 보조제는 암 치료 또는 예방용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.
상기 암 치료 또는 예방용 조성물은 CISD2 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 xCT(system xc -cystine/glutamate antiporter) 억제제 투여 여부 결정에 대한 정보의 제공 방법을 제공한다:
(a) 암 환자로부터 분리된 시료 내에 존재하는 CISD2(CDGSH iron sulfur domain 2) 단백질의 활성 또는 발현 정도를 측정하는 단계; 및
(b) 상기 환자로부터 분리된 시료 내에 존재하는 CISD2 단백질의 활성 또는 발현 정도가 정상인 또는 xCT 억제제 비내성 환자의 것과 비교하여 유의하게 높지 않은 경우 xCT 억제제 투여가 가능하다고 판단하는 단계.
본 발명자들은 xCT 억제제에 대한 내성을 갖고 있는 암세포주의 경우 그렇지 않은 세포주와 비교하여 CISD2 mRNA와 단백질의 수준이 유의하게 높았음을 확인하였다. 따라서, CISD2 단백질의 활성 또는 발현 정도를 비교할 경우 xCT 억제제에 대한 투여여부를 결정하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명에서 피검자(환자 또는 정상인)는 제한되지 않으며, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간, 래트, 마우스, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 포유류, 가장 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 방법이 포함하는 샘플은 피검자로부터 자연적 또는 인위적으로 분리되어 피검자의 CISD2 관련 유전정보를 포함하는 한 제한되지 않으며, 바람직하게는 체외로 분리된 분변, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 모발 또는 뇨 등으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 xCT(system xc -cystine/glutamate antiporter) 억제제의 감수성 증진용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) CISD2(CDGSH iron sulfur domain 2) 단백질을 포함하는 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 후보물질이 처리된 CISD2 단백질의 활성 또는 발현 정도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 후보물질 처리에 의해 CISD2 단백질의 활성이 저하되거나, CISD2 단백질의 발현이 감소될 경우 xCT 억제제의 감수성을 증가시킬 수 있는 물질로 판단하는 단계.
상기 후보물질은 CISD2 단백질의 활성을 억제하거나 발현을 억제할 수 있어서, xCT 억제제의 감수성을 증진시키는 것을 특징으로 한다.
상기 CISD2 단백질의 발현을 억제할 수 있는 후보물질은 CISD2 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 및 miRNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 CISD2 단백질의 활성을 억제할 수 있는 후보물질은 CISD2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체, 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 CISD2 단백질의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 xCT 억제제에 대한 감수성 증진용 조성물을 제공한다.
(ⅱ) 또한, 본 발명은 xCT 억제제 투여 여부 결정에 대한 정보의 제공 방법 또는 xCT 억제제의 감수성 증진용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
