KR102622408B1 - Opa1 억제에 의한 조골세포 활성화를 통한 골형성 촉진 유도용 또는 골질환 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 명세서는 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진용 및/또는 골질환 예방, 치료 및/또는 개선용 약학적 및/또는 식품 조성물을 포함하는 골형성 촉진제 및/또는 골질환 치료제에 관한 것이다. 구체적으로, 저농도의 봉크렉산 (Bongkrekic acid) 처리 및/또는 Opa1 (발현억제), Fis1 (발현증가), Bax (발현증가) 유전자의 활성조절로 미토콘드리아의 형태변화 및 분열을 유도하여, 골재생 및/또는 골형성을 촉진시킨다는 것을 처음으로 밝힌 것으로, 상기 유효성분들은 골재생 및/또는 골형성 촉진용 약학적 조성물 및 골질환의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물로 활용될 수 있다.
Description
본 명세서는 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진용 및/또는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및/또는 골형성 촉진용 및/또는 골질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
급격한 고령화로 인해 노인인구가 급증하고 있으며, 100세 시대를 맞이하는 노인의 대부분에서 골감소증으로 인한 골격계 질환으로 삶의 질이 저하되고 있다. 국내환자 수만 대략 100만 명에 달하는 대표적인 골감소증인 골다공증을 치료하기 위해 수많은 약제들이 개발되었으며, 치료제 시장 규모는 국내시장이 약 2000억원, 세계시장이 약 10조원이 넘는 것으로 추정된다.
대표적인 골다공증 치료제인 비스포스포네이트 성분의 골흡수억제제는 골밀도 증가 자체에는 효과가 있으나 Bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw (BRONJ)와 같은 심각한 부작용이 발생할 수 있기 때문에, 골흡수 억제제가 아닌 골형성을 촉진시키는 약제를 통한 골질환 치료에 대한 연구를 진행하였다.
미토콘드리아는 에너지 공급원으로서 아데노신 트라이포스페이트 (adenosine triphosphate, ATP) 합성 및 조절에 관여하는 모든 진핵세포의 생존에 필수적인 세포소기관이다. 세포 내 다양한 기능들이 미토콘드리아에 의해 조절되는데, 예를 들면, 세포신호처리, 세포주기, 세포분화, 및 세포성장 뿐만 아니라 세포사멸의 제어와도 관련되어 있다. 미토콘드리아는 주변 세포 소기관들과도 끊임없이 소통하며, 활발하게 형태를 변화시키기도 하는데, 이 과정에서 스스로 분열 (fission)하여 작은 미토콘드리아 형태로 변화하거나, 미토콘드리아 유래 소포체 (Mitochondrial-derived vesicle, MDV)를 생성하기도 한다.
척추동물의 골격을 이루는 뼈의 형태와 기능을 적절히 유지하는 것은 생명유지에 필수적이며, 뼈를 형성하는 세포인 조골세포는 이러한 뼈의 상태를 최적으로 유지하기 위해 여러 가지 물질을 분비한다. 본 발명자들은 활성화된 조골세포가 미토콘드리아 혹은 미토콘드리아에서 유래된 작은 소포체 (MDV)를 뼈가 형성될 주변으로 분비한다는 것을 발견하였고, 조골세포 유래의 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물 및 골질환 치료용 약학적 조성물을 2020년에 관련 특허를 출원 (출원번호: PCT/KR2020/007015)한 바 있다. 본 발명자는 미토콘드리아를 추출하기 위해 조골세포의 활성화를 유도하던 중 조골세포가 활성화되면 미토콘드리아의 형태가 동그란 도넛 모양으로 변화되고, 도넛 모양의 미토콘드리아가 많을수록 미토콘드리아 유래 소포체 분비 및 골형성이 증가한다는 것을 발견하였다.
봉크렉산 (Bongkrekic acid)은 발효된 코코넛이나 옥수수에서 발견되는 Burkholderia gladioli라는 세균이 생산하는 독소로 미토콘드리아에서 생산된 ATP가 미토콘드리아 밖으로 나오는 것을 억제해서 세포가 ATP를 사용하지 못하게 함으로써 세포의 기능을 억제하고 고농도에서는 사멸까지 유도할 수 있어, 인도네시아나 중국에서는 이 독소로 인한 사망사고도 보고된 바 있다. 하지만, 본 발명자는 낮은 농도의 봉크렉산을 조골세포에 처리할 경우, 조골세포가 활성화되고 골형성이 증가한다는 것을 처음으로 확인하여, 독으로 알려진 봉크렉산이 의료용으로도 사용될 수 있다는 가능성을 확인하였다.
본 발명자들은 미토콘드리아의 형태를 도넛 모양으로 변화시키거나 미토콘드리아의 분비를 증가시키는 약물을 스크리닝하였고, 봉크렉산 (Bongkrekic acid), 미토콘드리아의 형태조절에 중요한 유전자인 Opa1과 Fis1, 미토콘드리아 외막에 작용하는 유전자인 Bax 등의 활성을 조절하면 골형성을 유도할 수 있다는 것을 처음으로 확인하였다.
