KR102663668B1 - Trdn을 포함하거나 조절하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 - Google Patents

Trdn을 포함하거나 조절하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 Download PDF

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Abstract

본 명세서는 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제, 그 진단키트를 개시한다.

Description

TRDN을 포함하거나 조절하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제{Parkinson's disease pharmaceutical composition and its therapeutic agent containing or modulating TRDN}
본 명세서는 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파시누클레인을 조절하는 TRDN을 포함하거나 조절하는 약리학적 조성물(Pharmaceutical composition and its therapeutic agent containing or modulating TRDN that modulates dopaminergic cells and alpha synuclein in degenerative brain disease) 및 그 치료제를 제공한다.
파킨슨병(Parkinson's disease(PD))은 만성 진행성 신경 퇴행성 질환이다. 주요 병리학적 특징은 주로 SN(Substantia Nigra)에서 도파민성 뉴런의 극적인 손실이며, 세포질 내성 루이 소체(intracytoplasmic Lewy bodies) 및 영양 장애 성 신경 돌기(dystrophic neurites)의 형성이다.
그러나, 도파민성 뉴런의 손실 배후의 메카니즘은 아직 명확하지 않다.
본 실시예들은 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 제공한다.
일 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 TRDN 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 TRDN 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물, 및 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하는 파킨슨병 치료제를 제공한다.
다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 TRDN 유전자의 발현 정도에 영향을 미치는 물질들을 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법을 제공한다.
이 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법은 다음의 단계를 포함한다.
(a) 파킨슨병 모델로 생성된 실험 동물에 적어도 하나의 후보 물질을 투여하는 단계; 및
(b) TRDN 유전자의 발현량을 측정하는 단계, 상기 TRDN 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우에는
상기 후보 물질은 파킨슨병 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
또 다른 실시예는, 대상체로부터 검체를 분리하는 단계, 검체로부터 TRDN 유전자의 발현량을 측정하는 단계 및 TRDN 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우 상기 대상체에 대해 파킨슨병으로 진단하는 단계를 포함하는 파킨슨병 진단방법을 제공한다.
본 실시예들에 따르면, 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공한다.
본 실시예들에 따르면, 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병의 근육 기능과 관련된 증상을 완화키실 수 있는 효과를 제공한다.
본 실시예에 따르면, 파킨슨병 진단키트는 피키슨병을 조기에 진단하여 파킨슨병 치료 및 예방에 우수한 효과를 제공한다.
본 실시예에 따르면, 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법은 파킨슨병 치료제의 후보물질을 스크리닝하여 파킨슨병 치료 및 예방을 할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 로타-로드 테스트 및 폴 테스트를 수행한 결과를 도시하고 있다.
도 2는 웨스턴 블롯(WB)을 수행하여 각 그룹으로부터 뇌 조직, 특히 SN을 추출함으로써 TH 및 TRDN의 발현 수준을 확인한 결과를 도시하고 있다.
도 3은 SH-SY5Y 및 인간 유래 도파민 세포를 배양한 후 TRDN 및 TH 수준을 확인한 결과를 도시하고 있다.
도 4는 WB를 사용하여 시토크롬 C(Cyt.C), Bcl-2- 관련 X (Bax), Bcl-2의 수준 및 Bax/Bcl-2 비율에 대한 평가 결과를 도시하고 있다.
도 5는 세포 독성 분석을 수행한 결과를 도시하고 있다.
도 6은 대조군 및 MPP+ 유도-PD 모델 그룹의 SH-SY5Y 세포에서 TRDN 및 TH 수준을 관찰하기 위해, 면역 형광(IF)을 수행한 결과를 도시하고 있다.
도 7은 대조군과 1- 메틸-4-페닐--1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP)) 유발 파킨슨병 그룹의 로타로드 및 폴 테스트를 나타낸다.
도 8은 골격근 수축에 연결된 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 9은 C2C12 세포에서 다양한 1- 메틸 -4- 페닐 피리 디늄 (MPP+) 농도에서 근소포체(sarcoplasmic reticulum)의 Ca2+ 채널에 연결된 구성 요소의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 10은 1- 메틸 -4- 페닐 피리 디늄 (MPP+) 및 TRDN siRNA로 C2C12 세포를 처리 한 후 근소포체(sarcoplasmic reticulum) Ca2+ 채널에 연결된 구성 요소의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
이하, 본 발명의 일부 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다. 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명의 실시예들을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료", "억제" 및 "약화"란, 본 발명의 조성물을 개체에 사용하여, 특정 세포의 분화나, 특정 물질의 수준, 특정 질병 또는 질환의 진행을 감소시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"란, 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
이하, 본 발명의 실시예들에 따른 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제에 대하여 설명한다.
실시예 1: 약제학적 조성물 및 그 치료제
파킨슨병(Parkinson's disease(PD))은 만성 진행성 신경 퇴행성 질환이다. 파킨슨병(PD)은 노인에서 두 번째로 흔한 퇴행성 뇌 질환이다.
그러나 그 원인은 아직 밝혀지지 않았다. TRDN이 심장 및 일반 근육의 sarcoplasmic reticulum (SR)에서 Ca2 + 조절 인자의 인자이지만 뇌 기능은 불분명하다.
아래 실험예를 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명자는 유전자 배열에 의해 1- 메틸 -4- 페닐 -1,2,3,6- 테트라 하이드로 피리딘-유도 PD 마우스 모델에서 sarcoplasmic reticulum (SN)에서 TRDN 발현 수준이 감소함을 확인하였다.
본 발명자는 TRDN과 PD 사이의 관계를 조사하기 위해, PD와 관련된 단백질의 발현 수준 및 TRDN을 각각 SH-SY5Y 세포주에서 웨스턴 블롯팅(westen blotting, WB) 및 siRNA를 사용하여 연구하였다. 감소된 TRDN 수준에 의한 도파민성 세포에 대한 apoptosis 효과를 조사하기 위해, TRDN 수준이 감소할 때 세포 독성 분석(cytotoxicity assay) 및 형광-활성화 세포 분류 (cytotoxicity assay and fluorescence activated cell sorting, FACS) 분석을 사용하여 세포 생존율 및 apoptosis 를 평가하고, apoptosis 관련 단백질의 수준을 WB 또는 FACS분석으로 확인하였다.
이 결과는 감소된 TRDN 수준이 PD-유사 특성을 유도한다는 점에서 TRDN 발현과 PD의 관계를 보였다. 감소된 TRDN 수준은 또한 Cyt.C 및 PS 수준의 증가를 유발하였고, apoptosis 특성인 Bcl-2 수준을 감소시켰다. FACS dot 플롯 결과는 TRDN siRNA 농도가 증가함에 따라 apoptosis 가 증가함을 보여 주었다. 세포 독성 분석 결과, 세포 생존율은 FACS 분석에서와 동일한 조건에서 감소하였다.