(ⅲ) 본 발명의 조성물은 xCT 억제제에 의해 유발된 페롭토시스 세포사멸에 대한 내성을 효율적으로 극복할 수 있게 하여 항암제 또는 항암 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 SAS가 HNC에서 여러 수준의 ferroptotic 세포 사멸을 유도하는 결과를 나타낸 것이다. ((A, B) 다른 농도의 sulfasalazine (SAS)에 72 시간 동안 노출 된 HNC 세포의 생존 가능성. (C) 0.5 및 1 mM SAS에 72 시간 동안 노출된 PI 양성 세포를 염색하고 형광 현미경으로 계수하고 유동 세포 계측법으로 분석한 결과. NT는 SAS로 처리하지 않은 디메틸 술폭사이드 대조군. (D) 0.5 mM 트롤록스 전처리 유무에 관계없이 12시간 동안 SAS에 노출된 HN10 및 HN11 세포에서의 세포 글루타티온(GSH) 측정. (E) 12 시간 동안 1mM SAS에 노출된 HNC 세포의 세포 지질 ROS 수준의 변화. 세포는 또한 deferoxamine(DFO, 100 mM), ferrostatin-1(Fer-1, 20 μM) 또는 알파 토코페롤(αTP, 1 mM)로 전처리됨. 에러바는 세 번의 반복의 표준 에러를 나타냄. *: 대조군 또는 다른 처리군 비교해 P <0.01)
도 2는 CISD2 발현은 ferroptotic cancer cell death에 대한 내성과 관련이있다는 결과를 나타낸 것이다. ((A, B) HN10 및 HN11 세포에서의 CISD2 mRNA 및 단백질의 수준. (C) 로다민 B-[(1,10-페난트롤린-5-일)-아미노카르보닐] 벤질 에스테르 (0.5 및 1 mM SAS로 24 시간 처리한 세포에서의 RPA)를 사용하여 측정한 미토콘드리아 철의 축적. (D, E) 24 시간 동안 SAS에 노출된 HNC 세포에서 미토콘드리아 MDA와 철 이온 농도를 측정한 결과. (F) 24시간 동안 SAS에 노출시킨 후 TMRE(tetramethylrhodamine ethyl ester)를 사용하여 ΔΨM을 측정한 결과. *: 그룹간 비교해 P <0.01)
도 3은 CISD2 과발현이 ferroptotic cancer cell death에 대한 내성을 유도한다는 결과를 나타낸 것이다. ((A, B) CISD2 유전자 transfection에 의해 유도된 CISD2 과발현이 SAS-민감성 HN11 세포의 세포 성장 변화에 미치는 영향. (C-E) 벡터 대조군(vtr) 또는 CISD2 과발현 벡터로 형질 감염된 HN11 세포에서 세포질 지질 ROS, 미토콘드리아 MDA 및 RPA를 측정한 다음, 0.5 및 1 mM SAS에 24시간 동안 노출시킨 결과. *: 그룹간 비교해 P <0.01. (F) 유전자가 형질 감염된 HN11 세포에서 0.5 또는 1 mM SAS, 10 μM PGZ에 노출되거나 siCISD2로 형질 감염시 PI 양성 분획의 측정결과. *: 대조군 또는 두 군간에 비교해 P <0.01, **: 대조군 또는 두 군간에 비교해 P <0.001)
도 4는 CISD2의 저해가 ferroptotic cancer cell death에 대한 내성을 역전시키는 결과를 나타낸 것이다. ((A-C) SAS 내성 HN10 세포를 siRNA 대조군(siCtr) 또는 siCISD2로 형질 감염시킴. SAS의 부재 또는 존재 하에서의 형질 감염 후 mRNA 발현량(A), 세포 수 변화(B) 및 PI 양성 세포 수(C)를 측정한 결과. (D-E) siCtr 또는 siCISD2로 형질 감염된 HN10 세포에서 0.5 및 1 mM SAS에 24 시간 동안 노출시킨 다음 미토콘드리아 MDA, RPA, 철 이온 및 ΔΨM을 측정한 결과. *: 그룹간 비교해 P <0.01)
도 5는 PGZ가 ferroptotic cancer cell death에 대한 내성을 가진 HNC 세포의 성장을 억제하는 결과를 나타낸 것이다. ((A) 10 μm PGZ 유무에 관계없이 1 mM SAS에 노출 된 HN10 세포의 성장. (B - F) 10 μM PGZ을 단독으로 또는 0.5 및 1 mM SAS와 조합하여 HN10 세포에 노출 시킨 후, PI 양성, 지질 ROS, RPA, 및 mitosox 수준을 측정한 결과. *: 그룹간 비교해 P <0.01)
도 6은 PGZ가 in vivo에서 SAS 처리에 대해 HNC 세포를 민감하게 하는 결과를 나타낸다. ((A-C) HN10 세포를 이식한 누드 마우스의 종양 크기과 무게 및 체중 변화를 나타냄. 이 마우스는 비히클 (NT), SAS, PGZ 또는 이들의 조합에 대한 다른 처치를 받음. (D, E) 지질 ROS 및 RPA의 측정. (F) 이식된 종양에서 γH2AX 형성(붉은 색)의 면역형광염색. 다르게 처리된 종양 간 AU 비교. 에러바는 표준 에러를 나타냄. *: 대조군이나 다른 처치군 비교해 P <0.05, **: 대조군이나 다른 처치군 비교해 P <0.01.)
도 7은 CISD2 억제제로서 대표적인 티아졸리딘디온 계열의 약물인 PGZ 또는 RGZ가 다양한 암세포에서 SAS에 의해 유도된 ferroptosis를 향상시키는지를 확인한 결과이다.
도 8은 CISD2 억제제로서 대표적인 티아졸리딘디온 계열의 약물인 PGZ 또는 RGZ가 다양한 암세포에서 이라스틴에 의해 유도된 ferroptosis를 향상시키는지를 확인한 결과이다.