본 명세서는 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하고,
상기 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제는
1) 봉크렉산 (Bongkrekic acid) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염,
2) Opa1 또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제,
3) Fis1 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제 및
4) Bax 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인,
골형성 촉진용 및/또는 골질환 예방, 치료 및/또는 개선용 조성물을 제공한다.
본 명세서는 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진용 및/또는 골질환 예방, 치료 및/또는 개선용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서의 “골질환”은 골절, 골파괴증, 골다공증, 골연화증, 골관절염, 류머티즘 관절염 및/또는 골형성 장애를 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 Opa1, Fis1 (Mitochondrial fission 1) 및 Bax (bcl-2-associated X)는 각 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 의미할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니고, 특히 Opa1 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 dynamin-like 120 kDa protein일 수 있다.
본 명세세에서 Alpl은 Alpl 유전자 및 상기 유전자에 의해 암호화되는 효소 (Alkaline phosphatase, tissue-nonspecific isozyme)를 모두 의미할 수 있고, 상기 효소는 저인산효소증, 고칼슘형증 등 골질환과 직접적으로 연관되어 있다.
본 명세서에서 Ibsp는 Ibsp 유전자 및 상기 유전자에 의해 암호화되는 Bone sialoprotein를 모두 의미할 수 있고, 상기 유전자의 조절은 뼈 기질의 무기질화 및 뼈 종양의 성장에 중요하다.
본 명세서에서 “봉크렉산 (Bongkrekic acid)”는 발효 코코넛 또는 박테리아 Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans에 의해 오염된 옥수수에서 생성되는 호흡기 독소를 의미하고, 미토콘드리아 ADP/ATP 운반체라고도 불리는 ADP/ATP translocase를 억제하여 ATP가 미토콘드리아를 떠나 세포의 나머지 부분에 대사 에너지를 제공하는 것을 방지하기 때문에 독성이 높다.
본 명세서에서 단백질은 항체, 항체 단편, 또는 이의 유사체 등의 형태를 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 유전자는 DNA, RNA (예컨대, siRNA, microRNA, shRNA 등), PNA (peptide nucleic acid), 앱타머 등의 형태를 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 mRNA는 인위적으로 합성된 형태, 천연적으로 획득할 수 있는 형태일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
의약 용도
일 예는 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하고,
상기 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제는
1) 봉크렉산 (Bongkrekic acid) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염,
2) Opa1 또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제,
3) Fis1 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제 및
4) Bax 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물의 Opa1 또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제는 Opa1 유전자를 타겟으로 하는 Small-interfering RNAs (siRNAs), microRNAs (miRNAs), antisense oligonucleotides (ASOs), 및 aptamers로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물의 Fis1 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제는 Fis1 유전자를 암호화하는 mRNA 및 이를 운반하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물의 Bax 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제는 Bax 유전자를 암호화하는 mRNA 및 이를 운반하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 도넛 모양으로 변화된 조골세포 유래 미토콘드리아의 비율을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 “도넛 모양”은 조골세포 유래 미토콘드리아 중에서 원형도 ((4 x 미토콘드리아의 넓이)/(π x (FeretMax)2)) 값이 0.5 내지 1 및/또는 하나 이상의 구멍이 형성된 형태인 것을 의미할 수 있다 (FeretMax는 최대 페럿 직경 (Feret diameter)을 의미).
상기 약학적 조성물은 원형도 값이 0.5 내지 1 및/또는 하나 이상의 구멍이 형성된 조골세포 유래 미토콘드리아의 비율을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 상기 봉크렉산을 0.1 내지 1000μM, 0.1 내지 500μM, 0.1 내지 200μM, 0.1 내지 100μM, 0.1 내지 70μM, 0.1 내지 50μM, 0.1 내지 45μM, 1 내지 1000μM, 1 내지 500μM, 1 내지 200μM, 1 내지 100μM, 1 내지 70μM, 1 내지 50μM, 1 내지 45μM, 10 내지 1000μM, 10 내지 500μM, 10 내지 200μM, 10 내지 100μM, 10 내지 70μM, 10 내지 50μM, 10 내지 45μM, 30 내지 1000μM, 30 내지 500μM, 30 내지 200μM, 30 내지 100μM, 30 내지 70μM, 30 내지 50μM, 30 내지 45μM, 35 내지 1000μM, 35 내지 500μM, 35 내지 200μM, 35 내지 100μM, 35 내지 70μM, 35 내지 50μM 또는 35 내지 45μM의 농도, 예를 들어 40μM의 농도로 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 Alpl 및 Ibsp로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현 증가 효과가 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 골형성 촉진용 및/또는 골질환 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, “치료”는 질병 상태 또는 증상의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장, 질환 범위의 감소, 질병 진행의 지연 또는 완화, 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다. “예방”은 특정 질병을 갖지 않는 대상에게 작용하여 상기 특정 질병이 발병하지 않도록 하거나, 그 발병 시기를 늦추거나, 발병 빈도를 낮추는 모든 기작 및/또는 효과를 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 제공되는 약학적 조성물 내의 유효성분으로 사용된 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제의 함량은 사용 형태 및 목적, 사용 대상의 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 (추출물에서 용매를 제거한 고형성분) 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 0.001 내지 90 중량%, 0.001 내지 75 중량%, 0.001 내지 50 중량%, 0.01 내지 99.9 중량%, 0.01 내지 90 중량%, 0.01 내지 75 중량%, 0.01 내지 50 중량%, 0.1 내지 99.9 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 0.1 내지 75 중량%, 0.1 내지 50 중량%, 1 내지 99.9 중량%, 1 내지 90 중량%, 1 내지 75 중량%, 1 내지 50 중량%, 5 내지 99.9 중량%, 5 내지 90 중량%, 5 내지 75 중량%, 5 내지 50 중량%, 10 내지 99.9 중량%, 10 내지 90 