KR20220136701A - Srpk3을 포함하거나 조절하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 - Google Patents
Srpk3을 포함하거나 조절하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220136701A KR20220136701A KR1020210042660A KR20210042660A KR20220136701A KR 20220136701 A KR20220136701 A KR 20220136701A KR 1020210042660 A KR1020210042660 A KR 1020210042660A KR 20210042660 A KR20210042660 A KR 20210042660A KR 20220136701 A KR20220136701 A KR 20220136701A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- srpk3
- disease
- parkinson
- expression
- alpha
- Prior art date
Links
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 title claims abstract description 132
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title claims abstract description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 92
- 102000003802 alpha-Synuclein Human genes 0.000 claims description 69
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 claims description 69
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- 210000004002 dopaminergic cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 claims description 13
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 claims description 13
- 102100023017 SRSF protein kinase 3 Human genes 0.000 claims description 11
- 101710190448 SRSF protein kinase 3 Proteins 0.000 claims description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 abstract description 7
- PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Chemical compound C1N(C)CCC(C=2C=CC=CC=2)=C1 PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 34
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 26
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 21
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 20
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 20
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 16
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- FMGYKKMPNATWHP-UHFFFAOYSA-N Cyperquat Chemical compound C1=C[N+](C)=CC=C1C1=CC=CC=C1 FMGYKKMPNATWHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 10
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 7
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000006733 dopaminergic cell loss Effects 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 108010011505 fluorescein-avidin Proteins 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007873 MPTP Poisoning Diseases 0.000 description 2
- 102100021833 Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 101710155665 Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 2
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 description 2
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- -1 etc. Substances 0.000 description 2
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000004558 lewy body Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 2
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000012132 radioimmunoprecipitation assay buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- KOWJANGMTAZWDT-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin-1-ium;chloride Chemical compound Cl.C1N(C)CCC(C=2C=CC=CC=2)=C1 KOWJANGMTAZWDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VSWICNJIUPRZIK-UHFFFAOYSA-N 2-piperideine Chemical compound C1CNC=CC1 VSWICNJIUPRZIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 1
- 206010006100 Bradykinesia Diseases 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 235000019739 Dicalciumphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 1
- 101100456626 Homo sapiens MEF2A gene Proteins 0.000 description 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 206010061296 Motor dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 208000016285 Movement disease Diseases 0.000 description 1
- 101100079042 Mus musculus Myef2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010052904 Musculoskeletal stiffness Diseases 0.000 description 1
- 102100021148 Myocyte-specific enhancer factor 2A Human genes 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102000015097 RNA Splicing Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039259 RNA Splicing Factors Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101150110423 SNCA gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- ZRWYZCPYGPNQQF-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine hydrogen peroxide Chemical compound OO.NNC1=CC=C(C2=CC=C(NN)C=C2)C=C1 ZRWYZCPYGPNQQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000013404 behavioral symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L calcium stearate Chemical compound [Ca+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013539 calcium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008116 calcium stearate Substances 0.000 description 1
- 239000007963 capsule composition Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- NEFBYIFKOOEVPA-UHFFFAOYSA-K dicalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O NEFBYIFKOOEVPA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038472 dicalcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000390 dicalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940095399 enema Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- MVPICKVDHDWCJQ-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-pyrrolidin-1-ylpropanoate Chemical compound CCOC(=O)CCN1CCCC1 MVPICKVDHDWCJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- HJUFTIJOISQSKQ-UHFFFAOYSA-N fenoxycarb Chemical compound C1=CC(OCCNC(=O)OCC)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 HJUFTIJOISQSKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000010687 lubricating oil Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 101150014102 mef-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008196 pharmacological composition Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 210000000063 presynaptic terminal Anatomy 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940045902 sodium stearyl fumarate Drugs 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/45—Transferases (2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Neurology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 명세서는 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제, 그 진단키트를 개시한다.
Description
본 명세서는 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파시누클레인을 조절하는 Srpk3을 포함하거나 조절하는 약리학적 조성물 및 그 치료제를 제공한다.
파킨슨병(Parkinson's disease(PD))은 만성 진행성 신경 퇴행성 질환이다. 주요 병리학적 특징은 주로 SN(Substantia Nigra)에서 도파민성 뉴런의 극적인 손실이며, 세포질 내성 루이 소체(intracytoplasmic Lewy bodies) 및 영양 장애 성 신경 돌기(dystrophic neurites)의 형성이다.
그러나, 도파민성 뉴런의 손실 배후의 메카니즘은 아직 명확하지 않다.
본 실시예들은 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 제공한다.
일 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파-시누클레인을 조절하는 Srpk3 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파-시누클레인을 조절하는 Srpk3 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물, 및 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하는 파킨슨병 치료제를 제공한다.
다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파-시누클레인을 조절하는 Srpk3 유전자의 발현 정도에 영향을 미치는 물질들을 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법을 제공한다.
이 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법은 다음의 단계를 포함한다.
(a) 파킨슨병 모델로 생성된 실험 동물에 적어도 하나의 후보 물질을 투여하는 단계; 및
(b) Srpk3 유전자의 발현량을 측정하는 단계, 상기 Srpk3 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우에는
상기 후보 물질은 파킨슨병 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
또 다른 실시예는, 대상체로부터 검체를 분리하는 단계, 검체로부터 Srpk3 유전자의 발현량을 측정하는 단계 및 Srpk3 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우 상기 대상체에 대해 파킨슨병으로 진단하는 단계를 포함하는 파킨슨병 진단방법을 제공한다.
본 실시예들에 따르면, 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공한다.
본 실시예에 따르면, 파킨슨병 진단키트는 피키슨병을 조기에 진단하여 파킨슨병 치료 및 예방에 우수한 효과를 제공한다.
본 실시예에 따르면, 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법은 파킨슨병 치료제의 후보물질을 스크리닝하여 파킨슨병 치료 및 예방을 할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 MPTP 유발 파킨슨병 마우스 모델에서 도파민성 세포와 알파-시누 클레인 (α-syn) 발현을 나타낸다.
