CN114025772A - 用于治疗ras突变体癌症的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗ras突变体癌症的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本公开文本总体上涉及用于治疗RAS突变体癌症的组合物和方法。特别地，本发明技术涉及将治疗有效量的一种或多种TXNRD1抑制剂施用至被诊断为患有或有风险患上RAS突变体癌症(例如，RAS突变体胰腺癌)的受试者。

Description

用于治疗RAS突变体癌症的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年4月24日提交的美国临时专利申请号62/838,065的权益和优先权，将其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明技术一般涉及用于治疗、预防和/或改善有需要的受试者的RAS突变体癌症的组合物和方法。特别地，本发明技术涉及通过施用治疗有效量的TXNRD1抑制剂治疗、预防和/或改善RAS突变体胰腺癌的方法。
背景技术
下文提供对本发明技术背景的说明仅仅是为了帮助理解本发明技术，并且不承认所述说明描述或构成针对本发明技术的现有技术。
所有胰腺癌中大约90％是胰腺导管腺癌(PDAC)，其是最致命的癌症类型之一。PDAC仅有7％的5年存活率。详细的基因谱已经表明癌症之间的显著变异性。例如，基因组测序已经揭示PDAC中频繁突变的基因包括KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4、MLL3、TGFBR2、ARID1A和SF3B1、EPC1和ARID2、ATM、ZIM2、MAP2K4、NALCN、SLC16A4、MAGEA6、ROBO2、KDM6A、PREX2、ERBB2、MET、FGFR1、CDK6、PIK3R3、PIK3CA、BRCA1、BRCA2、PALB2等。尽管具有变异性，但在95％的PDAC病例中KRAS进行了突变。参见例如，Biankin等人,Nature 491(7424):399-405(2012)；Waddell等人,Nature 518(7540):495-501(2015)；以及Jones等人,Science 321(5897):1801-1806(2008)。
KRAS蛋白是GTP酶，其在细胞信号转导途径中发挥重要作用。KRAS蛋白被认为充当二元通断开关，在活性鸟苷三磷酸(GTP)结合与无活性鸟苷二磷酸(GDP)结合状态之间循环。在正常的休眠细胞中，KRAS大多数被发现在GDP结合的无活性状态下。响应于细胞外刺激，细胞表面受体暂时促进活性KRAS-GTP的形成。PDAC和其他类型的癌症中的KRAS突变通常是错义突变，其使得KRAS蛋白组成型GTP结合，导致对驱动癌症生长的信号传导途径的过度刺激。致癌突变体KRAS蛋白在多种癌症类型中驱动肿瘤进展。例如，在PDAC的情况下，突变体KRAS蛋白调节胰腺腺泡细胞重编程为导管细胞上皮内瘤形成。在PDAC和其他癌症的生长和维持中也需要KRAS。参见例如，Ying等人,Cell 149(3):656-70(2012)。实际上，PDAC被认为是最“KRAS上瘾”类型的癌症之一。
因此，KRAS被认为是针对PDAC和其他KRAS突变体癌症的重要治疗靶标。参见例如，Waters和Der,Cold Spring Harb Perspect Med.8(9):a031435(2018)。
发明内容
在一个方面，本公开文本提供了用于治疗有需要的受试者中的RAS突变体癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的选自以下的TXNRD1抑制剂：金诺芬、荜拔酰胺、D9、TRi-1、TRi-2、杨梅黄酮、PMX464、PX12、双鞭甲藻毒素-2、手霉素A、乙烷硒啉、金硫葡糖、原卟啉IX、抗TXNRD1抗体及其任何衍生物。本文还公开了用于治疗有需要的受试者中的RAS突变体癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抑制TXNRD1表达的抑制核酸。在一些实施方案中，所述抑制核酸包含选自以下的序列：TCTAATATCATTAACACCATGG(SEQ ID NO:1；人shTXNRD1)、TAAATAAAACTGAATATGGTCA(SEQ IDNO:2；人shTXNRD1)、TTAATAATAA CTTATGATATTA(SEQ ID NO:3；人shTXNRD1)、TTTGTAACAAAAATACATGGAA(SEQ ID NO:4；人shTXNRD1)、TTTAAATGAAAATCCTTCACAT(SEQ IDNO:5；人shTXNRD1)、TTTTAAATGAAAATCCTTCACA(SEQ ID NO:6；人shTXNRD1)、TAAGAAAAGAGAATCACAACAT(SEQ ID NO:7；人shTXNRD1)、TTTTCATTTATCTTCACCCCTA(SEQ IDNO:8；人shTXNRD1)、TTAGAAAGAAATAGATACCCAA(SEQ ID NO:9；人shTXNRD1)、TAATAATAACTTATGATATTAA(SEQ ID NO:10；人shTXNRD1)、TTTAGTCACAGGGTAATTCGTC(SEQ IDNO:11；鼠shTxnrd1)以及TTCGTCACTGACAACGTTGTGA(SEQ ID NO:12；鼠shTxnrd1)或其任何互补体。所述RAS突变体癌症可以是肺癌(例如，肺腺癌)、粘蛋白腺瘤、胰腺癌(例如，PDAC)、结直肠癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤)、子宫内膜癌、睾丸胚细胞癌或肾上腺癌。在某些实施方案中，所述RAS突变体癌症包含选自G12C、G12D、G12V、G12A、G12S、G12R、G13D、G13C、G13S、G13R、G13A、G13V、Q61H、Q61L、Q61R、Q61K、Q61P和Q61E的KRAS、NRAS或HRAS突变。另外地或可替代地，在一些实施方案中，经由DNA测序检测所述KRAS、NRAS或HRAS突变。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述受试者在治疗之前显示出癌细胞中RAS蛋白(例如，KRAS、HRAS、NRAS)的升高的表达水平。在本文公开的方法的任何实施方案中，所述受试者展现出选自以下的一种或多种体征或症状：辐射背部的上腹疼痛、食欲不振或非故意的体重减轻、抑郁症、新发作的糖尿病、血凝块、疲劳、皮肤和眼白发黄(黄疸)、胃气胀、恶心和呕吐。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述受试者具有TP53、CDKN2A、SMAD4、MLL3、TGFBR2、ARID1A、SF3B1、EPC1、ARID2、ATM、ZIM2、MAP2K4、NALCN、SLC16A4、MAGEA6、ROBO2、KDM6A、PREX2、ERBB2、MET、FGFR1、CDK6、PIK3R3、PIK3CA、BRCA1、BRCA2或PALB2中的一个或多个点突变。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在本文公开的方法的任何实施方案中，所述TXNRD1抑制剂或所述抑制TXNRD1表达的抑制核酸可以是口服、局部、鼻内、全身、静脉内、皮下、腹膜内、皮内、眼内、离子电渗、透粘膜或肌内施用。在一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂或所述抑制核酸是每天施用，持续6周或更长时间。在其他实施方案中，所述TXNRD1抑制剂或所述抑制核酸是每天施用，持续12周或更长时间。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者单独地、顺序地或同时施用一种或多种另外的治疗剂。所述另外的治疗剂的例子包括但不限于紫杉醇、吉西他滨、AMG 510、5-FU(氟尿嘧啶)和伊立替康。
在另一个方面，本公开文本提供了一种用于监测TXNRD1抑制剂在被诊断为患有RAS突变体癌症的受试者中的治疗功效的方法，所述方法包括：(a)在已向所述受试者施用所述TXNRD1抑制剂之后检测从所述受试者获得的测试样品中的TXNRD1蛋白水平；以及(b)当所述测试样品中TXNRD1蛋白水平相比于在施用所述TXNRD1抑制剂之前从所述受试者获得的对照样品中观察到的TXNRD1蛋白水平降低时，确定所述TXNRD1抑制剂是有效的。TXNRD1抑制剂的例子包括金诺芬、荜拔酰胺、D9、TRi-1、TRi-2、杨梅黄酮、PMX464、PX12、双鞭甲藻毒素-2、手霉素A、乙烷硒啉、金硫葡糖、原卟啉IX、抗TXNRD1抗体、抑制TXNRD1表达的抑制核酸或其任何衍生物。在一些实施方案中，所述抑制RNA是shRNA、反义寡核苷酸或sgRNA。
在一个方面，本公开文本提供了一种用于在有需要的受试者中抑制RAS突变体细胞增殖的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的至少一种TXNRD1抑制剂，其中所述至少一种TXNRD1抑制剂选自金诺芬、荜拔酰胺、D9、TRi-1、TRi-2、杨梅黄酮、PMX464、PX12、双鞭甲藻毒素-2、手霉素A、乙烷硒啉、金硫葡糖、原卟啉IX、抗TXNRD1抗体、抑制TXNRD1表达的抑制核酸或其任何衍生物，并且其中所述受试者患有特征在于RAS(例如，KRAS、HRAS、NRAS)和/或TXNRD1的升高的表达水平和/或增加的活性的疾病或病症。在一些实施方案中，所述抑制核酸包含选自以下的核酸序列：TCTAATATCATTAACACCATGG(SEQ IDNO:1；人shTXNRD1)、TAAATAAAACTGAATATGGTCA(SEQ ID NO:2；人shTXNRD1)、TTAATAATAACTTATGATATTA(SEQ ID NO:3；人shTXNRD1)、TTTGTAACAAAAATACATGGAA(SEQ IDNO:4；人shTXNRD1)、TTTAAATGAAAATCCTTCACAT(SEQ ID NO:5；人shTXNRD1)、TTTTAAATGAAAATCCTTCACA(SEQ ID NO:6；人shTXNRD1)、TAAGAAAAGAGAATCACAACAT(SEQ IDNO:7；人shTXNRD1)、TTTTCATTTATCTTCACCCCTA(SEQ ID NO:8；人shTXNRD1)、TTAGAAAGAAATAGATACCCAA(SEQ ID NO:9；人shTXNRD1)、TAATAATAACTTATGATATTAA(SEQ IDNO:10；人shTXNRD1)、TTTAGTCACAGGGTAATTCGTC(SEQ ID NO:11；鼠shTxnrd1)以及TTCGTCACTGACAACGTTGTGA(SEQ ID NO:12；鼠shTxnrd1)。
在本文所公开的方法的任何和所有实施方案中，经由以下方式检测TXNRD1和/或RAS(例如，KRAS、HRAS、NRAS)表达水平：RNA-seq、northern印迹、微阵列、斑点或狭线印迹、荧光原位杂交、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、核糖核酸酶保护测定(RPA)、实时定量RT-PCR、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱法-质谱法(LC/MS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、免疫电泳、免疫染色、免疫组织化学或蛋白质印迹。
另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的吉西他滨。在本文公开的方法的任何前述实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂，任选地其中所述KRASG12C抑制剂是AMG 510。
附图说明
图1A显示了说明本公开文本中使用的用于发现KRAS突变体胰腺癌中的治疗靶标的管线的示意图。管线包括使用基于规律成簇的间隔短回文重复序列的干扰(CRISPRi)文库对KRAS突变体胰腺癌细胞的低感染复数(MOI)转导(参见例如，Gilbert等人,Cell 154:442-451(2013))、单细胞RNA测序(scRNA-seq)、基因组比对和计数矩阵的产生(参见例如，Tang等人,Nature Methods 6:377–382(2009))、监督降维以及用于鉴定新型靶标的机器学习算法，其中抑制最大程度地且选择性地靶向癌细胞。
图1B显示了对于若干种CRISPR靶候选物的z转化的治疗得分的散点图。基于机器学习算法跨越两个阴性指导RNA对治疗指数进行评分，这共同建立了用于鉴定治疗靶标的阴性对照基准。
图2A显示了在使用机器学习算法进行监督降维之后细胞类型群体沿着单一维度的分布。显示了以下群体：1)癌细胞：非靶向指导RNA基因被靶向的癌细胞(N＝120)、2)无效靶标：阴性对照基因被靶向的癌细胞(N＝122)、3)TXNRD1：TXNRD1被靶向的癌细胞(N＝87)以及4)健康细胞：健康导管细胞(N＝600)。
图2B显示了对于前20个候选靶标的z转化的治疗得分的热图。候选靶标是基于来自机器学习算法的四个指示决策函数之间的平均排名以降序显示。如图所示，TXNRD1展现出最高的平均排名。
图2C显示了描绘一组候选靶标之间的治疗指数的加权平均决策函数得分的图表。TXNRD1作为最高排名靶标而出现。
图3A显示了shRNA介导的合并阴性选择筛选的交叉分析的结果。shRNA介导的合并阴性选择筛选是在以下细胞中进行的：(1)KrasG12D；Myc；shp53鼠胰腺导管腺癌(mPDAC)细胞以及(2)Myc；p53-/-鼠肝细胞癌(mHCC)细胞。出于比较目的，对从两种细胞类型进行shRNA介导的合并阴性选择筛选的结果进行交叉分析。
图3B显示了说明从图3A获得的候选基因的验证的条形图。在mPDAC细胞、mHCC细胞和非转化的永生化小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF)中进行竞争增殖测定。用携带诱导型shRNA的Venus+病毒转导这些细胞。使用以下对照shRNA：Ren.713(充当阴性对照的非靶向shRNA)、Rpa3.561(用于所有增殖细胞中的生长抑制的阳性对照)、Kras.247(用于mPDAC特异性生长抑制的阳性对照)。将G418选择的Venus+细胞与未转导的细胞混合并在存在多西环素的情况下培养以诱导shRNA。在不同时间点(T0：第0天；T12：第12天)确定Venus+和dsRed+(shRNA表达)细胞的百分比。改变充当表达的shRNA的生长抑制作用的读数。
图3C显示了说明在mPDAC、mHCC和iMEF细胞中的TXNRD1敲低的免疫印迹。
图3D显示了在胰腺癌细胞中对TXNRD1的药理学抑制的作用。将mPDAC细胞用渐增剂量的金诺芬处理72小时。通过测量活细胞数量来计算相对增殖，并将其针对DMSO处理的细胞的活细胞数量(其设定为1)进行归一化。然后将相对增殖作为金诺芬浓度的函数进行绘图并拟合至指数曲线。
图3E显示了如通过72小时后在具有渐增剂量的金诺芬的培养物中活细胞数量的变化所测量的在人胰腺癌细胞中对TXNRD1的药理学抑制作用。通过测量活细胞数量来计算相对增殖，并将其针对DMSO处理的细胞的活细胞数量(其设定为1)进行归一化。然后将相对增殖作为金诺芬浓度的函数进行绘图并拟合至指数曲线。L3.3、Colo357和BXPC3具有野生型KRAS，并且其余细胞系具有KRAS突变。
图4A显示了说明在人胰腺癌细胞系(n＝12)中TXNRD1抑制剂金诺芬的IC50值与KRAS状态的相关性的条形图。
图4B显示了说明在人胰腺癌细胞系(n＝9)中金诺芬的IC50与p53状态的相关性的条形图。
图4C显示了说明在人胰腺癌细胞系(n＝9)中金诺芬的IC50与Myc表达水平的相关性的散点图。
图4D显示了如通过用荜拔酰胺(另一种TXNRD1抑制剂)处理胰腺癌细胞72小时所测量的对TXNRD1的药理学抑制作用。测定了含有不同KRAS突变(G12C、G12D、G12V)或野生型等位基因的癌细胞。通过测量活细胞数量来计算相对增殖，并将其针对DMSO处理的细胞的活细胞数量(其设定为1)进行归一化。然后将相对增殖作为金诺芬浓度的函数进行绘图并拟合至指数曲线。
图4E显示了说明在TCGA人胰腺癌肿瘤(n＝149)中TXNRD1与KRAS表达水平之间的相关性的散点图。
图4F-图4H显示了在mPDAC细胞中TXNRD1敲低时基因标签的变化的评价。使用基因集合富集分析(GSEA)评价与具有shRen(充当阴性对照的非靶向shRNA)的细胞相比，在mPDAC细胞中TXNRD1敲低时KRAS依赖性的基因标签(图4F)、胰腺癌(图4G)以及氨基酸转运蛋白/铁死亡(图4H)的变化。
图5A显示了条件RNAi实验的示意图。将Tet-On感受态鼠PDAC细胞用TRMPV-Neo-miR-E shRNA和萤光素酶-hygro载体转导。针对G418和潮霉素抗性选择所转导的细胞，并将其移植至接受者小鼠的胰腺中。在疾病发作后，如使用生物发光成像所测定(通常在七天后发生)，通过在饮用水和食物中补充多西环素(dox)在一部分小鼠中诱导shRNA表达。
图5B显示了说明在用或未用可诱导相应shRNA的多西环素处理的动物(n＝4-5)中的肿瘤重量的散点图。
图5C显示了原位移植了具有指示TRMPV-Neo-miR-E shRNA的mPDAC细胞的代表性小鼠在用和未用多西环素处理7天的情况下的生物发光成像。多西环素是在疾病发作后施用。显示了第0天(D0)和第7天(D7)时的生物发光图像。
图5D显示了说明由金诺芬处理引起的体内肿瘤重量减少的条形图。将KRasG12D；p53-/-类器官移植在接受者小鼠中，并将小鼠(n＝3-4)仅用媒介物或用金诺芬处理1周。测量肿瘤重量并绘图。