중량%, 10 내지 75 중량%, 또는 10 내지 50 중량% 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제의 함량은 상기 약학적 조성물을 투여하는 대상의 체중 기준으로 0.001 내지 400 mg/kg (body weight; BW), 1 내지 400 mg/kg, 50 내지 400 mg/kg, 100 내지 400 mg/kg, 0.001 내지 300 mg/kg, 1 내지 300 mg/kg, 50 내지 300 mg/kg, 100 내지 300 mg/kg, 0.001 내지 200 mg/kg, 1 내지 200 mg/kg, 50 내지 200 mg/kg, 100 내지 200 mg/kg, 0.001 내지 100 mg/kg, 1 내지 100 mg/kg 또는 50 내지 100 mg/kg일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물 또는 유효성분인 조골세포 활성화를 촉진하는 제제는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼 등의 설치류, 이외의 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말, 염소 등을 포함하는 포유류, 닭, 오리, 거위 등을 포함하는 조류, 뱀, 도마뱀, 거북, 악어 등을 포함하는 파충류, 양서류, 및 어류 등의 척추동물에서 선택된 투여 대상에 다양한 경로로 투여될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물의 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 정맥, 근육, 또는 피하 주사, 또는 국소 주입 등의 비경구 투여의 경로로 투여될 수 있다. 일 예에서, 상기 약학적 조성물은 골형성이 필요한 부위 또는 골질환 부위에 투여 (예컨대, 주사제 형태로 주입 등)를 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 주사제 (예컨대, 멸균 주사용액 등)의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 앞서 설명한 유효성분 이외에도, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행 (Standard pharmaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및 희석제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조제와 혼합되어 투여될 수 있다. 예컨대, 상기 약제학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있고 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 글리세롤, 에탄올 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 담체일 수 있다.
상기 약제학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 희석제 및/또는 부형제는 약학적 조성물의 적절한 제제화에 통상적으로 사용되는 모든 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 윤할제, 계면활성제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제 등의 경구투여를 위한 고형 제제의 경우, 상기 부형제는 이러한 고형 제제의 제제화를 위한 적어도 1종 이상의 물질, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose), 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이외에도, 마그네슘 스티레이트 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 또한, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등의 경구투여를 위한 액상제제의 제제화의 경우, 통상적으로 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있고, 이외에, 통상적으로 사용되는 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 및/또는 보존제 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, 상기 약학적 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 적절한 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강내 또는 혀밑 투여될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제 (예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔 (Witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유 (Apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제형화 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 약학적 조성물을 이용한 비경구용 제제는 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 약학적 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 명세서의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 (ampoule) 또는 바이알 (vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 약학적 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.
본 명세서의 약학적 조성물을 연고, 크림, 도포용 파우더, 오일, 피부 외용제 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 순서와 관계없이 연속적으로 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 명세서의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로 투여할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한, 특별한 제한 없이 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 약학적 조성물의 비경구 투여 방법으로는, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 약학적 조성물은 단독으로 사용할 수 있으나, 치료 효율을 증가시키기 위하여 추가적으로 방사선 요법, 화학 요법 등의 다양한 피부 노화 예방 또는 치료 방법 및/또는 상처 치료 방법들과 병용하여 사용할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
식품 조성물
일 예는 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하고,
상기 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제는
1) 봉크렉산 (Bongkrekic acid) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염,
2) Opa1 또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제,
3) Fis1 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제 및
4) Bax 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물의 Opa1 또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제는 Opa1 유전자를 타겟으로 하는 Small-interfering RNAs (siRNAs), microRNAs (miRNAs), antisense oligonucleotides (ASOs), 및 aptamers로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식품 조성물의 Fis1 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제는 Fis1 유전자를 암호화하는 mRNA 및 이를 운반하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식품 조성물의 Bax 또는 이를 암호화하는 유전자의 활성화제는 Bax 유전자를 암호화하는 mRNA 및 이를 운반하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식품 조성물은 도넛 모양으로 변화된 조골세포 유래 미토콘드리아의 비율을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 “도넛 모양”은 조골세포 유래 미토콘드리아 중에서 원형도 ((4 x 미토콘드리아의 넓이)/(π x (FeretMax)2)) 값이 0.5 내지 1 및/또는 하나 이상의 구멍이 형성된 형태인 것을 의미할 수 있다 (FeretMax는 최대 페럿 직경 (feret diameter)를 의미).