도 2는 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나제 3(Srpk3) 발현이 MPTP 유발 4 주 파킨슨병 마우스 모델에서 감소했음을 나타낸다.
도 3은 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나아제 3(Srpk3)이 MPTP로 유도된 4 주 파킨슨병 마우스 모델의 SN에서 알파-시누클레인(α-syn)과 공동 국소화되었음을 나타낸다.
도 4는 웨스턴 블롯 분석과 Srpk3 및 알파-시누클레인(α-syn) 발현의 히스토그램을 나타낸다.
도 5는 웨스턴 블롯 분석(a)과 TH 및 알파-시누클레인(α-syn) 발현의 히스토그램(b)을 통해 서 SH-SY5Y 세포에서 MPP+ 중독시 세린 / 아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나제3(Srpk3) siRNA에 의해 유발된 악화를 나타낸다.
도 2는 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나제 3(Srpk3) 발현이 MPTP 유발 4 주 파킨슨병 마우스 모델에서 감소했음을 나타낸다.
도 3은 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나아제 3(Srpk3)이 MPTP로 유도된 4 주 파킨슨병 마우스 모델의 SN에서 알파-시누클레인(α-syn)과 공동 국소화되었음을 나타낸다.
도 4는 웨스턴 블롯 분석과 Srpk3 및 알파-시누클레인(α-syn) 발현의 히스토그램을 나타낸다.
도 5는 웨스턴 블롯 분석(a)과 TH 및 알파-시누클레인(α-syn) 발현의 히스토그램(b)을 통해 서 SH-SY5Y 세포에서 MPP+ 중독시 세린 / 아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나제3(Srpk3) siRNA에 의해 유발된 악화를 나타낸다.
이하, 본 발명의 일부 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다. 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명의 실시예들을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료", "억제" 및 "약화"란, 본 발명의 조성물을 개체에 사용하여, 특정 세포의 분화나, 특정 물질의 수준, 특정 질병 또는 질환의 진행을 감소시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"란, 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
이하, 본 발명의 실시예들에 따른 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제에 대하여 설명한다.
실시예: 약제학적 조성물 및 그 치료제
파킨슨 병(PD)은 SN(Substantia Nigra)에서 도파민성 뉴런의 손실로 인해 발생하는 두 번째로 흔한 신경 퇴행성 장애이다. 그러나 도파민성 뉴런의 죽음에 대한 이유는 불분명하다. 알파-시누클레인(alpha-synuclein(α-syn))의 증가는 파킨슨병(PD) 발병의 중요한 요인으로 간주된다.
후술하는 실험예를 통해 알 수 있는 바와 같이, 발명자들은 1- 메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP))로 유도된 파킨슨병 마우스 모델과 1- 메틸 -4- 페닐 피리디늄(MPP+)로 처리된 SH-SY5Y 세포에서 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나아제 3(serine/arginine-rich protein specific kinase 3(Srpk3))와 파킨슨병(PD) 사이의 연관성을 조사했다.
Srpk3 발현은 유의미하게 하향 조절되는 반면, 타이로신 하이드록실라제(tyrosine hydroxylase(TH))는 감소하고 알파-시누클레인(α-syn)은 MPTP 중독 치료 4 주 후에 증가했다. 도파민성 세포 감소 및 알파-시누클레인(α-syn) 증가는 SH-SY5Y 세포에서 siRNA에 의한 Srpk3 발현을 억제함으로써 입증되었다. 더욱이, siRNA 처리시 Srpk3 발현의 감소는 MPP + 처리된 SH-SY5Y 세포에서 도파민성 세포 감소 및 알파-시누클레인(α-syn) 증가를 촉진시켰다. 이러한 결과는 Srpk3 siRNA로 인한 Srpk3 발현의 감소가 TH의 감소와 알파-시누클레인(α-syn)의 증가를 모두 유발했음을 시사한다. 이것은 Srpk3가 파킨슨병(PD)의 병인과 관련이 있을 수 있는 도파민성 세포 및 알파-시누클레인(α-syn) 발현을 제어하는 것을 확인할 수 있었다.
이 결과로 도파민 세포 손실 및 SN의 알파-시누클레인(α-syn) 증가하는 동안 Srpk3의 역할을 이해할 수 있었다. 또한, 이 결과로 Srpk3 발현의 유지가 도파민성 세포 감소를 억제한다는 점에서 파킨슨병(PD)에 대한 치료 가능성을 뒷받침할 수 있다.
이러한 실험예에 기반하여, 본 명세서는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파-시누클레인(alpha-synuclein)을 조절하는 Srpk3을 포함하거나 조절하는 약리학적 조성물을 제안한다.
일 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파-시누클레인을 조절하는 Srpk3 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물을 제공한다.
세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나아제 3(serine/arginine-rich protein specific kinase 3 )인 Srpk3는 Srpk3 유전자에 의해 인코딩되는 인간에 존재하는 효소이다.
본 명세서에서 Srpk3 유전자 발현에 의한 물질인 Srpk3는 상기 Srpk3 유전자 발현에 의한 물질은 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나아제 3인 Srpk3를 의미할 수도 있다.
알파-시누클레인(α-syn)은 인간의 뇌에 풍부한 단백질이다. 소량은 심장, 근육 및 다른 조직에서도 발견된다. 뇌에서, 알파-시누클레인(α-syn)은 시냅스전 말단이라 불리는 특수한 구조의 신경 세포(뉴런)의 끝에서 주로 발견된다. 인간의 알파-시누 클레인 단백질은 140 개의 아미노산으로 이루어지고, SNCA유전자에 의해 코딩된다.
다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파-시누클레인을 조절하는 Srpk3 유전자 발현에 의한 물질인 Srpk3를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물, 및 그 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하는 파킨슨병 치료제를 제공한다.
상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 명세서의 파킨슨병 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 명세서의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 명세서의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를더 함유할 수 있다.
본 명세서의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물 및 그 치료제의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥 내, 피하, 복강 내, 흡입, 피부도포, 패치제 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다.
투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다.