图5E显示了说明金诺芬处理对人胰腺癌细胞系肿瘤重量的体内影响的条形图。将MIAPaCa-2(KRAS突变体)或Colo357(KRAS野生型)类器官移植至接受者小鼠的胰腺中。将小鼠(n＝5)仅用媒介物或用金诺芬处理2周。测量肿瘤重量并绘图。
图6A-图6B显示了说明指示细胞系对所列基因的存活依赖性的热图。每列表示展现出最高平均排名的细胞系，并且每一行表示一个基因。通过对所有相应sgRNA(图6A)或shRNA(图6B)的log2FC(相对于未患病组织的丰度倍数变化)取平均值来计算基因依赖性得分。零表示没有变化，负数表示耗尽，并且正数表示指示细胞系的富集。使用未监督聚类对具有相似表型的基因进行聚类。如图所示，敲除或敲低复制基因RAP1或PCNA导致对几乎所有细胞系的普遍致死性。相比之下，展现出对于KRAS、HRAS和NRAS的类似依赖性的某些细胞系条件性地需要TXNRD1。
图7A-图7D显示了在KRAS突变体胰腺癌细胞中TXNRD1抑制剂金诺芬的抗增殖作用以及当与吉西他滨组合时潜在的协同抑制作用。图7A显示了金诺芬、吉西他滨及其组合对MIAPaCa-2(KRASG12C)和PSN1(KRASG12R)胰腺癌细胞系的剂量依赖性作用。图7B显示了来自图7A的每种浓度的金诺芬和吉西他滨在MIAPaCa-2(KRASG12C)和PSN1(KRASG12R)细胞中的生长抑制百分比。数据呈现为三个独立实验的平均值(n＝3)。图7C显示了用金诺芬与吉西他滨的组合处理的MIAPaCa-2(KRASG12C)和PSN1(KRASG12R)细胞的组合指数(CI)图。根据图7C，CI值<1指示金诺芬与吉西他滨之间的协同作用。图7D显示了用金诺芬与吉西他滨的组合以指示浓度处理的MIAPaCa-2(KRASG12C)和PSN1(KRASG12R)细胞的组合指数(CI)得分。每个CI得分表示来自至少三个独立实验的数据。
图8A-图8D显示了在KRAS突变体胰腺癌细胞中TXNRD1抑制剂金诺芬的抗增殖作用以及当与KRASG12C抑制剂AMG 510组合时潜在的协同抑制作用。图8A显示了金诺芬、AMG 510及其组合对MIAPaCa-2(KRASG12C)和PSN1(KRASG12R)胰腺癌细胞系的剂量依赖性作用。图8B显示了来自图8A的每种浓度的金诺芬和AMG 510在MIAPaCa-2(KRASG12C)和PSN1(KRASG12R)细胞中的生长抑制百分比。数据呈现为三个独立实验的平均值(n＝3)。图8C显示了CI图，其呈现CI值<1，指示金诺芬与AMG 510之间的协同作用。图8D显示了用金诺芬与AMG 510的组合以指示浓度处理的MIAPaCa-2(KRASG12C)和PSN1(KRASG12R)细胞的组合指数(CI)得分。每个CI得分表示来自至少三个独立实验的数据。
图9显示了在具有TXNRD1 mRNA上调的患有胰腺腺癌的患者中的总存活率。将178名患者分成两组，即TXNRD1低和TXNRD1高/中。对于高/中和低的比例截断值(0-100％)分别为>15.87％(Z得分>-1，n＝145)以及<＝15.87％(Z得分<＝-1，n＝33)。数据分析是基于可获得的TCGA数据。
图10显示了在10mg/kg金诺芬悬浮液的单次腹膜内注射剂量后在NCR nu/nu小鼠中的血浆和胰腺金浓度。经24小时收集三个系列样品(2h、4h、24h)(n＝3)。
具体实施方式
应理解，下文以不同详细程度描述了本发明方法的某些方面、模式、实施方案、变化形式和特征，以提供对本发明技术的实质理解。
在实践本发明方法时，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。参见例如，Sambrook和Russell编辑(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版；Ausubel等人编辑(2007)Current Protocols inMolecular Biology系列丛书；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)系列丛书；MacPherson等人,(1991)PCR 1:A Practical Approach(IRL Press at OxfordUniversity Press)；MacPherson等人,(1995)PCR 2:A Practical Approach；Harlow和Lane编辑(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique,第5版；Gait等人(1984)OligonucleotideSynthesis；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编辑(1984)Nucleic AcidHybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编辑(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984)A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller和Calos编辑(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring HarborLaboratory)；Makrides等人(2003)Gene Transfer and Expression in MammalianCells；Mayer和Walker编辑(1987)Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology(Academic Press,London)；以及Herzenberg等人编辑(1996)Weir’s Handbook ofExperimental Immunology。
本公开文本部分地基于以下发现，即TXNRD1是用于治疗RAS突变体胰腺癌的治疗靶标并且在胰腺癌细胞中对TXNRD1的药理学抑制在治疗RAS突变体胰腺癌方面是有效的。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科技术语通常均具有与本发明技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”(“the”)包括复数指示物，除非上下文另外明确规定。例如，对“一种/一个细胞”的提及包括两种/个或更多种/个细胞的组合，等等。通常，本文所用的命名和下文所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域中熟知的和常用的那些。
除非上下文另外说明或另外明显看出，否则如本文所用，关于数字的术语“约”通常视为包括落在所述数字任一方向(大于或小于)的1％、5％或10％范围内的数字(这样的数字低于可能值的0％或超过可能值的100％的情况除外)。
如本文所用，向受试者“施用”药剂或药物包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，所述途径包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)或局部。施用包括自施用和由另一个人施用。
如本文所用，术语“抗体”共同地指代免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合、以及在任何脊椎动物中例如在哺乳动物(如人、山羊、兔和小鼠)以及非哺乳动物物种中在免疫应答期间产生的类似分子(如鲨鱼免疫球蛋白)。如本文所用，“抗体”(包括完整免疫球蛋白)和“抗原结合片段”与目的分子(或一组高度类似的目的分子)特异性结合，而基本上排除与其他分子的结合(例如，对于目的分子的结合常数比对于生物样品中的其他分子的结合常数大至少103M-1、大至少104M-1或大至少105M-1的抗体和抗体片段)。术语“抗体”还包括基因工程化形式如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合抗体(如双特异性抗体)。还参见Pierce Catalog和Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.)；Kuby,J.,Immunology,第3版,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。
更具体地，抗体是指特异性地识别并结合抗原表位的至少包含轻链免疫球蛋白可变区或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体由重链和轻链构成，它们各自具有可变区，称为重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。VH区和VL区共同负责结合由抗体识别的抗原。通常，免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。有两种类型的轻链，即λ(lambda)和κ(kappa)。有五种主要的重链类别(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，它们决定了抗体分子的功能活性。每条重链和轻链均含有恒定区和可变区(所述区也称为“结构域”)。组合起来，重链可变区和轻链可变区特异性结合抗原。轻链可变区和重链可变区含有被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)打断的“框架”区。已经定义了框架区和CDR的范围(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991，其通过引用特此并入)。Kabat数据库目前在线上维护。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区(即组成性轻链和重链的组合框架区)主要采用β-折叠构象，并且CDR形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下所述环形成β-折叠结构的一部分。因此，框架区起到形成支架的作用，所述支架通过链间非共价相互作用使CDR以正确取向定位。
CDR主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始依次编号，并且通常还依据其中定位特定CDR的链来标识。因此，VH CDR3位于发现它所在的抗体的重链的可变结构域中，而VL CDR1是来自发现它所在的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。结合TXNRD1蛋白的抗体将具有特定的VH区和VL区序列，从而具有特定的CDR序列。具有不同特异性(即对于不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管不同的抗体之间CDR不同，但CDR内仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。如本文所用，“免疫球蛋白相关组合物”是指抗体(包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、多特异性抗体、双特异性抗体等)以及抗体片段。抗体或其抗原结合片段与抗原特异性结合。
如本文所用，术语“抗体相关多肽”意指包括单链抗体在内的抗原结合抗体片段，其可以单独包含一个或多个可变区或包含一个或多个可变区与以下多肽要素中的全部或部分的组合：抗体分子的铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。所述技术中还包括一个或多个可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。可用于本方法中的抗体相关分子，例如是但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。例子包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。因此，“抗体片段”或“抗原结合片段”可以包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段或抗原结合片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“抗原结合片段”是指完整免疫球蛋白结构的片段，所述片段具有负责与抗原结合的多肽部分。可用于本技术中的抗原结合片段的例子包括scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab'和F(ab')2，但不限于此。
如本文所用，术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH VL)。通过使用过短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，并且产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如以下文献中：EP404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
如本文所用，术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子。单链抗体分子可以包含具有多个单独分子的聚合物，例如二聚体、三聚体或其他聚合物。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，从而使得它们能够成为单条蛋白质链，在其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。Bird等人(1988)Science242:423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA 85:5879-5883。此类单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶促切割或化学切割来制备。
任何上述抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对结合特异性和中和活性筛选所述片段。
如本文所用的关于多核苷酸(即核苷酸序列，如寡核苷酸或靶核酸)的术语“互补的”或“互补性”是指碱基配对原则。如本文所用的核酸序列的互补体是指如下寡核苷酸，其在与核酸序列比对以使一个序列的5'端与另一个序列的3'端配对时，呈“反平行缔合”。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。在本文所述的核酸中可以包括天然存在的核酸中通常不存在的某些碱基。这些碱基包括例如肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。互补性无需完美；稳定双链体可以含有错配碱基对、变性或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可以在考虑多个变量后凭经验确定双链体稳定性，所述变量包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率。互补序列还可以是与DNA序列或其互补序列互补的RNA序列，并且还可以是cDNA。
如本文所用，术语“共有FR”意指共有免疫球蛋白序列中的框架(FR)抗体区。抗体的FR区不与抗原接触。
如本文所用，“对照”是实验中出于比较目的使用的替代样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。例如，在实验目的是确定用于治疗特定类型疾病或病症的治疗剂的功效相关性的情况下，通常采用阳性对照(已知展现出所需治疗效果的化合物或组合物)和阴性对照(不接受疗法或接受安慰剂的受试者或样品)。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如导致预防或减少本文所述疾病或病症或者与本文所述疾病或病症相关的一种或多种体征或症状的量。在治疗或预防应用的情况下，施用至受试者的组合物的量将根据组合物、疾病的程度、类型和严重程度以及根据个体的特征(如一般健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性)而变化。技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。所述组合物也可以与一种或多种另外的治疗化合物组合施用。在本文所述的方法中，可以将所述治疗组合物施用至患有RAS突变体癌症的一种或多种体征或症状的受试者。如本文所用，组合物的“治疗有效量”指其中疾病或病症的生理作用得到改善或消除的组合物水平。可以将治疗有效量在一次或多次施用中给予。
如本文所用，“表达”包括以下中的一项或多项：基因转录为前体mRNA；前体mRNA的剪接和其他加工以产生成熟mRNA；mRNA稳定性；成熟mRNA翻译成蛋白质(包括密码子使用和tRNA可用性)；以及糖基化和/或翻译产物的其他修饰(如果适当的表达和功能需要)。
