DE60208400T2 - Therapeutisch verwendbare triethylenglykol-cholesteryl-oligonukleotide - Google Patents

Therapeutisch verwendbare triethylenglykol-cholesteryl-oligonukleotide Download PDF

Info

Publication number
DE60208400T2
DE60208400T2 DE60208400T DE60208400T DE60208400T2 DE 60208400 T2 DE60208400 T2 DE 60208400T2 DE 60208400 T DE60208400 T DE 60208400T DE 60208400 T DE60208400 T DE 60208400T DE 60208400 T2 DE60208400 T2 DE 60208400T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
seq
cells
cell
cancer
cholesteryl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60208400T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60208400D1 (de
Inventor
C. Nigel PHILLIPS
C. Mario FILION
Cristina Andrea HERRERA-GAYOL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Telesta Therapeutics Inc
Original Assignee
Bioniche Life Sciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioniche Life Sciences Inc filed Critical Bioniche Life Sciences Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE60208400D1 publication Critical patent/DE60208400D1/de
Publication of DE60208400T2 publication Critical patent/DE60208400T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/547—Chelates, e.g. Gd-DOTA or Zinc-amino acid chelates; Chelate-forming compounds, e.g. DOTA or ethylenediamine being covalently linked or complexed to the pharmacologically- or therapeutically-active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/18—Type of nucleic acid acting by a non-sequence specific mechanism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Cholesteryl-konjugierte Oligonukleotid-Zusammensetzungen und deren Verwendung zur Herstellung eines Medikaments für die Hemmung der Zellproliferation, Induktion von Apoptose, Modifizierung des Verlaufs des Zellzyklus und Modulation extrazellulärer Wechselwirkungen zwischen Matrix und Zelle.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Proliferation ist der Kulminationspunkt, den eine Zelle während des Zellzyklus durchläuft und welche zur Teilung einer Zelle in zwei Zellen führt. Die fünf Hauptphasen des Zellzyklus sind G0, G1, S, G2 und M. Während der G0-Phase befinden sich die Zellen im Ruhezustand. Zu einem bestimmten Zeitpunkt befinden sich die meisten Zellen des Körpers in diesem Stadium. Während der G1-Phase produzieren Zellen, welche auf Signale zur Teilung ansprechen, die für eine DNA-Synthese benötigte RNA sowie die benötigten Proteine. Während der S-Phase (SE, frühe S-Phase; SM, mittlere S-Phase; und SL, späte S-Phase) replizieren die Zellen ihre DNA. In Vorbereitung auf die Zellteilung werden während der G2-Phase Proteine synthetisiert. Während der mitotischen Phase (M) teilt sich die Zelle in zwei Tochterzellen. Veränderungen in der Progression des Zellzyklus treten bei allen Krebsarten auf, und können aus der Überexpression von Genen, Mutation von regulatorischen Genen, oder Außerkraftsetzung von Kontrollpunkten für geschädigte DNA resultieren (Hochhauser D., Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents, 8: 903, 1997).
  • Die Apoptose oder programmierte Zelltod ist der physiologische Vorgang zum Abtöten und Entfernen unerwünschter Zellen und stellt einen Mechanismus dar, mittels welchem Chemotherapeutika Krebszellen abtöten. Die Apoptose ist durch ausgeprägte morphologische Veränderungen innerhalb der Zellen gekennzeichnet, welche die Kondensation des Kernchromatins, Schrumpfung der Zelle, Zersetzung des Zellkerns, Bläschenbildung der Plasmamembran, sowie die Bildung membrangebundener apoptotischer Körperchen umfasst (Wyllie et al., Int. Rev. Cytol., 68: 251, 1980). Die Translokation von Phosphatidylserin von der Innenseite der Plasmamembran zu deren Außenseite fällt zeitlich mit der Chromatinkondensation zusammen und wird als zelluläres Merkmal für Apoptose betrachtet (Koopman, G. et al., Blood, 84: 1415, 1994). Es ist bekannt, dass der Apoptosemechanismus durch die Aktivierung einer Familie von Cysteinproteasen, bekannt als Caspasen, vermittelt wird.
  • Caspasen erkennen hauptsächlich drei Peptidsequenzen als Substrate (Thornberry et al., J. Biol. Chem. 272: 17907, 1997): (i) Tyr-Val-Ala-Asp (YVAD, Caspase-1, -4), (ii) Asp-Glu-Val-Asp (DEVD, Caspase-2, -3 und -7), und (iii) Ile-(Leu)-Glu-X-Asp (I(L)EXD, Caspase-8 und -10). Die Sequenzerkennung in einem Zielprotein führt zu einer eingeschränkten und spezifischen Proteolyse der Zielstruktur, wie etwa der Aktivierung von Caspase-7 durch Caspase-3, einer Zersetzung von als Zielstruktur dienenden Strukturproteinen, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Lamine, oder einer Aktivierung von Enzymen, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase. Es wird beschrieben, dass Caspase-3 im Anschluss an proapoptotische Signale in ihre katalytisch aktiven Untereinheiten (17 und 13 kDa) gespalten wird, was zu Apoptose führt (Susin et al., J. Exp. Med. 186: 25, 1997).
  • Während der Apoptose führt die Aktivierung von Caspasen zur proteolytischen Spaltung zahlreicher Substrate. Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP), ein an der Reparatur von DNA beteiligtes Enzym des Zellkerns, ist ein für Caspase-3-Spaltung während der Apoptose bekanntes Substrat. Seine Spaltung wird als Merkmal für Apoptose betrachtet (O'Brien et al., Biotechniques, 30: 886, 2001).
  • Die extrazelluläre Matrix (ECM) beeinflusst das Verhalten normaler Zellen sowie von Tumorzellen (Radisky et al., Seminars Cancer Biol., 11: 87, 2001). Aus diesem Grund wird die Wechselwirkung zwischen Tumorzellen und den ECM-Bestandteilen, wenn die ECM mit Tumorzellen belegt wird, Signaltransduktionsereignisse aktivieren, welche in vivo verschiedene biopathologische Eigenschaften von Tumoren, wie etwa die Modulation von Kontakten zwischen Zellen, nachahmen (Weaver et al., J. Cell Biol., 137: 231, 1997).
  • Synthetische Oligonukleotide stellen polyanionsche Sequenzen dar, welche in Zellen integriert werden (Vlassov et al., Biochim. Biophys. Acta, 11197: 95, 1994). Es wurden synthetische Oligonukleotide beschrieben, welche selektiv an Nukleinsäuren (Wagner, R., Nature, 372: 333, 1994), an spezifische zelluläre Proteine (Bates et al., J. Biol. Chem., 274: 26369, 1999), sowie an spezifische Proteine des Zellkerns (Scaggiante et al., Eur. J. Biochem., 252: 207, 1998) binden, um die Proliferation von Krebszellen zu hemmen.
  • Die Synthese und die physikalischen Eigenschaften von Oligonukleotiden mit einer Cholesteryleinheit wurden beschrieben. Das Anbringen einer Cholesteryleinheit an das 3'-Ende von Antisense-Oligonukleotiden erhöht deren Aktivität (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6553, 1989; Boutorin et al., FEBS Letter, 254: 129, 1989; Corrias et al., J. Neurooncol., 31: 171, 1997; US-Patent Nr. 4,958,013; WO-Patent Nr. 9714440). Das Anbringen einer Cholesteryleinheit an das 3'-Ende verbessert die Aufnahme von Antisense-Molekülen durch die Zellen (Corrias et al., J. Neurooncol., 31: 171, 1997) und bewirkt in vivo eine Erhöhung der Retention von Antisense-Molekülen in Gefäßen (Fieser et al., Circulation, 92: 1296, 1995). Internukleosidische Cholesteryl-Seitenketten, welche über Phosphoramidatbindungen mit Phosphor verknüpft sind, wurden als Modifikation zur Erhöhung der Aktivität von Antisense-Molekülen beschrieben (US-Patent Nr. 4,958,013). Es wurde entdeckt, dass Homopolymere von 15 Cytidin- oder Thymidinresten mit einer Cholesteryleinheit am 5'-Ende die cytosolische Ca2+-Konzentration in promyeloischen Leukämiezellen modulieren, während heteropolymere Sequenzen mit einer Cholesteryleinheit am 5'-Ende, oder Cholesteryl-modifizierte Phosphorothioat-Sequenzen inaktiv waren (Saxon et al., Antisense Res. Dev., 2: 243, 1992). Es wurde gezeigt, dass Heteropolymere, welche aus 15 Phosphorothioat-Desoxynukleotiden mit alternierenden Cytosin- und Adenosinresten bestehen, oder Homopolymere mit 15 Cytosin- oder Thymidinresten wirksame Hemmer des Methotrexat-Transports darstellen, wenn eine Cholesterylgruppe an das 5'-Ende gebunden war (Henderon et al., Nucl. Acids Res., 25: 3726, 1995). Die kovalente Modifizierung eines 10 Nukleotidbasen langen Homocytidin-Phosphorothioat-Oligonukleotids mittels einer Cholesteryleinheit am 5'-Ende blockierte durch Hemmung der Reversen Transkriptase von HIV die Bildung von Synzytien in T-Lymphozyten, welche mit HIV-1 oder HIV-2 infiziert waren (Stein et al., Biochemistry, 5: 2439, 1991).
  • Das Anbringen einer Cholesteryleinheit an Oligonukleotide wirkt sich minimal auf das Wachstum von Krebszellen aus (Henderon et al., Nucl. Acids Res., 25: 3726, 1995). Typische Merkmale des apoptotischen Zelltods wurden für Krebszelllinien, welche mittels Oligonukleotiden mit Cholesteryleinheit am 3'-Ende behandelt wurden, nicht beobachtet (Corrias et al., J. Neurooncol., 31: 171, 1997).
  • Die meisten Anti-Krebstherapien, ob auf Hemmung der Proliferation, Induktion eines Anhaltens des Zellzyklus, Induktion von Apoptose, Stimulierung des Immunsystems, oder auf Modulation extrazellulärer Wechselwirkung zwischen Matrix und Zelle gerichtet, haben sich für klinische Anwendungen als ungeeignet erwiesen. Viele dieser Therapien sind ineffizient oder toxisch, besitzen unerwünschte Nebenwirkungen, führen zur Entwicklung von Arzneimittelresistenzen oder zu Immunsensibilisierung, und bewirken eine Schwächung des Empfängers.
  • Aus diesem Grund besteht ein kontinuierliches Bedürfnis nach neuen Zusammensetzungen und Verfahren, welche ein Anhalten des Zellzyklus in Krebszellen induzieren, Apoptose in Krebszellen induzieren, und eine Modulation extrazellulärer Wechselwirkungen zwischen Matrix und Zelle bewirken.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wird diesem Bedürfnis durch Bereitstellung einer Zusammensetzung gerecht, in welcher eine Triethylenglykol (TEG)-Cholesteryleinheit an das 3'-Ende synthetischer Oligonukleotidsequenzen SEQ ID NO: 1 (5' OH-GGGTGG-OH 3'), SEQ ID NO: 2 (5' OH-GGGAGG-OH 3'), SEQ ID NO: 3 (5' OH-CCACCC-OH 3'), oder SEQ ID NO: 4 (5' OH-GTG-OH 3') angebracht ist, was zur Ausbildung korrespondierender, neuer synthetischer 5'-OH, 3'-TEG-Cholesteryl-Oligonukleotidsequenzen SEQ ID NO: 5 (5' OH-GGGTGG (TEG-Cholesteryl) 3'), SEQ ID NO: 6 (5' OH-GGGAGG (TEG-Cholesteryl) 3'), SEQ ID NO: 7 (5' OH-CCACCC (TEG-Cholesteryl) 3'), oder SEQ ID NO: 8 (5' OH-GTG (TEG-Cholesteryl) 3') führt. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung dieser neuen synthetischen Oligonukleotidsequenzen bereit, indem diese durch Kombinieren mit einem annehmbaren Träger eine Zusammensetzung bilden, und die Zusammensetzung in vitro oder in vivo verabreicht wird. Die Zusammensetzung wird einem Tier, einschließlich eines Menschen, verabreicht, um in einer Zelle eine Reaktion zu induzieren. Solche Reaktionen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hemmung der Zellproliferation, Induktion eines Anhaltens des Zellzyklus, Induktion von Apoptose, Aktivierung von Caspase, Spaltung von Poly(ADP-Ribose)-Polymerase, oder Modulation extrazellulärer Wechselwirkungen zwischen Matrix und Zelle, oder eine Kombination hiervon. Eine für die Induktion der Reaktion bevorzugte Zelle ist eine Krebszelle oder eine synoviale Zelle. Jegliche Erkrankung oder jeglicher Zustand, welcher durch unerwünschte Zellproliferation gekennzeichnet ist, kann durch die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen behandelt werden. Derartige durch unerwünschte Zellproliferation gekennzeichnete Erkrankungen oder Zustände umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Autoimmunerkrankungen, Entzündungen, lymphoproliferative Erkrankungen, Arthritis und Krebs.
