KR102376945B1

KR102376945B1 - 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제

Info

Publication number: KR102376945B1
Application number: KR1020190170601A
Authority: KR
Inventors: 여수정
Original assignee: 상지대학교산학협력단
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2022-03-21
Also published as: KR20210078794A

Abstract

본 명세서는 serping1의 발현을 제어하는 serping1 siRNA를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 파킨슨병 치료제를 개시한다.

Description

파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제{Parkinson's disease pharmaceutical composition and its therapeutic agent}

본 명세서는 파킨슨병에 사용되는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 제공한다.

파킨슨병(Parkinson's disease(PD))은 만성 진행성 신경 퇴행성 질환이다. 주요 병리학적 특징은 주로 SN(Substantia Nigra)에서 도파민성 뉴런의 극적인 손실이며, 세포질 내성 루이 소체(intracytoplasmic Lewy bodies) 및 영양 장애 성 신경 돌기(dystrophic neurites)의 형성이다.

그러나, 도파민성 뉴런의 손실 배후의 메카니즘은 아직 명확하지 않다.

본 실시예들은 파키슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 제공한다.

일 실시예는, serping1 siRNA를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 제공한다.

다른 실시예는 세린/시스테인 프로테이나제 억제제(serping1)인 serping1의 발현을 제어하는 serping1 siRNA를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병용 약제학적 조성물을 제공한다.

또 다른 실시예는 세린/시스테인 프로테이나제 억제제(serping1)인 serping1의 발현을 제어하는 serping1 siRNA를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 상기 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하는 치료제를 제공한다.

본 실시예들에 따르면, 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 파키슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공한다.

도 1은 만성 MPTP 유도 파킨슨증 마우스 모델에서 SN(substantia nigral)와 striatum (ST)에서 감소된 tyrosine hydroxylase(TH) 발현의 대표 이미지이다.
도 2는 MPTP 처리에 의해 Serping1 신호가 증가한(28 일 동안 하루에 한 번 20mg/kg) 것을 나타낸다.
도 3은 MPP + 처리된 SH-SY5Y에서 TH(티로신 하이드록실라제)와 함께 국소화된 Serping1을 도시하고 있다.
도 4는 웨스턴 면역 블롯 분석(a)은 Serping1 siRNA의 투여가 Serping1 및 α-synuclein(α-syn) 발현을 감소시켰지만 SH-SY5Y 세포에서 TH 발현을 증가시켰음을 보여준다.
도 5는 SH-SY5Y 세포에서 MPP + 중독에 대한 Serping1 siRNA의 신경 보호 효과를 나타낸다.

이하, 본 발명의 일부 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다. 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명의 실시예들을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료", "억제" 및 "약화"란, 본 발명의 조성물을 개체에 사용하여, 특정 세포의 분화나, 특정 물질의 수준, 특정 질병 또는 질환의 진행을 감소시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"란, 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.

이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 serping1 siRNA를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제에 대하여 설명한다.

일 실시예는, serping1 발현이 도파민성 뉴런의 TH 발현에 밀접한 관련이 있음을 확인하고 serping1 siRNA을 사용하므로 serping1 발현이 녹다운되는 것을 확인하므로, 도파민성 뉴런의 TH 발현에 대해 serping1 siRNA의 치료 타겟으로서의 역할을 제공한다.

다른 실시예는 serping1의 발현을 제어하는 serping1 siRNA를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병용 약제학적 조성물을 제공한다.

또 다른 실시예는 serping1의 발현을 제어하는 serping1 siRNA를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하는 치료제를 제공한다.

상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 명세서의 serping1 siRNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 파킨슨병 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 명세서의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 명세서의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를더 함유할 수 있다.

본 명세서의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물 및 그 치료제의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥 내, 피하, 복강 내, 흡입, 피부도포 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다.

또 다른 실시예는 serping1 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 제공한다.

serping1 siRNA를 포함하는 올리고 RNA 구조체는 다음 구조식 1으로 표시될 수 있다.

[구조식 1]

X-Y_Z

구조식 1에서, X는 친수성 물질을 포함하고, Y는 serping1 siRNA를 의미하고, Z는 소수성 물질을 포함할 수 있다.

예를 들어, X는 A-B-로, A는 친수성 물질을 의미하고, B는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미할 수 있다. Y는 -C-D로, C는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하고, D는 소수성 물질을 의미할 수 있다.

상기 구조식 1에서의 친수성 물질은 분자량이 200 내지 10,000 인 양이온성 또는 비이온성고분자 물질인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 2,000인 비이온성 고분자 물질이다. 예를 들어, 친수성 고분자 물질로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린 등의 비이온성 친수성 고분자 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 구조식 1에서의 소수성 물질은 소수성 상호작용을 통해 구조식 1에 따른 올리고뉴 클레오티드 구조체로 구성된 나노입자를 형성하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 물질은 분자량이 250 내지 1,000인 것이 바람직하며, 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린 (diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.

본 발명에 따른 구조식 1에서의 친수성 물질 또는 소수성 물질과 serping1 siRNA는 단순 공유 결합 또는 링커가 매개된 공유결합에 의해 결합된다. 상기 공유결합을 매개하는 링커는 친수성 물질, 또는 소수성 물질과 serping1 siRNA의 말단에서 공유결합하며, 필요에 따라 특정 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 링커는 또 다른 실시예에 따른 올리고 RNA 구조체의 제조과정 중 serping1 siRNA 및/또는 친수성 물질(또는 소수성 물질)을 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 사용될 수 있다. 상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 또는 인산화결합이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

예를 들어, 또 다른 실시예에 따른 siRNA를 활용한 후보 유전자를 녹다운시키는 약제학적 조성물 및 그 치료제는, 후보 유전자들의 siRNA를 통해 세포주에서 녹다운시켜 도파민세포의 변화양상을 western blot, immunofluorance 등으로 확인하여 신경보호효과와 관련된 유전자들의 기전을 탐색. 후보유전자의 “구조식 1을 갖는 serping1 siRNA를 포함하는 올리고 RNA 구조체”로 제작될 수 있다.

“구조식 1을 갖는 serping1 siRNA를 포함하는 올리고 RNA 구조체”를 포함하는 약제학적 조성물 및 그 치료제는 합성 oligonucleotide 약물로서, 예를 들어 PEG와 탄화수소(hydrocarbon)이 conjugation된 DNA와 RNA의 이중나선으로, 목표 mRNA를 세포 내에서 분해시키는 기능을 가진 siRNA계통의 약물이다.

