KR20200021880A - 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 브루세아(brucea) 속 식물의 추출물 또는 상기 브루세아 속 식물의 지표 성분을 유효성분으로 포함하는 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 아담자 추출물은 SMN2 유전자로부터 전사되는 pre-mRNA의 스플라이싱 시에 엑손 7이 결손되는 것을 개선함으로써, 척수성 근위축증과 같은 신경근육질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{A Pharmaceutical Composition For Preventing Or Treating Neuromuscular Diseases}

본 발명은 브루세아(brucea) 속 식물 추출물을 유효성으로 포함하는 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

대표적인 희귀 신경근육질환인 척수성 근위축증은, 신생아 6,000-10,000명 당 1명꼴로 발생하는 유전에 의한 영유아 사망원인 1위에 해당하는 질병이다. 이와 같은 척수성 근위축증은 루게릭병과 매우 유사한 증상을 보이며, 질환이 발생하면 척수가 퇴화되면서 뇌에서 보내는 신호가 운동근육으로 정상적으로 전달되지 않아, 점차 근육이 마비되고 위축되어 결국 질환이 발생된 개체를 사망에 이르게 한다.

척수성 근위축증은 증상의 심각도에 따라 크게 4개의 타입으로 구분된다. 가장 심각한 증상을 나타내는 타입 I(Type I)은 척수성 근위축증 중에서 가장 큰 비중을 차지하는 타입으로, 생후 6개월 이내에 증상이 나타나 2년 이내에 죽음에 이르게 된다. 발병 후 비교적 빠른 시간 내에 개체가 죽음에 이르는 현상 때문에, 발병률에 비해 유병률이 낮게 나타나는 경향이 있다.

척수성 근위축증은 단일 유전자인 SMN(survival of motor neuron)의 결함과 직접적으로 관련되어 있다. 상기 SMN 유전자에 의해 암호화되는 SMN 단백질은, 게민(gemin)이라고 불리는 일련의 단백질들과 함께 SMN 복합체(complex)를 형성하여 세포 내에 존재한다. 상기 SMN 복합체는 세포 내에서 유전자 발현 과정인 스플라이싱(splicing)에 관여하는 snRNP(small nuclear ribonucleoprotein)를 형성하는 데 결정적인 역할을 한다. 척수성 근위축증 환자의 세포에서는 SMN 복합체를 이루는 SMN 단백질의 양이 감소되어, 정상적인 수준의 snRNP가 형성되지 못하고, 이로 인하여 정상적인 스플라이싱이 유도되지 않아 세포 내 수많은 유전자들의 발현 양상이 비정상적으로 바뀌게 된다.

인간의 세포 내에는 두 개의 SMN 유전자(SMN1, SMN2)가 존재하는데, SMN1 유전자와 SMN2 유전자는 단백질을 암호화하는 부분 중 엑손 7의 6번째 염기만이 유일하게 다르다는 차이점이 존재한다. 이와 같은 차이점으로 인하여, 정상적인 스플라이싱이 일어나는 SMN1의 mRNA에서는 전장의 SMN(full-length SMN) 단백질이 주로 만들어지는 반면, 비정상적인 스플라이싱이 일어나는 SMN2의 mRNA에서는 엑손 7이 결손된 형태의 SMN 단백질(SMNΔ7 단백질)이 주로 만들어진다.

척수성 근위축증 환자는, SMN1 유전자와 SMN2 유전자를 모두 가지고 있는 정상인과 다르게, SMN2 유전자만을 가지고 있다. 이로 인해, SMN2 유전자로부터 발현되는 SMNΔ7 단백질은 세포 내에서 매우 불안정하여 쉽게 분해됨으로써, 척수성 근위축증 환자의 세포 내에는 정상인의 세포에 비해 SMN 단백질의 양이 현저히 감소되어 있다. 이러한 현상에 의해 척수성 근위축증이 발병되는바, SMN 단백질의 양과 척수성 근위축증의 증상 사이에는 뚜렷한 역상관 관계가 존재한다. 실제로 척수성 근위축증 환자는 각자가 다른 사본수(copy number)의 SMN2 유전자를 갖고, SMN2 유전자의 사본수가 증가되어 있는 환자는 SMN 단백질의 양이 증가되어 있어, SMN2 유전자의 사본수를 적게 가지고 있는 환자에 비해 완화된 증상을 나타낸다. 따라서 SMN 유전자의 스플라이싱 결함을 개선하는 것이 척수성 근위축증의 가장 확실한 치료전략이라고 할 수 있다.