  • Die vorliegende Erfindung sieht weiterhin die Verwendung dieser neuen, synthetischen Oligonukleotidsequenzen für die Herstellung eines Medikaments vor. Derartige Medikamente sind für die Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes von Nutzen, welcher durch unerwünschte Zellproliferation gekennzeichnet ist, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Autoimmunerkrankungen, Entzündungen, lymphoproliferative Erkrankungen, Arthritis oder Krebs.
  • Eine oder mehrere der erfindungsgemäßen neuen Sequenzen können mit einem annehmbaren Träger kombiniert, und als Zusammensetzung in vitro an in Kultur befindliche Zellen oder Gewebe, oder in vivo an ein Tier oder an einen Menschen, verabreicht werden. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in Verbindung mit einem oder mehreren Therapeutika verabreicht werden. Eine derartige Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann vor, während oder nach Verabreichung einer oder mehrerer Therapeutika, welche einem Fachmann auf dem Gebiet der Medizin oder Veterinärmedizin bekannt sind, erfolgen. Jegliches Therapeutikum, welches einem Fachmann auf dem Gebiet der Medizin oder Veterinärmedizin bekannt ist und zur Behandlung von Erkrankungen eingesetzt wird, kann in Kombination mit diesen neuen Sequenzen verwendet werden. Derartige Kombinationen können die Verwendung niedrigerer Dosierungen an Therapeutika gestatten, wodurch eine Verringerung unerwünschter Nebeneffekte bewirkt wird.
  • Die Verabreichung einer Zusammensetzung, welche eine effektive Menge einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Sequenzen umfasst, an ein Tier oder an einen Menschen stellt eine therapeutische Behandlung dar, welche einer Erkrankung oder einem Zustand, die/der durch unerwünschte Zellproliferation gekennzeichnet ist, vorbeugt, diese/diesen behandelt oder beseitigt. Derartige Erkrankungen und Zustände sind einem Fachmann auf dem Gebiet der Medizin oder Veterinärmedizin bekannt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Krebs, Entzündungen, Arthritis, lymphoproliferative Erkrankungen, Asthma, und Restenose von Arterien als Folge von Angioplastie. Die Krebsarten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Plattenepithelkarzinom, Fibrosarkom, sarkoides Karzinom, Melanom, Brustkrebs, Lungenkrebs, Kolorektalkrebs, Nierenkrebs, Osteosarkom, Hautmelanom, Basalkarzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Blasenkrebs, Gehirnkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Leukämie, Lymphom, und hiervon abgeleitete Metastasen.
  • Verfahren und Formen der Verabreichung von Therapeutika an Tiere und Menschen sind einem Fachmann bekannt und können zur Verabreichung von Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Sequenzen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen, eingesetzt werden.
  • Die unerwartete und überraschende Fähigkeit, durch kovalente Bindung einer Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit-Einheit an den 3'-Sauerstoff funktionell inerter 3'-OH-Oligonukleotide eine Hemmung der Proliferation von Krebszellen und synovialen Zellen zu bewirken, Apoptose in Krebszellen und synovialen Zellen zu induzieren, extrazelluläre Wechselwirkungen zwischen Matrix und Zelle in Krebszellen zu modulieren, und die Progression des Zellzyklus in Krebszellen zu modifizieren, wendet sich an seit langem bestehende, unerfüllte Bedürfnisse in der Medizin und stellt einen bedeutenden Nutzen für Tiere, einschließlich Menschen, dar.
  • Es ist demzufolge eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue Zusammensetzung bereitzustellen, welche eine synthetische 5'-OH, 3'-TEG-Cholesteryl-Sequenz umfasst.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung und eines Verfahrens, welche/welches in der Behandlung einer Erkrankung eines Tieres, einschließlich eines Menschen, wirksam ist.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung und eines Verfahrens, welche/welches in der Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes, die/der durch unerwünschte Zellproliferation gekennzeichnet ist, wirksam ist.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung und eines Verfahrens, welche/welches in der Behandlung von Krebs wirksam ist.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung und eines Verfahrens, welche/welches in der Behandlung von Arthritis wirksam ist.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung und eines Verfahrens, welche/welches eine Reaktion in Zellen induziert, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Hemmung der Zellproliferation, Induktion eines Anhaltens des Zellzyklus, Induktion der Aktivierung von Caspase, Spaltung von Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, Induktion von Apoptose oder Modulation extrazellulärer Wechselwirkungen zwischen Matrix und Zelle, oder Kombinationen hiervon.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung und eines Verfahrens, welche/welches eine Reaktion in Krebszellen oder synovialen Zellen, einschließlich arzneimittelresistenten Krebszellen oder synovialen Zellen, induziert, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Hemmung der Zellproliferation, Induktion eines Anhaltens des Zellzyklus, Induktion der Aktivierung von Caspase, Spaltung von Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, Induktion von Apoptose oder Modulation extrazellulärer Wechselwirkungen zwischen Matrix und Zelle, oder Kombinationen hiervon.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung und eines Verfahrens, welche/welches unabhängig von BCR-ABL (eine Verschmelzung des BCR-Gens auf Chromosom 22 und des ABL-Gens auf Chromosom 9) Apoptose in Zellen induziert.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung und eines Verfahrens, welche/welches unabhängig von einer p53-Mutation Apoptose in Zellen induziert.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung, welche einfach herzustellen ist.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung, welche für den Empfänger eine minimale Toxizität besitzt.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung der Verwendung dieser neuen synthetischen Oligonukleotidsequenzen zur Herstellung eines Medikaments, wobei das Medikament zur Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes von Nutzen ist, die/der durch unerwünschte Zellproliferation gekennzeichnet ist.
  • Diese und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Durchsicht der nachfolgenden detaillierten Beschreibung der offenbarten, nicht begrenzenden Ausführungsform, sowie der beigefügten Ansprüche, deutlich werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1. Fotografie des Wachstums von MCF-7-, MDA-MB-231- (MDA-231), Hs578T- und Mpanc-96-Zellen auf MATRIGEL® nach Vorinkubation mit ausschließlich normalem Kulturmedium (RCM), oder normalem Kulturmedium (RCM) mit Zusatz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5.
  • 2. Fotografie des Wachstums humaner Brustkrebszellen auf MATRIGEL® nach Vorinkubation mit ausschließlich normalem Kulturmedium (RCM), oder normalem Kulturmedium (RCM) mit Zusatz von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 8.
  • 3. Fotografie von MCF-7-Zellen, welche man auf MATRIGEL®-beschichteten Wells für 48 Stunden wachsen ließ. Anschließend wurden die resultierenden dreidimensionalen Zellstrukturen ausschließlich einem normalen Kulturmedium (RCM), oder einem normalen Kulturmedium (RCM) mit Zusatz von Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 7 ausgesetzt.
  • 4. Fotografie von MDA-231-Zellen, welche man auf MATRIGEL®-beschichteten Wells für 48 Stunden wachsen ließ. Anschließend wurden die resultierenden dreidimensionalen Zellstrukturen ausschließlich einem normalen Kulturmedium (RCM), oder einem normalen Kulturmedium (RCM) mit Zusatz von Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 7 ausgesetzt.
  • 5. Fotografie von Hs578T-Zellen, welche als Sphäroide angezüchtet und für 3 Tage einem normalen Kulturmedium (RCM) mit oder ohne Zusatz von Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit (Chol-TEG), SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 oder entsprechenden Kontrollen (RCM plus Wasser (RCMW) und RCM plus Acetonitril (RCMA)) ausgesetzt wurden.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue Zusammensetzungen bereit, umfassend synthetische 5'-OH, 3'-TEG-Cholesteryl-Sequenzen, wobei die Sequenz SEQ ID NO: 5 (5' OH-GGGTGG (TEG-Cholesteryl) 3'), SEQ ID NO: 6 (5' OH- GGGAGG (TEG-Cholesteryl) 3'), SEQ ID NO: 7 (5' OH-CCACCC (TEG-Cholesteryl) 3') oder SEQ ID NO: 8 (5' OH-GTG (TEG-Cholesteryl) 3') ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Verwendung dieser neuen Zusammensetzungen bereit. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erweisen sich für die Induktion einer Reaktion in einer Zelle von Nutzen, wenn sie Tieren oder Menschen in einer zur Induktion einer Reaktion in der Zelle wirksamen Menge verabreicht werden. Diese Reaktionen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hemmung der Zellproliferation, Anhalten des Zellzyklus, Induktion von Apoptose, Aktivierung von Caspase, Spaltung von Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase in der Zelle oder Modulation extrazellulärer Wechselwirkungen zwischen Matrix und Zelle, oder eine Kombination hiervon. Das Tier oder der Mensch kann an Krebs oder an Arthritis erkrankt sein. Die Zellen können Krebszellen sein. Die Zellen können synoviale Zellen sein.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen verwendet werden, welche durch unerwünschte Zellproliferation gekennzeichnet sind. In einer Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Zusammensetzung einem an Krebs erkrankten Tier oder Menschen in einer zur Behandlung der Krebserkrankung des Tieres oder des Menschen effektiven Menge verabreicht.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann einem an Arthritis erkrankten Tier oder Menschen in einer zur Behandlung von Arthritis in dem Tier oder dem Menschen effektiven Menge verabreicht werden.
  • Die unerwartete und überraschende Fähigkeit der 3'-TEG-Cholesteryl-Oligonukleotide, eine Hemmung der Proliferation zu bewirken, ein Anhalten des Zellzyklus zu induzieren, Apoptose zu induzieren, Caspasen zu aktivieren oder extrazelluläre Wechselwirkungen zwischen Matrix und Zelle in Zellen zu modulieren, oder eine Kombination dieser Reaktionen in Zellen zu induzieren, wendet sich an seit langem bestehende, unerfüllte Bedürfnisse in der Medizin und stellt einen bedeutenden Nutzen für Tiere und Menschen dar.
  • Das hier verwendete Wort "Sequenz" bezeichnet ein synthetisches 3'-OH, 5'-OH-Oligonukleotid, umfassend SEQ ID NO: 1 (5' OH-GGGTGG-OH 3'), SEQ ID NO: 2 (5' OH-GGGAGG-OH 3'), SEQ ID NO: 3 (5' OH-CCACCC-OH 3'), oder SEQ ID NO: 4 (5' OH-GTG-OH 3'), oder ein synthetisches 5'-OH, 3'-TEG-Cholesteryl-Oligonukleotid, umfassend SEQ ID NO: 5 (5' OH-GGGTGG (TEG-Cholesteryl) 3'), SEQ ID NO: 6 (5' OH-GGGAGG (TEG-Cholesteryl) 3'), SEQ ID NO: 7 (5' OH-CCACCC (TEG-Cholesteryl) 3'), oder SEQ ID NO: 8 (5' OH-GTG (TEG-Cholesteryl) 3').
  • Die hier verwendeten Ausdrücke "3'-TEG-Cholesteryl-Oligonukleotid" und "synthetisches 3'-TEG-Cholesteryl-Oligonukleotid" bezeichnen ein 3'-Triethylenglykol-Cholesteryl-modifiziertes Oligonukleotid, d.h. ein 5'-OH-Oligonukleotid, an welches eine TEG-Cholesteryleinheit am 3'-Ende gebunden ist. Zur Veranschaulichung ist nachfolgend die chemische Struktur von SEQ ID NO: 7, einem Beispiel eines synthetischen 5'-OH, 3'-TEG-Cholesteryl-Oligonukleotids, dargestellt:
  • Figure 00110001
  • Das hier verwendete Wort "Reaktion" bezeichnet die Induktion einer Reaktion, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Hemmung der Zellproliferation, Induktion eines Anhaltens des Zellzyklus, Aktivierung von Caspasen, Spaltung von Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, Induktion von Apoptose in Zellen oder Modulation extrazellulärer Wechselwirkungen zwischen Matrix und Zelle, oder eine Kombination hiervon.
  • Der hier verwendete Ausdruck „effektiv in reagierenden Zellen" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Sequenz, eine Reaktion zu induzieren, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, eine Fähigkeit der Sequenz, eine Hemmung der Zellproliferation zu bewirken, ein Anhalten des Zellzyklus zu induzieren, eine Aktivierung von Caspasen zu induzieren, eine Spaltung von Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase zu induzieren, Apoptose in Zellen zu induzieren oder extrazelluläre Wechselwirkungen zwischen Matrix und Zelle zu modulieren, oder eine Kombination hiervon.