도 9는 CISD2 억제는 HNC 세포에서 SAS-유도된 ferroptosis에 대한 내성을 역전시키는 기전을 나타낸다. SAS는 xCT의 억제와 GSH의 고갈을 통해 암세포에서 ferroptosis를 유도한다. 그러나, 증가된 CISD2 발현은 미토콘드리아 철 이온의 감소 된 수준을 통한 ferroptosis 내성에 기여한다. CISD2의 유전적 저해 또는 PGZ의 사용은 미토콘드리아에서 철 이온 수준을 증가시켜 SAS에 대한 암세포의 ferroptosis 저항성을 역전시킨다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험재료 및 방법
1. 세포배양 및 시약
본 연구에는 아산병원의 HNC 세포주(AMC-HN2-11)(Kim et al., Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines, Acta oto-laryngologica 1997;117:775-84) 및 SNU 세포주(SNU-1041, -1066, 및 -1076)를 이용하였으며, 상기 세포주들은 한국세포주은행(서울, 한국)에서 구입하였다. 또한, A549, HCT116 및 SKOV3 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 상기 세포주들은 STR(short tandem repeat)-기반 DNA 핑거프린팅 및 멀티플렉스 PCR을 이용하여 검증하였다. 세포들을 10% FBS가 첨가된 EMEM(Eagle’s minimum essential medium) 또는 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 지정된 시간 및 용량에 따라 xCT 억제제의 대표 약물인 SAS(sulfasalazine, sc-204312, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 또는 Erastin (Sellechem; Houston, TX, USA)과 티아졸리딘디온(thiazolidinedione) 계열의 대표 약물인 PGZ(pioglitazone; E6910, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 또는 RGZ(rosiglitazone; Sigma-Aldrich; St. Louise, MO, USA)를 상기 세포에 처리하였다.
2. 세포 생존능 및 세포사멸 분석
상기 세포들은 SAS 또는 PGZ, 또는 이의 조합에 노출시킨 후, MTT(3-(4,5- 디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드, Sigma-Aldrich), 트립판블루 (trypan blue) exclusion 및 PI(propidium iodide) 염색법을 이용하여 72시간동안 세포 생존력 및 세포 사멸 정도를 분석하였다. 대조군 세포는 동량의 DMSO(dimethyl sulfoxide )에 노출시켰다. 세포를 MTT로 4시간 동안 인큐베이션 한 다음, 가용화 완충액으로 2시간 동안 인큐베이션하였다. SpectraMax M2 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 트립판 블루 exclusion 시험은 0.4% 트립판 블루 염색 및 헤모사이토미터를 통한 계수를 포함하였다. PI 염색을 위해, 샘플을 PBS로 2회 세척하고, PBS (각각의 플레이트는 30분 동안)에 2.5 μg/ml 요오드화 프로피듐(Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 염색된 세포를 CellQuest Pro(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)가 장착 된 FACSCalibur 유세포계측기를 사용하여 분석하고, ZEISS 형광 현미경(Oberkochen Germany) 하에서 관찰하였다. 각 군의 평균 형광강도는 대조군의 평균 형광 강도로 표준화하였다.
3. GSH 및 ROS 수준과 지질 과산화 분석
HNC 세포 용해물의 세포 GSH 수준은 GSH 비색 검출 키트(BioVision Inc., Milpitas, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. HNC 세포 용해물의 상층액에서 세포 활성 산소종(ROS)의 생성은 2 μM의 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCF-DA)(cytosolic ROS, Enzo Life Sciences, Farmingdale, -BODIPY C11 (lipid peroxidation; Thermo Fisher Scientific)을 37℃에서 30분간 처리하여 평가하였다. CellQuest Pro(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)가 장착된 FACSCalibur 유세포 계측기로 ROS 수준을 분석하였다. HNC 세포 용해물의 세포질 지질 과산화는 lipid peroxidation assay kit(Sigma-Aldrich)를 사용하여 지질 과산화의 최종 생성물인 말론디알데히드(MDA)의 농도를 측정하여 평가하였다.
