WO2016190785A1 - Бисамидное производное дикарбоновой кислоты в качестве средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей - Google Patents

Бисамидное производное дикарбоновой кислоты в качестве средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей Download PDF

Info

Publication number
WO2016190785A1
WO2016190785A1 PCT/RU2016/050015 RU2016050015W WO2016190785A1 WO 2016190785 A1 WO2016190785 A1 WO 2016190785A1 RU 2016050015 W RU2016050015 W RU 2016050015W WO 2016190785 A1 WO2016190785 A1 WO 2016190785A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tissue
pharmaceutically acceptable
treamide
formula
acceptable salt
Prior art date
Application number
PCT/RU2016/050015
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Владимир Евгеньевич НЕБОЛЬСИН
Анастасия Владимировна РЫДЛОВСКАЯ
Александр Михайлович ДЫГАЙ
Татьяна Геннадьевна БОРОВСКАЯ
Евгений Германович СКУРИХИН
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to EP16800380.4A priority Critical patent/EP3305286A4/en
Priority to CN201680044227.3A priority patent/CN108024978B/zh
Priority to EA201792565A priority patent/EA034437B1/ru
Priority to KR1020177037304A priority patent/KR102174191B1/ko
Priority to AU2016266439A priority patent/AU2016266439B2/en
Priority to CA2986911A priority patent/CA2986911C/en
Priority to MX2017015192A priority patent/MX2017015192A/es
Priority to BR112017025283-0A priority patent/BR112017025283A2/pt
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез"
Priority to US15/576,387 priority patent/US10076511B2/en
Priority to UAA201712838A priority patent/UA122336C2/ru
Priority to SG11201709654YA priority patent/SG11201709654YA/en
Priority to RU2017144851A priority patent/RU2727142C2/ru
Priority to JP2017561321A priority patent/JP6700312B2/ja
Publication of WO2016190785A1 publication Critical patent/WO2016190785A1/ru
Priority to IL255899A priority patent/IL255899B/en
Priority to HK18106870.2A priority patent/HK1247126A1/zh
Priority to US16/103,264 priority patent/US10772870B2/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/417—Imidazole-alkylamines, e.g. histamine, phentolamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4178—1,3-Diazoles not condensed 1,3-diazoles and containing further heterocyclic rings, e.g. pilocarpine, nitrofurantoin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy

Definitions

  • the invention relates to medicine, specifically to pharmacology, urology, andrology, endocrinology, pulmonology, gastroenterology, and relates to a means of stimulating tissue regeneration and restoration of reduced functions of tissues and organs.
  • the invention relates to a method for stimulating tissue regeneration and restoring reduced functions of tissues and organs, and even more specifically, regenerating and restoring reduced functions of pancreatic tissue, liver, lung, muscle tissue, spermatogenic tissue, testicular tissue, prostate tissue.
  • the invention also relates to a means of normalizing reduced male fertility (treatment of male infertility), which may be due to pathological conditions such as hypogonadism, in particular, hypogonadotropic or hypergonadotropic hypogonadism, asthenospermia, erectile dysfunction, correlative testicular insufficiency, testicular insufficiency and other diseases.
  • pathological conditions such as hypogonadism, in particular, hypogonadotropic or hypergonadotropic hypogonadism, asthenospermia, erectile dysfunction, correlative testicular insufficiency, testicular insufficiency and other diseases.
  • This invention can be used for the treatment and prevention of pathological conditions selected from the group comprising metabolic syndrome, impaired glucose tolerance, hepatitis, idiopathic pulmonary fibrosis, pulmonary emphysema, chronic obstructive pulmonary disease, cachexia, hypogonadism, preferably hypogonadism or hypergonadotropism ; prostatitis; benign prostatic hyperplasia, correlative testicular insufficiency, and autoimmune orchitis.
  • pathological conditions selected from the group comprising metabolic syndrome, impaired glucose tolerance, hepatitis, idiopathic pulmonary fibrosis, pulmonary emphysema, chronic obstructive pulmonary disease, cachexia, hypogonadism, preferably hypogonadism or hypergonadotropism ; prostatitis; benign prostatic hyperplasia, correlative testicular insufficiency, and autoimmune orchitis.
  • the invention also relates to a means for restoring sperm motility.
  • pathological conditions including metabolic syndrome, impaired glucose tolerance, hepatitis, pulmonary emphysema, chronic obstructive pulmonary disease, prostatitis, benign prostatic hyperplasia, hypogonadism, testicular insufficiency, asthenospermia, are accompanied by a decrease in functional activity and impaired tissue structure of the affected organs.
  • Metabolic syndrome is a pathological symptom complex that includes various metabolic and hormonal disorders.
  • the diagnosis of metabolic syndrome is made in the presence of central obesity and at least two of the following factors: 1) an increase in triglycerides> 150 mg / dl (1.7 mmol / L), 2) a decrease in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol ⁇ 40 mg / dl (1.03 mmol / L) (men), ⁇ 50 mg / dl (1.29 mmol / L) (women), 3) arterial hypertension (blood pressure (BP)> 130/85 mm Hg. Art.
  • HDL high-density lipoprotein
  • hypogonadism testosterone deficiency
  • Many researchers have discovered not only the high prevalence of hypogonadism in men with metabolic syndrome, but also the relationship between the level of total testosterone in plasma and manifestations of the metabolic syndrome. Data have been obtained both on the relationship between overweight and low testosterone levels, and on the relationship between insulin resistance and a decrease in serum testosterone in obese men [Svartberg J., von Miihlen D., Sundsfjord J., et al. Waist circumference and testosterone levels in community dwelling men. The Troms0 study // European Journal of Epidemiology. 2004. Vol. 19 (7). P. 657-667].
  • the adult pancreas contains approximately 10 9 cells. Normally, worn-out ⁇ -cells are constantly replaced by new ones that multiply in the pancreas (Minami K., Seino S. Current status of regeneration of pancreatic ⁇ -cells. Journal of Diabetes investigation. Volume 4, Issue 2. pages 131-141 March 2013) . With various disorders of the pancreas, such as autoimmune or toxic lesions, ⁇ -cells of the islets of Langerhans are first characterized by reduced functional activity, which manifests itself in a decrease in insulin production, and at later stages they die. Obvious signs of pancreatic tissue damage appear when more than 90% of ⁇ -cells are already destroyed, insulin deficiency becomes constant and there is a complete dependence on insulin introduced from the outside.
  • Insulin therapy fails to achieve the degree of accuracy in the regulation of glycemia that is ensured with the normal functioning of the islets of Langerhans. Attempts are continuing to treat damaged pancreas with transplantation of the entire organ, Langerhans islets, ⁇ -cells. But transplantation is not always successful (the manifestation of transplant rejection is frequent). In case of successful transplantation, the constant use of immunosuppressants is subsequently required.
  • Another problem is impaired glucose tolerance. It is a violation of the metabolic response to endogenous or exogenous insulin. This condition leads to an increased concentration of insulin in the blood plasma compared with physiological values for the existing glucose concentration.
  • the greatest clinical significance is impaired glucose tolerance of muscle, fat and liver tissue.
  • a violation of glucose tolerance of muscle tissue is manifested in a decrease in the intake of glucose from the blood into myocytes and its utilization in muscle cells, adipose tissue - in resistance to the antilipolytic effect of insulin, leading to the accumulation of free fatty acids (FFA) and glycerol. FFA enter the liver, where it becomes the main source of education very low density atherogenic lipoproteins (VLDL).
  • VLDL very low density atherogenic lipoproteins
  • the impaired glucose tolerance of liver tissue is characterized by reduced glycogen synthesis and activation of the breakdown of glycogen to glucose (glycogenolysis) and de novo synthesis of glucose from amino acids, lactate, pyruvate, glycerol (gluconeogenesis).
  • impaired tissue tolerance to glucose will restore the functional activity of tissues.
  • the liver is the vital gland of the body. It performs about 500 unique functions that ensure digestion, inactivation of toxic substances, the synthesis of blood coagulation components, the metabolism of proteins, amino acids, fats, carbohydrates, nucleic acids, vitamins, trace elements, etc. Liver tissue is often damaged by chemical, microbial, traumatic, pharmaceutical and other adverse factors. This leads to a decrease in the number of workable hepatocytes. Chronic hepatitis of various etiologies can last for many years, while it is often diagnosed in the late stages of the disease, when the likelihood of developing cirrhosis and chronic liver failure increases sharply [Jung Yl, Witek RP, Syn WK. Signals from dying hepatocytes trigger growth of liver progenitors // Gut. - 2010 .-- Vol. 5. P. 655-65].
  • hepatoprotectors Essentiale, lipoic acid, Sirepar, a-tocopherol.
  • these agents cannot fully protect or restore impaired functions of membranes, mitochondria, and other structures of hepatocytes, since any of them affects only certain stages of the pathogenesis of hepatitis.
  • modern hepatoprotectors are used in complex therapy.
  • this approach to the treatment of hepatitis is dangerous for drug interactions due to polypharmacy and complication of the course of the disease.
  • almost all drugs in this group have side effects that limit their use.
  • the development of methods that can effectively stimulate liver regeneration remains very relevant.
  • Inflammatory diseases of the adnexal glands include diseases of the prostate gland accompanied by inflammation, such as acute bacterial prostatitis, chronic bacterial prostatitis, BPH (benign prostatic hyperplasia), and inflammation of the seminal vesicles, such as acute or chronic vesiculitis.
  • Prostate diseases also include chronic abacterial prostatitis, chronic non-inflammatory prostatitis or ZB category prostatitis [Ludwig M, Vidal A, Diemer Th, Pabst W, Failing K, Weidner W. Chronic prostatitis / chronic pelvic pain syndrome: seminal markers of inflammation. // World J Urol. 2003. Vol. 21, N 2. P. 82-85].
  • BPHG benign prostatic hyperplasia
  • Hyperprolactinemia observed against the background of BPHH leads to erectile insufficiency, to oligospermia. This, of course, reduces the male reproductive potential [Johri A.M., Heaton J. P., Morales A. Severe erectile dysfunction is a marker for hyperprolactinemia // Int J Import Res. 2001. Vol. 13 N ° 3. P. 176-82].
  • prostate diseases affect the quality of the ejaculate, since the prostate gland secrets factors that support, first of all, sperm motility.
  • correlative testicular insufficiency is revealed (secondary infertility).
  • the treatment of diseases of the prostate gland favorably affects male fertility.
  • hypogonadism is currently detected in 4-5 million people. Hypogonadotropic hypogonadism (or secondary hypogonadism) is due to gonadotropin deficiency. Primary hypogonadism is caused by dysfunction of the testicular (testicular) tissue of the testis. Its non-hereditary forms (acquired hypogonadotropic hypogonadism) may be due to external influences, medication (anabolic steroids, metoclopramide, phenothiazide, drugs, etc.), radiation therapy [Filicori M. Endocrine basis of reproductive function.
  • testosterone Patients with secondary hypogonadism are prescribed testosterone [Dohie G.R., Diemer A., Giwerman A., Jungwith A., Kora Z., Kraus C. Man Infertility, European Association of Urology 2014, p.35]. However, testosterone has many contraindications and side effects.
  • hypogonadism due to pathology of the gonads is one of the most common forms of decreased male fertility [Dohie GR, Diemer A., Giwerman A., Jungwith A., Kora Z., Kraus C. Man Infertility, European Association of Urology 2014, p.8].
  • spermatogenesis proliferative potential of spermatogenesis can be restored by transplantation of spermatogenic cells.
  • testosterone is recommended for drug therapy of hypergonadotropic hypogonadism. It stimulates the final phase of spermatomeiosis, that is, postmitotic divisions, thereby leading to an increase in the number of spermatocytes and to an increase in the productivity of spermatogenesis due to the stimulation of its final phase.
  • the disadvantage of this tool is the lack of effectiveness in relation to the stimulation of spermatogonia, which are known to mitotically divide.
  • the drug Speman is recommended, which stimulates spermatogenesis and increases sperm motility.
  • the drug is expensive, it consists of a complex composition of medicinal herbs that grow in different countries of the world and have limited raw materials. As a disadvantage, it should be noted that it has not very high efficiency.
  • Pulmonary emphysema, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and idiopathic pulmonary fibrosis (IFL) are severe multifactorial pulmonary disorders in which a chronic and progressive course is characteristic of older people (mainly men).
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • IFL idiopathic pulmonary fibrosis
  • the clinical picture and pathogenesis of COPD is different from IFL.
  • the cause of poorly reversible and progressive airflow restriction in COPD is airway inflammation and emphysematous expansion of the alveoli and bronchioles [Hogg JC, Timens W: The pathology of chronic obstructive pulmonary disease.
  • Testosterone stimulates myoblasts and increases the number of satellite cells, thereby contributing to protein synthesis and restoration of damaged muscles [Bhasin S., Taylor W.E., Singh R. et al. The mechanisms of androgen effects on body composition: mesenchymal pluripotent cell as the target of androgen action. J Gerontol Med Sci 2003; 58A: M1103-1 11O]. Testosterone also inhibits the synthesis of pro-inflammatory cytokines IL-1, IL-6, TNFa and stimulates the production of anti-inflammatory cytokine - IL-10.
  • Inflammatory mediators interfere with muscle protein synthesis during cachexia, are involved in lipolysis and beta oxidation of fatty acids [Ryden M., Arvidsson E., Blomqvist L., Perbeck L., Dicker A., Arner P. Targets for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Biochem Biophys Res Commun 2004; 318: 168-175].
  • the objective of this invention is to develop a means of regeneration and restoration of reduced tissue functions.
  • Such a tool will, in particular, contribute to the treatment of impaired glucose tolerance, hepatitis, pulmonary emphysema, chronic obstructive pulmonary disease, idiopathic pulmonary fibrosis, cachexia, and also help to restore male reproductive function and will overcome the disadvantages of the known drugs described above.
  • the first objective of the present invention is the development of tools that promotes the regeneration of tissues, in particular tissues of the pancreas, liver, lung, testicular tissue, prostate tissue, muscle tissue.
  • the agent according to the invention should facilitate the regeneration of testicular tissue and prostate tissue.
  • the next objective of the present invention is to develop a means of lowering blood glucose levels, the increase of which is caused, in particular, by pathological conditions such as metabolic syndrome or impaired glucose tolerance.
  • the next objective of the present invention is the development of a means of restoring liver function, a decrease in which is caused, in particular, by pathological conditions such as chronic hepatitis of various etiologies.
  • the next objective of the present invention is to develop a means of normalizing reduced male sexual activity, due, in particular, to pathologies such as hypogonadism, correlative testicular insufficiency, testicular insufficiency.
  • the next objective of the present invention is the development of a means of restoring spermatogenesis (including sperm motility), the reduction of which is caused in particular by pathologies such as metabolic syndrome, prostatitis, hypogonadism, asthenospermia, testicular failure, and other diseases.
  • the next objective of the present invention is the development of a means of restoring impaired histoarchitectonics and lung tissue functions, caused in particular by pathologies such as emphysema, idiopathic pulmonary fibrosis and chronic obstructive pulmonary disease.
  • the next objective of the present invention is to develop a means of restoring the structure and function of the liver.
  • a further object of the present invention is to provide an agent for restoring the structure and function of the pancreas due to diseases such as metabolic syndrome and impaired glucose tolerance.
  • the objectives are solved in that as a medicine for the treatment and / or prevention of the above pathological conditions, it is proposed to use a tool based on Treamide.
  • the latter is a bisamide derivative of a dicarboxylic acid of the formula (I):
  • Treamide has the ability to effectively regenerate tissues and restore their reduced function, in particular, this concerns the tissues of the male reproductive system.
  • Treamide reduces the severity of morphological changes in the prostate gland with abacterial prostatitis and BPH, restores sperm motility, enhances sex drive and copulative activity, which together leads to the restoration of male reproductive function.
  • FIG. 1 Morphological picture of the pancreas in male mice of the C57B1 / 6 line of intact control, on the 70th day of metabolic disorders without treatment (pathological control) and the 70th day of metabolic disorders with a course of treatment with Treamide at a dose of 10 mg / kg. Hematoxylin and eosin stain.
  • A Treamide at a dose of 10 mg / kg (x100); B: Intact control (x100); C. Pathological control (x100); D: Treamide at a dose of 10 mg / kg (x400); E: Intact control (x100); F: Intact control (x400)
  • FIG. 2 Morphological picture of the pancreas in mice of males of the C57B1 / 6 line of intact control, on the 70th day of metabolic disorders without treatment (pathological control) and on the 70th day of metabolic disorders with a course of treatment with Treamide at a dose of 10 mg / kg. Picrofuchsin stain according to Van Gieson.
  • A Treamide at a dose of 10 mg / kg (x100); B: Intact control (x100); C. Pathological control (x100); D: Treamide at a dose of 10 mg / kg (x400); E: Intact control (x400); F: Pathological control (x400)
  • FIG. 3 Morphological picture of the liver in C57B1 / 6 mice of the intact control group, the pathological control group of chronic toxic hepatitis, and the group of animals treated with Treamide at a dose of 10 mg / kg, x100 magnification, the preparations were made on the 28th day of the study.
  • FIG. 4 Morphological picture of the lungs in female mice of the C57B1 / 6 line of the intact control group, the pathological control group of mice with emphysema on days 14 and 30, and the group of animals treated with Treamide at a dose of 10 mg / kg on day 30.
  • Intact control A is the apex of the lung, B is the middle pulmonary field and C is the lower pulmonary field.
  • Pathological control (14 days): D is the apex of the lung, E is the middle pulmonary field and F is the lower pulmonary field.
  • the group of animals treated with Treamide M is the apex of the lung, N is the middle pulmonary field and O is the lower pulmonary field.
  • FIG. 5 Morphological picture of the lungs of male C57BL / 6 male mice of the intact control (A) line, pathological control (B) and a group of mice with pulmonary fibrosis treated with 10 mg / kg treamide (C). Picrofuxin stain according to Van Gieson (magnification x100); preparations were made on the 21st day of the experiment.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for tissue regeneration, comprising an effective amount of a compound of formula (I)
  • the present invention also relates to a tissue regeneration drug, which is a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the tissue is selected from the group consisting of pancreatic tissue, liver, lung, muscle tissue, spermatogenous tissue, testicular tissue, and prostate tissue.
  • the present invention also relates to a method for tissue regeneration, comprising administering to a needy subject an effective amount of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Further, the present invention relates to the use of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof for tissue regeneration.
  • the tissue is selected from the group consisting of pancreatic tissue, liver, lung, muscle tissue, spermatogenous tissue, testicular tissue, and prostate tissue.
  • the present invention also relates to the use of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the treatment of pathological conditions associated with impaired tissue structure.
  • the inventive condition is selected from the group consisting of metabolic syndrome, impaired glucose tolerance, hepatitis, in particular chronic hepatitis and toxic hepatitis, idiopathic pulmonary fibrosis (IFL), pulmonary emphysema, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and cachexia, in particular due to impaired glucose tolerance, idiopathic pulmonary fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease, cancer, and other diseases.
  • metabolic syndrome impaired glucose tolerance
  • hepatitis in particular chronic hepatitis and toxic hepatitis
  • IFL idiopathic pulmonary fibrosis
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • cachexia in particular due to impaired glucose tolerance, idiopathic pulmonary fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease, cancer, and other diseases.
  • the disease is hypogonadism and an associated violation of erectile dysfunction and / or libido, prostatitis and an associated violation of erectile dysfunction and / or libido, benign prostatic hyperplasia, correlative testicular insufficiency, autoimmune orchitis, where hypogonadism is preferably hypogonadism or hypergonadotropic hypogonadism.
  • Prostatitis can be abacterial, autoimmune prostatitis, or category B. Prostatitis.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition for normalizing reduced male fertility, comprising an effective amount of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the invention also relates to a medicament for normalizing reduced male fertility, which is a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention also relates to a method for normalizing reduced male fertility, comprising administering to a needy subject an effective amount of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention further relates to the use of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof for normalizing reduced male fertility.
  • the decrease in male fertility is preferably due to a pathological condition including hypogonadism, preferably hypogonatropic hypogonadism or hypergonadotropic hypogonadism; asthenospermia, erectile dysfunction, correlative testicular failure, testicular insufficiency and other diseases.
  • a decrease in male fertility may also be due to inhibition of copulative activity and libido, which, in particular, can be triggered by the diseases listed above.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for restoring sperm motility, comprising an effective amount of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the invention also relates to a drug for restoring sperm motility, which is a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the invention further relates to a method for restoring sperm motility, comprising administering to a needy subject an effective amount of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention also relates to the use of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof for restoring sperm motility, where such a decrease may be due to hypogonadism, asthenospermia, correlative testicular insufficiency, testicular insufficiency. Also, a decrease in mobility may be due to inhibition of copulative activity and libido of various etiologies.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for reducing blood glucose in the treatment and / or prevention of a pathological condition, comprising an effective amount of a compound of formula (I).
  • the present invention also relates to a drug for reducing blood glucose, which is a compound of formula (I).
  • the invention also relates to a method for reducing blood glucose in the treatment and / or prevention of a pathological condition, comprising administering to a needy subject a therapeutically effective amount of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the pathological condition can be selected from the group including metabolic syndrome and impaired glucose tolerance.
  • the invention also relates to the use of a compound of the formula or its a pharmaceutically acceptable salt for lowering blood glucose.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition for restoring the structure and function of the liver in the treatment and / or prevention of a pathological condition, comprising an effective amount of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also relates to a medicament for restoring the structure and function of the liver, which is a compound of formula (I).
  • the pathological condition can be selected from the group comprising hepatitis, in particular, chronic hepatitis and toxic hepatitis.
  • the present invention also relates to the use of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof for restoring liver function.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for restoring the structure and function of the lung in the treatment and / or prevention of a pathological condition, comprising an effective amount of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pathological condition can be selected from the group including chronic obstructive pulmonary disease (COPD), pulmonary emphysema, and idiopathic pulmonary fibrosis.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • pulmonary emphysema pulmonary emphysema
  • idiopathic pulmonary fibrosis idiopathic pulmonary fibrosis.
  • the present invention also relates to a drug for restoring the structure and function of the lung, which is a compound of formula (I).
  • the present invention also relates to the use of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof for restoring lung structure and function.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for restoring the structure and function of the pancreas in the treatment and / or prevention of a pathological condition, comprising an effective amount of a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pathological condition can be selected from the group including metabolic syndrome and impaired glucose tolerance.
  • the present invention also relates to a drug for restoring the structure and function of the pancreas, which is a compound of formula (I). It is also an object of the invention to use a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof to restore pancreatic structure and function.
  • the invention relates to a means of stimulating tissue regeneration and restoration of reduced functions of tissues and organs, and even more specifically, the regeneration and restoration of reduced functions of pancreatic tissue, liver, lung, muscle tissue, spermatogenic tissue, testicular tissue, prostate tissue.
  • the object of the present invention is a tool that promotes the regeneration of tissues, in particular tissues involved in the functioning of the male sex glands.
  • This tool is a bisamide derivative of a dicarboxylic acid of the formula (I):
  • salts of the compounds of formula (I) of the present invention include acid addition salts of organic acids (e.g., formate, acetate, maleate, tartrate, methanesulfonate, benzenesulfonate, toluenesulfonate, etc.), acid addition salts of inorganic acids (for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, etc.), salts with amino acids (for example, aspartic acid salt, glutamic acid salt, etc.), preferably hydrochlorides and acetates.
  • organic acids e.g., formate, acetate, maleate, tartrate, methanesulfonate, benzenesulfonate, toluenesulfonate, etc.
  • inorganic acids for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, etc.
  • salts with amino acids for example, aspartic acid salt, glutamic acid salt,
  • Treamide has the ability to effectively regenerate tissues and restore reduced tissue function, in particular, this applies to tissues involved in the functioning of the male sex glands.
  • epithelial tissues include various types of epithelial tissues, in particular the epithelium of the convoluted seminiferous tubules (testicular tissue), the epithelium (acini) of the structural units of the prostate (prostate tissue), as well as various types of connective tissues.
  • Treamide effectively normalizes reduced male sexual activity, caused in particular by pathologies such as hypogonadism, correlative testicular insufficiency, testicular insufficiency.
  • Treamide effectively restores sperm motility, the violation of which is caused, in particular, by pathologies such as prostatitis, hypogonadism, asthenospermia, correlative testicular insufficiency, testicular insufficiency.
  • the compound of formula (I) is administered in an effective amount that provides the desired therapeutic result.
  • the compound of formula (I) can be administered orally, topically, parenterally, intranasally, inhalation and rectally in unit dosage forms containing non-toxic pharmaceutically acceptable carriers.
  • parenteral administration means subcutaneous, intravenous, intramuscular or intrathoracic injection or infusion.
  • the compound of formula (I) of the present invention can be administered to a patient in doses of 0.1 to 100 mg / kg body weight per day, preferably in doses of 0.0, 1 to 25 mg / kg one or more times per day. .
  • the specific dose for each particular patient will depend on many factors, including the activity of the compound used, age, body weight, gender, general health status and diet of the patient, time and method of administering the drug, speed of its removal from organism, specifically used combination of drugs, as well as the severity of the disease in the individual to be treated.
  • compositions of the present invention contain a compound of formula (I) in an amount effective to achieve the desired result, and can be entered in the form of standard dosage forms (for example, in solid, semi-solid or liquid form) containing the compounds of the present invention as an active ingredient in a mixture with a carrier or excipient suitable for intramuscular, intravenous, oral, sublingual, inhalation, intranasal and intrarectal administration.
  • the active ingredient may be included in the composition along with commonly used non-toxic pharmaceutically acceptable carriers suitable for the manufacture of solutions, tablets, pills, capsules, dragees, emulsions, suspensions, ointments, gels and any other dosage forms.
  • Various substances such as saccharides, for example, glucose, lactose or sucrose, mannitol or sorbitol, cellulose derivatives and / or calcium phosphates, for example tricalcium phosphate or calcium acid phosphate, can be used as fillers, such as starch paste, for example, corn, wheat, rice, potato starch, gelatin, tragacanth, methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose and / or polyvinylpyrrolidone.
  • saccharides for example, glucose, lactose or sucrose, mannitol or sorbitol, cellulose derivatives and / or calcium phosphates, for example tricalcium phosphate or calcium acid phosphate
  • fillers such as starch paste, for example, corn, wheat, rice, potato starch, gelatin, tragacanth, methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose and / or polyvinylpyrrol
  • disintegrating agents such as the aforementioned starches and carboxymethyl starch, crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar or alginic acid or a salt thereof, such as sodium alginate, can be used.
  • Optional additives such as flow control agents and lubricants such as silica, talc, stearic acid and its salts such as magnesium stearate or calcium stearate, and / or propylene glycol can be used.
  • the core of the dragee is usually coated with a layer that is resistant to the action of gastric juice.
  • concentrated saccharide solutions may be used, which may optionally contain gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol and / or titanium dioxide, and suitable organic solvents or mixtures thereof.
  • additives As additives, stabilizers, thickeners, colorants and perfumes can also be used.
  • ointment bases such as white and yellow petroleum jelly (Vaselinum album, Vaselinum flavum), petroleum jelly oil (Oleum Vaselini), white and liquid ointment (Unguentum album, Unguentum flavum), and as additives to give a denser consistency - such as paraffin wax and wax; absorbent ointment bases, such as hydrophilic petrolatum (Vaselinum hydrophylicum), lanolin (Lanolinum), cold cream (Unguentum leniens) ointment bases, washable with water, such as hydrophilic ointment (Unguentum hydrophylum), water-soluble ointment bases, such as polyethylene glycol glycol , bentonite bases and others.
  • absorbent ointment bases such as hydrophilic petrolatum (Vaselinum hydrophylicum), lanolin (Lanolinum), cold cream (Unguentum leniens) ointment bases
  • methyl cellulose sodium carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polyethylene glycol or polyethylene oxide, carbopol can be used.
  • water-insoluble bases such as cocoa butter can be used; bases soluble in water or miscible with water, such as gelatin-glycerol or polyethylene oxide; combined bases - soap-glycerin.
  • the amount of active ingredient used in combination with a carrier may vary depending on the recipient being treated, on the particular method of drug administration.
  • the content of the active agent in them is up to 5% by weight.
  • diluents 0.9% sodium chloride solution, distilled water, novocaine solution for injection, Ringer's solution, glucose solution, specific additives for dissolution can be used.
  • Dosage forms of the present invention are prepared according to standard procedures, such as, for example, mixing, granulating, dragee-forming, dissolving and lyophilization processes.
  • Asthenospermia was modeled using the drug Etoposide, which has pronounced prooxidant properties.
  • the use of a drug that induces an increase in the level of free radicals is due to the fact that according to modern concepts, the direct cause of asthenospermia is oxidative stress (Kao S. N. et.al. Increase of oxidativestress in human sperm with lower motility. Fertil. And Steril. 2008; 89: 5: 1183-1190).
  • Treamide was administered daily intragastrically once a day at a dose of 5 mg / kg treatment course (within 10 days after administration of etoposide a) and treatment and prevention course (within 5 days before and 5 days after administration of etoposide) to male rats having a reduced motility of mature sperm.
  • the effectiveness of treamide was evaluated by the percentage of motile forms of sperm isolated from the epididymis.
  • the presented experimental data showed that on the 5th and 10th day after the administration of etoposide (control), the percentage of motile sperm significantly decreased and amounted to -73-74% of the background values.
  • the percentage of motile spermatozoa against the background of Treamide administration significantly increased compared to the control (Etoposide), in the first series - and compared with Speman.
  • the percentage of motile sperm in the experimental groups did not differ from that in intact animals (background).
  • the data obtained indicate that Treamide is an effective means of restoring sperm motility.
  • Estrogens are able to inhibit the secretion of LH (Luteinizing hormone) and FSH (follicle-stimulating hormone).
  • LH Louteinizing hormone
  • FSH follicle-stimulating hormone
  • the experiments were carried out on 36 Wistar rats (age 3 months). Within 30 days after the start of the experiment, all male rats (except the background group) were injected intramuscularly with Sinestrol at a dose of 50 U / kg / day. Then, from the 31st to the 45th days of the experiment, the animals of the experimental group, in addition to Sinestrol, were intragastrically administered Treamide at a dose of 0.5 mg / kg or the comparison drug Tribestan at a dose of 70 mg / kg. Evaluation of the effectiveness of Treamide was carried out by the number of motile forms of sperm (percentage of motile forms of sperm) isolated from the epididymis. The research results were compared with those with the introduction of Sinestrol (control) and the comparison drug Tribestan.
  • treamide effectively restores sperm motility, with hypogonadotropic hypogonadism.
  • the model is based on the antagonism of androgenic and extrogenic hormones.
  • the administration of synestrol to male rats inhibits the sexual activity of animals.
  • the experiments were carried out on 36 Wistar rats (age 3 months). Within 30 days after the start of the experiment, all male rats (except the intact group (background)) were injected intramuscularly with a dose of 50 U / kg / day. Then, from the 31st to the 45th days of the experiment, the animals of the experimental groups, in addition to Sinestrol, were intragastrically administered Treamide at a dose of 1.5 mg / kg and the comparison drug Tribestan at a dose of 70 mg / kg. Evaluation of sexual activity was carried out in a test of paired sexual behavior. For this, female rats were used in the experiment, were in the stage of estrus, which was caused by a preliminary 4-fold administration of Sinestrol.
  • Treamide was evaluated by indicators: the latent period of the first attempt to mate (J11111C), the number of attempts to mate (cage), the number of ejaculations. The data obtained were compared with those in the same animals before the start of the experiment (first test) and with those in the control (second test).
  • Erectile dysfunction was modeled by using animals of late and senile reproductive age (14-19 months). Inhibition of sexual motivation was modeled using animals of late reproductive age (14 months).
  • Treamide was administered intragastrically for 14 days at a dose of 5 mg / kg.
  • the comparison drug Sildenafil (100 mg, PFIZER PGM, France)
  • Sildenafil 100 mg, PFIZER PGM, France
  • Evaluation of sexual activity was carried out in a test of paired sexual behavior. To do this, in the experiment used female rats who were in the stage of estrus, which was caused by a preliminary 4-fold administration of sinestrol.
  • the effectiveness of Treamide was evaluated by indicators: the latent period of the first attempt to mate the number of attempts to
  • This model is based on the fact that rats are social animals and strive not only for sexual, but also for social contacts. Determination of sexual motivation involves determining the time spent near a sexual stimulus and a preference score in animals without direct contact with “social” and “sexual” stimuli. As a sexual stimulus, a female was in the estrus stage, and a social one was used in the male.
  • Treamide With the introduction of Treamide at a dose of 5 mg / kg, the time spent near the “sexual” stimulus increased compared to that in the same animals before the administration of the drug. At the same time, the time spent in the “social” stimulus zone decreased (by 2 times) compared with the control. The preference score increased statistically significantly compared to that in the first test and reached 0.64 ⁇ 0.09. The data obtained indicate that the administration of Treamide at a dose of 5 mg / kg has a stimulating effect on the sexual motivation of male rats of the late reproductive period. It should be noted that the preference score in this group of rats is statistically significantly did not differ from that in intact rats, i.e. in "young" animals.
  • Treamide as a stimulant of sexual motivation of male rats of mature reproductive age (14 months) showed that the substance stimulates sexual motivation of animals of late reproductive age.
  • the action is manifested in a dose of 5 mg / kg, the optimal duration of therapy is 14 days.
  • the comparison drug, Sildenafil did not show activity in the test for sexual motivation. In the test for copulative activity, its effects were not sufficiently pronounced and short-lived.
  • Treamide at a dose of 5 mg / kg and comparison drug Sildenafil (at a dose of 3 mg / kg 2 times a week, was administered intragastrically 1 time per day for 15 days. Sexual activity was assessed in a paired sexual behavior test. Testing was performed twice: before administration and 1 h after the last administration of Treamide Rats of the control groups treated with the solvent were tested at the same time as the animals of the experimental groups.
  • Test results of male rats of the background group showed that the animals are characterized by rather high and stable indicators of sexual activity.
  • the average latent period of the first cage was 114 sec, the number of cages - 14.7, the number of mating - 0.33.
  • Comparison of the tested parameters in the “summer” season with that in the “winter period” shows that the latent period of the first mating attempt increased by 4 times, the number of mating attempts decreased by 3.4 times (P ⁇ 0.05).
  • the males of the control group did not perform any ejaculation in the winter period (P ⁇ 0.05).
  • sildenafil did not significantly affect the sexual behavior of male rats under conditions of seasonal inhibition of their sexual activity. Before and after its introduction, the studied parameters did not differ from those from each other and with those in the control group.
  • the latency of the first cage after administration significantly decreased by 1.8 times compared to that before testing, which indicates a stimulating effect of the drug on the centers sex drive and, to a certain extent, copulative activity.
  • the total number of attempts to mate increased by 1.8 times, but the differences were not statistically significant.
  • calculating the number of animals in the group that performed ejaculation it was found that after administration of Treamide a they were detected in 33%, while before administration of the drug, these animals did not ejaculate (P ⁇ 0.05).
  • HAP modeled by flashing of the ventral lobe of the gland with silk thread
  • BPH was modeled by the administration of Sulpiride.
  • Prostamol Uno was used as a comparison drug.
  • Animals with HAP Treamide was administered intragastrically at a dose of 0.5 mg / kg for 15 days.
  • Teramide was administered intragastrically to animals with BPH for 2 months at a dose of 0.5 mg / kg.
  • BPH benign prostatic hyperplasia
  • Treamide was administered intragastrically to the animals of the experimental group at a dose of 0.5 mg / kg once a day for 15 days.
  • the body weight of the animals was determined, their euthanasia was performed in a C0 2 chamber.
  • the ventral lobe of the gland was dissected, mass and volume were measured, weight coefficient was determined and morphological analysis was performed.
  • the prostate was fixed in formalin, embedded in paraffin. Paraffin sections with a thickness of 5 ⁇ m were stained on the connective tissue according to Van Gieson, to calculate the relative area of the epithelium - hematoxylin-eosin.
  • Prostamol Uno does not affect the area of the acini epithelium.
  • the data obtained suggest that the use of Treamide in a dose of 0.5 mg / kg in rats with CAP promotes the regeneration of epithelial tissue of the prostate gland. the severity of atrophic processes. The latter, obviously, will lead to an increase in the functional activity of the acinus epithelium and will contribute to the restoration of the qualitative characteristics of the ejaculate.
  • the presence of proliferative centers and the presence of daughter acini on the standard section area were determined.
  • the area of epithelial and stromal structures was measured on a standard histological section area. These indicators were determined using computer graphical analysis on a standard histological section area (micrographs of 10 consecutive fields of view taken with an AxioCam Erc5s video camera mounted on an AxioLab A microscope (lens x 10, eyepiece x 10) with an image transfer program to a computer AxioVision LE, Carl Zeisis)
  • the stromal-epithelial ratio was defined as the ratio of the stroma area to the area of the epithelium.
  • test compounds were determined by the following criteria: a lesser degree of morphological signs of benign prostatic hyperplasia: - a decrease in the number of proliferation centers and daughter acini, a decrease in the area of the epithelium.
  • Treamide at a dose of 0.5 mg / kg effectively restores the morphological state of the prostate gland during the administration of Sulpiride, which is manifested in a decrease in the severity of BPH in experimental animals. Its effectiveness exceeds that of the comparison drug Prostamol Uno.
  • the latter was modeled by a single administration to male rats (3 months old) of the cytostatic drug Paclitaxel (Mitotax, Dr. Reddy's, India).
  • the choice of the drug is due to the fact that it is one of the drugs that damage the spermatogenesis precursors - stem cells.
  • Paclitaxel was administered to animals of the control and experimental groups once intravenously, at the maximum tolerated dose of 7.6 mg / kg.
  • Treamide was administered to animals of the experimental groups intragastrically at a dose of 5 mg / kg as a suspension in 2% starch mucus for 15 days 1 month after Paclitaxel administration.
  • Control animals instead of the test substance received a solvent (2% starch mucus) in an equivalent volume.
  • a 24-well plate 0.5 ml of the prepared suspension of cells at a concentration of 1 x 106 / ml in the medium for culturing the progenitor cells was placed in each well, and then incubated for 1 hour in a C0 2 incubator at 37 ° C 5% ⁇ 0 2 and 100% humidity of air. After incubation, a non-adherent portion of the cells was collected. 0.5 ml of medium for culturing spermatogenic progenitor cells was placed in wells containing a fraction of adherent cells and incubated for 7 days in a C0 2 incubator at 37 ° C, 5% C0 2 and 100% air humidity.
  • the culture medium was replaced, followed by layering over the obtained stroma of non-adherent testis cells of experimental animals.
  • the cells were divided into adhesive and non-adhesive fractions. Organ homogenate was incubated in Petri dishes for 1 hour in a C0 2 incubator at 37 ° C, 5% C0 2 and 100% air humidity. Then, the non-adherent fraction of cells was collected; in the Goryaev chamber, the number of cells / ml was counted. Non-adherent cells were layered at a concentration of 2x 105 / ml over the resulting stroma in a volume of 0.5 ml per well.
  • CFU-Sp colony forming spermatogenic units
  • the determination of colony-stimulating activity of spermatogenous tissue microenvironment cells was carried out as follows. Using the above methodology, the testis homogenate was obtained, followed by isolation of the adherent cell fraction. Adherent cells were cultured for 24 hours in a complete culture medium at 37 ° C, 5% C0 2 and 100% air humidity. After a day, the supernatant was collected, which was stored at a temperature of 20 ° C. To test the level of humoral spermatogenesis factors in the supernatant, the CFU-Sp test system of the testes of intact rats was used. The results were expressed by the number of colonies grown from the number of layered non-adherent cells (10 5 cells / well).
  • the effectiveness of treamide was determined by a significant increase in colonies grown from cells of the test system under the action of cell supernatant the testes of experimental animals compared with those in the control.
  • a non-adherent fraction of spermatogenic tissue cells was isolated and transferred to the resulting sublayer in complete culture medium (80% DMEM, 20% ETS, L-glutamine , antibiotics, heparin) at a concentration of 2 ⁇ 10 5 / ml.
  • complete culture medium 80% DMEM, 20% ETS, L-glutamine , antibiotics, heparin
  • Treamide was added to the complete culture medium at concentrations of 1 ng / ml, 3 ng / ml, 10 ng / ml, 30 ng / ml, 100 ng / ml, 300 ng / ml and 1000 ng / ml.
  • CFU-Sp colony forming spermatogenic units
  • Treamide was determined by a significant increase in the number of cells giving rise to CFU-Sp in the culture with the addition of the test substance, compared with that in the control.
  • the morphological and functional state of spermatogenic tissue was performed to further confirm the effectiveness of stimulation of the formation of stem committed cells.
  • the number of spermatogonia cell population was estimated by the following indicators: the number of spermatogonia cell population, the average number of Sertoli cells, the degree of maturity of the spermatogenous layer, the number of Leydig cells, endocrine activity of the testis, the total number of spermatozoa per epididymis, the percentage of motile spermatozoa.
  • the experiment day 90 was homogenized in warm (37 ° C) physiological saline and the number of motile forms of spermatozoa was determined in suspension of epididymis cells.
  • testes of rats were fixed in Carnoy fluid and paraffin sections were prepared. 5 micron thick dewaxed sections were stained with hematoxylin-eosin. At the testis section, the number of spermatogonia cell population was determined, the number of Sertoli cells, the number of Leydig cells, the endocrine activity of Leydig cells was determined. Based on the Sertoli cell count, the degree of maturity of the spermatogenic layer was calculated.
  • the criteria for stimulating the testicular tissue regeneration process were: - an increase in the number of spermatogonia cell population, the number of Sertoli cells, a decrease in the degree of maturity of the spermatogenic layer, and an increase in spermatogenesis productivity.
  • the criterion for the functional activity of sperm is the percentage of their motile forms.
  • Treamide was accompanied by a significant increase (by 44–48%) in the number of colony forming cells in all studied periods (on the 45th and 65th days of the experiment) compared with the cytostatic control (Table 17).
  • Treamide To study the direct effect of Treamide on spermatogenic tissue precursors, an in vitro study was conducted with the addition of Treamide in cell cultures at concentrations of 1, 30, 100, and 1000 ng / ml.
  • Treamide at concentrations of 100 and 1000 ng / ml
  • CFU-Sp CFU-Sp
  • Treamide has the ability to directly stimulate the functional activity of spermatogenous tissue progenitor cells.
  • the introduction of Paclitaxel led to a decrease in the regenerative potential of the testis, which is expressed in a decrease in the number of committed colony-forming spermatogenic cells. This is due not only to the direct toxic effect of Paclitaxel on the sources of the proliferative pool of spermatogenesis, but also to the inhibition of humoral factors that stimulate the proliferation of these cells.
  • the introduction of treamide boosted tissue regenerative potential.
  • Treamide not only directly stimulated the formation of new sources of the proliferative pool of spermatogenesis (stem cells), but also enhanced the effect of humoral factors stimulating their formation.
  • testicular insufficiency in the form of pathospermia was noted, which is one of the causes of male infertility.
  • the period of 45 days corresponds to the manifestation of a toxic effect on the spermatogonia cell population.
  • a decrease (by 40%) in the number of spermatogenesis precursor cells is observed, in this study we obtained a model of testicular failure due to depletion of sources of the proliferative pool of spermatogenesis.
  • the degree of maturity of the spermatogenic layer (although it was reduced compared to the control), but did not decrease compared to the previous study period, the number of Sertoli cells did not increase either.
  • the absence of positive dynamics during regenerative processes is obviously associated with a low number of committed colony-forming cells of spermatogenic tissue.
  • the number of spermatogonia was statistically increased compared to the control, which is obviously the result of the previously noted increase in the number of sources of the proliferative pool of spermatogenesis and the increase in humoral factors stimulating their proliferation. Judging by ACS, spermatogenesis productivity increased (by 46%) compared to control and reached baseline values. The functional activity of sperm cells also increased (the number of motile sperm cells significantly exceeded the control values). These data indicate the effectiveness of the treatment. The number of Leydig cells was similar to the control values. Their endocrine activity returned to normal.
  • Treamide can effectively stimulate the reparative regeneration of testicular tissue, the inhibition of which was due to a decrease in the number of committed colony-forming cells.
  • the effectiveness of treamide is confirmed by the data of morphological analysis of testicular tissue.
  • the blood glucose level was evaluated.
  • the blood glucose level was determined after 4 hours of feed deprivation using a glucometer (SencoCard glucometer, 77 Electronics Kft, Hungary).
  • the part of the pancreas adjacent to the spleen was fixed in 10% formalin and embedded in paraffin. 5 micron thick dewaxed sections were stained with hematoxylin and eosin. On sections, the area of 10 consecutive Langerhans islets was determined by graphical computer analysis and the total number of cells and the number of pycnotized cells were counted in them. Then, the number of cells per unit area of the islet and the percentage of pyknotized cells were calculated.
  • inflammatory cells neutrils, lymphocytes, macrophages
  • pancreatic tissue and their composition histological sections were stained with hematoxylin-eosin and azure-eosin.
  • the level of mouse type I collagen in the lung homogenate was determined by enzyme-linked immunosorbent assay using a commercial kit (Cusabio Biotech CO., LTD, China). Lung tissue homogenate was prepared according to the manufacturer's protocol Cusabio Biotech CO., LTD (China).
  • the level of total collagen in the lung homogenate was determined using a collagen determination kit by binding it to a dye and treating it with an acid and pepsin solution SIRCOL Collagen Assay (Biocolor Ltd, UK) in accordance with the manufacturer's instructions. Homogenate of lung tissue was prepared according to the protocol of the manufacturer of the test system. The results of the study are presented in tables 23-25.
  • Treamide reduced the number of pycnotized pancreatocytes in the islets of Langerhans of sick animals, increased the area and cellularity of islet tissue (table 24), decreased the concentration of total collagen and type I collagen in the pancreas in experimental animals in relation to pathological control (table 25).
  • Treamide has a regenerative effect on pancreatic tissue.
  • the number of cells in the islets of Langerhans is restored, the area of islet tissue increases, the number of pycnotized cells in the islet of Langerhans is normalized, fibrotic changes in the pancreatic tissue decrease, and as a result, the blood glucose level decreases.
  • Treamide can be used in the treatment of impaired glucose tolerance.
  • Example 9 A study of the effect of Treamide on the regeneration of pancreatic cells and restoration of testicular tissue function in male mice using a metabolic syndrome model.
  • Metabolic disorders were modeled as follows: on day 2 after birth, male C57B1 / 6 mice were injected with streptozotocin at a dose of 200 mg / kg, once, subcutaneously into the withers, the volume of the injected solution was 30 ⁇ l. From 4 weeks after birth, animals were transferred to a high fat diet. For this, feed enriched with heavy saturated fats (30% fat) was used (Siff EF R / M with 30% Fat cat. N ° E15116-34, Germany). The duration of the high-fat feed was 42 days (from the 28th to the 70th day of the experiment). Treamide was administered at a dose of 10 mg / kg intragastrically once a day from the 49th to the 70th day of the experiment. Control animals instead of the test substance received the solvent in an equivalent volume.
  • Blood glucose levels were evaluated. Blood glucose was measured using a glucometer (Accu-Chek Performs Nanu (Roche Diagnostes GmbH, Germany). Measurement the initial blood glucose level in animals was performed after a 16-hour feed deprivation, all subsequent glucose measurements were also taken after a 16-hour food deprivation.
  • the level of free serum testosterone was evaluated by enzyme immunoassay in accordance with the protocol of the manufacturer of test systems.
  • pancreas adjacent to the spleen was fixed in 10% formalin, embedded in paraffin according to a standard method.
  • Treamide increased the number of islets of Langerhans in the pancreas and their cellularity, prevented the development of fatty degeneration of acinar cells and significantly reduced the number of pyknotized cells in islets of Langerhans in mice under conditions of metabolic disturbances.
  • Treamide reduced the intensity of edema and islet tissue infiltration by inflammatory cells ( Figures 1 and 2, table 26).
  • mice of the C57BL / 6 male line The results of a study of glucose in the blood serum of mice showed that the modeling of metabolic disorders led to a persistent increase in blood glucose in mice of the C57BL / 6 male line, starting from 42 days of the experiment. High glucose levels lasted up to 70 days. Maximum indicator values were detected on the 63rd day of the experiment and exceeded the initial level by 3.8 times, on the 70th day - by 4.2 times (Table 27).
  • mice The results of a study of free testosterone in the blood serum of mice showed a decrease (1.6 times) of the hormone in males of the pathological control group in comparison with intact animals.
  • the data obtained indicate the formation of hypogonadism in males against the background of metabolic disorders laboratory animals, which largely corresponds to the clinical picture of hypogonadism in humans.
  • Treamide has a regenerative effect on pancreatic tissue.
  • the number of cells in the islets of Langerhans is restored, the area of islet tissue increases, the number of pycnotized cells in the islet of Langerhans is normalized, fibrotic changes in the pancreatic tissue decrease, and as a result, the blood glucose level decreases.
  • Treamide also restores the function of testicular tissue, preventing the development of hypogonadism.
  • treamide can be used in the treatment of metabolic syndrome and hypogonadism.
  • Example 10 The study of the influence of Treamide on the regeneration of pancreatic cells and restoration of testicular tissue function in male rats on a model of metabolic syndrome.
  • Metabolic syndrome was modeled in male Wistar rats (260-280 g) by keeping animals on a high-fat diet (“cafeteria diet”) for 12 weeks.
  • the cafeteria Diet is balanced according to Current Protocols in Pharmacology [Current Protocols in Pharmacology (2005) Animal Models of Disease // Contributed by Petter Hedlund, Kenshi Matsumoto, and Karl-Erik Andersson].
  • the diet contained 25–35% fat and 25–30% easily digestible carbohydrates in addition to the standard rodent diet.
  • Treamide was administered at a dose of 0.5 mg / kg intragastrically once a day at the 7-11th week of the diet.
  • Comparison drug Metformin was administered at a dose of 200 mg / kg intragastrically in the same mode.
  • Treamide The assessment of the development of the pathology and therapeutic effect of Treamide was carried out according to the following indicators: blood biochemical parameters (glucose, cholesterol (OCH), triglycerides (TG), HDL, LDL, atherogenicity index), glucose tolerance test, visceral fat mass, total number and percentage of mobile forms sperm cells.
  • the level of triglycerides, OXS and HDL was determined using a diagnostic kit (Olveks diagnosticum, Russia).
  • the level of LDL was determined by the formula 2.
  • LDL low density lipoprotein cholesterol
  • the atherogenic coefficient (KA) was calculated by the formula 3.
  • KA is the atherogenic coefficient
  • HDL - high density lipoprotein cholesterol The atherogenicity index was calculated individually for each animal, then the arithmetic mean value for the group was calculated.
  • mice were anesthetized by intraperitoneal injection of a mixture of Zoetil and Xila (0.2 ml of Zoetil + 0.8 ml Xila) in a volume of 70 ⁇ l / 100 g of mass. Epididymis was isolated. The epididymis head was cut off from the tail, weighed, 5 incisions were made (to improve sperm yield) and placed in a test tube containing 10 ml of phosphate-saline buffer heated to 37 ° C. The tube was kept at 37 ° C for 10 minutes.
  • the tube was shaken on a shaker, 20 ⁇ l of liquid was taken, applied to a glass slide heated to 37 ° C, and the number of motile spermatozoa was evaluated under a microscope. Counting was carried out to 100 sperm.
  • ⁇ -differences are statistically significant compared with intact (p ⁇ 0.05); & - differences are statistically significant compared with the control group
  • the results of measuring the level of glucose (on an empty stomach) in the whole blood of rats are shown in table 30.
  • the first measurement was carried out before the introduction of drugs to animals for a period of 6 weeks of the study. From table 30 it is seen that in intact rats contained in a standard diet, the glucose level for a 6-week diet was 3.9 ⁇ 0.3 mmol / l, for a 12-week diet - 6.8 ⁇ 0.93 mmol / l In turn, in rats on a high-fat diet, the glucose level at 6 weeks of the diet was 6.7 ⁇ 0.3 mmol / L, and at 12 weeks of the diet it was 11.6 ⁇ 0.9 mmol / L. Thus, in animals treated with a high-fat diet, severe hyperglycemia was observed, which is another sign of the metabolic syndrome.
  • Treamide The intragastric administration of Treamide to experimental animals, starting from the 7th week of a high-fat diet, restrained the increase in blood glucose. Treamide showed effect after 3 weeks of therapy and retained it until the end of the study (table 30). Table 30
  • Metformin therapy also increased the total sperm count by 1.8 times, but unlike Treamide, it did not affect the percentage of motile forms of sperm (Table 32). Table 32
  • Treamide reduced the increase in blood glucose, decreased the atherogenicity index, reduced the amount of visceral fat increased against the background of the pathology, and restored the total number of spermatozoa and the percentage of their motile forms reduced due to endocrine disorders. This confirms the ability of Treamide to restore the function of the pancreas and testicular tissue. Treamide is recommended for metabolic syndrome and reduced testicular tissue function.
  • Example 11 A study of the effect of Treamide on the fertility of male mice in a metabolic syndrome model.
  • Metabolic disorders were modeled as follows: on day 2 after birth, male C57B1 / 6 mice were injected with streptozotocin at a dose of 200 mg / kg, once, subcutaneously into the withers, the volume of the injected solution was 30 ⁇ l. From 4 weeks after birth, animals were transferred to a high fat diet. For this, feed enriched with heavy saturated fats (30% fat) was used (Siff EF R / M with 30% Fat cat. N ° E15116-34, Germany). The duration of keeping animals on a high-fat diet was 42 days (from the 28th to the 70th day of the study). Treamide was administered at a dose of 10 mg / kg intragastrically once a day from the 49th to the 80th day of the experiment. Control animals instead of the test substance received the solvent in an equivalent volume.
  • PI number of fertilized females / number of females hatched with males x 100%.
  • Tremid administered at a dose of 10 mg / kg increased the level of free testosterone in the blood serum of mice with metabolic disorders in 2 times compared with the pathological control and by 16% compared with intact animals.
  • Treamide at a dose of 10 mg / kg restored the level of free testosterone in blood serum in mice with metabolic disorders.
  • Treamide effectively restored the function of the testicular tissue of male mice, which led to an increase in animal fertility.
  • Treamide is recommended for the treatment of metabolic syndrome, hypogonadism and male infertility.
  • Example 12 A study of the effect of Treamide on liver tissue repair in a model of chronic toxic hepatitis.
  • CBA / CaLac by intragastric administration of a 20% solution of tetrachlorocarbon (CC14) in olive oil in a volume of 0.2 ml / mouse on days 0, 3, 7, 10, 14 and 17 of the study.
  • Treamide was administered at a dose of 10 mg / kg daily intragastrically once a day from day 14 to day 27 of the study.
  • an animal study was euthanized in a C0 2 chamber and a liver biopsy was taken for histological analysis.
  • liver was fixed in a 10% solution of neutral formalin and then embedded in paraffin according to a standard method.
  • Deparaffinized sections with a thickness of 5 ⁇ m were stained with: 1) hematoxylin and eosin according to standard methods for routine histological examination; 2) picrofuxin for determining the area of connective tissue, using computer graphics processing data.
  • Treamide exerted a regenerative effect on liver tissue: it reduced fibrosis, reduced the intensity of fatty degeneration, and prevented the development of necrosis. This allows us to conclude that Treamide can be used as a drug that restores the structural and functional characteristics of liver tissue.
  • Example 13 The study of the effect of Treamide on the restoration of lung tissue on a model of emphysema.
  • Pulmonary emphysema was induced in female C57B1 / 6 mice by a single intratracheal injection of elastase (Sigma, USA) at a dose of 0.6 U / mouse in 30 ⁇ l 0.9% NaCl [Liithje L., Raupach T., Michels H. et al. . // Respiratory Research 2009, 10: 7]. The day of surgery was taken as day 0 of the experiment. Treamide was administered at a dose of 10 mg / kg daily intragastrically once a day from 7 to 60 days of the study. On days 7, 14, 30 and 60, animal studies were euthanized in a C0 2 chamber and lungs were isolated.
  • the area of emphysema-dilated lung tissue was measured as an estimated indicator of emphysema development, vessels and bronchi [ArrateMunoz-Barrutia, Mario Ceresa, Xabier Artaechevarria, Luis M. Montuenga, and Carlos Ortiz-de-Solorzano were excluded from the calculations. Quantification of Lung Damage in an Elastase-Induced Mouse Model of Emphysema // International Journal of Biomedical Imaging.
  • treamide administered to mice caused a decrease in the intensity of inflammatory infiltration of the lung parenchyma throughout the observation period.
  • the drug reduced the area of emphysema-dilated alveoli in the apex of the lung (7, 14, 30, 60 days) and in the lower pulmonary field (14, 30, 60 days) compared with the pathological control group (Fig. 4, table 35,).
  • Treamide can be used as a drug that restores the structural and functional characteristics of the lungs.
  • Example 14 The study of the effect of Treamide on the development of pulmonary fibrosis.
  • Toxic damage to the alveolar lung epithelium causing pulmonary fibrosis was modeled by intratracheal administration of the bleomycin cytostatic once in a dose of 80 ⁇ g / mouse in 30 ⁇ l of saline.
  • inhaled ether anesthesia was used for anesthesia during surgery.
  • the surgical field was disinfected with 70% ethanol and freed from the hairline.
  • the skin, subcutaneous tissue, and the neck's own fascia were dissected along the midline of the neck.
  • blunt tissue extension method the muscles were spread on the ventral side of the trachea.
  • the surgical field was treated with an antiseptic. The introduction of bleomycin was taken for day 0 of the experiment.
  • Treamide and reproduction of pulmonary fibrosis was evaluated by the number and intensity of synthesis of connective tissue in the lungs, as well as by histo-architectonics of the lungs.
  • Treamide at a dose of 10 mg / kg was effective in the treatment of pulmonary fibrosis: the amount of collagen fibers deposited around the vessels and bronchioles decreased to the level of intact control (Fig. 5, table 37).
  • An additional characteristic of the antifibrotic effect of Treamide was a significant decrease in the concentration of collagen, type I collagen and hydroxyproline in homogenates of lung mice with pulmonary fibrosis (table 37).
  • Treamide has an antifibrotic effect, manifested in the normalization of the production of collagen fibers by fibroblasts. This indicates the ability of Treamide to regenerate pulmonary fibroblasts.
  • Treamide can be used as a drug that prevents the development of pulmonary fibrosis and promotes the regeneration of lung tissue.
  • Example 15 The study of the effect of Treamide on the development of cachexia in animals with a tumor.
  • the day of the introduction of tumor cells was taken as 1 day of the experiment.
  • Treamide was administered at a dose of 10 mg / kg daily intragastrically once a day from the 15th to the 28th day of the study.
  • Weighing of animals was carried out one day before the introduction of tumor cells (day 0) and on the 28th day of the experiment.
  • animal studies were euthanized in a C0 2 chamber and blood was collected.
  • an enzyme-linked immunosorbent assay determined the level of free testosterone.
  • Treamide can be used as a drug that prevents the development of cachexia.
  • Treamide promotes tissue regeneration and normalization of prostate tissue structure in models of chronic abacterial prostatitis (CAP) and benign prostatic hyperplasia (BPH).
  • CAP chronic abacterial prostatitis
  • BPH benign prostatic hyperplasia
  • Treamide is a means of enhancing the processes of reparative regeneration of testicular tissue and can be used to treat testicular failure due to depletion of the proliferative pool of spermatogenesis.
  • Treamide has the ability to directly stimulate functional activity of spermatogenous tissue precursor cells.
  • Treamide is promising for restoring the regenerative potential of the testis.
  • the introduction of Treamide increased the regenerative potential of the tissue.
  • the drug not only directly stimulated the formation of new sources of the proliferative pool of spermatogenesis (stem cells), but also enhanced the effect of humoral factors stimulating their formation.
  • Treamide restores sperm motility, reduced due to the introduction of paclitaxel.
  • Treamide can effectively stimulate the reparative regeneration of testicular tissue, the inhibition of which was due to a decrease in the number of committed colony-forming cells.
  • Treamide restores sperm motility detected by hypogonadism.
  • Treamide is an effective means of restoring the copulative activity of various etiologies (including age-related decrease in activity, seasonal decrease in activity, and others).
  • Treamide has been shown to have a regenerative effect on pancreatic tissue. Treamide can be used to treat impaired glucose tolerance and metabolic syndrome.
  • Treamide can be used as a drug that restores the structural and functional characteristics of liver tissue. It was also shown that Treamide can be used as a drug that restores the structural and functional characteristics of lung tissue.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины и касается средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановлениe сниженных функций тканей и органов. В качестве лекарственного средства для лечения и/или профилактики патологического состояния выбранного из группы, включающей метаболический синдром, нарушение толерантности к глюкозе, гепатит, в частности хронический гепатит и токсический гепатит, идиопатический фиброз легкого (ИФЛ), эмфизему лёгких, хроническую обструктивную болезнь лёгких (ХОБЛ), и кахексию, в частности, обусловленную нарушением толерантности к глюкозе, лёгочным фиброзом, хронической обструктивной болезнью легких, раком, и другими заболеваниями. путем предлагается применять средство на основе Треамида. Последний представляет собой бисамидное производное дикарбоновой кислоты формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль. (I)