이하, 실험예를 기술함으로써 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실험예는 본 발명의 일 예시에 불과하며, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
이하 실험예에서 추출물을 추출하는데 사용하는 용매를 기재할 수 있으나, 통상적으로 추출물을 추출하는데 사용하는 다양한 용매들을 포함할 수 있다. 실험예에서 사용한 처리시약도 동일한 목적의 통상적인 처리시약으로 대체할 수 있다.
실험예: 약제학적 조성물
1. 개요
파킨슨병(PD)은 알츠하이머병 다음으로 두 번째로 흔한 신경 퇴행성 질환이다. 파킨슨병(PD)는 떨림, 운동 장애, 운동 완서(bradykinesia, 運動緩徐) 및 뻣뻣함과 같은 행동 증상이 특징이다. 파킨슨병(PD)는 뇌에서 병리학적 특징은 중뇌의 substantia nigra(SN)에서 도파민성 뉴런의 손실로 인해 발생한다. 그러나 도파민성 뉴런의 죽음에 대한 이유는 불분명하다. 파킨슨병(PD)의 신경 변성은 무질서한 단백질 알파- 시누클레인(α-syn)의 응집체를 포함하는 세포 내 내포물인 루이체의 발생과 상관 관계가 있는 것으로 보고되었다(Goedert M, Spillantini MG, Del Tredici K, et al. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol 2013;9(1):13-24. doi: 10.1038/nrneurol.2012.242 [published Online First: 2012/11/28]). 알파-시누클레인(α-syn)의 증가는 PD의 병인의 중요한 요인으로 간주된다.
이 실험예에서는 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)에 중독된 파킨슨병 마우스 모델에서 SN 세포의 변경된 유전자 발현 수준을 분석하여 도파민성 세포 감소를 유도했다. 높은 감도와 신뢰성을 가진 PCR (polymerase chain reaction) 기반의 발현 프로파일링 자동화 시스템을 적용하여 MPTP 주입으로 인한 신경 퇴행성 상태에서 발현이 변경된 여러 유전자가 검출되었다. 더욱이, 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나제 3(Srpk3)는 MPTP 중독 치료 4 주 후에 현저하게 하향 조절되었다.
세린/아르기닌 반복 함유 단백질(serine/arginine repeat-containing proteins)을 인산화하는 것으로 보고된 Srpk3는 세린/아르기닌 단백질 키나아제 계열에 속하며 MEF2에 의해 조절되는 근육 특이적 인핸서(muscle-specific enhancer)에 의해 제어된다. Srpk3는 폐, 피부, 비장, 심장, 관절, 근육 및 뇌에서 발현된다. 이 유전자는 스플라이 싱 인자(splicing factors )의 세린/아르기닌이 풍부한 도메인 (serine/arginine-rich domain (SR 도메인)) 계열에 특이적인 단백질 키나아제를 암호화한다. 유사한 단백질도 근육 발달에 역할을 하는 것으로 나타났다 .
이러한 흥미로운 관찰은 Srpk3의 감소가 파킨슨병(PD)와 관련이 있을 수 있다는 가설로 이어진다. 파킨슨병(PD)의 발병 기전에서 MPTP에 중독된 마우스의 α-syn 증가와 관련된 도파민성 세포 감소는 Srpk3 수준의 감소에 영향을 받을 수 있다.
이 가설을 검증하기 위해 만성 MPTP 유발 파킨슨병(PD) 마우스 모델에서 Srpk3 발현이 감소하고 티로신 하이드록 실라제(TH) 발현이 감소하고 알파-시누클레인(α-syn)이 증가하는 것을 보여주는 실험을 수행했다.
또한, SH-SY5Y 세포에서 siRNA에 의한 Srpk3 발현을 억제함으로써 도파민 성세포 감소 및 알파-시누클레인(α-syn) 증가를 조사하였다. 따라서 이 실험예의 주요 발견은 Srpk3 발현의 감소가 MPTP에 중독된 마우스의 SN 영역에서 도파민성 세포 손실 및 α-syn 증가를 촉진하는 반면, siRNA 처리시 Srpk3 발현의 감소는 도파민성 세포 감소 및 α- MPP +로 처리된 SH-SY5Y 세포의 알파-시누클레인(α-syn) 증가를 촉진하였다.
이와 관련하여 본 실험예의 목적은 Srpk3와 파킨슨병(PD) 사이의 연관성을 조사하고 도파민성 세포 손실 및 SN의 알파-시누클레인(α-syn) 증가 동안 Srpk3의 역할에 대한 통찰력을 제공한다. 또한, 이 실험예는 Srpk3 발현의 유지가 도파민성 세포 감소를 억제한다는 점에서 파킨슨병(PD)에 대한 치료 가능성을 뒷받침할 수 있다.
2. 방법
2.1. 파킨슨병의 MPTP 모델
6 주령의 수컷 C57BL / 6 마우스(20-22g; DBL, 한국)를 대조군(CTL군) 및 MPTP- 중독군(MPTP군)의 두 그룹으로 나누었다. CTL군의 마우스에 4주 동안 매일 1회 식염수 0.9% (100μL)를 복강 내 주사하고, MPTP군의 마우스에 4주 동안 매일 식염수 0.9% (100μL)의 MPTP-HCl (20mg/kg의 유리 염기)을 복강 내 주사하여, 지속적인 만성 파킨슨병 모델을 생성한다. 최종 MPTP 처리 후 다음날, 마우스를 알파산(Alfaxan)을 사용하여 마취시키고, 0.05M 인산 나트륨 완충액으로 심내 관류하였다.
상지대 학교 동물 실험위원회는 이 실험예에 사용된 모든 동물 프로토콜을 승인했다. 사용되었지만 언급되지 않은 시약은 미국 시그마에서 구입했다.
2.2. RNA 추출 및 마이크로 어레이 분석
RNeasy Plus Mini 키트(QIAGEN, 미국)를 사용하여 각 그룹의 양측 SN 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. 분리된 RNA 품질을 NanoDrop ND-1000 분광 광도계(NanoDrop Technologies, 미국)를 사용하여 추정하고 정량하였다.