현재 상용화된 siRNA 기반 치료 기술로는 2018년 8월 미국 FDA에서 판매승인을 받은 Alnylam사의 신약 온파트로(Onpattro, patisiran)로 RNA 간섭(RNAi) 치료제로서 처음으로 판매 승인을 받았고 많은 신약들이 개발되고 있어 차세대 신약의 플랫폼으로 부각되고 있다.

siRNA 기반 치료제는 기술의 특성 상 단회 투여로 비교적 장시간 목표 유전자의 발현이 저해되는 장점이 있고 sequence specific하게 작용을 하므로 선택적으로 모든 mRNA를 제어할 수 있는 물질이다.

또한 siRNA기반 치료제는 어떠한 질병에 대한 치료제도 개발이 가능하다는 장점을 갖고 있기 때문에, 특정 질병에 대한 고유한 목표 유전자 선정된 경우 타 기술 기반 의약품에 비하여 개발기간을 단축할 수 있는 장점을 가진다. 현재 siRNA의 체내 안정성과 전달 효율이 매우 낮은 것이 siRNA 기반 치료제의 실용화 단계에서 가장 중요한 걸림돌이며, 기존 siRNA 치료제/전달 기술이 가지고 있는 효과적 전달 및 대량생산의 용이성, 부작용 등의 문제들을 해결할 수 있는 기술의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.

또 다른 실시예에 따른 구조식 1을 갖는 serping1 siRNA를 포함하는 올리고 RNA 구조체를 포함하는 약제학적 조성물 및 그 치료제는 본 발명자가 개발한 혁신적인 신기술로 기존의 siRNA 치료제 기술의 문제점들을 극복하여 siRNA를 생체 내 질병 표적장기 세포까지 효율적이고 안정적으로 전달할 수 있는 나노입자형 RNAi 신약물질이다.

또 다른 실시예에 따른 구조식 1을 갖는 serping1 siRNA를 포함하는 올리고 RNA 구조체를 포함하는 약제학적 조성물 및 그 치료제는 전세계 주요국가에 물질특허가 등록된 native siRNA/miRNA를 전달하는 단분자 나노입자 전달체 신약물질로서, 단일 분자구조로 스스로 나노입자로 만들어져 주사제로 사용되었을 때 혈액 내에서 안정적인 나노입자 구조를 유지하며 암 및 질병조직에만 선택적으로 전달된 후, 세포 내에서 활성화된 siRNA로 전환되어 표적 RNA를 분해시키는 획기적인 RNAi 물질이다.

현재 임상테스트에 사용 중인 대부분의 siRNA 치료제 기술은 siRNA 제조 후, 제조된 siRNA를 생체 조직 내로 전달해 주는 전달체(delivery vehicle)인 리포좀(liposome)과 섞어 주는 포뮬레이션(formulation 혹은 encapsulation)의 과정을 겪게 되는데 이 때 siRNA가 리포좀 안으로 들어가는 효율(loading efficiency)의 조절이 용이하지 않으며, 낮은 loading efficiency로 인해 대량생산 시 이를 분리, 정제하는 복잡한 QC 과정을 겪게 된다.

또한 이때 리포좀의 구성성분으로 사용되는 지질(lipid) 자체의 독성 또한 보고되고 있다. 이러한 포뮬레이션을 기반으로 하는 리포좀 siRNA 신약기술 대비 또 다른 실시예에 따른 구조식 1을 갖는 serping1 siRNA를 포함하는 올리고 RNA 구조체를 포함하는 약제학적 조성물 및 그 치료제는 전자동 합성라인에서 단일분자(single chemical entity)로 만들어지며 포뮬레이션을 거치지 않고 수용액 안에서 자가 조립되어 안정적인 나노입자의 형태로 만들어 짐으로 대량생산과 제조공정상의 QC(Quality Control) 과정의 단순화를 통해 생산원가를 획기적으로 절감할 수 있다. 또한 생체 적합형 지질과 PEG를 사용함으로 주사제로 사용 시 독성 및 부작용이 없다.

이하, 실시예, 및 실험예를 기술함으로써 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예, 및 실험예는 본 발명의 일 예시에 불과하며, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

구체적으로, 하기의 실시예, 및 실험예는 serping1 발현이 도파민성 뉴런의 TH 발현에 밀접한 관련이 있음을 확인하고 serping1 siRNA을 사용하므로 serping1 발현이 녹다운되는 것을 확인하였다.

실시예 1: 약제학적 조성물

그러나, 도파민성 뉴런의 손실 배후의 메카니즘은 아직 명확하지 않다. 도파민성 뉴런의 손실을 일으키는 원인을 조사하기 위해, 본 발명자들은 1- 메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라 하이드로 피리딘(MPTP)에 중독된 생쥐의 SN에서 유전자 발현의 패턴을 분석하였다. 마우스의 SN에서 도파민성 세포의 하향 조절(down-regulation)이 일어났다.

본 발명자들은 분명히 만성 MPTP- 중독에서 상향 조절되는(upregulated) 유전자 중 하나로서 세린/시스테인 프로테이나제 억제제(Serping1)를 확인하였다.

웨스턴 블롯 분석의 결과는 도파민성 세포의 하향 조절과 함께, 만성 MPTP-유도 파킨슨증 마우스에서 SN에서 Serping1 발현의 증가가 입증되었음을 보여 주었다.

Serping1과 도파민성 세포 사이의 발현 상관 관계를 조사하기 위해, SH-5YSY 세포를 Serping1 siRNA로 녹다운시킨 후, 도파민성 세포의 상향 조절이 관찰되었다. 또한, 도파민성 세포 손실에 대한 신경 보호 효과는 MPP + 처리된 SH-SY5Y 세포에서 siRNA에 의한 Serping1 발현을 억제함으로써 입증되었다.

이러한 결과 Serping1의 증가된 발현은 만성 MPTP 유발 파킨슨증 마우스의 SN 및 SH-SY5Y 세포에서 도파민성 세포 사멸에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다.

