ES2250713T3 - Oligonucleotidos de trietilenglicol-colesterilo terapeuticamente utiles. - Google Patents

Oligonucleotidos de trietilenglicol-colesterilo terapeuticamente utiles.

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ES2250713T3
ES2250713T3 ES02775055T ES02775055T ES2250713T3 ES 2250713 T3 ES2250713 T3 ES 2250713T3 ES 02775055 T ES02775055 T ES 02775055T ES 02775055 T ES02775055 T ES 02775055T ES 2250713 T3 ES2250713 T3 ES 2250713T3
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Nigel C. Phillips
Mario C. Filion
Andrea Cristina Herrera-Gayol
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Abstract

Una composición que comprende una secuencia sintética de 5''¿OH, 3''¿TEG¿colesterilo, en donde la secuencia es SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8.

Description

Oligonucleótidos de trietilenglicol-colesterilo terapéuticamente útiles.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones de oligonucleótidos conjugados con colesterilo y su uso para la preparación de un medicamento destinado a la inhibición de la proliferación celular, inducción de la apoptosis, modificación de la progresión del ciclo celular y modulación de la interacción matriz extracelular-célula.
Antecedentes de la invención
La proliferación es la culminación de la progresión de una célula a través del ciclo celular, dando como resultado la división de una sola célula en dos células. Las cinco fases principales del ciclo celular son: G_{0}, G_{1}, S, G_{2}, y M. Durante la fase G_{0}, las células están en reposo. La mayoría de las células en el cuerpo, en un momento dado, se encuentran en esta etapa. Durante la fase G_{1}, las células, respondiendo a señales para dividirse, producen el RNA y las proteínas necesarias para la síntesis de DNA. Durante la fase S (SE, fase S temprana; SM, fase S intermedia; y SL, fase S tardía) las células replican su DNA. Durante la fase G_{2}, se elaboran proteínas en preparación para la división celular. Durante la fase mitótica (M), la célula se divide en dos células hijas. Las alteraciones en la progresión del ciclo celular ocurren en todos los cánceres y pueden ser resultado de la sobreexpresión de genes, mutación de genes reguladores, o anulación de puntos de comprobación de deterioro del DNA (Hochhauser D., Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents, 8:903, 1997).
La apoptosis o muerte celular programada es el proceso fisiológico para la destrucción y eliminación de células no deseadas, y un mecanismo por el cual los agentes quimioterapéuticos destruyen las células cancerosas. La apoptosis se caracteriza por cambios morfológicos distintivos en el interior de las células que incluyen condensación de la cromatina nuclear, contracción celular, desintegración nuclear, formación de pequeñas vesículas en la membrana plasmática, y formación de cuerpos apoptóticos fijados a la membrana (Wyllie et al., Int. Rev. Cytol., 68:251, 1980). La translocación de la fosfatidilserina desde la cara interna de la membrana plasmática a la cara externa coincide con condensación de la cromatina y está considerada como un sello celular de la apoptosis (Koopman, G. et al., Blood, 84:1415, 1994). Se sabe que el mecanismo de la apoptosis está mediado por la activación de una familia de cisteína-proteasas, conocidas como caspasas.
Las caspasas reconocen como sustrato tres secuencias peptídicas principales (Thornberry et al., J. Biol.. Chem. 272:17907, 1997):(i) Tyr-Val-Ala-Asp (YVAD, caspasa-1, -4), (ii) Asp-Glu-Val-Asp (DEVD, caspasa-2, -3 y -7), y (iii) Ile-(Leu)-Glu-X-Asp (I(L)EXD; caspasa -8 y -10). El reconocimiento de la secuencia en una diana proteínica da como resultado una proteólisis limitada y específica de la diana, tal como activación de la caspasa-7 por la caspasa-3, degradación de dianas proteínicas estructurales con inclusión de, pero sin carácter limitante, laminas, o activación de enzimas con inclusión, pero sin carácter limitante, de poli(ADP-ribosa)-polimerasa. Se ha comunicado que la caspasa-3 se escinde en sus subunidades catalíticamente activas (de 17 y 13 kDa) siguiendo señales proapoptóticas, que conducen a la apoptosis (Susin et al., J. Exp. Med. 186:25, 1997).
Durante la apoptosis, la activación de las caspasas da como resultado la escisión proteolítica de numerosos sustratos. La poli(ADP-ribosa)-polimerasa (PARP), una enzima nuclear implicada en la reparación del DNA, es un sustrato bien conocido para la escisión de la caspasa-3 durante la apoptosis. Su escisión está considerada como un sello de apoptosis (O'Brien et al., Biotechniques 30:886, 2001).
La matriz extracelular (ECM) afecta al comportamiento de las células normales y tumorales (Radisky et al., Seminars Cancer Biol., 11:87, 2001). Por esta razón, la interacción entre las células tumorales y los componentes de la ECM, cuando las células tumorales se extienden sobre la ECM, activará sucesos de transducción de señales que mimetizan varias características biopatológicas de los tumores in vivo, tales como la modulación de los contactos célula-célula (Weaver et al., J. Cell Biol., 137:231, 1997).
Los oligonucleótidos sintéticos son secuencias polianiónicas que se internalizan en las células (Vlassov et al., Biochim. Biophys. Acta, 11197:95, 1994). Se ha informado de oligonucleótidos sintéticos que se fijan selectivamente a los ácidos nucleicos (Wagner, R., Nature, 372:333, 1994), a proteínas celulares específicas (Bates et al., J. Biol. Chem., 274:26369, 1999) y a proteínas nucleares específicas (Scaggiante et al., Eur. J. Biochem., 252:207, 1998) a fin de inhibir la proliferación de las células del cáncer.
Se han descrito la síntesis y propiedades específicas de oligonucleótidos con un resto colesterilo. La fijación de un resto colesterilo al extremo 3' de oligonucleótidos antisentido mejora sus actividades (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6553, 1989; Boutorin et al., FEBS Letter, 254:129, 1989; Corrias et al., J. Neurooncol. 31:171, 1997; Patente U.S. No. 4.958.013; Patente WO No. 9714440). La fijación de un resto colesterilo al extremo 3' mejora la absorción de moléculas antisentido por las células (Corrias et al., J. Neurooncol. 31:171, 1997), y aumenta la retención vascular antisentido in vivo (Fleser et al., Circulation 92:1296, 1995). Se han descrito cadenas laterales internucleosídicas de colesterilo enlazadas a fósforo por la vía de enlaces fosforamidato como modificación para aumentar la actividad de moléculas antisentido (Patente US No. 4.958.013). Se ha encontrado que homopolímeros de 15 residuos citidina o timidina con un resto colesterilo en el extremo 5' modulaban los niveles citosólicos de Ca^{2+} en células de leucemia pro-mielocítica, mientras que las secuencias heteropolímeras con un resto colesterilo en el extremo 5' de secuencias fosforotioato modificadas con colesterilo eran inactivas (Saxon et al., Antisense Res. Dev. 2:243, 1992). Se ha demostrado que heteropolímeros constituidos por 15 desoxinucleótidos fosforotioato con residuos citosina y adenosina, alternantes, u homopolímeros con 15 residuos citosina o timidina, eran inhibidores potentes del transporte de metotrexato cuando se enlazaba un grupo colesterilo al extremo 5' (Henderon et al., Nucl. Acids Res. 25:3726, 1995). La modificación covalente de un oligonucleótido de homocitidina-fosforotioato de 10 bases con un resto colesterilo en el extremo 5' bloqueaba la formación de sincitios en linfocitos T infectados con HIV-1 o HIV-2 por inhibición de la transcriptasa inversa del HIV (Stein et al., Biochemistry 5:2439, 1991).
La fijación de un resto colesterilo a oligonucleótidos tiene efectos mínimos sobre el crecimiento de las células del cáncer (Henderon et al., Nucl. Acids Res. 25:3726, 1995). No se observaron las características típicas de la muerte celular apoptótica en líneas de células de cáncer tratadas con oligonucleótidos que llevaban colesterilo en el extremo 3' (Corrias et al., J. Neurooncol. 31:171, 1997).
La mayoría de las terapias anti-cáncer, sean dirigidas a inhibición de la proliferación, inducción de la parada del ciclo celular, inducción de apoptosis, estimulación del sistema inmunitario o modulación de la interacción matriz extracelular- célula han demostrado ser poco adecuadas para aplicaciones clínicas. La mayoría de estas terapias son ineficientes o tóxicas, tienen efectos adversos importantes, dan como resultado el desarrollo de resistencia a los fármacos o inmunosensibilización, y son debilitantes para el receptor.
Por esta razón, existe una necesidad continuada de nuevas composiciones y nuevos métodos que induzcan la parada del ciclo celular en las células del cáncer, que induzcan apoptosis en las células del cáncer, y que modulen las interacciones matriz extracelular-célula.
Sumario de la invención
La presente invención satisface esta necesidad por proporcionar una composición, en donde un resto trietilenglicol (TEG)-colesterilo está unido al extremo 3' de las secuencias oligonucleotídicas sintéticas SEQ ID NO:1 (5'OH-GGGTGG-OH3'), SEQ ID NO:2 (5'OH-GGGAGG-OH3'), SEQ ID NO:3 (5'OH-CCACCC-OH3'), o SEQ ID NO:4 (5'OH-GTG-OH3'), dando como resultado las nuevas secuencias oligonucleotídicas sintéticas correspondientes 5'-OH, 3' TEG-colesterilo SEQ ID NO:5 (5'OH-GGGTGG(TEG-colesteril) 3'), SEQ ID NO:6 (5'OH-GGGAGG(TEG-colesteril) 3'), SEQ ID NO:7 (5'OH-CCACCC(TEG-colesteril) 3'), o SEQ ID NO:8 (5'OH-GTG(TEG-colesteril) 3'). La presente invención proporciona también métodos para la utilización de estas nuevas secuencias de oligonucleótidos sintéticos por combinación de las mismas con un portador aceptable para producir una composición, y administración de la composición in vitro o in vivo. La composición se administra a un animal, con inclusión de un humano, a fin de inducir una respuesta en una célula. Respuestas de este tipo incluyen, pero sin carácter limitante, inhibición de la proliferación celular, inducción de la parada del ciclo celular, inducción de apoptosis, activación de caspasas, escisión de poli(ADP-ribosa)-polimerasa, o modulación de las interacciones matriz extracelular-célula, o una combinación de las mismas. Una célula preferida para inducción de la respuesta es una célula de cáncer o una célula sinovial. Cualquier enfermedad o afección caracterizada por proliferación celular no deseada puede tratarse por las composiciones de la presente invención. Dichas enfermedades o afecciones caracterizadas por proliferación celular no deseada incluyen, pero sin carácter limitante, enfermedad autoinmunológica, inflamación, enfermedad linfoproliferativa, artritis y cáncer.