총 RNA의 분취량을 Affymetrix GeneChip® Mouse Gene 1.0 ST Array(Affymetrix, 미국)에 적용하였다. 이전에 보고된 바(Choi et al., 2011; Lin et al., 2010, Yeo et al., 2018).)와 같이 GeneChip Whole Transcript(WT) Sense Target 표지 분석 매뉴얼을 따랐다.
2.3. 마이크로 어레이 데이터 분석
스캔된 이미지의 의미있는 신호 강도는 먼저 육안 검사를 사용하여 평가되었다. 스캔된 데이터의 품질 제어는 Expression Console 소프트웨어(Affymetrix, USA)를 사용하여 poly-A 및 하이브리드화 컨트롤의 신호 강도의 순서를 확인함으로써 수행되었다. 마이크로 어레이 데이터는 GenPlex ver.3.0(ISTECH, Korea)을 사용하여 분석되었다.
유전자의 평균 신호 강도는 각 그룹에서 2 개의 칩으로부터 얻어졌다. 정규화 후, 폴드 체인지 컷오프(2) 및 학생의 t- 검정 유의 기준(p <0.05)의 조건을 만족하는 GeneChip의 차등 발현 유전자 (DEG)를 DEG- 찾기 모듈(DEG-finding module)을 사용하여 확인했다.
2.4. 세포주 및 배양
신경 모세포종 세포주 SH-SY5Y의 세포는 10 % 소태아 혈청(FBS; BioWhittaker), 0.1 mM 비필수 아미노산, 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토 마이신을 함유하는 최소 필수 배지(MEM; Welgen, Namcheon-myeon)에서 표준 세포 배양 조건 (37 ℃, 5 % CO2)에서 유지되었다.
2.5. siRNA(Short interfering RNA) 녹다운
Srpk3에 대한 stealth siRNA(5-GAA AAC UGC CUG UUU GUU U -3) 및 음성 대조군 듀플렉스(즉, Srpk3에 대한 스크램블된 siRNA, 5- UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT -3)를 Bioneer Inc (대전, 한국)에서 구입했습니다.
2.6. siRNA 형질 감염
SH-SY5Y 세포는 siRNA 형질 감염을 수행하기 전에 적어도 하루 동안 Opti-MEM 배지(Gibco, 미국)에서 배양되었다. 형질 감염을 위해 형질 감염 시약(Promega, 미국)과 Srpk3 siRNA는, SH-SY5Y 세포의 밀도가 60 %일 때, (3.5:1) 비율로 사용되었다. 24 시간 동안 형질 감염을 계속 하였다.
2.7. MPP + 치료
SH-SY5Y 세포는 18 시간 동안 500 μM MPP + 요오드화물 (Sigma)로 처리되었다.
2.8 면역 조직 화학
4 주 후 마우스의 뇌를 절제하고 4 % 파라 포름 알데히드가 포함된 인산 완충 식염수(PBS)에 12 시간 동안 4 ℃에서 고정하고 PBS로 헹구고 수크로스 버포로 12 시간 동안 4 ℃에서 탈수한 다음 냉동 절편하였다.
대조 뇌 섹션은 냉동 조직절편기(cryomicrotome)을 사용하여 30μm 두께로 절단했다. 면역 조직 화학 분석은 ABC 키트 및 Mouse on Mouse(M.O.M) 면역 검출 키트(Vector Laboratories, CA) 및 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 방법의 변형을 사용하여 수행되었다.
간단히, 전체 ST 및 SN 영역을 포함하는 섹션을 3% H2O2와 함께 인산 완충 식염수(PBS; pH 7.4)에서 배양하고, 3% 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 및 03.% Triton X-100에 1시간 동안 노출시키고, 아비딘 비오틴 차단 키트 (Vector Laboratories)로 처리했다. 뇌 절편은 M.O.M. 항체와 함께 배양하기 전에 실온에서 1시간 동안 M.O.M. 마우스 Ig-차단 시약 (Vector Laboratories)으로 처리했다.
각 섹션은 anti-TH 항체(1 : 2000; Santa Cruz Biotechnology), anti-Srpk3 (1 : 1000; Cloud-clone Corp.) 및 anti-α-syn (1 : 500; Santa Cruz Biotechnology)으로 밤새 염색되었습니다. 4℃에서. 절편을 비오티닐화된 항-마우스 IgG(biotinylated anti-mouse IgG) 및 아비딘-비오틴-퍼옥시다제(avidin-biotin-peroxidase) 복합체로 배양한 다음, 디아미노벤지딘-과산화수소 용액(diaminobenzidine-hydrogen peroxide solution)(0.05M Tris에서0.03 % 과산화수소 및 0.003 % 3,3- 디아 미노 벤지딘)을 사용하여 관찰했다.
2.9. 면역 형광
세포는 면역 조직 화학에 사용된 것과 동일한 절차를 사용하여 처리되었다. 세포는 일차 항체와 그다음 비오틴화된 항-마우스 IgG 및 항-토끼 IgG와 함께 배양되었습니다. 뇌 절편은 마우스 anti-TH (1 : 2,000) 및 토끼 anti-Srpk3 (1 : 1000)에 대해 fluorescein avidin DCS (Vector Laboratories)로 처리되었다.
이후 세포를 아비딘 비오틴 차단 키트와 M.O.M 마우스 Ig 차단 시약 (Vector Laboratories)으로 처리한 후 4℃에서 밤새 anti-TH 및 anti-Srpk3 IgG로 염색했습니다.
각 그룹은 비오틴화된 항-마우스 IgG 및 항-토끼 IgG로 처리한 다음, 플루오레세인 아비딘 D(fluorescein avidin D) 및 로다민 아비딘 D(fluorescein avidin D ) (Vector Laboratories)와 함께 배양했습니다. 사진 문서화는 Nikon X-Cite-Series 120 Q 현미경 (Nikon)을 사용하여 수행되었다. 이미지는 디지털 카메라 (DS-Fi2; Nikon)가 장착된 ECLIPSE Ni-U 현미경 (Nikon)을 사용하여 수집되었다. 이미지는 이미징 소프트웨어 NIS-Elements F ver를 사용하여 수집되었다. 4.00.00 (니콘). ImageJ 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 각 이미지 데이터 파일에서 Tiff 이미지 및 정량화 데이터를 수집했다.
