CN114533726B

CN114533726B - 一种用于抑制纤维化的小分子药物及其应用

Info

Publication number: CN114533726B
Application number: CN202210436246.8A
Authority: CN
Inventors: 肖晗; 张幼怡; 王秀杰; 冯姗; 刘鑫
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS; Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS; Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
Priority date: 2022-04-25
Filing date: 2022-04-25
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2042-04-25
Also published as: CN114533726A

Abstract

本发明通过构建细胞模型和动物模型，首次以PAX4作为靶点进行药物筛选，并获得一种可有效抑制PAX4从而达到抑制脏器纤维化的小分子药物ez908‑6。实验证实，PAX4抑制剂ez908_6可逆转由AngII引起的转录因子PAX4以及心脏纤维化发生时常见的标志物fibronectin、αSMA和Col I含量的增长；在心脏发生纤维化的组织中，PAX4抑制剂ez908_6可降低由AngII引起的心脏纤维化面积，并可以改善血管紧张素II造成的心脏舒张功能异常（E/E’上升），以上结果显示，PAX4抑制剂ez908_6能够通过抑制PAX4，起到缓解细胞外基质增多，抑制纤维化发生，改善心脏功能的作用，并且安全剂量窗口宽，符合临床药物标准，为纤维化疾病的治疗提供了新的用药途径和理论依据。

Description

一种用于抑制纤维化的小分子药物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种小分子PAX4抑制剂及其在制备抑制纤维化的药物中的应用。

背景技术

心脏纤维化是大多数心脏疾病的重要病理改变。心脏纤维化的表现是心脏组织中细胞外基质的过度沉积，导致生理性心脏组织结构的破坏，最终导致心力衰竭，严重威胁人类的健康和生命。成纤维细胞中的基因表达的改变是心脏纤维化反应的启动和维持中心。肌成纤维细胞主要由成纤维细胞分化而来。肌成纤维细胞具有重要的收缩和分泌功能，并以大量的表达α-平滑肌动蛋白（α-smooth actin, αSMA）、纤连蛋白（fibronectin）以及I型胶原蛋白（Collagen I，Col I）为其特点。血管紧张素II是一种现今研究中公认的调节血管收缩、影响心脏功能，能够诱发心脏纤维化的多肽制剂，通常可以使用该制剂处理小鼠或者成纤维细胞，模拟心脏纤维化的状态。迄今为止，心脏纤维化仍是当今临床治疗心脏疾病的重要靶点和难点。由于治疗心脏纤维化能够延缓心力衰竭的发生、发展，因此寻找治疗心脏纤维化的靶点与药物是一个尚待解决的重要问题。

转录因子PAX4是Paired box（PAX）家族第IV亚族的成员。目前的研究认为PAX家族的成员在胚胎发育以及器官形成的诸多阶段行使重要功能，并且也在成年后机体的方方面面发挥功能。 PAX家族的成员，从昆虫、两栖动物、鸟类、哺乳动物中，其序列的演化过程是相当保守的。PAX4的蛋白结构包括一个128个氨基酸的bipartite paired 结构域（PD），和一个homeodomain结构域（HD），其C-端不仅有一个PAX家族常见的转录激活域，还有一个独特的负调节结构域。目前的研究认为，PAX家族的成员是组织发育以及细胞分化的重要调控因子。而对于PAX4的研究，主要集中在胰岛、癌症以及视网膜相关的研究中。在我们团队早先的研究中，已发现PAX4为导致脏器纤维化的重要靶点（CN111214660B），在此基础上，开发可用于纤维化治疗的药物则成为进一步研究的焦点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于抑制纤维化小分子药物及其应用。更为具体的，本发明提供如下的技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种小分子化合物ez908-6，所述化合物的结构如下所示：