개요

파킨슨병(Parkinson's disease (PD))은 주요 행동 증상을 특징으로 하는 퇴행성 신경 질환이며 진전, 운동 장애, 운동 완서(bradykinesia, 運動緩徐) 및 강성을 포함한다(Jankovic, 2008). 파킨슨병은 SN에서 도파민성 뉴런의 사멸에 기인한다(SN; (Chauhan et al., 2001; Fernandez-Espejo, 2004; Goto et al., 1989; Kim et al., 2003)). SN은 여러 가지 뇌 기능, 특히 운동 계획, 안구 운동, 학습, 보상 추구 및 중독에 중요한 영향을 준다. SN 지역의 손상으로 인한 총 운동 장애는 파킨슨병의 증상이다.

최근의 연구에서, 본 발명자는 SN 세포가 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라 하이드로 피리딘(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)에 중독된 생쥐에서 유전자 발현 패턴을 변화시켰으며, 이는 도파민성 세포 손실을 일으키는 것을 분석했다(Yeo et al 2015년). 높은 감도와 신뢰성을 가진 자동화된 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 기반 발현 프로파일링 시스템의 적용을 통해(Maelicke and Lubbert, 2002), MPTP 주입으로 인한 퇴행성 과정에서 발현을 변화시키는 몇 가지 유전자를 발견했다. 특히, 세린 (또는 시스테인) 펩티다아제 억제제, 클로드 G, 구성원 1 (Serping1)은 만성 MPTP 중독의 결과로 상당히 증가 조절되었다(significantly upregulated).

Serping1은 보체 성분 1 억제제(complement component 1 inhibitor)인 C1INH로 알려진 세린/시스테인 프로테이나제 억제제(serine/cysteine proteinase inhibitor)인데, Serping1 유전자는 세린 프로테아제 억제제(serpin)의 일종인 C1 억제제라 불리는 단백질을 만드는 지침을 제공한다. Serping1 유전자는 혈액, 간, 신장, 폐, 심장 및 뇌에서 발현된다(Heit et al., 2013). serpin은 특정 단백질의 활성을 차단하여 여러 유형의 화학 반응을 제어하는 데 도움이 된다(Beinrohr et al., 2007). Serping1은 염증을 포함하여 혈관 유지와 관련된 다양한 과정을 제어하는 데 중요하다(Farfara et al., 2019). 보체 관련 유전자의 유전자 발현 분석은 췌장암(Osther et al., 2019)과 HIV + 환자의 단핵구(monocytes)에서 Serping1의 상향 조절을 보여준다(Sanfilippo et al., 2017).

위의 흥미로운 관찰은 MPTP에 의해 유도된 Serping1 증가가 MPTP- 처리된 동물에서 도파민성 세포 감소를 유발한다는 가설을 세웠다. 이 가설을 테스트하기 위해, MPTP 중독이 도파민성 세포 사멸을 야기하는 만성 MPTP- 유발 파킨슨증 마우스 모델에서 Serping1 발현이 증가하고 티로신 하이드록 실라제 발현이 감소됨을 보여주는 실험을 수행하였다. 또한, 도파민성 세포 손실에 대한 신경 보호 효과는 SH-SY5Y 세포에서 siRNA에 의한 Serping1 발현을 억제함으로써 입증되었다.

본 명세서에서 주요 발견은 Serping1 발현의 증가가 MPTP로 중독된 마우스의 SN 세포에서 도파민성 세포 사멸을 촉진하여 파킨슨증을 발생시키고 siRNA 세포에 의한 Serping1 발현의 감소는 MPP +에 의해 처리된 SH-SY5Y에서 도파민성 세포 감소를 억제한다는 것이었다. 본 명세서는 SN에서 도파민성 세포 손실과 관련된 Serping1의 역할을 명확히 하는 장을 제공할 것이다.

참고로,serpin은 가장 크고 기능적으로 다양한 프로테아제 억제제 계열을 나타낸다. serpin이라는 이름은 이 계열의 첫 번째 기능인 세린 프로테이나제 억제제에서 유래했다. 본래 상태에서, serpin은 단량체 단백질로서 존재한다. 대부분의 serpin 패밀리 구성원은 키모 트립신 패밀리의 세린 프로테이나제를 억제하여 단백질 분해 캐스케이드를 억제한다. 그러나, 일부 serpin은 호르몬 수송 및 기타 메커니즘과 같은 촉매 활성의 억제와 관련이 없는 기능을 나타낸다.

대략 1,500 개의 serpin 서열이 확인되었다. 그것들은 5개 왕국의 게놈에서 발견된다. 인간 추정 기능성 단백질 코딩 유전자는 36 가지가 있다. serpin 수퍼 패밀리는 서열 유사성에 따라 클래드들(clades)이라 불리는 그룹들로 나뉜다. 클레이드는 A-P로 분류되며 클로드 A-I는 인간 serpin을 나타낸다.

serpin은 노출된 반응성 중심 루프(RCL)로 잘 보존된 2 차 구조를 가지고 있으며, 프로테아제 활성 부위와 상호 작용하여 프로테아제 활성을 억제한다. serpin이 구조적 변화를 겪는 능력은 serpin이 자살 기질 억제 메커니즘을 통해 작용하는 기능에 중요하다. 대부분의 serpin은 세린 프로테아제를 선택적으로 억제하지만, 일부는 시스테인 프로테아제, 예컨대 카스파제 및 카테스핀을 억제하고, 다른 사람들은 호르몬 수송과 혈압 조절을 수행한다. serpin은 호르몬 수송, 코르티코 스테로이드 결합, 응고 및 혈압 조절에서 중요한 생리학적 역할을 한다.

방법

1.1. 파킨슨증의 MPTP 모델

6 주령의 수컷 내성 C57BL / 6 마우스(20-22g; DBL, 한국)를 대조군(CTL) 및 MPTP- 치료군(MPTP)의 두 그룹으로 나누었다. 대조군 그룹의 마우스에 4주 동안 매일 1회 식염수 0.9% (100μL)를 복강 내 주사하고, MPTP 그룹의 마우스에 식염수 0.9% (100μL)의 MPTP-HCl (20mg/kg의 유리 염기)을 복강 내 주사하였다). 4주 동안 24시간 간격으로 지속적인 만성 파킨슨병 모델을 생성한다. 최종 MPTP 처리 후, 마우스를 16.5% 우레탄을 사용하여 마취시키고, 차가운 0.05-M 나트륨-포스페이트 완충액으로 심내 관류하여 면역 조직 화학 평가를 가능하게 하였다. 파킨슨증의 MPTP 모델은 도파민성 세포 사멸로 확인되었다(Choi and Lim, 2010). α-syn 내포물이 포함된 만성 파킨슨증 마우스 모델을 준비하는 데 사용되는 방법론에 대한 자세한 설명은 Choi and Lim (2010)을 참조할 수 있다(파킨슨증의 MPTP 모델은 Choi et al., 2011a, 2011b; Yeo et al., 2013). 상지대 학교 동물 실험위원회는 이 연구에 사용된 모든 동물 프로토콜을 승인했습니다. 사용되었지만 언급되지 않은 시약은 미국 시그마에서 구입했다.