如本文所用，术语“基因”意指含有用于RNA产物的经调节的生物合成的所有信息的DNA区段，包括启动子、外显子、内含子和控制表达的其他非翻译区。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中的位置来确定同源性，所述序列可以出于比较目的被比对。当所比较序列中的位置被相同的核碱基或氨基酸占据时，则所述分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度随所述序列共享的匹配或同源位置数而变。多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列具有一定百分比(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”意味着，当比对时，在比较两个序列中，该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。可以使用本领域已知的软件程序确定此比对以及同源性或序列同一性百分比。在一些实施方案中，将默认参数用于比对。一种比对程序是BLAST，使用默认参数。具体而言，程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高得分(HIGH SCORE)；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可以在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)找到。生物学上等同的多核苷酸是具有指定同源性百分比并编码具有相同或相似生物活性的多肽的那些多核苷酸。如果两个序列彼此共享小于40％的同一性或小于25％的同一性，则将所述序列视为“无关的”或“非同源的”。
如本文所用，术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)前后，以及VH中的31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)前后(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及VH中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987)))。
如本文所用的术语“杂交”是指两个基本上互补的核酸链(在至少14至25个核苷酸的延伸段上至少约65％互补、至少约75％或至少约90％互补)在适当严格的条件下彼此退火，以通过在互补碱基对之间形成氢键而形成双链体或异源双链体的过程。核酸杂交技术是本领域熟知的。参见例如，Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.。杂交和杂交强度(即核酸之间的缔合强度)受诸如核酸之间的互补程度、所涉及条件的严格性和所形成杂交体的热熔点(Tm)等因素的影响。本领域技术人员了解如何估计和调整杂交条件的严格性，使得具有至少所需互补水平的序列将稳定杂交，而具有较低互补性的序列将不会杂交。关于杂交条件和参数的例子，参见例如Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.；Ausubel,F.M.等人1994,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Secaucus,N.J.。在一些实施方案中，特异性杂交发生在严格杂交条件下。对靶核酸具有特异性的寡核苷酸或多核苷酸(例如，探针或引物)将与靶核酸在合适条件下“杂交”。
如本文所用，“寡核苷酸”是指在主要以限定间隔包含相同单体单元的主链上具有核酸碱基序列的分子。碱基在主链上的排列方式使得其可与具有与所述寡核苷酸的碱基互补的碱基序列的核酸结合。最常见的寡核苷酸具有磷酸糖单元的主链。可区分2'位不具有羟基的寡脱氧核糖核苷酸与2'位具有羟基的寡核糖核苷酸。寡核苷酸还可以包括如下衍生物，其中羟基中的氢被有机基团(例如，烯丙基)替代。寡核苷酸的一个或多个碱基也可以被修饰为包括硫代磷酸酯键(例如，磷酸酯主链中的不参与核苷酸桥接的两个氧原子之一被硫原子替代)以增加对核酸酶降解的抗性。所述寡核苷酸的确切大小将依赖于许多因素，而这些因素又依赖于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以以任何方式产生，包括例如化学合成、DNA复制、质粒或噬菌体DNA的限制性内切核酸酶消化、逆转录、PCR或其组合。例如，可以通过添加甲基、生物素或地高辛配基部分、荧光标签或通过使用放射性核苷酸来修饰寡核苷酸。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌化合物和抗真菌化合物、等渗化合物和吸收延迟化合物等。药学上可接受的载体及其配制品是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Remington'sPharmaceutical Sciences(第20版，A.Gennaro,2000,Lippincott编辑，Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.)中。
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”意指任何RNA或DNA，其可以是未修饰的或修饰的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、作为单链和双链区域的混合物的DNA、单链和双链RNA、作为单链和双链区域的混合物的RNA以及包含DNA和RNA的杂交分子，所述DNA和RNA可以是单链的或更通常是双链的或者单链和双链区域的混合物。另外，多核苷酸是指包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及出于稳定性或其他原因对骨架进行修饰的DNA或RNA。
如本文所用，障碍或病症的“预防”(“prevention”、“prevent”或“preventing”)是指如下一种或多种化合物，其在统计学样品中，相对于未经治疗的对照样品降低所治疗样品中的障碍或病症的发生率，或者相对于未经治疗的对照样品延迟障碍或病症的一种或多种症状的发作。如本文所用，预防RAS突变体癌症包括预防或延迟RAS突变体癌症的症状的开始。如本文所用，预防RAS突变体癌症还包括预防RAS突变体癌症的一种或多种体征或症状的复发。
如本文所用，术语“样品”是指从受试者获得的临床样品。生物样品可以包括从受试者分离的组织、细胞、细胞的蛋白质或膜提取物、粘液、痰、骨髓、支气管肺泡灌洗液(BAL)、支气管冲洗液(BW)和生物流体(例如，腹水或脑脊液(CSF))以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体(血液、血浆、唾液、尿液、血清等)。
如本文所用，术语“分开”治疗使用是指通过不同途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用，术语“顺序”治疗使用是指在不同时间施用至少两种活性成分，施用途径相同或不同。更具体地，顺序使用是指一种活性成分的整个施用在另外一种或多种活性成分的施用开始之前。因此，可以在施用另外一种或多种活性成分之前几分钟、几小时或几天内施用一种活性成分。在这种情况下，没有同时治疗。
如本文所用，术语“同时”治疗使用是指通过相同途径并且同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用，术语“受试者”、“个体”或“患者”可互换使用，并且是指单个生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在某些实施方案中，所述个体、患者或受试者是人。
如本文所用，术语“靶序列”和“靶核酸序列”是指待调节(例如，抑制或下调)的特定核酸序列。
如本文所用的术语“TXNRD1抑制剂”是指抑制TXNRD1的基因表达或生物活性的药剂。TXNRD1生物活性的例子包括但不限于酶活性、底物结合活性、同或异二聚体化活性以及与细胞结构的结合。存在硫氧还蛋白还原酶1的若干种不同的同种型。本公开文本的TXNRD1抑制剂抑制至少一种同种型的至少一种生物活性。TXNRD1抑制剂的例子包括但不限于金诺芬、荜拔酰胺、D9、TRi-1、TRi-2、杨梅黄酮、PMX464、PX12、双鞭甲藻毒素-2、手霉素A、乙烷硒啉、金硫葡糖、原卟啉IX、针对TXNRD1的shRNA或siRNA、针对TXNRD1的反义寡核苷酸、抗TXNRD1抗体或其任何衍生物。
如本文所用的“治疗”(“treating”、“treat”或“treatment”)涵盖治疗受试者(如人)的本文所述的疾病或障碍，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或障碍，即引起障碍的消退；(iii)减缓障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或障碍的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，治疗意指使与疾病相关的症状例如缓和、减轻、治愈或处于缓解状态。
还应理解，如所述的医学疾病和病症的各种治疗或预防方式旨在意指“基本上的”，其包括完全的以及小于完全的治疗或预防，并且其中实现一些生物学或医学上相关的结果。所述治疗可以是针对慢性疾病的连续延长治疗，或者是针对急性病症治疗的单次或几次施用。
本发明技术的TXNRD1抑制剂
TXNRD1蛋白(也称为硫氧还蛋白还原酶1、GRIM-12、TR、TR1、TRXR1或TXNR)是吡啶核苷酸氧化还原酶家族的成员，并且是硫氧还蛋白(Trx)系统的组分。TXNRD1是黄素酶，其还原硫氧还蛋白以及其他基质并在氧化还原自稳态和硒代谢中发挥关键作用。TXNRD1蛋白作为含有FAD的同二聚体起作用，并在活性位点具有硒代半胱氨酸(Sec)。
在一个方面，本公开文本提供了用于治疗RAS突变体癌症的组合物。在一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂降低TXNRD1的基因表达和/或活性水平。在一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂降低选自以下的TXNRD1活性：酶活性、底物结合活性、同或异二聚体化活性以及与细胞结构的结合。
在一个方面，本公开文本提供了药理学抑制剂，包括但不限于金诺芬、荜拔酰胺、D9、TRi-1、TRi-2、杨梅黄酮、PMX464、PX12、双鞭甲藻毒素-2、手霉素A、乙烷硒啉、金硫葡糖和原卟啉IX。抗TXNRD1抗体或其任何衍生物也可以用于本文公开的方法中。
在另一个方面，本公开文本提供了抑制TXNRD1表达和/或活性水平的抑制RNA(例如，sgRNA、反义RNA或shRNA)。此类抑制RNA的例子包括具有如下序列的那些，所述序列包括TCTAATATCATTAACACCATGG(SEQ ID NO:1；人shTXNRD1)、TAAATAAAACTGAATATGGTCA(SEQ IDNO:2；人shTXNRD1)、TTAATAATAACTTATGATATTA(SEQ ID NO:3；人shTXNRD1)、TTTGTAACAAAAATACATGGAA(SEQ ID NO:4；人shTXNRD1)、TTTAAATGAAAATCCTTCACAT(SEQ IDNO:5；人shTXNRD1)、TTTTAAATGAAAATCCTTCACA(SEQ ID NO:6；人shTXNRD1)、TAAGAAAAGAGAATCACAACAT(SEQ ID NO:7；人shTXNRD1)、TTTTCATTTATCTTCACCCCTA(SEQ IDNO:8；人shTXNRD1)、TTAGAAAGAAATAGATACCCAA(SEQ ID NO:9；人shTXNRD1)、TAATAATAACTTATGATATTAA(SEQ ID NO:10；人shTXNRD1)、TTTAGTCACAGGGTAATTCGTC(SEQ IDNO:11；鼠shTxnrd1)以及TTCGTCACTGACAACGTTGTGA(SEQ ID NO:12；鼠shTxnrd1)或其任何互补体。
本公开文本提供了一种包含如下核酸序列的反义核酸，所述核酸序列与以下中任一种的一部分互补并且与其特异性地杂交：
NM_182729.2智人(Homo sapiens)硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)，转录物变体1，mRNA(SEQ ID NO:13)
Figure BDA0003421823880000111
Figure BDA0003421823880000121
Figure BDA0003421823880000131
NM_182742.2智人硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)，转录物变体2，mRNA(SEQ ID NO:14)
Figure BDA0003421823880000132
Figure BDA0003421823880000141
智人硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)，转录物变体3，mRNA NCBI参考序列：NM_182743.2(SEQ ID NO:15)
Figure BDA0003421823880000142
Figure BDA0003421823880000151
Figure BDA0003421823880000161
智人硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)，转录物变体4，mRNA NCBI参考序列：NM_003330.3(SEQ ID NO:16)
Figure BDA0003421823880000162
Figure BDA0003421823880000171
智人硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)，转录物变体5，mRNA NCBI参考序列：NM_001261445.1(SEQ ID NO:17)
Figure BDA0003421823880000172
Figure BDA0003421823880000181
Figure BDA0003421823880000191
智人硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)，转录物变体6，mRNA NCBI参考序列：NM_001261446.1(SEQ ID NO:18)
Figure BDA0003421823880000192
Figure BDA0003421823880000201
智人硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)，转录物变体7，mRNA NCBI参考序列：NM_001093771.3(SEQ ID NO:19)
Figure BDA0003421823880000202
Figure BDA0003421823880000211
Figure BDA0003421823880000221
小家鼠(Mus musculus)硫氧还蛋白还原酶1(Txnrd1)，转录物变体1，mRNA NCBI参考序列：NM_001042513.1(SEQ ID NO:20)
Figure BDA0003421823880000222
Figure BDA0003421823880000231
小家鼠硫氧还蛋白还原酶1(Txnrd1)，转录物变体3，mRNA NCBI参考序列：NM_001042514.1(SEQ ID NO:21)
Figure BDA0003421823880000232
Figure BDA0003421823880000241
小家鼠硫氧还蛋白还原酶1(Txnrd1)，转录物变体2，mRNA NCBI参考序列：NM_015762.2(SEQ ID NO:22)
Figure BDA0003421823880000251
Figure BDA0003421823880000261
小家鼠硫氧还蛋白还原酶1(Txnrd1)，转录物变体4，mRNA NCBI参考序列：NM_001042523.1(SEQ ID NO:23)
Figure BDA0003421823880000262
Figure BDA0003421823880000271
(即，TXNRD1 mRNA同种型)，从而降低或抑制TXNRD1表达。所述反义核酸可以是反义RNA或反义DNA。基于已知的TXNRD1基因序列的反义核酸可以容易地使用本领域已知的方法进行设计并工程化。在一些实施方案中，所述反义核酸包含SEQ ID NO:1-12中任一个的核酸序列或其互补体。
所述反义核酸是与有义核酸链互补，例如与双链DNA分子(或cDNA)的编码链互补或与mRNA序列互补的分子。因此，反义核酸可以与有义核酸形成氢键。所述反义核酸可以与整个TXNRD1编码链或其一部分(例如，全部或部分蛋白质编码区(或开放阅读框))互补。在一些实施方案中，所述反义核酸是仅与TXNRD1 mRNA的编码区的一部分互补的寡核苷酸。在某些实施方案中，反义核酸分子可以与TXNRD1编码链的非编码区互补。在一些实施方案中，所述非编码区是指侧接编码区且不翻译成氨基酸的5′和3′非翻译区。例如，所述反义寡核苷酸可以与TXNRD1的翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸的长度可以是例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。
使用本领域已知的程序利用化学合成和酶连接反应来构建反义核酸。例如，反义核酸(例如，反义寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或修饰的核苷酸来化学合成，所述修饰的核苷酸被设计为增加分子的生物稳定性或增加在反义核酸与有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)。可用于产生反义核酸的修饰的核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-hodouracil、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁苷、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w以及2,6-二氨基嘌呤。可替代地，可以使用表达载体在生物学上产生所述反义核酸，其中核酸已经以反义取向亚克隆(即，从插入的核酸转录的RNA将具有对目的靶靶核酸的反义取向)。