4. 미토콘드리아 분리, 철, 슈퍼 옥사이드 생성 및 멤브레인 전위 분석
미토콘드리아는 미토콘드리아 분리 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분리하였다. 세포 또는 미토콘드리아 내 제 1 철 수준은 철 분석 키트 (Sigma-Aldrich)를 사용하여 측정하였다. 미토콘드리아 철의 축적 수준은 로다민 B-[(1,10- 페난트롤린-5-일)-아미노카르보닐]벤질 에스테르(RPA), 형광 무독성 철 센서 (Enzo Biochem, Inc., Farmingdale, NY, USA)를 이용하여 측정하였다. Mitochondrial superoxide 생성은 생존 암 세포에서 mitoSOX (Thermo Fisher Scientific)로 평가하였다. AU(Arbitrary fluorescence units)은 다르게 처리된 군 간 비교 하였다. 미토콘드리아 막 전위(ΔΨm)는 200 nM 테트라메틸 로다민 에틸 에스테르 (TMRE, Thermo Fisher Scientific)로 20분 동안 염색함으로써 측정하였다. 각 군의 평균 형광 강도는 대조군의 평균 형광 강도로 표준화하였다.
5. RNA 간섭 및 유전자 형질감염
CISD2를 침묵(silence)시키기 위해, SAS-내성 HN10 세포를 시딩하였다. 24 시간 후에 인간 CISD2 또는 scrambled control siRNA (TriFECTa® RNAi 키트, Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA)를 표적으로 하는 10 nmol/L의 small interfering RNA (siRNA)로 세포를 형질 감염시켰다. SensiFASTTM SYBR® No-ROX 키트 (Bioline International, Toronto, Canada)를 사용하여 1-2 μg total RNA (각 시료)에서 siRNA가 유도된 유전자 침묵을 RT-qPCR(reverse transcription-quantitative PCR)을 통해 확인하였다. 이것은 SensiFASTTM cDNA 합성 키트 (Bioline International)로 cDNA를 합성하고 항-NAF-1 항체로 웨스턴 블랏팅한 후에 수행하였다. CISD2를 안정적으로 과발현하는 세포를 생성하기 위해, HN11 세포를 대조 플라스미드 또는 CISD2-발현 플라스미드 (Transomic, Huntsville, AL, USA)로 안정적으로 형질감염시켰다. CISD2 과발현은 RT-qPCR 및 웨스턴 블랏팅을 이용하여 확인하였다.
6. 면역블롯팅
세포를 플레이팅하고, 70 % 컨플루언트로 성장시킨 다음, 지시된 약물로 처리하였다. 세포를 프로테아제/포스파타제 억제제 칵테일 (Cell Signaling Technology)을 포함하는 세포 용해 완충액 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)에서 4℃로 용해시켰다. 총 5-15 μg의 단백질을 10%-15% 겔에서 SDS-PAGE로 분석하고, 니트로셀룰로스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 옮기고, 1 차 및 2 차 항체로 프로빙하였다. 1차 항체는 다음의 것을 사용하였다: NAF-1 (60758S, Cell Signaling Technology), GPX4 (ab125066, Abcam, Cambridge, MA, USA), Bcl-2 (B 세포 림프종 2, ab117115, Abcam), NCOA4 (nuclear receptor coactivator 4; A302-272A, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA), beclin-1 (4122s, Cell Signaling Technology), FTH1 (ferritin heavy chain 1; 4393, Cell Signaling Technology). β- 액틴 (BS6007M, BioWorld, Atlanta, GA, USA)을 총 로딩 컨트롤로 사용하였다. 모든 항체를 1 : 500 내지 1 : 10000으로 희석하였다.
7. 종양 제노그래프트
모든 동물 연구 절차는 아산병원의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행하였다. 6 주된 무균성 BALB/c 수컷 누드 마우스(nu/nu)를 중앙살험동물(주)(서울, 대한민국)로부터 구입하였다. SAS-내성 HN10 세포를 누드 마우스의 측면에 피하 주사하였다. 종양 임플란트에서 결절이 발견 된 후, 상기 마우스들을 하기의 다른 처치를 수행하였다: 비히클, SAS (250 mg/kg/일 복강 내 투여), PGZ (20 mg/kg/일 경구 투여), 또는 SAS와 PGZ 동시투여. 각 군은 10 마리의 마우스를 포함하였다. 각 마우스의 종양 크기 및 무게를 일주일에 두 번 측정하였고, 부피는 (길이×폭2)/2로 계산하였다. 마우스를 희생시키고 종양을 분리하고 세포질 지질 ROS 및 미토콘드리아 철 수준 및 γH2AX의 면역 형광 염색으로 분석하였다. 다르게 처치된 종양 간 AU(Arbitrary fluorescence units)를 비교 하였다.