。

本发明的第二个方面，提供一种用于抑制纤维化的药物组合物，其中，所述药物组合物的活性成分为小分子化合物ez908-6。

在一种实施方式中，上述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅助性成分。

在一种实施方式中，上述药物组合物选自溶液、悬浮液、膏剂、粉剂、颗粒、片剂或酊剂。

本发明的第三个方面，提供一种上述小分子化合物ez908-6在制备用于抑制纤维化的药物中的应用。

在一种优选的实施方式中，所述纤维化是指肺纤维化、心脏纤维化或胰纤维化。

本发明相对于现有技术获得了如下技术效果：

本发明通过构建细胞模型和动物模型，首次以PAX4作为靶点进行药物筛选，并获得一种可有效抑制PAX4从而达到抑制脏器纤维化的小分子药物ez908-6。实验证实，PAX4抑制剂ez908_6（100μg/kg）可逆转由AngII引起的转录因子PAX4以及心脏纤维化发生时常见的标志物fibronectin、αSMA和Col I含量的增长；在心脏发生纤维化的组织中，PAX4抑制剂ez908_6可降低由AngII引起的心脏纤维化面积，并可以有能够改善血管紧张素II造成的心脏舒张功能异常（E/E’升高）。该剂量的ez908_6对小鼠并无明显的心脏和肝肾功能的损伤，同时远低于可能的毒理剂量。以上结果显示，PAX4抑制剂ez908_6能够通过抑制PAX4，起到缓解细胞外基质增多，抑制纤维化发生，改善心脏功能的作用，为纤维化疾病的治疗提供了新的用药途径和理论依据。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1A：给予ez908_6刺激后转录因子PAX4、以及纤维化标志物fibronectin、αSMA、Col I的亮度；

图1B：亮度的相对定量及统计分析结果。

图2：实时荧光定量PCR检测心脏成纤维细胞给予PAX4抑制剂ez908_6预处理半小时，再接受1μM 血管紧张素II刺激2天后，转录因子PAX4、以及纤维化标志物fibronectin、αSMA、Col I转录水平的变化。

图3：给小鼠腹腔注射PAX4抑制剂ez908_6后，小鼠血生化指标AST（肝功）、CR（肾功能）、GLU（血糖）和CKMB（心肌酶）的检测结果。

图4A：给予PAX4抑制剂ez908_6后，心脏天狼星红染色，标尺：500μm；

图4B：心脏纤维化面积统计分析结果。

图5：通过给小鼠埋微渗透泵注射AngII构建纤维化模型后，再腹腔注射PAX4抑制剂ez908_6后的超声心动检测结果。

图6：给小鼠埋微渗透泵注射AngII构建纤维化模型，再腹腔注射PAX4抑制剂ez908_6，实时荧光定量PCR检测心脏组织的转录因子PAX4、以及纤维化标志物fibronectin、αSMA、Col I转录水平的变化。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1、小鼠心脏成纤维细胞中各标志物表达水平的检测

1. 小鼠心脏成纤维细胞的分离和培养：

将约8周龄的雄性C57/BL6小鼠断颈处死，迅速浸泡于75%的酒精约半分钟，立即于超净工作台中开胸取出心脏，置入4摄氏度的PBS缓冲液中清洗两次，剪掉心房和心底部的血管，然后将心室剪碎成小块，用PBS洗一遍，以洗去部分残血。加入PBS平衡盐溶液配制的0.1% II型胶原酶（330U, Worthington, Columbia, NJ, USA/ Sigma, St. Louis, MO,USA）进行消化。整个消化过程在36~37摄氏度恒温搅拌条件下进行，每消化8 分钟后取上清消化液，加入到等量的含10% FBS的DMEM 培养液中，混合均匀。重复该过程约7~8次直到组织块消化完全，将收集的几管细胞室温1000 rpm 离心5分钟，弃上清，用含10% FBS的DMEM培养液重悬细胞，合并每次所得心肌细胞悬液，接种于直径100 mm的培养皿中，在37摄氏度、5% CO₂ 的培养箱内放置2小时使成纤维细胞基本贴壁。吸弃培养皿中的培养液，加入新的含10% FBS的DMEM培养液继续培养。3天后细胞长满，传代并进行后续实验。

2. 实验方法：

2.1 免疫荧光染色实验：

步骤1获得的小鼠心脏成纤维细胞在37摄氏度条件下，用37摄氏度温热4%多聚甲醛固定15分钟后，使用温热PBS清洗3次，再用0.2% Triton X-100破膜20-30分钟。温热PBS清洗3次后加入封闭液（5% BSA）封闭30分钟。此后使用一抗αSMA (ab32575, abcam,Cambridge, MA, USA), fibronectin (ab2413, abcam, Cambridge, MA, USA), PAX4(ab101721, abcam, Cambridge, MA, USA) 在4摄氏度条件下过夜孵育。回收储存一抗后，PBS清洗3次，然后室温孵育二抗Alexa Fluor 488 1小时。室温条件下使用Hoechst(Invitrogen, Carlsbad,CA, USA)染核8分钟。使用高内涵筛选成像系统CellomicsArrayScan VTI HCS Reader (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)的Morphology Explorer BioApplication模块统计和分析荧光强度。