현재 척수성 근위축증의 치료제 개발을 위해서 많은 글로벌 제약사가 다양한 방식의 파이프라인(pipeline), 예를 들면 유전자 치료(gene therapy), 줄기세포 치료(stem cell therapy), SMN 단백질을 증가시키는 전략, 신경세포의 활성화 및 근육기능개선 등의 개발을 진행 중에 있다. 특히, 2016년 말 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 기반의 SMN 유전자의 스플라이싱 조절약물로서, 'SPINRAZA' 이 최초의 신약으로 미국 FDA 승인을 받았으나, 근육 기능을 향상시키는 효과가 매우 미비하고, 한번 투여하기 위해 1억원 정도의 약가가 들며, 1년에 6회 척수강 주사로 맞아야 한다는 문제점이 존재한다.

이에, 천연물을 기반으로 하는 소분자(small molecule) 치료전략을 통해, 제한된 약효, 높은 약가 및 침습적 투여 등을 극복할 수 있는 새로운 대체치료약물의 개발이 시급한 상황이다.

본 발명은 SMN2 유전자만을 가지고 있는 신경근육질환 환자에서 SMN2 유전자의 스플라이싱 결함을 개선함으로써 신경근육질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 브루세아(brucea) 속 식물의 추출물 또는 상기 브루세아 속 식물의 지표 성분을 유효성분으로 포함하는, 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 SMN2 유전자로부터 전사되는 pre-mRNA의 스플라이싱 시에 엑손 7이 결손되는 것을 개선함으로써, 척수성 근위축증과 같은 신경근육질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1의 A 및 B는 척수성 근위축증 환자 유래 세포에서 아담자 추출물에 의한 SMN2 mRNA 양의 변화를 RT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2의 A 및 B는 아담자 추출물에 의한 SMN 단백질 양의 변화를 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 A 및 B는 아담자 추출물에 의한 스플라이싱 결함의 개선에 연관된 단백질 양의 변화를 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4의 A 및 B는 척수성 근위축증 동물 모델에서, SMN2 mRNA의 양의 변화를 RT-PCR 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 A 및 B는 척수성 근위축증 동물 모델에서, SMN 단백질의 양의 변화를 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6의 A 내지 D는 척수성 근위축증 동물 모델에서, 아담자 추출물에 의한 표현형 개선 및 근육 기능 개선 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7의 A 및 B는 아담자 추출물의 근육세포 분화 촉진 여부를 확인할 수 있는 프로모터 활성 분석 시스템에 이용된 유전자 컨스트럭트의 구조를 도시한 것이고, 도 7의 C 및 D는 상기 분석 시스템으로 MCK(muscle creatine kinase) 프로모터와 미오제닌(myogenin) 프로모터의 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8의 A 및 B는 각각 척수성 근위축증 환자 유래 세포에서 아담자의 지표 성분 6종(화학식 1 내지 화학식 6의 화합물)에 의한 SMN2 mRNA 양의 변화를 RT-PCR을 통해 분석한 결과와, 브루세인 D, 야단지올리드 A, 브루세안티놀에 의한 SMN 단백질 양의 변화를 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9의 A 및 B는 각각 척수성 근위축증 동물 모델에서 브루세인 D에 의한 SMN2 mRNA의 양의 변화를 RT-PCR 분석을 통해 분석한 결과와 SMN 단백질의 양의 변화를 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석한 결과이고, 도 9의 C 내지 F는 각각 척수성 근위축증 동물 모델에서 브루세인 D에 의한 표현형 개선 및 근육 기능 개선 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 브루세아(brucea) 속 식물의 추출물 또는 브루세아 속 식물의 지표 성분을 유효성분으로 포함한다.