8. 두경부 암 이외 다양한 암 세포주에서의 ferroptosis 효과 측정
상기 SAS 또는 SAS+PGZ를 이용한 실험과 마찬가지 조건으로, xCT 억제제의 대표 약물인 SAS 또는 Erastin을 이용하여 티아졸리딘디온 계열의 대표 약물인 PGZ 또는 RGZ와 조합하여 상기 두경부 암 세포주를 포함하는 다양한 암 세포주(폐암(A459), 대장암(HCT 116), 난소암(SKOV3))에서의 세포 생존능을 시험하였다.
9. 통계분석
자료는 평균 ± 표준 오차로 나타내었다. 처리 그룹 간의 차이에 대한 통계적 유의성은 Mann-Whitney U-test 또는 Bonferroni post-hoc test와 함께 ANOVA 분석을 사용하여 평가하였다. Windows(IBM, Armonk, NY, USA)용 통계 소프트웨어 인 IBM® SPSS® Statistics 버전 24.0이 사용되었다. 통계적 유의성은 two-sided P value < 0.05으로 정의하였다.
실험결과
1. SAS는 HNC에서 여러 수준의 ferroptotic 세포 사멸을 유도
SAS는 농도 의존적 *?**?*방식으로 HNC 세포의 생존력을 감소시켰으며, HN9 및 HN11 세포가 가장 높은 감도를 나타내고 HN10 세포가 가장 낮은 (P <0.01) 감도를 나타내었다(도 1A 및 1B). SAS의 IC50은 다음 실험 (0.95 vs 0.17 mM, P <0.01)을 위해 선택된 HN10 및 HN11 세포주간에 유의한 차이가 있었다. 증가된 PI 염색은 HN11 세포에서 관찰되었지만 0.5 mM SAS (P <0.01) (도 1C)로 처리했을 때 HN10 세포에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 그러나 GSH 수준은 SAS 처리 후 HN10 및 HN11 세포 모두에서 유의하게 감소하였으나, 항산화제 트롤록스(trolox) (P <0.01)로 전처리한 경우 회복되었다(도 1D). 세포 지질 ROS의 수준은 1 mM SAS로 12시간 처리한 SAS 민감성 HN11 세포에서 유의하게 증가했다(P <0.01)(도 1E). HNC 세포에서 SAS 처리에 의해 유도된 세포 사멸 및 지질 ROS는 ferroptotic 세포사의 전형적인 패턴을 나타내는 iron chelator deferoxamine, ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 또는 α-tocopherol로 전처리함으로써 역전되었다.
2. CISD2 발현은 ferroptotic 암세포 사멸에 대한 내성과 연관되어 있음
CISD2 mRNA와 단백질의 수준은 SAS-내성 HN10 세포에서 SAS-민감성 HN11 세포보다 유의하게 높았다(P <0.01)(도 2A-2B). 24 시간동안 SAS에 노출시킨 후 RPA 분석으로 측정한 미토콘드리아 철량은 HN11 세포에서는 유의하게 증가했지만 HN10 세포에서는 유의적으로 증가하지 않았다(P <0.01)(도 2C). 미토콘드리아 MDA와 철 이온의 수준 또한 HN11 세포에서 유의하게 증가하는 반면, ΔΨM은 HN11 세포에서는 유의하게 감소했지만 HN10 세포에서는 유의적으로 감소하지 않았다 (P <0.01) (도 2D-2F). 모든 변화는 철 킬레이터 deferoxamine으로 전처리함으로써 역전되었다.
우리는 다음으로 CISD2 과발현이 SAS-민감성 HN11 세포의 성장과 생존에 미치는 영향을 조사했다. CISD2 과발현은 암 세포에서의 CISD2 유전자 전달에 의해 유도 될 수 있다. CISD2 과발현은 CISD2-형질감염된 HN11 세포가 ferroptotic 세포 사멸에 대한 저항성을 유도하고, SAS 처리에 의해 감소*?**?*된 암세포 성장의 회복으로 나타났다(도 3A-3B). CISD2로 형질 감염된 HN11 세포에서 세포질 지질 ROS, 미토콘드리아 MDA 및 미토콘드리아 철의 수준이 유의하게 감소했다(P <0.01) (도 3C-3E). 세포 사멸 또한 유의하게 감소했지만(P <0.01), CISD2 유전자의 침묵 또는 10 μM 피오글리타존(pioglitazone)과의 병용 처리에 의해 역전되었다 (도 3F).