La presente invención proporciona también el uso de estas nuevas secuencias de oligonucleótidos sintéticos en la preparación de un medicamento. Tales medicamentos son útiles para tratar una enfermedad o afección caracterizada por proliferación celular no deseada, con inclusión, pero sin carácter limitante, de enfermedad autoinmunológica, inflamación, enfermedad linfoproliferativa, artritis o cáncer.
Una o más secuencias nuevas de la presente invención pueden combinarse con un portador aceptable y administrarse como una composición in vitro en células o tejidos en cultivo, o in vivo a un animal o humano. Adicionalmente, las composiciones de la presente invención pueden administrarse juntas con uno o más agentes terapéuticos. Dicha administración de las composiciones de la presente invención pueden ocurrir antes, durante o después de la administración de uno o más agentes terapéuticos conocidos por una persona con experiencia ordinaria en las técnicas médicas o veterinarias. Cualquier agente terapéutico conocido por una persona con experiencia ordinaria en las técnicas médicas o veterinarias, y empleado para tratar enfermedades, puede utilizarse en combinación con estas nuevas secuencias. Tales combinaciones pueden permitir el uso de dosis menores de agentes terapéuticos, reduciendo con ello los efectos secundarios no deseados.
La administración de una composición que comprende una cantidad eficaz de una o más de las secuencias de la presente invención a un animal o humano es un tratamiento terapéutico que previene, trata o elimina una enfermedad o afección caracterizada por proliferación celular no deseada. Enfermedades y afecciones de este tipo son conocidas por una persona con experiencia en las técnicas médicas o veterinarias, e incluyen, pero sin carácter limitante, cáncer, inflamación, artritis, trastornos linfoproliferativos, asma y restenosis de arterias después de angioplastia. Los cánceres incluyen, pero sin carácter limitante, carcinoma de células escamosas, fibrosarcoma, carcinoma sarcoideo, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer renal, osteosarcoma, melanoma cutáneo, carcinoma de células basales, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, leucemia, linfoma, y metástasis derivadas de los mismos.
Los métodos y rutas de administración de agentes terapéuticos a animales y humanos son conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica y pueden emplearse para administrar composiciones que comprenden las secuencias de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
La capacidad inesperada y sorprendente de la fijación covalente de un resto colesteril-TEG-fosforamidito al oxígeno 3' de oligonucleótidos 3'-OH funcionalmente inertes para inhibir la proliferación de las células del cáncer y las células sinoviales, para inducir la apoptosis en células de cáncer y células sinoviales, para modular las interacciones matriz extracelular-célula en las células del cáncer, y para modificar la progresión del ciclo celular de las células del cáncer aborda necesidades sentidas desde hace mucho tiempo y no satisfechas en las técnicas médicas y proporciona un beneficio importante para los animales, con inclusión de los humanos.
De acuerdo con ello, es un objeto de la presente invención proporcionar una nueva composición que comprende una secuencia sintética 5'-OH, 3'-TEG-colesterilo.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición y un método eficaces para tratar una enfermedad en un animal, con inclusión de un humano.
Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición y un método eficaces para tratar una enfermedad o una afección caracterizada por proliferación celular no deseada.
Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición y un método eficaces para tratar el cáncer.
Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición y un método eficaces para tratar la artritis.
Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce una respuesta en las células que incluye, pero sin carácter limitante, inhibición de la proliferación celular, inducción de la parada del ciclo celular, inducción de la activación de caspasas, escisión de la poli(ADP-ribosa)-polimerasa, inducción de apoptosis o modulación de las interacciones matriz extracelular-célula, o combinaciones de las mismas.
Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce una respuesta, con inclusión pero sin carácter limitante de la inhibición de la proliferación celular, inducción de la parada de ciclo celular, inducción de la activación de caspasas, escisión de la poli(ADP-ribosa)-polimerasa, inducción de apoptosis o modulación de las interacciones matriz extracelular-célula, o combinaciones de las mismas, en células de cáncer o sinoviales, con inclusión de células de cáncer o sinoviales resistentes a fármacos.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en células independientes de BCR-ABL (una fusión del gen BCR en el cromosoma 22 y el gen ABL en el cromosoma 9).
Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en células independientes de la mutación de p53.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que es sencilla de preparar.
Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición que es mínimamente tóxica para el receptor.
Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar el uso de estas nuevas secuencias de oligonucleótidos sintéticos en la preparación de un medicamento, siendo el medicamento útil para tratar una enfermedad o afección caracterizada por proliferación celular no deseada.
Estos y otros objetos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes después de una revisión de la descripción detallada siguiente de la realización no limitante descrita y las reivindicaciones del apéndice.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Fotografías del crecimiento de células MCF-7, MDA-MB-231 (MDA-231), Hs578T y Mpanc-96 sobre MATRIGEL® después de pre-incubación con medio de cultivo regular (RCM) solo, o con adición de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:5.
Figura 2. Fotografías del crecimiento de células de cáncer de mama humanas sobre MATRIGEL® después de pre-incubación con medio de cultivo regular (RCM) solo, con adición de SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:8.
Figura 3. Fotografías de células MCF-7 que se dejaron crecer sobre pocillos recubiertos con MATRIGEL® durante 48 horas. A continuación, las estructuras celulares tridimensionales resultantes se expusieron a medio de cultivo regular (RCM) solo, o con adición de colesteril-TEG-fosforamidito, a SEQ ID NO:3 o a SEQ ID NO:7.
Figura 4. Fotografías de células MDA-231 que se dejaron crecer sobre pocillos recubiertos con MATRIGEL® durante 48 horas. A continuación, las estructuras celulares tridimensionales resultantes se expusieron a medio de cultivo regular (RCM) solo, con adición de colesteril-TEG-fosforamidito, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:7.
Figura 5. Fotografías de células Hs578T que se dejaron crecer como esferoides y se expusieron durante 3 días a medio de cultivo regular (RCM) con o sin adición de colesteril-TEG-fosforamidito (chol-TEG), SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, o a los controles correspondientes (RCM más agua (RCMW)) y RCM más acetonitrilo (RCMA).
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona nuevas composiciones que comprenden secuencias sintéticas 5'-OH, 3'-TEG-colesterilo, en donde la secuencia es SEQ ID NO:5 (5'OH-GGGTGG(TEG-colesteril) 3'), SEQ ID NO:6 (5'OH-GGGAGG(TEG-colesteril) 3'), SEQ ID NO:7 (5'OH-CCACCC(TEG-colesteril) 3') o SEQ ID NO:8 (5'OH-GTG(TEG-colesteril) 3').
La presente invención proporciona también métodos para utilizar estas nuevas composiciones. Las composiciones de la presente invención son útiles para inducir una respuesta en una célula cuando se administran a animales o humanos, en una cantidad eficaz para inducir una respuesta en la célula. Estas respuestas incluyen, pero sin carácter limitante, inhibición de la proliferación celular, parada del ciclo celular, inducción de apoptosis, activación de caspasa, escisión de poli(ADP-ribosa)-polimerasa en la célula, o modulación de las interacciones matriz extracelular-célula, o una combinación de las mismas. El animal o humano puede padecer cáncer o artritis. Las células pueden ser células de cáncer. Las células pueden ser células sinoviales.
Las composiciones de la presente invención pueden utilizarse para tratar enfermedades o afecciones caracterizadas por proliferación celular no deseada. En una realización, se administra una composición de la presente invención a un animal o humano que padece cáncer en una cantidad eficaz para tratar el cáncer en el animal o el humano.
La composición de la presente invención puede administrarse a un animal o humano que padece artritis en una cantidad eficaz para tratar la artritis en el animal o el humano.
La capacidad inesperada y sorprendente de los oligonucleótidos 3'-TEG-colesterilo para inhibir la proliferación, inducir la parada del ciclo celular, inducir apoptosis, activar caspasas, o modular las interacciones matriz extracelular-célula en las células, o inducir una combinación de estas respuestas en las células satisface una necesidad sentida desde hace mucho tiempo en las técnicas médicas y proporciona un beneficio importante para animales y humanos.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "secuencia" hace referencia a un oligonucleótido sintético 3'-OH, 5'-OH que comprende SEQ ID NO:1 (5'OH-GGGTGG-OH3'), SEQ ID NO:2 (5'OH-GGGAGG-OH3'), SEQ ID NO:3 (5'OH-CCACCC-OH3'), o SEQ ID NO:4 (5'OH-GTG-OH3'), o a un oligonucleótido sintético 5'-OH, 3' TEG-colesterilo que comprende SEQ ID NO:5 (5'OH-GGGTGG(TEG-colesteril) 3'), SEQ ID NO:6 (5'OH-GGGAGG(TEG-colesteril) 3'), SEQ ID NO:7 (5'OH-CCACCC(TEG-colesteril) 3'), o SEQ ID NO:8 (5'OH-GTG(TEG-colesteril) 3').
Tal como se utilizan en esta memoria, los términos "oligonucleótido 3'-TEG-colesterilo", y "oligonucleótido sintético 3'-TEG-colesterilo" hacen referencia a un oligonucleótido modificado con 3'-trietilenglicol-colesterilo, un oligonucleótido 5'-OH con un resto TEG-colesterilo unido en el extremo 3'. Para fines ilustrativos, se muestra a continuación la estructura química de SEQ ID NO:7, un ejemplo de un oligonucleótido sintético 5'-OH, 3'-TEG-colesterilo.
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Tal como se utiliza en esta memoria, el término "respuesta" hace referencia a la inducción de una respuesta, con inclusión pero sin carácter limitante de inhibición de la proliferación celular, inducción de la parada del ciclo celular, activación de caspasas, escisión de poli(ADP-ribosa)-polimerasa, inducción de apoptosis en células o modulación de las interacciones matriz extracelular-célula, o una combinación de las mismas.
Tal como se utiliza en esta memoria, la frase "eficaz en células sensibles" hace referencia a la capacidad de una secuencia para inducir una respuesta, con inclusión pero sin carácter limitante de la capacidad de la secuencia para inhibir la proliferación celular, inducir la parada del ciclo celular, inducir activación de caspasas, inducir escisión de poli(ADP-ribosa)-polimerasa, inducir apoptosis en células o modular las interacciones matriz extracelular-célula, o una combinación de las mismas.