상기 식품 조성물은 원형도 값이 0.5 내지 1 및/또는 하나 이상의 구멍이 형성된 조골세포 유래 미토콘드리아의 비율을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식품 조성물은 상기 봉크렉산을 0.1 내지 1000μM, 0.1 내지 500μM, 0.1 내지 200μM, 0.1 내지 100μM, 0.1 내지 70μM, 0.1 내지 50μM, 0.1 내지 45μM, 1 내지 1000μM, 1 내지 500μM, 1 내지 200μM, 1 내지 100μM, 1 내지 70μM, 1 내지 50μM, 1 내지 45μM, 10 내지 1000μM, 10 내지 500μM, 10 내지 200μM, 10 내지 100μM, 10 내지 70μM, 10 내지 50μM, 10 내지 45μM, 30 내지 1000μM, 30 내지 500μM, 30 내지 200μM, 30 내지 100μM, 30 내지 70μM, 30 내지 50μM, 30 내지 45μM, 35 내지 1000μM, 35 내지 500μM, 35 내지 200μM, 35 내지 100μM, 35 내지 70μM, 35 내지 50μM 또는 35 내지 45μM의 농도, 예를 들어 40μM의 농도로 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식품 조성물은 Alpl 및 Ibsp로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현 증가 효과가 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식품 조성물은 골형성 촉진용 및/또는 골질환 예방 및/또는 개선용 식품 조성물일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공되는 식품 조성물에서, 용어 "식품"은 영양소를 한 가지 이상 함유하고 있는 식용의 천연물 또는 가공품을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 일반 식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제, 음료 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 의미하기 위하여 사용될 수 있다. 용어 "식품 조성물"은 상기 식품을 제조하기 위한 재료의 조합을 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 식품은 건강기능식품을 의미할 수 있다.
상기 식품 조성물 내의 유효성분으로 사용된 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제의 함량은 식품사용 형태, 목적 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 예컨대, 고형분 중량 기준으로 0.00001 내지 99.9 중량%, 0.0001 내지 99.9 중량%, 0.001 내지 99.9 중량%, 또는 0.001 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제의 함량은 상기 식품 조성물을 투여하는 대상의 체중 기준으로 0.001 내지 400 mg/kg (body weight; BW), 1 내지 400 mg/kg, 50 내지 400 mg/kg, 100 내지 400 mg/kg, 0.001 내지 300 mg/kg, 1 내지 300 mg/kg, 50 내지 300 mg/kg, 100 내지 300 mg/kg, 0.001 내지 200 mg/kg, 1 내지 200 mg/kg, 50 내지 200 mg/kg, 100 내지 200 mg/kg, 0.001 내지 100 mg/kg, 1 내지 100 mg/kg 또는 50 내지 100 mg/kg일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식품 조성물의 투여 '대상'은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼 등의 설치류, 이외의 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말, 염소 등을 포함하는 포유류, 닭, 오리, 거위 등을 포함하는 조류, 뱀, 도마뱀, 거북, 악어 등을 포함하는 파충류, 양서류, 및 어류 등의 척추동물 중에서 선택된 개체, 상기 개체로부터 분리된 세포, 조직, 또는 세포 배양물 등일 수 있다.
본 명세서의 조성물은 조골세포의 활성화를 촉진하는 효과가 있으며, 구체적으로 골형성 촉진 및/또는 골질환의 예방, 치료 및/또는 개선 효과가 있다.
도 1a 내지 1c는 조골세포에 siOpa1, pCMV-fis1 및 siFis1을 각각 형질주입하거나 봉크렉산을 첨가한 후 조골세포 유래 미토콘드리아를 관찰한 결과를 보여주는 사진이다. siCtrl은 siOpa1 및 siFis1에 대한 대조군, Ctrl (Tris)는 봉크렉산에 대한 대조군, pCMV-Ctrl은 pCMV-fis1에 대한 대조군을 의미한다.
도 1d 및 1e는 조골세포에 siOpa1, pCMV-fis1 및 siFis1을 각각 형질주입하거나 봉크렉산을 첨가한 후 조골세포 유래 미토콘드리아의 형태 변화를 정량적으로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다. siCtrl은 siOpa1 및 siFis1에 대한 대조군, Ctrl은 봉크렉산에 대한 대조군, pCMV-Ctrl은 pCMV-fis1에 대한 대조군을 의미한다.
도 2a, 3a, 3c 및 4a는 조골세포에 siOpa1, siFis1 및 pCMV-Fis1을 각각 형질주입하거나 봉크렉산을 첨가한 후 alkaline phosphatase (ALP)를 염색한 조골세포를 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 2b, 3b, 3d 및 4b는 조골세포에 siOpa1, siFis1 및 pCMV-Fis1을 각각 형질주입하거나 봉크렉산을 첨가한 후 qRT-PCR을 수행하여 골형성 마커의 발현을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5a, 5b는 조골세포에 siBax 및 pCMV-Bax를 각각 형질주입한 후 alkaline phosphatase (ALP)를 염색한 조골세포를 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 6은 Opa1, Fis1, Bax 및 bongkrekic acid가 미토콘드리아에 미치는 효과 및 이에 따른 골형성을 표현하는 모식도이다.