Description

БИСАМИДНОЕ ПРОИЗВОДНОЕ ДИКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО РЕГЕНЕРАЦИЮ ТКАНЕЙ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ СНИЖЕННЫХ ФУНКЦИЙ ТКАНЕЙ
Область техники
Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, урологии, андрологии, эндокринологии, пульмонологии, гастроэнтерологии, и касается средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей и органов.
Более конкретно, изобретение относится к способу стимуляции регенерации тканей и восстановления сниженных функций тканей и органов, и еще более конкретно, регенерации и восстановления сниженных функций ткани поджелудочной железы, печени, лёгкого, мышечной ткани, сперматогенной ткани, тестикулярной ткани, ткани предстательной железы.
Изобретение также относится к средству нормализации сниженной мужской фертильности (лечения мужского бесплодия), которая может быть обусловлена такими патологическими состояниям, как гипогонадизм, в частности, гипогонадотропный или гипергонадотропный гипогонадизм, астеносперимя, эректильная дисфункция, коррелятивная недостаточность яичек, тестикулярная недостаточность и другие заболевания.
Данное изобретение может быть использовано для лечения и профилактики патологических состояний, выбранных из группы, включающей метаболический синдром, нарушение толерантности к глюкозе, гепатит, идиопатический фиброз легкого, эмфизему лёгких, хроническую обструктивную болезнь лёгких, кахексию, гипогонадизм, предпочтительно, гипогонатропный гипогонадизм или гипергонадотропный гипогонадизм; простатит; доброкачественную гиперплазию предстательной железы, коррелятивную недостаточность яичек и аутоимунный орхит.
Изобретение также относится к средству для восстановления подвижности сперматозоидов.
Уровень техники
Многие патологические состояния, среди которых метаболический синдром, нарушение толерантности к глюкозе, гепатит, эмфизема лёгких, хроническая обструктивная болезнь лёгких, простатит, доброкачественная гиперплазия простаты, гипогонадизм, тестикулярная недостаточность, астеноспермия, сопровождаются снижением функциональной активности и нарушением структуры тканей пораженных органов.
Метаболический синдром - патологический симптомокомплекс, включающий различные метаболические и гормональные нарушения. Диагноз "метаболический синдром" ставят при наличии центрального ожирения и как минимум двух из далее перечисленных факторов: 1) повышение уровня триглицеридов > 150 мг/дл (1,7 ммоль/л), 2) снижение уровня холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) < 40 мг/дл (1,03 ммоль/л) (мужчины), < 50 мг/дл (1,29 ммоль/л) (женщины), 3) артериальная гипертензия (артериальное давление (АД) > 130/85 мм рт. ст. или нормальное АД, контролируемое гипотензивными препаратами), 4) повышение уровня глюкозы плазмы > 100 мг/дл (5,6 ммоль/л). Метаболический синдром в настоящее время примерно одинаково часто встречается у мужчин и женщин, его частота, например, в США достигает 39% [Flegal К.М., Carroll M.D., Ogden C.L., et al. Prevalence and trends in obesity among US adults, 1999-2000 // The Journal of the American Medical Association. 2002. Vol. 288(14). P. 1723-1727].
По данным разных авторов, у 30-50% мужчин с ожирением и другими проявлениями метаболического синдрома выявляется гипогонадизм (дефицит тестостерона). Многими исследователями обнаружена не только высокая распространенность гипогонадизма у мужчин с метаболическим синдромом, но и связь между уровнем общего тестостерона в плазме и проявлениями метаболического синдрома. Получены данные как о взаимосвязи между избыточной массой тела и низким уровнем тестостерона, так и о связи между инсулинорезистентностью и снижением содержания тестостерона в сыворотке крови у мужчин с ожирением [Svartberg J., von Miihlen D., Sundsfjord J., et al. Waist circumference and testosterone levels in community dwelling men. The Troms0 study // European Journal of Epidemiology. 2004. Vol. 19(7). P. 657-667]. Снижение содержания тестостерона в сыворотке крови при метаболическом синдроме и состоянии инсулинрезистентности у мужчин происходит вследствие нарушения функциональной активности тестикулярной ткани. В соответствие с этим способы регенерации тестикулярной ткани с целью лечения гипогонадизма как самостоятельного заболевания, так и сопутствующего метаболическому синдрому являются актуальными.
Поджелудочная железа взрослого человека содержит примерно 109 клеток. В норме износившиеся β-клетки постоянно заменяются новыми, размножающимися в поджелудочной железе (Minami К., Seino S. Current status of regeneration of pancreatic β-cells. Journal of Diabetes investigation. Volume 4, Issue 2. pages 131-141 March 2013). При различных нарушениях работы поджелудочной железы, таких как аутоиммунные или токсические поражения, β -клетки островков Лангерганса сначала характеризуются сниженной функциональной активностью, которая проявляется в снижении продукции инсулина, а на более поздних стадиях погибают. Явные признаки поражения ткани поджелудочной железы появляются, когда разрушено уже больше 90% β-клеток, дефицит инсулина становится постоянным и возникает полная зависимость от вводимого извне инсулина.
Инсулинотерапией не удается достигнуть той степени точности регуляции гликемии, которая обеспечивается при нормальном функционировании островков Лангерганса. Продолжаются попытки лечения поврежденной поджелудочной железы трансплантацией всего органа, островков Лангерганса, β-клеток. Но трансплантация не всегда проходит успешно (частым является проявление отторжения трансплантата). В случае успешного проведения трансплантации, впоследствии требуется постоянное применение иммунодепрессантов.
Иная проблема - нарушение толерантности к глюкозе. Она представляет собой нарушение метаболического ответа на эндогенный или экзогенный инсулин. Данное состояние приводит к повышенной концентрации инсулина в плазме крови по сравнению с физиологическими значениями для имеющейся концентрации глюкозы. Наибольшее клиническое значение имеет нарушение толерантности к глюкозе мышечной, жировой и печеночной тканей. Нарушение толерантности к глюкозе мышечной ткани проявляется в снижении поступления глюкозы из крови в миоциты и ее утилизации в мышечных клетках, жировой ткани — в резистентности к антилиполитическому действию инсулина, приводящему к накоплению свободных жирных кислот (СЖК) и глицерина. СЖК поступают в печень, где становятся основным источником образования атерогенных липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП). Нарушение толерантности к глюкозе ткани печени характеризуется сниженным синтезом гликогена и активацией распада гликогена до глюкозы (гликогенолиз) и синтеза глюкозы de novo из аминокислот, лактата, пирувата, глицерина (глюконеогенез). Таким образом лечение нарушения толерантности тканей к глюкозе позволит восстановить функциональную активность тканей.
Печень - жизненно важная железа организма. Она выполняет около 500 уникальных функций, обеспечивающих процессы пищеварения, инактивацию токсичных веществ, синтез компонентов свёртывания крови, метаболизм белков, аминокислот, жиров, углеводов, нуклеиновых кислот, витаминов, микроэлементов и т.д. Ткань печени часто повреждается химическими, микробными, травматическими, фармацевтическими и другими неблагоприятными факторами. Это приводит к уменьшению количества работоспособных гепатоцитов. Хронический гепатит различной этиологии может длиться многие годы, при этом его часто диагностируют на поздних стадиях развития болезни, когда резко возрастает вероятность развития цирроза печени и хронической печеночной недостаточности [Jung Yl, Witek RP, Syn WK. Signals from dying hepatocytes trigger growth of liver progenitors// Gut. - 2010. - Vol. 5. P. 655-65].
Известны гепатопротекторы: Эссенциале, липоевая кислота, Сирепар, а- токоферол. Однако эти средства не могут полностью защитить или восстановить нарушенные функции мембран, митохондрий и других структур гепатоцитов, поскольку любой из них влияет лишь на отдельные стадии патогенеза гепатитов. В связи с этим современные гепатопротекторы используются в комплексной терапии. Однако такой подход к лечению гепатитов опасен взаимодействием препаратов вследствие полипрагмазии и осложнением течения заболевания. Одновременно практически все препараты данной группы имеют побочные эффекты, которые ограничивают их применение. В связи с вышесказанным, разработка методов, способных эффективно стимулировать регенерацию печени, остается весьма актуальной.
Одной из самых частых патологий клиники мужского бесплодия являются воспалительные заболевания придаточных половых желез. К воспалительными заболеваниям придаточных желез относят заболевания предстательной железы, сопровождающихся воспалением, такие, как острый бактериальный простатит, хронический бактериальный простатит, ДГПЖ (доброкачественная гиперплазия предстательной железы), а также воспаление семенных пузырьков, такое как, острый или хронический везикулит. К заболеваниям предстательной железы относятся также хронический абактериальный простатит, хронический невоспалительный простатит или простатит категории ЗБ [Ludwig М, Vidal A, Diemer Th, Pabst W, Failing К, Weidner W. Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: seminal markers of inflammation. // World J Urol. 2003. Vol. 21, N 2. P. 82-85].
Указанные выше патологии встречаются у 40-70 % мужчин. У 40% мужчин с патоспермией наблюдается хронический простатит, который в 80 % случаев является абактериальным (Benway В.М., Moon T.D.// Urol Clin North Am 2008 Feb; 35(l):23-32).
Следует отметить, что хронические воспаления предстательной железы очень часто сопровождаются доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГГГЖ). Наблюдаемая на фоне ДГГГЖ гиперпролактинемия приводит к эректильной недостаточности, к олигоспермии. Это, безусловно, снижает мужской репродуктивный потенциал [Johri A.M., Heaton J. P., Morales A. Severe erectile dysfunction is a marker for hyperprolactinemia // Int J Import Res. 2001. Vol. 13 N° 3. P. 176-82].
Многие аспекты проявления заболеваний простаты оказывают влияние на качество эякулята, так как предстательная железа выделяет факторы, поддерживающие, прежде всего, подвижность сперматозоидов. В связи с этим на фоне развития заболеваний простаты выявляется коррелятивная недостаточность яичек (вторичное бесплодие). Таким образом, лечение заболеваний предстательной железы благоприятно сказывается на мужской фертильности.
В настоящее время к числу препаратов, оказывающих положительное действие на факторы, сопровождающие течение абактериальных хронических простатитов и ДГГГЖ, принадлежат экстракты, выделенные из растительного сырья - Простамол Уно [Bayane C.W., Ross М., Donnelly F., Habib F.K.// J. Urol. 2000. Vol. 164, N3, Pt.l. Р.876-881]. Однако, их эффективность не всегда оказывается достаточно высокой.
К снижению мужской фертильности приводит также угнетение процесса образования андрогенов (гипогонадизм) [Dohie G.R. , Diemer A., Giwerman А., Jungwith A., Kora Z., Kraus С. Man Infertility, European Association of Urology 2014. 7].
Мужской гипогонадизм в настоящее время выявлен у 4-5 млн. человек. Гипогонадотропный гипогонадизм (или вторичный гипогонадизм) обусловлен недостаточностью гонадотропинов. Первичный гипогонадизм обусловлен нарушением функции тестикулярной (яичковой) ткани семенника. Его ненаследственные формы (приобретенный гипогонадотропный гипогонадизм) могут быть следствием внешних воздействий, приема лекарственных препаратов (анаболических стероидов, метоклопрамида, фенотиазида, наркотических средств и др.), лучевой терапии [Filicori М. Endocrine basis of reproductive function. - Bologna: Monduzzi Editore, 2000. - R 605.; Meczekalski В., Tonetti A., MonteleoneR et al. Hypothalamic amenorrhea with normal body weight: ACTH, allopregnanolone and Cortisol responses to corticotrophin - releasing hormone test // Eur. J. Endocrinol. - 2000. - V.142. - R. 280-285].
Пациентам с вторичным гипогонадизмом назначают тестостерон [Dohie G.R., Diemer A., Giwerman A., Jungwith A., Kora Z., Kraus С. Man Infertility, European Association of Urology 2014, p.35]. Однако тестостерон имеет много противопоказаний и побочных эффектов.
Известен препарат Трибестан (производитель Sofarma (Болгария)), который стимулирует у мужчин выработку тестостерона и повышает подвижность сперматозоидов, однако эффективность данного препарата не всегда высока.
Гипогонадизм, обусловленный патологией половых желез (гипергонадотропный гипогонадизм или тестикулярная недостаточность), относится к наиболее частой форме снижения мужской фертильности [Dohie G.R., Diemer A., Giwerman A., Jungwith A., Kora Z., Kraus С. Man Infertility, European Association of Urology 2014, p.8].
К числу причин его возникновения относится действие экзогенных факторов, таких как лекарственные препараты, в том числе цитостатические средства, облучение, повышение температуры. Длительное снижение продуктивности сперматогенеза, вплоть до его полной остановки, является следствием повреждения сперматогоний типа А. Восстановление сперматогенеза после повреждения может происходить только за счет этих клеток. Они не теряют специфичность половых клеток, так как необратимо определились как предшественники сперматогенеза, и, как стволовые клетки, обладают способностью к колониеобразованию. Эти клетки составляют глубокий резерв регенерационной способности сперматогенной ткани.
Известно, что пролиферативный потенциал сперматогенеза может быть восстановлен за счет трансплантации сперматогенных клеток. Для лекарственной терапии гипергонадотропного гипогонадизма рекомендуется применять тестостерон. Он стимулирует заключительную фазу сперматомейоза, то есть постмитотические деления, приводя тем самым к увеличению количества сперматоцитов и к увеличению продуктивности сперматогенеза за счет стимуляции его конечной фазы. Недостатком этого средства является отсутствие эффективности в отношении стимуляции сперматогоний, которые, как известно, делятся митотически.
Средств медикаментозного лечения мужского бесплодия, обусловленного истощением глубокого резерва регенерационной способности сперматогенной ткани, с восстановлением количества коммитированных колониеобразующих сперматогенных клеток, на фармацевтическом рынке не представлено. Предлагаемое в данном изобретении средство восстановления мужской фертильности при тестикулярной недостаточности, обусловленной повреждением стволовых клеток, не имеет аналогов среди существующих средств лечения этой патологии.
Во многих случаях снижение фертильности у мужчин обусловлено нарушением качества спермы. К наиболее частой патологии эякулята относится астеноспермия (Као S. Н. et.al. Increase of oxidative stress in human sperm with lower motility. Fertil. and Steril. 2008; 89: 5: 1183-1190). Нарушение сперматогенеза по типу астеноспермии рассматривают как отдельную нозологическую форму. Она является следствием возрастных изменений, курения, воспаления, дисгормональных расстройств, воздействия токсических веществ, высоких температур. Лечение астеноспермии зависит от причин ее возникновения. В большинстве случаев рекомендуют хориогонический гонадотропин и тестостерон. Однако эти гормональные лекарственные средства вызывают серьезные побочные эффекты и имеют противопоказания.
Для лечения астеноспермии рекомендуется препарат Спеман, который стимулирует сперматогенез и повышает подвижность сперматозоидов. Препарат является дорогостоящим, состоит из сложной композиции лекарственных трав, произрастающих в разных странах мира и имеющих ограниченные сырьевые запасы. В качестве недостатка следует отметить, что он обладает не очень высокой эффективностью.
Эмфизема лёгких, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и идиопатический фиброз легких (ИФЛ) являются тяжелыми многофакторными легочными расстройствами, у которых хроническое и прогрессирующее течение характерно для пожилых людей (преимущественно для мужчин). Клиническая картина и патогенез ХОБЛ отличается от ИФЛ. Причиной слабо обратимого и прогрессирующего ограничения воздушного потока при ХОБЛ является воспаление дыхательных путей и эмфизематозное расширение альвеол и бронхиол [Hogg JC, Timens W: The pathology of chronic obstructive pulmonary disease. Annu Rev Pathol 2009, 4:435-459], в то время как ограничение легочных функций при ИФЛ наступает вследствие развития интерстициального фиброза и формирования сотового легкого [American Thoracic Society: Idiopathic pulmonary fibrosis: diagnosis and treatment. International consensus statement. American Thoracic Society (ATS), and the European Respiratory Society (ERS). Am J Respir Crit Care Med 2000, 161:646-664]. Распространенность этих двух заболеваний легких совершенно различны. Однако с каждый годом частота и распространенность ИФЛ неуклонно растет, что связано, в том числе, с улучшением диагностических средств. В свою очередь распространенность ХОБЛ всегда была очень высока. Во многом заболевание связано с вдыханием вредных внешних агентов (в основном в следствие табакокурения).
Несмотря на достаточно большое количество экспериментальных и клинических исследований понимание патогенеза эмфиземы лёгких и ХОБЛ ограничено, не существует признанных эффективных подходов лечения данного заболевания. Существующий набор лекарственных средств для ИФЛ ограничен глюкокортикоидами, циклофосфамидом, иммунодепрессантами, антикоагулянтами и направлен на лечение осложнений и является по сути своей поддерживающей терапией. В настоящее время только такой терапевтический агент, как пирфенидон, был одобрен для лечения ИФЛ. Между тем, пирфенидон в клинических исследованиях не проявил ожидаемую высокую антифибротическую активность на этапе развернутой стадии болезни. Кроме этого препарат обладает многими побочными эффектами, используется в высоких дозах.
При развитии ИФЛ, ХОБЛ, злокачественных новообразований и многих других хронических заболеваний наблюдается резкая потеря массы тела. Наибольшую опасность представляет крайняя степень истощения— кахексия. Клинически кахексия проявляется чрезмерной потерей веса в условиях протекающего заболевания, обычно с диспропорциональной атрофией скелетных мышц.
При заболеваниях, приводящих к кахексии, наблюдается снижение функциональной активности тестикулярной ткани и, как следствие, снижение уровня тестостерона. Тестостерон стимулирует миобласты и повышает число клеток-сателлитов, тем самым способствуя синтезу белка и восстановлению поврежденных мышц [Bhasin S., Taylor W.E., Singh R. et al. The mechanisms of androgen effects on body composition: mesenchymal pluripotent cell as the target of androgen action. J Gerontol Med Sci 2003;58A:M1103-1 11О]. Также тестостерон подавляет синтез провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, TNFa и стимулирует продукцию противовоспалительного цитокина - IL-10. С воспалением связывают крайнюю степень истощения при различных заболеваниях. Медиаторы воспаления препятствуют синтезу мышечных белков при кахексии, участвуют в липолизе и бета-окислении жирных кислот [Ryden М., Arvidsson Е., Blomqvist L., Perbeck L., Dicker A., Arner P. Targets for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Biochem Biophys Res Commun 2004;318: 168-175].
К сожалению, до сих пор не существует единого признанного подхода к лечению кахексии. Известны многочисленные попытки коррекции этого состояния. Терапия пациентов с выраженной потерей массы тела включает препараты тестостерона, гормоны роста (соматропин), стимуляторы аппетита (антагонисты серотонина, прогестагены, дронабинол) и ингибиторы глюконеогенеза (гидразина сульфат), однако их эффективность недостаточна.
Таким образом, задачей данного изобретения является разработка средства регенерации и восстановления сниженных функций тканей. Такое средство будет, в частности, способствовать лечению нарушений толерантности к глюкозе, гепатита, эмфиземы лёгкого, хронической обструктивной болезни легких, идиопатического фиброза легких, кахексии, а также способствовать восстановлению мужской репродуктивной функции и позволит преодолеть недостатки известных средств, описанных выше.
Более конкретно, первой задачей настоящего изобретения является разработка средства, которое способствует регенерации тканей, в частности, тканей поджелудочной железы, печени, лёгкого, тестикулярной ткани, ткани предстательной железы, мышечной ткани. В частности, средство по изобретению должно способствовать регенерации тестикулярной ткани и ткани предстательной железы.
Следующей задачей настоящего изобретения является разработка средства снижения уровня глюкозы в крови, повышение которого обусловлено, в частности, такими патологическими состояниями, как метаболический синдром или нарушение толерантности к глюкозе.
Следующей задачей настоящего изобретения является разработка средства восстановления функции печени, снижение которой обусловлено, в частности, такими патологическими состояниями, как хронический гепатит различной этиологии.
Следующей задачей настоящего изобретения является разработка средства нормализации сниженной мужской половой активности, обусловленной, в частности, такими патологиями, как гипогонадизм, коррелятивная недостаточность яичек, тестикулярная недостаточность.
Следующей задачей настоящего изобретения является разработка средства восстановления сперматогенеза (в том числе, подвижности сперматозоидов), снижение которого обусловлено в частности, такими патологиями, как метаболический синдром, простатит, гипогонадизм, астеноспермия, тестикулярная недостаточность, и другими заболеваниями. Следующей задачей настоящего изобретения является разработка средства восстановления нарушенной гистоархитектоники и функций легочной ткани, обусловленной в частности такими патологиями, как эмфизема, идиопатический фиброз легкого и хроническая обструктивная болезнь легких.
Следующей задачей настоящего изобретения является разработка средства восстановления структуры и функции печени.
Следующей задачей настоящего изобретения является разработка средства для восстановления структуры и функции поджелудочной железы, обусловленной такими заболеваниями как метаболический синдром и нарушение толерантности к глюкозе.
Поставленные задачи решаются тем, что в качестве лекарственного средства для лечения и/или профилактики вышеуказанных патологических состояний предлагается применять средство на основе Треамида. Последний представляет собой бисамидное производное дикарбоновой кислоты формулы (I):
Figure imgf000013_0001
или его фармацевтически приемлемую соль.
Данное соединение было описано в заявке RU 2013116822 (опубл. 20.10.2014), посвященной новым соединениям, пригодным для использования в качестве хелаторов металлов, в том числе и для лечения ассоциированных с хелатированием металлов заболеваний.
Заявителем впервые обнаружено, что Треамид обладает способностью эффективно регенерировать ткани и восстанавливать их сниженную функцию, в частности, это касается тканей мужской половой системы. Треамид уменьшает степень выраженности морфологических изменений предстательной железы при абактериальном простатите и ДГПЖ, восстанавливает подвижность сперматозоидов, усиливает половое влечение и копулятивную активность, что, в совокупности, ведет к восстановлению мужской репродуктивной функции.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1 - Морфологическая картина поджелудочной железы у мышей- самцов линии С57В1/6 интактного контроля, на 70е сутки метаболических нарушений без лечения (патологический контроль) и 70е сутки метаболических нарушений с проведенным курсом лечения Треамидом в дозе 10 мг/кг. Окраска гематоксилином и эозином.
А: Треамид в дозе 10 мг/кг (x100); В: Интактный контроль (x100); С. Патологический контроль (x100); D : Треамид в дозе 10 мг/кг (х400); Е: Интактный контроль (x100) ; F: Интактный контроль (х400)
Фиг. 2 - Морфологическая картина поджелудочной железы у мышей самцов линии С57В1/6 интактного контроля, на 70е сутки метаболических нарушений без лечения (патологический контроль) и 70е сутки метаболических нарушений с проведенным курсом лечения Треамидом в дозе 10 мг/кг. Окраска пикрофуксином по Ван-Гизону.
А: Треамид в дозе 10 мг/кг (x100); В: Интактный контроль (x100); С. Патологический контроль (x100); D : Треамид в дозе 10 мг/кг (х400); Е: Интактный контроль (х400) ; F: Патологический контроль (х400)
Фиг. 3 - Морфологическая картина печени у мышей линии С57В1/6 группы интактного контроля, группы патологического контроля хронического токсического гепатита, и группы животных, получающих лечение Треамидом в дозе 10 мг/кг, увеличение x100, препараты изготовлены на 28-е сутки исследования.
А, В, С - Окраска гематоксилин и эозином, D, Е, F - окраска пикрофуксином по Ван-Гизону. A, D - Интактный контроль, В, Е - патологический контроль, С, F - животные с гепатитом, получившие лечение Треамидом в дозе 10 мг/кг.
Фиг. 4 - Морфологическая картина легких у мышей-самок линии С57В1/6 группы интактного контроля, группы паталогического контроля мышей с эмфиземой на 14 и 30 сутки, и группы животных, получающих лечение Треамидом в дозе 10 мг/кг, на 30 сутки. Увеличение x100. Окраска гематоксилином и эозином.
Интактный контроль: А - верхушка легкого, В - среднее легочное поле и С - нижнее легочное поле. Патологический контроль (14 сутки): D - верхушка легкого, Е - среднее легочное поле и F - нижнее легочное поле. Патологический контроль (30 сутки): Н - верхушка легкого, К - среднее легочное поле и L - нижнее легочное поле. Группа животных, получившая лечение Треамидом: М - верхушка легкого, N - среднее легочное поле и О - нижнее легочное поле.
Фиг. 5 - Морфологическая картина легких мышей-самцов линии C57BL/6 интактного контроля (А), паталогического контроля (В) и группы мышей с лёгочным фиброзом, получивших лечение треамидом в дозе 10 мг/кг (С). Окраска пикрофуксином по Ван-Гизону (увеличение x100), препараты изготовлены на 21-е сутки эксперимента.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для регенерации тканей, включающей эффективное количество соединения формулы (
Figure imgf000015_0001
или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель. Также настоящее изобретение относится к лекарственному средству для регенерации тканей, представляющему собой соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль.
В одном варианте осуществления изобретения ткань выбрана из группы, включающей ткань поджелудочной железы, печени, лёгкого, мышечной ткани, сперматогенной ткани, тестикулярной ткани и ткани предстательной железы.
Настоящее изобретение также относится к способу регенерации тканей, включающему введение нуждающемуся субъекту эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли. Далее, настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для регенерации тканей. В одном варианте осуществления изобретения ткань выбрана из группы, включающей ткань поджелудочной железы, печени, лёгкого, мышечной ткани, сперматогенной ткани, тестикулярной ткани и ткани предстательной железы. Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для лечения патологических состояний, связанных с нарушениями структуры тканей. В одном варианте осуществления изобретения патологическое состояние выбрано из группы, включающей метаболический синдром, нарушение толерантности к глюкозе, гепатит, в частности хронический гепатит и токсический гепатит, идиопатический фиброз легкого (ИФЛ), эмфизему лёгких, хроническую обструктивную болезнь лёгких (ХОБЛ), и кахексию, в частности, обусловленную нарушением толерантности к глюкозе, идиопатическим лёгочным фиброзом, хронической обструктивной болезнью легких, раком, и другими заболеваниями. В другом варианте заболевание представляет собой гипогонадизм и ассоциированное с ним нарушение эректильной дисфункции и/или либидо, простатит и ассоциированное с ним нарушение эректильной дисфункции и/или либидо, доброкачественную гиперплазию предстательной железы, коррелятивную недостаточность яичек, аутоимунный орхит, где гипогонадизм предпочтительно представляет собой гипогонатропный гипогонадизм или гипергонадотропный гипогонадизм. Простатит может представлять собой абактериальный, аутоимунный простатиты, или простатит категории Б.
Настоящее изобретение кроме того относится к фармацевтической композиции для нормализации сниженной мужской фертильности, включающей эффективное количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель.
Изобретение также относится к лекарственному средству для нормализации сниженной мужской фертильности, представляющему собой соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль.
Настоящее изобретение также относится к способу нормализации сниженной мужской фертильности, включающему введение нуждающемуся субъекту эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли. Настоящее изобретение далее относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для нормализации сниженной мужской фертильности. Снижение мужской фертильности в предпочтительном варианте обусловлено патологическим состоянием, включающим гипогонадизм, предпочтительно, гипогонатропный гипогонадизм или гипергонадотропный гипогонадизм; астеноспермию, эректильную дисфункцию, коррелятивную недостаточность яичек, тестикулярную недостаточность и другие заболевания. Снижение мужской фертильности может быть также обусловлено угнетением копулятивной активности и либидо, которые, в частности, могут быть спровоцированы заболеваниями, перечисленными выше.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для восстановления подвижности сперматозоидов, включающей эффективное количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель. Также изобретение относится к лекарственному средству для восстановления подвижности сперматозоидов, представляющему собой соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль. Изобретение далее относится к способу восстановления подвижности сперматозоидов, включающему введение нуждающемуся субъекту эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли. Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для восстановления подвижности сперматозоидов, где такое снижение может быть обусловлено гипогонадизмом, астеноспермией, коррелятивной недостаточностью яичек, тестикулярной недостаточностью. Также снижение подвижности может быть обусловлено угнетением копулятивной активности и либидо разной этиологии.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для снижения уровня глюкозы в крови в лечении и/или профилактике патологического состояния, включающей эффективное количество соединения формулы (I). Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству для снижения уровня глюкозы в крови, представляющему собой соединение формулы (I). Также изобретение относится к способу снижения уровня глюкозы в крови в лечении и/или профилактике патологического состояния, включающий введение нуждающемуся субъекту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли. При этом патологическое состояние может быть выбрано из группы, включающей метаболический синдром и нарушение толерантности к глюкозе. Также изобретение относится к применению соединения формулы или его фармацевтически приемлемой соли для снижения уровня глюкозы в крови.
Также изобретение относится к фармацевтической композиция для восстановления структуры и функции печени в лечении и/или профилактике патологического состояния, включающей эффективное количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству для восстановления структуры и функции печени, представляющему собой соединение формулы (I). При этом патологическое состояние может быть выбрано из группы, включающей гепатит, в частности, хронический гепатит и токсический гепатит. Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для восстановления функции печени.
Также настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для восстановления структуры и функции легкого в лечении и/или профилактике патологического состояния, включающая эффективное количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель. При этом патологическое состояние может быть выбрано из группы, включающей хроническое обструктивное заболевание легких (ХОБЛ), эмфизему легких, и идиопатический фиброз легкого. Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству для восстановления структуры и функции легкого, представляющему собой соединение формулы (I). Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для восстановления структуры и функции легкого.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для восстановления структуры и функции поджелудочной железы в лечении и/или профилактике патологического состояния, включающая эффективное количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель. При этом патологическое состояние может быть выбрано из группы, включающей метаболический синдром и нарушение толерантности к глюкозе. Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству для восстановления структуры и функции поджелудочной железы, представляющему собой соединение формулы (I). Также объектом изобретения является применение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для восстановления структуры и функции поджелудочной железы.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к средству стимуляции регенерации тканей и восстановления сниженных функций тканей и органов, и еще более конкретно, регенерации и восстановления сниженных функций ткани поджелудочной железы, печени, лёгкого, мышечной ткани, сперматогенной ткани, тестикулярной ткани, ткани предстательной железы.
Объектом настоящего изобретения является средство, которое способствует регенерации тканей, в частности, тканей, участвующих в функционировании мужских половых желез. Данное средство представляет собой бисамидное производное дикарбоновой кислоты формулы (I):
Figure imgf000019_0001
или его фармацевтически приемлемую соль, известное также под названием Треамид.
В качестве фармацевтически приемлемых солей соединения формулы (I) по настоящему изобретению могут быть использованы кислотно-аддитивные соли органических кислот (например, формиат, ацетат, малеат, тартрат, метансульфонат, бензолсульфонат, толуолсульфонат и др.), кислотно-аддитивные соли неорганических кислот (например, гидрохлорид, гидробромид, сульфат, фосфат и др.), соли с аминокислотами (например, соль аспарагиновой кислоты, соль глутаминовой кислоты и т.д.), предпочтительно, хлоргидраты и ацетаты.
Заявителем впервые обнаружено, что Треамид обладает способностью эффективно регенерировать ткани и восстанавливать сниженную функцию тканей, в частности, это относится к тканям, участвующие в функционировании мужских половых желез.
К тканям, участвующими в функционировании мужских половых желез, относятся различные виды эпителиальных тканей, в частности эпителий семенных извитых канальцев (тестикулярная ткань), эпителий (ацинусов) структурных единиц простаты (ткань простаты), а также различные виды соединительных тканей.
Заявителем также было обнаружено, что Треамид эффективно нормализует сниженную мужскую половую активность, обусловленную, в частности, такими патологиями, как гипогонадизм, коррелятивная недостаточность яичек, тестикулярная недостаточность.
Заявителем также было обнаружено, что Треамид эффективно восстанавливает подвижность сперматозоидов, нарушение которой обусловлено, в частности, такими патологиями, как простатит, гипогонадизм, астеноспермия, коррелятивная недостаточность яичек, тестикулярная недостаточность.
Соединение формулы (I) вводят в эффективном количестве, которое обеспечивает желаемый терапевтический результат.
Соединение формулы (I) может быть введено перорально, местно, парентерально, интраназально, ингаляционно и ректально в виде стандартных дозированных форм, содержащих нетоксичные фармацевтически приемлемые носители. Используемый в настоящем описании термин «парентеральное введение» означает подкожные, внутривенные, внутримышечные или внутригрудные инъекции или вливания.