따라서, 감소된 TRDN 수준은 PD의 SN에서 도파민성 세포의 apoptosis 사멸과 관련될 수 있고, TRDN 투여는 apoptosis 세포 사멸을 감소시킴으로써 PD에 긍정적인 효과를 줄 수 있다.
이러한 연구에 기반하여, 본 명세서는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인(alpha-synuclein)을 조절하는 TRDN을 포함하거나 조절하는 약리학적 조성물을 제안한다.
일 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 TRDN 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물을 제공한다.
TRDN 유전자 또는 트리아딘(Triadin) 유전자는 칼슘-유도된 칼슘 방출을 통한 근육 수축을 유발하는 근 세포질 망상으로부터 칼슘 이온의 방출과 관련된 인간 유전자이다. TRDN은 염색체에 대한 TRDN 유전자의 다른 처리로 인해 발생하는 다 단백질 군이다.
실험예에서 후술하는 바와 같이, TRDN의 몇몇 이소형(isoforms)이 확인되고, TRDN의 기능은 탈분극-유도된 유세포질 그물(depolarization-induced sarcoplasmic reticulum, SR)로부터 Ca2 + 방출을 억제한다.
본 명세서에서 TRDN 유전자 발현에 의한 물질은 TRDN　유전자 서열에 의해 발현되는 단백질이나, 이 단백질　발현이 잘 되도록 TRDN 유전자에 일부 변형을 주어 발현시킨 단백질을 의미할 수 있다.
알파-시누클레인은 인간의 뇌에 풍부한 단백질이다. 소량은 심장, 근육 및 다른 조직에서도 발견된다. 뇌에서, 알파-시누클레인은 시냅스전말단이라 불리는 특수한 구조의 신경 세포 (뉴런)의 끝에서 주로 발견된다. 인간의 알파-시누 클레인 단백질은 140 개의 아미노산으로 이루어지고, SNCA유전자에 의해 코딩된다.
다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 TRDN 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물, 및 그 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하는 파킨슨병 치료제를 제공한다.
상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 명세서의 파킨슨병 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 명세서의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 명세서의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를더 함유할 수 있다.
본 명세서의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물 및 그 치료제의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥 내, 피하, 복강 내, 흡입, 피부도포, 패치제 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다.
투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다.
이하, 실험예를 기술함으로써 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실험예는 본 발명의 일 예시에 불과하며, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실험예 1: 약제학적 조성물
1. 개요
파킨슨병(Parkinson's disease (PD))은 주요 행동 증상을 특징으로 하는 퇴행성 신경 질환이며 진전, 운동 장애, 운동 완서(bradykinesia, 運動緩徐) 및 강성을 포함한다(Jankovic, 2008).
파킨슨병(PD)은 노인에서 두 번째로 흔한 퇴행성 뇌 질환이다. PD는 진전, bradykinesia (느린 운동), 근육 강성 및 자세 불안정과 같은 임상 증상을 유발한다. 일부 환자는 치매, 우울증 및 불안증이 있다 (Dauer and Przedborski, 2003).
뇌에서 병리학적 특징은 중뇌의 substantia nigra pars compacta (SNpc)에서 도파민 신경 세포의 손실을 보여준다. 또한, 티로신을 촉매화하여 L-DOPA를 형성하는 티로신 하이드록실라제(tyrosine hydroxylase, TH)의 수준은 선조체 (striatum, ST)와 substantia nigra(SN)에서 감소된다 (Haavik and Toska, 1998).
PD의 원인은 아직 알려져 있지 않지만, PD의 추측 원인은 산화적 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애, 소포체 (ER) 스트레스 및 가족 유형과 같은 유전적 요인이다(Haavik and Toska, 1998, Walden and Muqit, 2017). PD 사례의 약 95 %가 산발성 PD이다. 알파-시누클레인(α-synuclein), 파킨(Parkin) 및 Dj-1의 유전자 돌연변이로 인한 유전자 PD는 모든 PD 사례의 5 %를 차지한다(Dauer and Przedborski, 2003). 한편, 1- 메틸-4-페닐-1,2,3,6- 테트라 하이드로 피리딘 (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP) 에의 노출은 인간뿐만 아니라 마우스에서도 PD의 선택적 도파민성 신경 변성을 야기한다. 따라서 MPTP는 연구를 위해 PD의 동물 모델을 만드는 데 가장 일반적으로 사용된다(Dauer and Przedborski, 2003).
이 실험예에서 MPTP 마우스 모델을 만들고 유전자 배열을 수행하기 위해 마우스 뇌의 SN 부분을 사용했다. 이 결과 Triadin (TRDN) 유전자 발현 수준에서 상당한 감소를 보였다. 따라서 이 명세서는 TRDN과 PD의 관계에 중점을 두었다.
TRDN은 주로 심장 및 골격근에서 연구되었다. TRDN의 몇몇 이소형(isoforms)이 확인되고, TRDN의 기능은 탈분극-유도된 유세포질 그물(depolarization-induced sarcoplasmic reticulum, SR)로부터 Ca2 + 방출을 억제한다. 또한, TRDN- 결핍 마우스는 SR의 Ca2 + 저장 크기가 감소되었다(Wang et al., 2009). 따라서, 이 명세서는 TRDN 발현이 Ca2 + 조절과 밀접한 관련이 있다고 추론 할 수 있다. 근육이 수축되면, SR로부터 Ca2 + 방출이 원형질막 탈분극에 의해 생성된다. 따라서, TRDN 결실은 또한 근육 기능 장애를 유발하는 것으로보고되었다 (Oddoux et al., 2009).
그러나 TRDN과 PD의 관계는 보고된 바 없습니다. 따라서, 이 명세서에서, 우리는 PD의 병리학적 특징과 관련하여 TRDN 발현을 조사하고 어떻게 TRDN 하향 조절이 siRNA 형질 감염을 사용하여 SH-SY5Y 세포에서 뉴런에 영향을 미치는지 조사했다. 또한, 보고된 문헌에 기초하여, apoptosis는 PD에서 뉴런의 분해로 간주된다(Anglade et al., 1997, Tatton et al., 2003). 따라서, TRDN과 PD의 관계는 apoptosis 측면에서 연구되었다.