2.10. 웨스턴 블롯 분석
ST 및 SN 영역은 30 분 동안 얼음 위에서 방사 면역 침전 분석 완충액(RIPA)을 사용하여 균질화되었습니다. 12,000rpm에서 20 분 동안 원심 분리한 후, 12 % 나트륨 도데 실 설페이트-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDSPAGE)을 사용하여 동일한 단백질 농도의 가용성 상층액 샘플을 분리하고 폴리 비닐 리덴 디 플루오라이드(polyvinylidene difluoride)(PVDF) 막(PBio-Rad)으로 옮겼다.
막을 실온에서 1 시간 동안 0.1 % 트리스-완충 식염수 (TBS; 20-mM 트리스 -HCl [pH 7.5] 및 0.1 % 트윈 -20, TBST를 함유하는 150mM NaCl)에 5 % 탈지유로 차단하고 anti-TH (1 : 2,000), anti-α-syn (1 : 500), anti -Srpk3 (1 : 2000) 및 anti-β-actin (1 : 5,000, Santa Cruz Biotechnology) 항체로 배양하였다. 이후 0.1 % Tween-20 (TBST)이 포함된 0.1 % TBS로 막을 세척하고 항 마우스 IgG-peroxidase 항체 (1 : 2,000, Bio-Rad)와 함께 배양한 후 항원-항체 복합체는 Pierce ECL 웨스턴 블로 팅 기판 (Thermo Scientific)을 사용하여 시각화되었다. 면역 반응 밴드에 대한 농도계 값의 백분율은 각 실험에서 계산되었다. 밀도는 ImageJ 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 측정되었다.
2.11. 통계 분석
SPSS 25(출시 2017, PASW Statistics for Windows, 버전 25.0, 시카고: SPSS Inc.)의 학생 t- 테스트 및 분산 분석(Student's t-test and the analysis of variance)(ANOVA)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 모든 값은 평균 ± 표준 오차로 표시된다.
3. 결과
TH 및 알파-시누클레인(α-syn) 발현의 변화를 평가하여 MPTP 유발 파킨슨병 마우스 모델의 정확한 형성을 확인했다. TH 수준은 CTL군(도 1a 및 c)보다 MPTP군(도 1b 및 d)에서 눈에 띄게 낮았다.
웨스턴 면역 블롯 분석은 또한 MPTP군의 ST 및 SN의 TH 수준에서 상당한 감소(p <0.005)를 보여주었다(도 1e). SN 영역의 α-syn 수준은 CTL군(도 1c)보다 MPTP군(도 1f)에서 눈에 띄게 높았다. 웨스턴 면역 블롯 분석은 MPTP군의 알파-시누클레인(α-syn) 수준에서 지속적으로 유의미한 증가(p <0.005)를 보여주다(도 1g 및 1h).
도 1은 MPTP 유발 파킨슨병 마우스 모델에서 도파민성 세포와 알파-시누 클레인(α-syn) 발현을 나타낸다.
SN(a, c, d 및 f) 및 ST(b 및 e)는 항-티로신 하이드록실라제(TH; a 및 d, 100x; b 및 e, 40x) 항체와 항-알파-시누클레인(α-syn) (c 및 f, 1000x) 항체로 염색되었다. 웨스턴 면역 블롯 분석(g)은 SN 및 ST의 TH 발현이 감소한 반면, SN의 알파-시누클레인(α-syn) 발현은 MPTP에서 증가함을 보여 주었다. 이들은 대조군 (h)의 100 %로 정규화된 MPTP와 비교하여 통계적으로 유의했다. CTL, 식염수 대조군; MPTP, MPTP 처리. * p <0.005.
SN 영역의 Srpk3 발현 수준은 CTL군의 마우스보다 MPTP군의 마우스에서 현저하게 낮았다(도 2). 면역 블롯 분석 관찰에서 볼 수 있듯이 마이크로 어레이 분석 및 웨스턴 면역 블롯 분석의 결과는 Srpk3 발현이 대조군과 비교하여 MPTP에서 현저하게 감소했음을 나타낸다(도 2f).
도 2는 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나제 3(Srpk3) 발현이 MPTP 유발 4 주 파킨슨병 마우스 모델에서 감소했음을 나타낸다.
도 2의 (a-d) 면역 조직 화학의 결과를 나타내고, 도 2의 (e) 면역 블롯 분석의 결과를 나타내고, 도 2의 (f)에서 마이크로 어레이 및 웨스턴 블롯 분석의 히스토그램은 100 %로 정규화된 대조군과 비교하여 MPTP에서 Srpk3 발현이 감소했음을 나타냅니다. CTL, 식염수 대조군; MPTP, MPTP 처리. * p <0.005 및 ** p <0.001.
Srpk3와 α-syn의 관계를 조사하기 위해 MPTP로 유도된 4 주 파킨슨병 마우스 모델의 SN 영역에서 Srpk3가 알파-시누클레인(α-syn)과 공존하는 실험을 수행했다. 대조군에서 Srpk3 발현은 α-syn과 공존하는 것으로 밝혀졌다.
MPTP군에서는 대조군에 비해 공존하는 Srpk3 및 알파-시누클레인(α-syn)이 감소했다. MPTP 군에서 알파-시누클레인(α-syn)이 증가했지만 Srpk3가 감소하여 공존성질(co-localization)이 감소한 것으로 생각된다. 이는 Srpk3가 MPTP군에서 알파-시누클레인(α-syn)을 커버하기에 충분하지 않음을 시사한다(도 3).
도 3은 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나아제 3(Srpk3)이 MPTP로 유도된 4 주 파킨슨병 마우스 모델의 SN에서 알파-시누클레인(α-syn)과 공동 국소화되었음을 나타낸다. 세포는 로다민 아비딘 (도 2의 a, e; 빨간색)과 플루오 레세인 아비딘 (도 3의 b, f; 녹색)을 사용하여 항-Srpk3(도 3의 a, e) 및 항-알파-시누클레인(α-syn) (도 3의 b, f) 항체로 면역 형광 표지되었다.