所述反义核酸分子可以被施用至受试者或在原位产生，使得它们与编码目的蛋白质的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译来抑制所述蛋白质的表达。所述杂交可以通过以下方式发生：经由Watson-Crick碱基配对形成稳定的双链体，或者在与DNA双链体结合的反义核酸分子的情况下，通过双螺旋的大沟中的特异性相互作用。
在一些实施方案中，所述反义核酸分子被修饰为例如通过将所述反义核酸分子与结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体连接使得它们与在选择的细胞表面上表达的受体或抗原特异性地结合。在一些实施方案中，所述反义核酸分子是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特定双链杂交体，其中与通常的β-单元相对照，两条链彼此平行延伸(Gaultier等人,Nucleic Acids.Res.15:6625-6641(1987))。所述反义核酸分子还可以包含2'-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等人,Nucleic Acids Res.15:6131-6148(1987))或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人,FEBS Lett.215:327-330(1987))。
本公开文本还提供了短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)，其包含与SEQ IDNO:13-23(TXNRD1 mRNA同种型)中任一个的一部分互补且特异性杂交的核酸序列，从而降低或抑制TXNRD1表达。在一些实施方案中，所述shRNA或siRNA的长度为约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个碱基对。双链RNA(dsRNA)可以在许多生物体(如秀丽隐杆线虫(C.elegans)、果蝇属(Drosophila)、植物、哺乳动物、卵母细胞和早期胚胎)中诱导序列特异性转录后基因沉默(例如，RNA干扰(RNAi))。RNAi是干扰或显著降低由mRNA制备的蛋白质拷贝的数量的过程。例如，双链siRNA或shRNA分子被工程化为与靶基因的mRNA互补并杂交。在细胞内递送之后，所述siRNA或shRNA分子与RNA诱导的沉默复合物(RISC)有关，然后其结合并降解互补靶mRNA(例如TXNRD1 mRNA)。在一些实施方案中，所述shRNA或siRNA包含SEQID NO:1-12中任一个的核酸序列。
本公开文本还提供了核糖酶，其包含与SEQ ID NO:13-23(TXNRD1 mRNA同种型)中任一个的一部分互补且特异性杂交的核酸序列，从而降低或抑制TXNRD1表达。核糖酶是具有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，其能够切割互补的单链核酸，如mRNA。因此，核糖酶(例如，锤头状核糖酶(描述于Haselhoff和Gerlach,Nature 334:585-591(1988)))可以用于催化切割TXNRD1转录物，从而抑制TXNRD1的翻译。
可以基于本文公开的TXNRD1核酸序列设计对TXNRD1编码核酸具有特异性的核糖酶。例如，可以构建四膜虫属L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与TXNRD1编码mRNA中待切割的核苷酸序列互补。参见例如，美国专利号4,987,071和美国专利号5,116,742。可替代地，TXNRD1 mRNA可以用于从RNA分子池选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化RNA。参见例如，通过引用并入本文的Bartel和Szostak(1993)Science 261:1411-1418。
本公开文本还提供了合成指导RNA(sgRNA)，其包含与SEQ ID NO:13-23(TXNRD1mRNA同种型)中任一个的一部分互补且特异性杂交的核酸序列。用于CRISPR-Cas系统中的指导RNA通常作为包含crRNA区段和tracrRNA区段的单个指导RNA产生。crRNA区段和tracrRNA区段也可以作为单独的RNA分子产生。crRNA区段包含与SEQ ID NO:13-23(TXNRD1mRNA同种型)中任一个的一部分结合的靶向部分以及与tracrRNA杂交的茎部分。所述tracrRNA区段包含与所述crRNA的茎序列部分或完全互补的核苷酸序列以及与CRISPR酶结合的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述crRNA区段和所述tracrRNA区段作为单个指导RNA提供。在一些实施方案中，所述crRNA区段和所述tracrRNA区段作为单独的RNA提供。CRISPR酶与所述crRNA和tracrRNA的组合构成功能性CRISPR-Cas系统。用于靶向核酸的示例性CRISPR-Cas系统描述于例如WO2015/089465中。
在一些实施方案中，合成指导RNA是表示为包含以下元件的单个RNA：
5′-X1-X2-Y-Z-3′
其中X1和X2表示crRNA区段，其中X1是与SEQ ID NO:13-23中任一个的一部分结合的靶向序列，X2是与tracrRNA杂交的茎序列，Z表示包含与X2部分或完全互补的核苷酸序列的tracrRNA区段，并且Y表示接头序列。在一些实施方案中，所述接头序列包含两个或更多个核苷酸并且将所述crRNA和tracrRNA区段连接。在一些实施方案中，所述接头序列包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，所述接头是当茎序列与tracrRNA杂交时形成的发夹结构的环。
在一些实施方案中，合成指导RNA作为两个单独的RNA提供，其中一个RNA表示crRNA区段：5'-X1-X2-3'，其中X1是与SEQ ID NO:13-23中任一个的一部分结合的靶向序列，X2是与tracrRNA杂交的茎序列，并且一个RNA表示tracrRNA区段Z，其是与crRNA区段分开的RNA并且包含与crRNA的X2部分或完全互补的核苷酸序列。
示例性crRNA茎序列和tracrRNA序列提供于例如WO/2015/089465中，将其通过引用并入本文。一般而言，茎序列包括任何序列，其具有与tracrRNA中的互补序列足够的互补性以促进在靶序列处形成CRISPR复合物，其中所述CRISPR复合物包含与tracrRNA杂交的茎序列。一般而言，互补性的程度是关于茎序列与tracrRNA中的互补序列沿着这两个序列中的较短者的长度的最佳比对。最佳比对可以通过任何合适的比对算法来确定，并且还可以考虑二级结构，如茎序列或tracrRNA中的互补序列内的自身互补性。在一些实施方案中，当最佳比对时，所述茎序列与所述tracrRNA中的互补序列之间的互补性的程度为约或大于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更高。在一些实施方案中，所述茎序列的长度为约或大于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，所述茎序列和所述tracrRNA中的互补序列被包含在单个RNA内，使得两者之间的杂交产生具有二级结构的转录物，如发夹。在一些实施方案中，所述tracrRNA具有形成发夹的另外的互补序列。在一些实施方案中，所述tracrRNA具有至少两个或更多个发夹。在一些实施方案中，所述tracrRNA具有两个、三个、四个或五个发夹。在一些实施方案中，所述tracrRNA具有最多五个发夹。
在发夹结构中，环的最终“N”和上游的5'端的序列部分对应于所述crRNA茎序列，并且环的3'端的序列部分对应于所述tracrRNA序列。包含指导序列、茎序列和tracr序列的单个多核苷酸的其他非限制性例子如下(以5'至3'列出)，其中“N”表示指导序列(例如，本文提供的修饰的寡核苷酸)的碱基，第一段小写字母表示茎序列，并且第二段小写字母表示tracrRNA序列，并且最终的聚T序列表示转录终止子：(a)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataa ggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT(SEQ ID NO:24)；(b)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccg aaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT(SEQ ID NO:25)；(c)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccg aaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT(SEQ ID NO:26)；(d)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaactt gaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT(SEQ ID NO:27)；(e)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaac ttgaaaaagtgTTTTTTT(SEQ ID NO:28)；以及(f)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTT TTTTTT(SEQ ID NO:29)。
在CRISPR Cas系统中用作靶向序列的合适的寡核苷酸取决于若干种因素，包括待使用的特定CRISPR酶以及在靶核酸中靶序列下游的相应的前间区序列邻近基序(PAM)的存在。所述PAM序列通过CRISPR酶引导靶核酸的切割。在一些实施方案中，对于SpCas9或SaCas9酶(或其衍生酶)合适的PAM分别是5'-NRG或5'-NNGRR(其中N是任何核苷酸)。通常，所述PAM序列应存在于靶序列的约1至约10个核苷酸之间以产生靶核酸的有效切割。因此，当指导RNA与CRISPR酶形成复合物时，所述复合物定位至靶序列和PAM序列，解开DNA双链体，并且指导RNA退火至相对链上的互补序列。这使得Cas9核酸酶能够产生双链断裂。在一些实施方案中，所述sgRNA包含SEQ ID NO:1-12中任一个的核酸序列。
多种CRISPR酶可用于与本公开文本的公开的指导RNA组合使用。在一些实施方案中，所述CRISPR酶是II型CRISPR酶。在一些实施方案中，所述CRISPR酶催化DNA切割。在一些实施方案中，所述CRISPR酶催化RNA切割。在一些实施方案中，所述CRISPR酶是任何Cas9蛋白，例如任何天然存在的细菌Cas9以及任何嵌合体、突变体、同源物或直系同源物。Cas蛋白的非限制性例子包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物或其修饰的变体。在一些实施方案中，所述CRISPR酶在前间区序列邻近基序(PAM)处切割靶核酸的两条链。在一些实施方案中，所述CRISPR酶是切口酶，其仅切割靶核酸的一条链。在一些实施方案中，所述CRISPR酶是用另外的酶活性标记的dCas9，其抑制或激活目的基因的表达。
药物组合物
在一个方面，本公开文本提供了包含TXNRD1抑制剂的药物组合物。
本公开文本的药物组合物可以通过药物技术中已知的任何方法来制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和特定的施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。通常，活性化合物的量将在约0.1％至99％、更典型地约5％至70％、以及更典型地约10％至30％的范围内。
在一些实施方案中，本发明技术的药物组合物可以含有一种或多种药学上可接受的载体，如本文所用，其通常是指药学上可接受的组合物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造辅助物(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)或可用于将活性剂引入体内的溶剂包封材料。
可用于本发明技术的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的例子包括例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)以及它们的合适混合物。可以例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度、以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
在一些实施方案中，所述配制品可以包含以下项中的一种或多种：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；海藻酸；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙基醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；防腐剂；助流剂；填充剂；以及药物配制品中使用的其他无毒相容物质。
各种助剂(如润湿剂、乳化剂、润滑剂(例如，十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁)、着色剂、脱离剂、涂层剂、甜味剂、调味剂、防腐剂和抗氧化剂)也可以包含在本发明技术的药物组合物中。药学上可接受的抗氧化剂的一些例子包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。在一些实施方案中，所述药物配制品包含选自例如纤维素、脂质体、脂质纳米颗粒、胶束形成剂(例如，胆汁酸)和聚合物载体(例如聚酯和聚酸酐)的赋形剂。除活性化合物外，悬浮液可以含有悬浮剂，例如像乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇、脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄芪胶及其组合。可以通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如像对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保防止微生物对活性化合物的作用。还可能令人希望的是在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的药剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延迟吸收。
治疗方法
以下讨论仅通过示例的方式呈现，而不是旨在限制性的。
本发明技术的一个方面包括治疗特征在于TXNRD1的升高的表达水平和/或增加的活性的疾病或病症的方法。另外地或可替代地，在一些实施方案中，本发明技术包括治疗RAS突变体癌症的方法。RAS的三种主要同种型(KRAS、NRAS和HRAS)合起来在约20％的人癌症中突变，其主要在靠近鸟苷三磷酸(GTP)底物的g-磷酸盐的残基G12、G13和Q61处的活性位点中(参见Marcus和Mattos,Clin Cancer Res 21(8):1810-1818(2015))。在某些实施方案中，所述RAS突变体癌症包含选自G12C、G12D、G12V、G12A、G12S、G12R、G13D、G13C、G13S、G13R、G13A、G13V、Q61H、Q61L、Q61R、Q61K、Q61P和Q61E的KRAS、NRAS或HRAS突变。
在一些实施方案中，本发明技术包括治疗RAS突变体胰腺癌的方法。在一个方面，本公开文本提供了一种用于在有需要的受试者中抑制RAS突变体癌症的增殖的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文公开的至少一种TXNRD1抑制剂，并且其中所述受试者患有特征在于TXNRD1的升高的表达水平和/或增加的活性的RAS突变体癌症。
在一些实施方案中，所述受试者被诊断为患有、被怀疑患有或有风险患上特征在于TXNRD1的升高的表达水平和/或增加的活性的疾病或病症。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述受试者被诊断为患有RAS突变体癌症。在某些实施方案中，所述RAS突变体癌症包含选自G12C、G12D、G12V、G12A、G12S、G12R、G13D、G13C、G13S、G13R、G13A、G13V、Q61H、Q61L、Q61R、Q61K、Q61P和Q61E的KRAS、NRAS或HRAS突变。在一些实施方案中，所述受试者被诊断为患有肺癌(例如，肺腺癌)、粘蛋白腺瘤、胰腺癌(例如，PDAC)、结直肠癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤)、子宫内膜癌、睾丸胚细胞癌或肾上腺癌。在一些实施方案中，所述受试者被诊断为患有胰腺癌。在一些实施方案中，所述受试者被诊断为患有RAS突变体胰腺癌。