1.2. RNA 추출 및 마이크로 어레이 분석

제조사의 지시에 따라 RNeasy Plus Mini 키트(QIAGEN, 미국)를 사용하여 각 그룹의 양측 SN 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. 분리된 RNA 품질을 NanoDrop ND-1000 분광 광도계(NanoDrop Technologies, 미국)를 사용하여 추정하고 정량하였다. 총 RNA의 분취량(300ng)을 이전에 보고된 바(Choi et al., 2011; Lin et al., 2010)와 같이 GeneChip Whole Transcript(WT) Sense Target 표지 분석 매뉴얼에 따라 Affymetrix GeneChip® Mouse Gene 1.0 ST Array(유전체 와이드 발현 프로파일링 칩; 35,557 개 프로브의 28,853 개의 유전자; Affymetrix, 미국)에 적용하였다. 절차는 다음과 같이 수행되었습니다.

-T7-(N)6 프라이머 및 폴리-A RNA 대조군과 각 그룹의 SN으로부터 분리된 300ng의 총 RNA와 혼합

-첫 번째 사이클, 첫 번째 가닥 상보성 DNA (cDNA) 및 두 번째 가닥 cDNA의 합성

-1 차 cRNA의 합성 및 cRNA의 정화

-2 차 사이클, 단일 가닥 cDNA (ss cDNA)의 합성 및 ss cDNA의 정리

-ss cDNA의 단편화 및 단편화된 ss cDNA의 표지

-ss cDNA의 GeneChip에 대한 하이브리드화

-Fluidics 450 스테이션 및 GeneChip 운영 소프트웨어 (GCOS, Affymetrix)를 사용하여 GeneChip의 염색, 세척 및 스캔.

1.3. 마이크로 어레이 데이터 분석

신호 강도의 유용성은 먼저 스캔된 이미지의 육안 검사에 의해 평가되었다. 그 후, 폴리-A 대조군 및 하이브리드화 대조군의 신호 강도의 순서를 확인하기 위해 Expression Console 소프트웨어(Affymetrix, 미국)를 사용하여 스캔된 데이터의 품질 관리를 수행하였다. 마이크로 어레이 데이터는 GenPlex ver. 3.0(ISTECH, 한국)을 사용하여 분석되었다. 다음과 같은 조건에서 총 4 개의 CEL 파일(각 그룹에서 생성된 2개의 CEL 파일 x 2개의 실험 그룹)이 업로드 및 정규화되었다; (1)완전 일치 (PM)-PM 강도 조정으로만 사용, (2)베이스 2 (log2)를 이용한 로그 변환을 위한 프로브 세트 요약 알고리즘으로써 강력한 멀티 칩 분석(RMA) 정량 방법, 및 전처리 모듈에서 예비 데이터의 품질을 평가하기 위한 양자화 정규화 방법, 이는 데이터 품질 관리로서 기능한다. 28,853개의 유전자의 평균 신호 강도는 각 그룹에서 2 개의 칩으로부터 얻어졌다. 정규화 후, 폴드 체인지 컷오프 조건 (2)과 학생의 t- 검정 유의 기준 (P <0.05)의 조건을 만족하는 GeneChip의 차등 발현 유전자 (DEG)를 DEG- 찾기 모듈(DEG-finding module)을 사용하여 확인했다.

1.4. 실시간 RT-PCR

실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 분석을 위해, 샘플(CTL, MPTP 및 MPTP-A)의 총 RNA(500ng)를 SuperScript First-strand Synthesis Kit (Invitrogen Life Technologies, 미국)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 반응시켰다. 대표적인 DEG의 고급 상대 발현 수준(relative expression levels of representative DEGs)을 LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche Diagnostics, 독일)를 사용하여 LightCycler 480 II 실시간 PCR 기기 및 LightCycler 480 소프트웨어 ver. 1.5.0.39(Roche Diagnostics; 독일)로 모니터링하였다. 평균 교차점(Mean crossing point(CP)) 값을 획득한 후, 다양한 그룹에서의 표적 유전자의 발현 수준을 고급 상대 정량법을 사용하여 참조 유전자인 글리세르 알데히드-3- 포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)의 것과 비교하였다. 표적 유전자의 농도 대 기준 유전자의 농도의 비가 얻어졌다. 각 유전자에 대한 프라이머 서열을 표 1에 나타낸다. 각 프라이머 세트의 특이성은 겔 전기 영동에 의해 각 생성물의 용융 온도 및 크기를 결정함으로써 확인되었다.

Gene symbol	Gene accession No	Primer sequences (5'3')
Serping1	NM_009776	F: ccaaaggtgtcacttctgtgtc R: gagatgcattcacataggtgtcc
GAPDH	NM_008084	F: gtcttcaccaccatggagaagg R: tcatggatgaccttggccag

1.5. 세포주 및 배양

인간 유래 SH-SY5Y 세포주로부터의 세포를 표준 배양 조건(5% CO₂, 37°C) 하에서 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum(FBS)), 100U/ml의 페니실린, 0.1mM의 비필수 아미노산 및 100mg/ml의 스트렙토 마이신을 함유하는 최소 필수 배지(MEM; Welgen, Namcheon-myeon, South Korea)에서 배양 하였다(FBS, BioWhittaker).

1.6. si RNA(Short interfering RNA) 녹다운

Serping1(5'-CAC CUA UGU GAA UGC AUC U-3 ')에 대한 스텔스 siRNA(Stealth siRNA) 및 음성 대조군 듀플렉스(즉, Serping1, 5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'에 대한 스크램블 siRNA)는 Bioneer Inc에서 구입했다.