상기 브루세아(brucea) 속 식물은 아담자(brucea javanica (L.) Merr)일 수 있다. 상기 아담자는 소태나무과에 속한 상록관목(大灌木) 혹은 소교목(小喬木)으로, 고삼자(苦參子), 노아담(老鴉膽) 및 압담자(鴨膽子)의 이명을 가진다. 상기 아담자의 성상은 계란형으로, 길이는 6~10mm, 지름 4~7mm 이며, 아담자의 표면은 흑색계통의 주름이 있고, 과실의 껍질은 질이 단단하여 부서지기가 쉽고 종자 역시도 계란형에 황백색을 띤다.

상기 아담자(brucea javanica (L.) Merr)는 아담자의 열매, 종자, 줄기, 뿌리 및 잎으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 바람직하게는 아담자의 줄기나 잎일 수 있다. 상기 아담자의 종자는 아담자의 가을에 채취한 열매를 햇볕에 말린 후 외각을 제거하는 과정을 통해 얻을 수 있다. 또한, 상기 아담자의 줄기, 뿌리 또는 잎은 아담자에서 채취한 뒤 세절하여 음지에서 건조하는 과정을 통해 얻을 수 있다.

상기 브루세아 속 식물의 추출물은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용매를 이용한 추출법, 이산화탄소에 의한 감압 추출법, 고온에 의한 초임계 추출법, 초음파를 이용한 추출법 및 열수 추출법 등과 같은 방법을 적절하게 선택하여 얻을 수 있고, 바람직하게는 용매를 이용한 추출법을 통해 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용매를 이용한 추출법을 이용하는 경우, 예를 들어, 하기와 같은 단계로 제조될 수 있다: 1) 브루세아 속 식물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계; 2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압농축하는 단계; 및 4) 단계 4)의 농축물을 동결 건조하는 단계.

상기 브루세아 속 식물은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 추출 용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물, 바람직하게는 C1 내지 C6의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 용매를 사용할 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 용매의 양은 브루세아 속 식물 건조 중량의 2 내지 15배, 또는 3 내지 10배일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 추출 방법은 열수추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 방법에 있어서, 추출시 온도는 10℃ 내지 100℃인 것이 바람직하며 25℃ 내지 50℃인 것이 더욱 바람직하다. 상기 추출 시간은 30분 내지 120시간, 12시간 내지 96시간 또는 36시간 내지 84시간일 수 있고, 상기 추출은 1~5회 또는 3회 반복될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 단계 4)의 건조는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 브루세아 속 식물의 지표 성분은 브루세인 D(Bruceine D; CAS No. 21499-66-1), 야단지올리드 A(Yadanziolide A; CAS No. 95258-14-3), 브루세안티놀(Bruceantinol; CAS No. 53729-52-5) 등일 수 있고, 특히 브루세인 D(Bruceine D)일 수 있다.

상기 신경근육질환은 말초신경계와 운동신경계의 지배조직인 횡문근을 침범하는 질환을 통칭하는 것으로, 척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophym, SMA), 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS) 등이 대표적이고, 근육질환인 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular Dystrophy), 근긴장성 위축증(Mytonic Dystrophy), 샤코마리투스(Charcot-Marie-Tooth, CMT) 등일 수 있으며, 바람직하게 SMN1 유전자가 결핍되고 SMN2 유전자만이 존재하여, 세포 내 SMN 단백질의 양이 정상 수준에 미치지 못하는 척수성 근위축증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 브루세아 속 식물의 추출물 또는 상기 브루세아 속 식물의 지표 성분은 스플라이싱에 관여되어 있는 Tra2-β 및 hnRNP A1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1)의 단백질의 양이 감소되도록 유도할 수 있기 때문에, 세포 내에서 SMN2 유전자의 전장 mRNA(pre-mRNA)의 스플라이싱 시에 엑손의 결손이 방지되도록 유도하는 것일 수 있다.