在治疗应用中，将包含本文公开的TXNRD1抑制剂的组合物或药物以一定的量施用至被怀疑患有或已经患有这种疾病或病症的受试者(如被诊断为患有特征在于TXNRD1的升高的表达水平和/或增加的活性的疾病或病症的受试者和/或被诊断为患有RAS突变体癌症的受试者和/或被诊断为患有胰腺癌的受试者)，所述量足以治愈或至少部分阻止所述疾病的症状，包括其并发症和所述疾病的发展中的中间病理学表型。
通过本领域已知的诊断或预后测定的任一种或其组合可以鉴定患有特征在于TXNRD1的升高的表达水平和/或增加的活性的疾病或病症的受试者和/或被诊断为患有RAS突变体癌症的受试者。
在一些实施方案中，所述受试者可以展现出KRAS中的一个或多个突变。另外，所述受试者可以展现出以下基因中至少一个基因中的一个或多个突变：TP53、CDKN2A、SMAD4、MLL3、TGFBR2、ARID1A和SF3B1、EPC1和ARID2、ATM、ZIM2、MAP2K4、NALCN、SLC16A4、MAGEA6、ROBO2、KDM6A、PREX2、ERBB2、MET、FGFR1、CDK6、PIK3R3、PIK3CA、BRCA1、BRCA2、PALB2等。Biankin等人,Nature 491(7424):399-405(2012)；以及Waddell等人,Nature 518(7540):495-501(2015)。另外地或可替代地，所述受试者可以展现出十二个细胞信号传导途径和过程的核心组中的一个或多个中的至少一个突变。Jones等人,Science 321(5897):1801-1806(2008)。
在一些实施方案中，用所述TXNRD1抑制剂治疗的患有特征在于TXNRD1的升高的表达水平和/或增加的活性的疾病或病症的受试者和/或患有RAS突变体胰腺癌的受试者将显示出以下症状中一种或多种的改善或消除：辐射背部的上腹疼痛、食欲不振或非故意的体重减轻、抑郁症、新发作的糖尿病、血凝块、疲劳、皮肤和眼白发黄(黄疸)、胃气胀、恶心和呕吐。
在某些实施方案中，与患有RAS突变体癌症的未治疗受试者相比，用所述TXNRD1抑制剂治疗的患有特征在于TXNRD1的升高的表达水平和/或TXNRD1的增加的活性水平的疾病或病症的受试者和/或患有RAS突变体癌症的受试者和/或患有胰腺癌的受试者将显示出降低的RAS突变体细胞增殖和/或增加的存活率。在某些实施方案中，与患有RAS突变体癌症的未治疗受试者相比，用所述TXNRD1抑制剂治疗的患有特征在于TXNDR1的升高的表达水平和/或TXNRD1的增加的活性的疾病或病症的受试者和/或患有RAS突变体癌症的受试者和/或患有胰腺癌的受试者将显示出降低的TXNRD1和/或RAS表达水平和/或降低的TXNRD1和/或RAS活性水平。
在一个方面，本公开文本提供了一种用于监测TXNRD1抑制剂在被诊断为患有RAS突变体癌症的受试者中的治疗功效的方法，所述方法包括：(a)在已向所述受试者施用所述TXNRD1抑制剂之后检测从所述受试者获得的测试样品中的TXNRD1蛋白水平；以及(b)当所述测试样品中TXNRD1蛋白水平相比于在施用所述TXNRD1抑制剂之前从所述受试者获得的对照样品中观察到的TXNRD1蛋白水平降低时，确定所述TXNRD1抑制剂是有效的。所述TXNRD1抑制剂可以是金诺芬、荜拔酰胺、D9、TRi-1、TRi-2、杨梅黄酮、PMX464、PX12、双鞭甲藻毒素-2、手霉素A、乙烷硒啉、金硫葡糖、原卟啉IX、针对TXNRD1的抑制RNA、抗TXNRD1抗体或其任何衍生物。所述测试样品可以是受试者体内存在的组织、细胞或生物流体(血液、血浆、唾液、尿液、血清等)。可替代地，可以使用RAS(例如，KRAS、HRAS、NRAS)和/或TXNRD1表达水平来确定所述TXNRD1抑制剂在所述受试者中的功效(参见本文所述的实施例6)。因此，在某些实施方案中，所述方法还包括检测受试者中RAS(例如，KRAS、HRAS、NRAS)和/或TXNRD1表达水平，其中RAS(例如，KRAS、HRAS、NRAS)和/或TXNRD1表达水平相对于治疗前在所述受试者中观察到的那些表达水平的减小指示所述TXNRD1抑制剂的治疗功效。另外地或可替代地，在某些实施方案中，所述方法还包括检测受试者中RAS(例如，KRAS、HRAS、NRAS)和/或TXNRD1蛋白的活性，其中RAS(例如，KRAS、HRAS、NRAS)和/或TXNRD1活性相对于治疗前在所述受试者中观察到的那些活性的减小指示所述TXNRD1抑制剂的治疗功效。在某些实施方案中，所述RAS突变体癌症包含选自G12C、G12D、G12V、G12A、G12S、G12R、G13D、G13C、G13S、G13R、G13A、G13V、Q61H、Q61L、Q61R、Q61K、Q61P和Q61E的KRAS、NRAS或HRAS突变。在某些实施方案中，经由DNA测序检测所述KRAS、NRAS或HRAS突变。
在本文所公开的方法的任何和所有实施方案中，经由以下方式检测TXNRD1和/或RAS(例如，KRAS、HRAS、NRAS)表达水平：RNA-seq、northern印迹、微阵列、斑点或狭线印迹、荧光原位杂交、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、核糖核酸酶保护测定(RPA)、实时定量RT-PCR、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱法-质谱法(LC/MS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、免疫电泳、免疫染色、免疫组织化学或蛋白质印迹。
预防方法
在一个方面，本发明技术提供了一种用于预防或延迟特征在于TXNRD1的升高的表达水平和/或增加的活性的疾病或病症的发作的方法。另外地或可替代地，在一些方面，本发明技术提供了一种用于预防或延迟RAS突变体癌症发作的方法。在某些实施方案中，所述RAS突变体癌症包含选自G12C、G12D、G12V、G12A、G12S、G12R、G13D、G13C、G13S、G13R、G13A、G13V、Q61H、Q61L、Q61R、Q61K、Q61P和Q61E的KRAS、NRAS或HRAS突变。所述RAS突变体癌症可以是肺癌(例如，肺腺癌)、粘蛋白腺瘤、胰腺癌(例如，PDAC)、结直肠癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤)、子宫内膜癌、睾丸胚细胞癌或肾上腺癌。
有风险患上或易患上特征在于TXNRD1的升高的表达水平和/或增加的活性的疾病或病症的受试者和/或有风险患上或易患上RAS突变体癌症的受试者和/或有风险患上或易患上胰腺癌的受试者包括展现出RAS(例如，KRAS、HRAS、NRAS)中的一个或多个突变的受试者。另外，所述受试者可以展现出以下基因中一个或多个中的一个或多个点突变：TP53、CDKN2A、SMAD4、MLL3、TGFBR2、ARID1A和SF3B1、EPC1和ARID2、ATM、ZIM2、MAP2K4、NALCN、SLC16A4、MAGEA6、ROBO2、KDM6A、PREX2、ERBB2、MET、FGFR1、CDK6、PIK3R3、PIK3CA、BRCA1、BRCA2、PALB2等。Biankin等人,Nature491(7424):399-405(2012)；以及Waddell等人,Nature 518(7540):495-501(2015)。另外地或可替代地，所述受试者可以展现出十二个细胞信号传导途径和过程的核心组中的一个或多个中的至少一个突变。Jones等人,Science321(5897):1801-1806(2008)。此类受试者可以通过例如本领域已知的诊断或预后的任一种或其组合来鉴定。在某些实施方案中，所述RAS突变体癌症包含选自G12C、G12D、G12V、G12A、G12S、G12R、G13D、G13C、G13S、G13R、G13A、G13V、Q61H、Q61L、Q61R、Q61K、Q61P和Q61E的KRAS、NRAS或HRAS突变。
在预防应用中，将包含本文公开的TXNRD1抑制剂的药物组合物或药物以一定的量施用至易患上或原本有风险患上特征在于(a)TXNRD1的升高的表达水平和/或增加的活性的疾病或病症的受试者和/或(b)易患上或原本有风险患上RAS突变体癌症的受试者和/或易患上或原本有风险患上胰腺癌的受试者，所述量足以消除或降低所述疾病发作的风险或延迟所述疾病发作，包括所述疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症以及在所述疾病发展过程中的中间病理学表型。预防性TXNRD1抑制剂的施用可以在所述疾病或障碍所特有的症状显现之前进行，使得预防所述疾病或障碍或者延迟其进展。
在一些实施方案中，用所述TXNRD1抑制剂的治疗将预防或延迟以下症状中一种或多种的发作：辐射背部的上腹疼痛、食欲不振或非故意的体重减轻、抑郁症、新发作的糖尿病、血凝块、疲劳、皮肤和眼白发黄(黄疸)、胃气胀、恶心和呕吐。在某些实施方案中，用所述TXNRD1抑制剂治疗的(a)患有特征在于TXNRD1的升高的表达水平和/或增加的活性的疾病或病症的受试者和/或(b)患有RAS突变体癌症的受试者和/或患有胰腺癌的受试者将显示出这样的TXNRD1和/或RAS表达水平，其类似于在健康对照受试者中观察到的那些表达水平。
对于治疗和/或预防应用，将包含本文公开的TXNRD1抑制剂的组合物施用至所述受试者。在一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂是每天施用一次、两次、三次、四次或五次。在一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂是每天施用多于五次。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂是每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天或每六天施用一次。在一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂是每周、每两周、每三周或每月施用一次。在一些实施方案中，将所述TXNRD1抑制剂施用一周、两周、三周、四周或五周的时间段。在一些实施方案中，将所述TXNRD1抑制剂施用六周或更长时间。在一些实施方案中，将所述TXNRD1抑制剂施用十二周或更长时间。在一些实施方案中，将所述TXNRD1抑制剂施用不到一年的时间段。在一些实施方案中，将所述TXNRD1抑制剂施用多于一年的时间段。在一些实施方案中，将所述TXNRD1抑制剂施用受试者的整个生命周期。
在本发明技术的方法的一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂是每天施用，持续1周或更长时间。在本发明技术的方法的一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂是每天施用，持续2周或更长时间。在本发明技术的方法的一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂是每天施用，持续3周或更长时间。在本发明技术的方法的一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂是每天施用，持续4周或更长时间。在本发明技术的方法的一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂是每天施用，持续6周或更长时间。在本发明技术的方法的一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂是每天施用，持续12周或更长时间。在一些实施方案中，所述TXNRD1抑制剂是每天施用，持续受试者的整个生命周期。
TXNRD1抑制剂的生物作用的测定
在各种实施方案中，进行合适的体外或体内测定以测定特异性TXNRD1抑制剂的效果以及是否表明其施用可用于治疗。在各种实施方案中，可以用代表性动物模型进行体外测定以测定给定的TXNRD1抑制剂是否对减轻或消除RAS突变体癌症的体征和/或症状产生所需的效果。在人受试者中测试之前，可以在合适的动物模型系统中测试用于疗法的化合物，所述合适的动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、奶牛、猴子、兔等。类似地，对于体内测试，可以在向人受试者施用之前使用本领域已知的任何动物模型系统。在一些实施方案中，体外或体内测试涉及本发明技术的一种或多种TXNDR1抑制剂的生物功能。
可以使用本领域已知的技术(参见本文所述的实施例7)产生RAS突变体癌症和/或胰腺癌的动物模型。此类模型可以用于证明TXNRD1抑制剂在预防和治疗由特定基因的破坏引起的病症和/或抑制特定蛋白质的活性方面的生物作用，以及用于确定本文公开的一种或多种TXNRD1抑制剂在给定上下文中的治疗有效量是多少。
施用模式和有效剂量
可以使用本领域技术人员中已知的用于使细胞、器官或组织与本文公开的一种或多种TXNRD1抑制剂接触的任何方法。合适的方法包括体外、离体或体内方法。体内方法通常包括将一种或多种TXNRD1抑制剂施用至哺乳动物(合适地是人)。当在体内使用疗法时，将本文所述的一种或多种TXNRD1抑制剂以有效量(即，具有所需治疗效果的量)施用至所述受试者。所述剂量和剂量方案将取决于受试者的疾病状态的程度、所用的特定TXNRD1抑制剂的特征(例如其治疗指数)以及受试者的病史。
可以通过医生和临床医生熟悉的方法在临床前试验和临床试验期间确定有效量。可以将有效量的一种或多种可用于这些方法的TXNRD1抑制剂通过用于施用药物组合物的许多熟知方法中的任一种施用至有需要的哺乳动物。所述TXNRD1抑制剂可以全身或局部施用。
本文所述的一种或多种TXNRD1抑制剂可以掺入药物组合物中以单独或组合施用至受试者以用于治疗或预防RAS突变体癌症和/或单独或组合施用至受试者以用于治疗或预防胰腺癌。此类组合物通常包括活性剂和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。也可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
通常将药物组合物配制为与其预期的施用途径相容。施用途径的例子包括肠胃外(例如，静脉内、皮内、腹膜内或皮下)、口服、吸入、透皮(局部)、眼内、离子电渗和透粘膜施用。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或混悬液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。可以将pH用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。为了便于患者或治疗医生，给药配制品可以提供于试剂盒中，所述试剂盒含有对于治疗过程(例如，治疗7天)的所有必需的设备(例如，药物的小瓶、稀释剂的小瓶、注射器和针头)。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CREMOPHOR ELTM(BASF，帕西帕尼，新泽西州)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，用于肠胃外施用的组合物必须是无菌的，并且应是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下应稳定并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。
具有本文公开的一种或多种TXNRD1抑制剂的药物组合物可以包括载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌以及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞(thiomerasol)等来实现。可以包含谷胱甘肽和其他抗氧化剂以防止氧化。在许多情况下，在所述组合物中包含等渗剂将是有利的，所述等渗剂例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝或明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，接着过滤灭菌。通常，通过将所述活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，典型制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥可以由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。出于口服治疗施用的目的，可以将所述活性化合物与赋形剂掺在一起，并以片剂、锭剂或胶囊(例如，明胶胶囊)的形式使用。也可以使用用作漱口水的流体载体制备口服组合物。药学上相容的结合剂和/或辅助材料可以作为组合物的一部分被包含在内。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解剂，如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如二氧化硅胶体；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
对于通过吸入施用，可以从加压容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如气体(如二氧化碳))或者喷雾器以气溶胶喷雾剂形式递送所述化合物。此类方法包括描述于美国专利号6,468,798中的那些。
如本文所述的治疗化合物的全身施用也可以通过透粘膜或透皮装置进行。对于透粘膜或透皮施用，在配制品中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域通常已知的，并且对于透粘膜施用，包括例如洗涤剂、胆盐和夫西地酸衍生物。透粘膜施用可以通过使用鼻腔喷雾剂来完成。对于透皮施用，将活性化合物配制成如本领域通常已知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。在一个实施方案中，可以通过离子电渗进行透皮施用。