1.7. 면역 조직 화학

4주 후, 마우스의 뇌를 제거하고, 4°C에서 12시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드를 함유하는 0.05-M 나트륨-포스페이트 완충액에 고정한 후, 12시간 동안 수크로오스로 탈수시킨 0.05-M 나트륨-포스페이트 완충액으로 린스하고, 수크로스(sucrose)로 4 ℃에서 12 시간 동안 탈수시킨 후 동결 절편화시켰다.

뇌의 코로날 섹션(30-μm 두께)을 냉동 조직절편기(cryomicrotome)을 사용하여 절단했다. 면역 조직 화학 분석은 ABC 키트 및 Mouse on Mouse(M.O.M) 면역 검출 키트(Vector Laboratories, CA) 및 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 방법의 변형을 사용하여 수행되었다. 간단히, 전체 ST 및 SN 영역을 포함하는 섹션을 3% H₂O₂와 함께 인산 완충 식염수(PBS; pH 7.4)에서 배양하고, 1시간 동안 PBS에서 3% 소혈청 알부민(BSA) 및 0.3% 트리톤 X-100에 노출시켰다. 그런 다음 아비딘 비오틴 차단 키트(Vector Laboratories)로 치료했습니다. 토끼 항 -TH 항체 를 사용한 경우, 섹션을 M.O.M. 1차 항체와 함께 배양하기 전에 실온에서 1시간 동안 마우스 Ig-차단 시약 (Vector Laboratories)으로 처리했다.

그 후, 각 섹션을 항-TH 항체(1:2,000; Santa Cruz Biotechnology, 미국) 로 4℃에서 밤새 염색하여 ST와 SN 영역의 뉴런에서 도파민 작용을 확인하였다. 이어서, 섹션을 비오티닐화된 항-마우스 IgG로 이어서 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체로 처리하고, 디아미노 벤지딘-과산화수소 용액(0.003% 3,3-디아미노 벤지딘 및 0.03% 과산화수소를 0.05M-Tris, pH7.0)을 사용하여 현상시켰다.

1.8. 면역 형광

세포를 4% 파라 포름 알데히드를 함유하는 0.05-M 나트륨-포스페이트 완충액에 4℃에서 12시간 동안 후-고정시키고, 0.05-M 나트륨-포스페이트 완충액으로 헹구고, 면역 조직 화학에 사용된 것과 동일한 절차를 사용하여 처리하였다. 1차 항체 및 비오티닐화된 항-마우스 IgG와 함께 배양한 후, 각 섹션을 TH (1:2,000) and Serping1(1:1000)에 대해 플루오레세인 아비딘 DCS(Vector Laboratories, CA)로 처리하였다. 이어서, 세포는 아비딘/비오틴 차단 키트 및 M.O.M 마우스 Ig 차단 시약(Vector Laboratories, CA)으로 추가로 처리한 후, 4℃에서 밤새 항-TH(anti-TH) 또는 항-serping IgG(anti-SGK1 IgG)로 염색하였다. 각 그룹을 비오티닐화된 항 마우스 IgG(antimouse IgG)로 처리한 후, 로다민 아비딘 D(Vector Laboratories, CA)와 배양하였다. Nicon X-cite 시리즈 120 Q 현미경(일본 니콘, 일본)을 사용하여 사진 문서화를 수행하였고, 노출 파라미터는 대조군 및 PTP+ 샘플에 대해 동일하였다.

1.9. 웨스턴 블로팅

양측 ST 및 SN 영역을 30분 동안 얼음상에서 20mM 방사선 면역 침전 분석 완충제(radioimmunoprecipitation assay buffer(RIPA))에서 균질화시켰다. 4℃에서 20분 동안 12,000℉에서 20분 동안 원심 분리한 후, 동일한 단백질 농도(30μg 총 단백질)의 가용성 상등액 샘플을 12% 소듐 도데실 설페이트-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)을 사용하여 분리한 다음 폴리 비닐리덴디플루오라이드(polyvinylidene difluoride (PVDF)) 막(Bio-Rad; 미국)으로 옮겼다. 막을 실온에서 1시간 동안 0.1% 트리스 완충 식염수(Tris-buffered saline(TBS); 20-mM 트리스-HCl (pH 7.5) 및 0.1% 트윈-20을 함유하는 150-mM NaCl; TBST) 중 5% 탈지유(skim milk)로 막을 차단하고 그 후 항-TH(anti-TH)(1:2,000), 항-α-syn(anti-α-syn)(1:500, Santa Cruz Biotechnology, 미국)), 항-Serping1(1:2000, Cloud-clone corp., 미국) 및 항-β-액틴(anti-β-actin)(1:5,000, Santa Cruz Biotechnology) 항체와 함께 배양했다. 0.1% TBST로 세척한 후, 막을 항-마우스 IgG- 퍼옥시다제 항체(anti-mouse IgG-peroxidase antibody)(1:2,000, Bio-Rad)와 배양하고 피어스 ECL(Pierce ECL) 웨스턴 블롯팅 기질 (Thermo Scientific, 미국)을 사용하여 항원-항체 복합체를 시각화하였다.

1.10. 통계 분석

SPSS 18(SPSS Inc. 출시 2009, PASW Statistics for Windows, 버전 18.0, 시카고: SPSS Inc.)의 스튜던트 t- 테스트 및 분산 분석(Student's t-test and the analysis of variance)(ANOVA)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 모든 값은 평균 ± 표준 오차(SE)로 표시된다.

결과

만성 MPTP- 유도된 파킨슨증(chronic MPTP-induced Parkinsonism) 마우스 모델의 확립을 검증하기 위해, 본 발명자들은 tyrosine hydroxylase(TH)의 발현이 피킨슨병 환자(Pardridge, 2005) 및 파킨슨증 동물의 뇌에서 현저하게 감소되는 것으로 밝혀졌기 때문에 TH의 발현 변화를 먼저 평가하였다((Kang et al., 2007; Yeo et al., 2015).

ST와 SN(substantia nigral) 영역의 tyrosine hydroxylase(TH) 수준은 대조군과 비교하여 MPTP 그룹 (도 1b 및 d)에서 눈에 띄게 낮았다(도 1a 및 c). 면역 조직 화학적 관찰에서와 같이, 웨스턴 블롯 분석은 또한 t-테스트 분석에 기초하여 MPTP에 중독된 생쥐의 뇌에서 ST와 SN(substantia nigral) 영역에서 상당한 TH 감소(P- 값 <0.005)를 보여 주었다(도 1e). 이는 MPTP 처리로 인한 TH 면역 반응성의 통계적으로 유의한 감소를 입증하였다(도 1f).