Tal como se utilizan en esta memoria, las expresiones "tratamiento terapéutico", "cantidad eficaz" y "cantidad eficaz para" hacen referencia a una cantidad de una secuencia eficaz para inducir una respuesta, con inclusión pero sin carácter limitante de la inhibición de la proliferación celular, parada del ciclo celular, activación de caspasas, escisión de poli(ADP-ribosa)-polimerasa, inducción de apoptosis en células, modulación de las interacciones matriz extracelular-célula, o una combinación de las mismas.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "enfermedad" hace referencia a una afección en la cual la salud del cuerpo está deteriorada.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "agente terapéutico" es cualquier agente, con inclusión de radiación, aprobado por una agencia reguladora de un país o un gobierno de estado enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso con objeto de tratar una enfermedad en un animal, con inclusión de un humano.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "quimioterapéutico" es cualquier agente aprobado por una agencia reguladora de un gobierno de un país o un estado, o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para tratar una enfermedad en un animal, con inclusión de un humano.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "anti-artrítico" es cualquier agente aprobado por una agencia reguladora de un país o un gobierno de estado o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea reconocida generalmente para uso en el tratamiento de la artritis en un animal, con inclusión de un humano.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "antineoplástico" hace referencia a la prevención del desarrollo, la progresión, la proliferación o la propagación de las células de cáncer.
La administración de una cantidad eficaz de una composición de la presente invención a un animal, o un humano, es un tratamiento terapéutico que induce una respuesta, previene, trata, o elimina una enfermedad, o una combinación de dichos efectos. La respuesta incluye, pero sin carácter limitante, inhibición de la proliferación celular, parada del ciclo celular, activación de caspasas, escisión de poli(ADP-ribosa)- polimerasa, inducción de apoptosis en las células, modulación de las interacciones matriz extracelular-célula, o una combinación de las mismas. La enfermedad incluye, pero sin carácter limitante, cáncer, artritis, trastornos linfoproliferativos e inflamación. Los cánceres incluyen, pero sin carácter limitante, carcinoma de células escamosas, fibrosarcoma, hemangiosarcoma, linfangiosarcoma, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, carcinoma sarcoideo, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorectal, cáncer renal, osteosarcoma, melanoma cutáneo, carcinoma de células basales, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, leucemia, linfoma, mieloma y metástasis derivadas de ellos. Formas de artritis incluyen, pero sin carácter limitante, artritis juvenil, osteoartritis y artritis reumatoide.
La eficacia terapéutica de una secuencia puede incrementarse por métodos que incluyen, pero sin carácter limitante, modificación química de la cadena principal de base, azúcar, o fosfato, suplemento químico o amplificación biotecnológica de las secuencias utilizando plásmidos bacterianos que contienen las secuencias apropiadas, complejación de las secuencias a portadores biológicos o químicos, o acoplamiento de las secuencias a ligandos o anticuerpos dirigidos a un tipo de tejido o un tipo de célula.
Las composiciones que comprenden una o más secuencias y un portador farmacéuticamente aceptable se preparan poniendo en asociación uniforme e íntimamente la secuencia y el portador farmacéuticamente aceptable. Las expresiones "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador farmacéuticamente aceptable" se utilizan en esta memoria para significar, sin limitación, cualquier líquido, sólido o semisólido, con inclusión, pero sin carácter limitante, de agua o solución salina, un gel, crema, pomada, disolvente, diluyente, base líquida de ungüento, ungüento, pasta, implante, liposoma, micela, micela gigante, y análogos, que es adecuado para uso en contacto con un tejido vivo animal o humano sin causar respuestas fisiológicas adversas, y que no interacciona con los otros componentes de la composición de una manera desfavorable. Otros portadores o vehículos farmacéuticamente aceptables conocidos por una persona con experiencia en la técnica pueden emplearse para fabricar las composiciones para suministrar las secuencias de oligonucleótidos de la presente invención. Los portadores líquidos son portadores acuosos, portadores no acuosos o ambos e incluyen, pero sin carácter limitante, suspensiones acuosas, dimetil-sulfóxido, etanol, emulsiones de aceite, emulsiones de agua-en-aceite, emulsiones de agua-en-aceite-en-agua, emulsiones orientadas, emulsiones de residencia larga, emulsiones pegajosas, microemulsiones y nanoemulsiones. Los portadores sólidos son portadores biológicos, portadores químicos o ambos e incluyen, pero sin carácter limitante, sistemas de vectores víricos, partículas, micropartículas, nanopartículas, microesferas, nanoesferas, minibombas, extractos de pared de células bacterianas y polímeros naturales o sintéticos biodegradables o no biodegradables que permiten la liberación sostenida de las secuencias. Las emulsiones, minibombas y polímeros pueden implantarse en la proximidad o donde se requiere el suministro. Métodos utilizados para complejar una o más secuencias a un portador sólido incluyen, pero sin carácter limitante, adsorción directa a la superficie del portador sólido, acoplamiento covalente a la superficie del portador sólido, sea directamente o por la vía de un resto enlazador, y acoplamiento covalente o acoplamiento electrostático al polímero utilizado para producir el portador sólido. Opcionalmente, una o más secuencias pueden estabilizarse por la adición de polímeros no iónicos o iónicos tales como monooleatos de polioxietilensorbitán (Tweens), ácido hialurónico o hidróxido de aluminio. Pueden emplearse otros portadores conocidos por las personas con experiencia ordinaria en la técnica.
Portadores acuosos preferidos incluyen, pero sin carácter limitante, agua, solución salina, y tampones farmacéuticamente aceptables. Portadores no acuosos preferidos incluyen, pero sin carácter limitante, un aceite mineral o un aceite neutro con inclusión, pero sin carácter limitante, de un diglicérido, un triglicérido, un fosfolípido, un lípido, un aceite y mezclas de los mismos, en donde el aceite contiene una mezcla apropiada de ácidos grasos poliinsaturados y saturados. Ejemplos incluyen, pero sin carácter limitante, aceite de soja, aceite de canola, aceite de palma, aceite de oliva y migliol, en donde los ácidos grasos pueden ser saturados o insaturados. Opcionalmente, pueden incluirse excipientes con indiferencia del portador farmacéuticamente aceptable utilizado para presentar la secuencia a las células sensibles. Estos excipientes incluyen, pero sin carácter limitante, antioxidantes, tampones, y bacteriostáticos, y pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes.
Las secuencias de la presente invención pueden combinarse con portadores farmacéuticamente aceptables y administrarse como composiciones in vitro a células o tejidos en cultivo, o in vivo a animales o humanos. Formas de administración incluyen, pero sin carácter limitante, inyecciones, soluciones, cremas, geles, implantes, bombas, ungüentos, emulsiones, suspensiones, microesferas, partículas, micropartículas, nanopartículas, liposomas, pastas, parches, tabletas, dispositivos de suministro transdérmico, pulverizaciones, aerosoles, y otros medios familiares para una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Tales portadores farmacéuticamente aceptables son conocidos comúnmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden prepararse por procedimientos conocidos en la técnica utilizando ingredientes bien conocidos y fácilmente disponibles. Por ejemplo, los compuestos pueden formularse con excipientes, diluyentes, o portadores comunes, y conformarse en tabletas, cápsulas, suspensiones, polvos, etcétera. Ejemplos de excipientes, diluyentes, y portadores que son adecuados para tales formulaciones incluyen los siguientes: cargas y extendedores (v.g., almidón, azúcares, manitol, y derivados silícicos); agentes ligantes (v.g., carboximetil-celulosa y otros derivados de celulosa, alginatos, gelatina, y polivinilpirrolidona); agentes humectantes (v.g., glicerol); agentes desintegrantes (v.g., carbonato de calcio y bicarbonato de sodio); agentes para retardo de la disolución (v.g., parafina); aceleradores de la resorción (v.g., compuestos de amonio cuaternario); agentes tensioactivos (v.g., alcohol cetílico, monoestearato de glicerol); portadores adsorbentes (v.g., caolín y bentonita); emulsionantes; conservantes; edulcorantes; estabilizadores; agentes colorantes; agentes perfumantes; agentes saborizantes; lubricantes (v.g., talco, estearato de calcio y de magnesio); polietil-glicoles sólidos; y mezclas de los mismos.
Las formulaciones pueden constituirse de tal modo que las mismas liberen el ingrediente activo única o preferiblemente en una localización particular, posiblemente a lo largo de un periodo de tiempo. Tales combinaciones proporcionan sin embargo un mecanismo adicional para controlar la cinética de liberación. Los revestimientos, envolturas, y matrices protectoras pueden fabricarse, por ejemplo, a partir de sustancias polímeras o ceras.
Una o más secuencias pueden administrarse solas, o en combinación con otras modalidades terapéuticas que incluyen, pero sin carácter limitante, agentes quimioterapéuticos, agentes anti-artríticos, agentes inmuno-terapéuticos, agentes antimicrobianos, o agentes antivíricos, o en combinación con terapia de radiación, o cualquier combinación de los mismos. Agentes quimioterapéuticos incluyen, pero sin carácter limitante, anti-metabolitos, agentes deteriorantes del DNA, desestabilizadores de los microtúbulos, estabilizadores de los microtúbulos, despolimerizantes de las actinas, inhibidores del crecimiento, inhibidores de las topoisomerasas, inhibidores de la HMG-CoA (3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A)-reductasa, inhibidores de la síntesis de purinas, inhibidores de la síntesis de pirimidinas, inhibidores de las metaloproteinasas, inhibidores de la CDK (proteína-quinasa dependiente de ciclinas), inhibidores de la angiogénesis, mejoradores de la diferenciación, y agentes inmunoterapéuticos. Los agentes anti-artríticos incluyen, pero sin carácter limitante, agentes anti-inflamatorios, con inclusión de agentes anti-inflamatorios no esteroidales (NSAIDs), analgésicos, modificadores de la respuesta biológica, fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDs), anti-metabólicos, pro-apoptóticos, deteriorantes del DNA, desestabilizadores de los microtúbulos, estabilizadores de los microtúbulos, despolimerizantes de las actinas, inhibidores del crecimiento, inhibidores de las topoisomerasas, inhibidores de la síntesis de purinas, inhibidores de la síntesis de pirimidinas, inhibidores de las metaloproteinasas, inhibidores de la CDK, o inhibidores de la angiogénesis. Los NSAIDs incluyen, pero sin carácter limitante, NSAIDs tradicionales, tales como diclofenaco potásico, diclofenaco sódico, diclofenaco sódico con misoprostol, diflunisal, etodolac, fenoprofeno, flurbiprofeno cálcico, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, meclofenamato, mefenamato de sodio, ácido meloxicámico, nabumetona, naproxeno, naproxeno-sodio, oxaprozina, piroxicam, sulindac, y tolmetina-sodio, inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), tales como celecoxib y rofecoxib, salicilatos, tales como aspirina, salicilato de colina, salicilato de magnesio, salsalato y salicilato de sodio. Los analgésicos incluyen, pero sin carácter limitante, acetaminofeno, acetaminofeno con codeína, hidrocodona con acetaminofeno, oxicodona, hidrocloruro de propoxifeno, y tramadol. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen, pero sin carácter limitante, etanercept e infliximab. Los glucocorticoides incluyen, pero sin carácter limitante, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisolona-fosfato de sodio y prednisona-triamzinolona. los DMARDs incluyen, pero sin carácter limitante, auranofín (oro oral), azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, metotrexato, minociclina, penicilamina, sulfasalazina, aurotioglucosa y oro-tiomalato de sodio.