可以将治疗剂配制在载体系统中。所述载体可以是胶体系统。所述胶体系统可以是脂质体、磷脂双层媒介物或脂质纳米颗粒。在一个实施方案中，将所述治疗剂包封在脂质体中，同时保持所述药剂的结构完整性。本领域技术人员将理解，有多种方法制备脂质体。(参见Lichtenberg等人,Methods Biochem.Anal.,33:337-462(1988)；Anselem等人,Liposome Technology,CRC Press(1993))。脂质体配制品可以延迟清除并增加细胞摄取(参见Reddy,Ann.Pharmacother.,34(7-8):915-923(2000))。也可以将活性剂装载至由药学上可接受的成分制备的颗粒中，包括但不限于可溶性、不溶性、可渗透的、不可渗透的、可生物降解的或胃滞留的聚合物或脂质体。此类颗粒包括但不限于纳米颗粒、可生物降解的纳米颗粒、微粒、可生物降解的微粒、纳米球、可生物降解的纳米球、微球、可生物降解的微球、胶囊、乳液、脂质体、胶束和病毒载体系统。
所述载体也可以是聚合物，例如可生物降解的生物相容性聚合物基质。在一个实施方案中，可以将所述治疗剂包埋在聚合物基质中，同时保持所述药剂的结构完整性。所述聚合物可以是天然的(如多肽、蛋白质或多糖)或合成的(如聚α-羟基酸)。例子包括由例如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、醋酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶及其组合制成的载体。在一个实施方案中，所述聚合物是聚乳酸(PLA)或共聚乳酸/乙醇酸(PGLA)。所述聚合物基质可以以各种形式和大小(包括微球和纳米球)制备和分离。聚合物配制品可以导致治疗效果的持续时间延长。(参见Reddy,Ann.Pharmacother.,34(7-8):915-923(2000))。对于人生长激素(hGH)的聚合物配制品已用于临床试验。(参见Kozarich和Rich,ChemicalBiology,2:548-552(1998))。
聚合物微球持续释放配制品的例子描述于PCT公开WO 99/15154(Tracy等人)、美国专利号5,674,534和5,716,644(两个专利均为Zale等人)、PCT公开WO 96/40073(Zale等人)以及PCT公开WO 00/38651(Shah等人)。美国专利号5,674,534和5,716,644以及PCT公开WO 96/40073描述了含有针对与盐聚集稳定的红细胞生成素颗粒的聚合物基质。
在一些实施方案中，所述治疗化合物用载体来制备，所述载体将保护所述治疗化合物免于从身体迅速清除，如控制释放配制品，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。此类配制品可以使用已知技术来制备。所述材料也可以例如从AlzaCorporation and Nova Pharmaceuticals,Inc.商购获得。脂质体悬浮液(包括用针对细胞特有抗原的单克隆抗体靶向特定细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可以根据例如在美国专利号4,522,811中所述的本领域技术人员已知的方法来制备。
所述治疗化合物也可以被配制为增强细胞内递送。例如，脂质体递送系统是本领域已知的，参见例如Chonn和Cullis,“Recent Advances in Liposome Drug DeliverySystems,”Current Opinion in Biotechnology 6:698-708(1995)；Weiner,“Liposomesfor Protein Delivery:Selecting Manufacture and Development Processes,”Immunomethods,4(3):201-9(1994)；以及Gregoriadis,“Engineering Liposomes forDrug Delivery:Progress and Problems,”Trends Biotechnol.,13(12):527-37(1995)。Mizguchi等人,Cancer Lett.,100:63-69(1996)描述了使用促融合脂质体将蛋白质在体内和体外递送至细胞。
任何治疗剂的剂量、毒性和治疗功效可以在细胞培养物或实验动物中通过例如用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)的标准药学程序来确定。在毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为比率LD50/ED50。展现出高治疗指数的化合物是有利的。尽管可以使用展现出毒性副作用的化合物，但是应谨慎设计递送系统，其将此类化合物靶向累及组织的部位，以最小化对未感染细胞的潜在损害，从而减少副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制用于人的一系列剂量。此类化合物的剂量可以在包括ED50而几乎没有或没有毒性的一系列循环浓度内。剂量可以取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而在这个范围内变化。对于所述方法中使用的任何化合物，最初可以从细胞培养测定估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以达到循环血浆浓度范围，其包括如细胞培养中确定的IC50(即，测试化合物的达到症状的半数最大抑制的浓度)。此类信息可以用于准确地确定人的有用剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱法测量。
通常，足以实现治疗或预防效果的本文公开的一种或多种TXNRD1抑制剂的有效量在每天每公斤体重约0.000001mg至每天每公斤体重约10,000mg的范围内。合适地，剂量范围是从约0.0001mg/公斤体重/天至约100mg/公斤体重/天。例如，剂量可以是每天、每两天或每三天1mg/kg体重或10mg/kg体重，或者在每周、每两周或每三周1-10mg/kg的范围内。在一个实施方案中，所述治疗化合物的单剂量在每kg体重0.001-10,000微克的范围内。在一个实施方案中，载体中的一种或多种TXNRD1抑制剂浓度在递送的每毫升中0.2至2000微克的范围内。示例性治疗方案需要每天施用一次或每周施用一次。在治疗性应用中，有时需要间隔相对短的相对高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，或直到受试者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向患者施用预防性方案。
在一些实施方案中，治疗有效量的一种或多种TXNRD1抑制剂可以被定义为在靶组织处10-32至10-6摩尔(例如，约10-7摩尔)的抑制剂浓度。此浓度可以通过0.001至100mg/kg的全身剂量或依据体表面积的当量剂量来递送。将优化剂量时间表以维持靶组织处的治疗剂浓度，例如通过每天或每周单次施用，但是也包括连续施用(例如，肠胃外输注或透皮施用)。
本领域技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，这些因素包括但不限于，疾病或障碍的严重程度、先前治疗、受试者的总体健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的本文所述的治疗组合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。
根据本发明方法治疗的哺乳动物可以是任何哺乳动物，包括例如农场动物，如绵羊、猪、牛和马；宠物动物，如狗和猫；实验动物，如大鼠、小鼠和兔。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。
组合疗法
在一些实施方案中，本文公开的一种或多种TXNRD1抑制剂可以与用于预防或治疗RAS突变体癌症或胰腺癌的一种或多种另外的疗法组合。另外的治疗剂包括但不限于
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(白蛋白结合的紫杉醇)、
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(吉西他滨)、5-FU(氟尿嘧啶)、
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(伊立替康脂质体注射剂)、手术、放射或其组合。
在一些实施方案中，本文公开的一种或多种TXNRD1抑制剂可以与至少一种选自以下的另外的治疗剂单独地、顺序地或同时施用：免疫治疗剂、烷基剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应激诱导剂、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、氮芥、亚硝基脲、烷基磺酸盐、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、RAS抑制剂、PARP抑制剂、抑制细胞生长的生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、内分泌/激素剂、双膦酸盐治疗剂、苯乙双胍和靶向生物治疗剂(例如US 6306832、WO 2012007137、WO 2005000889、WO 2010096603中描述的治疗肽)。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂是化学治疗剂。
特异性化学治疗剂包括但不限于环磷酰胺、氟尿嘧啶(或5-氟尿嘧啶或5-FU)、甲氨蝶呤、依达曲沙(10-乙基-10-脱氮-氨蝶呤)、噻替派、卡铂、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、蛋白质结合的紫杉醇、多西紫杉醇、长春瑞滨、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、氟维司群、吉西他滨、伊立替康、伊沙匹隆、替莫唑胺、拓扑替康、长春新碱、长春花碱、艾瑞布林、突变霉素、卡培他滨、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、亮丙瑞林、阿巴瑞克、布舍瑞林、戈舍瑞林、醋酸甲地孕酮、利塞膦酸盐、帕米膦酸盐、伊班膦酸盐、阿仑膦酸盐、地诺单抗、唑来膦酸、曲妥珠单抗、泰立沙、蒽环类药物(例如，道诺霉素和阿霉素)、克拉屈滨、米哚妥林、贝伐单抗、奥沙利铂、美法仑、依托泊苷、氮芥、博来霉素、微管毒物、番荔枝内酯、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、链脲佐菌素、卡莫司汀、洛莫司汀、白消安、达卡巴嗪、替莫唑胺、六甲蜜胺、6-巯基嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、培美曲塞、表柔比星、去甲氧基柔红霉素、SN-38、ARC、NPC、喜树碱、9-硝基喜树碱、9-氨基喜树碱、rubifen、吉马替康、二氟替康、BN80927、DX-8951f、MAG-CPT、氨吖啶、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、氮杂胞苷(Vidaza)、地西他滨、浆果赤霉素III、10-脱乙酰紫杉醇、7-木糖基-10-脱乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、10-脱乙酰-7-表紫杉醇、7-表紫杉醇、10-脱乙酰浆果赤霉素III、10-脱乙酰三尖杉宁碱、链脲佐菌素、尼莫司汀、雷莫司汀、苯达莫司汀、乌拉莫司汀、雌莫司汀、甘露舒凡、喜树碱、依喜替康、勒托替康、片螺素D9-氨基喜树碱、安吖啶、玫瑰树碱、金精三羧酸、HU-331或其组合。
抗代谢药的例子包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞及其混合物。
紫杉烷的例子包括浆果赤霉素III、10-脱乙酰紫杉醇、7-木糖基-10-脱乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、10-脱乙酰-7-表紫杉醇、7-表紫杉醇、10-脱乙酰浆果赤霉素III、10-脱乙酰三尖杉宁碱及其混合物。
DNA烷化剂的例子包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、苯达莫司汀、乌拉莫司汀、雌莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、链脲佐菌素、白消安、甘露舒凡及其混合物。
拓扑异构酶I抑制剂的例子包括SN-38、ARC、NPC、喜树碱、拓扑替康、9-硝基喜树碱、依喜替康、勒托替康、片螺素D9-氨基喜树碱、rubifen、吉马替康、二氟替康、BN80927、DX-8951f、MAG-CPT及其混合物。拓扑异构酶II抑制剂的例子包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、道诺霉素、米托蒽醌、安吖啶、玫瑰树碱、金精三羧酸、阿霉素和HU-331及其组合。
免疫治疗剂的例子包括免疫检查点抑制剂(例如、靶向CTLA-4、PD-1、PD-L1的抗体)、伊匹单抗、90Y-泰坦-克利妥珠单抗、派姆单抗、纳武单抗、曲妥珠单抗、西妥木单抗、加尼妥单抗、登赛珠单抗、西妥昔单抗、尼妥珠单抗、达洛妥珠单抗、西普鲁塞-T、CRS-207以及GVAX。
RAS抑制剂的例子包括AMG 510、MRTX849、ARS-3248、BI 1701963、ARS-1620、ARS-853、硫醇反应性GDP类似物、BBP-454、mRNA-5671、KRAS G12D抑制剂等。
在任何情况下，多种治疗剂可以以任何顺序施用或甚至同时施用。如果同时施用的话，可以按单一的统一形式或按多种形式(仅通过举例的方式，作为单个药丸或作为两个分开的药丸)提供多种治疗剂。所述治疗剂之一可以以多个剂量给予，或者二者均可以作为多个剂量给予。如果不同时的话，多次剂量之间的时间可能从超过零周至不到四周变化。另外，所述组合方法、组合物和制剂并不限于仅使用两种药剂。
试剂盒
本公开文本还提供了用于预防和/或治疗RAS突变体癌症(例如，RAS突变体胰腺癌)的试剂盒，其包含一种或多种TXNRD1抑制剂。任选地，本发明技术的试剂盒的上述组分被包装在合适的容器中并标记为用于预防和/或治疗RAS突变体癌症(例如，RAS突变体胰腺癌)。
上述组分可以作为水溶液(优选无菌溶液)或作为用于重构的冻干(优选无菌)配制品的形式储存在单元容器或多剂量容器(例如，密封的安瓿、小瓶、瓶子、注射器和试管)中。所述试剂盒还可以包含第二容器，所述第二容器容纳有适合于将药物组合物稀释至更大体积的稀释剂。合适的稀释剂包括但不限于药物组合物的药学上可接受的赋形剂和盐水溶液。此外，所述试剂盒可以包含用于稀释药物组合物的说明书和/或用于施用稀释的或未稀释的药物组合物的说明书。所述容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)制成，并且可以具有无菌的进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或带有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述试剂盒还可以包含更多容器，所述容器含有药学上可接受的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。所述试剂盒还可以包括从商业和用户的角度来看合意的其他材料，包括用于一种或多种合适宿主的其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器、培养基。所述试剂盒可以任选地包括通常包含在治疗或诊断产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于例如关于使用此类治疗或诊断产品的适应症、用法、剂量、制造、施用、禁忌症和/或警告的信息。
试剂盒也可以包含例如缓冲剂、防腐剂或稳定剂。试剂盒还可以含有对照样品或一系列对照样品，可以对其进行测定并与测试样品进行比较。试剂盒的每个组分可以封装在单独的容器内，并且所有不同的容器可以与用于解释使用所述试剂盒进行测定的结果的说明书一起放在单个包装内。本技术的试剂盒可以在试剂盒容器上或试剂盒容器中含有书面产品。所写的产品描述了如何使用试剂盒中包含的试剂。在某些实施方案中，可以根据本技术的方法使用所述试剂。
实施例
通过以下实施例进一步说明本技术，不应将所述实施例视为以任何方式加以限制。提供本文的实施例以说明本发明技术的优点，并进一步帮助本领域普通技术人员制备或使用本发明技术的组合物和系统。实施例决不应解释为限制如所附权利要求所限定的本发明技术的范围。实施例可以包括或并入上述本发明技术的任何变型、方面或实施方案。上述变型、方面或实施方案还可以进一步各自包括或并入本发明技术的任何或所有其他变型、方面或实施方案。以下实施例展示了抑制TXNRD1表达和/或活性的本发明技术的说明性组合物的制备、表征和使用。
实施例1：实验材料与方法
scRNA-seq计数数据的预处理。对经由10×测序产生的原始HGNC比对的UMI计数矩阵进行预处理和换算，之后在下游分析管线中进行分析。从计数矩阵去除低丰度基因(例如，平均计数<0.25)和在<10％的细胞中具有读段的基因以及对于所有基因的<10％具有非零读段的细胞。为了调整单独细胞之间测序深度的差异，在一些情况下将计数矩阵进行归一化并在进行后续分析之前进行换算。归一化的方法包括但不限于：1)全局换算细胞水平计数以匹配跨越所有细胞的中值深度(标量调整)以及2)求解线性系统以获得单独细胞的独特换算因系数。在一些情况下，经由相互最近邻算法校正样品批次间效应。