도 1은 만성 MPTP 유도 파킨슨증 마우스 모델에서 SN(substantia nigral)와 striatum (ST)에서 감소된 tyrosine hydroxylase(TH) 발현의 대표 이미지이다.

항-티로신 하이드록실라제(TH; a, b, 100x; c, d, 40x;) 항체, CTL, 식염수 주입, MPTP, MPTP 주입(20 mg/kg, 28일 동안 하루에 한 번)를 사용하여 SN (도 1에서 a, b) 및 ST (도 1에서 c, d)를 면역 염색하였다. 웨스턴 면역 블롯 분석(e)은 MPTP 그룹뿐만 아니라 SN 및 ST에서도 TH 발현이 감소된 것으로 나타났으며; 이러한 감소는 100% (f)로 정규화된 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하였다. *는 대조군과 비교하여 p <0.005를 나타낸다.

MPTP 또는 대조군에서 각각의 마우스의 양측 SN 영역에서 얻은 RNA를 GeneChip 마이크로 어레이(Affymetrix, 미국)에 증폭시키고, 단편화시키고, 라벨링하고 하이브리드화시켰다. 올리고 뉴클레오티드 어레이 상에 표현된 28,835개의 유전자 중에서, 대조군과 MPTP- 처리된 마우스 사이에서 로그 2로 변환된 신호 강도의 평균이 1보다 크고(fold change cut-off 1.2), 학생의 t- 테스트(student's t-test )가 선택되어 평가에 사용될 때 p- 값이 0.05보다 작다. 이들 유전자 중에서, Serping1 마이크로 어레이 신호가 추출되었다(도 2). Serping1의 마이크로 어레이 신호 변화에서 볼 수 있듯이, 정량적 실시간 PCR은 MPTP 그룹의 마우스에서 대조군의 마우스와 비교하여 Serping1의 발현이 증가한 것으로 나타냈다(도 2).

도 2는 MPTP 처리에 의해 Serping1 신호가 증가한(28 일 동안 하루에 한 번 20mg/kg) 것을 나타낸다. t-테스트를 사용하여 분석한 마이크로 어레이 및 정량적 실시간 PCR의 히스토그램은 100%로 정규화된 대조군과 비교하여 MPTP 처리가 마이크로 어레이 분석(p <0.05) 및 웨스턴 블롯 분석(p <0.001)에서 Serping1 발현을 증가시켰음을 보여 주었다. *는 대조군과 비교하여 p <0.05를 나타내고 **은 p <0.005를 나타낸다.

Serping1과 TH 발현 사이에 상관 관계가 있는지 조사하기 위해, SH-SY5Y 세포에서 면역 형광 분석(immunofluorescence analysisO)을 통해 Serping1과 TH 발현을 병합했다. Serping1과 TH의 발현은 대조군과 MPP+ 처리군 모두에 부분적으로 국한된 것으로 나타났지만, MPP + 처리된 SH-SY5Y 세포는 대조군보다 더 많이 발현되는 것으로 밝혀졌다(도 3). MPP + 처리 군에서, Serping1 발현이 증가하였고, 핵 영역에서 나타났으나, 대조군에서는 그렇지 않았다. 이러한 관찰은 Serping1이 적어도 부분적으로 도파민성 뉴런의 TH 발현과 밀접하게 관련될 수 있고 MPP + 중독을 통해 핵 영역에서 증가할 수 있음을 나타낼 수 있다.

도 3은 MPP + 처리된 SH-SY5Y에서 TH(티로신 하이드록실라제)와 함께 국소화된 Serping1을 도시하고 있다. CTL, 처리 없음; MPP +, 500mM MPP + 처리. Fluorescein Avidin (a 및 d, green)을 사용하여 세포를 항-Serping1 (a 및 d) 및 anti-TH (b 및 e) 항체로 면역 형광 라벨링한 다음 Rhodamine Avidin (b and e, red)을 사용하여 Serping1 항체로 이중-면역 표지했다. 오른쪽 패널(c 및 f)은 각각 왼쪽(a 및 d) 및 중간(b 및 e) 패널의 병합된 이미지를 보여준다. 노란색 영역 (흰색 화살표)은 각 오른쪽 패널에서 Serping1과 TH의 공동 위치를 나타낸다. 스케일바 = 25μm.

Serping1 발현과 도파민성 뉴런의 관계를 조사하기 위해 Serping1 siRNA를 사용하여 Serping1 발현이 중단된 SH-SY5Y 세포로 실험을 수행하였다. 웨스턴 면역 블롯 분석은 SH-SY5Y 세포에서 Serping1 siRNA가 Serping1을 감소시키고 TH 발현을 증가시켰지만 α-syn 발현은 감소시켰음을 보여 주었다. 이는 siRNA로 인한 Serping1 발현의 감소가 TH 발현의 증가와 α-syn 발현의 감소를 유발했으며, 이는 Serping1이 어떻게 도파민성 세포를 조절하는지 연구할 수 있는 새로운 장을 마련 해준다(도 4).

도 4는 웨스턴 면역 블롯 분석(a)은 Serping1 siRNA의 투여가 Serping1 및 α-synuclein(α-syn) 발현을 감소시켰지만 SH-SY5Y 세포에서 TH 발현을 증가시켰음을 보여준다. CTL, 대조군 siRNA 처리 (2일 동안 100nM); siRNA 10, Serping1 siRNA 처리 (2일 동안 10 nM); siRNA 100, Serping1 siRNA 처리 (2 일 동안 100 nM). 웨스턴 면역 블롯 분석 (b)는 Serping1, TH 및 α-syn의 발현에 대한 CTL, siRNA 10 및 siRNA 100 히스토그램을 비교하고 있다. *은 P <0.05를 나타내고, **은 P <0.005를 나타내고 ***은 P <0.001을 나타낸다.

Serping1이 도파민성 세포를 어떻게 조절하는지 조사하기 위해 Serping1 siRNA를 이용하여 Serping1 발현이 중단된 SH-SY5Y 세포와 MPP +를 이용한 실험을 수행하였다. 웨스턴 면역 블롯 분석은 SH-SY5Y 세포에서 MPP + 처리가 MPP + 그룹에서 TH 발현을 감소시켰지만, TH 감소는 Serping1 siRNA에 의해 억제됨을 보여 주었다(도 5a). 10nM siRAN에 의해 녹다운되고 MPP + 500μM로 처리된 MPP + 10 군에서, α-syn 발현 및 TH 발현은 대조군과 유사하게 유지되었다(도 5b).