도 1d 및 1e는 조골세포에 siOpa1, pCMV-fis1 및 siFis1을 각각 형질주입하거나 봉크렉산을 첨가한 후 조골세포 유래 미토콘드리아의 형태 변화를 정량적으로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다. siCtrl은 siOpa1 및 siFis1에 대한 대조군, Ctrl은 봉크렉산에 대한 대조군, pCMV-Ctrl은 pCMV-fis1에 대한 대조군을 의미한다.
도 2a, 3a, 3c 및 4a는 조골세포에 siOpa1, siFis1 및 pCMV-Fis1을 각각 형질주입하거나 봉크렉산을 첨가한 후 alkaline phosphatase (ALP)를 염색한 조골세포를 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 2b, 3b, 3d 및 4b는 조골세포에 siOpa1, siFis1 및 pCMV-Fis1을 각각 형질주입하거나 봉크렉산을 첨가한 후 qRT-PCR을 수행하여 골형성 마커의 발현을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5a, 5b는 조골세포에 siBax 및 pCMV-Bax를 각각 형질주입한 후 alkaline phosphatase (ALP)를 염색한 조골세포를 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 6은 Opa1, Fis1, Bax 및 bongkrekic acid가 미토콘드리아에 미치는 효과 및 이에 따른 골형성을 표현하는 모식도이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예에서 진행한 통계분석의 모든 값은 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 표시하였고 Tukey의 사후 테스트를 통한 일원 분산 분석을 2개 이상의 그룹에 대한 통계 분석을 위해 수행하였고 Student’s t 테스트를 2개 그룹의 통계 분석에 대해 수행하였다. P < 0.05인 경우 유의한 것으로 판단하였다.
실시예 1. 두개골 유래 조골세포의 추출
조골세포 미토콘드리아의 형태 변화를 확인하기 위해 미토콘드리아 기질에서만 특이적으로 녹색형광단백질 (GFP)이 발현되도록 형질전환 마우스를 준비하였다. 구체적으로, lgs1CKI-mitoGFP이 knock-in된 C57BL/6 암컷 형질전환 마우스 (lgs1CKI-mitoGFP/CKI-mitoGFP)를 Jeremy Nathans (Johns Hopkins University School of Medicine, MD)으로부터 제공받고, Col1a1-Cre 수컷 마우스를 한국생명공학연구원에서 제공받았고, 2.3kb 뮤린 Col1a1 프로모터를 사용하여 상기 마우스에서 Col1a1-Cre가 발현하도록 준비하였다. 준비된 상기 C57BL/6 암컷 형질전환 마우스와 Col1a1-Cre 수컷 마우스를 교배시켜, 조골세포의 미토콘드리아에서만 조건부로 GFP를 발현하는 갓 태어난 형질전환 마우스 (Col1a1-Cre; Igs1CKI-mito-GFP/+)를 준비하였다. 모든 동물 연구는 서울대학교 Institutional Animal Care and Use Committees의 승인을 받았다.
상기 준비한 미토콘드리아에서만 조건부로 GFP를 발현하는 형질전환 마우스의 두개골 세포를 0.25% 트립신 (Gibco)에 10분동안 처리한 후 용액을 제거하고, 2mg/mL의 제2형 콜라겐분해효소 (type 2 collagenase, Worthington)에 30분동안 배양한 후 용액을 제거하여 골조직에서 불순물을 제거한 후, 다시 제2형 콜라겐분해효소로 60분 동안 골조직을 배양하였다. 골조직에서 분리되어 나온 세포를 1300 rpm 속도로 3분간 원심분리하여 수집한 후 세포를 혈청 위에 놓고 원심분리하여 잔해물을 제거하였고, 골조직에서 분리된 모든 세포를 살아있으면서 미토콘드리아에 GFP를 발현하는 조골세포만을 분리하기 위하여, 7AAD (Bio-Legend)로 10분동안 염색 (죽은 세포만 염색됨) 후, 초고속 유세포 자동 분리기 (Fluorescence-activated cell sorting, FACS)를 사용하였다. 이때, 비슷한 모양과 크기를 가지는 세포를 분리하고, 이 중에서 살아있는 세포들 (7-AAD negative cells)만을 선택하여, GFP를 발현하는 조골세포와 GFP를 발현하지 않는 비조골세포로 분리한 후, GFP를 발현하는 조골세포만을 수집하였다.
실시예 2. 조골세포의 분화과정 동안 미토콘드리아의 형태 변화 확인
실시예 2-1. 조골세포 분화 및 형질주입
상기 실시예 1에서 추출한 조골세포를 10% fetal bovine serum (Gibco) 및 100U/mL의 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin, Gibco)이 첨가된 alpha MEM (Minimum Essential Media, Hyclone)으로 구성된 배지에서 5일동안 분화를 유도하였다. 구체적으로 상기 분화용 배지는 50μg/mL의 ascorbic acid (Amreasco), 5mM의 beta-glycerophosphate (Sigma), 10% fetal bovine serum (Gibco) 및 100 U/mL의 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin, Gibco)이 첨가된 alpha MEM으로 구성되어 있으며 5일동안 분화를 유도하여 준비하였다.