Соединение формулы (I) настоящего изобретения может быть введено пациенту в дозах, составляющих от 0, 1 до 100 мг/кг веса тела в день, предпочтительно, в дозах от 0,0, 1 до 25 мг/кг один или более раз в день.
При этом следует отметить, что конкретная доза для каждого конкретного пациента будет зависеть от многих факторов, включая активность данного используемого соединения, возраст, вес тела, пол, общее состояние здоровья и режим питания пациента, время и способ введения лекарственного средства, скорость его выведения из организма, конкретно используемую комбинацию лекарственных средств, а также тяжесть заболевания у данного индивида, подлежащего лечению.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат соединение формулы (I) в количестве, эффективном для достижения желаемого результата, и могут быть введены в виде стандартных дозированных форм (например, в твердой, полутвердой или жидкой форме), содержащих соединения настоящего изобретения в качестве активного ингредиента в смеси с носителем или наполнителем, пригодным для внутримышечного, внутривенного, перорального, сублингвального, ингаляционного, интраназального и интраректального введения. Активный ингредиент может быть включен в композицию вместе с обычно используемыми нетоксичными фармацевтически приемлемыми носителями, пригодными для изготовления растворов, таблеток, пилюль, капсул, драже, эмульсий, суспензий, мазей, гелей и любых других лекарственных форм.
В качестве наполнителей могут быть использованы различные вещества, такие как сахариды, например, глюкоза, лактоза или сахароза, маннит или сорбит, производные целлюлозы и/или фосфаты кальция, например, трикальций фосфат или кислый фосфат кальция, в качестве связующего компонента могут быть использованы, такие как крахмальная паста, например, кукурузный, пшеничный, рисовый, картофельный крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон. При необходимости могут быть использованы разрыхляющие агенты, такие как вышеупомянутые крахмалы и карбоксиметилкрахмал, поперечносшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия. Могут быть использованы необязательные добавки, такие как агенты, регулирующие текучесть, и смазывающие агенты, такие как диоксид кремния, тальк, стеариновая кислота и ее соли, такие как стеарат магния или стеарат кальция, и/или пропиленгликоль. Ядро драже обычно покрывают слоем, который устойчив к действию желудочного сока. Для этой цели могут быть использованы концентрированные растворы сахаридов, которые могут необязательно содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, и подходящие органические растворители или их смеси.
В качестве добавок могут быть также использованы стабилизаторы, загустители, красители и отдушки.
В качестве мазевой основы могут быть использованы углеводородные мазевые основы, такие как вазелин белый и желтый (Vaselinum album, Vaselinum flavum), вазелиновое масло (Oleum Vaselini), мазь белая и жидкая (Unguentum album, Unguentum flavum), а в качестве добавок для придания более плотной консистенции - такие как твердый парафин и воск; абсорбтивные мазевые основы, такие как гидрофильный вазелин (Vaselinum hydrophylicum), ланолин (Lanolinum), кольдкрем (Unguentum leniens) мазевые основы, смываемые водой, такие как гидрофильная мазь (Unguentum hydrophylum) водорастворимые мазевые основы, такие как полиэтиленгликолевая мазь (Unguentum Glycolis Polyaethyleni), бентонитовые основы и другие.
В качестве основы для гелей могут быть использованы метилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, оксипропилцеллюлоза, полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид, карбопол.
В качестве основы для суппозитория могут быть использованы основы, не растворимые в воде, такие как масло какао; основы, растворимые в воде или смешиваемые с водой, такие как желатино-глицериновые или полиэтиленоксидные; комбинированные основы - мыльно-глицериновые.
При приготовлении стандартной дозированной формы количество активного ингредиента, используемого в комбинации с носителем, может варьироваться в зависимости от реципиента, подвергающегося лечению, от конкретного способа введения лекарственного средства.
Так, например, при использовании соединений настоящего изобретения в виде растворов для инъекций, содержание активного агента в них составляет до 5% по массе. В качестве разбавителей могут быть использованы 0,9% раствор хлорида натрия, дистиллированная вода, раствор новокаина для инъекций, раствор Рингера, раствор глюкозы, специфические добавки для растворения.
При введении в организм соединений настоящего изобретения в виде таблеток и суппозиториев, их количество составляет до 200 мг на стандартную лекарственную форму.
Дозированные формы настоящего изобретения получают по стандартным методикам, таким как, например, процессы смешивания, гранулирования, формирование драже, растворение и лиофилизация.
Далее эффективность Треамида подтверждена в представленных экспериментальных примерах, предназначенных для иллюстрации реализации изобретения, и не ограничивающих его объем.
Все данные, полученные в экспериментальных исследованиях, были обработаны статистически с помощью непараметрического U критерия Манна- Уитни. В исследованиях считали достоверным уровень значимости 0,05.
Пример 1
Исследование эффективности Треамида по восстановлению подвижности сперматозоидов при астеноспермии
Астеноспермию моделировали путем использования препарата Этопозид, обладающего выраженными прооксидантными свойствами. Использование препарата, индуцирующего повышение уровня свободных радикалов, обусловлено тем, что согласно современным представлениям, непосредственной причиной астеноспермии является окислительный стресс (Као S. Н. et.al. Increase of oxidativestress in human sperm with lower motility. Fertil. and Steril. 2008; 89: 5: 1183-1190).
Треамид вводили ежедневно внутрижелудочно один раз в сутки в дозе 5 мг/кг лечебным курсом (в течение 10 дней после введения Этопозид а) и лечебно- профилактическим курсом (в течение 5 дней до и 5 дней после введения Этопозида) крысам-самцам, имеющим пониженную подвижность зрелых спермиев.
Эксперименты проводили на 50 крысах-самцах породы Вистар ( возраст - 3 мес). Этопозид вводили однократно внутривенно в максимально-переносимой дозе - 30 мг/кг.
Эффективность Треамида оценивали по проценту подвижных форм сперматозоидов, выделенных из придатка семенника.
В первой серии результаты исследований сравнивали с таковыми при введении препарата сравнения Спеман, который вводили внутрижелудочно в дозе 140 мг/кг.
Результаты исследований представлены в таблицах 1-2. Таблица 1
Количество подвижных спермиев (в %) у животных, получавших Треамид за 5 дней до и 5 дней (лечебно-профилактический курс) после введения Этопозида
Figure imgf000024_0001
Примечания: здесь и далее:
# - различия достоверны по сравнению с фоном;
* - различия достоверны по сравнению с контролем;
♢- различия достоверны по сравнению с препаратом сравнения
Таблица 2.
Количество подвижных спермиев (в %)
Figure imgf000024_0002
Представленные экспериментальные данные показали, что на 5-й и 10 день после введения Этопозида (контроль) процент подвижных спермиев достоверно снижался и составлял -73-74% от фоновых значений. В каждой из серий эксперимента процент подвижных спермиев на фоне введения Треамида достоверно возрастал по сравнению с контролем (Этопозид), в первой серии - еще и по сравнению с препаратом Спеман. Во второй серии эксперимента процент подвижных спермиев в опытных группах не отличался от такового у интактных животных (фон). Полученные данные свидетельствуют о том, что Треамид является эффективным средством восстановления подвижности сперматозоидов.
Пример 2
Исследование эффективности Треамида по восстановлению подвижности сперматозоидов при гипогонадотропном гипогонадизме
Гипогонадотропный гипогонадизм моделировали введением синестрола. Эстрогены способны ингибировать секрецию ЛГ (Лютеинизирующий гормон) и ФСГ (фолликулостимудирующий гормон). Повышение концентрации эстрогенов в мужском организме сопровождается увеличением содержания сексстероидсвязывающих глобулинов, что ведет к снижению концентрации свободного тестостерона и возникновению астеноспермии.
Эксперименты проводили на 36 крысах породы Вистар (возраст 3 мес). В течение 30 дней после начала эксперимента всем крысам-самцам (кроме группы фон) внутримышечно вводили Синестрол в дозе 50 ЕД/кг/сут. Далее с 31 -го по 45- й дни опыта животным опытной группы, кроме Синестрола, внутрижелудочно вводили Треамид в дозе 0,5 мг/кг или препарат сравнения Трибестан в дозе 70 мг/кг. Оценку эффективности Треамида проводили по количеству подвижных форм спермиев (проценту подвижных форм сперматозоидов) выделенных из придатка семенника. Результаты исследований сравнивались с таковыми при введении Синестрола (контроль) и препарата сравнения Трибестан.
Результаты исследований представлены в таблице 3.
Таблица 3
Количество подвижных спермиев (в %)
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Примечание:
# - различия достоверны по сравнению с фоном;
*- различия достоверны по сравнению с контролем;
♢ - различия достоверны по сравнению с препаратом сравнения
Представленные экспериментальные данные показывают, что процент подвижных форм сперматозоидов у интактных крыс составил 81,20±1,55, что соответствует видовой норме. Введение Синестрола животным (контрольная группа) привело к достоверному снижению количества подвижных форм сперматозоидов до 46,38±7,27 %, что составило 57% от фона. В группе экспериментальных животных этот показатель статистически значимо превышал контрольные значения на 49%. Трибестан эффекта не оказал.
Таким образом, Треамид эффективно восстанавливает подвижность сперматозоидов, при гипогонадотропном гипогонадизме.
Пример 3
Исследование эффективности Треамида по восстановлению копулятивной активности
Снижение копулятивной активности, обусловленной андрогенной недостаточностью, моделировали путем введения крысам-самцам синестрола.
Модель основана на антогонизме андрогенных и экстрогенных гормонов. Введение синестрола крысам-самцам приводит к угнетению половой активности животных.
Эксперименты проводили на 36 крысах породы Вистар (возраст 3 мес). В течение 30 дней после начала эксперимента всем крысам-самцам (кроме интактной группы (фон)) внутримышечно вводили синестрол в дозе 50 ЕД/кг/сут. Далее с 31-го по 45-й дни опыта животным опытных групп, кроме синестрола, внутрижелудочно вводили Треамид в дозе 1,5 мг/кг и препарат сравнения Трибестан в дозе 70 мг/кг. Оценку половой активности проводили в тесте парного полового поведения. Для этого в эксперименте использовали крыс-самок, находившихся в стадии эструсе, который вызывали предварительным 4-кратным введением Синестрола. Эффективность Треамида оценивали по показателям: латентный период первой попытки к спариванию (J11111C), количество попыток к спариванию (садок), количество эякуляций. Полученные данные сравнивали с таковыми у этих же животных до начала опыта (первое тестирование) и с таковыми в контроле (второе тестирование).
Результаты исследования представлены в таблице 4.
Таблица 4
Влияние Треамида на иоказатели подового поведения крыс-самцов, получавших синестрол
Figure imgf000028_0001
Примечание: # - различия достоверны по сравнению с фоном при Р < 005 при сравнении в одном тестировании;
*- различия достоверны по сравнению с контролем при Р < 005 при сравнении в одном тестировании; ;
♢ - различия достоверны при Р < 005 внутри группы при сравнении первого и второго тестирований.
Представленные экспериментальные данные показали, что крысы-самцы, получавшие только Синестрол, характеризовались отсутствием эякуляций, возрастанием У животных, получавших Треамид, эякуляции выявлялись в
Figure imgf000029_0001
44% случаях (так же, как и у интактных животных). Их количество превышало контрольные значения и таковые у этих же животных при первом тестировании. Кроме того, количество попыток к спариванию в опытной группе восстанавливалось до контрольного уровня. Эффективность препарата сравнения Трибестан была выражена в меньшей степени. Таким образом, лекарственное средство Треамид эффективно восстанавливает копулятивную активность у животных, находящихся в условиях андрогенной недостаточности.
Пример 4
Исследование эффективности Треамида по восстанавлению копулятивной функции и половой мотивации, сниженных возрастными изменениями, у крыс-самцов
Эректильную дисфункцию моделировали путем использования животных позднего и старческого репродуктивного возраста (14-19 мес). Угнетение половой мотивации моделировали использованием животных позднего репродуктивного возраста (14 мес).
Эксперименты по изучению влияния Треамида на копулятивную активность проведены на 76 крысах, породы Вистар (возраст 14 мес, 19 мес). Треамид вводили внутрижелудочно, в течение 14 дней в дозе 5 мг/кг. Препарат сравнения, Силденафил (100 мг, PFIZER PGM, Франция), также вводили внутрижелудочно, что соответствует клиническому применению, в дозе 3 мг/кг два раза в неделю. Оценку половой активности проводили в тесте парного полового поведения. Для этого в эксперименте использовали крыс-самок, находившихся в стадии эструс, который вызывали предварительным 4-кратным введением синестрола. Эффективность Треамида оценивали по показателям: латентный период первой попытки к спариванию количество попыток к
Figure imgf000029_0002
спариванию (КС), количество эякуляций (КЭ). Полученные данные сравнивали с таковыми у этих же животных до введения Треамида и с таковыми в контроле (второе тестирование).
Эксперименты по изучению влияния Треамида на половую мотивацию проведены на 40 крысах-самцах породы Вистар (возраст 14 мес). В качестве экспериментальной модели сексуального влечения крыс была использована модель, предназначенная для целенаправленного поиска новых средств терапии этой патологии [Xi Chu, Ekaterina S. Zhavbert , Julia L. Dugina, Irina A. Kheyfets, Svetlana A. Sergeeva, Oleg I. Epstein, Anders Agmo Sindenafil and a compound stimulating endothelial NO synthase modify sexual incentive motivation and copulatory behavior in male wistar and fisher 344 II J Sex Med. - 2008. - 5. - P. 2085 - 2009]. Эта модель основана на том, что крысы являются общественными животными и стремятся не только к сексуальным, но и к социальным контактам. Определение половой мотивации предполагает определение времени нахождения возле сексуального стимула и балла предпочтения у животных без непосредственных контактов с «социальным» и «сексуальным» стимулами. В качестве сексуального стимула использовали самку, находившуюся в стадии эструс, социального - самца.
Результаты исследований по изучению влияния Треамида на копулятивное поведение и половую мотивацию, проведенных на животных позднего репродуктивного и старческого возраста, представлены в таблицах 5, 6, 7 и 8.
Таблица 5
Показатели копулятивного поведения крыс-самцов позднего репродуктивного возраста (14 мес.)
Figure imgf000030_0001
Таблица 6
Показатели копулятивного поведения крыс-самцов позднего репродуктивного возраста после введения Треамид а (14 мес)
Figure imgf000031_0002
Примечания:
1 - - латентный период первой садки,
Figure imgf000031_0001
2 - КС - количество садок,
3 - КЭ - количество эякуляций,
4 - # - различия достоверны при сравнении с фоном в этом же тестировании (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни),
5 - * - различия достоверны при сравнении с контролем в этом же тестировании (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни),
6 - 0 - различия достоверны при сравнении внутри группы с первым тестированием (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни)
Представленные в таблицах 5 и 6 данные показали, что у крыс позднего репродуктивного возраста наблюдается снижение показателей половой активности (увеличение латентного времени первой садки, снижение количества садок, эякулирующие животные не выявлялись, табл.5). У животных, получавших Треамид, достоверно сокращалось латентное время первой садки, увеличивалось количества садок, выявлялись эякулирующие животные (табл.6). Введение силденафила улучшало половую активность животных, но в меньшей степени: латентный период первой садки снижался, количество садок возрастало, но эякулирующие животные не выявлялись. Таким образом, Треамид является эффективным средством восстановления копулятивной активности у животных позднего репродуктивного возраста.
Результаты исследований, проведенных на животных предстарческого возраста (19 мес), представлены в таблице 7.
Таблица 7
Показатели вдиуяятивного поведения крыс-самцов предстарческого возраста (19 мес)
до введения и после 14-дневного введения Треамида
Figure imgf000033_0002
Примечания;
1
Figure imgf000033_0001
- латентный период первой садки,
2 - КС - количество садок,
3 - КЭ - количество эякуляций,
4 - # - различия достоверны при сравнении с фоном в этом же тестировании (р<0,05, и-критерий Манна-Уиши),
5 - * - различия достоверны при сравнении с контролем в этом же тестировании (р<0,05, U-критерий Манна-Уитни), 6 -♢- различия достоверны при сравнении внутри группы с первым тестированием (р<0,05, U-критерий Манна-Уитни),
Представленные в Таблице 7 данные показывают, что у животных контрольной группы оказалось повышенным латентное время первой садки, снижалось количества садок, эякулирующие животные отсутствовали. После 14- дневного введения Треамида в дозе 5 мг/кг отмечалось достоверное возрастание количество садок, выявлялись эякулирующие животные.
Таким образом, проведенное исследование показало, что Треамид при введении в дозе 5 мг/кг в течение 14 дней, приводит к восстановлению копулятивной активности крыс позднего и предстарческого возраста.
Таблица 8
Показатели, сексуальной мотивации крыс-самцов позднего репродуктивного возраста до введения и после J 4- дневного введения
Треамида
Figure imgf000035_0001
Примечания:
1 - А - время нахождения в зоне «сексуального» стимула,
2 ~ Б - время нахождения в зоне «социального» стимула,
3 - БП - балл предпочтения = X 100,
4 - ЕЖ - количество пересеченных квадратов,
5 - # - различия достоверны при сравнении с фоном в этом же тестировании (р<0,05, U-критерий Манна-Уитни),
6 - * - различия достоверны при сравнении с контролем в этом же тестировании (р<0,05, U-критерий Манна-Уитни), 7 -♢- различия достоверны при сравнении внутри группы с первым тестироваиием (р<0,05, U-критерий Манна-Уитни).
Представленные в таблице 8 данные показывают, что время нахождения возле сексуального стимула и балл предпочтения в контроле оказались сниженными по сравнению с таковыми у интактных животных (первое тестирование). Полученные данные свидетельствуют о том, что в контроле получена модель угнетения половой мотивации, обусловленная использованием 14-ти месячных животных. Это позволяет проводить тестирование лекарственного средства.
Определение времени нахождения исследуемых крыс-самцов в зоне сексуального стимула и подсчет балла предпочтения до начала эксперимента показали, что значения этих показателей в опыте и контроле достоверно не отличались друг от друга. Это подтверждает корректность проведенной рандомизации и тот факт, что крысы-самки не избегали самцов и были к ним восприимчивы.
При анализе средних показателей времени нахождения интактных крыс- самцов (фон) в зонах социального и сексуального стимулов и балла предпочтения, полученных при первом и втором тестировании, выявлено, что они статистически значимо не отличались друг от друга. Это свидетельствует о стабильности мотивационного поведения крыс-самцов, взятых в эксперимент, и подтверждает данные литературы о том, что сексуальная мотивация остается на одном и том же уровне в течение определенного периода времени (до 55 суток).
Анализ исследуемых показателей первого и второго тестирования крыс контрольной группы показал, что уровень сексуальной мотивации животных остается неизменен.
При введении Треамида в дозе 5 мг/кг время нахождения возле «сексуального» стимула возрастало по сравнению с таковым у этих же животных до введения лекарственного средства. Одновременно с этим снижалось (в 2 раза) по сравнению с контролем время пребывания в зоне «социального» стимула. Балл предпочтения статистически значимо возрастал по сравнению с таковым при первом тестировании и достигал 0,64±0,09. Полученные данные свидетельствуют о том, что введение Треамида в дозе 5 мг/кг оказывает стимулирующее влияние на сексуальную мотивацию крыс-самцов позднего репродуктивного периода. Следует отметить, что балл предпочтения в этой группе крыс статистически значимо не отличался от такового у интактных крыс, т.е. у «молодых» животных.
В группе крыс, которым водили препарат сравнения Силденафил (3 мг/кг), среднее значение времени пребывания у самки не возрастало. Однако при этом увеличивалось время пребывания около социального стимула. Балл предпочтения практически не отличался от исходного уровня. Это свидетельствует о том, что Силденафил не оказывал влияние на половую мотивацию крыс-самцов.
Таким образом, тестирование Треамида в качестве стимулятора половой мотивации крыс-самцов зрелого репродуктивного возраста (14 месяцев) показало, что субстанция стимулирует половую мотивацию животных позднего репродуктивного возраста. Действие проявляется в дозе 5 мг/кг, оптимальный срок терапии - 14 дней.
Препарат сравнения, Силденафил, в тесте на половую мотивацию не проявил свою активность. В тесте на копулятивную активность его эффекты оказались недостаточно выраженными и кратковременными.
Пример 5
Исследование эффективности Треамида по восстанавлению копулятивной активности крыс-самцов интактных животных, находящихся в условиях сезонного угнетения копулятивной активности сезонное угнетение репродуктивной активности моделировали проведением экспериментов в зимний период (конец декабря). В качестве фоновой группы использовались интактные животные (возраст 3 мес) протестированные в июне-месяце.
Эксперименты проведены на 27 крысах-самцах репродуктивного возраста (3 мес) породы Вистар. Треамид в дозе 5 мг/кг и препарат сравнения Силденафил ( в дозе 3 мг/кг 2 раза в неделю, вводили внутрижелудочно 1 раз в сутки в течение 15 дней. Оценку половой активности проводили в тесте парного полового поведения. Тестирование проводили дважды: до начала введения и через 1 ч после последнего введения Треамида. Крысы контрольных групп, получавшие растворитель, тестировались в те же сроки, что и животные опытных групп.
В эксперименте использовали крыс-самок, находившихся в стадии эструс, который вызывали предварительным 4-кратным введением синестрола. Эффективность Треамида оценивали по показателям: латентный период первой попытки к спариванию
Figure imgf000038_0001
количество попыток к спариванию (КС), количество эякуляций (КЭ). Полученные данные сравнивали с таковыми у этих же животных до введения тестируемого соединения и с таковыми в контроле (второе тестирование).
Результаты сравнения копулятивной активности животных контрольной и опытной групп представлены в таблице 9.
Таблица 9
Влияние Треамида на показатели копулятивного поведения крыс-самцов на модели его сезонного угнетения
Figure imgf000039_0001
♦ - различия достоверны по сравнению с 1-м тестированием, т.е. до и после введения нрошводиой.
Результаты тестирования крыс-самцов фоновой группы показали, что животные характеризуются достаточно высокими и стабильными показателями половой активности. Средний латентный период первой садки составил 114 сек, количество садок - 14,7, количество спариваний - 0,33. Сравнение тестируемых показателей в «летнее» время года с таковым в «зимний период» показывает, что латентный период первой попытки к спариванию возрос в 4 раза, количество попыток к спариванию снизилось в 3 ,4 раза (Р< 0,05). Кроме того, самцы контрольной группы, в зимний период не осуществили ни одной эякуляции (Р< 0,05).
Введение силденафила не оказало существенного влияния на половое поведение крыс-самцов, находящихся в условиях сезонного угнетения их половой активности. До и после его введения исследуемые показатели не отличались от таковых друг от друга и с таковыми в контрольной группе. При наблюдении за половой активностью крыс-самцов, которым вводили Треамид в дозе 5мг/кг было установлено, что латентный период первой садки после введения достоверно снизился в 1 , 8 раза по сравнению с таковым до тестирования, что свидетельствует о стимулирующем влиянии лекарственного средства на центры полового влечения и, в определенной степени, и на копулятивную активность Общее количество попыток к спариванию возросло на 1,8 раза, но различия оказались статистически не значимыми. При подсчете количества животных в группе, осуществивших эякуляции, было установлено, что после введений Треамид а они выявлялись у 33%, в то время, как до введения препарата, эти животные не эякулировали (Р<0,05).
Таким образом, получены убедительные доказательства способности Треамида восстанавливать половую активность крыс-самцов, находящихся в условиях сезонного снижения ее активности.
Пример 6
Исследование эффективности Треамида по регенерации и нормализации структуры ткани предстательной железы при хроническом абактериальном простатите (ХАП) или доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ)
Это проявляется в уменьшении степени выраженности морфологических изменений, характерных для этих заболеваний. ХАП моделировали прошиванием вентральной доли железы шелковой нитью, ДГПЖ моделировали введением Сульпирида В качестве препарата сравнения использовался Простамол Уно.
Животным с ХАП Треамид вводили внутрижелудочно в дозе 0,5 мг/кг в течение 15 дней.
Животным с ДГПЖ Терамид вводили внутрижелудочно в течение 2-х месяцев в дозе 0.5 мг/кг.
1. Исследование эффективности Треамида по регенерации и нормализации структуры ткани предстательной железы на модели хронического абактериального простатита (ХАП)
Эксперименты проведены на 40 крысах-самцах популяции Вистар (возраст 3 мес). При моделировании хронического абактериального простатита шелковой нитью прошивалась (под наркозом) вентральная доля предстательной железы. Для реализации модели доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) у крыс вызывали гиперпролактинемию, для чего крысам-самцам внутрибрюшинно вводили сульпирид в дозе 40 мг/ кг ежедневно в течение 2-х месяцев (эглонил; «Санофи Винтроп Индустрия», Франция).
Через 1 месяц после операции животным экспериментальной группы внутрижелудочно вводили Треамид в дозе 0.5 мг/кг 1 раз в сутки в течение 15 дней . По окончании курса введений определяли массу тела животных, проводили их эвтаназию в С02-камере. Затем препарировали вентральную долю железы, измеряли массу, объем, определяли весовой коэффициент и проводили морфологический анализ. Для этого простату фиксировали в формалине, заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали на соединительную ткань по Ван-Гизону, для подсчета относительной площади эпителия - гематоксилин-эозином. Далее проводили количественную оценку выраженности атрофических процессов и развивающегося склероза. Оценку проводили на стандартной площади среза железы с помощью компьютерного графического анализа (микрофотографии последовательных 10 полей зрения, выполненные видеокамерой "AxioCam Erc5s", установленной на микроскопе "AxioLab Α ' (объектив х 10, окуляр х 10), с программой передачи изображения на компьютер фирмы "AxioVision LE", Carl Zeiss). Определяли площадь, занимаемую секреторными отделами, коллагеновыми волокнами соединительно -тканных прослоек. Эффективность лекарственного средства оценивали по следующим критериям: меньшая степень выраженности морфологических признаков хронического абактериального простатита (атрофии и склероза): площадь, занимаемая секреторными отделами, коллагеновыми волокнами соединительно- тканных прослоек.
Результаты исследования представлены в таблицах 10-11.
Таблица 10
Влияние Треамида на массу и объем передней доли предстательной железы крыс на фоне ХАП
Figure imgf000042_0001
Примечания:
1 - # - различия достоверны при сравнении с фоном в (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни)
2 - * - различия достоверны при сравнении с контролем в (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни),
3 - Ω - различия статистически значимы по сравнению с группой Простамол-Уно (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни). Таблица 11
Морфометрические показатели передней доли предстательной железы крыс, на фоне хронического асептического воспаления предстательной железы, %
Figure imgf000043_0001
Примечания:
1 - # - различия достоверны при сравнении с фоном (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни)
2 - * - различия достоверны при сравнении с контролем (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни),
3 - Ω - различия статистически значимы по сравнению с группой Простамол- Уно (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни).
Представленные экспериментальные данные показывают, что масса железы, ее весовой коэффициент, объем во всех сравниваемых группах достоверно не отличались друг от друга (табл.10). Морфологический анализ (табл.11) показал, что в предстательной железе крыс контрольных животных достоверно снижалась площадь эпителия ацинусов (атрофия) и возрастала (площадь коллагеновых волокон (склероз). Ведение Треамида крысам - самцам в дозе 0,5 мг/кг приводило к возрастанию (на 22%) площади эпителия ацинусов. Значение этого показателя достоверно не отличалось от фоновых значений, в то время как в контроле он был значимо снижен по сравнению с фоном. Площадь коллагеновых волокон имела тенденцию к снижению. При сравнении полученных данных с таковыми при введении Простамола Уно, установлено, что Простамол Уно не оказывает влияния на площадь эпителия ацинусов. Полученные данные позволяют заключить, что использование Треамида в дозе 0,5 мг/кг у крыс с ХАП способствует регенерации эпителиальной ткани предстательной железы. Это выражается в снижении степени выраженности атрофических процессов. Последнее, очевидно, приведет к возрастанию функциональной активности эпителия ацинусов и будет способствовать восстановлению качественных характеристик эякулята.
2. Исследование эффективности Треамида по регенерации и нормализации структуры ткани предстательной железы на модели доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ)
Изучали способность Треамида нормализовать структуру предстательной железы на фоне введения Сульпирида, Терамид вводили внутрижелудочно в течение 2-х месяцев в дозе 0.5 мг/кг одновременно с Сульпиридом. Контрольные животные получали растворитель (2% крахмальную слизь) в эквивалентном объеме. Животным группы сравнения внутрижелудочно вводили раствор препарата Простамол Уно в дозе 50 мг/кг. По окончании курса введений определяли массу тела животных, проводили их эвтаназию в С02-камере. Известно, что сульпирид вызывает развитие ДГПЖ в боковой доле железы крыс [Van Coppenolle Fabien, Christian Slomianny, Francoise Carpentier Effects of hyperprolactinemia on rat prostate growth: evidence of androgeno - dependence. // Physiol.Endocrinol. Metab. - 2001. - P.120-129]. В связи с этим, препарировали эту долю. Определяли ее массу, весовой коэффициент, объем. Далее проводили морфологическое исследование. Боковую долю предстательной железы фиксировали в 10% формалине, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 5 мкм. Депарафинированные срезы железы окрашивали гематоксилином и эозином. На гистологических срезах определяли наличие пролиферативных центров и наличие дочерних ацинусов на стандартную площадь среза. Кроме того, на стандартной площади гистологического среза измеряли площадь эпителиальных и стромальных структур. Эти показатели определяли с помощью компьютерного графического анализа на стандартной площади гистологического среза (микрофотографии последовательных 10 полей зрения, выполненные видеокамерой "AxioCam Erc5s", установленной на микроскопе "AxioLab А '(объектив х 10, окуляр х 10), с программой передачи изображения на компьютер фирмы "AxioVision LE", Carl Zeisis). Стромально-эпителиальное соотношение определяли как отношение площади стромы к площади эпителия.
Эффективность тестируемого соединения определяли по следующим критериям: меньшая степень выраженности морфологических признаков доброкачественной гиперплазии предстательной железы: - снижение количества центров пролиферации и дочерних ацинусов, снижение площади эпителия.
Результаты экспериментов представлены в таблицах 12-16.
Таблица 12
Масса тела; масса и объем боковой доли 'предстательной железы крыс на фоне её доброкачественной гиперплазии (ДГПЖ)
Figure imgf000046_0001
Примечания:
1 - # - различия достоверны при сравнении е фоном в этом же тестировании (р<0,05, U-крнтерий Манна-Уитни)
2 - *— различия достоверны при сравнении с контролем в этом же тестировании (р<0,05, И «критерий Манна-Уитни),
3 - Ώ - различия статистически значимы по сравнению с группой Простамол-Уно (р<0,05, U-критернй Манна-Уитни).
Таблица 13
Относительная плошадь (%) эпителия ацинусов на стандартной площади среза боковой доли предстательной железы крыс-самцов в условиях гиперплазии
Figure imgf000047_0001
Примечания: здесь и далее
1 - # - различия достоверны при сравнении с фоном в этом же тестировании (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни)
2 - * - различия достоверны при сравнении с контролем в этом же тестировании (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни),
3 - Ω - различия статистически значимы по сравнению с группой Простамол Уно (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни).
Таблица 14
Количество структур (абс), состоящих из 2-3 плотно прилегающих друг к другу железок, на стандартной площади среза боковой доли предстательной железы крыс-самцов в условиях гиперплазии
Figure imgf000047_0002
Таблица 15
Количество дочерних пролиферативных центров (абс.) на стандартной площади среза боковой доли предстательной железы крыс-самцов в условиях гиперплазии
Figure imgf000048_0001
Таблица 16
Относительная плошадь (%) стромы на стандартной площади среза боковой доли предстательной железы крыс-самцов в условиях гиперплазии
Figure imgf000048_0002
Примечания:
1 - # - различия достоверны при сравнении с фоном в этом же тестировании (р<0,05, U-критерий Манна-Уитни)
2 - * - различия достоверны при сравнении с контролем в этом же тестировании (р<0,05, U-критерий Манна-Уитни),
3 - Ω - различия статистически значимы по сравнению с группой Простамол Уно (р<0,05,
U-критерий Манна- Уитни).
Представленные экспериментальные данные показали, что масса простаты, ее весовой коэффициент во всех сравниваемых группах достоверно не отличались друг от друга (табл.12). Количественный морфологический анализ показал, что введение Сульпирида приводило к достоверному возрастанию на 33% площади эпителия ацинусов на стандартной площади среза (табл. 13), что свидетельствует об его усиленной пролиферации. Морфологически это выражается, прежде всего, в обильном разрастании папиллярных выростов эпителия. В простате крыс, получавших Сульпирид, отмечалось появление структур, состоящих из 2-3-х прилегающих друг к другу железок (табл.14). Кроме того, на стандартной площади среза выявлялось около 3-х - 8-ми дочерних центров пролиферации (табл. 15). Относительная площадь стромальных структур достоверно возрастала на 22%.
При введении Треамида признаки ДГПЖ были выражены в меньшей степени. Так, в простате животных этой группы выявлялось достоверное снижение площади эпителия ацинусов (табл.14), снижение количества дочерних пролиферативных центров (табл. 15). Эти данные свидетельствуют о наличие антипролиферативных свойств тестируемого соединения. Препарат сравнения Простамол Уно так же обладал терапевтическим эффектом. Так, его введение крысам-самцам, получавшим сульпирид, приводило к снижению количества дочерних пролиферативных центров (табл.15). Однако его эффективность оказалась ниже таковой у тестируемого соединения, о чем свидетельствует способность последнего приводить к снижению площади эпителия, что не выявлялось на фоне введения препарата сравнения.