Las rutas de administración son conocidas por una persona con experiencia en la técnica e incluyen, pero sin carácter limitante, oral (v.g. bucal o sublingual), rectal, como un supositorio o un enema, tópica, parenteral, subcutánea, transdérmica, sub- dérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravesicular, intraarticular, intravenosa, intradérmica, intracraneal, intralesional, intratecal, intratumoral, intraocular, ocular, aerosol, intrapulmonar, intraespinal, intraprostática, sublingual, colocación en el interior de cavidades del cuerpo, inhalación nasal, inhalación pulmonar, impresión en la piel y electroporación, intrauterina, vaginal, en una cavidad del cuerpo, administración quirúrgica en la localización de un tumor o lesión interna, directamente en tumores, en el lumen o parénquima de un órgano, y en la médula ósea. Técnicas útiles en las diversas formas de administraciones arriba mencionadas incluyen, pero sin carácter limitante, aplicación tópica, ingestión, administración quirúrgica, inyecciones, pulverizaciones, dispositivos de suministro transdérmico, bombas osmóticas, electrodeposición directa en un sitio deseado, u otros medios habituales para una persona son experiencia ordinaria en la técnica. Los sitios de aplicación pueden ser externos, tales como en la epidermis, o internos, por ejemplo en la cápsula de una articulación, un tumor, una úlcera gástrica, un campo quirúrgico, o cualquier otro sitio.
Las composiciones de la presente invención pueden aplicarse en la forma de cremas, geles, soluciones, suspensiones, liposomas, partículas, u otros medios conocidos por una persona con experiencia en la técnica de la formulación y el suministro de composiciones. Pueden utilizarse tamaños de partícula ultrafinos para suministro de agentes terapéuticos por inhalación. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para administración subcutánea incluyen, pero sin carácter limitante, implantes, formulaciones de acción prolongada, agujas, cápsulas, y bombas osmóticas. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para administración vaginal incluyen, pero sin carácter limitante, cremas, supositorios, esponjas, geles, espumas, y anillos. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para administración oral incluyen, pero sin carácter limitante: píldoras, cápsulas, líquidos, jarabes, y suspensiones. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para administración transdérmica y transmucosal incluyen, pero sin carácter limitante, cremas, pastas, parches, pulverizaciones, y geles. Algunos ejemplos de mecanismos de suministro apropiado para administración subcutánea incluyen, pero sin carácter limitante, implantes, formulaciones de acción prolongada, agujas, cápsulas, y bombas osmóticas. Formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen, pero sin carácter limitante, soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor propuesto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Soluciones y suspensiones de inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos, gránulos y tabletas estériles utilizados comúnmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica.
Las secuencias de la invención pueden combinarse con uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables para formar una composición. Estas composiciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar por técnicas farmacéuticas convencionales. Dichas técnicas incluyen el paso de poner en asociación las composiciones que contienen el ingrediente activo y el o los portadores o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan poniendo en contacto uniforme e íntimamente del ingrediente activo con portadores líquidos. Formulaciones preferidas de dosificación unitaria son aquéllas que contienen una dosis o unidad del ingrediente administrado, o una fracción apropiada de la misma. Debe entenderse que, además de los ingredientes anteriores mencionados particularmente, las formulaciones que comprenden las composiciones de la presente invención pueden incluir otros agentes utilizados comúnmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica.
El volumen de administración variará dependiendo de la ruta de administración. Dichos volúmenes son conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica de la administración de composiciones a animales o humanos. Dependiendo de la ruta de administración, el volumen por dosis es con preferencia aproximadamente 0,001 a 100 ml, de modo más preferible aproximadamente 0,01 a 50 ml, y de modo muy preferible aproximadamente 0,1 a 30 ml. Con preferencia, la cantidad de secuencia administrada por dosis es de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal, de modo más preferible desde aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg y de modo muy preferible desde aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg. La secuencia, combinación de secuencias, y/o agentes terapéuticos adicionales puede(n) administrarse en un tratamiento monodosis, en tratamientos de dosis múltiples o por infusión continua de acuerdo con un protocolo y a lo largo de un periodo de tiempo apropiado para la enfermedad de que se trate, el estado del receptor y la ruta de administración. Además, la secuencia puede administrarse antes, simultáneamente, o después de la administración del agente terapéutico. La secuencia particular y el agente terapéutico particular administrado, la cantidad por dosis, y la ruta de administración deben ser decididos por el técnico especialista utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica y dependerán de la enfermedad o afección de que se trate, por ejemplo el tipo de cáncer, la gravedad del cáncer, la localización del cáncer y otros factores clínicos tales como el tamaño, peso y condición física del receptor. Adicionalmente, pueden emplearse opcionalmente diversos ensayos in vitro e in vivo para ayudar a identificar los intervalos óptimos para administración de la secuencia y de la secuencia más el agente terapéutico.
Una secuencia en combinación con un agente terapéutico, por ejemplo un agente quimioterapéutico o un agente anti-artrítico, se administra a un animal o humano que padezca cáncer o artritis en una cantidad eficaz para mejorar el efecto anti- neoplástico de un agente quimioterapéutico o el efecto anti-artrítico de un agente anti- artrítico. Con preferencia, la cantidad de agente terapéutico administrada por dosis es de aproximadamente 0,001 a 1000 mg/m^{2} de superficie corporal o de aproximadamente 0,01 a 1000 mg/kg de peso corporal, de modo más preferible desde aproximadamente 0,01 a 500 mg/m^{2} o desde aproximadamente 0,01 a 500 mg/kg y de modo muy preferible desde aproximadamente 0,1 a 100 mg/m^{2} o aproximadamente 0,1 a 100 mg/kg. La secuencia particular y el agente terapéutico particular administrado, la cantidad por dosis, el protocolo de dosificación y la ruta de administración deberían ser decididos por el técnico especialista utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica y dependerán del tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad, la localización de la enfermedad y otros factores clínicos tales como el tamaño, peso y estado físico del receptor. Adicionalmente, pueden emplearse de manera opcional diversos ensayos in vitro e in vivo para ayudar a identificar los intervalos óptimos para la administración de la secuencia y de la secuencia más el agente terapéutico. Diversos ensayos útiles para este propósito se describen en el documento PCT CA00/01467 (WO 01/44465). Ensayos adicionales para la evaluación de la eficiencia de las secuencias de la presente invención, y para evaluación de la eficacia de estas secuencias en combinación con otros agentes terapéuticos han sido descritos por Oncogene Research Products, P.O. Box 12087, La Jolla, California, 92039 (Apoptosis Catalog and Technical Guide 2002-2003, especialmente las páginas 5-295). Dichos ensayos incluyen ensayos designados para analizar fragmentación del DNA, apoptosis, marcadores mitocondriales, marcadores del retículo endoplásmico, nucleosomas libres, proteínas de la matriz nuclear, detección y actividad de numerosas caspasas y proteínas afines, que incluyen pero sin carácter limitante las caspasas 1 a 14, glutatión, superóxido- dismutasa, miembros de la familia bcl-2, análisis de la superfamilia Fas/TNR-R, productos relacionados con PARP, análisis de transductores de señales apoptóticas, análisis de diversos receptores de señalización con inclusión de receptores de muerte, Apo2, receptores de reclamo, análisis de proteínas apoptóticas de membrana, marcadores apoptóticos del sistema nervioso, numerosos marcadores para el ciclo celular y la proliferación celular, quinasas mitóticas, ensayos de bromodesoxiuridina, y ensayos de p53. La eficacia de las secuencias de la presente invención puede evaluarse también en términos de otros agentes, con inclusión de agentes terapéuticos que incluyen, pero sin carácter limitante, agentes anti-artríticos, o inductores de la apoptosis y reactivos de sincronización celular como han sido descritos por Oncogene Research Products, P.O. Box 12087, La Jolla, California, 92039 (Apoptosis Catalog and Technical Guide 2002-2003, especialmente las páginas 99-104 y las páginas 214-255). Tales agentes incluyen, pero sin carácter limitante, actinomicina D, anfidocolina, A23187, cafeína, camptotecina, cicloheximida, dexametasona, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, hidroxiurea, paclitaxel, estaurosporina, timidina, vinblastina, ácido retinoico, etoposido, ácido okadaico, vincristina, y metotrexato.
Diversos ensayos y modelos in vitro e in vivo conocidos por un experto en la técnica pueden emplearse para evaluación de la eficacia y los intervalos óptimos de dosis de las secuencias, solas o en combinación con uno o más agentes terapéuticos, para el tratamiento de la artritis. Modelos animales incluyen, pero sin carácter limitante, modelos de enfermedad adyuvantes, modelos aceitosos inducidos por adyuvantes, microorganismos y modelos inducidos por componentes de su pared celular, modelos inducidos por componentes de cartílago, modelos transgénicos y de genes desactivados ("knockout"), modelos de osteoartritis no inmunológicos, y modelos de síndromes parciales, como se describen en Waxman, B.H., Scand. J. Immunol., 56:12, 2002. Modelos animales incluyen, pero sin carácter limitante, ratas, ratones, primates, cobayos, y conejos.