  • Die hier verwendeten Ausdrücke „therapeutische Behandlung", „effektive Menge" und „Menge, welche effektiv ist" beziehen sich auf eine Menge einer Sequenz, welche effektiv ist, eine Reaktion zu induzieren, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Hemmung der Zellproliferation, Anhalten des Zellzyklus, Aktivierung von Caspasen, Spaltung von Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, Induktion von Apoptose in Zellen, Modulation extrazellulärer Wechselwirkungen zwischen Matrix und Zelle, oder eine Kombination hiervon.
  • Das hier verwendete Wort „Erkrankung" bezieht sich auf einen Zustand, in welchem das körperliche Befinden beeinträchtigt ist.
  • Der hier verwendete Ausdruck „Therapeutikum" stellt jegliches Mittel einschließlich Bestrahlung dar, welches von einer Aufsichtsbehörde eines Landes oder einer Staatsregierung zugelassen oder im US-Arzneibuch oder anderen allgemein anerkannten Arzneibüchern aufgeführt ist, um eine Erkrankung eines Tieres, einschließlich eines Menschen, zu behandeln.
  • Der hier verwendete Ausdruck „Chemotherapeutikum" stellt jegliches Mittel dar, welches von einer Aufsichtsbehörde eines Landes oder einer Staatsregierung zugelassen oder im US-Arzneibuch oder anderen allgemein anerkannten Arzneibüchern aufgeführt ist, um eine Erkrankung eines Tieres, einschließlich eines Menschen, zu behandeln.
  • Der hier verwendete Ausdruck „antiarthritisch" stellt jegliches Mittel dar, welches von einer Aufsichtsbehörde eines Landes oder einer Staatsregierung zugelassen oder im US-Arzneibuch oder anderen allgemein anerkannten Arzneibüchern aufgeführt ist, um Arthritis in einem Tier, einschließlich eines Menschen, zu behandeln.
  • Das hier verwendete Wort „antineoplastisch" bezieht sich auf die Prävention der Entwicklung, Progression, Proliferation oder Verbreitung von Krebszellen.
  • Die Verabreichung einer effektiven Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung an ein Tier oder an einen Menschen stellt eine therapeutische Behandlung dar, welche eine Reaktion induziert, verhindert, behandelt oder eine Erkrankung beseitigt, oder eine Kombination hiervon. Die Reaktion umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf, eine Hemmung der Zellproliferation, ein Anhalten des Zellzyklus, eine Aktivierung von Caspasen, eine Spaltung von Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, eine Induktion von Apoptose in Zellen, eine Modulation extrazellulärer Wechselwirkungen zwischen Matrix und Zelle, oder eine Kombination hiervon. Die Erkrankung umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf, Krebs, Arthritis, lymphoproliferative Funktionsstörungen und Entzündungen. Die Krebsarten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Plattenepithelkarzinom, Fibrosarkom, Hämangiosarkom, Lymphangiosarkom, Rhabdomyosarkom, Leiomyosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, sarkoides Karzinom, Melanom, Brustkrebs, Lungenkrebs, Kolorektalkrebs, Nierenkrebs, Osteosarkom, Hautmelanom, Basalkarzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Blasenkrebs, Gehirnkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Leukämie, Lymphom, Myelom, und hiervon abgeleitete Metastasen. Die Arthritisarten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, juvenile Arthritis, Osteoarthritis und rheumatoide Arthritis.
  • Die therapeutische Wirksamkeit einer Sequenz kann durch Verfahren erhöht werden, welche die chemische Modifizierung der Base, des Zuckers oder des Phosphat-Rückgrats, chemische Ergänzung oder biotechnologische Amplifizierung der Sequenz unter Verwendung bakterieller Plasmide, die die entsprechenden Sequenzen enthalten, Komplexierung der Sequenzen an biologische oder chemische Träger, oder Kupplung der Sequenzen an Liganden oder Antikörper, die auf eine bestimmte Gewebe- oder Zellart gerichtet sind, umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind.
  • Die Herstellung von Zusammensetzungen, welche eine oder mehrere Sequenzen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen, erfolgt durch gleichmäßiges und enges Inkontaktbringen der Sequenz und des pharmazeutisch annehmbaren Trägers. Die hier verwendeten Ausdrücke „pharmazeutisch annehmbarer Träger" oder „pharmazeutisch annehmbares Vehikel" bezeichnen, ohne Einschränkung, jegliche Flüssigkeit, jeglichen Feststoff oder jegliches halbfeste Material, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Wasser, Kochsalzlösung, ein Gel, eine Creme, eine Wundsalbe, ein Lösungsmittel, ein Verdünnungsmittel, eine flüssige Salbengrundlage, eine Salbe, eine Paste, ein Implantat, ein Liposom, eine Mizelle, eine Riesenmizelle, und dergleichen, welche(r,s) geeignet ist, in Kontakt mit lebendem tierischem oder menschlichem Gewebe verwendet zu werden, ohne hierbei physiologische Nebenwirkungen hervorzurufen, und welche(r,s) nicht mit anderen Bestandteilen der Zusammensetzung in schädlicher Art und Weise wechselwirkt. Zur Herstellung von Zusammensetzungen, welche eine Abgabe der erfindungsgemäßen Oligonukleotidsequenzen bewirken, können andere einem Fachmann bekannte pharmazeutisch annehmbare Träger oder Vehikel eingesetzt werden. Flüssige Träger sind wässrige Träger, nicht-wässrige Träger, oder beides, und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, wässrige Suspensionen, Dimethylsulfoxid, Ethanol, Ölemulsionen, Wasser-in-Öl-Emulsionen, Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen, ortsspezifische Emulsionen, Emulsionen mit langer Verweilzeit, klebrige Emulsionen, Mikroemulsionen und Nanoemulsionen. Feste Träger sind biologische Träger, chemische Träger, oder beides, und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, virale Vektorsysteme, Partikel, Mikropartikel, Nanopartikel, Mikrosphären, Nanosphären, Minipumpen, bakterielle Zellwandextrakte, und biologisch abbaubare oder biologisch nicht abbaubare natürliche oder synthetische Polymere, welche eine verzögerte Freisetzung der Sequenzen gestatten. Emulsionen, Minipumpen und Polymere können in der Nähe des Ortes implantiert werden, an welchem es einer Abgabe bedarf. Verfahren, welche zur Komplexierung einer Sequenz oder von Sequenzen an einen festen Träger verwendet werden, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine direkte Adsorption an die Oberfläche des festen Trägers, eine kovalente Kupplung an die Oberfläche des festen Trägers, welche entweder direkt oder mittels einer Verknüpfungseinheit erfolgt, sowie eine kovalente Kupplung oder elektrostatische Kupplung an das zur Herstellung des festen Trägers verwendete Polymer. Wahlweise kann eine Sequenz/können Sequenzen durch Zusatz nicht-ionischer oder ionischer Polymere, wie etwa Polyoxyethylensorbitan-Monooleate (Tweens), Hyaluronsäure oder Aluminiumhydroxid stabilisiert werden. Es können andere einem Durchschnittsfachmann bekannte Träger eingesetzt werden.
  • Bevorzugte wässrige Träger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Wasser, Kochsalzlösung, und pharmazeutisch annehmbare Puffer. Bevorzugte nicht-wässrige Träger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, ein Mineralöl oder ein Neutralöl, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, ein Diglycerid, ein Triglycerid, ein Phospholipid, ein Lipid, ein Öl, sowie Mischungen hiervon, wobei das Öl eine geeignete Mischung aus polyungesättigten und gesättigten Fettsäuren enthält. Beispiele hierfür umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Sojaöl, Canolaöl, Palmöl, Olivenöl und Myglyol, wobei die Fettsäuren gesättigt oder ungesättigt sein können. Wahlweise können, ungeachtet des pharmazeutisch annehmbaren Trägers, Hilfsstoffe umfasst sein, welche dazu verwendet werden, die Sequenz in den reagierenden Zellen darzubieten. Diese Hilfsstoffe umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Antioxidantien, Puffer und Bakteriostatika, und können Suspendierungsmittel und Verdickungsmittel umfassen.
  • Die erfindungsgemäßen Sequenzen können mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern kombiniert werden, und als Zusammensetzungen in vitro an in Kultur befindliche Zellen oder Gewebe, oder in vivo an Tiere oder Menschen, verabreicht werden. Verabreichungsformen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Injektionen, Lösungen, Cremes, Gele, Implantate, Pumpen, Salben, Emulsionen, Suspensionen, Mikrosphären, Partikel, Mikropartikel, Nanopartikel, Liposomen, Pasten, Pflaster, Tabletten, transdermale Abgabevorrichtungen, Sprays, Aerosole, oder andere einem Fachmann geläufige Mittel. Derartige pharmazeutisch annehmbare Träger sind einem Fachmann allgemein bekannt. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen können unter Verwendung bekannter und leicht verfügbarer Inhaltsstoffe mit Hilfe von Verfahren hergestellt werden, welche aus dem Stand der Technik bekannt sind. So können die Verbindungen beispielsweise mit gebräuchlichen Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln oder Trägern formuliert, und in Form von Tabletten, Kapseln, Suspensionen, Pulvern und dergleichen ausgestaltet sein. Beispiele für Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel und Träger, welche für derartige Formulierungen geeignet sind, umfassen: Füllstoffe und Streckmittel (zum Beispiel Stärke, Zucker, Mannitol und Kieselsäurederivate), Bindemittel (zum Beispiel Carboxymethylcellulose und andere Cellulosederivate, Alginate, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon), feuchtigkeitsspendende Mittel (zum Beispiel Glycerin), zersetzungsbewirkende Mittel (zum Beispiel Calciumcarbonat und Natriumbicarbonat), auflösungsverzögernde Mittel (zum Beispiel Paraffin), Resorptionsbeschleuniger (zum Beispiel quartäre Ammoniumverbindungen), oberflächenaktive Mittel (zum Beispiel Cetylalkohol, Glycerinmonostearat), adsorptive Träger (zum Beispiel Kaolin und Bentonit), Emulgatoren, Konservierungsmittel, Süßstoffe, Stabilisatoren, Farbstoffe, Parfümierungsmittel, Aromastoffe, Gleitmittel (zum Beispiel Talk, Calcium- und Magnesiumstearat), feste Polyethylglykole, und Mischungen hiervon.
  • Die Formulierungen können derart zusammengesetzt sein, dass sie den Wirkstoff ausschließlich oder bevorzugt an einer bestimmten Stelle, unter Umständen während einer gewissen Zeitspanne, freisetzen. Derartige Kombinationen stellen noch einen weiteren Mechanismus zur Kontrolle der Freisetzungskinetik bereit. Die Beschichtungen, Ummantelungen und Schutzmatrizen können beispielsweise aus polymeren Substanzen oder Wachsen hergestellt sein.
  • Eine oder mehrere Sequenzen können alleine, oder in Kombination mit anderen therapeutischen Modalitäten verabreicht werden, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Chemotherapeutika, Antiarthritika, Immunotherapeutika, antimikrobielle Mittel oder antivirale Mittel, oder in Kombination mit Strahlentherapie, oder jegliche Kombination hiervon. Chemotherapeutika umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Antimetabolika, DNA-schädigende Mittel, Mittel zur Destabilisierung von Mikrotubuli, Mittel zur Stabilisierung von Mikrotubuli, Mittel zur Depolymerisation von Aktin, wachstumshemmende Mittel, Mittel zur Hemmung von Topoisomerase, Mittel zur Hemmung von HMG-CoA (3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A)-Reduktase, Mittel zur Hemmung der Purinsynthese, Mittel zur Hemmung der Pyrimidinsynthese, Mittel zur Hemmung von Metalloproteinase, Mittel zur Hemmung von CDK (cyclinabhängige Proteinkinase), Mittel zur Hemmung von Angiogenese, Mittel zur Steigerung der Differenzierung, sowie Immunotherapeutika. Antiarthritika umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Entzündungshemmer, umfassend nichtsteroidale Entzündungshemmer (NSAIDs), Analgetika, Modifikatoren biologischer Reaktionen, krankheitsmodifizierende Antirheumatika (DMARDs), Antimetabolika, proapoptotische Mittel, DNA-schädigende Mittel, Mittel zur Destabilisierung von Mikrotubuli, Mittel zur Stabilisierung von Mikrotubuli, Mittel zur Depolymerisation von Aktin, wachstumshemmende Mittel, Mittel zur Hemmung von Topoisomerase, Mittel zur Hemmung der Purinsynthese, Mittel zur Hemmung der Pyrimidinsynthese, Mittel zur Hemmung von Metalloproteinase, Mittel zur Hemmung von CDK, oder Mittel zur Hemmung von Angiogenese. NSAIDs umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, herkömmliche NSAIDs, wie etwa Diclofenac-Kalium, Diclofenac-Natrium, Diclofenac-Natrium mit Misoprostol, Diflunisal, Etodolac, Fenoprofen, Flurbiprofen-Calcium, Ibuprofen, Indomethacin, Ketoprofen, Meclofenamat, Mefenaminsäure-Natrium, Meloxicam, Nabumeton, Naproxen, Naproxen-Natrium, Oxaprozin, Piroxicam, Sulindac und Tolmetin-Natrium, Cyclooxygenase-2 (COX-2)-Hemmer, wie etwa Celecoxib und Rofecoxib, Salicylate, wie etwa Aspirin, Cholinsalicylat, Magnesiumsalicylat, Salsalat und Natriumsalicylat. Analgetika umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Acetaminophen, Acetaminophen mit Codein, Hydrocodon mit Acetaminophen, Oxycodon, Propoxyphen-Hydrochlorid und Tramadol. Modifikatoren biologischer Reaktionen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Etanercept und Infliximab. Glucocorticoide umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Cortison, Dexamethason, Hydrocortison, Methylprednisolon, Prednisolon, Prednisolon-Natriumphosphat und Prednisolon-Triamcinolon. DMARDs umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Auranofin (orales Gold), Azathioprin, Cyclophosphamid, Cyclosporin, Hydroxychloroquinsulfat, Leflunomid, Methotrexat, Minocyclin, Penicillamin, Sulfasalazin, Aurothioglucose und Gold-Natriumthiomalat.