监督降维。为了计算地鉴定治疗靶标，将高维计数数据映射至低维潜在的空间。潜在空间是经由监督降维在纯的细胞类型的集合(例如，胰腺腺癌，导管细胞和腺泡细胞)上构建的，其中细胞类型充当降维的监督标记。以这种方式，潜在空间最大化癌细胞与原代细胞之间的可分性。在一些情况下，在潜在空间的构建中也包括以必需基因靶向(例如，经由RNAi或CRISPR靶向PCNA或MCM6)的细胞，以限定“毒性”区域。毒性体现为例如在原代细胞中敲低基因诱导的细胞凋亡。根据模型训练，将被CRISPR靶候选物询问的细胞映射至由纯的细胞类型构建的相同潜在空间，以定量其朝向野生型表达谱的转录转移(治疗指数)。
若干种算法被用于监督降维。在一些情况下，肘部法则(Elbow method)(Richards等人,J Shoulder Elbow Surg 8(4):351-354(1999))用于确定潜在空间的最佳维数。
治疗指数的评分。将经由合并CRISPRi文库询问的靶基因关于其使癌细胞的转录谱转移回到野生型样表达状态的能力(治疗指数)进行定量。经由机器学习算法对基因进行评分。简而言之，基于不同细胞类型的潜在表达谱训练单独的单一类别机器学习算法，所述细胞类型包括但不限于：1)胰腺导管细胞；2)胰腺腺泡细胞；3)胰腺腺癌；以及4)作为毒性模型的必需基因(例如，PCNA或MCM6)被靶向(经由CRISPR/RNAi)胰腺腺癌。每个训练的机器学习模型随后用于基于如下决策函数的输出对候选基因进行评分，所述决策函数被应用于用CRISPRi文库靶向的单个细胞的潜在表达谱。在一些情况下，反复对细胞进行有放回抽样，以构建对于决策函数估计值的自举置信区间。
2维合并阴性选择RNAi筛选。如先前所述设计并构建集中于442个药物靶基因的自定义shRNA文库(2245个shRNA，每个基因五到六个)(Huang等人,Genes Dev.28(16):1800–1814(2014))。将文库克隆至TRMPV-Neo载体并转导至Tet-On鼠胰腺导管腺癌(mPDAC)细胞(KrasG12D；Myc；shp53)中。Lito等人,Cancer Cell 25(5):697-710(2014)。用于文库转导的条件主要导致单个逆转录病毒整合并且在至少1000个细胞的计算数量中呈现了每个shRNA。使用1mg/mL G418(Invitrogen)选择转导的细胞，持续5天。在每次传代时，维持>2000万个细胞以在整个实验中保存文库呈现。在药物选择之后，获得T0样品(每次重复实验2000万个细胞)并将其针对Venus+细胞进行分选。在12天(六代，T12)之后，对于每个重复实验使用FACSAriaII(BD Biosciences)分选2000万个shRNA表达(dsRed+Venus+)细胞。通过以下方式从T0和T12样品分离基因组DNA：使用PhaseLock管(5Prime)进行两轮酚提取，接着进行异丙醇沉淀。
然后将从mPDAC筛选获得的结果与从Myc；p53-/-鼠肝细胞癌(mHCC)获得的结果进行比较(Huang等人,Genes Dev.28(16):1800–1814(2014))，并构建二维RNAi筛选图。参见例如图3A。
质粒。对于条件RNAi实验，由来自先前描述的miR-E或miR-30骨架(Zuber等人,NatBiotechnol.29(1):79-83(2011)；Fellmann等人,Cell Rep 5(6):1704-1713(2013))的TRMPV-Neo载体表达shRNA。通过免疫印迹评价敲低效率或过表达。
免疫印迹。在Laemmli缓冲液中(100mM Tris-HCl(pH 6.8)、5％甘油、2％SDS、5％2-巯基乙醇)裂解细胞沉淀物。将相等量的蛋白质在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上溶解，并转移至PVDF膜上，在90V下持续120分钟。监测β-肌动蛋白的丰度以确保相等的装载。使用AlphaView软件(ProteinSimple)分析图像。使用对于TXNRD1(TrxR1)(1:1000,sc-28321,Santa Cruz Biotechnology)、KRAS(1:200,WH0003845M1,Sigma-Aldrich)或β-肌动蛋白-HRP(1:10000,A3854,Sigma)的抗体进行免疫印迹。
增殖测定。如先前所述(Huang等人,Genes Dev.28(16):1800-1814(2014))使用TRMPV-Neo载体(用miR-30或miR-E骨架)中的shRNA进行竞争增殖测定。在存在渐增浓度的金诺芬或荜拔酰胺的情况下将细胞孵育72h之后，通过以下方式进行金诺芬或荜拔酰胺的体外生长抑制的测定：使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)对活细胞数量进行计数。通过使72h处的活细胞数量除以0h处的活细胞数量来计算增殖速率。通过针对媒介物处理的细胞的增殖速率归一化来计算相对增殖速率。
动物研究。本研究中描述的所有实验程序都是通过凯特琳癌症中心(纽约)的机构动物护理和使用委员会(IACUC)在协议号11-06-016和11-06-018下批准的。将小鼠维持在特定的无病原体的条件下并且无限制地提供食物和水。
体内条件RNAi实验。用萤光素酶-hygro和TRMPV-Neo-miR-E shRNA构建体转导Tet-On鼠PDAC细胞。一百万只鼠PDAC细胞原位移植至雌性裸体接受者小鼠(NCR nu/nu，购自查尔斯河实验室和Harlan Laboratories)中。对于全身生物发光成像，向小鼠腹膜内注射50mg/kg D-萤光素(Goldbio)，并且在10min之后使用IVIS Spectrum系统(CaliperLifeSciences)进行分析。使用具有覆盖小鼠尾躯干和四肢的目的标准化圆形区域的Living Image软件(Caliper Lifesciences)进行定量。对于shRNA诱导，将动物用饮用水(2mg/ml，具有2％蔗糖；Sigma-Aldrich)和食物(625mg/kg，Harlan Laboratories)中的多西环素处理。
体内药物处理实验。对于金诺芬处理试验，首先将16mg金诺芬溶解在4mL乙醇中，然后用12mL PBS稀释至终浓度为1mg/ml。向小鼠通过腹膜内注射每日给予金诺芬(10mg/kg)或类似体积的媒介物。生病的动物被处死，并且胰腺组织和肿瘤用于进一步分析。
RNA测序和基因集合富集分析(GSEA)分析。对于RNA测序，使用RNeasy Mini Kit、QIAshredder Columns和RNase-Free DNase Set(Qiagen)分离来自含有靶向对照海肾萤光素酶或TXNRD1的shRNA的mPDAC细胞的总RNA。根据MSKCC的集成基因组运行(IGO)核心使用的协议进行RNA-Seq文库构建和测序。每一重复实验样品获取500-1000万个读段。在用Trimmomatic(Bolger等人,2014)去除衔接子序列之后，使用STAR比对工具(Dobin等人,2013)将RNA-seq读段与GRCh37.75(hg19)进行比对。通过HTSeq进行全基因组转录物计数以产生FPKM矩阵(Anders等人,2015Bioinformatics)。使用GSEA v2.07软件进行基因集合富集分析(Subramanian等人,2005)。
统计学。如果没有另外说明，否则数据将呈现为平均值±标准偏差。通过双尾学生t检验计算各组之间的统计显著性。通过皮尔逊检验计算相关性。使用Prism 7软件计算IC50值。显著性值是P<0.05(*)、P<0.01(**)以及P<0.001(***)。在一些情况下制作火山图。
基因依赖性分析。用于所有热图的人癌细胞系全基因组sgRNA筛选的数据来自http://genomecrispr.dkfz.de/。使用Log2FC(使用对数变换所得的丰度倍数变化)计算每个实验中每个基因的基因依赖性得分。经由对靶向相同基因的所有sgRNA的Log2FC取平均值计算基因依赖性得分。使用“Pheatmap”R软件包的未监督聚类用于对具有相似表型的基因进行聚类以供可视化。
对金诺芬敏感的倍数变化的确定以及药物协同作用的定量分析。CompuSyn软件(1.0版)(http://www.combosyn.com)基于中效原理，并且使用组合指数-等效线图定理分析药物协同作用。组合指数(CI)值CI>1指示拮抗作用；CI＝0.75-1.25指示累加作用；并且<1指示协同作用。每个GI(生长抑制)或CI得分表示来自至少三个独立实验的数据。
金诺芬药代动力学。在经由腹膜内注射施用单剂量的10mg/kg金诺芬悬浮液后，在9只NCR nu/nu小鼠中分析金的血浆和胰腺药代动力学。在施用金诺芬后2、4和24小时获得血浆和胰腺样品以确定金浓度。使用电感耦合等离子体质谱(ICPMS)方法分析收集的血浆和胰腺样品以定量金浓度。
实施例2：计算发现并验证Kras突变体胰腺癌中的新型靶标
图1A-图1B提供了一种用于计算发现在RAS突变体胰腺癌中的治疗靶标的管线。如图1A所示，使用以低感染复数(MOI)转导的CRISPRi文库筛选Kras突变体胰腺癌细胞系。将单个细胞的转录组分离，并使用铬仪器(10X Genomics)和酶试剂盒(10X Genomics)转化成DNA文库，并使用Hiseq4000系统(Illumina)进行测序。将单独细胞的单细胞RNA测序(scRNA-seq)谱经由配对末端测序并使用条形码映射至它们各自的CRISPR靶标。将FASTQ格式的原始读段与全基因组进行比对，并映射至每个基因的适当的基因组坐标和HGNC基因，从而导致计数矩阵由N细胞×M基因构成(参见图1A)。将该N×M矩阵进一步经由监督降维降低至N×50矩阵(参见图1A)。该降维模型被训练以鉴定纯的细胞类型(例如癌细胞、导管细胞、腺泡细胞或表达非靶向指导RNA的癌细胞，其充当阴性对照)，使得较低维数的潜在空间最大限度地将健康细胞与癌细胞彼此分离(参见图1A-图2A)。使用这种算法鉴定表达CRISPR靶标的细胞，其最大程度地将mRNA表达模式与阴性对照区分开并趋向健康细胞(导管细胞或腺泡细胞)，并且此类CRISPR靶标构成了在临床前开发中寻求的最有希望的靶标。
如图1A-图1B所示，使用机器学习算法来定量治疗指数。简而言之，单独的机器学习模型被训练以鉴定不同的细胞群，包括：1)胰腺导管细胞(治疗指数的阳性对照)；2)胰腺腺泡细胞(治疗指数的阳性对照)；3)表达非靶指导RNA的Kras突变体PDAC细胞(治疗指数的阴性对照)；以及4)表达所靶向的必需基因的Kras突变体PDAC细胞(毒性靶标的阳性对照)。如图1A-图1B所示，训练的机器学习模型随后被应用于表达CRISPRi靶标的Kras突变体PDAC细胞的RNA-seq数据，以检测展现出类似于胰腺腺泡细胞并区别于Kras突变体PDAC细胞(表示治疗指数的阴性对照)的RNA-seq谱的细胞。通过此类细胞表达的CRISPRi靶标的身份基于配对末端测序和条形码进行鉴定。选择具有最大治疗指数的靶标进行临床前开发。
实施例3：计算鉴定作为KRAS突变体胰腺癌中的治疗靶标的TXNRD1
如图1B所示，使用如上所述在两个非靶指导RNA、毒性靶标和健康导管细胞系上训练的机器学习算法的决策函数分析表达CRISPRi靶标的单独Kras突变体PDAC细胞的scRNA-seq谱。决策函数的输出经由各种方法进一步转化，包括但不限于：效应量、K.S.统计学、z得分或相对于对照群体的p值。经由各种方法进一步聚合了跨越多个机器学习算法和重复实验的得分，所述方法包括但不限于：平均值、加权平均值、排名聚合、加权排名聚合、Stouffer方法(z得分)和Fischer方法(p值)。
如图2A所示，将TXNRD1鉴定为如下CRISPRi靶标，其将Kras突变体PDAC细胞转化以展现出类似于胰腺腺泡细胞的RNA-seq谱。在使用机器学习算法进行监督降维后，分析细胞类型群体沿着单一维度的分布并绘图。如图2A所示，表达靶向TXNRD1的指导RNA的Kras突变体PDAC细胞(N＝87)显示出朝向健康导管细胞(N＝600)的转移。相比之下，表达无效的CRISPRi靶标(非靶向指导RNA)的Kras突变体PDAC细胞(N＝122)与癌细胞的谱大部分重叠。如图2B所示，在机器学习算法的四个决策函数之间取平均值的TXNRD1的z转化的治疗指数是前20个候选靶标的最高值。类似地，如图2C所示，TXNRD1展现出在一组超过五十个候选靶标之间治疗指数的最高的加权平均决策函数得分。
实施例4：通过2维RNAi筛选方法鉴定作为治疗靶标的TXNRD1
为了选择性地鉴定对维持KRAS突变体PDAC必需的药物靶标，在遗传定义的鼠HCC模型(KrasG12D；Myc；shp53)中针对阴性选择筛选了定向至已知药物靶标的短发夹RNA(shRNA)的自定义文库。将结果与鼠HCC模型的现有阴性选择结果进行交叉分析(Myc；p53-/-)(Huang等人,Genes Dev.28(16):1800–1814(2014))。如图3A所示，与在两种细胞系中保持未改变的阴性对照shRNA相比，发现在Kras突变体PDAC细胞中靶向Txnrd1、Acpp和Amt的shRNA被选择性地耗尽。相比之下，阳性对照shRNA在鼠HCC和鼠HCC中耗尽(参见图3A)。
为了检测在mPDAC、mHCC和iMEF中定量的表达特异性siRNA的细胞的耗尽，将这些细胞用携带针对Txnrd1、Acpp、Amt的诱导型shRNA以及对照：Ren.713(充当阴性对照的非靶向shRNA)、Rpa3.561(用于所有增殖细胞中的生长抑制的阳性对照)、Kras.247(用于mPDAC特异性生长抑制的阳性对照)的病毒进行转导。在shRNA诱导的第0天和第12天确定表达这些shRNA的细胞的百分比。表达shRNA的细胞的百分比的降低表明shRNA的抑制作用。如图3B所示，作为非靶向阴性对照(针对海肾萤光素酶)的shRNA Ren.713在任何细胞中均没有作用，阳性对照shRNA Rpa3.561在测试的所有细胞类型中耗尽。与mHCC和iMEF相比，在mPDAC中mPDAC特异性阳性对照Kras.247耗尽。如图3B所示，与阴性对照相比，针对Txnrd1、Acpp和Amt的shRNA展现出在Kras突变体PDAC细胞(KrasG12D；Myc；shp53)中的抑制作用，但在mHCC细胞(Myc；p53-/-)或非转化的永生化小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF)中并无抑制作用。Txnrd1shRNA的作用比靶向Acpp或Amt的shRNA更显著。图3B所示的蛋白质印迹显示，shRNA减少了它们所靶向的蛋白质的量。因此，该测定还将Txnrd1鉴定为有希望的靶标。鉴于RAS增加功能突变(例如，在密码子12、13或61处)发生在KRAS、NRAS和HRAS同种型之间共享100％氨基酸序列同一性的区域中(参见Prior等人,Cancer Research 72(10)(2012))，预期TXNRD1的抑制可治疗与KRAS、NRAS和HRAS突变相关的癌症。
在各种细胞系中进一步研究了TXNRD1依赖性。如图6A-图6B所示，敲除或敲低复制基因RAP1或PCNA导致对几乎所有细胞系的普遍致死性。相比之下，展现出对于KRAS、HRAS和NRAS的类似依赖性的某些细胞系条件性地需要TXNRD1。
这些结果表明，本发明技术的TXNRD1抑制剂组合物可用于治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症的特征在于有需要的受试者中升高的RAS表达水平和/或升高的TXNRD1表达水平。
实施例5：KRAS突变体PDAC生长对药理学TXNRD1抑制敏感
为了评价小分子药物在胰腺癌中对TXNRD1的药理学抑制的作用，进行了杨梅黄酮、手霉素A、原卟啉IX和金诺芬的抑制剂研究。
金诺芬是TXNRD1的酶活性的抑制剂(参见Gromer等人,J Biol Chem 273(32):20096-20101)。杨梅黄酮、手霉素A和原卟啉IX也是TXNRD1的酶活性的抑制剂。将mPDAC细胞用TXNRD1抑制剂金诺芬或DMSO处理72h，并测量活力。DMSO处理充当导致缺乏生长抑制的阴性对照。DMSO处理的细胞的活细胞数量设定为1。将金诺芬处理的细胞的活力针对DMSO处理的细胞的活力进行归一化，作为金诺芬浓度的函数进行绘图并拟合至指数增长曲线。杨梅黄酮、手霉素A、原卟啉IX中的每一种也进行类似处理。
如图3D所示，金诺芬在亚微摩尔浓度下抑制mPDAC细胞的生长。这些结果表明，本发明技术的TXNRD1抑制剂组合物可用于治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症的特征在于有需要的受试者中RAS突变、升高的RAS表达水平和/或升高的TXNRD1表达水平。
实施例6：KRAS状态预测对TXNRD1抑制的反应
由于以上以及图1A-图3B讨论的筛选系统是由突变体Kras、p53丢失和Myc过表达驱动的，因此研究了任一基因中的改变是否可以影响对TXNRD1抑制的敏感性。用渐增浓度的金诺芬或DMSO治疗十二种胰腺癌细胞系。在本实验中使用的细胞系L3.3、Colo357和BXPC3中具有野生型KRAS。细胞系PANC0327、MIAPaCa-2、PANC0213、ASPC1、8898、CFPAC-1、L3.6pl、PANC1和SU8686具有KRAS突变。如图3E所示，尽管细胞系之间有变异性，但KRAS突变体细胞通常比野生型KRAS细胞更敏感。
为了了解野生型KRAS细胞与KRAS突变体细胞的敏感性之间观察到的差异是否为统计上显著的，比较了人PDAC细胞系对于金诺芬对TXNRD1抑制的相对敏感性的IC50。如图4A所示，在对TXNRD1抑制的抗增殖反应与KRAS突变状态之间的发现显著相关性。相比之下，如图4B-图4C所示，在对TXNRD1抑制的反应与p53突变状态或MYC mRNA表达之间没有显著相关性。为了了解KRAS突变(G12C、G12D、G12V)对金诺芬敏感性的影响，将具有不同的KRAS突变(G12C、G12D、G12V)的人胰腺癌细胞或野生型用另一种TXNRD1抑制剂荜拔酰胺处理。如图4D所示，KRAS突变体细胞比野生型KRAS细胞对荜拔酰胺更敏感，这进一步加强了上述发现。