2. 방법
2.1. 파킨슨증의 MPTP 모델
6 주령의 수컷 내성 C57BL / 6 마우스(20-22g; DBL, 한국)를 대조군(CTL) 및 MPTP- 치료군(MPTP)의 두 그룹으로 나누었다. 대조군 그룹의 마우스에 4주 동안 매일 1회 식염수 0.9% (100μL)를 복강 내 주사하고, MPTP 그룹의 마우스에 식염수 0.9% (100μL)의 MPTP-HCl (20mg/kg의 유리 염기)을 복강 내 주사하였다). 4주 동안 24시간 간격으로 지속적인 만성 파킨슨병 모델을 생성한다. 최종 MPTP 처리 후, 마우스를 16.5% 우레탄을 사용하여 마취시키고, 차가운 0.05-M 나트륨-포스페이트 완충액으로 심내 관류하여 면역 조직 화학 평가를 가능하게 하였다. 파킨슨증의 MPTP 모델은 도파민성 세포 사멸로 확인되었다(Choiand Lim, 2010, Yeo et al., 2013).
상지대 학교 동물 실험위원회는 이 명세서에 사용된 모든 동물 프로토콜을 승인했다. 사용되었지만 언급되지 않은 시약은 미국 시그마에서 구입했다.
2.2. 로타-로드(Rota-rod) 및 폴(pole) 테스트
이 테스트는 light phase 동안 마지막 MPTP 주입 전에 MPTP- 유도된 4 주 파킨슨증 모델에서 운동 능력을 평가하기 위해 수행되었다. 로타-로드 훈련은 2 주 동안 2 일에 일정한 30 rpm으로 15 분 동안 수행되었으며, 극 테스트 훈련도 하루에 한 번 수행되었다.
로타-로드 트레드밀 직경(treadmill diameter)은 280 mm이고, 로타-로드 테스트는 5 분의 작동 시간에서 10 rpm에서 50 rpm으로 4 분 동안 가속 모드로 수행되었다. 가속 모드에서 4 분 후, 완료될 때까지 1 분 동안 일정한 50 rpm을 유지하였다. 첫 번째 낙하(falling) 또는 첫 번째 낙하(drop)까지의 시간을 측정하고 시험을 2 회 진행 하였다. 극 테스트에서, 길이가 548 mm이고 직경이 8 mm인 극을 수직으로 위치시키고 목재로 만들었다. 마우스를 위에서 아래로 움직였고 시간을 측정했다(n=6/그룹).
2.3. RNA 추출 및 마이크로 어레이 분석
RNeasy Plus Mini 키트(QIAGEN, 미국)를 사용하여 각 그룹의 양측 SN 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. 분리된 RNA 품질을 NanoDrop ND-1000 분광 광도계(NanoDrop Technologies, 미국)를 사용하여 추정하고 정량하였다.
총 RNA의 분취량(300ng)을 Affymetrix GeneChip®Mouse Gene 1.0 ST Array(유전체 와이드 발현 프로파일링 칩; 35,557 개 프로브의 28,853 개의 유전자; Affymetrix, 미국)에 적용하였다. 이전에 보고된 바(Choi et al., 2011; Lin et al., 2010, Yeo et al., 2018).)와 같이 GeneChip Whole Transcript(WT) Sense Target 표지 분석 매뉴얼을 따랐다.
1.4. 마이크로 어레이 데이터 분석
스캔된 이미지의 의미있는 신호 강도는 먼저 육안 검사를 사용하여 평가되었다. 스캔 된 데이터의 품질 제어는 Expression Console 소프트웨어 (Affymetrix, USA)를 사용하여 poly-A 및 하이브리드화 컨트롤의 신호 강도의 순서를 확인함으로써 수행되었다. 마이크로 어레이 데이터는 GenPlex ver.3.0 (ISTECH, Korea)을 사용하여 분석되었다. 4 개의 CEL 파일 (각 그룹에서 생성된 2 개의 CEL 파일 x 2 개의 실험 그룹)은 다음 조건에서 업로드 및 정규화되었다; 완전 일치 (PM)-PM 강도 조정으로만 사용, (2)베이스 2(log2)를 이용한 로그 변환을 위한 프로브 세트 요약 알고리즘으로써 강력한 멀티 칩 분석(RMA) 정량 방법, 및 전처리 모듈에서 예비 데이터의 품질을 평가하기위한 양자화 정규화 방법(데이터 품질 관리로서 기능함). 28,853 개의 유전자의 평균 신호 강도는 각 그룹에서 2 개의 칩으로부터 얻어졌다. 정규화 후, 폴드 체인지 컷오프 (1.5) 및 학생의 t- 검정 유의 기준 (p <0.05)의 조건을 만족하는 GeneChip의 차등 발현 유전자 (DEG)를 DEG- 찾기 모듈(DEG-finding module)을 사용하여 확인했다.
1.5. 면역 조직 화학
4주 MPTP 파킨슨증 마우스의 뇌를 제거하고, 4°에서 하루 동안 4 % 파라 포름 알데히드를 함유하는 0.05-M 나트륨-포스페이트 완충액에 고정한 후, 뇌를 2일 동안 수크로스(sucrose) 버퍼로 탈수시켰다.
대조 뇌 섹션(40-μm 두께)을 냉동 조직절편기(cryomicrotome)을 사용하여 절단했다. 면역 조직 화학 분석은 ABC 키트 및 Mouse on Mouse(M.O.M) 면역 검출 키트(Vector Laboratories, CA) 및 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 방법의 변형을 사용하여 수행되었다. 간단히, 전체 ST 및 SN 영역을 포함하는 섹션을 3% H2O2와 함께 인산 완충 식염수(PBS; pH 7.4)에서 배양한 후 차단 버퍼(3% 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 및 10% 말 혈청(horse serum))에서 배양하였다. 토끼 항 -TH 항체(mouse anti-TH antibody)(1:200; Santa Cruz Biotechnology, USA)를 사용한 경우, 조직을 4°에서 밤새 1차 항체와 함께 배양하기 전에 실온에서 1시간 동안 M.O.M. 마우스 Ig-차단 시약 (Vector Laboratories)으로 처리했다.
그 후, 섹션을 비오티닐화된 항-마우스 IgG(biotinylated anti-mouse IgG) 및 아비딘-비오틴-퍼옥시다제(avidin-biotin-peroxidase) 복합체로 처리하고, 이는 트리 아미노 및 SN 영역에서 도파민성 뉴런을 확인하기 위해 디아미노벤지딘-과산화수소 용액(diaminobenzidine-hydrogen peroxide solution)과 반응할 수 있다. 뉴런 세포는 Nicon X-cite 시리즈 120 Q 현미경 (Nikon; 일본)을 사용하여 관찰되었다.