Таким образом, Треамид в дозе 0,5 мг/кг эффективно восстанавливает морфологическое состояние предстательной железы на фоне введения Сульпирида, что проявляется в снижении степени выраженности ДГПЖ у экспериментальных животных. Его эффективность превышает таковую препарата сравнения Простамола Уно.
Пример 7
Исследование эффективности Треамида по усилению процессов репаративной регенерации тестикулярной ткани и лечению тестикулярной недостаточности, обусловленной истощением пролиферативного пула сперматогенеза
Последняя моделировали однократным введением крысам-самцам (возраст 3 месяцев) цитостатического препарата Паклитаксел (Митотакс, Dr. Reddy's, Индия). Выбор препарата обусловлен тем, что он относится к числу лекарственных средств, повреждающих предшественники сперматогенеза - стволовые клетки.
Паклитаксел вводили животным контрольной и опытной группы однократно внутривенно, в максимально переносимой дозе - 7,6 мг/кг. Треамид вводили животным опытных групп внутрижелудочно в дозе 5 мг/кг в виде взвеси в 2 % крахмальной слизи в течение 15 дней через 1 месяц после введения Паклитаксела. Контрольные животные вместо исследуемого вещества получали растворитель (2 % крахмальная слизь) в эквивалентном объеме.
Для изучения влияния Треамида на глубокий резерв регенерации сперматогенной ткани был использован метод оценки колониеобразующей способности, позволяющий определять количество комметированных стволовых сперматогенных клеток [AJ. Richards, G.C.Enders, J.L Resnick // Biol. Reprod. - 1999. - Vol. 61. - P. 1146-1151.].
Ha 1-й (через 24 ч) день, а также на 45-й и 65-й день после введения Паклитаксела проводили эвтаназию животных и препарирование семенников. Далее методом клонирования in vitro определяли содержание клеток- предшественников сперматогенеза в семенниках. Для культивирования клеток- предшественников исследуемого органа использовали подслой, который был представлен клетками адгезирующей фракции. Для приготовления подслоя прилипающих клеток в условиях 5% С02 и 37°С один семенник интактного животного гомогенизировали в среде DMEM и отмывали центрифугированием (1500 об/мин, 10 мин). Далее полученную взвесь клеток разделяли на адгезирующую и неадгезирующую фракции. Для этого в 24-луночном планшете в каждую лунку помещали по 0,5 мл приготовленной взвеси клеток в концентрации 1 х 106 /мл в среде для культивирования клеток-предшественников, и далее инкубировали в течение 1 часа в С02-инкубаторе при 37°С, 5% С02 и 100% влажности воздуха. После инкубирования собирали неадгезирующую часть клеток. В лунки, содержащие фракцию прилипших клеток, помещали 0,5 мл среды для культивирования сперматогенных клеток-предшественников и инкубировали в течение 7 суток в С02-инкубаторе при 37°С, 5% С02 и 100% влажности воздуха. Через 7 суток проводили замену культуральной среды с последующим наслоением поверх полученной стромы неадгезирующих клеток семенников опытных животных. Для этого, по описанной выше методике, клетки разделяли на адгезирующую и неадгезирующую фракции. В чашках Петри инкубировали гомогенат органа в течение 1 часа в С02 инкубаторе при 37°С, 5% С02 и 100% влажности воздуха. Далее собирали не прилипшую фракцию клеток, в камере Горяева подсчитывали количество клеток/мл. Наслоение не прилипших клеток проводили в концентрации 2x 105 /мл поверх полученной стромы в объёме 0,5 мл на лунку. Инкубировали в течение 7 суток в С02 - инкубаторе при 37°С, 5% С02 и 100% влажности воздуха. После инкубации подсчитывали количество колониеобразующих единиц сперматогенных (КОЕ-Сп) - скопления более 30 клеток округлой формы и различного диаметра. Критерием эффективности используемого средства являлось достоверное увеличение количества клеток, дающих начало КОЕ-Сп, в ткани семенников опытных животных по сравнению с таковым в контроле.
Определение колониестимулирующей активности клеток микроокружения сперматогенной ткани (продукция клетками Сертоли гуморальных регуляторов сперматогенеза) проводили следующим образом. С помощью вышеописанной методики получали гомогенат семенника, с последующим выделением адгезирующей фракции клеток. Прилипающие клетки культивировали 24 часа в полной культуральной среде при 37°С, 5% С02 и 100% влажности воздуха. Через сутки собирали супернатант, который хранили при температуре 20°С. Для тестирования уровня гуморальных факторов сперматогенеза в супернатанте использовали тест-систему КОЕ-Сп семенников интактных крыс. Полученные результаты выражались количеством колоний, выросших из количества наслоенных неадгезирующих клеток (105 кл/лунка).
Эффективность Треамида определяли по достоверному увеличению колоний, выросших из клеток тест-системы под действием супернатанта клеток семенников опытных животных по сравнению с таковым в контроле.
Для культивирования клеток-предшественников исследуемого органа использовали подслой (представленный клетками адгезирующей фракции), заранее приготовленный в 96-луночном планшете, по вышеописанной методике.
Далее, от двух групп животных (интактные животные, и животные, которым за 24 часа до исследования вводили Паклитаксел внутривенно) выделяли неадгезирующую фракцию клеток сперматогенной ткани и переносили на полученный подслой в полной культуральной среде (80% DMEM, 20% ЭТС, L- глютамин, антибиотики, гепарин) в концентрации 2х 105 /мл. Перед инкубированием в полную культуральную среду добавляли Треамид в концентрациях 1 нг/мл, 3 нг/мл, 10 нг/мл, 30 нг/мл, 100 нг/мл, 300 нг/мл и 1000 нг/мл. Инкубировали в течение 7 суток в С02-инкубаторе при 37°С, 5% С02 и 100% влажности воздуха. После инкубации подсчитывали количество колониеобразующих единиц сперматогенных (КОЕ-Сп) - скопления более 30 клеток округлой формы и различного диаметра.
Эффективность Треамида определяли по достоверному увеличению количества клеток, дающих начало КОЕ-Сп, в культуре при добавлении исследуемого вещества, по сравнению с таковым в контроле.
Морфологическое и функциональное состояние сперматогенной ткани проводили с целью дополнительного подтверждения эффективности стимуляции образования стволовых коммитированных клеток.
Его оценивали по следующим показателям: численность клеточной популяции сперматогоний, среднее количество клеток Сертоли, степень зрелости сперматогенного пласта, количество клеток Лейдига, эндокринная активность семенника, общее количество сперматозоидов, приходящихся на эпидидимис, процент подвижных форм спермиев. Для этого при эвтаназии на 45 и 65 день 90 день эксперимента, при вскрытии выделялись хвостовые части эпидидимиса и семенник. Придаток одного семенника гомогенизировали в теплом (37 °С) физиологическом растворе и во взвеси клеток эпидидимиса определили количество подвижных форм сперматозоидов. При подсчете общего количества сперматозоидов, приходящихся на придаток (ОКС), была использована гомогенизированная клеточная взвесь второго эпидидимиса в дозированном количестве физиологического раствора с применением лейкоцитарного меланжера и камеры Горяева.
Для морфологического исследования семенники крыс фиксировали в жидкости Карнуа и готовили парафиновые срезы. Депарафинированные срезы толщиной 5 мкм окрасили гематоксилин-эозином. На срезе семенника определили численность клеточной популяции сперматогоний, количество клеток Сертоли, количество клеток Лейдига, определяли эндокринную активность клеток Лейдига. На основании подсчета клеток Сертоли вычисляли степень зрелости сперматогенного пласта. Расчет проводили по формуле для экспериментальных групп у = 5,95 - 0,18х для группы интактных животных у=6,7 - 0,23х, где х - среднее количество клеток Сертоли на поперечном срезе извитого семенного канальца, у - индекс, характеризующий степень зрелости сперматогенного пласта. При выборе сроков исследований учитывалась длительность сперматогенеза у крыс, которая составляет полтора месяца. Сроки 45 и 65 сутки после введения Паклитаксела соответствует проявлению эффектов воздействия на клеточную популяцию сперматогоний.
Критериями стимуляции процесса регенерации тестикулярной ткани явились: - увеличение численности клеточной популяции сперматогоний, количества клеток Сертоли, снижение степени зрелости сперматогенного пласта, увеличение продуктивности сперматогенеза. Критерием функциональной активности спермиев является процент их подвижных форм.
Результаты экспериментов представлены в таблицах 17 и 18.
Таблица 17
Динамика содержания КОЕ-Сп в семенниках крыс при введении
Паклитаксела и исследуемого вещества Треамид
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0002
Примечания:
1. * отмечена достоверность различий показателя с интактным контролем (фон), тестировании (р<0,05, U-критерий Манна-Уитни)
2. # - отмечена достоверность различий между контролем (Паклитаксел) и опытными группами (р<0,05, U-критерий Манна-Уитни).
Представленные экспериментальные данные показали, что в результате изучения содержания количества предшественников сперматогенной ткани в семенниках крыс после введения Паклитаксела, было обнаружено статистически значимое снижение количества клеток, дающих начало колониям (КОЕ-Сп) на 1- е, 45-е и 65-е сутки опыта (табл.17). Так, к концу опыта количества колониеобразующих клеток сократилось почти на 40%.
Введение Треамида сопровождалось достоверным увеличением (на 44- 48%) количества колониеобразующих клеток во все исследуемые сроки (на 45 и 65-е дни опыта) по сравнению с цитостатическим контролем (табл. 17).
Таблица 18
Изменение уровней колониестимулирующий активности кондиционных - сред клеток семенников (х 105 клеток) при введении Паклитаксела и исследуемого вещества Треамид
Figure imgf000054_0001
Примечания:
1. отмечена достоверность различии показателя с интактным контролем
(р<0,01, U-критерий Манна-Уитни),
2. # - отмечена достоверность различий между контролем (Паклитаксел) и опытными группами (р<0,01, U- критерий Манна-Уитни).
Исследование механизмов снижения колониеобразующей активности стволовых клеток после введения Паклитаксела выявило снижение продукции клетками микроокружения сперматогенной ткани гуморальных факторов, стимулирующих рост колоний из предшественников сперматогенной ткани, на 1- е, 45 и 65-е сутки исследования (табл.18). Наиболее существенное угнетение гормональной регуляции (в 2,8 и 3 раза) процессов колониеобразования комитированных сперматогенных клеток выявлялось на 1-й и 65-й день опыта. Полученные данные свидетельствуют о том, что Паклитаксел оказывал не только прямое токсическое действие на стволовые сперматогонии, но и угнетал функциональную активность клеток микроокружения, тем самым снижал их стимулирующее влияние на процессы обновления клеток, составляющих глубокий резерв сперматогенной ткани. Это свидетельствует об угнетении под действием Паклитаксела гормональной регуляции функционирования стволовых сперматогониев .
На 65-е сутки опыта в группе крыс, получавшей Треамид, было отмечено статистически значимое увеличение (на 80%) секреторной активности клеток микроокружения по сравнению с контролем (табл.18). Это свидетельствует об активации под действием Треамида функционального состояния клеток микроокружения.
Для изучения прямого действия Треамида на предшественники сперматогенной ткани было проведено исследование in vitro с добавлением Треамида в культуры клеток в концентрациях 1, 30, 100, и 1000 нг/мл.
Результаты эксперимента представлены в таблице 19.
Таблица 19
Влияние Треамида на рост колоний из КОЕ-Сп при добавлении in vitro
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
Примечания:
1. *- различия достоверны при сравнении с интактным контролем (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни);
2. # - различия достоверны при сравнении с цитостатическим контролем на (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни).
В результате определения содержания предшественников сперматогенной ткани в семенниках крыс после введения Паклитаксела, было обнаружено статистически значимое (табл.19) снижение колониеобразования на 1-е сутки, что соответствует ранее полученным данным.
При добавлении Треамида (в концентрациях 100 и 1000 нг/мл) в полную культуральную среду, содержащую предшественники сперматогенной ткани интактных животных, было выявлено достоверное увеличение содержания КОЕ- Сп.
Изучение прямого воздействия Треамида in vitro на формирование сперматогенных колоний из клеток, взятых из семенников крыс на 1 -е сутки после внутривенного введения Паклитаксела, выявило увеличение колониеобразования под влиянием исследуемого вещества при введении его во всех исследуемых концентрациях (табл.19).
Полученные данные свидетельствуют о наличии у Треамида способности непосредственно стимулировать функциональную активность клеток- предшественников сперматогенной ткани.
Таким образом, введение Паклитаксела приводило к снижению регенеративного потенциала семенника, выражающееся в уменьшении количества комитированных колониеобразующих сперматогенных клеток. Это обусловлено не только непосредственным токсическим действием Паклитаксела на источники пролиферативного пула сперматогенеза, но и угнетением гуморальных факторов, стимулирующих пролиферацию этих клеток. Введение Треамида повышало регенераторный потенциал ткани. При этом Треамид не только непосредственно стимулировал образование новых источников пролиферативного пула сперматогенеза (стволовых клеток), но и усиливал действие гуморальных факторов, стимулирующих их образование.
При изучении морфологического и функционального состояния сперматогенной ткани через 45 дней после начала опыта было обнаружено, что введение Паклитаксела приводило к достоверному снижению (более чем на 30%) численности клеточной популяции сперматогоний, продуктивность сперматогенеза, судя по ОКС, снижалась по сравнению с фоном более чем на 40% (табл.19).
Габлица 20
Оценка состояния сперматогенеза крыс через 45 дней после введения Паклитаксела
Figure imgf000058_0001
Примечание:
* - различия достоверны по сравнению с фоном
# - различия достоверны по сравнению е контролем.
Одновременно со снижением общего количества зрелых половых клеток выявлялось и статистически значимое уменьшение процента их подвижности. Таким образом, через 45 суток после введения Паклитаксела отмечалась тестикулярная недостаточность в виде патоспермии, что является одной из причин мужского бесплодия. Срок 45 суток соответствует проявлению токсического действия на клеточную популяцию сперматогоний. Учитывая, что при этом наблюдается снижение (на 40%) количества клеток-предшественников сперматогенеза, то в настоящем исследовании получена модель тестикулярной недостаточности, обусловленной истощением источников пролиферативного пула сперматогенеза. Судя по таким показателям, как степень зрелости сперматогенного пласта и количество клеток Сертоли, у контрольных животных выявляются признаки активация процессов репаративной регенерации тестикулярной ткани. Так, количество клеток микроокружения возрастает, а степень зрелости сперматогенного пласта падает (табл. 20). Однако, функциональная активность клеток микроокружения является сниженной. Полученные данные свидетельствуют о низком регенерационном потенциале сперматогенной ткани животных, получавших один Паклитаксел.
Через 45 суток после сочетанного введения Паклитаксела и Треамида (табл. 20), среднее количество сперматогоний статистически значимо возрастало по сравнению с контролем (Паклитаксел), продуктивность сперматогенеза достоверно не увеличивалась, но увеличивался процент подвижных форм спермиев. Возрастание общего количества сперматогоний, очевидно, связано с возрастанием количества коммитированных колониеобразующих клеток сперматогенной ткани. В опытной группе выявлялось достоверное возрастание по сравнению с контролем среднего количества клеток Сертоли, но их функциональная активность оставалась сниженной как в контроле. Степень зрелости сперматогенного пласта не снижалась по сравнению с контрольными значениями. Таким образом, введение лекарственного средства приводило к снижению выраженности патоспермии (судя по проценту подвижных форм), возрастанию количества сперматогоний.
При изучении морфологического функционального состояния сперматогенной ткани крыс, получавших только Паклитаксел, было установлено, что через 65 дней опыта численность клеточной популяции сперматогоний, продуктивность сперматогенеза снижалась (табл.21).
Таблица 21
Оценка состояния сперматогенеза крыс через 63 дней после введения Пажлитакеела
Figure imgf000061_0001
Примечание * - различия достоверны по сравнению с фоном
# - различия достоверны по сравнению с контролем.
Это, очевидно, является следствием, отмеченного выше истощения популяции клеток-предшественников сперматогенеза и угнетения гуморальных факторов, стимулирующих их пролиферацию. Оставался сниженным и процент подвижности зрелых половых клеток, что свидетельствует об их частичной неполноценности. Таким образом, и в данный срок наблюдения (через 65 дней опыта) выявлялась тестикулярная недостаточность, обусловленная снижением источников пролиферативного пула сперматогенеза, т.е. воспроизводилась экспериментальная модель патологического процесса. Количество клеток Лейдига оставалось на прежнем уровне. Эндокринная активность клеток Лейдига возрастала Интенсивность процессов репаративной регенерации, не усиливались. Так, степень зрелости сперматогенного пласта (хотя и была снижена по сравнению с контролем), но не уменьшалась по сравнению с предшествующим сроком исследования, не возрастало также и количество клеток Сертоли. Отсутствие положительной динамики в течение регенераторных процессов, очевидно, связано с низким количеством коммитированных колониеобразующих клеток сперматогенной ткани.
У животных, получавших терапию Треамидом на 65 сутки исследования, численность клеточной популяции сперматогоний не возрастала по сравнению с контролем, но продуктивность сперматогенеза, судя по ОКС, увеличивалась (на 43%) (табл. 21). Возрастал также (на 32%) и процент подвижных форм спермиев. Этот показатель статистически значимо не отличался от фоновых значений. Количество клеток Лейдига находилось на уровне контрольных значений. Эндокринная активность клеток Лейдига нормализовалась и достигала контрольных значений. При оценке степени выраженности процессов репаративной регенерации ткани было установлено, что количество клеток Сертоли возрастало, а степень зрелости сперматогенного пласта снижалась. Степень зрелости сперматогенного пласта, напротив, достоверно снижалась. Эти данные, совместно с данными о возрастании количества клеток- предшественников сперматогенеза свидетельствуют о том, что введение Треамида крысам, получавшим Паклитаксел, стимулировало процессы репаративной регенерации сперматогенной ткани. Тестикулярная недостаточность, судя по проценту подвижных форм, проявлялась в меньшей степени. Следует отметить, что отсутствие положительного влияния на численности клеточной популяции сперматогоний, несмотря на увеличение количества клеток-предшественников сперматогенеза и усиление гуморальной регуляции их жизнедеятельности, очевидно, свидетельствует о том, что для проявления эффекта на клетки- предшественники необходим более длительный промежуток времени. С этой целью было исследовано морфологическое и функциональное состояние сперматогенной ткани на 90-й день опыта.
При изучении морфологического и функционального состояния сперматогенной ткани на 90-й день опыта было установлено, что численность клеточной популяции сперматогоний, ОКС, процент подвижных форм у крыс, получавших один Паклитаксел, были сниженными по сравнению с контролем и не возрастали по сравнению с предшествующими сроками исследования (табл.22). Эти данные свидетельствуют о сохранении тестикулярной недостаточности, обусловленной истощением источников пролиферативного пула сперматогенеза. Количество клеток Лейдига достоверно снижалось, но их эндокринная активность возрастала. Количество клеток Сертоли (табл.22) не увеличивалось и было сниженным по сравнению с контролем. Однако, судя по степени зрелости сперматогенного пласта (этот показатель снижен на 10% от фона, табл.22), можно говорить о некоторой активности процессов репаративной регенерации ткани, но интенсивность их является явно недостаточной для восстановления исходного количества клеток-предшественников и всего процесса сперматогенеза в целом.
Таблица 22
Оценка состояния сперматогенеза крыс через 90 дней после введения Паюнггаксела
Figure imgf000064_0001
Примечание * - различия достоверны по сравнению с фоном.
В группе животных, получавших терапию Треамидом, количество сперматогоний оказалось статистически повышенным по сравнению с контролем, что является, очевидно, результатом, отмеченного ранее, увеличения количества источников пролиферативного пула сперматогенеза и усиления гуморальных факторов, стимулирующих их пролиферацию. Продуктивность сперматогенеза, судя по ОКС, возрастала (на 46%) по сравнению с контролем и достигала фоновых значений. Увеличилась и функциональная активность спермиев (число подвижных спермиев достоверно превышало контрольные значения). Эти данные свидетельствуют об эффективности проводимого лечения. Количество клеток Лейдига было сходно с контрольными значениями. Их эндокринная активность нормализовалась. Интенсивность процессов репаративной регенерации ткани, судя по степени зрелости сперматогенного пласта и количеству клеток Сертоли, статистически значимо увеличивалась по сравнению с контролем. Это свидетельствует о том, что регенерационные возможности ткани на фоне введения лекарственного средства остаются на высоком уровне и еще до конца не исчерпаны.
Представленные данные свидетельствуют о том, что Треамид позволяет эффективно стимулировать репаративную регенерацию тестикулярной ткани, угнетение которой было обусловлено снижением количества коммитированных колониеобразующих клеток. Эффективность Треамида подтверждается данными морфологического анализа тестикулярной ткани.
Пример 8.
Исследование влияния Треамида на регенерацию клеток поджелудочной железы на модели стрептозотоцин-индуцированного поражения поджелудочной железы.
Исследование проводили на мышах-самцах линии C57BL/6 в возрасте 4 недель. Поражение поджелудочной железы индуцировали внутрибрюшинным введением стрептозотоцина в дозе 40 мг/кг в 0,25 мл фосфатного буфера ежедневно в течение 5 -и дней [Szkudelski Т. The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in В Cells of the Rat Pancreas// Physiological Research. - 2001. - Vol. 50. - P. 536-546]. Треамид в дозе 1 мг/кг вводили ежедневно внутрижелудочно один раз в день на 7-20е сутки исследования.
На 0, 6, 10, 13, 16, 19, 21, 24 и 28 сутки исследования проводили оценку уровня глюкозы в крови. Уровень глюкозы в крови определяли после 4-х часовой депривации корма при помощи глюкометра (глюкометр SencoCard, «77 Электроника Кфт», Венгрия).
На 28-е сутки исследования животных эвтаназировали в С02-камере, проводили морфологическое исследование поджелудочной железы и иммуноферментный анализ на общий коллаген и коллаген типа I в гомогенате поджелудочной железы.
Для морфологического исследования часть поджелудочной железы, прилежащую к селезенке, фиксировали в 10% формалине, заливали в парафин. Депарафинированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. На срезах определяли площадь 10 последовательных островков Лангерганса методом графического компьютерного анализа и подсчитывали в них общее количество клеток и количество пикнотизированных клеток. Затем вычисляли количество клеток на единицу площади островка и процент пикнотизированных клеток.
Для выявления клеток воспаления (нейтрофилы, лимфоциты, макрофаги) в ткани поджелудочной железы и их состава использовали окрашивание гистологических срезов гематоксилин-эозином и азур-эозином.
Уровень мышиного коллагена типа I в гомогенате легких определяли методом иммуноферментного твердофазного анализа с использованием коммерческого набора (Cusabio Biotech CO., LTD, Китай). Гомогенат ткани легких готовили согласно протоколу производителя Cusabio Biotech CO., LTD (Китай).
Уровень общего коллагена в гомогенате легких определяли с использованием набора для определения коллагена путем связывания его с красителем и обработки кислотой и раствором пепсина SIRCOL Collagen Assay (Biocolor Ltd, Великобритания) в соответствии с инструкцией производителя. Гомогенат ткани легких готовили согласно протоколу производителя тест- системы. Результаты проведенного исследования представлены в таблицах 23-25.
Таблица 23
Влияние ХС-268-БГ на уровень глюкозы в крови (мМоль/л) у мышей линии
C57BL/6 в условиях введения стрептозотоцина (М±щ)
Figure imgf000067_0001
Примечание.* - достоверность различия (Р < 0,05) с исходным уровнем, • - достоверность различия (Р < 0,05) с патологическим контролем.
Таблица 24
Влияние Треамида на общее количество клеток, площадь островка Лангерганса и количество пикнотизированных клеток в островке Лангерганса у мышей линии С57В1/6 в условиях введения стрептозотоцина на 28-е сутки исследования (М± т)
Figure imgf000067_0002
римечание: * - достоверность различия (Р < 0,05) с интактным контролем, - достоверность различия (Р < 0,05) с патологическим контролем. Таблица 25
Влияние Треамида на содержание общего коллагена и коллагена типа I в поджелудочной железе у мышей линии C57BL/6 в условиях повреждения поджелудочной железы на 28-е сутки исследования (М± т)
Figure imgf000068_0001
Примечание: * - достоверность различия (Р < 0,05) с интактным контролем, • -достоверность различия (Р < 0,05) с патологическим контролем.
Курсовое введение стрептозотоцина мышам в значительной степени повысило уровень глюкозы в крови животных на протяжении всего периода наблюдения (6, 10, 13, 16, 19, 21, 24, 28-е сутки после последнего введения стрептозотоцина) (Таблица 23). Морфологические исследования позволили установить, что в сроки пика гипергликемии (21, 28-е сутки) в ткани поджелудочной железы отмечались отек и гиперемия, регистрировалась инфильтрация поджелудочной железы нейтрофилами, макрофагами и лимфоцитами. Кроме этого, начиная с 6-х суток после последнего введения стрептозотоцина, у мышей опытной группы наблюдалось нарастающее снижение площади островковой ткани по сравнению с интактным контролем. На 28-е сутки падение показателя было наиболее выраженным: общая клеточность островка была снижена более чем на 50% по сравнению с интактными мышами, процент пикнотизированных клеток, напротив, значительно возрастал (в 2,3 раза), в травмированных островках появлялись фибробласты, что свидетельствовало о развитии склероза инсулярного аппарата (таблица 24). Методом иммуноферментого анализа гомогенатов поджелудочной железы у группы патологического контроля выявлено повышение уровней коллагена типа I и общего коллагена по сравнению с интактными животными контролем на 28-е сутки исследования (таблица 25).
Введение Треамида в дозе 1 мг/кг достоверно снижало уровень глюкозы в крови у мышей в условиях введения Стрептозотоцина на 13, 21, 24-е сутки исследования (таблица 1). Морфологическое исследование поджелудочной железы, проведенное на 28-е сутки исследование показало, что Треамид снизил число пикнотизированных панкреатоцитов в островках Лангерганса больных животных, увеличил площадь и клеточность островковой ткани (таблица 24), снижал концентрацию общего коллагена и коллагена типа I в поджелудочной железе у экспериментальных животных по отношению к патологическому контролю (таблица 25).
Полученные результаты позволяют заключить, что на модели стрептозотоцин-индуцированного поражения поджелудочной железы Треамид оказывает регенеративное действие в отношении ткани поджелудочной железы. В результате восстанавливается количество клеток в островках Лангерганса, увеличивается площадь островковой ткани, нормализуется количество пикнотизированных клеток в островке Лангерганса, происходит снижение фибротических изменений в ткани поджелудочной железы, как следствие снижается уровень глюкозы в крови. Треамид может применяться при лечении нарушения толерантности к глюкозе.
Пример 9. Исследование влияния Треамида на регенерацию клеток поджелудочной железы и восстановление функции тестикулярной ткани у самцов мышей на модели метаболического синдрома.
Метаболические нарушения моделировали следующим образом: на 2 день после рождения самцам мышей линии С57В1/6 вводили стрептозотоцин в дозе 200 мг/кг, однократно, подкожно в область холки, объем вводимого раствора 30 мкл. С 4-недели после рождения, животных переводили на рацион с высоким содержанием жира. Для этого использовали корм, обогащенный тяжелыми насыщенными жирами (30% жира) (Siff EF R/M with 30% Fat кат. N° Е15116-34, Germany). Продолжительность назначения корма с высоким содержанием жира составила 42 суток (с 28-х по 70-е сутки эксперимента). Треамид вводили в дозе 10 мг/кг внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки с 49-х по 70-е сутки эксперимента. Контрольные животные вместо исследуемого вещества получали растворитель в эквивалентном объеме.
На 28, 35, 42, 49, 56, 63 и 70 сутки эксперимента проводили оценку уровня глюкозы в крови. Уровень глюкозы в крови определяли при помощи глюкометра (Accu-Chek Performs Nanu ("Roche Diagnostes GmbH", Germany). Измерение исходного уровня глюкозы в крови у животных проводили после 16-часовой депривации корма, все последующие измерения уровня глюкозы также производили после 16-часовой депривации еды.
На 70-е сутки исследования животных эвтаназировали в С02-камере. Затем исследовали уровень свободного тестостерона в сыворотке, проводили морфологическое исследование поджелудочной железы.
Уровень свободного тестостерона в сыворотке оценивали иммуноферментным анализом в соответствии с протоколом производителя тест- систем.
Для морфологического исследования часть поджелудочной железы, прилежащую к селезенке, фиксировали в 10% формалине, заливали в парафин по стандартной методике.
Депарафинированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. На срезах определяли площадь 10 последовательных островков Лангерганса методом графического компьютерного анализа и подсчитывали в них общее количество клеток и количество пикнотизированных клеток. Затем вычисляли количество клеток на единицу площади островка и процент пикнотизированных клеток. Для выявления клеток воспаления (нейтрофилы, лимфоциты, макрофаги) в ткани поджелудочной железы и их состава использовали окрашивание гистологических срезов гематоксилин-эозином.
Результаты проведенного исследования показали, что моделирование метаболического синдрома вызывало отек и гиперемию в ткани поджелудочной железы у мышей самцов линии С 57В 1/6 на 70 сутки эксперимента (Фиг. 1). Кроме этого, у мышей в модельных условиях регистрировалась мелко и средне- капельная жировая дистрофия ацинарных клеток, утолщение и разрастание междольковых перегородок, инфильтрация островковой ткани клетками воспаления, отмечалось уменьшение общего количества островков Лангерганса, снижение их площади и клеточности. в сравнении с таковыми животных интактного контроля, между тем, процент пикнотизированных клеток в островках возрастал (Фиг. 2, таблица 26).
Внутрижелудочное введение Треамида в дозе 10 мг/кг с 49 по 70 сутки исследования препятствовало разрушению поджелудочной железы у мышей в условиях моделирования метаболических нарушений. Треамид увеличивал количество островков Лангерганса в поджелудочной железе и их клеточность, препятствовал развитию жировой дистрофии ацинарных клеток и значительно уменьшал количество пикнотизированных клеток в островках Лангерганса у мышей в условиях метаболических нарушений. Кроме этого, Треамид снижал интенсивность отека и инфильтрацию островковой ткани клетками воспаления (Фигуры 1 и 2, таблица 26).
Таблица 26
Морфология поджелудочной железы мышей на 70е сутки моделирования метаболических нарушений (М ±т)
Figure imgf000071_0001
Примечания:
1 - * -различия достоверны по сравнению с фоном (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни),
2 - ·- различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни).
Результаты исследования глюкозы в сыворотке крови мышей показали, что моделирование метаболических нарушений приводило к стойкому увеличению уровня глюкозы в крови у мышей самцов линии C57BL/6, начиная с 42 суток эксперимента. Высокий уровень глюкозы сохранялся до 70 суток. Максимальные значения показателя были выявлены на 63 сутки эксперимента и превысили исходный уровень в 3,8 раза, на 70 сутки - в 4,2 раза (Таблица 27).
Внутрижелудочное введение Треамида в дозе 10 мг/кг с 49 по 70 сутки эксперимента снижало уровень глюкозы в крови мышей на 56 и 63 сутки эксперимента (Таблица 27).
Таким образом, курсовое введение Треамида в дозе 10 мг/кг вызывало гипогликемическое действие у мышей самцов линии C57BL/6 в условиях моделирования метаболических нарушений.
Таблица 27 Концентрация глюкозы (ммоль/л) в сыворотке крови мышей в условиях моделирования метаболических нарушений и применения Треамида в дозе 10 мг/кг (М ±щ)
Figure imgf000072_0001
Примечания:
1 - * -различия достоверны по сравнению с фоном (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни),
2 - ·- различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни).
Результаты исследования свободного тестостерона в сыворотке крови мышей показали снижение (в 1.6 раза) гормона у самцов группы патологического контроля в сравнении с интактными животными. Полученные данные говорят о сформированном на фоне метаболических нарушений гипогонадизме у самцов лабораторных животных, который во многом соответствует клинической картине гипогонадизма у людей.
Курсовое введение Треамида в дозе 10 мг/кг восстановило концентрацию свободного тестостерона в крови мышей с экспериментальным гипогонадизмом до уровня интактных животных (Таблица 28). Таким образом, исследуемая фармацевтическая субстанция предотвратила развитие гормональных нарушений, которые были индуцированы метаболическими нарушениями.
Таблица 28
Уровень свободного тестостерона в сыворотке крови мышей на 70е сутки моделирования метаболических нарушений (М ±т)
Figure imgf000073_0001
Примечания:
1 - * -различия достоверны по сравнению с фоном (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни),
2 - ·- различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни).
Полученные результаты позволяют заключить, что на модели метаболического синдрома у самцов мышей Треамид оказывает регенеративное действие в отношении ткани поджелудочной железы. В результате восстанавливается количество клеток в островках Лангерганса, увеличивается площадь островковой ткани, нормализуется количество пикнотизированных клеток в островке Лангерганса, происходит снижение фибротических изменений в ткани поджелудочной железы, как следствие снижается уровень глюкозы в крови. Также Треамид восстанавливает функцию тестикулярной ткани, предотвращая развитие гипогонадизма. Таким образом, Треамид может применяться при лечении метаболического синдрома и гипогонадизма. Пример 10. Исследование влияния Треамида на регенерацию клеток поджелудочной железы и восстановление функции тестикулярной ткани у самцов крыс на модели метаболического синдрома.
Метаболический синдром моделировали у самцов крыс линии Вистар (260- 280 г) путем содержания животных на рационе высокожировой диеты («диеты кафетерия») в течение 12-и недель. «Диета кафетерия» сбалансирована в соответствии с Current Protocols in Pharmacology [Current Protocols in Pharmacology (2005) Animal Models of Disease//Contributed by Petter Hedlund, Kenshi Matsumoto, and Karl-Erik Andersson]. Диета содержала 25-35% жиров и 25- 30% легкоусвояемых углеводов в дополнение к стандартному рациону грызунов. Треамид вводили в дозе 0,5 мг/кг внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки на 7-11-й неделях диеты. Препарат сравнения Метформин вводили в дозе 200 мг/кг внутрижелудочно в том же режиме.