  • Die Verabreichungsformen sind einem Durchschnittsfachmann bekannt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, oral (zum Beispiel bukkal oder sublingual), rektal als Zäpfchen oder als Klistier, topisch, parenteral, subkutan, transdermal, subdermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravesikulär, intraartikulär, intravenös, intradermal, intrakranial, intraläsional, intrathekal, intratumoral, intraokulär, okulär, aerosolisch, intrapulmonal, intraspinal, intraprostatisch, sublingual, Platzieren in Hohlräume des Körpers, nasale Inhalation, pulmonale Inhalation, Eindrücken in die Haut und Elektroporation, intrauterin, vaginal, in einen Körperhohlraum, chirurgische Verabreichung am Ort eines Tumors oder einer inneren Verletzung, direkt in Tumore, in das Lumen oder Parenchym eines Organs, sowie in das Knochenmark. Techniken, welche für die verschiedenen oben genannten Verabreichungsformen von Nutzen sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, topische Applikation, Ingestion, chirurgische Verabreichung, Injektionen, Sprays, transdermale Abgabevorrichtungen, osmotische Pumpen, direktes Galvanisieren an einer gewünschten Stelle, oder andere einem Durchschnittsfachmann geläufige Mittel. Die Applikationsstellen können externer Natur, wie etwa auf der Epidermis, oder interner Natur, wie beispielsweise eine Gelenkkapsel, ein Tumor, ein Magengeschwür, ein Wundbereich, oder eine andere Stelle sein.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in Form von Cremes, Gelen, Lösungen, Suspensionen, Liposomen, Partikeln, oder anderen einem Fachmann bekannten Mitteln für eine Formulierung und Abgabe von Zusammensetzungen appliziert werden. Ultrafeine Partikelgrößen können für eine Abgabe von Therapeutika mittels Inhalation verwendet werden. Einige Beispiele geeigneter Formulierungen für subkutane Verabreichung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Implantate, Depots, Nadeln, Kapseln und osmotische Pumpen. Einige Beispiele geeigneter Formulierungen für vaginale Verabreichung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Cremes, Zäpfchen, Schwämme, Gele, Schäume und Ringe. Einige Beispiele geeigneter Formulierungen für orale Verabreichung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Pillen, Kapseln, Flüssigkeiten, Sirups und Suspensionen. Einige Beispiele geeigneter Formulierungen für transdermale und transmukosale Verabreichung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Cremes, Pasten, Pflaster, Sprays und Gele. Einige Beispiele geeigneter Abgabevorrichtungen für subkutane Verabreichung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Implantate, Depots, Nadeln, Kapseln und osmotische Pumpen. Formulierungen, welche für parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösungen, welche Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten, die die Isotonie der Formulierung mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers bewirken, und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, welche Suspendierungsmittel und Verdickungsmittel umfassen können. Improvisierte Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten hergestellt werden, welche von einem Durchschnittsfachmann allgemein verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Sequenzen können mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Hilfsstoffen unter Ausbildung einer Zusammensetzung kombiniert werden. Diese Zusammensetzungen können zweckmäßig in Form von Dosierungseinheiten bereitgestellt und nach herkömmlichen pharmazeutischen Techniken hergestellt werden. Derartige Techniken umfassen den Schritt des Inkontaktbringens der den Wirkstoff enthaltenden Zusammensetzungen und des/der pharmazeutischen Trägers) oder Hilfsstoffe(s). Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichmäßiges und enges Inkontaktbringen des Wirkstoffes mit flüssigen Trägern hergestellt. Bevorzugte Dosierungseinheiten der Formulierungen stellen jene dar, welche eine Dosis oder Einheit, oder einen entsprechenden Anteil hiervon, des verabreichten Wirkstoffes enthalten. Es versteht sich, dass die die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassenden Formulierungen neben den speziell oben erwähnten Wirkstoffen andere Mittel umfassen können, welche von einem Durchschnittsfachmann allgemein verwendet werden.
  • Das Verabreichungsvolumen wird je nach Verabreichungsform variieren. Derartige Volumina zur Verabreichung von Zusammensetzungen an Tiere oder Menschen sind einem Durchschnittsfachmann bekannt. Je nach Verabreichungsform ist das Volumen pro Dosis bevorzugt etwa 0.001 bis 100 ml, stärker bevorzugt etwa 0.01 bis 50 ml, und am stärksten bevorzugt etwa 0.1 bis 30 ml. Bevorzugt beträgt die Menge der pro Dosis verabreichten Sequenz von etwa 0.001 bis 100 mg/kg an Körpergewicht, stärker bevorzugt von etwa 0.01 bis 10 mg/kg, und am stärksten bevorzugt von etwa 0.1 bis 5 mg/kg. Die Sequenz, die Kombination von Sequenzen, und/oder zusätzliche Therapeutika können in einer Einzeldosisbehandlung, in Mehrfachdosisbehandlungen oder kontinuierlich verabreicht werden, wobei das Einbringen gemäß einem Plan und über eine Zeitspanne erfolgt, welcher) für die behandelte Erkrankung, den Zustand des Empfängers und die Verabreichungsform geeignet ist. Darüber hinaus kann die Sequenz vor, während oder nach Verabreichung des Therapeutikums verabreicht werden. Die speziell verabreichte Sequenz und das speziell verabreichte Therapeutikum, die Menge pro Dosis und die Verabreichungsform sollten von Seiten des praktischen Arztes unter Verwendung von Verfahren, welche dem Fachmann bekannt sind, festgelegt werden, wobei diese von der zu behandelnden Erkrankung oder dem zu behandelnden Zustand abhängig sind, wie beispielsweise der Krebsart, der Schwere der Krebserkrankung, dem Ort der Krebserkrankung, und anderen klinischen Faktoren, wie etwa Größe, Gewicht und körperlichem Zustand des Empfängers. Zusätzlich können wahlweise verschiedene in vitro- und in vivo-Assays eingesetzt werden, welche bei der Identifizierung optimaler Bereiche für die Verabreichung von Sequenz und Sequenz plus Therapeutikum dienlich sind.
  • Eine Sequenz in Kombination mit einem Therapeutikum, wie beispielsweise einem Chemotherapeutikum oder einem Antiarthritikum, wird einem an Krebs oder Arthritis erkrankten Tier oder Menschen in einer Menge verabreicht, welche effektiv ist, die antineoplastische Wirkung eines Chemotherapeutikums oder die antiarthritische Wirkung eines Antiarthritikums zu steigern. Bevorzugt beträgt die verabreichte Menge an Therapeutikum pro Dosis von etwa 0.001 bis 1000 mg/m2 an Körperoberfläche oder von etwa 0.01 bis 1000 mg/kg an Körpergewicht, stärker bevorzugt von etwa 0.01 bis 500 mg/m2 oder etwa 0.01 bis 500 mg/kg, und am stärksten bevorzugt von etwa 0.1 bis 100 mg/m2 oder etwa 0.1 bis 100 mg/kg. Die speziell verabreichte Sequenz und das speziell verabreichte Therapeutikum, die Menge pro Dosis, der Dosisplan und die Verabreichungsform sollten von Seiten des praktischen Arztes unter Verwendung von Verfahren, welche dem Fachmann bekannt sind, festgelegt werden, wobei diese von der Art der Erkrankung, der Schwere der Erkrankung, dem Ort der Erkrankung, und anderen klinischen Faktoren, wie etwa Größe, Gewicht und körperlichem Zustand des Empfängers, abhängig sind. Zusätzlich können wahlweise verschiedene in vitro- und in vivo-Assays eingesetzt werden, welche bei der Identifizierung optimaler Bereiche für die Verabreichung von Sequenz und Sequenz plus Therapeutikum dienlich sind. Verschiedene Assays, welche für diesen Zweck von Nutzen sind, sind in PCT CA00/01467 (WO 01/44465) beschrieben. Zusätzliche Assays zur Evaluierung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Sequenzen, sowie zur Evaluierung der Wirksamkeit dieser Sequenzen in Kombination mit anderen Therapeutika, werden von Oncogene Research Products, Postfach 12087, La Jolla, Kalifornien, 92039 (Apoptosekatalog und technisches Handbuch 2002–2003, insbesondere Seiten 5–295) beschrieben. Derartige Assays umfassen Assays, welche für die Analyse von DNA-Fragmentierung, Apoptose, mitochondrialen Markern, Markern des endoplasmatischen Retikulums, freien Nukleosomen, Matrixproteinen des Zellkerns, Detektion und Aktivität zahlreicher Caspasen und damit in Verbindung stehender Proteine, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Caspasen 1 bis 14, Glutathion, Superoxid-Dismutase, Mitglieder der Bcl-2-Familie, für die Analyse der Fas/TNR-R- Superfamilie, mit PARP in Verbindung stehender Produkte, die Analyse apoptotischer Signaltransducer, die Analyse zahlreicher Signalrezeptoren einschließlich Todesrezeptoren, Apo2, Decoy-Rezeptoren, die Analyse apoptotischer Membranproteine, apoptotischer Marker des Nervensystems, zahlreicher Marker des Zellzyklus und der Zellproliferation, mitotischer Kinasen, Bromodesoxyuridin-Assays und p53-Assays konzipiert sind. Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Sequenzen kann auch hinsichtlich anderer Mittel, einschließlich Therapeutika, evaluiert werden, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Antiarthritika, oder Mittel zur Induktion von Apoptose und Reagenzien zur Zellsynchronisation, wie von Oncogene Research Products, Postfach 12087, La Jolla, Kalifornien, 92039 (Apoptosekatalog und technisches Handbuch 2002–2003, insbesondere Seiten 99–104 und Seiten 214–255) beschrieben. Derartige Mittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Actinomycin D, Amphidocolin, A23187, Koffein, Camptothecin, Cycloheximid, Dexamethason, Doxorubicin, 5-Fluorouracil, Hydroxyharnstoff, Paclitaxel, Staurosporin, Thymidin, Vinblastin, Retinolsäure, Etoposid, Okadainsäure, Vincristin und Methotrexat.
  • Verschiedene einem Fachmann bekannte in vitro- und in vivo-Assays und -Modelle können zur Evaluierung der Wirksamkeit sowie der optimalen Dosierungsbereiche von bloßen Sequenzen, oder Sequenzen in Kombination mit einem Therapeutikum bzw. mit Therapeutika, zur Behandlung von Arthritis eingesetzt werden. Tiermodelle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Adjuvans-induzierte Erkrankungsmodelle, durch ölige Adjuvantien induzierte Modelle, durch Mikroorganismen und deren Zellwandbestandteile induzierte Modelle, durch Knorpelbestandteile induzierte Modelle, transgene Modelle und Knockout-Modelle, nicht-immunologische osteoarthritische Modelle, sowie Modelle für partielle Syndrome, wie in Waxman, B. H., Scand. J. Immunol., 56: 12, 2002, beschrieben. Als Modell eingesetzte Tiere umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Ratten, Mäuse, Primaten, Meerschweinchen und Kaninchen.