2.6. 세포주 및 배양
인간 유래 SH-SY5Y 세포주로부터의 세포를 표준 배양 조건(5 % CO2, 37 ℃)에서 배양하였다. 10 % 소 태아 혈청(fetal bovine serum)(BioWest), 100-U/mL 페니실린-스트렙토 마이신(penicillin-streptomycin)(Gibco; USA) 및 0.1mM 비필수 아미노산(nonessential amino acids)(Gibco, USA)을 함유하는 최소 필수 배지(Minimum essential medium)(MEM; 한국, 남천면 웰젠)에서 배양되었다.
2.7. siRNA(Small interfering RNA) 녹다운
TRDN의 발현을 하향 조절하고 효과를 조사하기 위해, TRDN에 대한 siRNA (5'-UCAUG UGG GUA GAC UCA GU-3') 및 음성 대조군 듀플렉스(siRNA, 5'- UUC UCC GAACGU GUC ACG UTT-3')를 사용하였다. siRNA는 한국의 Bioneer Inc.로부터 입수하였다.
형질 감염 시약(Transfection reagent)(Promega, USA)을 형질 감염 동안 Opti-MEM (Gibco) 배지에서 3.5 : 1 형질 감염 시약-이중 RNA 비율(3.5:1 transfection reagent-to-duplex RNA ratio)로 사용하였다.
2.8. 웨스턴 블로팅
SH-SY5Y 세포를 PBS 세척한 후 20 분 동안 얼음에서 20mM 방사선 면역 침전 분석 완충액(RIPA)에서 균질화시켰다. ST 및 SN 조직을 초음파 처리기(Qsonica Q55; USA)를 사용하여 20mM RIPA에서 균질화하고 20 분 동안 얼음에서 배양한 경우. 4℃에서 15 분 동안 12,000 rpm에서 원심 분리한 후, 동일한 단백질 농도의 상등액 샘플을 4-15 % 나트륨 도데 실 설페이트-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDSPAGE)을 사용하여 분리한 다음 폴리 비닐 리덴 디 플루오라이드(polyvinylidene difluoride)(PVDF) 막(Pall Life Science ; 미국)으로 옮겼다. 막을 실온에서 1 시간 동안 0.1 % 트리스-완충 식염수 (TBS; 20-mM 트리스 -HCl [pH 7.5] 및 0.1 % 트윈 -20, TBST를 함유하는 150mM NaCl) 중 3 % BSA로 차단 한 후 배양하였다. 일차 항체로 하룻밤 동안 세척한 다음 0.1 % TBST로 세척하였다. 막을 2차 항체와 함께 1 시간 동안 배양하고 0.1 % TBST로 세척하였다. 토끼 항 -TRDN (1 : 2000; MyBioSource), 토끼 항 -TH (1 : 5000; Abcam), 토끼 항 -β 액틴 (1 : 5000; Cloud Clone), 토끼 항-시토크롬 C (1 : 600; Abcam) 토끼 항 -Bax (1 : 1000; Abcam), 토끼 항 -Bcl-2 (1 : 5000; Abcam) 및 마우스 항 -β 액틴 (1 : 5000; Santa Cruz Biotechnology)을 1 차 항체로 사용 하였다. 염소 항-마우스 IgG (HRP; 적합한 비율; Abcam) 및 염소 항-토끼 IgG H & L (HRP; 적당한 비율 : Santa Cruz Biotechnology)을 이차 항체로 사용하였다. 항원 항체 복합체는 Amersham Imager 680 (GE Healthcare)에 의해 ECL 검출 시약 (GE Healthcare; USA)을 사용하여 시각화되었다.
2.9. 세포 독성 분석
TRDN 수준 감소가 세포에 미치는 영향을 알기 위해 세포 독성 분석을 수행하였다. EZ-CYTOX (DoGenBio, Korea)를 이용하여 세포 생존력 및 세포 독성을 조사하였다. 권장 프로토콜을 따르고, 24 시간 동안 TRDN siRNA (siTRDN) 처리한 후 세포 생존율을 측정 하였다. SH-SY5Y 세포를 다양한 농도의 siTRDN (5, 10, 25, 50 및 100 nM) 및 100-nM 음성 대조군 siRNA로 처리 하였다.
2.10. 형광 활성화 세포 분류 분석
siTRDN 처리에 따라, 세포에서 apoptosis를 분석하기 위해 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 수행하였다. 세포 독성 분석과 동일한 방식으로 siTRDN 처리를 수행하였다. 대조군은 보상을 위해 첨가되었고 대조군 세포에서는 아무것도 처리되지 않았다. 세포를 세포 스크레이퍼(cell scraper)로 수집하고 2500 rpm, 4 ℃에서 5 분 동안 PBS로 2 회 세척하였다. 세포를 106 세포/mL의 결합 완충액으로 재현탁시키고 100 μL (105 세포)을 분취 하였다. 플루오레세인(FITC)-아 넥신 V(Fluorescein(FITC)-annexin V) 및 프로피디움 요오다이드(propidium iodide)(PI)는 제조사의 제안된 프로토콜(BD ParmingenTM)에 따라 처리되었다. 샘플을 결합 완충액으로 5 회 희석하고 cytoFLEX (Beckman Coulter Life Sciences; US)로 검출을 수행하였다.
2.11. 면역 형광
SH-SY5Y 세포를 면역 형광에 사용하였고, 1mM MPP+를 18 시간 동안 MPP+ 군에서 처리하였다. 4 % 파라 포름 알데히드 및 메탄올을 사용하여 세포를 고정시켰다. 고정 후, 세포를 차단 완충액(1 % BSA, PBS 중 5 % 염소 혈청)에서 30 분 동안 배양하였다. 각 군의 세포를 일차 항체, 마우스 항 -TH 및 토끼 항 -TRDN과 함께 배양한 다음, 이차 항체, 염소 항-마우스 IgG Flamma 488 및 염소 항-토끼 IgG (H + L) 테트라 메틸 로다 민 (TRITC) 접합 . 마지막으로 DAPI (1μg / ml)를 사용하여 세포의 핵을 염색하였다.
Nicon X-cite 시리즈 120 Q 현미경 (Nikon; 일본)을 사용하여 사진 문서화를 수행하였고, 노출 파라미터는 대조군 및 MPP+ 그룹에 대해 동일하였다.
2.12. 통계 분석
SPSS 25(출시 2017, PASW Statistics for Windows, 버전 25.0, 시카고: SPSS Inc.)의 학생 t- 테스트 및 분산 분석(Student's t-test and the analysis of variance)(ANOVA)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
3. 결과
MPTP- 유도 PD 마우스 모델을 만들기 위해, 마우스에 24 시간마다 4 주 동안 MPTP-HCL(20mg/kg)을 주사하였다. 로타-로드 테스트 및 폴 테스트는 마우스의 상태를 확인하기 위해 수행되었으며, 결과는 도 1에 도시되어 있다. 로타-로드 테스트에서, MPTP 그룹의 마우스는 대조군 그룹(t(14)=3.17, P=0.007)의 마우스 보다 먼저 떨어졌다. 폴 테스트에서, MPTP 그룹의 마우스는 대조군 그룹((t (12) = 2.52, P = 0.027))의 마우스보다 먼저 바닥에 도달하였다 .