3. CISD2 저해는 ferroptotic 암세포 사멸에 대한 내성을 역전시킴
CISD2 유전자의 침묵은 SAS-내성, siCISD2-형질 감염된 HN10 세포의 성장을 유의하게 감소시켰다(P <0.01) (도 4A-4B). SAS 처리는 증가된 양성 PI 염색 (도 4C)에 의해 밝혀진 바와 같이, 벡터 대조군에 비해 siCISD2- 형질 감염된 HN10 세포의 사멸을 유도했다. MDA, RPA 및 철 이온의 미토콘드리아 수준은 siCISD2로 형질 감염된 HN10 세포에서 유의하게 증가했다(P <0.01)(도 4D-4F). ΔΨM은 siCISD2-침묵된 세포에서 유의하게 감소하였다(P <0.01)(도 4E).
NAF-1은 ER(endoplasmic reticulum)과 mitochondrial outer membrane 모두에 위치하고 있으며, ER에서 Beclin-1 의존성 autophagy의 Bcl-2-유도된 길항작용(antagonism)의 매개체로서 세포 autophagy에서 역할을 한다. 또한, NCOA4는 autophagosomes의 이중 막에 매우 풍부하게 존재하며 ferritin (ferritinophagy)의오토파지 회전율에 대한 선택적 카고 수용체(cargo receptor) 역할을 한다. 따라서 siCISD2 또는 si control-형질 감염된 HNC 세포에서 ferritinophagy와 관련된 단백질의 발현을 조사하였다. Western blot 분석 결과, 용량 의존적으로 siCISD2 및 si control-형질 감염된 HN10 세포에서 GPX4 발현이 유의하게 감소하였다. 그러나 NCOA4, beclin-1, Bcl-2 및 FTH1 단백질의 발현은 siCISD2-형질 감염된 HN10 세포에서 유의하게 감소하였지만, 벡터 대조군에서는 유의한 변화가 없었다. NCOA4는 siCISD2-형질 감염된 세포를 SAS로 처리함으로써 세포질에 고도로 국한되었다.
피오글리타존(pioglitazone, PGZ)은 티아졸리딘디온(thiazolidinedione, TZD) 약물로 인슐린 감수성을 높이고 지방 세포 분화를 유도하며 암 세포 증식을 억제하는 PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 리간드 약물이다(Kole L etl al., 2016). 또한, PGZ는 NAF-1이 2Fe-2S 클러스터를 apo-acceptor 단백질로, 철을 미토콘드리아로 전달하는 능력을 억제하는 것으로 알려져 있다 (Tamir S et al., 2013). PGZ 및 SAS와의 병용 처리는 SAS 내성 HN10 세포의 성장 및 생존률을 현저하게 감소시키고 세포 사멸을 증가시켰다(P <0.01)(도 5A-5B). 지질 ROS, RPA 및 mitoSOX 발현 수준은 SAS 용량 의존적 방식으로 유의하게 증가 하였다(도 5D 내지 5F). 종합 해보면, PGZ는 미토콘드리아에서 철 이온의 축적을 통한 SAS-유도 ferroptotic 암세포 사멸에 대한 저항성을 극복하였다.
4. PGZ는 생체 내( in vivo )에서 SAS 처리 시 HNC 세포를 민감하게 유도
HN10 세포가 이식된 마우스를 21일 동안 비히클(NT), SAS, PGZ 또는 SAS+PGZ로 처리하였다. 모든 마우스는 종양 세포 이식 및 치료 동안 생존하고, 치료 후 21 일째에 안락사시켰다. 생체 내 종양 성장은 SAS 또는 PGZ 단독 투여에 의해 완만하게 억제되었으며, SAS+PGZ 조합에 의해 유의하게 억제되었다(P < 0.01) (도 6A 및 6B). 대조군에서는 체중과 일일 섭취량이 감소했지만 총 종양 크기는 유의하게 증가하였으나, 약물 처리군에서는 유의한 변화가 없었다(P <0.05). 종양에서 측정된 지질 ROS 및 RPA의 수준은 대조군 또는 다른 처리군에서 보다 SAS+PGZ 조합군에서 유의하게 높았다(P <0.05). 종양 세포에서의 γH2AX 형성은 SAS+PGZ 군에서 다른 군보다 유의하게 높았다(P <0.01). 생체 기관의 조직학적 검사는 이들 그룹간에 유의 한 차이를 나타내지 않았다.