为了了解KRAS与TXNRD1的表达之间是否存在相关性，在来自癌症基因组图谱研究网络(TCGA)的149个人胰腺癌肿瘤中对这两种基因的表达进行定量，并将其显示为散点图。如图4E所示，观察到TXNRD1的表达与KRAS表达水平之间的相关性(r＝0.36，p<0.0001)。
为了了解PDAC细胞中TXNRD1抑制的分子机制，对具有靶向对照海肾或Txnrd1的shRNA的mPDAC细胞进行RNA-seq分析。如图4F-图4G中所示，Cdk9的抑制导致KRAS依赖性(图4F)和胰腺癌标签(图4G)二者的逆转，这进一步验证了如下发现，即TXNRD1是KRAS致癌信号传导所需的。有趣的是，如图4H所示，TXNRD1的抑制显示，与氨基酸转运蛋白和铁死亡有关的基因标签(包括称为SLC7A11的基因)的下调。
这些结果表明，本发明技术的TXNRD1抑制剂组合物可用于治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症的特征在于有需要的受试者中升高的RAS表达水平和/或升高的TXNRD1表达水平。
实施例7：TXNRD1是维持KRAS突变体胰腺肿瘤所需的。
还研究了TXNRD1与体内PDAC进展的相关性。为了抑制建立的胰腺肿瘤中的Txnrd1，将mPDAC细胞用含有Txnrd1 shRNA或对照shRNA(海肾和Kras)的萤光素酶和多西环素诱导型TRMPV-Neo-miR-E构建体进行转导，并通过原位注射移植至接受者小鼠的胰腺中(参见图5A)。在检测到发光信号时，将动物不用或用多西环素处理以诱导相应的shRNA表达。如图5C所示，生物发光成像揭示，来自未处理组(无多西环素)的小鼠到第7天显示大的胰腺肿瘤。相比之下，Txnrd1或Kras的敲低导致肿瘤生长的可比较的延迟。因此，RNAi介导的对Txnrd1的抑制近似于Kras抑制在Kras突变体PDAC中引发体内抗肿瘤作用方面的影响。从用或未用多西环素处理以诱导相应shRNA的动物(n＝4-5)定量肿瘤重量。如图5B所示，来自未处理组(无多西环素)的小鼠的肿瘤重量显示出与具有Txnrd1或Kras的敲低的小鼠相比较大的胰腺肿瘤，后者小鼠导致肿瘤生长的可比较的延迟。表达Ren.713E的肿瘤的重量不受多西环素处理的影响(比较图5B的Ren.713列中的两组重复实验)。通过多西环素处理可比较地抑制表达Txnrd1和KRAS shRNA的肿瘤的重量(比较图5B的Txnrd1.2057E、Txnrd1.1474E和KRas.247列中各组之间以及各组内的两组重复实验)。
这些结果表明，本发明技术的TXNRD1抑制剂组合物(如抑制TXNRD1表达的药剂)可用于治疗有需要的受试者中的RAS突变体癌症的方法。
还在如下另外的鼠PDAC模型中检查了药理学TXNRD1抑制的生长抑制作用，所述模型是通过将KRasG12D；p53-/-胰腺癌类器官系移植至接受者小鼠的胰腺中产生的。将小鼠仅用媒介物处理以用作阴性对照，或用金诺芬处理。如图5D所示，与体内RNAi结果(图5A-图5C)一致，用TXNRD1抑制剂金诺芬处理(10mg/kg，每天一次，每周5天)引发了Kras突变体肿瘤生长的延迟。另外，如图5E所示，药理学TXNRD1抑制的生长抑制作用发现于通过KRAS突变体PDAC细胞(MIAPaCa-2:KRAS突变体)产生的人异种移植物模型中，但在KRAS野生型细胞(Colo357:KRAS野生型)中未发现。因此，TXNRD1是体内维持KRAS突变体肿瘤和依赖性所需的。图10显示了将金诺芬递送至胰腺中。
图9显示了展现出TXNRD1 mRNA上调的患有胰腺腺癌(PDAC)的患者显示出与表达低水平TXNRD1的PDAC患者相比降低的总存活率。
图7A-图7D显示了在KRAS突变体胰腺癌细胞中TXNRD1抑制剂金诺芬的抗增殖作用以及当与吉西他滨组合时潜在的协同抑制作用。图8A-图8D显示了在KRAS突变体胰腺癌细胞中TXNRD1抑制剂金诺芬的抗增殖作用以及当与KRASG12C抑制剂AMG 510组合时潜在的协同抑制作用。
这些结果表明，本发明技术的TXNRD1抑制剂组合物可用于治疗有需要的受试者中的RAS突变体癌症的方法。
等同物
本发明技术并非受限于本申请中描述的具体实施方案，所述实施方案旨在作为本发明技术的单独方面的单一说明。如本领域技术人员将清楚的是，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行许多修改和改变。本领域技术人员根据前述描述将清楚，除了本文列举的方法和设备外，在本发明技术范围内的功能上等效的方法和设备。此类修改和改变旨在落入本发明技术的范围内。应理解，本发明技术并不限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，它们当然可以改变。还应理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在是限制性的。
另外，在本公开文本的特征或方面按马库什群组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开文本因此也按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。
本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何所列范围都可容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文中论述的每个范围可容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样如本领域技术人员可理解，所有诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等言辞都包括所述数字并且涉及随后可分解为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员可理解，范围包括每一个别成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。
本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都通过引用以其整体而并入，包括所有图形和表格，并入程度使其不会与本说明书的明确传授内容不一致。

Claims (22)

1.一种用于治疗有需要的受试者中的RAS突变体癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的选自以下的TXNRD1抑制剂：金诺芬、荜拔酰胺、D9、TRi-1、TRi-2、杨梅黄酮、PMX464、PX12、双鞭甲藻毒素-2、手霉素A、乙烷硒啉、金硫葡糖、原卟啉IX和抗TXNRD1抗体。
2.一种用于治疗有需要的受试者中的RAS突变体癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抑制TXNRD1表达的抑制核酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述抑制核酸包含选自以下的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12或其任何互补体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述受试者在治疗之前显示出癌细胞中RAS蛋白的升高的表达水平。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述RAS突变体癌症是肺癌、粘蛋白腺瘤、胰腺癌、结直肠癌、皮肤癌、子宫内膜癌、睾丸胚细胞癌或肾上腺癌。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述RAS突变体癌症包含选自G12C、G12D、G12V、G12A、G12S、G12R、G13D、G13C、G13S、G13R、G13A、G13V、Q61H、Q61L、Q61R、Q61K、Q61P和Q61E的KRAS、NRAS或HRAS突变。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述受试者展现出选自以下的一种或多种体征或症状：辐射背部的上腹疼痛、食欲不振或非故意的体重减轻、抑郁症、新发作的糖尿病、血凝块、疲劳、皮肤和眼白发黄(黄疸)、胃气胀、恶心和呕吐。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述受试者具有TP53、CDKN2A、SMAD4、MLL3、TGFBR2、ARID1A、SF3B1、EPC1、ARID2、ATM、ZIM2、MAP2K4、NALCN、SLC16A4、MAGEA6、ROBO2、KDM6A、PREX2、ERBB2、MET、FGFR1、CDK6、PIK3R3、PIK3CA、BRCA1、BRCA2或PALB2中的一个或多个点突变。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
10.根据权利要求1或3-9中任一项所述的方法，其中所述TXNRD1抑制剂是口服、局部、鼻内、全身、静脉内、皮下、腹膜内、皮内、眼内、离子电渗、透粘膜或肌内施用。
11.根据权利要求2-9中任一项所述的方法，其中所述抑制核酸是口服、局部、鼻内、全身、静脉内、皮下、腹膜内、皮内、眼内、离子电渗、透粘膜或肌内施用。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者单独地、顺序地或同时施用一种或多种另外的治疗剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述另外的治疗剂选自紫杉醇、吉西他滨、AMG510、5-FU(氟尿嘧啶)和伊立替康。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述TXNRD1抑制剂或所述抑制核酸是每天施用，持续6周或更长时间。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述TXNRD1抑制剂或所述抑制核酸是每天施用，持续12周或更长时间。
16.一种用于监测TXNRD1抑制剂在被诊断为患有RAS突变体癌症的受试者中的治疗功效的方法，所述方法包括：
(a)在已向所述受试者施用所述TXNRD1抑制剂之后检测从所述受试者获得的测试样品中的TXNRD1蛋白水平；以及
(b)当所述测试样品中TXNRD1蛋白水平相比于在施用所述TXNRD1抑制剂之前从所述受试者获得的对照样品中观察到的TXNRD1蛋白水平降低时，确定所述TXNRD1抑制剂是有效的。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述TXNRD1抑制剂是金诺芬、荜拔酰胺、D9、TRi-1、TRi-2、杨梅黄酮、PMX464、PX12、双鞭甲藻毒素-2、手霉素A、乙烷硒啉、金硫葡糖、原卟啉IX、抗TXNRD1抗体或抑制TXNRD1表达的抑制核酸。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抑制RNA是shRNA、反义寡核苷酸或sgRNA。
19.一种用于在有需要的受试者中抑制RAS突变体细胞增殖的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的至少一种TXNRD1抑制剂，
其中所述至少一种TXNRD1抑制剂选自金诺芬、荜拔酰胺、D9、TRi-1、TRi-2、杨梅黄酮、PMX464、PX12、双鞭甲藻毒素-2、手霉素A、乙烷硒啉、金硫葡糖、原卟啉IX、抗TXNRD1抗体和抑制TXNRD1表达的抑制核酸，并且
其中所述受试者患有特征在于RAS和/或TXNRD1的升高的表达水平和/或增加的活性的疾病或病症。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述抑制核酸包含选自以下的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12或其任何互补体。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的吉西他滨。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂，任选地其中所述KRASG12C抑制剂是AMG 510。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113952359A (zh) * 2021-11-19 2022-01-21 大连理工大学盘锦产业技术研究院 顺铂与Tri-1的联合抗肺癌药物组合物及其应用
WO2024008788A1 (fr) * 2022-07-05 2024-01-11 Association Francaise Contre Les Myopathies Utilisation de l'ebselen ou l'un de ses derives pour traiter des pathologies ou dysfonctionnements des mitochondries

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070050146A1 (en) * 2004-05-14 2007-03-01 Itzhak Bentwich Micrornas and uses thereof
WO2014122599A1 (en) * 2013-02-05 2014-08-14 Nestec S.A. Drug selection for colorectal cancer therapy using receptor tyrosine kinase profiling
WO2017027359A1 (en) * 2015-08-07 2017-02-16 The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pyridines and their use in the treatment of cancer
WO2018145090A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 New York University Methods of treating cancers having a deregulated nrf2/keap1 pathway
WO2018218087A1 (en) * 2017-05-24 2018-11-29 K-Gen, Inc. Methods of cancer treatment

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090312373A1 (en) * 2008-03-11 2009-12-17 The General Hospital Corporation Methods for the treatment of cancer using piperlongumine and piperlongumine analogs
US20140309278A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-16 Mirna Therapeutics, Inc. Combination cancer treatments utilizing micrornas and egfr-tki inhibitors

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070050146A1 (en) * 2004-05-14 2007-03-01 Itzhak Bentwich Micrornas and uses thereof
WO2014122599A1 (en) * 2013-02-05 2014-08-14 Nestec S.A. Drug selection for colorectal cancer therapy using receptor tyrosine kinase profiling
WO2017027359A1 (en) * 2015-08-07 2017-02-16 The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pyridines and their use in the treatment of cancer
WO2018145090A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 New York University Methods of treating cancers having a deregulated nrf2/keap1 pathway
WO2018218087A1 (en) * 2017-05-24 2018-11-29 K-Gen, Inc. Methods of cancer treatment

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GARTH POWIS等: "Thioredoxin signaling as a target for cancer therapy", CURRENT OPINION IN PHARMACOLOGY, vol. 7, no. 4, 1 August 2007 (2007-08-01) *

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