MPTP 그룹의 마우스는 뒷다리로 극을 잡을 힘이 없기 때문에 더 빨리 기어가는 것처럼 보였다. 이러한 행동 테스트는 MPTP 그룹에서 마우스의 이동성이 감소하고 대조군과 MPTP 그룹 사이의 분명한 차이를 보여 주었다.
유전자 배열의 결과는 TRDN 유전자 발현 수준이 도 2C에서 감소되었음을 확인하였다(t (2) = 59.77, P = 0.00028). 또한 웨스턴 블로팅 (WB)을 수행하여 각 그룹으로부터 뇌 조직, 특히 SN을 추출함으로써 TH 및 TRDN의 발현 수준을 확인하였다. 그 결과는 도 2에 도시되어 있다(도 2의 A 및 B). 유전자 배열 결과와 마찬가지로, WB 결과는 TRDN 및 TH의 발현 수준 감소를 보여주었다(TRDN; t (4) = 11.67, P = 0.0003, TH; t (2) = 53.3, P = 0.00035).
THB의 감소를 다시 확인하기 위해 3,3- 디아 미노-벤지딘 (DAB)을 사용한 면역 조직 화학(IHC)을 수행하였고, SN 및 ST에서의 TH 수준의 감소를도 2D에 도시하였다. 이러한 결과는 MPTP- 유도 PD 마우스 모델에서 TRDN 수준의 감소를 확인 하였다.
한편, 인간 세포에서의 효과를 관찰하기 위해 SH-SY5Y 및 인간 유래 도파민 세포를 배양하고 TRDN siRNA (siTRDN)를 24시간 동안 10 및 100 nM의 농도로 처리하였다. 24 시간 후, TRDN 및 TH 수준은 도 3에 도시한 바와 같이 감소하였다 (TRDN; F (2, 3) = 25.34, P = 0.013, TH; F (2, 3) = 82.0, P = 0.002). 이 결과는 감소된 TRDN이 TH 수준의 감소를 유도함을 보여주었다.
PD와 관련된 단백질의 발현 수준 외에도, TRDN 감소가 세포에 미치는 영향 확인하기 위해, WB를 사용하여 시토크롬 C(Cyt.C), Bcl-2- 관련 X (Bax), Bcl-2의 수준 및 Bax/Bcl-2 비율에 대해 평가하였다. 그 결과 Cyt.C 수준이 증가하고(t (4) = -2.79, P = 0.049) Bax 수준은 크게 변하지 않았지만 Bcl-2 수준은 감소하였다(F (2, 3) = 12.97, P = 0.033), Bax / Bcl-2 비율은 도 4에서 알 수 있는 바와 같이 증가하였다 (t (2) = -4.60, P = 0.044). 이 결과로부터, TRDN 감소가 apoptosis를 야기할 것으로 예상할 수 있다.
이는 TRDN 수준 감소가 PD의 도파민성 세포에서 apoptosis를 유발한다는 것을 의미하기 때문에 중요하다. 세포 사멸을 확인하기 위해, 세포 독성 분석을 수행하였고, 결과는 도 5C에 도시된 세포 생존력을 보여 주었다. 우리는 10-nM siTRDN에서 세포 생존율의 유의한 변화를 발견하지 못했지만, 세포 생존율은 siTRDN 농도> 25 nM에서 감소하였다(도 5C). 100-nM siTRDN에서 세포 생존율은 71.50 % 감소했다.
세포 사멸이 apoptosis에 의한 것임을 보다 정확하게 확인하기 위해, 세포를 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다. 세포에서 apoptosis 신호 인자로 알려진 포스파티딜 세린 (PSs)을 아 넥신 V-FITC로 염색하였고, 높은 FITC 신호는 세포가 apoptosis를 겪고 있음을 의미한다. 다른 한편으로, 핵은 PI로 염색되었고, 낮은 PI 신호는 세포가 여전히 살아 있음을 의미한다. 따라서, H1-LR 구역, 높은 FITC 신호 및 낮은 PI 신호는 음성 대조군 (100-nM NC siRNA 처리) 및 10-, 25-, 50-, 100-에서 apoptosis를 검출하는데 유용한 것으로 확인되었고, nM siTRDN 처리는 SH-SY5Y 세포에 효과적이었다(도 5A).
그 결과의 백분율은 도 5b에서 막대 그래프로 표현된다. apoptosis의 증가는 25-nM siTRDN에서 유의미하고 100-nM siTRDN (F (4, 5) = 5.23, P = 0.049)까지 지속적으로 증가했다. 이들 결과는 세포 생존율이 25 nM siTRDN으로부터의 apoptosis에 유의하게 영향을 미치는 세포 독성 분석 결과와 의미적으로 일치한다(F(4, 25)= 9.11, P=0.00011).
한편, 대조군 및 MPP+ 유도-PD 모델 그룹의 SH-SY5Y 세포에서 TRDN 및 TH 수준을 관찰하기 위해, 면역 형광(IF)을 수행하였다. TH는 FITC로 염색되었고, TRDN은 TRITC로 염색되었다. 그 결과는 TH와 TRDN이 특히 핵에서 대조군 (WT 군)에 성공적으로 병합되었음을 보여주었다(도 6D). 반면, MPP+ 그룹에서는 TH와 TRDN이 병합되지 않았다(도 6H). 따라서, WT 조건 하에서 TRDN과 TH는 서로 상호 작용하지만, PD가 발생하면 TRDN 레벨이 감소하고 TRDN과 TH 사이의 상호 작용도 감소된다.
4. 결론
현재까지 뉴런에서 TRDN의 기능과 역할은 알려져 있지 않습니다. 그러나 이 연구의 결과는 TRDN과 PD가 관련되어 있음을 보여준다. MPTP- 유도 파킨슨증 모델 마우스에서 TRDN 수준이 감소하였고, SH-SY5Y 세포는 TRDN이 감소되었을(knocked down) 때 PD의 특성을 보여 주었다. 즉, 감소된 TRDN 레벨은 PD의 특성으로서 TH 레벨을 감소시켰다. 이를 통해 TRDN 수준과 PD의 관계가 확인되었다.