도 5는 SH-SY5Y 세포에서 MPP + 중독에 대한 Serping1 siRNA의 신경 보호 효과를 나타낸다. 웨스턴 면역 블롯 분석 (a)은 SH-SY5Y 세포에서 Serping1 siRNA가 MPP+에 비해 TH 감소를 억제하고 세포 생존력 (b)이 MPP + 10 군에서 CTL과 유사하게 유지됨을 보여주었다. CTL, 100nM 음성 대조군 siRNA 처리, MPP +, 500μM MPP + 처리, MPP + 10, 10nM Serping1 siRNA 및 500μM MPP + 처리, MPP + 100, 100nM Serping1siRNA 및 500μM MPP + 처리. 대조군(CTL)과 비교된 *P <0.01과 **P <0.005과 MPP+와 비교된 #P <0.05은 유의미한 것으로 생각된다.

결론

면역 조직 화학적 관과 웨스턴 블롯 분석은 MPTP에 중독된 생쥐의 뇌에서 ST 및 SN 영역에서 상당한 TH 감소를 보여 주었으며, 이는 MPTP 처리로 인한 TH 면역 반응성의 통계적으로 유의한 감소를 입증하였다(도 1f).

그런 다음 MPTP 주입으로 인한 퇴행 과정에서 발현을 변화시키는 몇 가지 유전자를 발견했습니다. 대조군과 비교하여 MPTP 군에서 유의하게 증가된 유전자 중에서, Serping1 마이크로 어레이 신호가 추출되었다. Serping1의 마이크로 어레이 신호 변화에서 볼 수 있듯이, 정량적 실시간 PCR은 MPTP 그룹의 마우스에서 대조군의 마우스와 비교하여 Serping1의 발현이 증가한 것으로 나타났습니다 (도 2).

Serping1은 제1보체 성분(first complement component)의 활성화된 C1r 및 C1을 억제함으로써 보체 활성화를 조절한다. Serpin은 세포 사멸의 유도와 관련이 있지만(Patston et al., 1991), Serping1 발현이 도파민성 세포 손실과 관련이 있는 것으로 보고된 바는 없다.

면역 조직 화학적 관찰에서와 같이, 웨스턴 블롯 분석은 MPTP로 중독된 마우스의 뇌에서 ST 및 SN 영역에서 유의한 TH 감소를 보여 주었다. 이는 MPTP 처리로 인한 TH 면역 반응성의 통계적으로 유의한 감소를 입증하였다(도 1f). Serping1의 마이크로 어레이 신호 변화에서 볼 수 있듯이, 정량적 실시간 PCR은 MPTP 그룹의 마우스에서 대조군의 마우스와 비교하여 Serping1의 발현이 증가한 것으로 나타냈(도 2).

Serping1과 TH 발현 사이에 존재하는 상관 관계가 있는지 조사하기 위해, H-SY5Y 세포에서 면역 형광 분석을 통해 Serping1과 TH의 발현을 병합했다. Serping1과 TH의 발현은 대조군과 MPP + 처리 군 모두에 부분적으로 국한된 것으로 나타났지만, MPP + 처리된 SH-SY5Y 세포는 대조군보다 더 많이 발현되는 것으로 밝혀졌다(도 3). MPP + 처리 군에서, Serping1 발현이 증가하였고, 대조군이 아닌 핵 영역에서 나타났다. 이러한 관찰은 Serping1이 적어도 부분적으로 도파민성 뉴런의 TH 발현과 밀접하게 관련될 수 있고 MPP + 중독을 통해 핵 영역에서 증가할 수 있음을 나타낼 수 있다.

Serping1 발현과 도파민성 뉴런의 관계를 조사하기 위해 Serping1 siRNA를 사용하여 Serping1 발현이 중단된 SH-SY5Y 세포로 실험을 수행하였다. 웨스턴 면역 블롯 분석은 SH-SY5Y 세포에서 Serping1 siRNA가 Serping1을 감소시키고 TH 발현을 증가시켰지만, α-syn 발현은 감소시켰음을 보여 주었다. 이는 siRNA로 인한 Serping1 발현의 감소가 TH 발현의 증가와 α-syn 발현의 감소를 유발했으며, 이는 Serping1이 어떻게 도파민성 세포를 조절하는지 알 수 있다(도 4).

Serping1이 도파민성 세포를 어떻게 조절하는지 조사하기 위해 Serping1 siRNA를 이용하여 Serping1 발현이 중단된 SH-SY5Y 세포와 MPP +를 이용한 실험을 수행하였다. 웨스턴 면역 블롯 분석은 SH-SY5Y 세포에서 MPP + 처리가 MPP + 그룹에서 TH 발현을 감소시켰지만, TH 감소는 Serping1 siRNA에 의해 억제됨을 보여 주었다. MPP + 10 군에서, TH 발현과 세포 생존성(cell viability)은 대조군과 유사하게 유지되었다(도 5).

이 결과는 Serping1 siRNA의 역할이 MPP +에 의한 감소된 TH가 Serping1 siRNA에 의해 억제되는 결과를 통해 치료 목표로 기대될 수 있음을 시사한다. 이것은 siRNA로 인한 Serping1 siRNA가 도파민성 세포의 신경 보호(neuroprotection)과 α-syn 발현 감소를 일으킨다는 것을 시사한다. 이는 Serping1이 α-syn 발현을 조절하는 방법을 연구할 수 있는 새로운 장을 열어 준다. 이는 파킨슨병의 병인에서 도파민성 세포 손실과 관련이 있을 수 있음을 시사한다.

이상 실시예 및 실험예들을 통해 siRNA로 인한 Serping1 siRNA가 도파민성 세포의 신경 보호(neuroprotection)과 α-syn 발현 감소를 일으키는 것을 확인하므로, serping1의 발현을 제어하는 serping1 siRNA를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 파키슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 제공하는 것을 알 수 있다.

실시예 2. serping1 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조

또 다른 실시예는 구조식 1을 갖는, serping1 siRNA를 포함하는 올리고 RNA 구조체를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 제공한다.