Para determinar una etapa de ciclo celular, pueden emplearse diversos ensayos y procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Un procedimiento de este tipo utiliza un kit comercial CYCLETEST^{TM} PLUS DNA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Resumidamente, se obtienen núcleos de células por disolución de la membrana celular en un detergente no iónico, eliminación del citoesqueleto de la célula y de las proteínas nucleares con tripsina, digestión del RNA celular con RNasa, y estabilización de la cromatina nuclear con espermina. Se añade yoduro de propidio a los núcleos celulares y se analiza su fluorescencia en un citómetro de flujo equipado con capacidad de discriminación de dobletes electrónicos (FACSCalibur, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). La acumulación de células en las fases G_{0}/G_{1}, S precoz (SE), S intermedia (SM), S tardía (SL) o G_{2}/M del ciclo celular puede analizarse utilizando portador lógico MODFIT LT (Verity Software House Inc., Topsham, MA), u otro portador lógico apropiado.
Pueden utilizarse diversos ensayos in vitro e in vivo para evaluar la influencia del microentorno extracelular sobre el comportamiento de las células normales y las células tumorales. Tales ensayos pueden emplear MATRIGEL® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), que es una preparación membranal de base solubilizada extraída del sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm.
Los esferoides multicelulares (MS) son un ejemplo de un ensayo especial in vitro, en cual se cultivan células tumorales de una manera tridimensional para formar una estructura "semejante a un tumor". En este sistema, existe un reforzamiento de las interacciones célula-célula que mimetizan las condiciones microambientales de las células malignas en los tumores sólidos in vivo. En este tipo de ensayo, no se añade componente de matriz extracelular alguno. Las células cultivadas en este sistema MS difieren de las cultivadas en los sistemas bidimensionales (condiciones de cultivo monocapa). Algunas de estas diferencias están relacionadas con la diferenciación estructural y funcional de las células tumorales, cambios en el ciclo celular de las células tumorales, "resistencia multicelular a fármacos", y cambios en la difusión y penetración de fármacos a través de capas de células tumorales (revisado en Green et al., Anticancer Drug Des. 14:153, 1999).
Los ejemplos siguientes servirán para ilustrar adicionalmente la presente invención, sin constituir al mismo tiempo, no obstante, limitación alguna de la misma. Por el contrario, debe entenderse claramente que puede recurrirse a diversas otras realizaciones, modificaciones, y equivalentes de la misma que, después de leer la descripción de esta memoria, pueden ser sugeridas por sí mismas a los expertos en la técnica sin apartarse del espíritu de la invención.
Ejemplo 1
Preparación de secuencias de nucleótidos
Se prepararon secuencias de nucleótidos sintéticos de fosfodiéster y secuencias de nucleótidos sintéticos de 3'-TEG-colesterilo conjugadas por Sigma-Genosys (Woodlands, TX, EE.UU.) utilizando Tecnología de Síntesis Abacus Segmented. Las secuencias que terminaban en sus extremos 3' con TEG-colesterilo se sintetizaron sobre un portador TEG CPG (Glen Research, Sterling, VA, EE.UU.). Las secuencias se dispersaron en agua o en dimetil-sulfóxido (DMSO) inmediatamente antes de su utilización.
Ejemplo 2
Células
Todas las líneas de células se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) y se cultivaron en el medio recomendado por la ATCC. Las líneas de células de cáncer de mama se cultivaron en medio recomendado por la ATCC o descrito en artículos publicados (Herrera-Gayol y Jothy, Int, J. Exp. Path., 82:193, 2001). La Tabla 1 muestra las líneas de células, su origen y sus características biopatológicas como se describen en la bibliografía (Hackett et al., Cancer Inst., 58:1795, 1977; Price et al., Cancer Res., 50:717, 1990; Thompson et al., J. Cell Physiol., 150:534, 1992; y Peiper M et al., Int. J. Cancer 71:993, 1997).
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TABLA 1 Líneas de células
Línea de células Descripción
MEG-01* Línea de células de leucemia mielógena crónica humana
EL-4* Línea de células de linfoma T murino
HIG-82** Línea de células sinoviales de conejo
MCF-7** \begin{minipage}[t]{120mm} Adenocarcinoma de mama humano (efusión pleural). Bien diferenciado. No invasivo in vitro e in vivo. No metastásico in vivo. Negativo a la caspasa-3.\end{minipage}
MDA-MB-231** \begin{minipage}[t]{120mm} Adenocarcinoma de mama humano (efusión pleural). Escasamente diferenciado. Invasivo in vitro e in vivo. Metastásico. Mutado en p53.\end{minipage}
Hs578T** \begin{minipage}[t]{120mm} Carcinosarcoma humano de mama (tumor primario). Escasamente diferenciado. Invasivo in vitro e in vivo. Metastásico. Mutado en p53.\end{minipage}
Mpanc-96** \begin{minipage}[t]{120mm} Adenocarcinoma humano de páncreas (tumor primario). Adenocarcinoma moderadamente diferenciado. No invasivo in vivo.\end{minipage}
* Células no adherentes.
** Células adherentes. 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Inducción de apoptosis en células MEG-01 por SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6.
La redistribución de la fosfatidilserina de la membrana plasmática es una característica de las células que sufren apoptosis (Martin et al., J. Exp. Med., 182:1545, 1995). La redistribución de la fosfatidil-serina en la membrana plasmática durante la apoptosis se midió por citometría de flujo utilizando anexina V conjugada con FITC (fluoresceína-isotiocianato) (BD Pharmingen, San Diego, CA). Las células MEG-01, una línea de células de leucemia mielógena crónica humana positiva para el cromosoma de Philadelphia y que tiene una fusión de genes BCR-ABL, se incubaron a 2,5 x 10^{5} células/ml durante 48 horas con concentraciones finales 5,3, 26,5 y 53,0 \muM de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 y molécula de colesteril-TEG-fosforamidito. El porcentaje de células en apoptosis después de exposición al tratamiento con SEQ ID NÚMs:1, 2, 5, 6 ó colesteril-PEG-fosforamidito se consigna en la Tabla 2. El porcentaje de apoptosis en las células MEG-01 sin tratar era 12%.
TABLA 2 Porcentaje de células positivas para fosfatidil-serina (células en apoptosis) en células MEG-01
Composición Concentración (\muM)
5,3 26,5 53,0
SEQ ID NO:1 12 12 12
SEQ ID NO:5 12 27 42
SEQ ID NO:2 12 12 12
SEQ ID NO:6 13 22 39
Colesteril-TEG-fosforamidito 12 12 12
Como se muestra en la Tabla 2, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y colesteril-TEG-fosforamidito son inactivos contra MEG-01. Inesperadamente, la adición de un colesteril-TEG-fosforamidito en el extremo 3' de SEQ ID NO:1, que da como resultado SEQ ID NO:5, y en el extremo 3' de SEQ ID NO:2, que daba como resultado SEQ ID NO:6, conferían a estos oligonucleótidos inertes la capacidad de inducir apoptosis en células MEG-01 tal como se mide por la translocación de la fosfatidil-serina en la superficie celular.
Ejemplo 4
Inducción de apoptosis en células EL-4 por SEQ ID NO:7
Se incubaron células EL-4, una línea de células de linfoma T murino, a 2,5 x 10^{5} células/ml durante 24 horas con concentraciones 0,53, 5,3 y 53,0 \muM de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, o colesteril-TEG-fosforamidito. El porcentaje de células en apoptosis después de exposición a tratamiento con SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7 o colesteril-TEG-fosforamidito se consigna en la Tabla 3. El porcentaje de apoptosis en las células EL-4 sin tratar era 7%.
TABLA 4 Porcentaje de células positivas para fosfatidilserina (células en apoptosis) en células EL-4
Composición Concentración (\muM)
0,53 5,3 53,0
SEQ ID NO:3 7 7 7
SEQ ID NO:7 8 11 49
TEG-colesteril-fosforamidito 7 7 7
Como se muestra en la Tabla 3, ni SEQ ID NO:3 ni colesteril-TEG-fosforamidito causaban apoptosis en las células EL-4. Inesperadamente, la adición de un colesteril-TEG-fosforamidito en el extremo 3' de SEQ ID NO:3, que daba como resultado SEQ ID NO:7, confería a este oligonucleótido inerte la capacidad para inducir apoptosis en las células EL-4 tal como se mide por la translocación de fosfatidil-serina en la superficie celular.
Ejemplo 5
Activación de la caspasa 3 por SEQ ID NO:7
Se incubaron células EL-4 (2,5 x 10^{5} células/ml) durante 72 horas con 0 \muM (control), 53 \muM de SEQ ID NO:3 o 53 \muM de SEQ ID NO:7. Después de la incubación, se lavaron tanto las células de control como las células tratadas, se fijaron, se permeabilizaron y se incubaron con un anticuerpo conjugado con ficoeritrina (PE) que reconoce la unidad catalítica activa de la caspasa 3 (clon: C92-605; BD Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.) utilizando las condiciones recomendadas por el fabricante. La fluorescencia asociada con la caspasa 3 activa se analizó por citometría de flujo en un equipo FACSCALIBUR utilizando el programa CellQUEST (ambos de Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). El porcentaje de células que contenían caspasa 3 activa en las células EL-4 tratadas con 53 \muM de las secuencias se consigna en la Tabla 4.
TABLA 4 Porcentaje de células que contenían caspasa 3 activa en células EL-4
Tratamiento Porcentaje de células que contenían caspasa-3 activada
Células EL-4 sin tratar 3
Células EL-4 + 53 \muM de SEQ ID NO:3 4
Células EL-4 + 53 \muM de SEQ ID NO:7 38
Como se muestra en la Tabla 4, SEQ ID NO:3 era inactiva contra EL-4. Inesperadamente, la adición de un colesteril-TEG-fosforamidito en el extremo 3' de SEQ ID NO:3, que daba como resultado SEQ ID NO:7, confería a este oligonucleótido inerte la capacidad de inducir apoptosis como se mide por la activación de la caspasa-3.
Ejemplo 6
Escisión de poli(ADP-ribosa)polimerasa por SEQ ID NO:7
Se incubaron células EL-4 (2,5 x 10^{5} células/ml) durante 72 horas con 0 \muM (control), 53 \muM de SEQ ID NO:3 o 53 \muM de SEQ ID NO:7. Después de la incubación, tanto las células de control como las células tratadas se lavaron, fijaron, permeabilizaron e incubaron con un anticuerpo conjugado a FITC que reconoce específicamente los fragmentos de 85 kDa de la PARP escindida (BioSource, Camarillo, CA EE.UU.) utilizando las condiciones recomendadas por el fabricante. La fluorescencia asociada con la PARP escindida se analizó por citometría de flujo en un FACSCalibur utilizando el programa CellQUEST (ambos de Becton Dickinson). El porcentaje de células que contenían PARP escindida en las células EL-4 tratadas con concentración final 53 \muM de las secuencias se muestra en la Tabla 5.