또한, 감소된 TRDN 수준을 갖는 세포에서 apoptosis와 관련된 인자의 의미있는 변화는 또한 apoptosis와 관련되었다. 그 결과는 TRDN 레벨이 감소할 때 Cyt.C가 증가하고 Bcl-2가 증가함을 보여 주었다. Bcl-2는 미토콘드리아로부터 Cyt.C의 방출을 차단하고 세포의 apoptosis를 방지하는 것으로 알려져 있다(Yang et al., 1997).
실제로, 우리는 감소된 Bcl-2 수준이 미토콘드리아로부터 Cyt.C의 유출을 증가시키고 Cyt.C의 방출을 증가시켜 caspase 9 pathway를 통한 apoptosis를 유도한다고 추론했다 (Li et al., 1997). TRDN 수준이 감소하면 apoptosis 과정이 이런 방식으로 진행될 수 있다. 이것은 TRDN이 PD에서 도파민성 세포 사멸과 깊이 관련되어 있음을 추론할 수 있음을 의미한다. 일반적으로, TRDN은 이미 심장 및 일반 근육에서 SR로부터의 Ca2+ 방출 억제와 관련된 인자인 것으로 알려져 있다(Chen et al., 2013, Guo and Campbell, 1995, Marty, 2015). 감소된 TRDN 수준은 SN에서 뉴런의 ER에서 Ca2+ 조절의 기능 장애를 유도하는 것으로 간주될 수 있고, Ca2+와 관련된 apoptosis 과정이 활성화된다. 그러나 뉴런의 Ca2+ 조절 변화와 TRDN에 의한 세포 자멸사 유도 기전은 아직 밝혀지지 않았다.
결론적으로, TRDN 발현은 MPTP- 유도 PD 마우스 모델에서 TRDN 수준이 감소되고 PD의 병리학적 특징이 감소된 TRDN 수준에 의해 유도되었다는 점에서 PD와 관련된다. 또한, 세포는 siTRDN의 농도>25nM에서 죽기 시작했다. Cyt.C, Bcl-2, Bax / Bcl-2 비율 및 PS와 같은 apoptosis 관련 인자의 수준에 변화는 apoptosis가 발생했음을 보여주기 때문에, 감소된 TRDN 발현 수준에 의한 세포 사멸(cell death)은, apoptotic 세포 사멸이다.
또한, siTRDN의 농도가 증가함에 따라, apoptosis 수준도 증가 하였다. 따라서, TRDN은 뉴런의 apoptosis와 관련되고 PD에서 apoptosis 세포 사멸과 관련된다. 따라서, PD에서 도파민성 세포 사멸에서, TRDN 투여는 PD 치료의 잠재적 후보일 수 있다.
이러한 실험예 1을 통해, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 TRDN 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물 및 그 치료제를 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 것을 알 수 있다.
실험예2 : 약제학적 조성물 및 그 치료제
1. 개요
근육 수축은 세포질의 Ca2 + 수준에 의해 조절되며, 이는 차례로 Ca2 + 채널과 관련된다. 리아노딘 수용체(Ryanodine receptor(RYR)), 칼세퀘트린(calsequestrin 1(CSQ1)), 트리아딘(triadin(TRDN)), 정틴(junctin) 및 디하이드로피리딘 수용체(dihydropyridine receptor)는 Ca2+ 항상성에 관여하는 단백질이다(Oddoux et al., 2009).
이 실험예 2에서 근육에서 TRDN의 역할에 초점을 맞추고, 근소포체(sarcoplasmic reticulum) 막 Ca2 + 채널에서 TRDN과 관련된 RYR 및 CSQ1과 같은 단백질을 연구했다.
TRDN은 대부분 심장 및 골격근에서 연구되었다. TRDN은 SR에서 Ca2+ 방출을 조절한다. 심장 근육에서 TRDN 돌연변이는 CSQ1이 RYR에 의한 Ca2+ 이온의 방출을 억제할 수 없기 때문에 근소포체(sarcoplasmic reticulum) 루멘에서 Ca2+ 이온의 누출을 유발한다. TRDN의 감소는 근육 기능을 손상시킨다. 또한 CSQ1은 RYR에 대한 내강 칼슘 센서 역할을 하지만, TRDN은 RYR과 CSQ1 간의 상호 작용을 매개하여 SR 내강의 Ca2+ 수준을 감지할 수도 있다.
이 실험예 2에서, TRDN 관련 인자는 1- 메틸-4-페닐--1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP)) 유도 PD 마우스 모델에서 연구되었다. 대퇴사 두근 (QF)이 걷기와 점프에 가장 중요한 근육이기 때문에 연구에 대퇴사 두근(QF)을 사용되었다. 마우스 모델은 4 주간의 MPTP 투여에 의해 유도된 반만성 모델이었다. 불멸화된 마우스 근모세포 주인 C2C12 세포주는 1- 메틸 -4- 페닐 피리 디늄 (MPP+) 및 TRDN siRNA 처리 후 TRDN 관련 인자의 변화를 확인하는 데 사용되었다.
2. 방법
2.1. MPTP- 유도 PD 마우스 모델 및 로타-로드(Rota-rod) 및 폴(pole) 테스트
MPTP- 유도 PD 마우스 모델은 4 주 동안 24 시간마다 MPTP-HCL (20mg / kg)을 주입하여 생성되었다. 대조군 및 MPTP 그룹에서 마우스의 상태와 운동 능력을 확인하기 위해 로타로드 및 폴 테스트를 수행했다.
도 7은 대조군과 1- 메틸-4-페닐--1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP)) 유발 파킨슨병 그룹의 로타로드 및 폴 테스트를 나타낸다.
도 7에서 (A) 로타로드(직경 28mm) 테스트는 5 분의 실행 시간 동안 10 ~ 50rpm에서 4 분 동안 Accel Forward 모드에서 수행되었다. 최종 1 분은 일정한 50rpm에서 수행되었다. (n = 5, ** P <0.005) (B) 폴 테스트에서, 기둥의 길이와 직경은 각각 548mm와 8mm였다. 마우스는 수직 나무 기둥의 상단에서 하단으로 움직였다. (n = 5, * P <0.05) Student 's t-test를 사용하여 통계 분석을 수행했다.
도 7을 통해 알 수 있는 바와 같이, 로타로드 테스트에서 MPTP 그룹의 마우스는 대조군의 마우스보다 더 빨리 떨어졌으며 평균 차이는 44 초였다. 폴 테스트에서 MPTP 그룹의 마우스는 대조군 마우스보다 평균적으로 더 빨리 바닥에 도착했다. MPTP 그룹의 생쥐는 뒷다리로 장대를 잡지 않고 아래로 미끄러져서 힘이 부족한 것으로 나타났다. 이것은 MPTP 마우스가 대조군 마우스에 비해 감소된 운동 능력을 보였음을 나타내었다.