병합된 패널들(도 3의 c, g)은 각각 왼쪽 (도 3의 a, e) 및 중간(도 3의 b, f) 패널의 병합된 이미지를 표시한다. dapi로 병합된 패널들(도 3의 d, h)은 각각 dapi가 있는 왼쪽 (도 3의 a, e) 및 중간 (도 3의 b, f) 패널의 병합된 이미지를 표시한다. 병합된 패널의 노란색 영역은 Srpk3 및 알파-시누클레인(α-syn)의 공동 지역화를 나타낸다. CTL, 식염수 대조군; MPTP, MPTP 처리. 스케일 바 = 10 μm.
Srpk3 감소와 알파-시누클레인(α-syn) 증가와의 관계를 알아보기 위해 SH-SY5Y 세포에서 Srpk3 siRNA를 사용하여 Srpk3 발현이 녹다운되는 실험을 수행했다. Srpk3 siRNA는 Srpk3 발현을 감소 시켰지만 SH-SY5Y 세포에서 알파-시누클레인(α-syn) 발현을 증가시켰다(도 4).
도 4는 웨스턴 블롯 분석과 Srpk3 및 알파-시누클레인(α-syn) 발현의 히스토그램을 나타낸다.
도 4의 (a)인 웨스턴 블롯 분석에 따르면, 세린 / 아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나제 3 (Srpk3) siRNA(short interfering RNA)의 투여로 SH-SY5Y 세포에서의 Srpk3 발현은 감소하지만 알파-시누클레인(α-syn) 발현은 증가함을 보여준다. 도 4의 (b)의 Srpk3 및 알파-시누클레인(α-syn) 발현의 히스토그램에 따르면, Srpk3 및 알파-시누클레인(α-syn) 발현의 히스토그램은 대조군인 siRNA 10 및 siRNA 100과 비교하여 보여졌다. CTL, 대조군 siRNA 처리 (2 일 동안 100 nM); siSRPK3 10, Srpk3 siRNA 처리 (2 일 동안 10 nM); siSRPK3 100, Srpk3 siRNA 처리 (2 일 동안 100 nM). * p <0.05 및 ** p <0.005.
감소된 Srpk3가 PD 상태에 미치는 영향을 조사하기 위해 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 Srpk3 siRNA를 사용하여 Srpk3 발현이 녹다운되는 실험을 수행했다. 웨스턴 블롯 분석은 감소된 Srpk3가 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 티로신 하이드록실라제(TH) 감소 및 알파-시누클레인(α-syn) 증가를 악화 시켰음을 보여 주었다 (도 5).
도 5는 웨스턴 블롯 분석(a)과 TH 및 알파-시누클레인(α-syn) 발현의 히스토그램(b)을 통해서 SH-SY5Y 세포에서 MPP+ 중독시 세린 / 아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나제3(Srpk3) siRNA에 의해 유발된 악화를 나타낸다.
도 5의 (a)의 웨스턴 블롯 분석은 SH-SY5Y 세포에서 Srpk3 siRNA가 MPP+ 처리시 티로신 하이드록실라제(TH)를 감소시키고 알파-시누클레인(α-syn)을 증가 시켰음을 보여준다. 도 5의 (b)의 TH 및 알파-시누클레인(α-syn) 발현의 히스토그램이 표시되었다. CTL, 100 nM 음성 대조군 siRNA 처리; MPP +, 500 μM MPP + 처리; MPP + 10, 10 nM Srpk3 siRNA 및 500 μM MPP + 처리; MPP + 100, 100 nM Srpk3 siRNA 및 500 μM MPP + 처리.
SH-SY5Y 세포는 Srpk3 siRNA로 형질 감염되었다. 6 시간 후 SH-SY5Y 세포를 500μM MPP +로 18 시간 동안 처리했다. * p <0.05는 CTL과 비교되었으며 #p <0.05는 MPP +와 비교되었다.
전술한 바와 같이, MPTP 유발 파킨슨병 마우스 모델의 정확한 형성을 확인하기 위해 TH 및 알파-시누클레인(α-syn) 발현의 변화를 평가했다. ST 및 SN 영역의 TH 수준은 CTL군의 마우스보다 MPTP군의 마우스에서 눈에 띄게 낮았으므로 MPTP 처리로 인한 TH 면역 반응성의 통계적으로 유의한 감소를 확인했다. 더욱이, SN 영역의 알파-시누클레인(α-syn) 수준은 CTL군의 마우스보다 MPTP군의 마우스에서 현저하게 더 높았다. 이러한 결과는 MPTP 유발 파킨슨병 마우스 모델의 정확한 형성을 확인했다(도 1).
현재 실험예에서 SN 영역의 Srpk3 발현 수준은 CTL군의 마우스보다 MPTP군의 마우스에서 현저하게 낮았다. 면역 블롯 분석 관찰에서 볼 수 있듯이, 마이크로 어레이 분석 및 웨스턴 면역 블롯 분석의 결과는 MPTP군에서 Srpk3 발현이 현저하게 감소했음을 나타낸다(도 2).
Srpk3와 알파-시누클레인(α-syn)의 관계를 조사하기 위해 MPTP의 SN에서 Srpk3가 알파-시누클레인(α-syn)과 공존하는 실험을 수행하여 4 주 파킨슨병 마우스 모델을 유도했다. 대조군에서 Srpk3 발현은 알파-시누클레인(α-syn)과 공존하는 것으로 밝혀졌다. MPTP군에서는 대조군에 비해 공존하는 Srpk3 및 α-syn이 감소했다. MPTP군에서 알파-시누클레인(α-syn)이 증가 했음에도 불구하고 Srpk3가 감소하면 공존 특성(co-localization)이 감소한 것으로 생각된다. 대조군에서는 알파-시누클레인(α-syn)과 공존하지 않는 Srpk3가 관찰되었으나 MPTP군에서는 관찰되지 않았다. 이는 Srpk3가 MPTP군에서 알파-시누클레인(α-syn)을 커버하기에 충분하지 않음을 시사한다(도 3).