TABLA 5 Porcentaje de células que contenían PARP escindida en células EL-4
Tratamiento Porcentaje de células que contenían PARP escindida
Células EL-4 sin tratar 1
Células EL-4 + 53 \muM de SEQ ID NO:3 1
Células EL-4 + 53 \muM de SEQ ID NO:7 84
Como se muestra en la Tabla 5, SEQ ID NO:3 era inactiva contra EL-4. Inesperadamente, la adición de un colesteril-TEG-fosforamidito en el extremo 3' de SEQ ID NO:3, que daba como resultado SEQ ID NO:7, confería a este oligonucleótido inerte la capacidad de inducir apoptosis tal como se mide por la escisión de PARP.
Ejemplo 7
Efecto de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, y SEQ ID NO:8 sobre la proliferación de células sinoviales
Se incubaron células HIG-82 adherentes, una línea de células sinoviales, a 1,0 x 10^{5} células/ml durante 48 horas con 53 \muM (concentración final) de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:8. La proliferación celular se midió utilizando reducción con dimetiltiazol-difenil-tetrazolio (MTT) (Mosman et al., J. Immunol. Methods 65:55, 1983). Se midió MTT a una longitud de onda de 570 nm utilizando un lector espectrofotométrico múltiple (ELX800, Bio-TEK, Instruments Inc., Winooski, VT). El porcentaje de inhibición, calculado como
\frac{\text{absorbancia del control - absorbancia del tratamiento}}{\text{ absorbancia del control}} x 100%,
de la proliferación de las células HIG-82 se muestra en la Tabla 6.
TABLA 6 Inhibición de la proliferación de las células HIG-82 (%)
Tratamiento (53 \muM) Inhibición (%)
SEQ ID NO:2 6%
SEQ ID NO:6 75%
SEQ ID NO:3 0%
SEQ ID NO:7 53%
SEQ ID NO:4 -7%
SEQ ID NO:8 64%
Como se muestra en la Tabla 6, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, y SEQ ID NO:4 no inhibían la proliferación de las células sinoviales HIG-82. Inesperadamente, la adición de un colesteril-TEG-fosforamidito en los extremos 3' de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, que daba como resultado SEQ ID NÚMs:6, 7 y 8, respectivamente, confería la capacidad para inhibir la proliferación celular de las células HIG- 82.
Ejemplo 8
Inducción de apoptosis en células sinoviales proliferantes por SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6
Se incubaron células HIG-82 adherentes a 1,0 x 10^{5} células/ml durante 48 horas con concentración final 53 \muM de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6. Dado que la detección de la apoptosis por fosfatidilserina/anexina V no era fiable después de las técnicas de recogida de las células adherentes, tales como tripsinización (Van Engeland, Cytometry, 31:1, 1998), se evaluó la apoptosis en las células HIG-82 utilizando citometría de flujo por la detección del DNA fragmentado por marcación en los extremos de la mella terminal de bromodesoxiuridina-trifosfato-biotina mediada por la enzima desoxinucleotidil-transferasa terminal (TUNEL) utilizando un ensayo comercial (kit APO-BRDU™, BD Pharmingen). Se determinó el porcentaje de células que contenían fragmentación de DNA nuclear. Después de 24 horas, las células HIG-82 sin tratar eran esencialmente negativas para la fragmentación del DNA nuclear.
TABLA 7 Porcentaje de células que contienen fragmentación de DNA (células en apoptosis) en células HIG-82
Tratamiento (53 \muM) Porcentaje de células que contienen fragmentación de DNA
SEQ ID NO:1 1
SEQ ID NO:5 17
SEQ ID NO:2 1
SEQ ID NO:6 18
Como se muestra en la Tabla 7, SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 eran inactivas contra las células sinoviales que crecían exponencialmente. Inesperadamente, la adición de un colesteril-TEG-fosforamidito en el extremo 3' de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, que daba como resultado SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6, respectivamente, confería la capacidad para inducir apoptosis en células HIG-82 como se mide por el porcentaje de células que exhibían DNA nuclear fragmentado.
Ejemplo 9
Inducción de la parada del ciclo celular por SEQ ID NO:6
Se incubaron células MEG-01 en crecimiento exponencial (2 x 10^{5} células/ml) durante 24 horas con 0 \muM (control), 53 \muM de SEQ ID NO:2 o 53 \muM de SEQ ID NO:6. Las células se recogieron, se centrifugaron, y se determinó la etapa del ciclo celular.
TABLA 8 Inducción de la parada del ciclo celular en células de leucemia MEG-01 por SEQ ID NO:6
Tratamiento (53 \muM) % de células en la fase
G_{0}/G_{1}+SE SM SL+G_{2}/M
Células sin tratar 71,4 10,8 17,8
SEQ ID NO:2 68,6 11,6 19,8
SEQ ID NO:6 51,6 6,5 41,9
Como se muestra en la Tabla 8, SEQ ID NO:2 era inactiva contra MEG-01 cuando se comparó con células de control sin tratar. Inesperadamente, la adición de un colesteril-TEG-fosforamidito en el extremo 3' de SEQ ID NO:2, que daba como resultado SEQ ID NO:6, confería la capacidad para inducir la parada del ciclo celular en la fase SL + G_{2}/M en células MEG-01.
Ejemplo 10
Efecto de SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:7 sobre la proliferación celular de células de cáncer de mama humano
Se extendieron 2 x 10^{3} células MDA-MB-231 (MDA-231) o Hs578T en pocillos individuales de placas de 24 pocillos en medio de cultivo regular (RCM) en presencia o ausencia (control) de 53 \muM (concentración final) de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, 53 \muM colesteril-TEG-fosforamidito, o medios de control correspondientes (medio de cultivo regular (RCM) para SEQ ID NO:3, RCM con la misma cantidad de agua que la cantidad añadida con SEQ ID NO:7, y RCM con la misma cantidad de acetonitrilo que la cantidad añadida con colesteril-TEG-fosforamidito). Las células se cultivaron durante 72 horas, se separaron con tripsina y se contaron con un hemocitómetro utilizando la técnica de exclusión de azul Tripán. Los resultados de tres ensayos independientes (desviación media y desviación estándar (s.d.) del porcentaje de cambios en comparación con los controles) se muestran en la Tabla 9.
TABLA 9 Porcentaje de cambios en la proliferación celular* de las células de cáncer de mama humano MDA-231 y Hs578T cultivadas durante 3 días
SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:7 Colesteril-TEG-fosforamidito Valor P**
MDA-231 +6,9 \pm5 -97,9\pm2,5 -2,3 \pm15,9 < 0,01
Hs578T -6,5 \pm5 -91,8\pm10,5 +13 \pm9,2 < 0,01
* \begin{minipage}[t]{150mm} Los cambios "positivo +" representan estimulación de la proliferación, y los cambios "negativo -" representan inhibición de la proliferación calculada como\end{minipage}
\frac{\text{absorbancia del control - absorbancia del tratamiento}}{\text{absorbancia del control}} x 100%
** \begin{minipage}[t]{150mm} Valor p obtenido por ensayo de comparación múltiple de Dunnett después de Análisis de Medida Repetida de la varianza (RM ANOVA).\end{minipage}
Como se muestra en la Tabla 9, SEQ ID NO:3 y colesteril-TEG-fosforamidito no afectaban significativamente a la proliferación celular. Inesperadamente, la adición de colesteril-TEG-fosforamidito en el extremo 3' de SEQ ID NO:3, que daba como resultado SEQ ID NO:7, confería la capacidad para inhibir la proliferación celular de dos células de cáncer de mama humano altamente agresivas.
Ejemplo 11
Cambios en la formación de estructura tridimensional inducidos por SEQ ID NO:5 en experimentos de excrecencia con MATRIGEL®
Se cultivaron por separado células MCF-7, MDA-MB-231 (MDA-231), Hs578T y Mpanc-96 en medio de cultivo regular, se tripsinizaron, y se contaron. Se preincubaron por separado 100 x 10^{3} células MDA-231, 100 x 10^{3} células Hs578T, 150 x 10^{3} células de MCF-7 y 150 x 10^{3} células Mpanc-96 durante una hora a 37ºC en una concentración final 53 \muM de SEQ ID NO:1, 53 \muM de SEQ ID NO:5 o RCM, y se extendieron sobre placas recubiertas con MATRIGEL® (MATRIGEL® placa de 24 pocillos de material celular recubierta con matriz de membrana basal) durante 3 días. Las placas se fijaron con formalina al 10%. Se tomaron fotografías digitales de las células en las placas de 24 pocillos utilizando una cámara digital Nikon Coolpix 990 (Nikon Corporation, Tokio, Japón) conectada a un microscopio invertido Nikon modelo TMS. Mientras que SEQ ID NO:1 no cambiaba la morfología de las células, SEQ ID NO:5 impedía la formación de estructuras tridimensionalessimilares a las formadas cuando las células se cultivaron en medio de cultivo regular sobre MATRIGEL® (véase Figura 1).
Como se muestra en la Figura 1, SEQ ID NO:1 era inactiva mientras que, inesperadamente, la adición de colesteril-TEG-fosforamidito en el extremo 3' de SEQ ID NO:1, que daba como resultado SEQ ID NO:5, confería la capacidad de prevenir la formación de estructuras tridimensionalessimilares a las formadas cuando las células se cultivaron en medio de cultivo regular sobre MATRIGEL®. Se cree que SEQ ID NO:5 interfería con las interacciones célula-matriz extracelular, modulando con ello los mecanismos de adhesión célula-célula y célula-matriz extracelular.
Ejemplo 12
Cambios en la formación de estructuras tridimensionales inducidos por SEQ ID O:8 en experimentos de excrecencia con MATRIGEL® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)
Se cultivaron MDA-MB-231 (MDA-231) y Hs578T en medio de cultivo regular, se tripsinizaron y se contaron. Se preincubaron por separado 100x10^{3} células MDA-MB-231 o 100x10^{3} de células Hs578T, durante una hora a 37ºC en una concentración final 53 \muM de SEQ ID NO:4, 53 \muM de SEQ ID NO:8 o RCM y se extendieron en placas sobre placas recubiertas con MATRIGEL® durante 3 días. Las placas se fijaron con formalina al 10%. Se tomaron fotografías digitales de las células en las placas de 24 pocillos utilizando una cámara digital Nikon Coolpix 990 (Nikon Corporation, Tokio, Japón), conectada a un microscopio invertido Nikon modelo TMS. Mientras que SEQ ID NO:4 no cambiaba la morfología celular, SEQ ID NO:8 destruía el patrón de crecimiento de las células tumorales extendidas sobre MATRIGEL® (véase Figura 2).