실시예 2에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체는 구조식 2에 따른 C24-5'-serping1 siRNA-3'-폴리에텔렌 글리콜(polyethylene glycol)의 구조를 가질 수 있다.

[구조식 2]

실시예 2에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체에서 serping1 siRNA는 실시예 1에서 제작한 serping1 siRNA이고, anti-serping1 siRNA는 serping1 siRNA와 상보관계의 안티센스 가닥, serping1 siRNA와 상보관계의 miRNA일 수 있다. C24는 소수성 물질로 이황화결합(disulfide) 이 포함된 테트라도코산(tetradocosane)를 의미하고, 5' 및 3'은 이중나선 올리고 RNA 말단의 방향성을 의미한다.

상기 구조식 2에서의 serping1 siRNA은 3' 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG, Mn=2,000)-CPG를 지지체로 하여 β-시아노에틸포스포아미다이트를 이용하여 RNA 골격구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해가는 방법을 통해 3' 말단 부위에 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 serping1 siRNA을 포함하는 올리고 RNA-친수성 물질 구조체를 합성한 뒤, 이황화 결합이 포함되어있는 테트라도코산을 5' 말단에 결합하여 원하는 serping1 siRNA-고분자 구조체를 제조하였다.

또한, 일반적인 방법으로 serping1 siRNA와 어닐링을 수행할 안티센스 가닥의 경우, 앞서 언급한 반응을 통해 serping1 siRNA와 상보적인 서열의 miRNA을 제조하였다.

합성이 완료되면 60℃의 온탕기(water bath)에서 28%(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 serping1 siRNA-고분자 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection) 반응을 통해 보호잔기를 제거하였다. 보호 잔기가 제거된 serping1 siRNA-고분자 구조체는 70℃의 오븐에서 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민트리하이드로플로라이드 (triethylaminetrihydrofluoride)를 부피비 10:3:4의 비율로 처리하여 2'TBDMS(tert-butyldimethylsilyl)를 제거하였다.

serping1 siRNA와 serping1 siRNA와 상보적인 서열의 miRNA을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM 칼륨 아세테이트(Potassium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(Magnesium acetate), pH 7.0∼7.5)에 넣고, 90 ℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37 ℃에서 반응시켜, serping1 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 각각 제조하였다. 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 전기영동을 통하여 어닐링 되었음을 확인하였다.

상기 실시예 2에서 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 이중나선 올리고 RNA의 말단에 결합된 소수성 물질 간의 소수성 상호작용에 의하여 나노입자, 즉 미셀(micelle)을 형성하였다.

상기 실시예 2에서 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 실시예1과 동일한 방식으로 도파민성 세포의 신경 보호(neuroprotection)과 α-syn 발현 감소를 일으키는 것을 확인하므로, serping1의 발현을 제어하는 serping1 siRNA를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병용 약제학적 조성물 및 그 치료제를 파키슨병에 사용하여 파킨슨병에 우수한 치료 효과를 확인할 수 있다.

전술한 바와 같이, 상기 실시예 2에서 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 약제학적 조성물 및 그 치료제는 serping1 siRNA를 생체 내 질병 표적장기 세포까지 효율적이고 안정적으로 전달할 수 있는 나노입자형 RNAi 신약물질이다.

상기 실시예 2에서 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 약제학적 조성물 및 그 치료제는 주사제로 사용되었을 때 혈액 내에서 안정적인 나노입자 구조를 유지하며 암 및 질병조직에만 선택적으로 전달된 후, 세포 내에서 활성화된 serping1 siRNA로 전환되어 표적 RNA를 분해시킬 수 있다.

전술한 바와 같이 포뮬레이션을 기반으로 하는 리포좀 siRNA 신약기술 대비 또 다른 실시예에 따른 구조식 1을 갖는 serping1 siRNA를 포함하는 올리고 RNA 구조체를 포함하는 약제학적 조성물 및 그 치료제는 전자동 합성라인에서 단일분자(single chemical entity)로 만들어지며 포뮬레이션을 거치지 않고 수용액 안에서 자가 조립되어 안정적인 나노입자의 형태로 만들어 짐으로 대량생산과 제조공정상의 QC(Quality Control) 과정의 단순화를 통해 생산원가를 획기적으로 절감할 수 있다. 또한 생체 적합형 지질과 PEG를 사용함으로 주사제로 사용 시 독성 및 부작용이 없다.

이상 도면을 참조하여 실시예들을 설명하였으나 본 발명은 이에 제한되지 않으며, 상기 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

세린/시스테인 프로테이나제 억제제(serping1)인 serping1의 발현을 제어하는 serping1 siRNA를 유효성분으로 포함하고,
상기 serping1 siRNA는 다음 구조식 2를 갖는 이중나선 올리고 RNA 구조체에 포함되는 파킨슨병용 약제학적 조성물:
[구조식 2]

구조식 2에서, anti-serping1 siRNA는 상기 serping1 siRNA와 상보관계의 안티센스 가닥 또는 상기 serping1 siRNA와 상보관계의 miRNA이고, C24는 이황화결합(disulfide)이 포함된 테트라도코산(tetradocosane)을 의미하고, 5' 및 3'은 올리고 RNA 말단의 방향성을 의미한다.
제1항에 있어서,
상기 Serping1 siRNA가 도파민성 세포의 신경 보호(neuroprotection)과 α-syn 발현 감소를 일으키는 파킨슨병용 약제학적 조성물.
삭제
세린/시스테인 프로테이나제 억제제(serping1)인 serping1의 발현을 제어하는 serping1 siRNA를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병용 약제학적 조성물; 및
상기 약제학적 조성물을 담는 담체를 포함하고,
상기 serping1 siRNA는 다음 구조식 2를 갖는 이중나선 올리고 RNA 구조체에 포함되는 파킨슨병 치료제:
[구조식 2]

구조식 2에서, anti-serping1 siRNA는 상기 serping1 siRNA와 상보관계의 안티센스 가닥 또는 상기 serping1 siRNA와 상보관계의 miRNA이고, C24는 이황화결합(disulfide)이 포함된 테트라도코산(tetradocosane)을 의미하고, 5' 및 3'은 올리고 RNA 말단의 방향성을 의미한다.
제4항에 있어서,
상기 Serping1 siRNA가 도파민성 세포의 신경 보호(neuroprotection)과 α-syn 발현 감소를 일으키는 파킨슨병 치료제.
삭제