5. CISD2 억제제는 xCT 억제제 처리시 다양한 암 세포를 민감하게 유도
CISD2 억제제로서 대표적인 티아졸리딘디온 계열의 약물인 PGZ 또는 RGZ는 다양한 암세포에서 SAS에 의해 유도된 ferroptosis를 향상시켰다(도 7A 내지 E). 도 7A 및 B는 설파살라진 단독 투여군(SAS, 0.1-0.5 mM)과 피오글리타존 (PGZ, 10 μM) 및 로지글리타존 (RGZ, 10 μM)의 두경부 암 세포에 대한 72 시간 노출 시의 세포 생존율을 나타내며, 7C는 폐암 세포(A549), 7D는 대장암 세포(HCT 116) 및 7E는 난소암 세포(SKOV3)에서의 결과를 나타낸다. 에러바(error bars)는 세 번의 반복을 통한 표준 편차를 나타내며, 모든 종류의 암세포주에서 조합에 의한 세포 사멸의 상승효과를 나타내었다.
또한, PGZ 또는 RGZ는 다양한 암세포에서 Erastin에 의해 유도된 ferroptosis를 향상시켰다(도 8A 내지 E). 도 8A 및 B는 이라스틴 단독 투여군(Erastin, 1-20 μM)과 피오글리타존 (PGZ, 10 μM) 및 로지글리타존 (RGZ, 10 μM)의 두경부 암 세포에 대한 72 시간 노출 시의 세포 생존율을 나타내며, 8C는 폐암 세포(A549), 8D는 대장암 세포(HCT 116) 및 8E는 난소암 세포(SKOV3)에서의 결과를 나타낸다. 에러바(error bars)는 세 번의 반복을 통한 표준 편차를 나타내며, 모든 종류의 암세포주에서 조합에 의한 세포 사멸의 상승효과를 나타내었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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  9. CISD2(CDGSH iron sulfur domain 2) 단백질의 활성 억제제 또는 발현 억제제, 및 설파살라진(Sulfasalazine, SAS)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서,
    상기 CISD2 단백질의 활성 억제제는 CISD2 단백질에 특이적으로 결합하는 티아졸리딘디온(thiazolidinedione), 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이며, 상기 단백질의 발현 억제제는 CISD2 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 miRNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  10. CISD2(CDGSH iron sulfur domain 2) 단백질의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 설파살라진(Sulfasalazine, SAS) 내성암에 대한 항암 보조제로서,
    상기 CISD2 단백질의 활성 억제제는 CISD2 단백질에 특이적으로 결합하는 티아졸리딘디온(thiazolidinedione), 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이며, 상기 단백질의 발현 억제제는 CISD2 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 miRNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항암 보조제.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 CISD2 단백질의 활성 억제제 또는 발현 억제제는 설파살라진(Sulfasalazine, SAS)의 감수성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 항암 보조제.
  12. 하기의 단계를 포함하는 설파살라진(Sulfasalazine, SAS) 투여 여부 결정에 대한 정보의 제공 방법:
    (a) 암 환자로부터 분리된 시료 내에 존재하는 CISD2(CDGSH iron sulfur domain 2) 단백질의 활성 또는 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 환자로부터 분리된 시료 내에 존재하는 CISD2 단백질의 활성 또는 발현 정도가 정상인 또는 설파살라진(Sulfasalazine, SAS) 비내성 환자의 것과 비교하여 유의하게 높지 않은 경우 설파살라진(Sulfasalazine, SAS) 투여가 가능하다고 판단하는 단계.
  13. 하기의 단계를 포함하는 설파살라진(Sulfasalazine, SAS)의 감수성 증진용 물질의 스크리닝 방법:
    (a) CISD2(CDGSH iron sulfur domain 2) 단백질을 포함하는 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 후보물질이 처리된 CISD2 단백질의 활성 또는 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 후보물질 처리에 의해 CISD2 단백질의 활성이 저하되거나, CISD2 단백질의 발현이 감소될 경우 설파살라진(Sulfasalazine, SAS)의 감수성을 증가시킬 수 있는 물질로 판단하는 단계.
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