2.2 细胞RNA的提取：

用Trizol试剂提取细胞中的RNA，采用promega试剂盒逆转录后使用Bio-Rad CFX96Touch进行qPCR（1 μgRNA）检测。

3. 小鼠心脏成纤维细胞纤维化模型中标志物的检测：

在96孔板中培养步骤1获得的小鼠心脏成纤维细胞P1代，使用1μM浓度血管紧张素II刺激细胞2天构建细胞纤维化模型。2天后收集细胞样本，固定后利用免疫荧光检测其内源PAX4以及纤维化标志物fibronectin、αSMA和Col I蛋白水平。图1A-图1B展示了免疫荧光实验检测心脏成纤维细胞给予ez908_6预处理半小时，再接受1μM 血管紧张素II刺激2天后，转录因子PAX4、以及纤维化标志物fibronectin、αSMA、Col I荧光强度的变化。图1A中亮度分别表示特定抗体识别的PAX4、fibronectin、αSMA和Col I的定位和含量。实验结果可以看到转录因子PAX4主要表达与细胞核中。实验结果提示，在血管紧张素II刺激下，PAX4、fibronectin、αSMA和Col I荧光强度均有不同程度的增强，在使用PAX4抑制剂ez908_6后细胞中PAX4、fibronectin、αSMA和Col I荧光强度显著降低。图1B中定量结果显示在血管紧张素II刺激2天后，转录因子PAX4以及心脏纤维化发生时常见的标志物fibronectin、αSMA和Col I含量显著增长，而用PAX4抑制剂ez908_6预处理半小时后，再给予血管紧张素II刺激2天，可逆转由AngII引起的转录因子PAX4以及心脏纤维化发生时常见的标志物fibronectin、αSMA和Col I含量的增长。

实施例2、PAX4抑制剂对小鼠心脏纤维化病理模型的治疗作用

动物病理模型实验，构建小鼠心脏纤维化模型，取材心脏组织，利用天狼猩红染色实验的方法，检测心脏纤维化面积大小。

1. 血管紧张素II诱导小鼠心脏纤维化模型的制备：

10周周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为两组，模型组和治疗组：

模型组：小鼠使用血管紧张素（3 mg·kg-1·day-1）微渗透泵埋泵（Alzet MODEL1007D, DURECT, Cupertino, CA）7天的方式构建纤维化模型。微渗透压泵的准备：手术前1天，将血管紧张素II（无菌PBS缓冲液溶解）用1mL注射器注入微渗泵，将微渗透压泵浸泡于无菌PBS缓冲液中，37摄氏度平衡过夜。手术时，用2%~3%的异氟烷麻醉小鼠，在小鼠后颈部剪开一长约0.7 cm 的横切口，用镊子伸入皮下，钝性分离皮下组织，将微渗透压泵埋入，缝合伤口，涂上新霉素软膏防止感染。手术组持续输注血管紧张素II，浓度为3 mg/kg/d，持续7天。

治疗组：使用血管紧张素II微渗透泵埋泵后1天，采用腹腔注射PAX4抑制剂ez908_6（50μg/kg/d和100μg/kg/d 连续注射7天）的方式，选用10周雄性C57BL/6小鼠构建小鼠心脏纤维化模型，检测心脏中的纤维化程度。

小鼠腹腔注射PAX4抑制剂ez908_6 7天后，小鼠血生化指标AST、CR、GLU和CKMB的检测结果（图3）提示ez908_6小鼠无心脏和肝肾损伤。

2. 组织切片及染色：

分别取上述两组小鼠，处死后将心脏乳头肌水平的横断面于4%多聚甲醛溶液（W/V%，以PBS 配制）中固定6～8小时后，弃去多聚甲醛，加入20%的蔗糖溶液（W/V%，以PBS 配制）中脱水。然后再依次放入70% (3小时)，80% (3小时)乙醇溶液中梯度脱水，最后置于90％乙醇加正丁醇溶液（体积比1：1）中过夜。次日依次置入95％乙醇加正丁醇溶液（45分钟2次）、正丁醇（30分钟）、丁醇（20分钟），用滤纸吸干表面液体，用石蜡包埋组织块。之后用切片机做心脏切片，石蜡切片厚度5 μm，于乳头肌水平横切，进行天狼星红染色，以检测胶原沉积情况。首先进行脱蜡，二甲苯10分钟3次，100％乙醇3分钟2次，95％乙醇3分钟2次，80％乙醇3分钟1次，70％乙醇3分钟1次。最后用蒸馏水洗3次。之后进行天狼星红染色，先把水蘸干，放入天狼星红溶液中染色1分钟，蒸馏水中洗去浮色（3次），用95％乙醇快速洗1次，再放入100％乙醇中1分钟2 次（注意不要让黄染的颜色洗掉），最后用80%二甲苯进行透明处理（10分钟2次），中性树脂覆盖切片表面，加盖玻片封存。最后组织切片观察及定量分析。采用NanoZoomer-SQ (Hamamatsu, Japan) 图像分析系统分析定量胶原纤维面积（天狼星红染色）。观察天狼星红染色切片，每个标本测量胶原纤维化面积（红染部分），测量整个心脏横断面面积，用纤维化面积除以心脏总面积即纤维化的百分数。

染色结果如图4A所示，在心脏发生纤维化的组织中，PAX4抑制剂ez908_6可降低由AngII引起的心脏纤维化面积，统计结果如图4B所示。

3. 超声心动检测：

将两组小鼠分别置于麻醉箱中给予异氟烷（2.5%异氟烷，0.8 L/min）进行麻醉，麻醉完毕将小鼠从麻醉箱中取出，迅速将其以仰卧位放置于加热板上并将连接麻醉药的鼻罩戴好，胶条固定小鼠四肢，将异氟烷浓度调至1%进行维持麻醉。胸部用脱毛膏（Nail,Canada）进行脱毛。采用Vevo 2100超声仪(Fujifilm Visual sonics，Canada)进行小鼠超声心动图检测。

超声心动图的结果如图5所示，使用PAX4抑制剂ez908_6，能够改善血管紧张素II引起的心脏舒张功能异常（E/E’升高）。以上超声心动结果提示抑制PAX4对于小鼠心脏舒张功能起到保护作用。

综合以上实验结果，提示PAX4抑制剂ez908_6能够通过抑制PAX4，起到缓解细胞外基质增多，抑制纤维化发生，改善心脏功能的作用。

实施例3、PAX4抑制剂药物安全性测试

为预估本发明所涉及小分子化合物的安全性，利用药物毒性预测算法Lazar（https://lazar.in-silico.ch/predict）、Toxicity Predictor（my-pharm.ac.jp）、eMolTox（http://xundrug.cn/moltox）对化合物的最高使用剂量、肝肾毒性等安全性指标进行了预估。结果如下表1所示，表中显示，PAX4抑制剂ez908_6的最高（安全）使用剂量比动物实验显示的抗纤维化起效剂量高100倍以上，并且在最高使用剂量以内，对人心脏、呼吸、神经系统等毒性高敏感器官无毒副作用。当高于最高使用剂量时，才有可能体现出肝毒性和遗传突变毒性。

表1 ez908_6安全剂量分析

指标	结果	算法
			最高使用剂量（人）	~ 1.57 mg/kg_bw/day	Lazar
最高使用剂量（小鼠）	~ 14.3 mg/kg_bw/day	Lazar
			最高使用剂量（大鼠）	~ 9.89 mg/kg_bw/day	Lazar
心脏毒性	无	eMolTox
			肺毒性	无	Toxicity Predictor
中枢神经系统毒性	无	eMolTox
			肝毒性	有	eMolTox
肾毒性	无	eMolTox
			致癌性	无	eMolTox
繁殖毒性	无	eMolTox
			细胞毒性	无	eMolTox
皮肤过敏	无	eMolTox
			线粒体毒性	无	eMolTox
内分泌毒性	无	eMolTox
			突变遗传毒性	有	eMolTox
急性口服毒性	无	eMolTox
			P450药物代谢毒性	无	eMolTox

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种小分子化合物ez908-6在制备用于抑制心脏纤维化的药物中的应用，其特征在于，所述小分子化合物ez908-6的结构如下所示：

。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物进一步包括药学上可接受的辅助性成分。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物组合物选自溶液、悬浮液、膏剂、粉剂、颗粒、片剂或酊剂。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的使用剂量低于1.57 mg/kg_bw/day。