2.2. 웨스턴 블로팅
도 8은 골격근 수축에 연결된 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 도 8에서 걷기와 점프에 중요한 대퇴사두근의 조직은 ScN (좌골 신경)과 같이 B. 웨스턴 블롯 분석에 사용되었다. (B)TRDN, RYR의 웨스턴 블롯 분석 및 CSQ1은 대조군 및 MPTP 처리 그룹의 근소포체 막에서 Ca2+ 채널의 인자이다. (C) 웨스턴 블롯 결과에 대한 단백질 수준은 막대 그래프로 나타내었다(N = 3, * P <0.05, ** P <0.005, #의 P <0.0005).
대퇴사두근의 근육 조직의 웨스턴 블롯 분석(도 8에서 (A) 참조)은 MPTP 그룹에서 TRDN, RYR 및 CSQ1의 발현 수준이 감소했음을 보여주었다(도 8에서 (B) 및 (C) 참조). RYR 및 CSQ1 수준은 대조군에 비해 50 % 이상 낮았다. TRDN, RYR 및 CSQ1이 T-tubules의 SR 막에 있는 Ca2+ 채널의 구성 요소임을 고려할 때, 이것은 ㄱ근소포체(rcoplasmic reticulum (SR)) 막에서 감소된 수준의 Ca2+ 채널을 나타낼 수 있다.
도 9은 C2C12 세포에서 다양한 1- 메틸 -4- 페닐 피리 디늄 (MPP+) 농도에서 근소포체(sarcoplasmic reticulum)의 Ca2+ 채널에 연결된 구성 요소의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 도 9에서 (A) 다양한 MPP+ 처리 농도로, 근소포체(sarcoplasmic reticulum) 막의 Ca2+ 채널의 구성 요소인 TRDN, RYR 및 CSQ1의 웨스턴 블롯 분석에서 1mM, 2.5mM, 5mM MPP+가 18 시간 동안 적용되었다. 도 9에서 (A) 웨스턴 블롯 결과를 나타내고, (B)히스토그램은 정량화된 단백질 수준을 나타내었다. (N = 3, * P <0.05, ** P <0.005)
세포 수준에서 결과를 조사하기 위해 C2C12 (마우스 myoblast) 세포를 사용했다. 신경독 MPP+로 PD 모델을 유도한 후, MPP+ 농도가 증가할 때 C2C12 세포에 대한 MPP+의 효과를 조사했다. 높은 MPP+ 농도는 C2C12 세포에서의 Ca2+ 채널의 큰 TRDN, RYR, CSQ1의 발현 수준의 감소를 유도했다(도 9 참조).
도 10은 1- 메틸 -4- 페닐 피리 디늄 (MPP+) 및 TRDN siRNA로 C2C12 세포를 처리 한 후 근소포체(sarcoplasmic reticulum) Ca2+ 채널에 연결된 구성 요소의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 10에서 (A) MPP+ 및 TRDN siRNA 적용 후, 근소포체(sarcoplasmic reticulum) 막의 단백질인 TRDN, RYR 및 CSQ1의 웨스턴 블롯 분석을 나타내었다. 음성 대조군 세포는 TRDN siRNA 처리와 동일한 조건에서 음성 대조군 siRNA (100 nM)로 처리되었다. MPP+는 18 시간 동안 1mM의 농도로 적용되었다. TRDN과 음성 대조군 siRNA의 배양 시간은 48 시간이었다. 도 10에서 (B) 히스토그램은 웨스턴 블롯 결과로부터의 정량화된 단백질 수준을 나타내었다.
NC, 음성 대조군 siRNA 처리 (2 일 동안 100 nM); TRDN siRNA 10 nM, TRDN siRNA 처리 (2 일 동안 10 nM); TRDN siRNA 100 nM, TRDN siRNA 처리 (2 일 동안 100 nM). TRDN에 대한 스텔스 siRNA (5'-UC AUG UGG GUA GAC UCA GU-3 ') 및 음성 대조군 siRNA (5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3')는 한국 바이오니아에서 구입했다. (n = 4, * P <0.05, ** P <0.005, # P <0.0005) SPSS 25의 분산 분석을 통해 통계 분석을 수행했다.
또한 TRDN siRNA를 통해 TRDN 수치가 감소했을 때 MPP+ 처리한 C2C12 세포에서 Ca2+ 채널의 성분 변화를 분석했다(도 10 참조). TRDN, RYR, CSQ1의 단백질 수준은 1mM MPP+로 처리한 C2C12 세포에서 감소했기 때문에(도 9 참조), MPP+ 처리는 도 10에서 1mM으로 동일하게 수행되었다. 10nM 또는 100nM TRDN siRNA를 MPP+ 처리 된 C2C12 세포에서는 TRDN 발현 수준도 감소했다. 또한 RYR과 CSQ1의 발현 수준도 감소했다(도 10 참조). 이것은 이 PD 모델에서 TRDN 수준이 감소하면 RYR 및 CSQ1 발현도 감소했음을 나타내었다.
이 실험예 2에서 우리는 MPTP-유도 PD 마우스 모델을 개발하고 이를 사용하여 다리 대퇴사두근 근육에서 Ca2+ 채널 성분의 발현 수준이 감소했는지 확인했다. 또한, TRDN, RYR 및 CSQ1의 발현 수준은 세포 수준에서 살펴봤을 때 C2C12 세포에서 MPP+ 처리에 의해 감소하는 것으로 나타났다.
이러한 결과는 MPTP-유도 PD 마우스 모델에서 Ca2 + 채널 성분 TRDN, RYR 및 CSQ1의 발현이 감소되었음을 나타내었다. 또한 골격근의 SR 막에서 Ca2+ 채널 발현이 감소하는 것으로 나타났다. T-tubules의 RYR과 관련된 Ca2+ 채널은 파킨슨병의 운동 이상증과 관련하여 근육의 기능에 영향을 줄 수 있음을 시사한다. 근육의 ㄱ근소포체(rcoplasmic reticulum) 루멘에서 Ca2+ 방출이 수축에 중요하기 때문에 Ca2+ 채널 발현 감소로 인해 Ca2+ 방출이 충분하지 않으면 근육 수축 조절이 손상될 수 있다. 이것은 파킨슨병 환자에게서 나타나는 증상 중 하나인 서민증 (느린 움직임)과 관련이 있을 수 있다. 그러나 Ca2+ 항상성 조절과 관련된 요인에 대한 추가 조사가 필요한다.