  • Zur Bestimmung eines Stadiums des Zellzyklus können verschiedene einem Fachmann bekannte Assays und Verfahren eingesetzt werden. Ein derartiges Verfahren verwendet ein kommerziell erhältliches CYCLETESTTM PLUS DNA-Kit (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Kurz gesagt werden hierbei Zellkerne aus Zellen durch Auflösen der Zellmembran in einem nicht-ionischem Detergens, Entfernen des Zytoskeletts der Zelle sowie von Proteinen des Zellkerns mit Trypsin, Verdauen der zellulären RNA mit RNase, und Stabilisieren des im Zellkern befindlichen Chromatins mit Spermin erhalten. Es wird den Zellkernen Propidiumiodid zugesetzt, und ihre Fluoreszenz in einem mit elektronischem Dublett-Auflösungsvermögen ausgestattetem Durchflusszytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) analysiert. Die Anhäufung von Zellen in den Phasen G0/G1, frühe S (SE), mittlere S (SM), späte S (SL) oder G2/M des Zellzyklus kann unter Verwendung der MODFIT LT-Software (Verity Software House Inc., Topsham, MA), oder anderer geeigneter Software, analysiert werden.
  • Verschiedene in vitro- und in vivo-Assays können zur Evaluierung des Einflusses der extrazellulären Mikroumgebung auf das Verhalten von normalen Zellen und Tumorzellen verwendet werden. Derartige Assays können den Einsatz von MATRIGEL® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) umfassen, welches eine gelöste Basalmembranaufbereitung darstellt, die aus dem murinen Engelbreth-Holm-Swarm-Sarkom extrahiert wurde.
  • Multizelluläre Sphäroide (MS) stellen ein Beispiel eines speziellen in vitro-Assays dar, in welchem Tumorzellen dreidimensional unter Ausbildung einer „tumorähnlichen" Struktur kultiviert werden. In diesem System tritt eine Verstärkung der Wechselwirkungen zwischen Zellen auf, welche in vivo die Mikroumgebungsbedingungen maligner Zellen in festen Tumoren nachahmen. In dieser Art von Assay werden keine Bestandteile der extrazellulären Matrix hinzugefügt. Zellen, welche in diesem MS-System kultiviert werden, unterscheiden sich von jenen in zweidimensionalen Systemen (Monolayer-Kulturbedingungen). Einige dieser Unterschiede stehen mit der strukturellen und funktionellen Differenzierung von Tumorzellen, mit Veränderungen im Zellzyklus von Tumorzellen, „multizellulärer Arzneimittelresistenz", sowie mit Veränderungen hinsichtlich Diffusion und Eindringvermögen von Arzneimitteln durch die Schichten von Tumorzellen hindurch in Zusammenhang (Übersicht in Green et al., Anticancer Drug Des., 14: 153, 1999).
  • Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, ohne jedoch gleichzeitig jegliche Einschränkung hierfür darzustellen. Ganz im Gegenteil versteht es sich als eindeutig, dass auf verschiedene andere Ausführungsformen, Modifikationen und Äquivalente hiervon zurückgegriffen werden kann, welche sich dem Fachmann nach Lesen der vorliegenden Beschreibung von selbst erschließen, ohne dabei vom Erfindungsgedanken abzuweichen.
  • Beispiel 1
  • Herstellung von Nukleotidsequenzen
  • Synthetische Phosphodiester-Nukleotidsequenzen und konjugierte synthetische 3'-TEG-Cholesteryl-Nukleotidsequenzen wurden von Sigma-Genosys (Woodlands, TX, USA) unter Verwendung der Abakus-Segmentsynthesetechnologie hergestellt. Sequenzen, welche an ihren 3'-Enden mit TEG-Cholesteryl abschließen, wurden auf TEG-CPG-Trägern (Glen Research, Sterling, VA, USA) synthetisiert. Die Sequenzen wurden in Wasser oder Dimethylsulfoxid (DMSO) direkt vor Verwendung dispergiert.
  • Beispiel 2
  • Zellen
  • Alle Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) bezogen und in dem von der ATCC empfohlenen Medium kultiviert. Brustkrebszelllinien wurden in dem von der ATCC empfohlenen, oder dem in Veröffentlichungen (Herrera-Gayol und Jothy, Int. J. Exp. Path., 82: 193, 2001) beschriebenen Medium kultiviert. Tabelle 1 zeigt die Zelllinien, ihre Herkunft sowie ihre gemäß Literatur beschriebenen biopathologischen Eigenschaften (Hackett et al., Cancer Inst., 58: 1795, 1977; Price et al., Cancer Res., 50: 717, 1990; Thompson et al., J. Cell Physiol., 150: 534, 1992; und Peiper M. et al., Int. J. Cancer, 71: 993, 1997). Tabelle 1 Zelllinien
    Figure 00240001
    • * Nicht-adhärente Zellen.
    • ** Adhärente Zellen.
  • Beispiel 3
  • Induktion von Apoptose in MEG-01-Zellen durch SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6
  • Die Umverteilung von Phosphatidylserin der Plasmamembran stellt eine Eigenschaft von Zellen dar, in welchen Apoptose abläuft (Martin et al., J. Exp. Med., 182: 1545, 1995). Die Umverteilung von Phosphatidylserin in der Plasmamembran während der Apoptose wurde unter Verwendung von FITC (Fluorescein-Isothiocyanat)konjugiertem Annexin V (BD Pharmingen, San Diego, CA) mittels Durchflusszytometrie gemessen. MEG-01-Zellen, eine humane Zelllinie für chronische myeloische Leukämie, welche das Philadelphia-Chromosom enthält und eine BCR-ABL Genfusion aufweist, wurden bei 2.5 × 105 Zellen/ml für 48 Stunden mit Endkonzentrationen von 5.3, 26.5 und 53.0 μM an SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit-Molekül inkubiert. Der Prozentsatz an Zellen, welche einer Behandlung mit SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6 oder Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit ausgesetzt waren und sich danach in Apoptose befanden, ist in Tabelle 2 angegeben. Der Prozentsatz an unbehandelten MEG-01-Zellen in Apoptose betrug 12%.
  • Tabelle 2 Prozentsatz an Phosphatidylserin-postiven Zellen (in Apoptose befindliche Zellen) in MEG-01-Zellen
    Figure 00250001
  • Wie in Tabelle 2 dargestellt, sind SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit gegenüber MEG-01 inaktiv. Unerwartet verlieh die Einführung eines Cholesteryl-TEG-Phosphoramidits am 3'-Ende von SEQ ID NO: 1, wodurch SEQ ID NO: 5 erhalten wurde, und am 3'-Ende von SEQ ID NO: 2, wodurch SEQ ID NO: 6 erhalten wurde, diesen inerten Oligonukleotiden die Fähigkeit, Apoptose in MEG-01-Zellen zu induzieren, wie durch Messung der Translokation von Phosphatidylserin an der Zelloberfläche gezeigt wurde.
  • Beispiel 4
  • Induktion von Apoptose in EL-4-Zellen durch SEQ ID NO: 7
  • EL-4-Zellen, eine murine T-Lymphomzelllinie, wurden bei 2.5 × 105 Zellen/ml für 24 Stunden mit Konzentrationen von 0.53, 5.3 und 53.0 μM an SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 oder Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit inkubiert. Der Prozentsatz an Zellen, welche einer Behandlung mit SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 oder Cholesteryl- TEG-Phosphoramidit ausgesetzt waren und sich danach in Apoptose befanden, ist in Tabelle 3 angegeben. Der Prozentsatz an unbehandelten EL-4-Zellen in Apoptose betrug 7%.
  • Tabelle 3 Prozentsatz an Phosphatidylserin-positiven Zellen (in Apoptose befindliche Zellen) in EL-4-Zellen
    Figure 00260001
  • Wie in Tabelle 3 dargestellt, lösten weder SEQ ID NO: 3 noch Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit Apoptose in EL-4-Zellen aus. Unerwartet verlieh die Einführung eines Cholesteryl-TEG-Phosphoramidits am 3'-Ende von SEQ ID NO: 3, wodurch SEQ ID NO: 7 erhalten wurde, diesem inerten Oligonukleotid die Fähigkeit, Apoptose in EL-4-Zellen zu induzieren, wie durch Messung der Translokation von Phosphatidylserin an der Zelloberfläche gezeigt wurde.
  • Beispiel 5
  • Aktivierung von Caspase 3 durch SEQ ID NO: 7
  • EL-4-Zellen (2.5 × 105 Zellen/ml) wurden für 72 Stunden mit 0 μM (Kontrolle), 53 μM an SEQ ID NO: 3 oder 53 μM an SEQ ID NO: 7 inkubiert. Nach Inkubation wurden sowohl die Kontrolle als auch die behandelten Zellen gewaschen, fixiert, permeabilisiert, und mit einem Phycoerythrin (PE)-konjugierten Antikörper, welcher die aktive katalytische Einheit von Caspase 3 erkennt (Klon: C92-605; BD Pharmingen, San Diego, CA, USA), unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Bedingungen inkubiert. Die mit aktiver Caspase 3 in Zusammenhang stehende Fluoreszenz wurde auf einem FACSCalibur unter Verwendung des Programms CellQUEST (beides von Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) mittels Durchflusszytometrie analysiert. Der Prozentsatz an aktive Caspase 3 enthaltenden Zellen in mit 53 μM an Sequenzen behandelten EL-4-Zellen ist in Tabelle 4 angegeben.
  • Tabelle 4 Prozentsatz an aktive Caspase 3 enthaltenden Zellen in EL-4-Zellen
    Figure 00270001
  • Wie in Tabelle 4 dargestellt, war SEQ ID NO: 3 gegenüber EL-4 inaktiv. Unerwartet verlieh die Einführung eines Cholesteryl-TEG-Phosphoramidits am 3'-Ende von SEQ ID NO: 3, wodurch SEQ ID NO: 7 erhalten wurde, diesem inerten Oligonukleotid die Fähigkeit, Apoptose zu induzieren, wie durch Messung der Aktivierung von Caspase 3 gezeigt wurde.
  • Beispiel 6
  • Spaltung von Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase durch SEQ ID NO: 7
  • EL-4-Zellen (2.5 × 105 Zellen/ml) wurden für 72 Stunden mit 0 μM (Kontrolle), 53 μM an SEQ ID NO: 3 oder 53 μM an SEQ ID NO: 7 inkubiert. Nach Inkubation wurden sowohl die Kontrolle als auch die behandelten Zellen gewaschen, fixiert, permeabilisiert, und mit einem FITC-konjugierten Antikörper, welcher spezifisch die 85 kDa Fragmente von gespaltenem PARP erkennt (BioSource, Camarillo, CA, USA), unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Bedingungen inkubiert. Die mit gespaltenem PARP in Zusammenhang stehende Fluoreszenz wurde auf einem FACSCalibur unter Verwendung des Programms CellQUEST (beides von Becton Dickinson) mittels Durchflusszytometrie analysiert. Der Prozentsatz an gespaltenes PARP enthaltenden Zellen in mit einer Endkonzentration von 53 μM an Sequenzen behandelten EL-4-Zellen ist in Tabelle 5 dargestellt.
  • Tabelle 5 Prozentsatz an gespaltenes PARP enthaltenden Zellen in EL-4-Zellen
    Figure 00280001
  • Wie in Tabelle 5 dargestellt, war SEQ ID NO: 3 gegenüber EL-4 inaktiv. Unerwartet verlieh die Einführung eines Cholesteryl-TEG-Phosphoramidits am 3'-Ende von SEQ ID NO: 3, wodurch SEQ ID NO: 7 erhalten wurde, diesem inerten Oligonukleotid die Fähigkeit, Apoptose zu induzieren, wie durch Messung der Spaltung von PARP gezeigt wurde.
  • Beispiel 7
  • Wirkung von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 auf die Proliferation von synovialen Zellen
  • Adhärente HIG-82-Zellen, eine synoviale Zelllinie, wurden bei 1.0 × 105 Zellen/ml für 48 Stunden mit 53 μM (Endkonzentration) an SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 inkubiert. Die Zellproliferation wurde unter Verwendung der Reduktion von Dimethylthiazoldiphenyltetrazolium (MTT) gemessen (Mosman et al., J. Immunol. Methods, 65: 55, 1983). MTT wurde bei einer Wellenlänge von 570 nm unter Verwendung eines Spektralfotometer-Mehrfachlesegeräts (ELX800, Bio-TEK, Instruments Inc., Winooski, VT) gemessen. Der Prozentsatz der Hemmung der Zellproliferation von HIG-82, berechnet als
    Figure 00280002
    ist in Tabelle 6 dargestellt.
  • Tabelle 6 Hemmung der Zellproliferation von HIG-82 (%)
    Figure 00290001
  • Wie in Tabelle 6 dargestellt, bewirkten SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 keine Hemmung der Proliferation synovialer HIG-82-Zellen. Unerwartet verlieh die Einführung eines Cholesteryl-TEG-Phosphoramidits an den 3'-Enden von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4, wodurch SEQ ID NO: 6, 7 bzw. 8 erhalten wurden, die Fähigkeit zur Hemmung der Zellproliferation von HIG-82-Zellen.