SH-SY5Y 세포에서 Srpk3 siRNA를 이용하여 Srpk3 발현이 녹다운되는 실험을 수행했다. Srpk3 siRNA는 Srpk3 발현을 감소시켰지만 SH-SY5Y 세포에서 α-syn 발현을 증가시켰다(도 4). 이것은 Srpk3 발현의 감소가 알파-시누클레인(α-syn) 발현의 증가와 관련이 있음을 시사한다.
감소된 Srpk3가 PD 상태에 미치는 영향을 알아보기 위해 파킨슨병(PD) 상태와 유사한 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 Srpk3 siRNA를 사용하여 Srpk3 발현이 녹다운되는 실험을 수행했다. 웨스턴 면역 블롯 분석은 Srpk3의 감소가 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 알파-시누클레인(α-syn)의 증가를 악화 시켰음을 보여주었다(도 5). 이러한 결과는 Srpk3 siRNA로 인한 Srpk3 발현의 감소가 도파민성 세포 감소와 알파-시누클레인(α-syn) 증가를 모두 유발했음을 시사한다. 이것은 Srpk3가 파킨슨병(PD)의 병인과 관련이 있을 수있는 도파민성 세포 및 알파-시누클레인(α-syn) 발현을 제어하는 방법을 연구하는 새로운 길을 열어줄 것이다.
Srpk3는 아르기닌/세린 디펩티드가 풍부한 영역에 위치한 세린 잔기에서 기질을 인산화한다. 세린에서 인산화된 여러 종류의 알파-시누클레인(α-syn)이 파킨슨병(PD)의 발병에 관여하는 것으로 보고되었다. 본 실험예의 결과, Srpk3가 도파민성 뉴런의 알파-시누클레인(α-syn) 인산화 관련 신경 퇴행에 관여 할 수 있다고 생각된다. 이전 연구에서 줄무늬 근육은 Srpk3 발현 수준에 매우 민감한 것으로 보고되었다. Srpk3-null 마우스는 중심에 위치한 핵이 크게 증가하는 새로운 유형 2 섬유 특이적 근육 병증을 나타냈다.
Srpk3 돌연변이 마우스의 근육 병증은 다음과 같다. 근섬유 혼란, 근육 세포 사멸 또는 호중구 침윤과 같은 근육 퇴화 또는 재생의 징후가 없는 특징이 있다. 이러한 연구와 본 실험예를 결합하면 파킨슨병(PD)의 운동 기능 장애가 Srpk3 감소와 관련이 있을 수 있음을 시사한다.
결론적으로, 본 실험예의 결과는 MPTP 파킨슨병 마우스 모델에서 Srpk3 발현이 감소하고 Srpk3 발현이 감소하여 Srpk3 siRNA에 의해 유도된 SH-SY5Y 세포에서 알파-시누클레인(α-syn) 수준이 증가함을 보여 주었다. 이러한 결과는 Srpk3와 파킨슨병(PD) 사이의 연관성을 시사하며 도파민성 세포 손실 및 파킨슨병(PD)의 α-syn 증가 동안 Srpk3의 역할을 이해하는 길을 제공한다. 또한, 본 실험예는 파킨슨병(PD)의 발병 기전에서 알파-시누클레인(α-syn) 발현을 조절하기위한 파킨슨병(PD)의 치료 표적으로서 Srpk3의 유지에 대해 조명한다.
이러한 실험예를 통해, 퇴행성 뇌질환에서 도파민성 세포와 알파-시누클레인을 조절하는 Srpk3 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물 및 그 치료제를 파킨슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 것을 알 수 있다.
이하, 전술한 실험예를 참조하여, 다른 실시예들에 따른 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법 및 파킨슨병을 진단하는 진단 방법, 그 진단 키트에 대해 상세히 설명한다.
실시예2: 스크리닝하는 방법
다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파-시누클레인을 조절하는 Srpk3 유전자의 발현 정도에 영향을 미치는 물질들을 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법을 제공한다.
다른 실시예는, 다음의 단계를 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) 파킨슨병 모델로 생성된 실험 동물에 적어도 하나의 후보 물질을 투여하는 단계; 및
(b) Srpk3 유전자의 발현량을 측정하는 단계, 상기 Srpk3 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우에는
상기 후보 물질은 파킨슨병 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
파킨슨병 모델은 실험예에서 설명한 파킨슨병의 MPTP 모델일 수 있으나 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 아울러, 실험 동물은 실험예에서 설명한 마우스일 수 있으나 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
발현량의 측정은 실험예에서 기재한 바와 같이 실시할 수 있으나, 일반적인 다른 방법들에 의해 실시할 수도 있다.
실시예3: 진단 방법
또 다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파-시누클레인을 조절하는 Srpk3 유전자의 발현 정도로 파킨슨병을 진단하는 진단 방법을 제공한다.
또 다른 실시예에 따른 파킨슨병 진단 방법은, 대상체, 예를 들어 인간이나 동물로부터 분리한 물질, 예를 들어 혈액이나 세포 등에서 Srpk3의 발현량을 측정해서 파킨슨병을 진단할 수 있다.
구체적으로, 다른 실시예에 따른 파키슨병 진단 방법은, 대상체로부터 검체를 분리하는 단계, 검체로부터 Srpk3 유전자의 발현량을 측정하는 단계 및 Srpk3 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우 대상체에 대해 파킨슨병으로 진단하는 단계를 포함한다.
전술한 바와 같이 검체는 대상체로부터 분리된 어떤 물질, 예를 들어 혈액이나 세포 등일 수 있다. 대상체는 인간을 포함하는 동물일 수 있다.
검체를 분리하는 단계는 일반적으로 대상체로부터 자연스럽게 분리되거나 주사기 등을 이용하여 인위적으로 검체를 분리하는 방식들을 포함할 수 있다.
검체로부터 Srpk3 유전자의 발현량을 측정하는 단계에서 Srpk3 유전자의 발현량을 측정하는 것은 실험예에서 설명한 일반적인 방식들일 수 있다.