Como se muestra en la Figura 2, SEQ ID NO:4 era inactiva mientras que, inesperadamente, la adición de colesteril-TEG-fosforamidito en el extremo 3' de SEQ ID NO:4, que daba como resultado SEQ ID NO:8, confería la capacidad de prevenir la formación de estructuras de 3 dimensiones, similares a las formadas cuando las células se cultivaron en el medio de cultivo regular sobre pocillos recubiertos con MATRIGEL®. Se cree que SEQ ID NO:8 interfería con las interacciones célula-matriz extracelular modulando con ello las interacciones de las células tumorales y los componentes de la ECM.
Ejemplo 13
Cambios en la formación de estructura tridimensional de las células MCF-7 inducidos por SEQ ID NO:7 en experimentos de excrecencia con MATRIGEL®
Se cultivaron células MCF-7 en medio de cultivo regular (RCM), se tripsinizaron y se contaron. Se extendieron 150x10^{3} células MCF-7 en los pocillos de placas de 24 pocillos recubiertas con 350 \mul de MATRIGEL®. Después de la formación de estructuras tridimensionales durante 48 horas sin tratamiento alguno, se cambió el medio, y las estructuras se expusieron a una concentración final 53 \muM de SEQ ID NO:3, 53 \muM de SEQ ID NO:7, 53 \muM de colesteril-TEG-fosforamidito, RCM o su medio de control respectivo (RCM con agua, RCM con DMSO o RCM con acetonitrilo). Los tratamientos se repitieron cada 3-4 días hasta un tiempo máximo de cultivo de 19-20 días. El experimento se repitió tres veces. Se tomaron fotografías digitales de las células en las placas de 24 pocillos utilizando una cámara digital Nikon Coolpix 990 conectada a un microscopio invertido Nikon modelo TMS. Mientras que los medios de control respectivos (datos no presentados), SEQ ID NO:3 y colesteril-TEG-fosforamidito no afectaban a las estructuras tridimensionales, comparados con los controles, SEQ ID NO:7 destruía el patrón de crecimiento de las estructuras afectando con ello a las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular (véase Figura 3).
Como se muestra en la Figura 3, SEQ ID NO:3 y colesteril-TEG-fosforamidito era inactivos mientras que, inesperadamente, la adición de colesteril-TEG-fosforamidito en el extremo 3' de SEQ ID NO:3, que daba como resultado SEQ ID NO:7, confería la capacidad para destruir las estructuras tridimensionales pre-formadas.
Ejemplo 14
Cambios en la formación de estructura tridimensional de las células MDA-MB-231 inducidos por SEQ ID NO:7 en experimentos de excrecencia con MATRIGEL®
Las células MDA-MB-231 (MDA-231) se cultivaron en medio de cultivo regular, se tripsinizaron y se contaron. Se extendieron 100x10^{3} de células MDA-231 en medio de cultivo regular (RCM), en los pocillos de placas de 24 pocillos recubiertas con 350 \mul de MATRIGEL®. Después de la formación de estructuras tridimensionales durante 48 horas sin tratamiento alguno, se cambió el medio, y las estructuras se expusieron a una concentración final de 53 \muM de SEQ ID NO:3, 53 \muM de SEQ ID NO:7, 53 \muM de colesteril-TEG-fosforamidito, RCM, o su medio de control respectivo (RCM con agua, RCM con DMSO o RCM con acetonitrilo). Los tratamientos se repitieron cada 3-4 días hasta un tiempo máximo en cultivo de 17-21 días. El experimento se repitió 3 veces. Se tomaron fotografías digitales de las células en las placas de 24 pocillos utilizando una cámara digital Nikon Coolpix 990 conectada a un microscopio invertido Nikon modelo TMS. Mientras que los medios de control respectivos (datos no presentados), SEQ ID NO:3 y colesteril-TEG-fosforamidito no afectaban a las estructuras tridimensionales, que eran similares a las estructuras cultivadas en el RCM (medio de control negativo), SEQ ID NO:7 alteraba el patrón de crecimiento de las estructuras afectando con ello a las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular (véase Figura 4). Como se muestra en la Figura 4, SEQ ID NO:3 y colesteril-TEG-fosforamidito eran inactivos mientras que, inesperadamente, la adición de colesteril-TEG-fosforamidito en el extremo 3' de SEQ ID NO:3, que daba como resultado SEQ ID NO:7, confería la capacidad para romper las estructuras tridimensionales por interferir con las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular.
Ejemplo 15
Cambios en el ciclo celular inducidos por SEQ ID NO:7 cuando las células Hs578T se cultivaron como esferoides multicelulares
Se cultivaron aproximadamente 100x10^{3} células Hs578T por esferoide en presencia de 53 \muM de concentración final de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, 53 \muM de concentración final de colesteril-TEG-fosforamidito (cholTEG) o medios de control correspondientes (medio de cultivo regular (RCM), RCM con la misma cantidad de agua (RCMW) que la cantidad añadida con la SEQ ID NO:7, y RCM con la misma cantidad de acetonitrilo (MCMA) que la cantidad añadida con colesteril-TEG-fosforamidito). Se cultivaron cinco esferoides para cada condición experimental durante 72 horas. Después de ello, se evaluó la progresión del ciclo celular por tinción con yoduro de propidio (PI) (Calbiochem, Novabiochem Corporation, San Diego, CA) utilizando un citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Los cambios en el porcentaje de células en las diferentes fases del ciclo celular se analizaron utilizando portador lógico MODFIT LT (Verity Software House Inc.). Los resultados se muestran en la
Figura 5.
Como se muestra en la Figura 5, SEQ ID NO:3, colesteril-TEG-fosforamidito o los medios de control no modificaban significativamente la progresión del ciclo celular en comparación con los esferoides expuestos al medio de cultivo regular solo. Inesperadamente, la exposición a SEQ ID NO:7 aumentaba el porcentaje de células en la fase G_{2}M y la fase S y disminuía el porcentaje de células en G_{0}/G_{1} (p < 0,05 por el ensayo de \chi cuadrado). La adición de colesteril-TEG-fosforamidito confería a un oligonucleótido inactivo ensayado en el ensayo MS la capacidad de modificar la progresión del ciclo celular en un sistema complejo tridimensional que mimetiza varias características biopatológicas de los tumores in vivo.
Ejemplo 16
Cambios en la liberación de la proteína del aparato mitótico nuclear (NuMA) por las células de cáncer de mama humanas MDA-MB-231 cuando se incuban con SEQ ID NO:5
Se cultivaron células MDA-MB-231 como monocapas en medios de control respectivos, con concentración final 53 \muM de SEQ ID NO:1 o concentración final 53 \muM de SEQ ID NO:5 durante 72 horas. La liberación de la proteína del aparato mitótico nuclear (NuMA) se utilizó como medida de la apoptosis. Se determinó NuMA utilizando un kit comercial (ELISA) (Oncogene, Cambridge, MA) siguiendo el protocolo del fabricante. Los resultados se muestran en la Tabla 10 y se expresan como el aumento de porcentaje en la liberación de NuMA en comparación con controles respectivos basados en medidas de la densidad óptica.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 10 Cambios en la liberación de la proteína del aparato mitótico nuclear (NuMA) en células de cáncer de mama humanas MDA-MB-231
SECUENCIA Liberación de NuMA comparada con los controles (%)
SEQ ID NO:1 +5%
SEQ ID NO:5 +430%
Como se muestra en la Tabla 10, la liberación de la proteína del aparato mitótico nuclear (NuMA) aumentaba en un 430% después que las células se incubaran con SEQ ID NO:5. Inesperadamente, la adición de colesteril-TEG-fosforamidito al extremo 3' de SEQ ID NO:1, que daba como resultado SEQ ID NO:5, confería la capacidad de inducir la apoptosis.
\newpage
Ejemplo 17
Cambios en la liberación de la proteína del aparato mitótico nuclear (NuMA) por las células del cáncer de mama humano Hs578T cuando se incuban con SEQ ID NO:6
Se cultivaron células Hs578T como monocapa en condiciones de control negativo o con concentración final 53 \muM de SEQ ID NO:2, 53 \muM de SEQ ID NO:6 durante 72 horas. La liberación de la proteína del aparato mitótico nuclear (NuMA) se utilizó como medida de la apoptosis. Se determinó NuMA utilizando un kit ELISA comercial siguiendo el protocolo del fabricante. Los resultados se muestran en la Tabla 11 y se expresan como porcentaje de aumento en la liberación de NuMA en comparación con las condiciones de control basadas en medidas de la densidad óptica.
TABLA 11 Cambios en la liberación de la proteína del aparato mitótico nuclear (NuMA) por las células del cáncer de mama humano Hs578T
SECUENCIA Liberación de NuMA comparada con el control (%)
SEQ ID NO:2 +8%
SEQ ID NO:6 +288%
Como se muestra en la Tabla 11, la liberación de la proteína del aparato itótico nuclear (NuMA) aumentaba en un 288% después de incubar las células con SEQ ID NO:6. Inesperadamente, la adición de colesteril-TEG-fosforamidito al extremo 3' de SEQ ID NO:2 confería a un oligonucleótido inactivo la capacidad para inducir apoptosis.
Ejemplo 18
Efecto de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, y SEQ ID NO:6 sobre las células MEG-01 en ratones atímicos lampiños
Se inoculan subcutáneamente células MEG-01 en ratones atímicos lampiños como se ha descrito previamente (Takeo et al., Leukemia 7:1286, 1993). Los ratones se dividen en 13 grupos de 10 ratones. El día 0, los ratones del grupo 1 reciben solución salina, los ratones del grupo 2 reciben 1 mg/kg de SEQ ID NO:1, los ratones del grupo 3 reciben 10 mg/kg de SEQ ID NO:1, los ratones del grupo 4 reciben 100 mg/kg de SEQ ID NO:1, los ratones del grupo 5 reciben 1 mg/kg de SEQ ID NO:2, los ratones del grupo 6 reciben 10 mg/kg de SEQ ID NO:2, los ratones del grupo 7 reciben 100 mg/kg de SEQ ID NO:2, los ratones del grupo 8 reciben 1 mg/kg de SEQ ID NO:5, los ratones del grupo 9 reciben 10 mg/kg de SEQ ID NO:5, los ratones del grupo 10 reciben 100 mg/kg de SEQ ID NO:5, los ratones del grupo 11 reciben 1 mg/kg de SEQ ID NO:6, los ratones del grupo 12 reciben 10 mg/kg de SEQ ID NO:6 y los ratones del grupo 13 reciben 100 mg/kg de SEQ ID NO:6. Después de 4 semanas de tratamiento, se sacrifican los ratones y se examina la masa tumoral. Los ratones de los grupos 8-13 tienen menos masa tumoral que los ratones de los grupos 1-7. Los ratones de los grupos 8-13 exhiben menos masa tumoral en una modalidad dependiente de la dosis.