상기 분화를 유도할 때 미토콘드리아의 융합 (fusion)을 유도하는 Opa1 (dynamin-like 120 kDa protein) 유전자와 미토콘드리아 분열 (fission)을 유도하는 Fis1 (Mitochondrial fission 1 protein) 유전자의 발현을 억제하는 짧은 간섭 RNA (siRNA) (각각 siOpa1, siFis1)를 1mL당 300,000개의 조골세포에 Lipofectamine RNAiMAX Reagent (Invitrogen)를 이용하여 분화와 동시에 각각 30nM로 형질주입 (transfection) 하였으며, 미토콘드리아의 분열을 증가시키기 위한 pCMV-Fis1 플라스미드 (한국인간유전자은행)를 1mL당 300,000개의 조골세포에 TransIT®-LT1 Transfection Reagent (Mirus)를 이용하여 분화와 동시에 1μg/mL로 형질주입하여 Fis1 유전자를 과발현시켰다. 또한, 별도로 상기 준비한 조골세포에 Tris 용액 기반의 Bongkrekic acid (Sigma, B6179, USA)를 40μM의 농도로 분화와 동시에 처리하였다. 상기 siRNA의 대조군으로 control siRNA를 상기 siRNA와 실질적으로 동일한 방법으로 형질주입한 조골세포, 상기 플라스미드의 대조군으로 유전자가 삽입되지 않은 pCMV-SPORT6 empty vector 플라스미드를 상기 pCMV-Fis1 플라스미드와 실질적으로 동일한 방법으로 형질주입한 조골세포, 상기 Bongkrekic acid의 대조군으로 0.01M Tris 용액을 처리한 조골세포를 준비하였다. 상기 siRNA들은 대한민국 Bioneer에서 구입하여 제조사의 지침에 따라 Lipofectamine RNAimax (Invitrogen, USA)를 사용하여 형질주입 시킨 것이고, 해당 siRNA의 구체적인 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
siRNA 이름 | ID number (Bioneer siRNA IDs) |
RNA accession | 염기서열 (5’ → 3’) | 서열번호 |
siOpa1 Forward | 74143-1 | NM_001199177.1 NM_133752.3 |
guguucacaacgaaaccaatt | 1 |
siOpa1 Reverse | uugguuucguugugaacactt | 2 | ||
siFis1 Forward | 66437-1 | NM_001163243.1 NM_001347504.1 NM_025562.3 |
cugauugauaaggccaugatt | 3 |
siFis1 Reverse | ucauggccuuaucaaucagtt | 4 | ||
control siRNA Forward | SN-1002 (카탈로그 번호) |
- | - | - |
control siRNA Reverse | - | - |
상기 pCMV-Fis1 플라스미드는 한국 인간 유전자 은행에서 구입한 전장 마우스 Fis1 cDNA (ID: mMU002771)를 사용한 것이고, 제조업체의 지침에 따라 TransIT-LT1 형질 감염 시약 (Mirus Bio, USA)을 사용하여 조골세포로 형질주입 시켰다. 상기 pCMV-SPORT6 empty vector 플라스미드를 상기 pCMV-Fis1 (ID: mMU002771)에서 EcoRI과 MfeI 제한효소로 Fis1 유전자를 제거하고 다시 붙이는 방식으로 제작하였다.
실시예 2-2. 조골세포 형광 이미징
상기 실시예 2-1에서 형질주입 또는 약물처리 등을 통해 준비한 조골세포와 각각의 대조군을 4% 파라포름알데하이드 용액에 고정하고 DAPI Fluoremount-G® (Southern Biotech, 0100-20, USA)를 장착하여 핵을 염색하였다. Plan-Apochromat 63x/1.4 numerical aperture 오일 대물렌즈가 장착된 Zeiss LSM 800 공 초점 현미경 (Zeiss, Germany)을 사용하여 Airyscan 모드에서 이미지를 촬영하였다. 상기 촬영된 조골세포 샘플은 유리 바닥 접시 (MatTek; P35G-1.5-14-C, USA, or SPL; 101350, Korea)에서 배양되었다. 모든 촬영에서, 488nm 레이저는 미토콘드리아 매트릭스 GFP를 감지하기 위해 사용하였고, 405nm 레이저는 DAPI를 감지하기 위해 사용하였다. 상기 촬영한 이미지는 Zeiss Zen 3.1 (blue edition) 소프트웨어 (Zeiss, Germany)를 사용하여 조골세포에서 미토콘드리아 길이 (섬유 길이 기능 사용)와 도넛 모양의 미토콘드리아의 수를 분석하였다. 다음 두 조건을 충족하면 도넛 모양의 미토콘드리아로 판단하였다: 원형도 값이 0.5 내지 1이고, 구멍의 수가 1이상. 모든 분석은 수동으로 상기 소프트웨어에 의해 분석되었다.
실시예 2-3. 결과
상기 실시예 2-2에서 Zeiss LSM 800 공 초점 현미경 (Zeiss, Germany)을 사용하여 이미지를 촬영한 결과를 도 1a 내지 1c에 나타내었다. siOpa1 및 pCMV-Fis1 플라스미드가 각각 형질주입된 조골세포와 봉크렉산이 첨가된 조골세포에서 대조군에 비해 미토콘드리아의 분열과 도넛 모양의 미토콘드리아 (donut-shaped mitochondria)의 형성이 증가하였으며, siFis1이 형질주입된 조골세포에서는 대조군에 비해 미토콘드리아의 분열과 도넛 모양의 미토콘드리아의 형성이 유의미하게 감소하였다
상기 실시예 2-2에서 Zeiss Zen 3.1 소프트웨어 (Zeiss)를 이용하여 미토콘드리아의 형태 변화를 정량적으로 분석한 결과를 도 1d 및 1e에 나타내었다. siOpa1 및 pCMV-Fis1 플라스미드가 각각 형질주입된 조골세포와 봉크렉산이 첨가된 조골세포에서 각각의 대조군에 비해 미토콘드리아의 분열 (fission)이 유의미하게 증가하였으며 siFis1이 형질주입된 조골세포에서는 대조군에 비해 미토콘드리아의 분열이 유의미하게 감소하였다. 또한, siOpa1 및 pCMV-Fis1 플라스미드가 각각 형질주입된 조골세포와 봉크렉산이 첨가된 조골세포에서 각각의 대조군에 비해 도넛 모양의 미토콘드리아 (donut-shaped mitochondria)가 각각 유의미하게 증가하였으며, siFis1이 형질주입된 조골세포에서는 대조군에 비해 도넛 모양의 미토콘드리아가 유의미하게 감소하였다.
실시예 3. 조골 세포의 골형성 활성도 평가
실시예 3-1. 조골세포 형질주입 및 분화
상기 실시예 1에서 추출한 조골세포에 상기 실시예 2-1과 실질적으로 동일한 방법으로 30nM의 siOpa1, siFis1, 1μg/mL의 pCMV-Fis1 플라스미드를 각각 형질주입하고, 별도의 조골세포에 40μM의 봉크렉산을 처리하고, 추가적으로 상기 실시예 1에서 추출한 조골세포에 30nM의 Bax (Bcl-2-associated X)의 siRNA인 siBax, 1μg/mL의 pCMV-Bax 플라스미드 (한국 인간 유전자 은행, ID: mMU001857)를 각각 형질주입하고, 상기 실시예 2-1의 10% fetal bovine serum (Gibco) 및 100U/mL의 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin, Gibco)이 첨가된 alpha MEM (Minimum Essential Media, Hyclone)으로 구성된 배지에서 상기 조골세포들의 분화를 5일동안 유도하였다. 상기 siRNA의 대조군으로 상기 실시예 2-1의 control siRNA를 상기 siRNA와 실질적으로 동일한 방법으로 형질주입한 조골세포, 상기 플라스미드의 대조군으로 유전자가 삽입되지 않은 pCMV-SPORT6 empty vector 플라스미드를 상기 pCMV-Fis1 플라스미드와 실질적으로 동일한 방법으로 형질주입한 조골세포, 상기 Bongkrekic acid의 대조군으로 0.01M Tris 용액을 처리한 조골세포를 준비하였다. 상기 Bax (Bcl-2-associated X)의 siRNA인 siBax의 구체적인 정보는 하기 표 2에 나타내었다.
siRNA 이름 | ID number (Bioneer siRNA IDs) |
RNA accession | 염기서열 (5’ → 3’) | 서열번호 |
siBax Forward | 12028-1 | NM_007527.3 | gcugcagaggaugauugcutt | 5 |
siBax Reverse | agcaaucauccucugcagctt | 6 |
실시예 3-2. alkaline phosphatase (ALP) 염색
상기 실시예 3-1에서 분화를 유도한 조골세포의 골형성 활성을 확인하기 위해 골형성 마커인 alkaline phosphatase (ALP)의 염색을 수행하고 관찰하였다. 구체적으로, ALP 염색은 1mg의 Naphthol AS-MX phosphate (Sigma)를 100μL의 N,N-dimethylformamide (Sigma)에 용해시킨 후, 2 mL의 0.1% Fast blue BB salt (Sigma) 용액을 첨가한 후 37℃에서 30분 동안 진행하였다. 염색의 진한 정도로 골형성 활성을 확인하였고, 염색이 진하게 될수록 ALP의 발현이 높은 것으로 평가하였다.
실시예 3-3. 실시간 중합효소 연쇄반응 (Quantitative RT-PCR, qRT-PCR)
상기 실시예 3-2에서 ALP 염색을 수행한 조골세포의 유전자 발현 수준을 평가하기 위해 qRT-PCR을 수행하였다. QIAzol Lysis Reagent (Qiagen, Germany) 및 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 상기 세포에서 전체 RNA를 추출하고, 제조업체 지침에 따라 PrimeScript RT Reagent Kit (Takara, Japan)를 사용하여 cDNA를 준비하였다. TB Green Premix Ex Taq II (Takara, Japan) 및 StepOnePlus Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)을 사용하여 Quantitative RT-PCR을 수행하였다. 상대적 유전자 발현은 18S rRNA로 정규화하여 표준 2(-ΔΔCt) 계산을 사용하여 결정되었고, 사용된 프라이머 정보를 하기 표 3에 구체적으로 나타내었다.