대상체에 대해 파킨슨병으로 진단하는 단계에서, Srpk3 유전자의 발현 수준이 통계적으로 유의미하게 조절되는 경우 대상체에 대해 파킨슨병으로 진단할 수 있다.
다른 실시예는, 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파-시누클레인을 조절하는 Srpk3 유전자의 발현 정도로 파킨슨병을 진단하는 진단 키트를 제공한다. 이 진단 키트는 전술한 진단 방법을 수행하는 키트로, 일반적인 진단 키트의 구성을 가질 수 있다.
본 발명은, 파킨슨병에서 도파민 세포와 알파-시누클레인에 영향을 주는 Srpk3을 특정해서 파킨슨병(PD)의 치료제 및 Srpk3을 함유하고 있는 물질이나 Srpk3 유전자 발현 기작에 영향을 미치는 효소 등의 물질들 중 유전자 발현의 감소를 막거나 증가시키는 물질을 특정해서 파킨슨병의 치료제를 제공할 수 있다.
또한 본 발명은, 특정유전자의 발 현정도에 영향을 미치는 물질들을 치료의 후보 물질로 스크리닝하는 방법 및 Srpk3의 유전자 발현 수준으로 파킨슨병을 진단하는 방법 또는 진단 키트 등을 제공할 수 있다.
이상 도면을 참조하여 실시예들을 설명하였으나 본 발명은 이에 제한되지 않으며, 상기 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (6)
- 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파-시누클레인을 조절하는 Srpk3 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 Srpk3 유전자 발현에 의한 물질은 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나아제 3인 Srpk3인 파킨슨병용 약제학적 조성물. - 퇴행성 뇌질환에서 도파민 세포와 알파-시누클레인을 조절하는 Srpk3 유전자 발현에 의한 물질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 약제학적 조성물; 및
상기 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하는 파킨슨병 치료제. - 제3항에 있어서,
상기 Srpk3 유전자 발현에 의한 물질은 세린/아르기닌이 풍부한 단백질 특이적 키나아제 3인 Srpk3인 파킨슨병 치료제. - 다음의 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제의 후보물질로 스크리닝하는 방법을 제공한다:
(a) 파킨슨병 모델로 생성된 실험 동물에 적어도 하나의 후보 물질을 투여하는 단계; 및
(b) Srpk3 유전자의 발현량을 측정하는 단계, 상기 Srpk3 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우에는
상기 후보 물질은 파킨슨병 예방 또는 치료용 물질로 판정된다. - 대상체로부터 검체를 분리하는 단계:
상기 검체로부터 Srpk3 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
상기 Srpk3 유전자의 발현 수준이 조절되는 경우 상기 대상체에 대해 파킨슨병으로 진단하는 단계를 포함하는 파킨슨병 진단방법.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020210042660A KR20220136701A (ko) | 2021-04-01 | 2021-04-01 | Srpk3을 포함하거나 조절하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020210042660A KR20220136701A (ko) | 2021-04-01 | 2021-04-01 | Srpk3을 포함하거나 조절하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20220136701A true KR20220136701A (ko) | 2022-10-11 |
Family
ID=83599158
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020210042660A KR20220136701A (ko) | 2021-04-01 | 2021-04-01 | Srpk3을 포함하거나 조절하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR20220136701A (ko) |
-
2021
- 2021-04-01 KR KR1020210042660A patent/KR20220136701A/ko not_active Application Discontinuation
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kawaguchi et al. | Prior starvation mitigates acute doxorubicin cardiotoxicity through restoration of autophagy in affected cardiomyocytes | |
March-Diaz et al. | Hypoxia compromises the mitochondrial metabolism of Alzheimer’s disease microglia via HIF1 | |
Zhang et al. | Atorvastatin prevents amyloid-β peptide oligomer-induced synaptotoxicity and memory dysfunction in rats through a p38 MAPK-dependent pathway | |
Miyamoto et al. | PACAP38 suppresses cortical damage in mice with traumatic brain injury by enhancing antioxidant activity | |
CN114712503B (zh) | c-Abl抑制剂在制备预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用 | |
US20210186980A1 (en) | COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF INTRACTABLE EPILEPSY COMPRISING mTOR INHIBITOR | |
US20190194324A1 (en) | THERAPEUTIC USES OF LAG3 THE (alpha)-SYNUCLEIN TRANSMISSION RECEPTOR | |
CA2758829C (en) | Method of treating demyelinating disease | |
US20210101966A1 (en) | Pharmaceutical composition comprising expression or activity inhibitor of c-src for preventing or treating synucleinopathy | |
US20220233443A1 (en) | Production and use of extracellular vesicle-contained enampt | |
KR20220136701A (ko) | Srpk3을 포함하거나 조절하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 | |
CN110099688A (zh) | 骨骼肌肥大诱导物 | |
KR102663668B1 (ko) | Trdn을 포함하거나 조절하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 | |
Yu et al. | Piezo1 is the cardiac mechanosensor that initiates the hypertrophic response to pressure overload | |
JP7023518B2 (ja) | 分泌障害の処置のための方法および組成物 | |
CN110087644A (zh) | 作为骨骼肌肥大诱导物的lsd1抑制剂 | |
KR102379145B1 (ko) | PICALM 저해제 및 mTORC1 저해제를 포함하는 당뇨병 매개 신경퇴행성질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 | |
EP3747468A1 (en) | Therapeutic agent for frontotemporal lobar degeneration, method for screening therapeutic agent for frontotemporal lobar degeneration and method for treating frontotemporal lobar degeneration | |
Lei | The roles of sphingosine kinase 2 in behaviour, myelination and protection against Alzheimer’s disease | |
Yi et al. | The protective role of tacrine and donepezil in the retina of acetylcholinesterase knockout mice | |
KR102376945B1 (ko) | 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 | |
Liu | Mechanisms of Neurodegeneration in Niemann-Pick Type C Disease | |
WO2024143309A1 (ja) | 神経型ゴーシェ病の予防・治療剤 | |
KR102000694B1 (ko) | Creb 저해제를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물 | |
KR20230082790A (ko) | Itga7을 포함하거나 조절하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E902 | Notification of reason for refusal |