Ejemplo 19
Efecto de SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:7 sobre el crecimiento de las células de linfoma en los ratones
Se implantan subcutáneamente células de linfoma T EL-4 murino en ratones G57/BL6 como se ha descrito previamente (Krawczyk et al., Cancer Immunol. Immunother. 40:347, 1995). Se dividen los ratones en 7 grupos de 10 ratones. El día 0, los ratones del grupo 1 reciben solución salina, los ratones del grupo 2 reciben 1 mg/kg de SEQ ID NO:3, los ratones del grupo 3 reciben 10 mg/kg de SEQ ID NO:3, los ratones del grupo 4 reciben 100 mg/kg de SEQ ID NO:3, los ratones del grupo 5 reciben 1 mg/kg de SEQ ID NO:7, los ratones del grupo 6 reciben 10 mg/kg de SEQ ID NO:7 y los ratones del grupo 7 reciben 100 mg/kg de SEQ ID NO:7. Después de 4 semanas de tratamiento, se sacrifican los ratones y se determina la masa tumoral. Los ratones de los grupos 5-7 tienen menos masa tumoral que los ratones de los grupos 1-4. Los ratones de los grupos 5-7 exhiben menos masa tumoral en una modalidad dependiente de la dosis.
Ejemplo 20
Efecto de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 sobre las ratas con artritis inducida por la pared celular estreptocócica
La artritis inducida por la pared celular estreptocócica en las ratas LEW/N se asemeja a un neoplasma localizado constituido, en parte, por una población proliferativa e invasiva de células sinoviales semejantes a fibroblastos (Yocum et al., Am. J. Pathol. 132:38, 1988). La artritis se induce en las ratas LEW/N por inyección intraarticular de pared celular estreptocócica (SCW) de Streptococcus pyogenes del grupo A. las ratas se dividen en 13 grupos de 10 ratas. El día 0, las ratas del grupo 1 reciben SCW, las ratas del grupo 2 reciben SCW + 1 mg/kg de SEQ ID NO:1, las ratas del grupo 3 reciben SCW + 10 mg/kg de SEQ ID NO:1, las ratas del grupo 4 reciben SCW + 100 mg/kg de SEQ ID NO:1, las ratas del grupo 5 reciben SCW + 1 mg/kg de SEQ ID NO:2, las ratas del grupo 6 reciben SCW + 10 mg/kg de SEQ ID NO:2, las ratas del grupo 7 reciben SCW + 100 mg/kg de SEQ ID NO:2, las ratas del grupo 8 reciben SCW + 1 mg/kg de SEQ ID NO:5, las ratas del grupo 9 reciben SCW + 10 mg/kg de SEQ ID NO:5, las ratas del grupo 10 reciben SCW + 100 mg/kg de SEQ ID NO:5, las ratas del grupo 11 reciben SCW + 1 mg/kg de SEQ ID NO:6, las ratas del grupo 12 reciben SCW + 10 mg/kg de SEQ ID NO:6, y las ratas del grupo 13 reciben SCW + SEQ ID NO:6. La inflamación de la articulación se observa diariamente durante dos semanas. Las ratas de los grupos 8-13 exhiben menos inflamación que las ratas de los grupos 1-7. Las ratas de los grupos 8-13 tienen menos inflamación en una modalidad dependiente de la dosis.
Ejemplo 21
Efecto de las secuencias conjugadas con TEG-colesterilo sobre la morfología celular y el ciclo celular cuando se cultivan células de cáncer como monocapas, sobre MATRIGEL® o como esferoides multicelulares
Tipos diferentes de líneas de células malignas procedentes de mama, páncreas, colon, ovario y próstata se cultivan como monocapas sobre pocillos recubiertos con MATRIGEL® o como esferoides multicelulares (MS). Las células se tratan individualmente con secuencias oligonucleotídicas de longitudes diferentes (3 y 6 bases) con o sin colesteril-TEG-fosforamidito conjugado durante al menos 1-3 días. Tales secuencias incluyen, pero sin carácter limitante, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:4, o SEQ ID NO:8. Se estudian la proliferación/necrosis celular (medida por exclusión de azul Tripán), la apoptosis (medida por citometría de flujo, liberación de la proteína del aparato mitótico nuclear (NuMA), detección de DNA fragmentado por marcación en los extremos de la mella con bromodesoxiuridina-trifosfato-biotina mediada por la enzima desoxinucleotidil-transferasa terminal (TUNEL)), la progresión del ciclo celular estudiada por citometría de flujo (tinción con PI) y la morfología de las células tumorales extendidas en placa sobre pocillos recubiertos con MATRIGEL® o como esferoides multicelulares (MS).
Las secuencias oligonucleotídicas conjugadas con colesteril-TEG-fosforamidito aumentan la muerte celular (necrosis y apoptosis), modifican la progresión del ciclo celular cuando las células se cultivan como MS o sobre placas recubiertas con MATRIGEL®, y cambian la morfología celular cuando las células se cultivan como MS o sobre pocillos recubiertos con MATRIGEL®. Los oligonucleótidos no conjugados son inactivos.
Ejemplo 22
Efecto de SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:7 sobre los tumores MDA-MD-231 xenotransplantados
Se someten a xenotransplante células MDA-MB-231 subcutáneamente en ratones lampiños. Los ratones se dividen en 7 grupos de 10 ratones. Después que los tumores alcanzan 5 mm de diámetro, los ratones del grupo 1 reciben solución salina, los ratones del grupo 2 reciben 0,5 mg/kg de SEQ ID NO:3, los ratones del grupo 3 reciben 5 mg/kg de SEQ ID NO:3, los ratones del grupo 4 reciben 50 mg/kg de SEQ ID NO:3, los ratones del grupo 5 reciben 0,5 mg/kg de SEQ ID NO:7, los ratones del grupo 6 reciben 5 mg/kg de SEQ ID NO:7 y los ratones del grupo 7 reciben 50 mg/kg de SEQ ID NO:7. Los tratamientos se administran por vía intravenosa cada 3 días durante 6 dosis como máximo. Los ratones se sacrifican cuando el tumor alcanza 1 cm de diámetro, para cualquier síntoma de malestar o al final del estudio (3 meses desde la inyección de las células). Se realizan autopsias completas. Se determina la masa tumoral, la presencia de invasión y las metástasis. Los grupos 5-7 tienen menos masa tumoral que los ratones de los grupos 1-4. Los ratones de los grupos 5-7 exhiben menos masa tumoral en una modalidad dependiente de la dosis.
Ejemplo 23
Efecto de SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:7 sobre tumores MDA-MB-231 xenotransplantados
Se someten a xenotransplante células de cáncer de mama MDA-MB-231 subcutáneamente en ratones lampiños (1x10^{7} células). Los ratones se dividen en 7 grupos de 10 ratones. Después que los tumores alcanzan un diámetro de 5 mm^{2}, los ratones del grupo 1 reciben solución salina, los ratones del grupo 2 reciben 0,4 mg/kg de SEQ ID NO:3, los ratones del grupo 3 reciben 4 mg/kg de SEQ ID NO:3, los ratones del grupo 4 reciben 40 mg/kg de SEQ ID NO:3, los ratones del grupo 5 reciben 0,4 mg/kg de SEQ ID NO:7, los ratones del grupo 6 reciben 4 mg/kg de SEQ ID NO:7, y los ratones del grupo 7 reciben 40 mg/kg de SEQ ID NO:7. Los tratamientos se realizan por vía intravenosa cada 3 días durante 6 dosis como máximo. Se sacrifican los ratones cuando el tumor alcanza 1 cm de diámetro, para cualquier síntoma de malestar o al final del estudio (3 meses desde la inyección de las células). Se realizan autopsias completas. Se determinan la masa tumoral, la presencia de invasión y las metástasis. Los grupos 5-7 tienen menos masa tumoral y metástasis que los ratones de los grupos 1-4. Los ratones de los grupos 5-7 exhiben menos masa tumoral y metástasis en una modalidad dependiente de la dosis.
Debe entenderse, por supuesto, que lo que antecede hace referencia únicamente a realizaciones preferidas de la presente invención y que pueden hacerse numerosas modificaciones o alteraciones en ella.
<110> Bioniche LIfe Sciences Inc.
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Herrera-Gayol, Andrea C. 
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<120> Oligonucleótidos de trietilenglicol-colesterilo terapéuticamente útiles
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<130> 02811-0271WP 42368-278475
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<150> US 60/326.884
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<151> 2001-10-03
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<160> 8
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<221> características diversas
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<223> Oligonucleótido Sintético de 3'-trietilenglicol(TEG)-colesterilo
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3 
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Claims (11)

1. Una composición que comprende una secuencia sintética de 5'-OH, 3'-TEG-colesterilo, en donde la secuencia es SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8.
2. La composición de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.
3. La composición de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un agente terapéutico.
4. Uso de la composición de la reivindicación 1 para preparación de un medicamento.
5. El uso de la reivindicación 4, en donde el medicamento es eficaz para inducir una respuesta en una célula.
6. El uso de la reivindicación 4, en donde el medicamento es útil para administrar a un animal o un humano.
7. El uso de las reivindicaciones 4, 5 ó 6, en donde la respuesta es inhibición de la proliferación celular, parada del ciclo celular, inducción de apoptosis, activación de caspasa, escisión de poli(ADP-ribosa)-polimerasa en la célula, o modulación de la interacción matriz extracelular-célula, o una combinación de las mismas.
8. El uso de la reivindicación 7, en donde la célula es una célula de cáncer o una célula sinovial.
9. El uso de las reivindicaciones 4, 5 ó 6, en donde el medicamento es eficaz para tratar una enfermedad.
10. El uso de la reivindicación 9, en donde la enfermedad es cáncer o artritis.
11. El uso de la reivindicación 10, en donde el cáncer es linfoma, leucemia, o cáncer de mama.
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