결론적으로, Ca2+ 채널의 성분인 RYR, TRDN, CSQ1의 발현 수준은 MPTP로 유도된 PD 마우스의 대퇴사두근 근육과 MPP+로 처리된 C2C12 세포에서 감소하였다. TRDN 수준을 낮추면 RYR 및 CSQ1 수준이 감소했으며, 이로 인해 RYR을 통한 Ca2+ 누출 및 Ca2+ 방출 채널 수준 감소가 발생할 수 있다. 또한, 이것은 세포질에서 필요한 Ca2+ 농도에 도달할 때까지 근소포체 루멘에서 Ca2+ 흡수와 근육 수축을 지연시켜 잠재적으로 이 메커니즘을 PD의 운동 증상과 관련되어 있다. 이 실험예 2에서 조사된 Ca2+ 채널의 성분인 TRDN을 복원하면 파킨슨병의 근육 기능과 관련된 증상을 완화할 수 있다.
이러한 실험예 2를 통해, 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌질환에서 실시예 1에서 설명한 TRDN 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물 및 그 치료제를 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병의 근육 기능과 관련된 증상을 완화키실 수 있는 효과를 제공하는 것을 알 수 있다.
이하, 전술한 실험예들을 참조하여, 다른 실시예들에 따른 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법 및 파킨슨병을 진단하는 진단 방법, 그 진단 키트에 대해 상세히 설명한다.
실시예2: 스크리닝하는 방법
다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 TRDN 유전자의 발현 정도에 영향을 미치는 물질들을 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법을 제공한다.
전술한 실험예에서, TRDN 발현은 MPTP- 유도 PD 마우스 모델에서 TRDN 수준이 감소되고 PD의 병리학적 특징이 감소된 TRDN 수준에 의해 유도되었다는 점에서 PD와 관련되는 것을 알 수 있다. 또한, siTRDN의 농도가 증가함에 따라, apoptosis 수준도 증가하였으므로, TRDN은 뉴런의 apoptosis와 관련되고 PD에서 apoptosis 세포 사멸과 관련되는 것을 확인할 수 있었다.
다른 실시예는, 다음의 단계를 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) 파킨슨병 모델로 생성된 실험 동물에 적어도 하나의 후보 물질을 투여하는 단계; 및
(b) TRDN 유전자의 발현량을 측정하는 단계, 상기 TRDN 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우에는
상기 후보 물질은 파킨슨병 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
파킨슨병 모델은 실험예에서 설명한 파킨슨증의 MPTP 모델일 수 있으나 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 아울러, 실험 동물은 실험예에서 설명한 마우스일 수 있으나 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
발현량의 측정은 실험예에서 기재한 바와 같이 실시할 수 있으나, 일반적인 다른 방법들에 의해 실시할 수도 있다.
실시예3: 진단 방법
또 다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 TRDN 유전자의 발현 정도로 파킨슨병을 진단하는 진단 방법을 제공한다.
또 다른 실시예에 따른 파킨슨병 진단 방법은, 대상체, 예를 들어 인간이나 동물로부터 분리한 물질, 예를 들어 혈액이나 세포 등에서 TRDN의 발현량을 측정해서 파킨슨병을 진단할 수 있다.
구체적으로, 다른 실시예에 따른 파키슨병 진단 방법은, 대상체로부터 검체를 분리하는 단계, 검체로부터 TRDN 유전자의 발현량을 측정하는 단계 및 TRDN 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우 대상체에 대해 파킨슨병으로 진단하는 단계를 포함한다.
전술한 바와 같이 검체는 대상체로부터 분리된 어떤 물질, 예를 들어 혈액이나 세포 등일 수 있다. 대상체는 인간을 포함하는 동물일 수 있다.
검체를 분리하는 단계는 일반적으로 대상체로부터 자연스럽게 분리되거나 주사기 등을 이용하여 인위적으로 검체를 분리하는 방식들을 포함할 수 있다.
검체로부터 TRDN 유전자의 발현량을 측정하는 단계에서 TRDN 유전자의 발현량을 측정하는 것은 실험예에서 설명한 일반적인 방식들일 수 있다.
대상체에 대해 파킨슨병으로 진단하는 단계에서, TRDN 유전자의 발현 수준이 통계적으로 유의미하게 조절되는 경우 대상체에 대해 파킨슨병으로 진단할 수 있다.
다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 TRDN 유전자의 발현 정도로 파킨슨병을 진단하는 진단 키트를 제공한다. 이 진단 키트는 전술한 진단 방법을 수행하는 키트로, 일반적인 진단 키트의 구성을 가질 수 있다.
본 발명은, 파킨슨병에서 도파민세포와 알파-시누클레인에 영향을 주는 TRDN을 특정해서 PD의 치료제 및 TRDN을 함유하고 있는 물질이나 TRDN 유전자 발현 기작에 영향을 미치는 효소 등의 물질들 중 유전자 발현의 감소를 막거나 증가시키는 물질을 특정해서 파킨슨병의 치료제를 제공할 수 있다.
또한 본 발명은, 특정유전자의 발 현정도에 영향을 미치는 물질들을 치료의 후보 물질로 스크리닝하는 방법 및 TRDN의 유전자 발현 수준으로 파킨슨병을 진단하는 방법 또는 진단 키트 등을 제공할 수 있다.
이상 도면을 참조하여 실시예들을 설명하였으나 본 발명은 이에 제한되지 않으며, 상기 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 TRDN 유전자를 포함하여 발현시킨 물질을 유효성분으로 포함하고,
    상기 TRDN 유전자를 포함하여 발현시킨 물질은 TRDN　유전자를 포함하는 서열에 의해 발현되는 mRNA 또는 단백질인 파킨슨병 치료용 약제학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 퇴행성 뇌질환에서 도파민세포와 알파-시누클레인을 조절하는 TRDN 유전자를 포함하여 발현시킨 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 치료용 약제학적 조성물; 및
    상기 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하고,
    상기 TRDN 유전자를 포함하여 발현시킨 물질은 TRDN　유전자를 포함하는 서열에 의해 발현되는 mRNA 또는 단백질인 파킨슨병 치료제.
  5. (a) 파킨슨병 모델로 생성된 실험 동물에 적어도 하나의 후보 물질을 투여하는 단계; 및
    (b) TRDN 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 측정하는 단계하는 단계에서, 상기 TRDN 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우에는 상기 후보 물질은 파킨슨병 예방 또는 치료용 물질로 판정되는, 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법.
  6. 대상체로부터 분리된 검체로부터 TRDN 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
    상기 TRDN 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우 상기 대상체에 대해 파킨슨병으로 진단하는 단계를 포함하는 파킨슨병 진단을 위한 정보 제공 방법.
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