  • Beispiel 8
  • Induktion von Apoptose in proliferierenden synovialen Zellen durch SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6
  • Adhärente HIG-82-Zellen wurden bei 1.0 × 105 Zellen/ml für 48 Stunden mit einer Endkonzentration von 53 μM an SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 inkubiert. Da die Phosphatidylserin/Annexin V-Detektion von Apoptose im Anschluss an Erntetechniken für adhärente Zellen, wie etwa Trypsinierung (van Engeland, Cytometry, 31: 1, 1998), nicht verlässlich war, wurde die Apoptose in HIG-82-Zellen unter Verwendung der Durchflusszytometrie durch Detektion fragmentierter DNA evaluiert, wobei unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Assays (APO-BRDUTM-Kit, BD Pharmingen) eine durch das Enzym Terminale Desoxynukleotidyl-Transferase vermittelte DNA-Strangbruch-Endmarkierung mit Bromodesoxyuridin-Triphosphat-Biotin (TUNEL) vorgenommen wurde. Der Prozentsatz an Zellen mit DNA-Fragmentierung im Zellkern wurde bestimmt. Nach 24 Stunden wiesen unbehandelte HIG-82-Zellen im Wesentlichen keine DNA-Fragmentierung im Zellkern auf.
  • Tabelle 7 Prozentsatz an Zellen mit DNA-Fragmentierung (in Apoptose befindliche Zellen) in HIG-82-Zellen
    Figure 00300001
  • Wie in Tabelle 7 dargestellt, waren SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 gegenüber exponentiell wachsenden synovialen Zellen inaktiv. Unerwartet verlieh die Einführung eines Cholesteryl-TEG-Phosphoramidits am 3'-Ende von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2, wodurch SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 6 erhalten wurden, die Fähigkeit zur Induktion von Apoptose in HIG-82-Zellen, wie durch Messung des Prozentsatzes an Zellen mit fragmentierter DNA im Zellkern gezeigt wurde.
  • Beispiel 9
  • Induktion des Anhaltens des Zellzyklus durch SEQ ID NO: 6
  • Exponentiell wachsende MEG-01-Zellen (2 × 105 Zellen/ml) wurden für 24 Stunden mit 0 μM (Kontrolle), 53 μM an SEQ ID NO: 2 oder 53 μM an SEQ ID NO: 6 inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt, zentrifugiert, und das Stadium des Zellzyklus bestimmt.
  • Tabelle 8 Induktion des Anhaltens des Zellzyklus in MEG-01-Leukämiezellen durch SEQ ID NO: 6
    Figure 00310001
  • Wie in Tabelle 8 dargestellt, war SEQ ID NO: 2, verglichen mit unbehandelten Kontrollzellen, gegenüber MEG-01 inaktiv. Unerwartet verlieh die Einführung eines Cholesteryl-TEG-Phosphoramidits am 3'-Ende von SEQ ID NO: 2, wodurch SEQ ID NO: 6 erhalten wurde, die Fähigkeit zur Induktion des Anhaltens des Zellzyklus in der SL + G2/M-Phase in MEG-01-Zellen.
  • Beispiel 10
  • Wirkung von SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 7 auf die Zellproliferation von humanen Brustkrebszellen
  • Auf 24-er Wellplatten wurden 20 × 103 MDA-MB-231 (MDA-231)-Zellen oder Hs578T-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit (Kontrolle) von 53 μM (Endkonzentration) an SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, 53 μM Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit, oder entsprechenden Kontrollmedien (normales Kulturmedium (RCM) für SEQ ID NO: 3; RCM mit einer Menge an Wasser, welche der zu SEQ ID NO: 7 zugesetzten Menge entspricht; und RCM mit einer Menge an Acetonitril, welche der zu Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit zugesetzten Menge entspricht) in normalem Kulturmedium (RCM) in einzelnen Wells ausplattiert. Die Zellen wurden für 72 Stunden kultiviert, mit Trypsin abgelöst und mittels eines Hämozytometers unter Verwendung der Trypanblau-Ausschlusstechnik ausgezählt. Die Ergebnisse dreier unabhängiger Assays (mittlere Abweichung und Standardabweichung (s.d.) prozentualer Veränderungen gegenüber den Kontrollen) sind in Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9 Prozentuale Veränderungen der Zellproliferation* von humanen MDA-231- und Hs578T-Brustkrebszellen, welche für drei Tage kultiviert wurden.
    Figure 00320001
    • *„positive +" Veränderungen repräsentieren eine Stimulierung der Proliferation, und „negative –" Veränderungen repräsentieren eine Hemmung der Proliferation, welche als
      Figure 00320002
      berechnet wurde.
    • ** Der p-Wert wurde mittels Dunnetts multiplem Vergleichstest nach wiederholter Messung der Varianzanalyse (RM ANOVA) erhalten.
  • Wie in Tabelle 9 dargestellt, beeinflussen SEQ ID NO: 3 und Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit die Zellproliferation nicht signifikant. Unerwartet verlieh die Einführung eines Cholesteryl-TEG-Phosphoramidits am 3'-Ende von SEQ ID NO: 3, wodurch SEQ ID NO: 7 erhalten wurde, die Fähigkeit zur Hemmung der Zellproliferation zweier hochagressiver humaner Brustkrebszelllinien.
  • Beispiel 11
  • Veränderungen in der durch SEQ ID NO: 5 induzierten Bildung dreidimensionaler Strukturen in MATRIGEL®-Anzuchtexperimenten
  • MCF-7-, MDA-MB-231 (MDA-231)-, Hs578T- und Mpanc-96-Zellen wurden getrennt voneinander in normalem Kulturmedium kultiviert, trypsiniert und ausgezählt. 100 × 103 an MDA-231-Zellen, 100 × 103 an Hs578T-Zellen, 150 × 103 an MCF-7-Zellen und 150 × 103 an Mpanc-96-Zellen wurden getrennt voneinander für 1 Stunde bei 37°C mit einer Endkonzentration von 53 μM an SEQ ID NO: 1, 53 μM an SEQ ID NO: 5 oder RCM vorinkubiert, und auf MATRIGEL®-beschichteten Platten (für Zellware bestimmte, mit MATRIGEL®-Basalmembranmatrix beschichtete 24-er Wellplatte) für drei Tage ausplattiert. Die Platten wurden mit 10%-igem Formalin fixiert. Unter Verwendung einer Nikon Coolpix 990 Digitalkamera (Nikon Corporation, Tokio, Japan), welche mit einem inversen Mikroskop Modell TMS der Firma Nikon verbunden war, wurden digitale Fotographien der Zellen in den 24-er Wellplatten aufgenommen. Während SEQ ID NO: 1 keine Veränderung der Zellmorphologie bewirkte, verhinderte SEQ ID NO: 5 die Bildung dreidimensionaler Strukturen, welche eine Ähnlichkeit mit den bei der Kultivierung von Zellen auf MATRIGEL® in normalem Kulturmedium gebildeten Strukturen aufwiesen (siehe 1).
  • Wie in 1 dargestellt, war SEQ ID NO: 1 inaktiv, während die Einführung eines Cholesteryl-TEG-Phosphoramidits am 3'-Ende von SEQ ID NO: 1, wodurch SEQ ID NO: 5 erhalten wurde, unerwartet die Fähigkeit verlieh, die Bildung dreidimensionaler Strukturen, welche eine Ähnlichkeit mit den bei der Kultivierung von Zellen auf MATRIGEL® in normalem Kulturmedium gebildeten Strukturen aufwiesen, zu verhindern. Es wird angenommen, dass SEQ ID NO: 5 eine Beeinträchtigung von Wechselwirkungen zwischen Zelle und extrazellulärer Matrix bewirkte, wodurch Adhäsionsmechanismen zwischen Zellen und Adhäsionsmechanismen zwischen Zelle und extrazellulärer Matrix moduliert wurden.
  • Beispiel 12
  • Veränderungen in der durch SEQ ID NO: 8 induzierten Bildung dreidimensionaler Strukturen in MATRIGEL® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)-Anzuchtexperimenten
  • MDA-MB-231 (MDA-231) und Hs578T wurden in normalem Kulturmedium kultiviert, trypsiniert und ausgezählt. 100 × 103 an MDA-MB-231-Zellen oder 100 × 103 an Hs578T-Zellen wurden getrennt voneinander für eine Stunde bei 37°C bei einer Endkonzentration von 53 μM an SEQ ID NO: 4, 53 μM an SEQ ID NO: 8 oder RCM vorinkubiert, und auf MATRIGEL®-beschichteten Platten für drei Tage ausplattiert. Die Platten wurden mit 10%-igem Formalin fixiert. Unter Verwendung einer Nikon Coolpix 990 Digitalkamera (Nikon Corporation, Tokio, Japan), welche mit einem inversen Mikroskop Modell TMS der Firma Nikon verbunden war, wurden digitale Fotographien der Zellen in den 24-er Wellplatten aufgenommen, Während SEQ ID NO: 4 keine Veränderung der Zellmorphologie bewirkte, störte SEQ ID NO: 8 das Wachstumsmuster der auf MATRIGEL® ausplattierten Tumorzellen (siehe 2).
  • Wie in 2 dargestellt, war SEQ ID NO: 4 inaktiv, während die Einführung eines Cholesteryl-TEG-Phosphoramidits am 3'-Ende von SEQ ID NO: 4, wodurch SEQ ID NO: 8 erhalten wurde, unerwartet die Fähigkeit verlieh, die Bildung dreidimensionaler Strukturen, welche eine Ähnlichkeit mit den bei der Kultivierung von Zellen auf MATRIGEL®-beschichteten Wells in normalem Kulturmedium gebildeten Strukturen aufwiesen, zu verhindern. Es wird angenommen, dass SEQ ID NO: 8 eine Beeinträchtigung von Wechselwirkungen zwischen Zelle und extrazellulärer Matrix bewirkte, wodurch Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und den ECM-Bestandteilen moduliert wurden.
  • Beispiel 13
  • Veränderungen in der durch SEQ ID NO: 7 induzierten Bildung dreidimensionaler Strukturen von MCF-7-Zellen in MATRIGEL®-Anzuchtexperimenten
  • MCF-7-Zellen wurden in normalem Kulturmedium (RCM) kultiviert, trypsiniert und ausgezählt. 150 × 103 an MCF-7-Zellen wurden in den Wells von 24er-Wellplatten, welche mit 350 μl an MATRIGEL® beschichtet waren, ausplattiert. Nach Ausbildung dreidimensionaler Strukturen im Laufe von 48 Stunden ohne jegliche Behandlung wurde das Medium gewechselt, und die Strukturen einer Endkonzentration von 53 μM an SEQ ID NO: 3, 53 μM an SEQ ID NO: 7, 53 μM an Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit, RCM, oder deren entsprechenden Kontrollmedien (RCM mit Wasser, RCM mit DMSO, oder RCM mit Acetonitril) ausgesetzt. Die Behandlungen wurden alle 3–4 Tage bis hin zu einer maximalen Kultivierungsdauer von 19–20 Tagen wiederholt. Das Experiment wurde dreifach wiederholt. Unter Verwendung einer Nikon Coolpix 990 Digitalkamera, welche mit einem inversen Mikroskop Modell TMS der Firma Nikon verbunden war, wurden digitale Fotographien der Zellen in den 24-er Wellplatten aufgenommen. Während die entsprechenden Kontrollmedien (Daten nicht dargestellt), SEQ ID NO: 3 und Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit die dreidimensionalen Strukturen, verglichen mit den Kontrollen, nicht beeinflussten, störte SEQ ID NO: 7 das Wachstumsmuster der Strukturen, wodurch Wechselwirkungen zwischen Zellen und Wechselwirkungen zwischen Zelle und extrazellulärer Matrix beeinflusst wurden (siehe 3).
  • Wie in 3 dargestellt, waren SEQ ID NO: 3 und Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit inaktiv, während die Einführung eines Cholesteryl-TEG-Phosphoramidits am 3'-Ende von SEQ ID NO: 3, wodurch SEQ ID NO: 7 erhalten wurde, unerwartet die Fähigkeit verlieh, vorab gebildete dreidimensionale Strukturen zu stören.