Оценку развития патологии и терапевтического действия Треамида проводили по следующим показателям: биохимические показатели крови (уровень глюкозы, холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ), ЛПВП, ЛПНП, индекс атерогенности), глюкозотолерантный тест, масса висцерального жира, общее количество и процент подвижных форм сперматозоидов.
Определение глюкозы проводили при помощи глюкометра «OneNouch Select» (Щвейцария).
Уровень триглицеридов, ОХС и ЛПВП определяли с помощью диагностического набора (Ольвекс диагностикум, Россия).
Уровень ЛПНП определялся по формуле 2.
ЛПНП=OХС - (ЛПВП + ТГ/2.2) (1),
где ЛПНП - холестерин липопротеинов низкой плотности;
ЛПВП - холестерин липопротеинов высокой плотности;
ОХС - общий холестерин;
ТГ - триглицериды.
Коэффициент атерогенности (КА) рассчитывали по формуле 3.
КА = (ОХС - ЛПВП)/ ЛПВП (2),
где КА - коэффициент атерогенности;
ЛПВП - холестерин липопротеинов высокой плотности. Индекс атерогенности рассчитывали для каждого животного индивидуально, затем считали среднее арифметическое значение по группе.
Для проведения анализа спермы животных наркотизировали внутрибрюшинным введение смеси Золетила и Ксилы (0,2 мл Золетила + 0,8 мл Ксилы) в объеме 70 мкл/100 г массы. Выделяли эпидидимис. Головку эпидидимиса отрезали от хвоста, взвешивали, делали 5 надрезов (для улучшения выхода спермы) и помещали в пробирку, содержащего 10 мл фосфатно-солевого буфера, подогретого до 37 °С. В течение 10 минут пробирку выдерживали при 37 °С. Далее пробирку встряхивали на шейкере, отбирали 20 мкл жидкости, наносили на подогретое до 37 °С предметное стекло и под микроскопом оценивали количество подвижных сперматозоидов. Подсчет вели до 100 сперматозоидов.
Для оценки общего количества сперматозоидов из пробирки с эпидидимисом брали 20 мкл жидкости после встряхивания и вносили в пробирку, содержащую 400 мкл физ. раствора. После встряхивания пробирки отбирали содержимое (20 мкл) и вносили в камеру Горяева. Считали количество сперматозоидов в 100 больших квадратах. Количество сперматозоидов в головке эпидидимиса рассчитывали по формуле:
Количество сперматозоидов = количество сперматозоидов в 100 больших квадратах камеры Горяева * 0,525 (коэффициент из расчета разведения и объема камеры Горяева)/масса головки эпидидимиса.
Результаты проведенного исследования представлены в таблицах 29-32. Измерение массы висцерального жира у экспериментальных животных показало, что на фоне высокожировой диеты висцеральный жир около почек, кишечника и семенников нарастает равномерно: в 1.7, 1.5 и 2.0 раза, соответственно (таблица 29). Общая масса висцерального жира в группе контроля увеличилась примерно в 1,7 раза по сравнению с интактными животными. Полученные результаты дали основание заключить, что у экспериментальных животных, содержащихся на рационе высокожировой диеты, развилось абдоминальное ожирение - один из признаков метаболического синдрома. Введение Треамида (в дозе 0,5 мг/кг) самцам крыс снизило прирост массы висцерального жира в 1,3 раза по сравнению с группой контроля. Метформин оказал сходный эффект (Таблица 29).
Таблица 29 Относительная масса висцерального жира, % к массе тела (М±щ, п=8)
Figure imgf000076_0001
Примечание -
^-различия статистически значимы по сравнению с интактными (р<0,05); &- различия статистически значимы по сравнению с группой контроля
(Р<0,05)
Результаты измерения уровня глюкозы (натощак) в цельной крови крыс приведены в таблице 30. Первое измерение проводилось до введения препаратов животным на сроке 6 недель исследования. Из таблицы 30 видно, что у интактных крыс, содержащихся на стандартном рационе питания, уровень глюкозы на сроке 6 недель диеты составил 3,9±0,3 ммоль/л, на сроке 12 недель диеты - 6,8±0,93 ммоль/л. В свою очередь, у крыс, содержащихся на высокожировой диете, уровень глюкозы на сроке 6 недель диеты составил 6,7±0,3 ммоль/л, на сроке 12 недель диеты - 11,6±0,9 ммоль/л. Таким образом, у животных, получавших высокожировую диету, наблюдалась выраженная гипергликемия, которая является еще одним признаком метаболического синдрома.
Внутрижелудочное введение Треамида экспериментальным животным, начиная с 7-й недели высокожировой диеты, сдерживало увеличение уровня глюкозы в крови. Треамид проявил эффект через 3 недели терапии и сохранил его до конца исследования (Таблица 30). Таблица 30
Динамика уровня глюкозы в крови крыс-самцов, ммоль/л
Figure imgf000077_0002
имечания:
* -различия статистически значимы по сравнению с интактными
(р<0,05);
2 - &- различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (Р<0,05).
Для оценки влияния Треамида на липидный обмен были измерены ОХС, ТГ,
Figure imgf000077_0001
индекс атерогенности на 12ой неделе исследования.
Применение рациона «диеты кафетерия» у животных приводило к выраженному статистически значимому увеличению уровня общего ХС, ТГ, JillHll и снижению уровня ЛПВП по отношению к интактным животным (таблица 31). Расчётный показатель - индекс атерогенности у животных группы контроля был в 4,2 раза выше, чем у интактных животных. Внутрижелудочное введение Треамида повысило уровень ЛПВП с 1,5±0,2 до 1,9±0,2 и снизило индекс атерогенности с 2, 1±0,4 до 0,9±0,2. Это дает основание заключить, что при длительном применении Треамид оказывает антиатерогенное действие (таблица 31). Таблица 31
Липидный спектр крови самцов крыс, содержавшихся на высокожировой диете в
Figure imgf000078_0001
Примечание - *-различия статистически значимы по сравнению с интактными (р<0,05);
&- различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (Р<0,05)
Из таблицы 31 видно, что в группе, получавшей «диету кафетерия», общее количество сперматозоидов и процент подвижных форм сперматозоидов были в 2 раза ниже, чем у животных, содержащихся на стандартном рационе. Это согласуется с клиническими данными о снижении качества спермы у мужчин, страдающих метаболическими расстройствами. Внутрижелудочное введение Треамида увеличило в 1,7 раза общее количество сперматозоидов и в 1,5 раза процент подвижных форм сперматозоидов, доведя эти показатели до уровня интактных. Таким образом, можно заключить, что Треамид оказывает терапевтическое действие не только в отношении основных признаков метаболического синдрома, но и восстанавливает снизившееся на фоне патологии качество спермы.
Терапия Метформином также в 1,8 раза увеличила общее количество сперматозоидов, но в отличие от Треамида не повлияла на процент подвижных форм сперматозоидов (Таблица 32). Таблица 32
Общее количество сперматозоидов и процент подвижных форм сперматозоидов у самцов крыс на модели метаболического синдрома, индуцированного
высокожировой диетой (М±щ, п=8)
Figure imgf000079_0001
Примечание -
^-различия статистически значимы по сравнению с интактными (р<0,05); &- различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (Р<0,05)
Таким образом, на модели метаболического синдрома у самцов крыс Треамид снизил повышение уровня глюкозы в крови, снизил индекс атерогенности, снизил увеличенное на фоне патологии количество висцерального жира и восстановил сниженное вследствие эндокринных нарушений общее количество сперматозоидов и процент их подвижных форм. Это подтверждает способность Треамида восстанавливать функцию поджелудочной железы и тестикулярной ткани. Треамид рекомендуется применять при метаболическом синдроме и сниженной функции тестикулярной ткани.
Пример 11. Исследование влияния Треамида на фертильность самцов мышей на модели метаболического синдрома.
Метаболические нарушения моделировали следующим образом: на 2 день после рождения самцам мышей линии С57В1/6 вводили стрептозотоцин в дозе 200 мг/кг, однократно, подкожно в область холки, объем вводимого раствора 30 мкл. С 4-недели после рождения, животных переводили на рацион с высоким содержанием жира. Для этого использовали корм, обогащенный тяжелыми насыщенными жирами (30% жира) (Siff EF R/M with 30% Fat кат. N° Е15116-34, Германия). Продолжительность содержания животных на высокожировой диете составила 42 суток (с 28-х по 70-е сутки исследования). Треамид вводили в дозе 10 мг/кг внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки с 49-х по 80-е сутки эксперимента. Контрольные животные вместо исследуемого вещества получали растворитель в эквивалентном объеме.
Для оценки фертильности к самцам экспериментальных групп подсаживали интактных самок в соотношении 1 :2 на период с 70х по 80е сутки исследования. В этот период самцам опытной группы продолжали вводить внутрижелудочно один раз в сутки Треамид в дозе 10 мг/кг.
По окончании срока спаривания на 80-е стуки исследования самцов эвтаназировали в С02-камере. У животных отбирали кровь и в сыворотке методом иммуноферментного анализа определяли уровень свободного тестостерона. Эвтаназия проводилась в утренние часы с 9:30 до 11 :00.
Самок умерщвляли в С02-камере на 18 день беременности. Исследовали плоды в матке. Для оценки плодовитости вычисляли индекс плодовитости (ИП):
ИП = число оплодотворенных самок/число самок, ссаженных с самцами х 100%.
Результаты исследования свободного тестостерона в сыворотке крови у мышей самцов линии С57В1/6 после моделирования метаболических нарушений и применения Треамида в дозе 10 мг/кг представлены на 80 сутки эксперимента в таблице 33. Моделирование метаболических нарушений вызывало снижение концентрации свободного тестостерона в сыворотке крови на 80 сутки эксперимента в 1.8 раз по сравнению с группой интактных животных (таблица 33).
Курсовое введение Тремида в дозе 10 мг/кг повышало уровень свободного тестостерона в сыворотке крови мышей с метаболическими нарушениями в 2 раза по сравнению с патологическим контролем и на 16% по сравнению с интактными животными.
Таким образом, Треамид в дозе 10 мг/кг восстанавливал уровень свободного тестостерона в сыворотке крови у мышей с метаболическими нарушениями. Таблица 33
Содержание свободного тестостерона в сыворотке крови мышей с гипогонадизмом, вызванным метаболическими нарушениями (М ±m, п
Figure imgf000081_0001
Примечания:
1 - * -различия достоверны по сравнению с фоном (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни),
2 - ·- различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05, U-критерий Манна- Уитни).
Результаты исследования фертильности мышей на 70-80 сутки после моделирования метаболических нарушений и применения Треамида в дозе 10 мг/кг представлены в таблице 34.
Установлено, что индекс плодовитости самцов с метаболическими нарушениями на 70-80 сутки исследования был снижен в 2,8 раза по сравнению с интактным контролем. У самцов с метаболическими нарушениями, получавших Треамид в дозе 10 мг/кг с 49-80 сутки, индекс плодовитости был в 1,8 раза выше, чем у самцов с метаболическими нарушениями, не получавшими лечения (патологический контроль) (Таблица 34).
Таблица 34
Индекс плодовитости мышей-самцов в условиях моделирования метаболических нарушений и применения Треамида в дозе 10 мг/кг (п=20)
Figure imgf000081_0002
Примечания:
* - различия достоверны по сравнению с фоном (р<0,05, по Фишеру);
• - различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05, по Фишеру).
Таким образом, на модели метаболического синдрома Треамид эффективно восстановил функцию тестикулярной ткани самцов мышей, что привело к повышению фертильности животных. Треамид рекомендуется применять при лечении метаболического синдрома, гипогонадизма и мужского бесплодия.
Пример 12. Исследование влияния Треамида на восстановление ткани печени на модели хронического токсического гепатита.
Хронический токсический гепатит вызывали у мышей-самцов линии
CBA/CaLac внутрижелудочным введением 20% раствора тетрахлоруглерода (СС14) на оливковом масле в объеме 0,2 мл/мышь на 0, 3, 7, 10, 14 и 17 сутки исследования. Треамид вводили в дозе 10 мг/кг ежедневно внутрижелудочно один раз в сутки с 14 по 27 день исследования. На 28 сутки исследование животных эвтаназировали в С02-камере и забирали биоптат печени на гистологический анализ.
Для гистологических исследований печень фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и затем заливали в парафин по стандартной методике. Депарафинизированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали: 1) гематоксилином и эозином по стандартной методике для рутинного гистологического исследования; 2) пикрофуксином для определения площади соединительной ткани, с помощью средств компьютерной обработки графических данных.
Результаты исследования показали, что через 2 недели после последнего введения СС14 в печени мышей выявляются морфологические изменения, характерные для токсического гепатита. Так, на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, отмечалась мелко и среднекапельная жировая дистрофия, моноцеллюлярные и мостовидные некрозы гепатоцитов, а также развитие инфильтрации клетками воспаления (преимущественно макрофагами и лимфоцитами) печеночной паренхимы разной степени выраженности (Фиг. 3). Кроме этого, наблюдалось нарушение балочного строения печени вследствие отека и венозное полнокровие. Последнее указывает на гемодинамические нарушения в печени у мышей в условиях курсового введения ССl4. Окрашивание пикрофуксином препаратов печени позволило выявить у животных с индуцированным токсическим гепатитом увеличение содержания соединительной ткани в перипортальных зонах и разрастание коллагена из портальных пространств в виде септ (Фиг. 3).
Внутрижелудочное введение Треамида животным в дозе 10 мг/кг существенно снижало выраженность инфильтрации клетками воспаления больной печени, уменьшало количество моноцеллюлярных некрозов и интенсивность жировой дистрофии, выраженно уменьшало содержание соединительной ткани в печени больных животных по сравнению с патологическим контролем. Гистологическая картина печени леченных животных на 28 сутки эксперимента не отличалось от таковой интактного контроля (Фиг. 3).
Таким образом, на модели хронического токсического гепатита Треамид оказывал регенеративное действие в отношении ткани печени: снижал фиброз, снижал интенсивность жировой дистрофии, препятствовал развитию некроза. Это позволяет заключить, что Треамид может применяться в качестве препарата, восстанавливающего структурные и функциональные характеристики ткани печени.
Пример 13. Исследование влияния Треамида на восстановление ткани легкого на модели эмфиземы легкого.
Эмфизему легких вызывали у мышей-самок линии С57В1/6 однократным интратрахеальным введением эластазы (Sigma, США) в дозе 0,6 Е/мышь в 30 мкл NaCl 0,9% [Liithje L., Raupach Т., Michels H. et al. // Respiratory Research 2009, 10:7]. День операции приняли за 0 день эксперимента. Треамид вводили в дозе 10 мг/кг ежедневно внутрижелудочно один раз в сутки с 7 по 60 сутки исследования. На 7, 14, 30 и 60 сутки исследования животных эвтаназировали в С02-камере и выделяли легкие.
Для оценки динамики и выраженности развития эмфиземы в ткани легких изготавливались гистологические препараты. Для этого легкие фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и затем заливали в парафин по стандартной методике. Из депарафинизированных срезов получали препараты верхушки легкого, среднего легочного поля и нижнего легочного поля толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Далее делались фотографии верхушки легкого, среднего легочного поля и нижнего легочного поля, исследовали локализацию и площадь эмфиземы с помощью средств компьютерной обработки графических данных. В качестве оценочного показателя развития эмфиземы измерялась площадь эмфизематозно-расширенной ткани легких (% от нормальной ткани), из расчетов исключались сосуды и бронхи [ArrateMunoz-Barrutia, Mario Ceresa, Xabier Artaechevarria, Luis M.Montuenga, and Carlos Ortiz-de-Solorzano. Quantification of Lung Damage in an Elastase-Induced Mouse Model of Emphysema// International Journal of Biomedical Imaging. Volume 2012, Article ID 734734, 11 pages; Susumu Sato, Erzsebet Bartolak-Suki, Harikrishnan Parameswaran, Hiroshi Hamakawal and Bela Suki. Scale dependence of structure- function relationship in the emphysematous mouse lung//Front. Physiol. 6: 146. doi: 10.3389/fphys.2015.00146].
В ходе проведенных экспериментов выявлено, что эластаза истончала стенки альвеол и бронхиол, значительно увеличивала площадь просвета, вызывала разрывы альвеолярных стенок на 7-е сутки (таблица 13). Слизистая оболочка бронхов и бронхиол имела фестончатые очертания и была выстлана цилиндрическим и кубическим (в бронхиолах) эпителием респираторного типа, имели место умеренные десквамативные изменения. Дополнительно на гистологических препаратах легких обнаруживали умеренную гиперемию капилляров межальвеолярных перегородок и нарушение микроциркуляции: отмечалось умеренно выраженное полнокровие сосудов микроциркулярного русла, капилляров межальвеолярных перегородок в легких.
Таблица 35
Площадь эмфезаматозно-расширенной ткани легких (% от нормальной) у мышей-самок линии С57В1/6 в условиях интратрахеального введения эластазы
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000085_0001
Примечания:
* - достоверность различия с интактным контролем ( Р<0,05 );
• - достоверность различия с патологическим контролем (эмфизема легкого) ( Р<0,05 ).
Значительная часть ткани эластазных легких была занята эмфизематозно- расширенными альвеолами с разрушенными межальвеолярными перегородками. Площадь эмфезаматозно-расширенной ткани в нижнем легочном поле достигала 43% от площади нормальных легких, в среднем легочном поле - 6,5%, в верхушке легкого - 1,3% . Как видно эмфизема локализовалась преимущественно в нижнем легочном поле. Наряду с растяжением альвеол наблюдались разрывы альвеолярных перегородок. Эмфизематозно расширенные альвеолы вызывали сдавление неизменённых альвеол, вследствие чего в легких развивались очаговые ателектазы. В эластазных легких площадь соединительной ткани уменьшалась более чем в 3 раза (Р<0,05) по сравнению с интактным контролем на 7-е сутки. Дополнительно было отмечено, что эластаза приводила к утолщению стенок альвеол за счет лимфо-макрофагальной инфильтрации и воспалительная инфильтрация интерстициальной ткани. Просвет отдельных альвеол также был заполнен макрофагами и лимфоцитами (таблица 35).
К 14-м суткам происходило прогрессирование эмфиземы: отмечается увеличение площади эмфизематозно расширенных альвеол в среднем и нижнем легочном поле до 34,1% и 53,6% соответственно, и истончение их стенок (Фиг. 4, таблица 35,). Это приводило к истончению альвеолярных капилляров и их запустеванию. К 30-м суткам наблюдения % эмфизематозно расширенной ткани в верхушке легкого и в нижнем легочном поле увеличивался. На 60-е сутки величина показателя была незначительно ниже по сравнению с 30-и сутками.
Введение Треамида мышам вызывало снижение интенсивности воспалительной инфильтрации паренхимы легких на протяжении всего периода наблюдения. Препарат уменьшал площадь эмфизематозно-расширенных альвеол в верхушке легкого (7, 14, 30, 60 сутки) и в нижнем легочное поле (14, 30, 60 сутки) по сравнению с группой патологического контроля (Фиг. 4, таблица 35,).
Таким образом, на модели эластаза-индуцированной эмфиземы легкого пероральное применение Треамида оказывало регенеративное действие в отношении ткани легких: отмечалось уменьшение площади эмфезаматозно- расширенной ткани легких. Это позволяет заключить, что Треамид может применяться в качестве препарата, восстанавливающего структурные и функциональные характеристики легких.
Пример 14. Исследование влияния Треамида на развитие лёгочного фиброза.
Токсическое повреждение альвеолярного эпителия легких, вызывающее лёгочный фиброз, моделировали интратрахеальным введением цитостатика блеомицина однократно в дозе 80 мкг/мышь в 30 мкл физиологического раствора. Для анестезии во время операции использовали ингаляционный эфирный наркоз. Операционное поле дезинфицировали 70% раствором этанола и освобождали от волосяного покрова. По средней линии шеи рассекали кожу, подкожную клетчатку и собственную фасцию шеи. Методом тупого раздвижения тканей раздвигали мышцы на вентральной стороне трахеи. По ходу тока воздуха на вдохе производили инъекцию блеомицина с помощью шприца Гамильтона. После ушивания раны операционное поле обрабатывали антисептиком. Введение блеомицина принимали за 0 день эксперимента.
Эффективность действия Треамида и воспроизведения лёгочного фиброза оценивали по количеству и интенсивности синтеза соединительной ткани в легких, а так же по гисто-архитектонике легких.
В ходе проведенных экспериментов выявлено, что изменения морфологической картины легких мышей-самцов линии C57BL/6 после однократного интратрахеального введения блеомицина были подобны изменениям, характерным для фиброза легких. Так, окрашивание гистологических препаратов легких мышей линии C57BL/6 пикрофуксином по Ван-Гизону и последующая визуализация соединительной ткани позволили обнаружить значительное разрастание соединительной ткани в основном вокруг сосудов и бронхиол (Фиг. 5; таблица 36). Дополнительно иммуноферментным анализом были исследованы гомогенаты легких животных интактного контроля и патологического контроля. Как видно из таблицы 37, интратрахеальное введение блеомицина достоверно повышало уровни коллагена типа I, общего коллагена и гидроксипролина.
Таблица 36
Содержание соединительной ткани (%) в легких у мышей линии С57В1/6 в условиях лёгочного фиброза на 21-е сутки
опыта (М ± т, п=10).
Figure imgf000087_0001
Примечания:
* - достоверность различия с интактным контролем ( Р<0,05); · - достоверность различия с патологическим контролем
(лёгочный фиброз) ( Р<0,05 ). Таблица 37
Уровень общего коллагена, коллагена типа I и гидроксипролина в гомогенате легких у мышей линии C57BL/6 в условиях лёгочного фиброза на 21-е сутки опыта (М ± т, п=10).
Figure imgf000088_0001
Примечания:
* - достоверность различия с интактным контролем ( Р<0,05 );
• - достоверность различия с патологическим контролем (лёгочный фиброз) ( Р<0,05 ).
Треамид в дозе 10 мг/кг был эффективен в лечении лёгочного фиброза: количество депонированных коллагеновых волокон вокруг сосудов и бронхиол снижалось до уровня интактного контроля (Фиг. 5, таблица 37). Дополнительной характеристикой антифибротического действия Треамида выступало значительное падение концентрации коллагена, коллагена типа I и гидроксипролина в гомогенатах легких мышей с лёгочным фиброзом (таблица 37).
Полученные результаты позволяют заключить, что в условиях лёгочного фиброза Треамид оказывает антифибротическое действие, проявляющееся в нормализации продукции фибробластами коллагеновых волокон. Это свидетельствует о способности Треамида регенерировать фибробласты ткани лёгкого. Таким образом, Треамид может применяться в качестве препарата, препятствующего развитию фиброза легкого и способствующего регенерации легочной ткани. Пример 15. Исследование влияния Треамида на развитие кахексии у животных с опухолью.
Кахексия развивалась у мышей-самцов линии С57В1/6 при моделировании гематогенно метастазирующей карциномы легких Льюис (LLC). Опухолевые клетки вводили мышам однократно подкожно в концентрации 5x 106 в 0,1 мл физ. раствора (Yu-Chou Т., Samuel К.К., I-Lu L. et al. Preclinical Investigation of the Novel Histone Deacetylase Inhibitor AR-42 in the Treatment of Cancer-Induced Cachexia // JNCI J Natl Cancer Inst (2015) 107(12)).
День введения опухолевых клеток приняли за 1 день эксперимента. Треамид вводили курсом в дозе 10 мг/кг ежедневно внутрижелудочно один раз в сутки с 15 по 28 сутки исследования. Взвешивание животных проводили за сутки до введения опухолевых клеток (0 сутки) и на 28-е сутки эксперимента. На 28 сутки исследования животных эвтаназировали в С02-камере и отбирали кровь. В сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяли уровень свободного тестостерона.
В результате исследования установлено, что масса животных на 28 сутки после перевивки карциномы легких Льюис (патологический контроль) с учетом вычета массы первичного опухолевого узла достоверно снизилась в 1,2 раза по сравнению с этим показателем в группе здоровых животных (таблица 38). Внутрижелудочное введение Треамида полностью предотвращало потерю массы тела животных с карциномой легких Льюис (таблица 38).
Таблица 38
Масса тела мышей-самцов линии С57В1/6 с кахексией, индуцированной карциномой легких Льюис, с учетом вычета первичного опухолевого узла (г) на 28 сутки эксперимента
Figure imgf000089_0001
Примечания:
* - достоверность различия с интактным контролем ( Р<0,05 );
• - достоверность различия с патологическим контролем (Карцинома легких Льюис) ( Р<0,05 ).
Иммуноферментный анализ сыворотки крови показал, что у животных патологического контроля на фоне карциномы легких Льюис на 28е сутки исследования происходит выраженное снижение уровня тестостерона в сыворотке крови (до 14,8% от интактного контроля) (таблица 39). Курсовое введение Треамида значительно повышало концентрацию свободного тестостерона в сыворотке крови животных с LLC.
Таблица 39
Уровень свободного тестостерона (pg/ml) в сыворотке крови мышей-самцов линии С57В1/6 с кахексией, индуцированной карциномой легких Льюис, на 28
Figure imgf000090_0001
Примечания:
* - достоверность различия с интактным контролем ( Р<0,05 );
• - достоверность различия с патологическим контролем (Карцинома легких Льюис)
( Р<0,05 ).
Таким образом, в условиях развития карциномы легких Льюис пероральное применение Треамида препятствовало развитию кахексии. Терапевтический эффект Треамида обусловлен восстановлением функции мышечной и тестикулярной ткани, что выражалось в восстановлении уровня свободного тестостерона в сыворотке крови пораженных животных. Это позволяет заключить, что Треамид может применяться в качестве препарата, препятствующего развитию кахексии. Пример 40
Фармацевтическая композиция
одну таблетку, мг
Figure imgf000091_0001
Заявителем было установлено, что Треамид способствует регенерации ткани и нормализации структуры ткани предстательной железы на моделях хронического абактериального простатита (ХАП) и доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ). Полученные данные позволяют заключить, что использование Треамида способствует регенерации эпителиальной ткани предстательной железы. Это выражается в снижении степени выраженности атрофических процессов. Последнее, очевидно, приведет к возрастанию функциональной активности эпителия ацинусов и будет способствовать восстановлению качественных характеристик эякулята.
Также заявителем экспериментально in vivo показано, что при введении Треамида признаки ДГПЖ были выражены в меньшей степени. Полученные данные свидетельствуют о наличие антипролиферативных свойств Треамида.
Также заявителем обнаружено, что Треамид является средством усиления процессов репаративной регенерации тестикулярной ткани и может использоваться для лечения тестикулярной недостаточности, обусловленной истощением пролиферативного пула сперматогенеза.
Полученные заявителем экспериментальные данные свидетельствуют о наличии у Треамида способности непосредственно стимулировать функциональную активность клеток-предшественников сперматогенной ткани.
Также заявителем экспериментально подтверждено, что Треамид является перспективным для восстановления регенеративного потенциала семенника. Введение Треамида повышало регенераторный потенциал ткани. При этом лекарственное средство не только непосредственно стимулировало образование новых источников пролиферативного пула сперматогенеза (стволовых клеток), но усиливало действие гуморальных факторов, стимулирующих их образование.
Также заявителем экспериментально доказано, что Треамид восстанавливает подвижность сперматозоидов, сниженную вследствие введения паклитаксела.
Представленные заявителем данные свидетельствуют о том, что Треамид позволяет эффективно стимулировать репаративную регенерацию тестикулярной ткани, угнетение которой было обусловлено снижением количества коммитированных колониеобразующих клеток.
Кроме того, заявителем показана способность Треамида восстанавливать подвижность сперматозоидов при астеноспермии. Полученные данные свидетельствуют о том, что Треамид является эффективным средством восстановления подвижности сперматозоидов.
Также заявителем было показано, что Треамид восстанавливает подвижность сперматозоидов, выявляемую при гипогонадизме.
Многочисленные эксперименты подтвержают, что Треамид является эффективным средством восстановления копулятивной активности различной этиологии (в том числе возрастное снижение активности, сезонное снижение активности и другие).
Показано, что Треамид оказывает регенеративное действие в отношении ткани поджелудочной железы. Треамид может применяться для лечения нарушения толерантности к глюкозе и метаболического синдрома.
Также экспериментально показано, что Треамид может применяться в качестве препарата, восстанавливающего структурные и функциональные характеристики ткани печени. Также показано, что Треамид может применяться в качестве препарата, восстанавливающего структурные и функциональные характеристики ткани легких.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Фармацевтическая композиция для стимуляции регенерации включающая эффективное количество соединения формулы (I)
Figure imgf000094_0001
или его фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, где ткань выбрана из группы, включающей ткань поджелудочной железы, печени, лёгкого, мышечной ткани, сперматогенной ткани, тестикулярной ткани и ткани предстательной железы.
3. Лекарственное средство для стимуляции регенерации тканей, представляющее собой
соединение формулы (I)
Figure imgf000094_0002
или его фармацевтически приемлемую соль.
4. Лекарственное средство по п.З, где ткань выбрана из группы, включающей ткань поджелудочной железы, печени, лёгкого, мышечной ткани, сперматогенной ткани, тестикулярной ткани и ткани предстательной железы.
5. Способ регенерации тканей, включающий введение нуждающемуся субъекту эффективного количества соединения формулы (I):.
Figure imgf000094_0003
или его фармацевтически приемлемой соли.
6. Способ по п.5, где ткань выбрана из группы, включающей ткань поджелудочной железы, печени, лёгкого, мышечной ткани, сперматогенной ткани, тестикулярной ткани и ткани предстательной железы.
7. Применение соединения формулы (I):
Figure imgf000095_0001
или его фармацевтически приемлемой соли, для регенерации тканей.
8. Применение по п.7, где ткань выбрана из группы, включающей ткань поджелудочной железы, печени, лёгкого, мышечной ткани, сперматогенной ткани, тестикулярной ткани и ткани предстательной железы.
9. Применение соединения формулы (I):
Figure imgf000095_0002
или его фармацевтически приемлемой соли, для лечения патологических состояний, связанных с нарушениями структуры и функций тканей.
10. Применение по п.9, где ткань выбрана из группы, включающей ткань поджелудочной железы, печени, лёгкого, мышечной ткани, сперматогенной ткани, тестикулярной ткани и ткани предстательной железы.
11. Применение по п.10, где патологическое состояние выбрано из группы, включающей метаболический синдром, нарушение толератности к глюкозе, гепатит, идиопатический фиброз легкого, эмфизему лёгких, хроническую обструктивную болезнь лёгких, кахексию, гипогонадизм, простатит; доброкачественную гиперплазию предстательной железы, коррелятивную недостаточность яичек и аутоимунный орхит.
12. Применение по п. 11, где простатит представляет собой хронический простатит, в частности, абактериальный хронический простатит; или простатит категории ЗБ, или аутоимунный простатит.
13. Фармацевтическая композиция для нормализации сниженной мужской фертильности, включающая эффективное количество соединения формулы (I)
Figure imgf000096_0001
или его фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель.
14. Применение соединения формулы (I):
Figure imgf000096_0002
или его фармацевтически приемлемой соли, для нормализации сниженной мужской фертильности.
15. Применение по п.14, где снижение мужской фертильности обусловлено патологическим состоянием, выбранным из группы, включающей гипогонадизм, астеноспермию, эректильную дисфункцию, коррелятивную недостаточность яичек и тестикулярную недостаточность.
16. Фармацевтическая композиция для восстановления подвижности сперматозоидов, включающая эффективное количество соединения формулы (I)
Figure imgf000096_0003
или его фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель.
17. Применение соединения формулы (I):
Figure imgf000096_0004
или его фармацевтически приемлемой соли для восстановления подвижности сперматозоидов.
18. Применение по п.17, где снижение подвижности сперматозоидов обусловлено патологическим состоянием, выбранным из группы, включающей гипогонадизм, астеноспермию, коррелятивую недостаточность яичек и тестикулярную недостаточность.
19. Фармацевтическая композиция для снижения уровня глюкозы в крови в лечении и/или профилактике патологического состояния, включающая эффективное количество соединения формулы (I)
Figure imgf000097_0001
или его фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель.
20. Способ снижения уровня глюкозы в крови в лечении и/или профилактике патологического состояния, включающий введение нуждающемуся субъекту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I):
Figure imgf000097_0002
или его фармацевтически приемлемой соли.
21. Способ по п.20, где патологическое состояние выбрано из группы, включающей метаболический синдром и нарушение толерантности к глюкозе.
22. Применение соединения формулы (I):
Figure imgf000097_0003
или его фармацевтически приемлемой соли для снижения уровня глюкозы в крови.
23. Применение по п.22, где повышенный уровень глюкозы обусловлен патологическим состоянием, выбранным из группы, состоящей из метаболического синдрома и нарушения толерантности к глюкозе.
24. Фармацевтическая композиция для восстановления структуры и функции печени в лечении и/или профилактике патологического состояния, включающая эффективное количество соединения формулы (I)
Figure imgf000098_0001
или его фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель.
25. Применение соединения формулы (I):
Figure imgf000098_0002
или его фармацевтически приемлемой соли для восстановления функции печени в лечении и/или профилактике патологического состояния.
26. Применение по п.25, где патологическое состояние, выбрано из группы, включающей гепатит, в частности, хронический гепатит и токсический гепатит.
27. Фармацевтическая композиция для восстановления структуры и функции легкого в лечении и/или профилактике патологического состояния, включающая эффективное количество соединения формулы (I)
Figure imgf000098_0003
или его фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель.
28. Применение соединения формулы (I):
Figure imgf000098_0004
или его фармацевтически приемлемой соли для восстановления структуры и функции легкого в лечении и/или профилактике патологического состояния.
29. Применение по п.28, где патологическое состояние выбрано из группы, включающей хроническое обструктивное заболевание легких (ХОБЛ), эмфизему легких и идиопатический фиброз легкого.
30. Фармацевтическая композиция для восстановления структуры и функции поджелудочной железы в лечении и/или профилактике патологического состояния, обусловленного нарушением структуры и функции поджелудочной железы, включающая эффективное количество соединения формулы (I)
Figure imgf000099_0001
или его фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель.
31. Применение соединения формулы (I):
Figure imgf000099_0002
или его фармацевтически приемлемой соли в лечении и/или профилактике патологического состояния, обусловленного нарушением структуры и функции поджелудочной железы.
PCT/RU2016/050015 2015-05-27 2016-05-26 Бисамидное производное дикарбоновой кислоты в качестве средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей WO2016190785A1 (ru)

Priority Applications (16)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/576,387 US10076511B2 (en) 2015-05-27 2016-05-26 Bisamide derivative of dicarboxylic acid as an agent for stimulating tissue regeneration and recovery of diminished tissue function
CN201680044227.3A CN108024978B (zh) 2015-05-27 2016-05-26 二羧酸的双酰胺衍生物作为用于刺激组织再生和恢复减退的组织功能的药剂
UAA201712838A UA122336C2 (ru) 2015-05-27 2016-05-26 Бисамидное производное дикарбоновой кислоты в качестве средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей
AU2016266439A AU2016266439B2 (en) 2015-05-27 2016-05-26 Bisamide derivative of dicarboxylic acid as an agent for stimulating tissue regeneration and recovery of diminished tissue function
CA2986911A CA2986911C (en) 2015-05-27 2016-05-26 Bisamide derivative of dicarboxylic acid as an agent for stimulating tissue regeneration and recovery of diminished tissue function
MX2017015192A MX2017015192A (es) 2015-05-27 2016-05-26 Derivado de bisamida de acido dicarboxilico como agente que estimula regeneracion de tejidos y recuperacion de funcion tisular disminuida.
BR112017025283-0A BR112017025283A2 (pt) 2015-05-27 2016-05-26 derivado de bisamida de ácido carboxílico como agente estimulando a regeneração de tecidos e a recuperação da função de tecidos diminuídos
EP16800380.4A EP3305286A4 (en) 2015-05-27 2016-05-26 BISAMID DERIVATIVE OF DICARBOXYLIC ACID AS A MEANS FOR STIMULATING TISSUE GENERATION AND FOR RECOVERING REDUCED TISSUE FUNCTION
EA201792565A EA034437B1 (ru) 2015-05-27 2016-05-26 Бисамидное производное дикарбоновой кислоты в качестве средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей
KR1020177037304A KR102174191B1 (ko) 2015-05-27 2016-05-26 조직 재생 및 저하된 조직 기능의 회복을 자극하기 위한 제제로서의 디카르복시산의 비스아미드 유도체
SG11201709654YA SG11201709654YA (en) 2015-05-27 2016-05-26 Bisamide derivative of dicarboxylic acid as an agent for stimulating tissue regeneration and recovery of diminished tissue function
RU2017144851A RU2727142C2 (ru) 2015-05-27 2016-05-26 Бисамидное производное дикарбоновой кислоты в качестве средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей
JP2017561321A JP6700312B2 (ja) 2015-05-27 2016-05-26 組織再生及び衰えた組織機能の回復を刺激するための作用物質としてのジカルボン酸のビスアミド誘導体
IL255899A IL255899B (en) 2015-05-27 2017-11-26 Bisamide derivative of dicarboxylic acid as an agent for stimulating tissue regeneration and recovery of diminished tissue function
HK18106870.2A HK1247126A1 (zh) 2015-05-27 2018-05-25 二羧酸的雙酰胺衍生物作爲用於刺激組織再生和恢復減退的組織功能的藥劑
US16/103,264 US10772870B2 (en) 2015-05-27 2018-08-14 Bisamide derivative of dicarboxylic acid as an agent for stimulating tissue regeneration and recovery of diminished tissue function

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015120055 2015-05-27
RU2015120055A RU2647438C2 (ru) 2015-05-27 2015-05-27 Бисамидное производное дикарбоновой кислоты в качестве средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/576,387 A-371-Of-International US10076511B2 (en) 2015-05-27 2016-05-26 Bisamide derivative of dicarboxylic acid as an agent for stimulating tissue regeneration and recovery of diminished tissue function
US16/103,264 Continuation US10772870B2 (en) 2015-05-27 2018-08-14 Bisamide derivative of dicarboxylic acid as an agent for stimulating tissue regeneration and recovery of diminished tissue function

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016190785A1 true WO2016190785A1 (ru) 2016-12-01

Family

ID=57393489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2016/050015 WO2016190785A1 (ru) 2015-05-27 2016-05-26 Бисамидное производное дикарбоновой кислоты в качестве средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей

Country Status (17)

Country Link
US (2) US10076511B2 (ru)
EP (1) EP3305286A4 (ru)
JP (1) JP6700312B2 (ru)
KR (1) KR102174191B1 (ru)
CN (1) CN108024978B (ru)
AU (1) AU2016266439B2 (ru)
BR (1) BR112017025283A2 (ru)
CA (1) CA2986911C (ru)
EA (1) EA034437B1 (ru)
HK (1) HK1247126A1 (ru)
IL (1) IL255899B (ru)
MA (1) MA45829A (ru)
MX (1) MX2017015192A (ru)
RU (2) RU2647438C2 (ru)
SG (1) SG11201709654YA (ru)
UA (1) UA122336C2 (ru)
WO (1) WO2016190785A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110087650A (zh) * 2017-05-26 2019-08-02 制药有限责任公司 新的谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂及其在治疗多种疾病中的用途
WO2023177328A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Treamid Therapeutics Gmbh Bisamide derivative of dicarboxylic acid for use in restoring the external respiratory function after coronavirus infection

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2647438C2 (ru) * 2015-05-27 2018-03-15 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Бисамидное производное дикарбоновой кислоты в качестве средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей
RU2662559C1 (ru) * 2017-10-27 2018-07-26 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Новый ингибитор глутаминилциклаз и его применение для лечения заболеваний легких и дыхательных путей

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014168523A1 (ru) * 2013-04-12 2014-10-16 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Производные бисамидов дикарбоновых кислот, их применение, фармацевтическая композиция на их основе, способы их получения

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2647438C2 (ru) * 2015-05-27 2018-03-15 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Бисамидное производное дикарбоновой кислоты в качестве средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей
KR20240035919A (ko) * 2017-05-26 2024-03-18 엘티디 "발렌타-인텔렉트" 신규한 글루타미닐 고리화효소 억제제 및 다양한 질환의 치료에서의 이의 용도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014168523A1 (ru) * 2013-04-12 2014-10-16 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Производные бисамидов дикарбоновых кислот, их применение, фармацевтическая композиция на их основе, способы их получения

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE PubMed [O] XP055332975, Database accession no. 22894087 *
FERRY G ET AL.: "A zinc chelator inhibiting gelatinases exerts potent in vitro anti- invasive effects.", EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACOLOGY, vol. 351, 1998, pages 225 - 233, XP055290938 *
HOIZUMI M. ET AL.: "Diabetes treatment with the aim of blood glucose normalization.", NIHON RINSHO., vol. 70, no. 8, 2012, pages 1445 - 1450, XP009507607 *
PODYMINOGIN M.A. ET AL.: "Synthetic RNA-cleaving molecules mimicking ribonuclease A active center. Design and cleavage of tRNA transcripts.", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 21, no. 25, 1993, pages 5950 - 5956, XP055290935 *
See also references of EP3305286A4 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110087650A (zh) * 2017-05-26 2019-08-02 制药有限责任公司 新的谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂及其在治疗多种疾病中的用途
EP3632433A4 (en) * 2017-05-26 2021-03-03 Obschestvo S Ogranichennoi Otvetstvennostiyu "Pharmenterprises" NOVEL GLUTAMINYL CYCLASE INHIBITORS AND USES THEREOF IN THE TREATMENT OF VARIOUS DISEASES
JP2021533078A (ja) * 2017-05-26 2021-12-02 オブシェストヴォ・ス・オグラニチェンノイ・オトヴェトストヴェンノストジュ・“ファームエンタープライジーズ” 新規のグルタミニルシクラーゼ阻害剤及び様々な疾患の治療におけるそれらの使用
JP7293114B2 (ja) 2017-05-26 2023-06-19 リミテッド・”ヴァレンタ－インテレクト” 新規のグルタミニルシクラーゼ阻害剤及び様々な疾患の治療におけるそれらの使用
US11845740B2 (en) 2017-05-26 2023-12-19 LTD “Valenta-Intellekt” Glutaminyl cyclase inhibitors and the use thereof in treatment of various diseases
CN110087650B (zh) * 2017-05-26 2024-03-22 瓦伦塔有限责任公司 新的谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂及其在治疗多种疾病中的用途
WO2023177328A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Treamid Therapeutics Gmbh Bisamide derivative of dicarboxylic acid for use in restoring the external respiratory function after coronavirus infection

Also Published As

Publication number Publication date
BR112017025283A2 (pt) 2018-08-07
AU2016266439B2 (en) 2020-05-14
US20180353479A1 (en) 2018-12-13
CA2986911A1 (en) 2016-12-01
KR20180035739A (ko) 2018-04-06
AU2016266439A1 (en) 2018-01-25
EP3305286A1 (en) 2018-04-11
CN108024978B (zh) 2020-11-20
SG11201709654YA (en) 2017-12-28
EA201792565A1 (ru) 2018-04-30
US10772870B2 (en) 2020-09-15
RU2647438C2 (ru) 2018-03-15
JP6700312B2 (ja) 2020-05-27
RU2015120055A (ru) 2016-12-20
CN108024978A (zh) 2018-05-11
US20180147184A1 (en) 2018-05-31
MA45829A (fr) 2019-06-12
UA122336C2 (ru) 2020-10-26
EA034437B1 (ru) 2020-02-07
IL255899A (en) 2018-01-31
RU2727142C2 (ru) 2020-07-21
JP2018515584A (ja) 2018-06-14
KR102174191B1 (ko) 2020-11-05
RU2017144851A (ru) 2019-06-27
US10076511B2 (en) 2018-09-18
HK1247126A1 (zh) 2018-09-21
MX2017015192A (es) 2018-08-01
RU2017144851A3 (ru) 2019-07-17
CA2986911C (en) 2020-06-23
EP3305286A4 (en) 2019-06-12
IL255899B (en) 2022-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020244454A1 (zh) 五环三萜皂苷化合物的医药用途及其药物组合物
US10772870B2 (en) Bisamide derivative of dicarboxylic acid as an agent for stimulating tissue regeneration and recovery of diminished tissue function
KR101934328B1 (ko) 아모디아퀸 및 항당뇨 약물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
TW200819120A (en) Tetrahydro-isoalpha acid based protein kinase modulation cancer treatment
US20130072459A1 (en) Pharmaceutical composition for the prevention or the treatment of non-alcoholic fatty liver disease and the method for prevention or treatment of non-alcoholic fatty liver disease using the same
WO2016173435A1 (zh) 吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐新的药用用途以及药用组合物
WO2019103926A1 (en) P38 inhibitors for the treatment of fshd
JP2021533078A (ja) 新規のグルタミニルシクラーゼ阻害剤及び様々な疾患の治療におけるそれらの使用
TW201800102A (zh) 用於提升clock基因、arntl基因、及／或per2基因之表現的苦瓜萃取物及其應用
US11439631B2 (en) Use of a glutarimide derivative to treat diseases related to the aberrant activity of cytokines
JP7224303B2 (ja) 薬剤、組成物、及びそれに関連する方法
CN111956751A (zh) 一种治疗高尿酸血症的药物组合物及其制备方法
CN113521041A (zh) 麝香酮在制备防治骨性关节炎的药物中的用途
KR20200021880A (ko) 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN110652511B (zh) 中乌宁在制备防治肾功能衰竭药物中的应用
US20200108069A1 (en) Treatment of Fibrotic Conditions
KR101832351B1 (ko) 신코닌 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20210149516A (ko) 피조티펜 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN117224530A (zh) 一种改善雄性哺乳动物睾酮水平的化合物
CN117257803A (zh) 鲁拉西酮在制备治疗或预防缺血/再灌注损伤的药物和细胞保护药物中的应用
Berry et al. Detection of serum antibodies to the human coronavirus-NL63 nucleocapsid protein
CN112826816A (zh) 丁酸钠制备的预防、控制、治疗眼疾的药物及其应用
KR20120064067A (ko) 월경곤란증의 예방 및/또는 치료약
UA120704U (uk) Спосіб медичної реабілітації хворих з неалкогольним стеатогепатитом, поєднаним з цукровим діабетом 2-го типу
KR20160040970A (ko) 레세르핀을 이용한 amp 활성화 단백질 키나아제의 활성화용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16800380

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2986911

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11201709654Y

Country of ref document: SG

Ref document number: 15576387

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017561321

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 255899

Country of ref document: IL

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2017/015192

Country of ref document: MX

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201792565

Country of ref document: EA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20177037304

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: A201712838

Country of ref document: UA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017144851

Country of ref document: RU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2016800380

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016266439

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20160526

Kind code of ref document: A

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112017025283

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112017025283

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20171124