상기 SMN2 유전자에서 발현되는 단백질은 엑손 7 부분이 결손되어 있어서 세포 내에서 불안정하여 쉽게 분해되는데, 상기 브루세아 속 식물의 추출물이나 브루세아 속 식물의 지표 성분은 SMN2 유전자로부터 전장 mRNA가 만들어지는 스플라이싱에 관여하여 결과적으로 엑손 7이 결손되지 않도록 함으로써 세포 내 SMN 단백질의 양을 현저하게 상승시킬 수 있고, 이를 통해 SMN 단백질의 양이 감소되어 질환이 유발되거나, 중증 증상을 보이는 신경근육질환의 예방 또는 치료를 위하여 매우 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 척수성 근위축증 환자로부터 유래한 세포 및 척수성 근위축증 동물 모델에 브루세아 속 식물의 일 종인 아담자의 종자 추출물 또는 아담자의 대표적인 지표 성분인 브루세인 D(Bruceine D)를 처리한 뒤, 상기 세포 내 SMN mRNA 및 단백질의 양을 확인한 결과, 엑손 7이 결손되어 있는 SMN2 mRNA가 감소하고 엑손 7이 포함되어 있는 SMN2 mRNA가 증가되었으며, SMN 단백질의 양이 현저하게 증가되어 있음을 확인하였고(도 1, 2, 4, 5, 8 및 도 9의 A, B 참고), 척수성 근위축증 동물 모델에 아담자 추출물 또는 아담자의 대표적인 지표 성분인 브루세인 D(Bruceine D)를 투여한 뒤, 동물 모델의 표현형을 확인한 결과, 척수성 근위축증 동물 모델의 생존율 및 몸무게가 상승되었으며, 되뒤집기에 걸리는 시간이 감소하고 성공 시행 횟수가 증가하여, 근육 기능이 회복됨을 확인하였다(도 6 및 도 9의 C 내지 F 참고).

상기 약학적 조성물은 브루세아 속 식물의 추출물 또는 브루세아 속 식물의 지표 성분 이외에, 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 첨가제를 더 포함할 수 있다.

상기 '약학적으로 허용 가능한'의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 것이며, 상기 '담체'는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.

본 발명의 상기 브루세아 속 식물 추출물이나 브루세아 속 식물의 지표 성분은 단독으로 또는 어떤 편리한 담체 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회 투여 또는 반복 투여 제형일 수 있다. 상기 약학 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 담체, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 산제는 본 발명의 유효 성분인 브루세아 속 식물 추출물이나 브루세아 속 식물의 지표 성분과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용 가능한 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 상기 브루세아 속 식물 추출물이나 브루세아 속 식물의 지표 성분, 약학적으로 허용 가능한 적당한 담체 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용 가능한 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식 과립법 또는 압축력을 이용한 건식 과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용 가능한 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 투여 경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약학적으로 허용 가능한 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량으로 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량을 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되지 아니한다.

[1-1] 아담자 추출물의 제조

세절하여 음지에서 건조된 아담자의 잎과 줄기를 99.9% 메탄올 용매를 넣고 45℃에서 3일(15분 sonication후 2시간 정치, 10회/1day) 동안 정치시킨 후 sonicator를 이용하여 추출하였으며 무형광 솜을 사용하여 여과된 추출물을 얻었다. 상기 여과된 추출물은 45℃에서 Rotary Evaporator(N-1000SWD (EYELA))를 이용하여 농축하였으며 Biotron coporation, Modul spin 40을 이용하여 건조함으로써, 최종적으로 아담자 추출물을 제조하였다.

[1-2] 아담자의 지표 성분 준비

아담자의 지표 성분으로 알려진 하기 화학식 1 내지 화학식 6의 화합물 6종을 ChemFaces(ChemNorm사)로부터 구입하여 준비하였다.

척수성 근위축증 환자 유래 세포에서 아담자의 추출물 및 지표 성분에 의한 SMN2 mRNA 양의 변화 확인

척수성 근위축증 환자로부터 유래된 세포(GM09677, Coriell Institute)에, 상기 실시예 [1-1]에서 제조된 아담자 추출물을 각각 10 및 100㎍/ml의 농도로, 그리고 상기 실시예 [1-2]에서 확보된 6종의 화합물을 각각 0.1 및 1μM의 농도로, 각각 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포로부터 TRI REAGENT®(RNA/DNA/PROTEIN isolation reagent, KOREA)를 이용하여 전체 RNA를 분리한 뒤, Omniscript RT Kit (QIAGEN)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이렇게 합성된 cDNA를 주형으로, 엑손 7의 염기 서열이 포함되도록 제작된 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 서열을 이용하여 SMN2 유전자에 대하여, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 서열을 이용하여 GAPDH 유전자에 대하여 RT-PCR 반응을 수행하였다.

유전자	방향	프라이머 서열(5'->3')	서열번호
SMN2	정방향	ggaaagccaggtctaaaattcaa	1
	역방향	ctataacgcttcacattccagat	2
GAPDH	정방향	gcggggctctccagaacatc	3
	역방향	ccagccccagcgtcaaaggt	4

그 결과, 도 1의 A 및 B, 그리고 도 8의 A에 도시된 바와 같이, 상기 척수성 근위축증 환자로부터 유래된 세포에서는 정상(normal)으로부터 유래된 세포와 비교하여, 엑손 7이 결손되어 있는 SMN2 mRNA(이하, 'SMN 7 mRNA'라 함)가 증가되고, 엑손 7이 포함되어 있는 SMN2 mRNA(이하, 'FL-SMN mRNA'라 함)이 감소되어있음을 확인하였다. 또한, 아담자 추출물의 경우 10㎍/ml의 농도에서, 그리고 지표 성분들 중 브루세인 D, 야단지올리드 A, 브루세안티놀을 처리한 경우에, SMN2 7 mRNA가 감소하고 FL-SMN2 mRNA가 증가되었다.상기와 같은 결과로부터, 아담자 추출물이나 브루세인 D, 야단지올리드 A, 브루세안티놀은 SMN2 유전자의 스플라이싱에 관여하여, SMN2 mRNA에 엑손 7이 결손되는 현상이 매우 효과적으로 개선되도록 할 수 있음을 알 수 있다.

아담자의 추출물 및 지표 성분에 의한 SMN 단백질 양의 변화 확인

척수성 근위축증 환자로부터 유래된 세포(SMA)에, 상기 실시예 [1-1]에서 제조된 아담자 추출물을 10 ㎍/ml의 농도로, 그리고 상기 실시예 [1-2]에서 확보된 브루세인 D, 야단지올리드 A 및 브루세안티놀을 각각 0.1 및 1μM의 농도로, 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포로부터 단백질을 분리하여 SMN 단백질에 특이적인 항체로 웨스턴 블롯을 수행하여 SMN 단백질의 발현 양상을 확인하였다.

그 결과, 도 2의 A 및 B, 그리고 도 8의 B에 도시된 바와 같이, 척수성 근위축증 환자로부터 유래된 세포에서 감소되어 있는 SMN 단백질의 양이 아담자 추출물이나 브루세인 D의 처리에 의해 현저하게 증가되었다.

상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 아담자 추출물이나 브루세인 D는 SMN2 유전자의 스플라이싱 시에 엑손 7이 결손되는 현상이 개선 되도록 하여, SMN2 유전자로부터 암호화되는 SMN 7 단백질이 아닌, 정상 SMN 단백질이 생성되어 종국적으로 SMN 단백질의 양이 증가될 수 있도록 함을 알 수 있다.

아담자 추출물의 스플라이싱 결함의 개선에 연관된 단백질 양의 변화 확인

상기 실시예 3에서 스플라이싱 결함의 개선 효과가 뛰어난 아담자 추출물의 스플라이싱 결함의 개선에 연관되어 있는 단백질의 변화를 확인하였다.

척수성 근위축증 환자로부터 유래된 세포(SMA)에, 아담자 추출물을 0, 1, 3 및 10㎍/ml의 농도로 각각 처리하고 24시간 동안 배양한 뒤, 세포들로부터 단백질을 분리하였다.

이때, 스플라이싱 결함의 개선에 연관되어 있는 단백질의 발현 변화는 SRSF1(Serine/arginine-rich splicing factor 1), Tra2-β 및 hnRNP A1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1)에 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.

그 결과, 도 3의 A 및 B에 도시된 바와 같이, 아담자 추출물을 처리한 경우에 농도 의존적으로 Tra2-β 및 hnRNP A1의 단백질의 양이 아담자 추출물을 처리하지 않은 경우에 비하여 현저하게 감소되었다.

상기와 같은 결과로부터, 아담자 추출물에 의하여 SMN 스플라이싱 시에 음성 조절자로 작용되는 Tra2-β 및 hnRNP A1의 단백질의 양이 감소됨으로써, SMN2 유전자로부터 생성되는 SMN2 7 mRNA가 감소되고, FL-SMN2 mRNA가 증가될 수 있음을 알 수 있다.

동물 모델에서 아담자의 추출물 및 지표 성분의 스플라이싱 결함, 표현형 및 근육 기능의 개선 효과 확인

[5-1] SMN2 mRNA 및 SMN 단백질 양의 변화 확인

생후 2주 동안만 생존이 가능한 척수성 근위축증 마우스(FVB.Cg-Grm7Tg(SMN2)89Ahmb Smn1tm1Msd Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb/J 마우스, THE JACKSON LABORATORY에서 구매)는 5일째, 근육 약화의 징후가 나타나고 일주일째 비정상적인 걸음걸이, 뒷다리의 흔들림 및 넘어지는 경향을 보이며 점차 경향성이 더 뚜렷해 진다. 더불어 몸무게는 생후 9일 또는 10일에 최고점에 도달하고 이후 죽음에 이를 때까지 감소하며, 움직임 또한 현저히 감소한다.

이와 같은 척수성 근위축증 마우스가 생후 3일째 되는 날부터 10 또는 30mg/kg의 농도로 아담자 추출물, 0.1mg/kg의 농도로 브루세인 D 또는 vehicle을 8일 동안 1일 1회 복강 투여하였다. 실험의 정확성을 위하여 각각의 농도가 투여된 마우스는 3마리로 설정하였다. 그런 다음, 상기 마우스의 간을 적출한 뒤, 전체 mRNA를 분리하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하였다. 또한, 상기 적출된 간으로부터 단백질을 분리하여 SMN 단백질에 특이적인 항체로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 4의 A 및 B, 그리고 도 9의 A에 도시된 바와 같이, 척수성 근위축증 마우스에 아담자 추출물이 30mg/kg의 농도로, 그리고 브루세인 D가 0.1mg/kg의 농도로 복강 투여된 경우, SMN2 7 mRNA의 양의 변화는 없었지만 FL-SMN2 mRNA의 양이 증가되었다.

또한, 도 5의 A 및 B, 그리고 도 9의 B에 도시된 바와 같이, 척수성 근위축증 마우스에 아담자 추출물이나 브루세인 D를 처리한 경우 농도에 의존적으로 SMN의 발현이 3~4배 이상 증가되었다.

[5-2] 동물 모델에서의 표현형 개선 확인

상기 [5-1]과 동일한 방법으로 척수성 근위축증 마우스 8마리에 아담자 추출물이나 브루세인 D를 투여한 뒤, 1일 간격으로 상기 마우스의 몸무게 변화 및 생존 여부를 분석하였다.

그 결과, 도 6의 A 및 B, 그리고 도 9의 C 및 D에 도시된 바와 같이, vehicle을 투여한 군에 비하여, 아담자 추출물을 10mg/kg 및 30mg/kg, 또는 브루세인 D를 0.1mg/kg 투여한 경우에 1일 또는 2일 가량 생존율이 증가되었고, 몸무게 역시 소폭 상승되었다.

[5-3] 근육 기능 개선 확인

아담자 추출물을 투여하기 전과, 상기 [5-1]과 동일한 방법으로 척수성 근위축증 마우스에 아담자 추출물을 투여한 뒤의 시점에서, 마우스 한 마리당 60초의 제한된 시간 동안, 되뒤집기까지 걸린 시간을 측정하는 방식으로 총 5회를 시행하였고 뒤집기를 성공한 횟수도 측정함으로써, 정향 반사 시험(righting reflex test)을 수행하였다.

정향 반사란 동물이 이상 자세에서 정상 자세로 돌아오는 반사를 말하는데, 정상 마우스는 즉시 몸을 돌려 복부가 바닥을 향하도록 하나, 중추신경이 손상된 척수성 근위축증 마우스의 경우에는 되뒤집지 못하므로, 이러한 척수성 근위축증 마우스의 복부가 하늘을 향하게 한 다음 다시 정상 자세로 돌아오는 데에 걸리는 시간을 측정함으로써 평가할 수 있다.

그 결과, 도 6의 C 및 D, 그리고 도 9의 E 및 F에 도시된 바와 같이, 척수성 근위축증 마우스 군의 경우(vehicle) 근육 기능이 감소되어 있어, 되뒤집기를 못하거나 정상(Hetero) 마우스 군에 비하여 되뒤집기를 하는데 걸리는 시간이 30초 이상 소요되었다. 그러나, 아담자 추출물 투여군(10mg/kg 및 30mg/kg) 또는 브루세인 D 투여군(0.1mg/kg)은 아담자 추출물이나 브루세인 D를 투여한지 10일이 지난 이후부터 되뒤집기를 하는 시간이 정상 마우스 군에 비하여 약 10초 이상 감소되었고, 되뒤집기를 성공하는 횟수의 경우 정상 마우스 군과 유사할 정도로 회복되는 것을 확인하였다.

상기와 같은 결과로부터, 아담자 추출물이나 브루세인 D는 SMN2 mRNA의 스플라이싱 결함을 개선함으로써 척수성 근위축증 마우스에서 나타나는 근육 기능 저하와 같은 증상을 완화시킬 수 있음을 알 수 있다.

아담자 추출물의 근육세포 분화 촉진 여부 확인

상기 실시예 [5-3]에서 확인된 아담자 추출물의 근육 기능의 개선 효과가, 근육세포의 분화를 통해서 나타난 것인지, 아니면 SMN2 mRNA의 스플라이싱 결함의 개선 효과에 의해 유도된 것인지 확인하기 위하여, 근육분화인자인 MCK(muscle creatine kinase)와 미오제닌(myogenin)의 프로모터 어세이를 수행하였다.

도 7의 A, B에 도시된 바와 같이, MCK의 프로모터와 미오제닌의 프로모터의 하류에 루시퍼라아제 유전자가 작동가능하도록 연결된 유전자 컨스트럭트가 포함된 벡터를 C2C12 세포에 형질전환시켜, 상기 MCK 의 프로모터와 미오제닌의 프로모터의 활성을 확인할 수 있는 분석 시스템을 구축하였다(MCK 프로모터와 루시퍼라아제 유전자가 작동가능하도록 연결된 유전자 컨스트럭트는 Markus M et al., J. Biol. Chem., 277(8), 6469-6477 (2002) 문헌 참고, 미오제닌 프로모터와 루시퍼라아제 유전자가 작동가능하도록 연결된 유전자 컨스트럭트는 Hana Jeong et al., FASEB journal, 24(9), 3310-3320 (2017) 문헌 참고).

상기와 같이 제작된 각각의 분석 시스템(형질전환체)에 아담자 추출물을 1, 3, 10, 30, 100㎍/ml의 농도로 처리하고 24시간 동안 추가로 배양한 뒤, 동일한 양의 기질(one-glo, promega)을 넣은 후 루미노미터(luminometer) 장비를 이용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 이때, 대조군으로 전사 활성물질에 해당하는 SB(sodium butyrate)를 0.2, 1, 5, 25mM의 농도로 처리하였다.

그 결과, 도 7의 C 및 D에 도시된 바와 같이, 아담자 추출물을 SMN 단백질의 발현이 증가되는 농도인 10 및 100㎍/ml의 농도로 처리한 경우에도 MCK 및 미오제닌의 프로모터의 활성이 나타나지 않았다.

상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 아담자 추출물에 의한 근육 기능 개선의 효과는, 근육세포의 분화와는 관계가 적고, SMN 단백질의 스플라이싱 결함 개선에 의한 것임을 알 수 있다.

이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology <120> A Pharmaceutical Composition For Preventing Or Treating Neuromuscular Diseases <130> 2019DPA3270 <150> KR 10-2018-0097275 <151> 2018-08-21 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MSN2 <400> 1 at 2 <210> 2 <211> 1716 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MSN2 <400> 2 atggtagaca atatgaaacc gtctcttcct caagacgacc cgaaccaaga acagcgcaag 60 gactccttga atcgccagca gcaagcttat cagtttgact atgagagttt atcaccattg 120 gcattattga aaaacgtgcc cgcagttgag aacttttcgt caaagtatat tggggaaaga 180 atattagcaa catcggaact tccagcaaat atgctggcag cggattctag aacttttctg 240 gatcctctcg atgaactcca agattatgag gatttcttta ctctgctgcc gctgcctgct 300 gttgctaaaa tttaccaaac cgatcgctct ttcgcagaac agcgcctgtc tggagcaaac 360 ccgatggtgc ttcgtctgtt agatgccggc gatccgcggg cgcaaacact ggcacaaatt 420 tccagctttc atccattatt cgatctgggc caagagttgc agcaaaaaaa catttatgtg 480 gccgattaca cgggtactga cgaacactat cgcgcgccgt caaagatagg aggcgggagc 540 tatgaaaaag gcagaaaatt cctgccgaaa ccgcgggctt ttttcgcatg gcggtggacg 600 gggattcgcg atcgcggtga aatgacacca attgccatac aactagatcc cacgccagat 660 agccatgtct acaccccatt cgaccctcct gtggattggc tgtttgcgaa actctgtgtg 720 caagtagcag atgccaatca ccatgaaatg agctcgcatt taggtcgtac gcatctggtg 780 atggaaccaa ttgcgatcgt aaccgcccgt cagttggccc aaaatcatcc gctgagcctg 840 ttgctgaaac cgcactttcg ctttatgctt accaacaacg agctgggacg ttcttatcta 900 atcgctcccg gtgggcccgt cgacgaactt ctaggcggta ctcttccaga aacaatggag 960 atagctagag aggcttgtag tacctggagt ctcgatgagt ttgcgttgcc cgccgaactg 1020 aaaaatcgtg gcatggatga cacaaatcag ctgcctcact atccgtatcg agacgatgga 1080 cttctgcttt gggatgcgat agagacgttt gtttccggct atctgaaatt cttttatccg 1140 acggagatcg cgatcgtaca agatgttgaa ctgcagacct gggcccaaga attagcgtcc 1200 gataggggcg gtaaggtcaa aggaatgcct ccacgcatca ataccgttga acagttaatt 1260 aaaatcgtga caactataat tttcacctgc ggtccgcagc attcagcagt caactttcca 1320 cagtatgaat acatgagttt tgccgccaat atgccgttgg cagcgtaccg tgatattccc 1380 aaaattactg cttcaggcaa tctcgaagtt ataacagaaa aagacatctt acggctttta 1440 cctccgtaca aacgagcggc tgaccagctg aaaattctgt ttactctgtc agcttatagg 1500 tatgaccgtt tgggttacta cgataaatct tttcgtgaac tgtatcggat gagtttcgat 1560 gaggtttttg caggaacccc gatccagctt ttagcccgtc agttccagca gaacttaaat 1620 atggcagaac aaaagattga tgccaacaat caaaagcgag ttattcctta cattgctctc 1680 aagccttcct tggtaatcaa tagcatcagt atgtaa 1716 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 3 catatggtag acaatatgaa accgtctctt cctc 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 4 cttggtaatc aatagcatca gtatgtaact cgag 34

Claims (9)

1. 브루세아(brucea) 속 식물의 추출물 또는 상기 브루세아 속 식물의 지표 성분을 유효성분으로 포함하는, 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 브루세아 속 식물은 아담자(brucea javanica (L.) Merr)인 것인, 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 청구항 2에 있어서,
   상기 아담자는 아담자의 열매, 종자, 줄기, 뿌리 및 잎으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나인 것인, 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 브루세아 속 식물의 지표 성분은 브루세인 D(Bruceine D), 야단지올리드 A(Yadanziolide A) 및 브루세안티놀(Bruceantinol)로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 1종인 것인, 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 청구항 4에 있어서,
   상기 브루세아 속 식물의 지표 성분은 브루세인 D(Bruceine D)인 것인, 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 신경근육질환은 척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophym, SMA), 루게릭병 (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular Dystrophy), 근긴장성 위축증(Mytonic Dystrophy) 및 샤코마리투스(Charcot-Marie-Tooth, CMT) 중 어느 하나 이상인 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 신경근육질환은 척수성 근위축증인 것인, 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
8. 청구항 1에 있어서,
   상기 브루세아(brucea) 속 식물의 추출물 또는 상기 브루세아 속 식물의 지표 성분은 SMN2(survival motor neuron 2) 유전자의 스플라이싱 시에 엑손의 결손을 방지하는 것인, 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
9. 청구항 8에 있어서,
   상기 엑손은 SMN2 유전자의 엑손 7인 것인, 신경근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

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