  • Beispiel 14
  • Veränderungen in der durch SEQ ID NO: 7 induzierten Bildung dreidimensionaler Strukturen von MDA-MB-231-Zellen in MATRIGEL®-Anzuchtexperimenten
  • MDA-MB-231 (MDA-231)-Zellen wurden in normalem Kulturmedium kultiviert, trypsiniert und ausgezählt. 100 × 103 an MDA-231-Zellen wurden in normalem Kulturmedium (RCM) in den Wells von 24er-Wellplatten, welche mit 350 μl an MATRIGEL® beschichtet waren, ausplattiert. Nach Ausbildung dreidimensionaler Strukturen im Laufe von 48 Stunden ohne jegliche Behandlung wurde das Medium gewechselt, und die Strukturen einer Endkonzentration von 53 μM an SEQ ID NO: 3, 53 μM an SEQ ID NO: 7, 53 μM an Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit, RCM, oder deren entsprechenden Kontrollmedien (RCM mit Wasser, RCM mit DMSO, oder RCM mit Acetonitril) ausgesetzt. Die Behandlungen wurden alle 3–4 Tage bis hin zu einer maximalen Kultivierungsdauer von 17–21 Tagen wiederholt. Das Experiment wurde dreifach wiederholt. Unter Verwendung einer Nikon Coolpix 990 Digitalkamera, welche mit einem inversen Mikroskop Modell TMS der Firma Nikon verbunden war, wurden digitale Fotographien der Zellen in den 24-er Wellplatten aufgenommen. Während die entsprechenden Kontrollmedien (Daten nicht dargestellt), SEQ ID NO: 3 und Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit die dreidimensionalen Strukturen nicht beeinflussten, wobei diese Strukturen Ähnlichkeit mit den in RCM (negatives Kontrollmedium) kultivierten Strukturen aufwiesen, störte SEQ ID NO: 7 das Wachstumsmuster der Strukturen, wodurch Wechselwirkungen zwischen Zellen und Wechselwirkungen zwischen Zelle und extrazellulärer Matrix beeinflusst wurden (siehe 4).
  • Wie in 4 dargestellt, waren SEQ ID NO: 3 und Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit inaktiv, während die Einführung von Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit am 3'-Ende von SEQ ID NO: 3, wodurch SEQ ID NO: 7 erhalten wurde, unerwartet die Fähigkeit verlieh, dreidimensionale Strukturen durch Beeinträchtigung von Wechselwirkungen zwischen Zellen und Wechselwirkungen zwischen Zelle und extrazellulärer Matrix zu stören.
  • Beispiel 15
  • SEQ ID NO: 7-induzierte Veränderungen im Zellzyklus, wenn die Hs578T-Zellen als multizelluläre Sphäroide kultiviert wurden
  • Etwa 100 × 103 Hs578T-Zellen pro Sphäroid wurden in Gegenwart einer Endkonzentration von 53 μM an SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, einer Endkonzentration von 53 μM an Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit (Chol-TEG), oder entsprechender Kontrollmedien (normales Kulturmedium (RCM); RCM mit einer Menge an Wasser (RCMW), welche der zu SEQ ID NO: 7 zugesetzten Menge entspricht; und RCM mit einer Menge an Acetonitril (RCMA), welche der zu Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit zugesetzten Menge entspricht) kultiviert. Unter den jeweiligen Versuchsbedingungen wurden jeweils fünf Sphäroide für 72 Stunden kultiviert. Anschließend wurde die Progression des Zellzyklus durch Anfärben mittels Propidiumiodid (PI) (Calbiochem, Novabiochem Corporation, San Diego, CA) unter Verwendung eines FACScalibur Durchflusszytometers (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) evaluiert. Veränderungen im Prozentsatz an Zellen in den unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus wurden unter Verwendung der MODFIT LT-Software (Verity Software House Inc.) analysiert. Die Ergebnisse sind in 5 dargstellt.
  • Wie in 5 dargestellt, bewirkten SEQ ID NO: 3, Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit, oder die Kontrollmedien, verglichen mit jenen Sphäroiden, welche ausschließlich dem normalen Kulturmedium ausgesetzt waren, keine signifikante Modifizierung der Progression des Zellzyklus. Unerwartet bewirkte eine Exposition mit SEQ ID NO: 7 eine Erhöhung des Prozentsatzes an Zellen in der G2/M- und S-Phase, sowie eine Abnahme des Prozentsatzes an Zellen in G0/G1 (p < 0.05 gemäß χ-Quadrattest). Die Einführung von Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit verlieh einem im MS-Assay getesteten inaktiven Oligonukleotid die Fähigkeit, die Progression des Zellzyklus in einem komplexen dreidimensionalen System, welches verschiedene biopathologische Eigenschaften von in vivo-Tumoren nachahmt, zu modifizieren.
  • Beispiel 16
  • Veränderungen in der Freisetzung von Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) durch humane MDA-MB-231-Brustkrebszellen, wenn diese mit SEQ ID NO: 5 inkubiert wurden
  • MDA-MB-231-Zellen wurden in Form von Monolayerkulturen in entsprechenden Kontrollmedien mit einer Endkonzentration von 53 μM an SEQ ID NO: 1 oder einer Endkonzentration von 53 μM an SEQ ID NO: 5 für 72 Stunden kultiviert. Die Freisetzung von Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) wurde als Maß für Apoptose herangezogen. Unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen ELISA-Kits (Oncogene, Cambridge, MA) wurde NuMA entsprechend den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargestellt und werden als Erhöhung des Prozentsatzes der NuMA-Freisetzung im Vergleich zu entsprechenden Kontrollen ausgedrückt, wobei die Ergebnisse auf Messungen der optischen Dichte basieren.
  • Tabelle 10 Veränderungen in der Freisetzung von Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) in humanen MDA-MB-231-Brustkrebszellen
    Figure 00370001
  • Wie in Tabelle 10 dargestellt, erhöhte sich nach Inkubation der Zellen mit SEQ ID NO: 5 die Freisetzung von Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) um 430%. Unerwartet verlieh die Einführung von Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit am 3'-Ende von SEQ ID NO: 1, wodurch SEQ ID NO: 5 erhalten wurde, die Fähigkeit zur Induktion von Apoptose.
  • Beispiel 17
  • Veränderungen in der Freisetzung von Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) durch humane Hs578T-Brustkrebszellen, wenn diese mit SEQ ID NO: 6 inkubiert wurden
  • Hs578T-Zellen wurden in Form von Monolayerkulturen unter Negativ-Kontrollbedingungen, oder mit einer Endkonzentration von 53 μM an SEQ ID NO: 2 oder 53 μM an SEQ ID NO: 6 für 72 Stunden kultiviert. Die Freisetzung von Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) wurde als Maß für Apoptose herangezogen. Unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen ELISA-Kits wurde NuMA entsprechend den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 dargestellt und werden als Erhöhung des Prozentsatzes der NuMA-Freisetzung im Vergleich zu Kontrollbedingungen ausgedrückt, wobei die Ergebnisse auf Messungen der optischen Dichte basieren.
  • Tabelle 11 Veränderungen in der Freisetzung von Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) durch humane Hs578T-Brustkrebszellen
    Figure 00380001
  • Wie in Tabelle 11 dargestellt, erhöhte sich nach Inkubation der Zellen mit SEQ ID NO: 6 die Freisetzung von Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) um 288%. Unerwartet verlieh die Einführung von Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit am 3'-Ende von SEQ ID NO: 2 einem inaktiven Oligonukleotid die Fähigkeit zur Induktion von Apoptose.
  • Beispiel 18
  • Wirkung von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 auf MEG-01-Zellen in athymischen Nacktmäusen
  • MEG-01-Zellen werden, wie vorab beschrieben (Takeo et al., Leukemia, 7: 1286, 1993), subkutan in athymische Nacktmäuse eingeimpft. Die Mäuse werden in 13 Gruppen von jeweils 10 Mäusen unterteilt. Am Tag 0 erhalten Mäuse der Gruppe 1 Kochsalzlösung, Mäuse der Gruppe 2 1 mg/kg SEQ ID NO: 1, Mäuse der Gruppe 3 10 mg/kg SEQ ID NO: 1, Mäuse der Gruppe 4 100 mg/kg SEQ ID NO: 1, Mäuse der Gruppe 5 1 mg/kg SEQ ID NO: 2, Mäuse der Gruppe 6 10 mg/kg SEQ ID NO: 2, Mäuse der Gruppe 7 100 mg/kg SEQ ID NO: 2, Mäuse der Gruppe 8 1 mg/kg SEQ ID NO: 5, Mäuse der Gruppe 9 10 mg/kg SEQ ID NO: 5, Mäuse der Gruppe 10 100 mg/kg SEQ ID NO: 5, Mäuse der Gruppe 11 1 mg/kg SEQ ID NO: 6, Mäuse der Gruppe 12 10 mg/kg SEQ ID NO: 6, und Mäuse der Gruppe 13 100 mg/kg SEQ ID NO: 6. Nach 4 Wochen Behandlung werden die Mäuse geopfert und die Tumormasse bestimmt. Die Mäuse der Gruppen 8–13 weisen eine geringere Tumormasse auf als Mäuse der Gruppen 1–7. Die geringere Tumormasse bei Mäusen der Gruppen 8–13 ist durch Dosisabhängigkeit gekennzeichnet.
  • Beispiel 19
  • Wirkung von SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 7 auf das Wachstum von Lymphomzellen in Mäusen
  • Murine EL-4 T-Lymphomzellen werden, wie vorab beschrieben (Krawczyk et al., Cancer Immunol. Immunother., 40: 347, 1995), subkutan in C57/BL6-Mäuse implantiert. Die Mäuse werden in 7 Gruppen von jeweils 10 Mäusen unterteilt. Am Tag 0 erhalten Mäuse der Gruppe 1 Kochsalzlösung, Mäuse der Gruppe 2 1 mg/kg SEQ ID NO: 3, Mäuse der Gruppe 3 10 mg/kg SEQ ID NO: 3, Mäuse der Gruppe 4 100 mg/kg SEQ ID NO: 3, Mäuse der Gruppe 5 1 mg/kg SEQ ID NO: 7, Mäuse der Gruppe 6 10 mg/kg SEQ ID NO: 7, und Mäuse der Gruppe 7 100 mg/kg SEQ ID NO: 7. Nach 4 Wochen Behandlung werden die Mäuse geopfert und die Tumormasse bestimmt. Die Gruppen 5–7 weisen eine geringere Tumormasse auf als Mäuse der Gruppen 1–4. Die geringere Tumormasse bei Mäusen der Gruppen 5–7 ist durch Dosisabhängigkeit gekennzeichnet.
  • Beispiel 20
  • Wirkung von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 auf Ratten mit durch Streptokokkenzellwand-induzierter Arthritis
  • Streptokokkenzellwand-induzierte Arthritis in LEW/N-Ratten ähnelt einem lokalisierten Neoplasma, welches teilweise aus einer proliferativen und invasiven Population an fibroblastenähnlichen synovialen Zellen besteht (Yocum et al., Am. J. Pathol., 132: 38, 1988). Die Arthritis in LEW/N-Ratten wird durch intraartikuläre Injektion von Streptokokkenzellwand (SCW) aus der Gruppe A Streptococcus pyogenes induziert. Die Ratten werden in 13 Gruppen von jeweils 10 Ratten unterteilt. Am Tag 0 erhalten Ratten der Gruppe 1 SCW, Ratten der Gruppe 2 SCW + 1 mg/kg SEQ ID NO: 1, Ratten der Gruppe 3 SCW + 10 mg/kg SEQ ID NO: 1, Ratten der Gruppe 4 SCW + 100 mg/kg SEQ ID NO: 1, Ratten der Gruppe 5 SCW + 1 mg/kg SEQ ID NO: 2, Ratten der Gruppe 6 SCW + 10 mg/kg SEQ ID NO: 2, Ratten der Gruppe 7 SCW + 100 mg/kg SEQ ID NO: 2, Ratten der Gruppe 8 SCW + 1 mg/kg SEQ ID NO: 5, Ratten der Gruppe 9 SCW + 10 mg/kg SEQ ID NO: 5, Ratten der Gruppe 10 SCW + 100 mg/kg SEQ ID NO: 5, Ratten der Gruppe 11 SCW + 1 mg/kg SEQ ID NO: 6, Ratten der Gruppe 12 SCW + 10 mg/kg SEQ ID NO: 6 und Ratten der Gruppe 13 SCW + SEQ ID NO: 6. Die Gelenkentzündung wird über zwei Wochen täglich überwacht. Ratten der Gruppen 8–13 zeigen eine geringere Entzündung als Ratten der Gruppen 1–7. Die geringere Entzündung bei Ratten der Gruppen 8–13 ist durch Dosisabhängigkeit gekennzeichnet.
  • Beispiel 21
  • Wirkung von TEG-Cholesteryl-konjugierten Sequenzen auf die Zellmorphologie und den Zellzyklus, wenn die Krebszellen als Monolayerkulturen auf MATRIGEL® oder als multizelluläre Sphäroide angezüchtet werden
  • Verschiedene Typen maligner Zelllinien von Brust, Bauchspeicheldrüse, Dickdarm, Eierstöcken und Prostata werden als Monolayerkulturen auf MATRIGEL®-beschichteten Wells, oder als multizelluläre Sphäroide (MS) kultiviert. Die Zellen werden einzeln mit Oligonukleotidsequenzen unterschiedlicher Länge (3 bis 6 Nukleotidbasen) in Anwesenheit oder Abwesenheit von konjugiertem Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit für mindestens 1–3 Tage behandelt. Derartige Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 8. Die Zellproliferation/Nekrose (gemessen mittels Trypanblau-Ausschluss), Apoptose (gemessen mittels Durchflusszytometrie, Freisetzung von Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA), Detektion fragmentierter DNA mittels einer durch das Enzym Terminale Desoxynukleotidyl-Transferase vermittelten DNA-Strangbruch-Endmarkierung mit Bromodesoxyuridin-Triphosphat-Biotin (TUNEL)), Progression des Zellzyklus, welche mittels Durchflusszytometrie (Anfärben mit PI) untersucht wurde, sowie die Morphologie der auf MATRIGEL®-beschichteten Wells oder als multizelluläre Sphäroide (MS) ausplattierten Tumorzellen werden untersucht.