유전자이름 | 염기서열 (5’ → 3’) | 서열번호 |
Alpl F_primer | ccaactcttttgtgccagaga | 7 |
Alpl R_primer | ggctacattggtgttgagctttt | 8 |
Ibsp F_primer | cagggaggcagtgactcttc | 9 |
Ibsp R_primer | agtgtggaaagtgtggcgtt | 10 |
실시예 3-4. 조골세포 염색정도 및 분화와 관련된 유전자 발현 수준 평가
상기 실시예 3-2에서 ALP 염색한 조골세포를 관찰한 결과를 도 2a, 3a, 3c, 4a, 5a 및 5b에 나타내었다. siOpa1을 형질주입한 조골세포, pCMV-Fis1 플라스미드를 형질주입한 조골세포, pCMV-Bax 플라스미드를 형질주입한 조골세포 및 봉크렉산을 처리한 조골세포의 경우 각각 대조군에 비해 염색정도가 더 강하게 나타났고, siFis1을 형질주입한 조골세포 및 siBax를 형질주입한 조골세포의 경우 각각 대조군에 비해 염색정도가 더 약하게 나타났다.
상기 실시예 3-3에서 qRT-PCR을 수행하여 유전자 발현수준을 평가한 결과를 도 2b, 3b, 3d 및 4b에 나타내었다. siOpa1을 형질주입한 조골세포, pCMV-Fis1 플라스미드를 형질주입한 조골세포 및 봉크렉산을 처리한 조골세포의 경우 각각 대조군에 비해 골형성 마커로 알려진 Alpl, Ibsp의 발현이 유의미하게 증가하였고, siFis1을 형질주입한 조골세포의 경우 대조군에 비해 Alpl, Ibsp의 발현이 유의미하게 감소하였다. 이러한 결과를 통해 Opa1 유전자 발현의 억제, Fis1 유전자 발현의 촉진, Bax 유전자 발현의 촉진 및 봉크렉산 처리를 통해 미토콘드리아의 분열 및 도넛 모양이 형성되고 이를 통해 조골세포 골형성 활성도를 증가시킨다는 것을 확인하였다. 상기 실험을 통해 확인한 유전자 및 봉크렉산(Bongkrekic acid)이 미토콘드리아에 미치는 효과 및 이에 따른 골형성을 표현한 모식도를 도 6에 나타내었다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> Composition for promoting bone formation or treating bone disease
by acting on osteoblast mitochondria
<130> DPP20210572KR
<160> 10
<170> koPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siOpa1 Forward
<400> 1
guguucacaa cgaaaccaat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siOpa1 Reverse
<400> 2
uugguuucgu ugugaacact t 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siFis1 Forward
<400> 3
cugauugaua aggccaugat t 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siFis1 Reverse
<400> 4
ucauggccuu aucaaucagt t 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siBax Forward
<400> 5
gcugcagagg augauugcut t 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siBax Reverse
<400> 6
agcaaucauc cucugcagct t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alpl F_primer
<400> 7
ccaactcttt tgtgccagag a 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alpl R_primer
<400> 8
ggctacattg gtgttgagct ttt 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ibsp F_primer
<400> 9
cagggaggca gtgactcttc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ibsp R_primer
<400> 10
agtgtggaaa gtgtggcgtt 20
Claims (8)
- 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하고,
상기 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제는 Opa1 또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제를 포함하고,
상기 Opa1 또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제는 Opa1 유전자를 타겟으로 하는 Small-interfering RNAs (siRNAs)인 것인, 골형성 촉진용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서, 원형도 ((4 x 미토콘드리아의 넓이)/(π x (최대 페럿 직경)2)) 값이 0.5 내지 1 또는 하나 이상의 구멍이 형성된 조골세포 유래 미토콘드리아의 비율을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 골형성 촉진용 약학적 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, Alpl 및 Ibsp로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현 증가 효과가 있는, 골형성 촉진용 약학적 조성물.
- 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하고,
상기 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제는
Opa1 또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제를 포함하고,
상기 Opa1 또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제는 Opa1 유전자를 타겟으로 하는 Small-interfering RNAs (siRNAs)인 것인, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로,
상기 골질환은 골절, 골파괴증, 골다공증, 골연화증, 골관절염, 류머티즘 관절염, 또는 골형성 장애인, 조성물. - 제4항에 있어서, 원형도 ((4 x 미토콘드리아의 넓이)/(π x (최대 페럿 직경)2)) 값이 0.5 내지 1 또는 하나 이상의 구멍이 형성된 조골세포 유래 미토콘드리아의 비율을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, Alpl 및 Ibsp로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현 증가 효과가 있는, 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하고,
상기 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제는
Opa1 또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제를 포함하고,
상기 Opa1 또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제는 Opa1 유전자를 타겟으로 하는 Small-interfering RNAs (siRNAs)인 것인, 골형성 촉진용 식품 조성물. - 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제를 유효성분으로 포함하고,
상기 조골세포의 활성화를 촉진하는 제제는
Opa1 또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제를 포함하고,
상기 Opa1 또는 이를 암호화하는 유전자의 억제제는 Opa1 유전자를 타겟으로 하는 Small-interfering RNAs (siRNAs)인 것인, 골질환 예방 또는 개선용 식품 조성물로,
상기 골질환은 골절, 골파괴증, 골다공증, 골연화증, 골관절염, 류머티즘 관절염, 또는 골형성 장애인, 조성물.
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