  • Oligonukleotidsequenzen, welche mit Cholesteryl-TEG-Phosphoramidit konjugiert sind, bewirken einen vermehrten Zelltod (Nekrose und Apoptose), eine Modifizierung der Progression des Zellzyklus, wenn die Zellen als MS oder auf MATRIGEL®-beschichteten Platten kultiviert werden, sowie eine Veränderung der Zellmorphologie, wenn die Zellen als MS oder auf MATRIGEL®-beschichteten Wells kultiviert werden. Nicht-konjugierte Oligonukleotide sind inaktiv.
  • Beispiel 22
  • Wirkung von SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 7 auf MDA-MB-231-xenotransplantierte Tumore
  • MDA-MB-231-Zellen werden subkutan in Nacktmäuse xenotransplantiert. Die Mäuse werden in 7 Gruppen von jeweils 10 Mäusen unterteilt. Nach Erreichen eines Tumordurchmessers von 5 mm erhalten Mäuse der Gruppe 1 Kochsalzlösung, Mäuse der Gruppe 2 0.5 mg/kg SEQ ID NO: 3, Mäuse der Gruppe 3 5 mg/kg SEQ ID NO: 3, Mäuse der Gruppe 4 50 mg/kg SEQ ID NO: 3, Mäuse der Gruppe 5 0.5 mg/kg SEQ ID NO: 7, Mäuse der Gruppe 6 5 mg/kg SEQ ID NO: 7, und Mäuse der Gruppe 7 50 mg/kg SEQ ID NO: 7. Die Behandlungen werden alle 3 Tage bei einem Maximum von 6 Dosen intravenös verabreicht. Bei Erreichen eines Tumordurchmessers von 1 cm, bei geringsten Anzeichen von Qualen, oder am Ende der Studie (3 Monate nach Zellinjektion) werden die Mäuse geopfert. Es werden vollständige Autopsien durchgeführt. Es wird eine Bestimmung der Tumormasse, des Auftretens von Invasion, sowie einer Metastasierung durchgeführt. Die Gruppen 5–7 weisen eine geringere Tumormasse auf als Mäuse der Gruppen 1–4. Die geringere Tumormasse bei Mäusen der Gruppen 5–7 ist durch Dosisabhängigkeit gekennzeichnet.
  • Beispiel 23
  • Wirkung von SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 7 auf MDA-MB-231-xenotransplantierte Tumore
  • MDA-MB-231-Brustkrebszellen werden subkutan in Nacktmäuse xenotransplantiert (1 × 107Zellen). Die Mäuse werden in 7 Gruppen von jeweils 10 Mäusen unterteilt. Nach Erreichen eines Tumordurchmessers von 5 mm2 erhalten Mäuse der Gruppe 1 Kochsalzlösung, Mäuse der Gruppe 2 0.4 mg/kg SEQ ID NO: 3, Mäuse der Gruppe 3 4 mg/kg SEQ ID NO: 3, Mäuse der Gruppe 4 40 mg/kg SEQ ID NO: 3, Mäuse der Gruppe 5 0.4 mg/kg SEQ ID NO: 7, Mäuse der Gruppe 6 4 mg/kg SEQ ID NO: 7, und Mäuse der Gruppe 7 40 mg/kg SEQ ID NO: 7. Die Behandlungen werden alle 3 Tage bei einem Maximum von 6 Dosen intravenös verabreicht. Bei Erreichen eines Tumordurchmessers von 1 cm, bei geringsten Anzeichen von Qualen, oder am Ende der Studie (3 Monate nach Zellinjektion) werden die Mäuse geopfert. Es werden vollständige Autopsien durchgeführt. Es wird eine Bestimmung der Tumormasse, des Auftretens von Invasion, sowie einer Metastasierung durchgeführt. Die Gruppen 5–7 weisen eine geringere Tumormasse und Metastasierung auf als Mäuse der Gruppen 1–4. Die geringere Tumormasse und Metastasierung bei Mäusen der Gruppen 5–7 ist durch Dosisabhängigkeit gekennzeichnet.
  • Es versteht sich, dass sich die vorangehende Beschreibung selbstverständlich lediglich auf bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bezieht und in diesem Zusammenhang verschiedene Modifikationen oder Veränderungen vorgenommen werden können.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00430001
  • Figure 00440001

Claims (11)

  1. Zusammensetzung, welche eine synthetische 5'-OH, 3'-TEG-Cholesteryl-Sequenz umfasst, wobei die Sequenz SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 ist.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche weiterhin einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche weiterhin einen therapeutischen Wirkstoff umfasst.
  4. Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Medikament wirksam ist, eine Reaktion in einer Zelle zu induzieren.
  6. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Medikament nützlich ist, einem Tier oder einem Menschen verabreicht zu werden.
  7. Verwendung nach Anspruch 4, 5 oder 6, wobei die Reaktion eine Hemmung der Zellproliferation, ein Anhalten des Zellzyklus, eine Induktion von Apoptose, eine Aktivierung von Caspase, eine Spaltung von Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase in der Zelle oder eine Modulation extrazellulärer Wechselwirkung zwischen Matrix und Zelte, oder eine Kombination hiervon, ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Zelle eine Krebszelle oder eine synoviale Zelle ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 4, 5 oder 6, wobei das Medikament wirksam ist, eine Krankheit zu behandeln.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Krankheit Krebs oder Arthritis ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei der Krebs Lymphknotenkrebs, Leukämie oder Brustkrebs ist.
DE60208400T 2001-10-03 2002-10-03 Therapeutisch verwendbare triethylenglykol-cholesteryl-oligonukleotide Expired - Lifetime DE60208400T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32688401P 2001-10-03 2001-10-03
US326884P 2001-10-03
PCT/IB2002/004065 WO2003028764A1 (en) 2001-10-03 2002-10-03 Therapeutically useful triethyleneglycol cholesteryl oligonucleotides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60208400D1 DE60208400D1 (de) 2006-02-02
DE60208400T2 true DE60208400T2 (de) 2006-07-06

Family

ID=23274136

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60208400T Expired - Lifetime DE60208400T2 (de) 2001-10-03 2002-10-03 Therapeutisch verwendbare triethylenglykol-cholesteryl-oligonukleotide

Country Status (16)

Country Link
US (1) US7635686B2 (de)
EP (1) EP1432450B1 (de)
JP (1) JP4405259B2 (de)
KR (1) KR100971571B1 (de)
CN (1) CN100352510C (de)
AT (1) ATE314096T1 (de)
AU (1) AU2002341264B2 (de)
CA (1) CA2462425A1 (de)
DE (1) DE60208400T2 (de)
DK (1) DK1432450T3 (de)
ES (1) ES2250713T3 (de)
HK (1) HK1067308A1 (de)
IL (2) IL161181A0 (de)
MX (1) MXPA04002530A (de)
PT (1) PT1432450E (de)
WO (1) WO2003028764A1 (de)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2393808A1 (en) * 1999-12-13 2001-06-21 Bioniche Life Sciences Inc. Anti-cancer synthetic oligonucleotides
US7491805B2 (en) * 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
KR20050009697A (ko) * 2002-04-22 2005-01-25 바이오니취 라이프 사이언시즈 인코포레이티드 올리고뉴클레오티드 조성물 및 면역 반응 조절시 이의 용도
US20090087456A1 (en) * 2005-09-07 2009-04-02 James Edward Eyles Adjuvanted vaccine
US20090054366A1 (en) * 2007-06-15 2009-02-26 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. RNAi MEDIATED KNOCKDOWN OF NUMA FOR CANCER THERAPY
GB0906234D0 (en) 2009-04-14 2009-05-20 Secr Defence Vaccine

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4958013A (en) * 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
DE69434614T2 (de) * 1993-11-30 2006-10-05 Tanox, Inc., Houston Cdn apoptosis modulierende proteine, sie kodierende dns und verfahren zu ihrer verwendung
US5756668A (en) * 1994-11-15 1998-05-26 The Johns Hopkins University School Of Medicine Hypermethylated in cancer polypeptide, HIC-1
US5643890A (en) 1995-01-31 1997-07-01 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Synthetic oligonucleotides which mimic telomeric sequences for use in treatment of cancer and other diseases
AU7596496A (en) 1995-10-19 1997-05-07 Johnson & Johnson Interventional Systems Conjugation of c-myc antisense oligonucleotides with cholesterol to significantly enhance their inhibitory effect on neointimal hyperplasia
US5958780A (en) * 1997-06-30 1999-09-28 Boston Advanced Technologies, Inc. Method for marking and identifying liquids
WO1999011813A2 (en) 1997-09-04 1999-03-11 Bayer Corporation Oligonucleotide probes bearing quenchable fluorescent labels, and methods of use thereof
EP0979869A1 (de) 1998-08-07 2000-02-16 Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH Kurze Oligonukleotide zur Hemmung von VEGF-Expression
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
CA2393808A1 (en) * 1999-12-13 2001-06-21 Bioniche Life Sciences Inc. Anti-cancer synthetic oligonucleotides
US7087586B2 (en) * 2001-04-24 2006-08-08 Bioniche Life Sciences, Inc. Oligonucleotide compositions and their use to induce differentiation of cells
KR100991975B1 (ko) * 2001-05-16 2010-11-04 미게닉스 인코포레이티드 핵산을 기본으로 하는 화합물 및 이의 사용방법

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002341264B2 (en) 2007-07-12
HK1067308A1 (en) 2005-04-08
PT1432450E (pt) 2006-05-31
JP2005509607A (ja) 2005-04-14
CN1599627A (zh) 2005-03-23
US20030125290A1 (en) 2003-07-03
JP4405259B2 (ja) 2010-01-27
KR100971571B1 (ko) 2010-07-20
MXPA04002530A (es) 2004-05-31
IL161181A0 (en) 2004-08-31
US7635686B2 (en) 2009-12-22
WO2003028764A1 (en) 2003-04-10
ES2250713T3 (es) 2006-04-16
CN100352510C (zh) 2007-12-05
ATE314096T1 (de) 2006-01-15
KR20040068114A (ko) 2004-07-30
DK1432450T3 (da) 2006-05-15
IL161181A (en) 2010-06-30
EP1432450A1 (de) 2004-06-30
DE60208400D1 (de) 2006-02-02
CA2462425A1 (en) 2003-04-10
EP1432450B1 (de) 2005-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8350016B2 (en) Oligonucleotide compositions and their use to induce apoptosis
DE60036700T2 (de) Antiproliferative aktivität von g-reichen oligonukleotiden und verfahren um sie zur bindung an nukleotin zu verwenden
CN104781271B (zh) 具有生物可逆的基团的多核苷酸
CN102438978B (zh) 聚胺衍生物
CN102666879B (zh) 模板化的纳米缀合物
JP2016028605A (ja) Ｒｎａ干渉効果が高い脂質修飾２本鎖ｒｎａ
KR20170063949A (ko) 항-ｔｎｆ 화합물
CN109415731A (zh) 呈递用于特异性敲低白介素17受体mRNA的反义寡核苷酸(ASO)的脂质体球形核酸(SNA)构建体
JP2016524462A (ja) 非免疫原性及び核酸分解酵素耐性核酸折り紙デバイス及びその組成物
US20090061007A1 (en) Pharmaceutical preparation
DE60208400T2 (de) Therapeutisch verwendbare triethylenglykol-cholesteryl-oligonukleotide
AU2002330663A1 (en) Oligonucleotide compositions and their use to induce apoptosis
MXPA05006069A (es) Metodos para inhibir cancer y formacion de cicatrices.
AU2002341264A1 (en) Therapeutically useful triethyleneglycol cholesteryl oligonucleotides
Mann Investigating the biosafety and toxicity of magnetic iron oxide nanoparticles in vitro and in vivo
JP3150609B2 (ja) 癌治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド
TW202018080A (zh) Rna奈米結構，其製備方法和用途
WO2021158627A1 (en) Compositions comprising nanoparticles and methods thereof
DE10350256A1 (de) PIM-1-spezifische siRNA-Verbindungen

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition