ES2353885T3 - Composiciones oligonucleotídicas y su uso para inducir la diferenciación de células. - Google Patents

Abstract

Uso de una secuencia nucleotídica de fosfodiés-ter sintética, químicamente no modificada, 3'-OH, 5'-OH SEC ID NO: 4, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para inducir la diferen-ciación eritroide de células.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona composiciones que comprenden oligonucleótidos específicos combinados con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en las que las compo-siciones son útiles para inducir la diferenciación de célu-las, incluyendo células pluripotentes, células leucémicas, células de linfomas y células derivadas de la médula ósea, y para tratar enfermedades tales como leucemia, linfoma y trastornos asociados con diferenciación insuficiente de cé-lulas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Numerosas enfermedades y afecciones en animales y se-res humanos están asociadas con diferenciación insuficiente de células, o con una insuficiencia de células. Muchas de estas células derivan de la médula ósea. Tales enfermedades y afecciones incluyen, pero no se limitan a, leucemia, lin-foma, y trastornos sanguíneos no malignos tales como hemo-globinopatías, anemia drepanocítica, síndrome mielodisplá-sico e insuficiente producción de células derivadas de la médula ósea tras terapias tales como radiación y quimiote-rapia.

La terapia de diferenciación de células de leucemia en enfermedades tales como leucemia promielocítica aguda (APL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia promielocí-tica crónica (CPL) y leucemia mieloide crónica (CML) ha proporcionado una estrategia alternativa para el tratamien- to de leucemia. En la terapia de diferenciación, las célu-las de leucemia inmaduras son inducidas mediante compuestos químicos diferentes para lograr un fenotipo maduro que da como resultado la detención de su crecimiento.

Se ha dado a conocer un número de compuestos de dife-renciación y también la radiación para inducir la diferen-ciación de células leucémicas. Se ha dado a conocer que la hemina, el ácido butírico, la 5-azacitidina, el arabinósido de citosina, la hidroxiurea, la guanosina, la guanina, el ácido retinoico, el trimidox, la radiación gamma, la mitra-micina y la cromomicina inducen la diferenciación de célu-las de leucemia (Rutherford et al., Nature 280:164, 1979; Gambari et al., Biochem. Biophys. Acta, 886:203, 1986; Bi-anchi et al., Cancer Res. 46:6327, 1986; Adunyah et al., Biochem. Biophys. Acta, 1263:123, 1995; Osti et al., Haema-tologica 82:395, 1997; Cortesi et al., Eur. J. Haematol. 61:295, 1998; Iyamu et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 247:759, 1998; Schwenke et al., Leuk. Res. 19:955, 1995; y Bianchi et al., Br. J. Haematol. 104:258, 1999).

Los oligonucleótidos sintéticos son secuencias polia-niónicas que se internalizan en células (Vlassov et al. Biochim. Biophys. Acta 1197:95, 1994). Se informa que los oligonucleótidos sintéticos se unen selectivamente a ácidos nucleicos (Wagner, R. Nature: 372:333, 1994), a proteínas celulares específicas (Bates et al. J. Biol. Chem. 274:26369, 1999) y a proteínas nucleares específicas (Scag-giante et al. Eur. J. Biochem. 252:207, 1998), e inhiben la proliferación de células cancerígenas. No se ha informado de que los oligonucleótidos sintéticos posean actividad di-ferenciadora sobre células de leucemia promielocítica aguda y/o crónica ni/o sobre células de leucemia mieloide. Se ha demostrado que los oligonucleótidos de fosforotioato sinté- ticos que tienen un motivo CpG (5’purina-purina-citosina (C)-guanina (G)-pirimidina-pirimidina3’) inducen la proli-feración de leucemia linfocítica crónica de células B (Dec-ker et al., Blood 95:999, 2000). Se ha dado a conocer que secuencias sintéticas de 27 bases que contienen G y canti-dades variables de timina (T), en lo sucesivo oligonucleó-tido GTn, en el que n es  1 o  7 Ts (Scaggiante et al., Eur. J. Biochem. 252:207, 1998), y en el que el número de bases es >20 (Morassutti et al., Nucleosides and Nucleoti-des 18:1711, 1999), inhiben el crecimiento de células de leucemia mediante unión específica de la secuencia a una proteína nuclear de 45 kDa. Por el contrario, se da a cono-cer que las secuencias GTn, en las que el número total de bases es menor que 15, son inactivas frente a estas células (Morassutti et al. Nucleosides and Nucleotides 18:1711, 1999). Los oligonucleótidos de metilfosfonodiés-ter/fosfodiéster quiméricos de secuencia tipo CGNNN (N = A, C, G o T), introducidos en el citoplasma de células median-te 10 minutos de permeabilización reversible con estrepto-lisina O, inducen apoptosis de células de leucemia de célu-las T humanas. No obstante, se da a conocer que los oligo-nucleótidos CGNNN son inactivos frente a tres estirpes ce-lulares de CML (K562, LAMA84 y KYO1), no mostrando ningún efecto significativo sobre el crecimiento y supervivencia de estas células (Tidd et al., Nucleic Acid Res. 28:2242, 2000).

El agotamiento de células derivadas de la médula ósea se observa en varias afecciones, incluyendo el agotamiento tras terapia de radiación o quimioterapia. La producción insuficiente de células destinadas a convertirse en eritro-citos o granulocitos está asociada con numerosos problemas, incluyendo, pero sin limitarse a, suministro reducido de oxígeno a las células, función inmunitaria reducida, y anormalidades en la coagulación. A menudo se requieren di-versas terapias, incluyendo quimioterapias caras, para es-timular la producción de glóbulos rojos y blancos.

La mayoría de las terapias de diferenciación de la técnica anterior han demostrado ser menos que adecuadas pa-ra aplicaciones clínicas. Muchas de estas terapias son in-eficaces o tóxicas, tienen efectos secundarios significati-vos, y son debilitantes para el receptor. Por lo tanto, existe una necesidad continua de nuevas composiciones y mé-todos que induzcan la diferenciación de células, tales como células de leucemia derivadas de mieloide. Lo que también se necesita son nuevas composiciones terapéuticas y métodos para estimular la producción y diferenciación de células pluripotentes tales como células derivadas de la médula ósea. También se necesitan nuevas composiciones terapéuti-cas que induzcan la diferenciación de células. Lo que tam-bién se necesita son composiciones y métodos que se pueden usar para tratar enfermedades y afecciones caracterizadas por una diferenciación insuficiente de células o una pro-ducción insuficiente de células derivadas de la médula ósea.

Los documentos WO 01/44465 y WO 02/18593 describen composiciones y métodos que comprenden oligonucleótidos sintéticos. Además, ambos documentos se refieren a la in-hibición de la proliferación celular.

El documento WO 01/47561 describe composiciones que comprenden ácido hialurónico y oligonucleótidos sintéticos.

El documento WO 03/016567 se refiere a la evaluación realizada por ordenador de moléculas en busca de la activi-dad biológica proporcionando un método a base de ordenador para predecir si los oligonucleótidos pueden poseer activi-dad biológica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define mediante las reivin-dicaciones anejas.

La descripción hace referencia a estas necesidades proporcionando un método que comprende administrar una com-posición que comprende una secuencia oligonucleotídica de fosfodiéster sintética (en lo sucesivo secuencia), química-mente no modificada, 3’-OH, 5’-OH, seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 (5’GTG3’), SEC ID NO: 2 (5’GGGTGG3’), SEC ID NO: 3 (5’GGGAGG3’) y SEC ID NO: 4 (5’CCACCC3’), y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que la composición induce la diferenciación de células. La descripción hace referencia a un método para tratar en-fermedades asociadas con el crecimiento de células que no se diferencian en un fenotipo maduro. La diferenciación terminal de células puede incluir una o más respuestas se-leccionadas del grupo que consiste en inducción de fenotipo similar a eritrocitos, fenotipo similar a monocitos, feno-tipo similar a megacariocitos, inhibición de proliferación de células de leucemia, e inducción de síntesis de hemoglo-bina.

Las composiciones que se describen se pueden usar pa-ra tratar enfermedades relacionadas con la diferenciación insuficiente de células. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, leucemia, linfoma, y trastornos sanguíneos no malignos tales como hemoglobinopatías, asma drepanocíti-ca o síndrome mielodisplásico. Se cree que las composicio-nes que se describen son útiles para el tratamiento de pan- citopenia, anemia, trombocitopenia y leucopenia. Otras afecciones que se pueden tratar con las composiciones des-critas incluyen linfoma y trastornos sanguíneos no malig-nos, incluyendo, pero sin limitarse a, hemoglobinopatías, asma drepanocítica y síndromes mielodisplásicos.

Las composiciones descritas se administran a un ani-mal o a un ser humano con leucemia, en una cantidad eficaz para tratar la leucemia.

Las composiciones descritas también se pueden admi-nistrar a un animal o un ser humano junto con otras tera-pias como una terapia de combinación. Estas terapias pueden incluir la administración de compuestos terapéuticos o te-rapia de radiación. Las composiciones descritas se pueden administrar antes, después o concomitantemente con la otra terapia. Tal terapia de combinación puede aumentar el efec-to terapéutico neto sobre el animal o el ser humano. Las composiciones descritas se pueden administrar solas o en combinación con otras modalidades terapéuticas, incluyendo, pero sin limitarse a, agentes quimioterapéuticos, agentes diferenciadores, agentes inmunoterapéuticos, agentes anti-microbianos, agentes antivirales, o en combinación con te-rapia de radiación.

Las composiciones descritas se pueden administrar a un receptor para estimular la producción de células después de que otras terapias administradas al receptor hayan ago-tado tales células. Un ejemplo no limitante implica el ago-tamiento de células derivadas de médula ósea tras la tera-pia de radiación o quimioterapia. Las composiciones descri-tas también se pueden administrar a un receptor para esti-mular la producción y diferenciación de otras células, ta-les como células madre pluripotentes, células madre de mie-loide, células madre de linfoide, células progenitoras, precursores de células inmunitarias, y/u otras células de-rivadas de estas células madre pluripotentes, células madre de mieloide, células madre de linfoide, células progenito-ras, y precursores de células inmunitarias. Las composicio-nes descritas también se pueden administrar a un receptor para estimular la producción y diferenciación de células a partir de numerosas fuentes, incluyendo, pero sin limitarse a, médula ósea, hígado, bazo, ganglios linfáticos, timo y sangre del cordón umbilical.

Las composiciones descritas también se pueden admi-nistrar in vitro para efectuar la diferenciación de células tales como células madre pluripotentes, células madre de mieloide, células madre de linfoide, células progenitoras, precursores de células inmunitarias, y/u otras células de-rivadas de estas células madre pluripotentes, células madre de mieloide, células madre de linfoide, células progenito-ras, y precursores de células inmunitarias.

La capacidad inesperada y sorprendente de la composi-ción descrita para inducir la diferenciación de células de-rivadas de la médula ósea, incluyendo células de leucemia, resuelve una necesidad largamente sentida e insatisfecha en la técnica médica, y proporciona un beneficio importante para animales y seres humanos.

Se hace referencia a la provisión de un método que comprende administrar una composición que comprende una se-cuencia oligonucleotídica de fosfodiéster sintética (en lo sucesivo secuencia), químicamente no modificada, 3’-OH, 5’-OH, seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 (5’GTG3’), SEC ID NO: 2 (5’GGGTGG3’), SEC ID NO: 3 (5’GGGAGG3’) y SEC ID NO: 4 (5’CCACCC3’), y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para tratar una enfermedad en animales y seres humanos, en el que la enfermedad se carac- teriza por diferenciación insuficiente de células.

Se hace referencia a la provisión de un método que comprende administrar una composición que comprende una se-cuencia oligonucleotídica de fosfodiéster sintética (en lo sucesivo secuencia), químicamente no modificada, 3’-OH, 5’-OH, seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 (5’GTG3’), SEC ID NO: 2 (5’GGGTGG3’), SEC ID NO: 3 (5’GGGAGG3’) y SEC ID NO: 4 (5’CCACCC3’), y un vehículo farmacéuticamente aceptable para inducir la maduración y diferenciación de células progenitoras en animales y seres humanos.

Se hace referencia a la provisión de una composición y método para tratar la leucemia.

Se hace referencia a la provisión de un método que inhibe la proliferación de células leucémicas e induce la diferenciación de células leucémicas.

Se hace referencia a la provisión de un método para tratar linfoma.

Se hace referencia a la provisión de un método para tratar trastornos sanguíneos no malignos.

Se hace referencia a la provisión de un método para tratar hemoglobinopatías.

Se hace referencia a la provisión de un método para tratar asma drepanocítica.

Se hace referencia a la provisión de un método para tratar síndrome mielodisplásico.

Se hace referencia a la provisión de un método para tratar pancitopenia.

Se hace referencia a la provisión de un método para tratar anemia.

Se hace referencia a la provisión de un método para tratar trombocitopenia.

Se hace referencia a la provisión de un método para tratar leucopenia.

Se hace referencia a la provisión de un método para inducir la maduración y diferenciación de células progeni-toras.

Se hace referencia a la provisión de un método para inducir la maduración y diferenciación de células que in-cluyen, pero no se limitan a, células madre pluripotentes, células madre de mieloide, células madre de linfoide, célu-las progenitoras, precursores de células inmunitarias, y/u otras células derivadas de estas células madre pluripoten-tes, células madre de mieloide, células madre de linfoide, células progenitoras, y precursores de células inmunita-rias.

Se hace referencia a la provisión de un método para inducir la maduración de células progenitoras derivadas de médula ósea.

Se hace referencia a la provisión de un método que incrementa el número de células derivadas de médula ósea tras el tratamiento con agentes terapéuticos.

Se hace referencia a la provisión de un método que incrementa el número de células derivadas de médula ósea tras el tratamiento con agentes quimioterapéuticos.

Se hace referencia a la provisión de un método que restaura el número de células derivadas de médula ósea tras el tratamiento con radioterapia.

Se hace referencia a la provisión de un método que restaura el número de células derivadas de médula ósea tras el tratamiento con agentes inmunosupresores.

Se hace referencia a la provisión de una composición que es mínimamente tóxica para el receptor.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se entenderá más fácilmente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada de realizaciones específicas incluidas aquí.

La presente invención se define mediante las reivin-dicaciones anejas.

Se describe un método que comprende administrar una composición que comprende una secuencia oligonucleotídica de fosfodiéster sintética (en lo sucesivo secuencia), quí-micamente no modificada, 3’-OH, 5’-OH, seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NOs: 1, 2, 3 ó 4, y un ve-hículo farmacéuticamente aceptable, a un animal o a un ser humano en una cantidad eficaz para inducir la diferencia-ción de células. Las composiciones descritas se pueden usar para tratar una enfermedad relacionada con la diferencia-ción insuficiente de células. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, leucemia, linfoma, y trastornos san-guíneos no malignos tales como hemoglobinopatías, asma dre-panocítica y síndrome mielodisplásico. Se cree que las com-posiciones descritas son útiles para el tratamiento de pan-citopenia, anemia, trombocitopenia y leucopenia. Otras afecciones que se pueden tratar con las composiciones des-critas incluyen linfoma y trastornos sanguíneos no malig-nos, incluyendo, pero sin limitarse a, hemoglobinopatías, anemia drepanocítica y síndromes mielodisplásicos. La capa-cidad inesperada y sorprendente de estas composiciones para inducir la diferenciación y para inhibir la proliferación de células de leucemia satisface una necesidad largamente sentida de insatisfecha en la técnica médica, y proporciona un beneficio importante para animales y seres humanos.

También se describe un método que comprende adminis- trar una composición que comprende una secuencia oligonu-cleotídica de fosfodiéster sintética (en lo sucesivo se-cuencia), químicamente no modificada, 3’-OH, 5’-OH, selec-cionada del grupo de SEC ID NO: 1 (5’GTG3’), SEC ID NO: 2 (5’GGGTGG3’), SEC ID NO: 3 (5’GGGAGG3’) y SEC ID NO: 4 (5’CCACCC3’), y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para inducir la maduración de células progenitoras en ani-males y seres humanos. Tales células incluyen, pero no se limitan a, células madre pluripotentes, células madre de mieloide, células madre de linfoide, precursores de células inmunitarias, y/u otras células derivadas de estas células madre pluripotentes, células madre de mieloide, células ma-dre de linfoide y precursores de células inmunitarias. Las composiciones descritas también se pueden administrar a un animal y un ser humano para estimular la producción y dife-renciación de células procedentes de numerosas fuentes, in-cluyendo, pero sin limitarse a, médula ósea, hígado, bazo, ganglios linfáticos, timo y sangre del cordón umbilical.

Como se usa aquí, la palabra “secuencia” se refiere a una secuencia que comprende una secuencia nucleotídica de fosfodiéster sintética, químicamente no modificada, 3’-OH, 5’-OH, seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1 (5’GTG3’), SEC ID NO: 2 (5’GGGTGG3’), SEC ID NO: 3 (5’GGGAGG3’) y SEC ID NO: 4 (5’CCACCC3’).

La palabra “respuesta”, como se usa aquí, se refiere a uno o más de los siguientes ejemplos no limitantes de respuestas: diferenciación inducida de células madre pluri-potentes, células madre de mieloide, células madre de lin-foide, precursores de células inmunitarias, y/u otras célu-las derivadas de estas células madre pluripotentes, células madre de mieloide, células madre de linfoide y precursores de células inmunitarias; diferenciación inducida de células similares a eritrocitos, células similares a monocitos o células similares a megacariocitos; inhibición de la proli-feración celular debido a la inducción de la diferenciación terminal; inducción de la síntesis de hemoglobina; y esti-mulación de la síntesis de hemoglobina.

Como se usa aquí, la expresión “eficaz en células sensibles” se refiere a la capacidad de las composiciones de la presente invención para inducir la diferenciación y/o inhibición de la proliferación y/o síntesis de hemoglobina.

Como se usa aquí, las expresiones “tratamiento tera-péutico”, “cantidad eficaz” y “cantidad eficaz para” se re-fieren a una cantidad de una secuencia eficaz para inducir la diferenciación de células, para inhibir la proliferación de células o para estimular la producción de células pluri-potentes tales como células derivadas de médula ósea.

El término “enfermedad”, como se usa aquí, se refiere a una afección en la que está alterada la salud corporal.

Como se usa aquí, el término “quimioterapéutico” es cualquier agente aprobado por una agencia reguladora de un país o un gobierno estatal, o enunciado en la Farmacopea de los Estados Unidos de América u otra farmacopea generalmen-te reconocida, para uso para tratar cáncer en un animal o un ser humano. Como se usa aquí, el término “quimioterapéu-tico” incluye agentes inmunosupresores.

La administración de una cantidad eficaz de la compo-sición descrita a un animal o a un ser humano es un trata-miento terapéutico que evita, trata o elimina una enferme-dad, incluyendo, pero sin limitarse a, leucemia, pancitope-nia, anemia, trombocitopenia, leucopenia, linfoma, y tras-tornos sanguíneos no malignos tales como hemoglobinopatías, anemia drepanocítica o síndrome mielodisplásico. Los tipos de leucemia incluyen, pero no se limitan a, APL, AML, CPL y CML. La administración de una cantidad eficaz de la compo-sición descrita a un animal o un ser humano es también un tratamiento terapéutico que estimula la producción de célu-las progenitoras, incluyendo, pero sin limitarse a, células madre pluripotentes, células madre de mieloide, células ma-dre de linfoide, precursores de células inmunitarias, y/u otras células derivadas de estas células madre pluripoten-tes, células madre de mieloide, células madre de linfoide, y precursores de células inmunitarias. Se hace referencia a la provisión de un método para estimular la producción y diferenciación de células derivadas de la médula ósea. Las composiciones descritas también se pueden administrar a un animal o un ser humano para estimular la producción y dife-renciación de células a partir de numerosas fuentes, inclu-yendo, pero sin limitarse a, médula ósea, hígado, bazo, ganglios linfáticos, timo y sangre del cordón umbilical.

Las expresiones “vehículo farmacéuticamente acepta-ble” o “portador farmacéuticamente aceptable” se usan aquí para querer decir, sin limitación, cualquier líquido, sóli-do, o semisólido, incluyendo, pero sin limitarse a, agua o disolución salina, un gel, crema, pomada, disolvente, dilu-yente, base de ungüento fluido, ungüento, pasta, implante, liposoma, micela, micela gigante, y similar, que es adecua-do para uso en contacto con tejido vivo de animal o de ser humano sin provocar respuestas fisiológicas adversas, y que no interacciona con los otros componentes de la composición de manera perjudicial. Se pueden emplear otros vehículos o portadores farmacéuticamente aceptables conocidos por un experto en la técnica para obtener composiciones para sumi-nistrar las secuencias oligonucleotídicas de la presente invención.

Las secuencias oligonucleotídicas de la presente in- vención se pueden combinar con vehículos farmacéuticamente aceptables, y se pueden administrar como composiciones in vitro o in vivo. Las formas de administración incluyen, pe-ro no se limitan a, inyecciones, disoluciones, cremas, ge-les, implantes, bombas, ungüentos, emulsiones, suspensio-nes, microesferas, partículas, micropartículas, nanopartí-culas, liposomas, pastas, parches, comprimidos, dispositi-vos de suministro transdérmico, pulverizaciones, aerosoles, u otros medios familiares para un experto normal en la téc-nica. Tales vehículos farmacéuticamente aceptables son co-nocidos habitualmente por un experto normal en la técnica. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica usando ingredientes bien conocidos y fácilmente disponibles. Por ejemplo, los compuestos se pueden formular con excipientes, diluyentes o vehículos habituales, y se pueden conformar en comprimidos, cápsulas, suspensiones, polvos, y similares. Los ejemplos de excipientes, diluyen-tes y vehículos que son adecuados para tales formulaciones incluyen los siguientes: cargas y extendedores (por ejem-plo, almidón, azúcares, manitol, y derivados silícicos); agentes aglutinantes (por ejemplo, carboximetilcelulosa y otros derivados de celulosa, alginatos, gelatina, y polivi-nilpirrolidona); agentes humectantes (por ejemplo, glice-rol); agentes disgregantes (por ejemplo, carbonato de cal-cio y bicarbonato de sodio); agentes para retrasar la diso-lución (por ejemplo, parafina); aceleradores de la resor-ción (por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario); agen-tes tensioactivos (por ejemplo, alcohol cetílico, monoes-tearato de glicerol); vehículos adsorbentes (por ejemplo, caolín y bentonita); emulsionantes; conservantes; edulco-rantes; estabilizantes; agentes colorantes; agentes perfu- mantes; agentes saborizantes; lubricantes (por ejemplo, talco, estearato de calcio y de magnesio); polietilglicoles sólidos; y sus mezclas.

Las formulaciones se pueden constituir de forma que liberen el ingrediente activo sólo o preferiblemente en una localización particular, posiblemente a lo largo de un pe-ríodo de tiempo. Tales combinaciones proporcionan todavía un mecanismo adicional para controlar la cinética de libe-ración. Los revestimientos, cubiertas y matrices protecto-ras se pueden obtener, por ejemplo a partir de sustancias poliméricas o de ceras.

Las composiciones que comprenden una o más secuencias y un vehículo farmacéuticamente aceptable se preparan aso-ciando uniforme e íntimamente la secuencia y el vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamen-te aceptables incluyen vehículos líquidos, vehículos sóli-dos, o ambos. Los vehículos líquidos son vehículos acuosos, vehículos no acuosos, o ambos, e incluyen, pero no se limi-tan a, suspensiones acuosas, emulsiones oleosas, emulsiones de agua en aceite, emulsiones de agua en aceite en agua, emulsiones específicas del sitio, emulsiones de residencia prolongada, emulsiones pegajosas, microemulsiones y nanoe-mulsiones. Los vehículos sólidos son vehículos biológicos, vehículos químicos, o ambos, e incluyen, pero no se limitan a, sistemas de vectores víricos, partículas, micropartícu-las, nanopartículas, microesferas, nanoesferas, minibombas, extractos de la pared celular bacteriana y polímeros natu-rales o sintéticos biodegradables o no biodegradables que permiten la liberación sostenida de las composiciones oli-gonucleotídicas. Las emulsiones, minibombas y polímeros se pueden implantar en la vecindad de donde se requiere el su-ministro (Brem et al. J. Neurosurg. 74: 441, 1991). Los mé- todos usados para complejar una secuencia o secuencias oli-gonucleotídicas a un vehículo sólido incluyen, pero no se limitan a, adsorción directa a la superficie del vehículo sólido, acoplamiento covalente a la superficie del vehículo sólido, ya sea directamente o vía un resto enlazante, y acoplamiento covalente al polímero usado para obtener el vehículo sólido. Opcionalmente, una secuencia o secuencias se pueden estabilizar mediante adición de polímeros no ió-nicos o iónicos tales como monooleatos de polioxietilensor-bitán (TWEEN) o ácido hialurónico.

Los vehículos acuosos preferidos incluyen, pero no se limitan a, agua, disolución salina y tampones farmacéutica-mente aceptables. Los vehículos no acuosos preferidos in-cluyen, pero no se limitan a, un aceite mineral o un aceite neutro, incluyendo, pero sin limitarse a, un diglicérido, un triglicérido, un fosfolípido, un lípido, un aceite y sus mezclas, en el que el aceite contiene una mezcla apropiada de ácidos grasos poliinsaturados y saturados. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, aceite de haba de soja, aceite de colza con bajo contenido en ácido erúcico, aceite de palma, aceite de oliva y Miglyol, en los que los ácidos grasos pueden ser saturados o insaturados. Opcionalmente, se pueden incluir excipientes, independientemente del vehí-culo farmacéuticamente aceptable usado para presentar las composiciones oligonucleotídicas a las células. Estos exci-pientes incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes, tam-pones, y bacteriostáticos, y pueden incluir agentes de sus-pensión y agentes espesantes.

Se pueden administrar una o más secuencias solas o en combinación con otras modalidades terapéuticas, incluyendo, pero sin limitarse a, agentes quimioterapéuticos, agentes diferenciadores, agentes inmunoterapéuticos, agentes anti- microbianos, agentes antivirales, o en combinación con te-rapia de radiación. Los agentes diferenciadores incluyen, pero no se limitan a, hemina, ácido butírico, 5-azacitidina, arabinósido de citosina, hidroxiurea, guanosi-na, guanina, ácido retinoico, trimidox, radiación gamma, mitramicina y cromomicina. Los agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos, agentes que dañan el ADN, agentes que desestabilizan los microtúbu-los, agentes que estabilizan los microtúbulos, agentes des-polimerizantes de la actina, agentes que inhiben el creci-miento, agentes que inhiben las topoisomerasas, agentes que inhiben HMG-CoA, agentes inhibidores de purina, agentes in-hibidores de pirimidina, agentes inhibidores de metalopro-teinasas, agentes inhibidores de CDK, agentes inhibidores de la angiogénesis, agentes que potencian la diferencia-ción, y agentes inmunoterapéuticos. Las dosis y métodos de administración de estas otras modalidades terapéuticas son conocidos por una persona de pericia normal en la técnica.

Los métodos de administración in vivo de las composi-ciones descritas o de formulaciones que comprenden tales composiciones y otros materiales tales como vehículos de la presente invención que son particularmente adecuados para diversas formas incluyen, pero no se limitan a, los si-guientes tipos de administración: oral (por ejemplo bucal o sublingual), anal, rectal, como un supositorio, tópica, pa-renteral, en aerosol, mediante inhalación, intratecal, in-traperitoneal, intravenosa, intraarterial, transdérmica, intradérmica, subdérmica, intramuscular, intrauterina, va-ginal, en una cavidad corporal, administración quirúrgica en la localización de un tumor o lesión interna, directa-mente en tumores, en la luz o parénquima de un órgano, y en la médula espinal. Las técnicas útiles en las diversas for- mas de administraciones mencionadas anteriormente incluyen, pero no se limitan a, la aplicación tópica, la ingestión, la administración quirúrgica, la inyección, las pulveriza-ciones, los dispositivos de suministro transdérmico, bombas osmóticas, electrodeposición directamente en un sitio de-seado, u otro medio familiar para una persona de pericia normal en la técnica. Los sitios de aplicación pueden ser externos, tales como en la epidermis, o internos, por ejem-plo una úlcera gástrica, un campo quirúrgico, o en cual-quier otra parte.

Las composiciones descritas se pueden aplicar en for-ma de cremas, geles, disoluciones, suspensiones, liposomas, partículas, u otros medios conocidos por una persona exper-ta en la técnica de formulación y suministro de las compo-siciones. Se pueden usar tamaños ultrafinos de partículas para el suministro mediante inhalación de los compuestos terapéuticos. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para la administración subcutánea incluyen, pero no se li-mitan a, implantes, depósitos, agujas, cápsulas, y bombas osmóticas. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas pa-ra la administración vaginal incluyen, pero no se limitan a, cremas y anillos. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para administración oral incluyen, pero no se limitan a: pastillas, líquidos, jarabes, y suspensiones. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para la admi-nistración transdérmica incluyen, pero no se limitan a, ge-les, cremas, pastas, parches, pulverizaciones, y geles. Al-gunos ejemplos de mecanismos de suministro apropiados para la administración subcutánea incluyen, pero no se limitan a, implantes, depósitos, agujas, cápsulas, y bombas osmóti-cas. Las formulaciones adecuadas para la administración pa-renteral incluyen, pero no se limitan a, disoluciones esté- riles acuosas y no acuosas para inyección que pueden conte-ner antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesan-tes. Se pueden preparar disoluciones y suspensiones extem-poráneas para inyección a partir de polvos estériles, grá-nulos y comprimidos usados habitualmente por una persona de pericia normal en la técnica.

Las realizaciones en las que las composiciones des-critas se combinan con, por ejemplo, uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables se pueden presen-tar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante técnicas farmacéuticas convencio-nales. Tales técnicas incluyen la etapa de asociar las com-posiciones que contienen el ingrediente activo y el vehícu-lo o vehículos o el excipiente o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan asociando unifor-me e íntimamente el ingrediente activo con vehículos líqui-dos. Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis o unidad, o una frac-ción apropiada de la misma, del ingrediente administrado. Se debería entender que, además de los ingredientes parti-cularmente mencionados anteriormente, las formulaciones que comprenden las composiciones descritas pueden incluir otros agentes usados habitualmente por una persona de pericia normal en la técnica.

El volumen de administración variará dependiendo de la vía de administración. Tales volúmenes son conocidos por una persona de pericia normal en la técnica de administrar composiciones a animales o seres humanos. Dependiendo de la vía de administración, el volumen por dosis es preferible- mente alrededor de 0,001 a 100 ml por dosis, más preferi-blemente alrededor de 0,01 a 50 ml por dosis, y lo más pre-ferible alrededor de 0,1 a 30 ml por dosis. Por ejemplo, las inyecciones intramusculares pueden oscilar en volumen desde alrededor de 0,1 ml hasta 1,0 ml. Las composiciones oligonucleotídicas administradas solas, o junto con otro agente o agentes terapéuticos, se pueden administrar en un tratamiento de una sola dosis, en tratamientos de múltiples dosis, o se pueden infundir continuamente en un programa y durante un período de tiempo apropiado para la enfermedad que se esté tratando, la afección del receptor y la vía de administración. Además, el otro agente terapéutico se puede administrar antes, al mismo tiempo que, o después de la ad-ministración de las composiciones oligonucleotídicas.

Preferiblemente, la cantidad de composición oligonu-cleotídica administrada por dosis es desde alrededor de 0,001 hasta 100 mg/kg, más preferiblemente desde alrededor de 0,001 hasta 10 mg/kg, y lo más preferible desde alrede-dor de 0,01 hasta 5 mg/kg. Las composiciones oligonucleotí-dicas en combinación con un agente quimioterapéutico se pueden administrar a un animal o ser humano que tiene leu-cemia en una cantidad eficaz para añadirse a, sinergizarse con o potenciar el efecto antineoplásico del agente quimio-terapéutico. Preferiblemente, la cantidad de agente tera-péutico administrado por dosis es desde alrededor de 0,001 hasta 1000 mg/kg, más preferiblemente desde alrededor de 0,01 hasta 500 mg/kg, y lo más preferible desde alrededor de 0,1 hasta 100 mg/kg. La secuencia particular y el agente terapéutico particular administrado, la cantidad por dosis, el programa de dosificación y la vía de administración se deberían de decidir por el médico usando métodos conocidos por los expertos en la técnica, y dependerán del tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad, la localización de la enfermedad y otros factores clínicos tales como el tamaño, peso y estado físico del receptor. Además, opcio-nalmente se pueden emplear ensayos in vitro para ayudar a identificar intervalos óptimos para la administración de la secuencia y para la administración de la secuencia más el agente terapéutico.

Las composiciones descritas también se pueden admi-nistrar in vitro para efectuar la diferenciación de células tales como células madre pluripotentes, células madre de mieloide, células madre de linfoide, células progenitoras, precursores de células inmunitarias, y/u otras células de-rivadas de estas células madre pluripotentes, células madre de mieloide, células madre de linfoide, células progenito-ras, y precursores de células inmunitarias.

La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, que no se han de interpretar de ningu-na manera como limitaciones impuestas sobre el alcance de la misma. Por el contrario, se entenderá claramente que se pueden tener recursos para otras diversas realizaciones, modificaciones, y sus equivalentes, que, después de leer la descripción aquí, pueden sugerirse por sí mismas para los expertos en la técnica sin separarse del espíritu de la presente invención.

Ejemplo 1

Preparación de secuencias

Las secuencias nucleotídicas de fosfodiéster (SEC ID NOs: 1, 2, 3 y 4) se prepararon mediante Sigma-Genosys (Woodlands, TX) usando la tecnología de síntesis segmentada de Abacus. Excepto que se establezca de otro modo, las se-cuencias se dispersan en agua desionizada sometida a auto-clave o en un tampón farmacéuticamente aceptable tal como, pero sin limitarse a, disolución salina, inmediatamente an-tes del uso.

Ejemplo 2

Células

Como el modelo estándar para determinar in vitro el potencial terapéutico de nuevos compuestos diferenciadores, se usa la estirpe celular K562 derivada de las células leu-cémicas de un paciente con CML en crisis blástica (Ruther-ford et al., Nature, 280:164, 1979; Drexler et al. DSMZ Ca-talogue of Human and Animal Cell Lines, 6ª ed., Braunsch-weig, Alemania: DSMZ, 1997). Las células K562 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), y se cultivaron en un medio recomendado por la ATCC.

Ejemplo 3

Síntesis de hemoglobina por células K562 cultivadas con SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4.

Se sembraron células K562 en 1,0 ml a 2,0 X 105 célu-las/ml en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 6 pocillos durante 72 horas con 100 g de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 4. Para la determina-ción de la hemoglobina, las células se lavaron dos veces mediante centrifugación en disolución salina tamponada con fosfato (PBS), se tiñeron con 0,2% de bencidina (Sigma-Aldrich Canadá, Oakville, Ontario) en ácido acético 0,5 M activado con H2O2 al 10% (Gambari et al., Experimentia 41:673, 1985). Después de 10 minutos de incubación en la oscuridad, los porcentajes de células positivas a bencidina (células positivas a hemoglobina) se determinaron mediante microscopía de luz usando un hemocitómetro. Se contaron aproximadamente 500 células para la determinación de los porcentajes de células positivas a bencidina. El tamaño ce-lular también se determinó mediante microscopía de luz. Se añadió hemina (20 g) a células K562 durante 72 horas como un control para la síntesis de hemoglobina. La hemina se obtuvo de Sigma-Aldrich Canadá.

Tabla 1

Evaluación de la síntesis de hemoglobina (positividad a bencidina) y tamaño celular de células K562

SECUENCIA

% de células positivas a bencidina Tamaño celular

Ninguna

5,4 normal

SEC ID NO: 1

17,4 aumentó

SEC ID NO: 2

35,8 aumentó

SEC ID NO: 3

11,4 aumentó

SEC ID NO: 4

10,1 aumentó

Hemina

17,8 normal

Como se muestra en la Tabla 1, SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4 inducen la síntesis de hemoglobina por células K562 y un incremento en su tamaño celular, dos medidas de la diferenciación eritroide.

Ejemplo 4

Aumento de Rh D en células K562 cultivadas con SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3.

El antígeno Rh D es el antígeno más importante del sistema del grupo sanguíneo Rh. En seres humanos, el antí-geno Rh D es expresado solamente en eritrocitos (Cartron, Blood Rev. 6:199, 1994). Se sembraron células K562 en 1,0 ml a 2,0 X 105 células/ml en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 6 pocillos durante 72 horas con 2,5, 10,0, 25,0, 50,0 o 100,0 g de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3. La expresión de Rh D en la superficie celular se monitorizó mediante citometría de flujo. Tras la incubación, las célu-las K562 se lavaron dos veces mediante centrifugación con PBS, y se marcaron con anticuerpo monoclonal anti-Rh D con-jugado con ficoeritrina (PE) (IBGRL research product, Bris-tol, Países Bajos) durante 30 minutos a 4ºC. Tras lavar dos veces con PBS-seroalbúmina bovina al 1%, se determinó en-tonces la fluorescencia celular. Se llevó a cabo una cito-metría de flujo en un clasificador celular FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA, USA), y se analizó usando el programa CELLQuest (Becton Dickinson). Se determinó el número de veces de incremento en el nivel de Rh D con res-pecto al control (0 g de oligonucleótido). Las células K562 no tratadas fueron esencialmente negativas para este marcador.

Tabla 2

Número de veces de incremento en el nivel de Rh D con res-pecto al control en K562 tratadas con SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 3

SECUENCIA

Concentración (g/ml)

2,5

10 25 50 100

SEC ID NO: 2

1,7 x 2,5 x 4,6 x 9,8 x 15,4 x

SEC ID NO: 3

2,0 x 2,2 x 2,9 x 6,5 x 4,7 x

Como se muestra en la Tabla 2, SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 3 indujeron la expresión del antígeno Rh D en la super-ficie celular de K562, una medida de la diferenciación eri-troide.

Ejemplo 5

Aumento del antígeno CD41a en células K562 cultivadas con SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3

El antígeno CD41a, también denominado GpIIb/IIIa, se expresa en plaquetas y megacariocitos (Gruel et al., Blood 68:488, 1986). Se sembraron células K562 en 1,0 ml a 2,0 X 105 células/ml en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 6 pocillos durante 72 horas con 2,5, 10,0, 25,0, 50,0 ó 100,0 g de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3. La expre-sión de CD41a en la superficie celular se monitorizó me-diante citometría de flujo. Tras la incubación, las células K562 se levaron dos veces mediante centrifugación con PBS, y se marcaron con anticuerpo monoclonal anti-CD41a conjuga-do con ficoeritrina (PE) (BD Pharmingen, Mississauga, Onta-rio, Canadá) durante 30 minutos a 4ºC. Tras lavar dos veces con PBS-seroalbúmina bovina al 1%, se determinó entonces la fluorescencia celular. Se llevó a cabo una citometría de flujo en un clasificador celular FACSCalibur (Becton Dic- kinson), y se analizó usando el programa CELLQuest (Becton Dickinson). Se determinó el número de veces de incremento en el nivel de CD41a con respecto al control (0 g de oli-gonucleótido). Las células K562 no tratadas fueron esen-cialmente negativas para este marcador.

Tabla 3

Número de veces de incremento en el nivel de CD41a con res-pecto al control en células K562 tratadas con SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3

SECUENCIA

Concentración (g/ml)

2,5

10 25 50 100

SEC ID NO: 2

3,0 x 3,9x 12,3x 20,6x 18,9x

SEC ID NO: 3

3,2x 3,7x 8,3x 13,4x 11,7x

Como se muestra en la Tabla 3, SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 3 indujeron la expresión del antígeno CD41a, una medida de la diferenciación de megacariocitos, en la superficie celular de células K562.

Ejemplo 6

Aumento del antígeno CD14 en células K562 cultivadas con SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3.

El antígeno CD14, se expresa en grandes cantidades en monocitos. Adicionalmente, CD14 se expresa en macrófagos interfoliculares, células dendríticas reticulares y algunas células de Langherans (Wright et al., Science 249:1434, 1990). Se sembraron células K562 en 1,0 ml a 2,0 X 105 cé-lulas/ml en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 6 pocillos durante 72 horas con 2,5, 10,0, 25,0, 50,0 ó 100,0 g de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3. La expresión de CD14 en la superficie celular se monitorizó mediante cito-metría de flujo. Tras la incubación, las células K562 se levaron dos veces mediante centrifugación con PBS, y se marcaron con anticuerpo monoclonal anti-CD14 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (BD Pharmingen) duran-te 30 minutos a 4ºC. Tras lavar dos veces con PBS-seroalbúmina bovina al 1%, se determinó entonces la fluo-rescencia celular. Se llevó a cabo una citometría de flujo en un clasificador celular FACSCalibur (Becton Dickinson), y se analizó usando el programa CELLQuest (Becton Dickin-son). Se determinó el número de veces de incremento en el nivel de CD14 con respecto al control (0 g de oligonucleó-tido). Las células K562 no tratadas fueron esencialmente negativas para este marcador.

Tabla 4

Número de veces de incremento en el nivel de CD14 con res-pecto al control en células K562 tratadas con SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3

SECUENCIA

Concentración (g/ml)

2,5

10 25 50 100

SEC ID NO: 2

1,8x 1,9x 3,9x 7,2x 9,8x

SEC ID NO: 3

1,9x 2,8 x 3,8x 7,2x 3,7x

Como se muestra en la Tabla 4, SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 3 indujeron la expresión del antígeno CD14, una medida de la diferenciación de monocitos, en la superficie celular de células K562.

Ejemplo 7

Inducción de fenotipo CD14+Rh D+, CD14+ CD41a+ y Rh D+CD41a+ en células K562 cultivadas con SEC ID NO: 2.

Se sembraron células K562 en 1,0 ml a 2,0 X 105 célu-las/ml en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 6 pocillos durante 72 horas con 2,5, 10,0, 25,0, 50,0 ó 100,0 g de SEC ID NO: 2. La expresión de CD14, CD41a y Rh D en la superficie celular se monitorizó mediante citometría de flujo bidimensional. Tras la incubación, las células K562 se levaron dos veces mediante centrifugación con PBS, y se marcaron con anticuerpo monoclonal anti-CD14 conjugado con FITC, anti-CD41a conjugado con PE y/o anti-Rh D conjugado con PE (BD Pharmigen) durante 30 minutos a 4ºC. Después de lavar dos veces con PBS-1% de seroalbúmina bovina, entonces se determinó la fluorescencia celular. Se llevó a cabo una citometría de flujo en un clasificador celular FACSCalibur (Becton Dickinson), y se analizó usando el programa CELL-Quest (Becton Dickinson). Se determinó el número de veces de incremento en el nivel de CD14+Rh D+, CD14+CD41a+ y Rh D+CD41a+ con respecto al control (0 g de oligonucleótido). Las células K562 no tratadas fueron esencialmente negativas para estos marcadores.

Tabla 5

Número de veces de incremento en los niveles de CD14+Rh D+, CD14+CD41a+ y Rh D+CD41a+ en células K562 tratadas con SEC ID NO: 2

FENOTIPO

Concentración (g/ml)

2,5

10 25 50 100

CD14+Rh D+

4,0 x 7,0 x 16,0 x 34,0 x 41,0 x

CD14+CD41a+

2,0 x 2,0 x 4,0 x 11,0 x 22,0 x

Rh D+CD41a+

20,0 x 22,0 x 45,0x 87,0 x 100,7x

Como se muestra en la Tabla 5, SEC ID NO: 2 indujo la diferenciación de células K562 en células con fenotipos heterogéneos.

Ejemplo 8

Inducción de fenotipo CD14+Rh D+, CD14+CD41a+ y Rh D+CD41a+ en células K562 cultivadas con SEC ID NO: 3.

Se sembraron células K562 en 1,0 ml a 2,0 X 105 célu-las/ml en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 6 pocillos durante 72 horas con 2,5, 10,0, 25,0, 50,0 ó 100,0 g de SEC ID NO: 3. La expresión de CD14, CD41a y Rh D en la superficie celular se monitorizó mediante citometría de flujo bidimensional. Tras la incubación, las células K562 se levaron dos veces mediante centrifugación con PBS, y se marcaron con anticuerpo monoclonal anti-CD14 conjugado con FITC, anti-CD41a conjugado con PE y/o anti-Rh D conjugado con PE (BD Pharmigen) durante 30 minutos a 4ºC. Después de lavar dos veces con PBS-1% de seroalbúmina bovina, entonces se determinó la fluorescencia celular. Se llevó a cabo una citometría de flujo en un clasificador celular FACSCalibur (Becton Dickinson), y se analizó usando el programa CELL-Quest (Becton Dickinson). Se determinó el número de veces de incremento en el nivel de CD14+Rh D+, CD14+CD41a+ y Rh D+CD41a+ con respecto al control (0 g de oligonucleótido). Las células K562 no tratadas fueron esencialmente negativas para estos marcadores.

Tabla 6

Número de veces de incremento en los niveles de CD14+Rh D+, CD14+CD41a+ y Rh D+CD41a+ en células K562 tratadas con SEC ID NO: 3

FENOTIPO

Concentración (g/ml)

2,5

10 25 50 100

CD14+Rh D+

7,0 x 8,0 x 9,0 x 11,0 x 10,0 x

CD14+CD41a+

2,0 x 3,0 x 4,0 x 4,0 x 3,0 x

Rh D+CD41a+

6,0 x 4,0 x 7,0x 29,0 x 31,0 x

Como se muestra en la Tabla 6, SEC ID NO: 3 indujo la diferenciación de células K562 en células con fenotipos heterogéneos.

Ejemplo 9

Inhibición del crecimiento de células K562 mediante SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 3.

Se ha informado que la diferenciación terminal de cé-lulas K562 detiene su crecimiento celular (Bianchi et al., Biochem. Pharmacol, 60:31, 2000). Se sembraron células K562 en 1,0 ml a 2,0 X 105 células/ml en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 6 pocillos durante 72 horas con 1,0, 10,0 ó 100,0 g de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3. Las células se contaron después de 24, 48 y 72 horas de incuba-ción, usando microscopía de luz y colorante de azul de tri-pano.

Tabla 7

Número de células K562 (x 105) después del tratamiento con SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3

Horas

Sin oligonu-cleótido SEC ID NO: 2 SEC ID NO: 3

1,0 g/ml

10,0 g/ml 100,0 g/ml 1,0 g/ml 10,0 g/ml 100,0 g/ml

24

3,6 3,1 2,5 2,6 3,3 2,7 3,2

48

7,4 7,8 6,4 2,2 8,4 7,1 3,4

72

11,5 11,3 8,5 1,7 11,2 8,4 3,3

Como se muestra en la Tabla 7, SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 3 inhibieron el crecimiento celular de células K562 de una manera dependiente de la dosis. El ensayo de exclusión con azul de tripano demostró que el tratamiento de células K562 con SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3 no fue citotóxico, puesto que no se incorporó el colorante azul de tripano por las células K562.

Ejemplo 10

Diferenciación de precursor eritroide comprometido humano mediante SEC ID NO: 2

La glicoforina A es la glucoproteína principal de la membrana eritrocítica humana. La maduración de precursores eritroides humanos comprometidos se caracterizada por la expresión de glicoforina A en la superficie celular, y por un incremento en la granulosidad intracelular (Daniel y Greens, Vox Sang. S2:149, 2000; Wheater et al., Functional Histology, a text and color atlas, 2ª edición, Churchill Livingstone, U.K., 1987). Se aislaron precursores eritroi- des comprometidos humanos definidos por la glucoproteína CD36 de la superficie celular a partir de progenitores de CD34+ de sangre de cordón umbilical humana expandidos, me-diante inmunoselección positiva de células CD36+ (Clone-tics, San Diego, CA, USA). Se sembraron células eritroides comprometidas humanas en 1,0 ml a 1,5 X 105 células/ml en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 6 pocillos durante 96 horas con 100,0 g de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3. La expresión de glicoforina A en la superficie celular y la granulosidad intracelular se monitorizaron mediante ci-tometría de flujo. Después de 48 y 96 horas de incubación, las células eritroides comprometidas humanas se lavaron dos veces mediante centrifugación con PBS, y se marcaron con anticuerpo monoclonal anti-glicoforina A conjugado con PE (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA) durante 30 minu-tos a 4ºC. Después de lavar dos veces con PBS-1% de seroal-búmina bovina, se determinó la fluorescencia celular. La granulosidad intracelular se determinó por la medida de la dispersión de luz lateral (SSC) usando un citómetro de flu-jo. La citometría de flujo se llevó a cabo en un FACSCali-bur (Becton Dickinson), y se analizó usando el programa CELLQuest (Becton Dickinson). Se determinaron los porcenta-jes de células en SSChi glicoforina A+ y en SSClo glicofori-na A+. SSChi se define como > 450 unidades; SSClo se define como < 450 unidades.

Tabla 8

Porcentajes de células precursoras eritroides comprometidas humanas en SSChi glicoforina A+ y en SSClo glicoforina A+ después del tratamiento con SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3.

Ninguna SEC ID NO: 2 SEC ID NO: 3

48 h

96 h 48 h 96 h 48 h 96 h

SSChi glicoforina A+

0,9 1,2 8,0 12,8 0,6 0,4

SSClo glicoforina A+

9,1 3,8 9,3 18,1 7,4 2,2

Como se muestra en la Tabla 8, SEC ID NO: 2 indujo la diferenciación de células precursoras eritroides comprome-tidas humanas en células SSChi glicoforina A+ y en células SSClo glicoforina A+.

Ejemplo 11

Efecto de SEC ID NO: 2 sobre células K562 de leucemia mie-loide crónica diseminada humana en ratones con inmunodefi-ciencia combinada grave

Cuarenta ratones hembras con inmunodeficiencia combi-nada grave (ratones SCID) se expusieron a 1,8 Gy de radia-ción (tasa: 7,5 Gy/h) a partir de una fuente de radiación . Veinticuatro horas después de la irradiación completa del cuerpo (día 0), los 40 ratones SCID hembras se pesaron y se distribuyeron al azar para formar 4 grupos (10 rato-nes/grupo). El peso corporal medio de cada grupo no fue es-tadísticamente diferente de los otros (análisis de varian-za). A los ratones se les inyectó intraperitonealmente (ip) 2,0 x 107 células K562 en 0,5 ml de medio RPMI-1640. Se ad-ministró ip SEC ID NO: 2 (5’GGGTGG3’), resuspendido en clo-ruro de sodio USP al 0,9%, a 0,01, 0,1 y 1 mg por ratón por día desde el día 1 hasta el día 29 (30 días). Al grupo del vehículo se le inyectó ip vehículo (cloruro de sodio USP al 0,9%) siguiendo el mismo calendario. El calendario del tra-tamiento se resume en la tabla a continuación:

Tabla 9

Grupo

Tratamiento Ratones/ grupo Vía de admin. Dosis/iny. (mg/ratón/iny.) Vol./iny. (ml) Calendario de Trata-miento

1

vehículo 10 ip 0 0,250 Q1DX30

2

SEC ID NO: 2 10 ip 0,01 0,250 Q1DX30

3

SEC ID NO: 2 10 ip 0,1 0,250 Q1DX30

4

SEC ID NO: 2 10 ip 1 0,250 Q1DX30

El experimento se detuvo a los 120 días, cuando se sacrificaron los ratones. La supervivencia se registró dos veces por semana.

Se determinó la evaluación del ensayo expresada como un porcentaje (T/C%) y como el valor de la esperanza de vi-da incrementada (ILS%) de la evaluación del control. Estas son medidas de la eficacia de los compuestos ensayados. Los sistemas de supervivencia indican un grado de éxito cuando los porcentajes de T/C superan 125, y los porcentajes de ILS superan 25. T es el tiempo de supervivencia de la me-diana de animales tratados con fármacos, y C es el tiempo de supervivencia de la mediana de animales del control. T/C% e ILS% se expresan según lo siguiente:

ILS% = [(T-C)/C] x 100

T/C% = [T/C] x 100

Se realizó un análisis estadístico usando StatViewe (Abacus Concept, Berkeley, USA). El análisis estadístico de la eficacia del tratamiento se llevó a cabo usando el test de Bonferroni/Dunn (comparación de ANOVA).

Tabla 10

Tiempo de supervivencia de ratones SCID que tienen leucemia de K562 mieloide crónica diseminada humana tratada con SEC ID NO: 2

TRATAMIENTO

Grupo 1: ve-hículo Grupo 2: 0,01 mg de SEC ID NO: 2 Grupo 3: 0,1 mg de SEC ID NO: 2 Grupo 4: 1 mg de SEC ID NO: 2

Tiempo de supervivencia (Días) Tiempo de super-vivencia (Días) Tiempo de su-pervivencia (Días) Tiempo de super-vivencia (Días)

38 120 85 49

54 57 34 120

46 54 57 41

54 75 75 57

34 120 34 57

38 120 31 99

34 120 64 61

54 61 54 61

75 61 64 46

54 34 41 46

34 38 34 49

Media ± sd

48,6 ± 12,2 78,2 ± 34,9 52,1 ± 18,7 62,4 ± 24,6

mediana

46 61 41, 49

ILS%

- 32,6 -12,2 6,5

T/C%

- 132,6 89,1 106,5

Como se muestra en la Tabla 10, SEC ID NO: 2, a 0,01 mg/ratón/día, aumentó significativamente la esperanza de vida de ratones SCID que tienen leucemia en células K562 de mieloide crónica diseminada humana (p < 0,05). Después de 120 días, 4 de 11 ratones tratados con SEC ID NO: 2 a 0,01 mg/ratón/día, estaban vivos, mientras que ninguno de los 11 ratones sin tratar estaba vivo.

Ejemplo 12

Efecto de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4 sobre la diferenciación de células derivadas de médu-la ósea procedentes de ratones

Los ratones C57BL/6 se dividieron en 5 grupos de 10 ratones. Los ratones recibieron radiación gamma para indu-cir una reducción en el número de células derivadas de mé-dula ósea y células precursoras de médula ósea. En el día 0, los ratones del grupo 1 recibieron disolución salina, el grupo 2 recibió SEC ID NO: 1, el grupo 3 recibió SEC ID NO: 2, el grupo 4 recibió SEC ID NO: 3, el grupo 5 recibió SEC ID NO: 4. Las secuencias, resuspendidas en cloruro de sodio USP al 0,9%, se administran ip a 0,01 mg por ratón por día durante 7 días.

Después de 7 días de tratamiento, se sacrificó a los ratones. Se contaron las células presentes en la sangre pe-riférica y en la médula ósea, y se determinó su fenotipo mediante citometría de flujo. También se determinaron los niveles de hemoglobina. Los ratones en los grupos 2, 3, 4 y 5 tienen más células derivadas de médula ósea que los rato-nes en el grupo 1. Los ratones en los grupos 2, 3, 4 y 5 tienen más células derivadas de médula ósea maduras que los ratones en el grupo 1. Los niveles de hemoglobina son más elevados en ratones en los grupos 2, 3, 4 que en los rato-nes en el grupo 1.

Ejemplo 13

Efecto de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4 sobre CML en ratones SCID

Se inocularon células K562 (2 x 107 células) en rato-nes SCID (ratones con inmunodeficiencia combinada grave), como se describe previamente (Beran et al., Hematol. Pat-hol. 8:135, 1994). Los ratones se dividieron en 5 grupos de 10 ratones. En el día 0, los ratones del grupo 1 recibieron disolución salina, los ratones del grupo 2 recibieron SEC ID NO: 1, los ratones del grupo 3 recibieron SEC ID NO: 2, los ratones del grupo 4 recibieron SEC ID NO: 3, los rato-nes del grupo 5 recibieron SEC ID NO: 4. Las secuencias, resuspendidas en cloruro de sodio USP al 0,9%, se adminis-tran ip a 0,01 mg por ratón por día durante 30 días.

Después de 30 días, los ratones se sacrifican. Se analiza la diseminación leucémica, el fenotipo de células leucémicas y los niveles de hemoglobina. Los ratones en el Grupo 1 tienen la mayor parte de células y diseminación leucémicas. Los ratones en los grupos 2, 3, 4 y 5 tienen menos células y diseminación leucémicas. Los ratones en los grupos 2, 3, 4 y 5 muestran un mayor número de células K562 diferenciadas que los ratones en el grupo 1. Los ratones en los grupos 2, 3, 4 y 5 muestran mayor síntesis de hemoglo-bina que los ratones en el grupo 1.

Claims (7)

1.- Uso de una secuencia nucleotídica de fosfodiés-ter sintética, químicamente no modificada, 3’-OH, 5’-OH SEC ID NO: 4, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para inducir la diferen-ciación eritroide de células.

2.- El uso de la reivindicación 1, en el que el me-dicamento es para tratar anemia.

3.- El uso de la reivindicación 1, en el que la in-ducción de la diferenciación eritroide es inducción de fe-notipo similar a eritrocito, o inducción de síntesis de hemoglobina en células.

4.- Uso de una secuencia nucleotídica de fosfodiés-ter sintética, químicamente no modificada, 3’-OH, 5’-OH, seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 3, y un vehículo farmacéuticamente acep-table, para la preparación de un medicamento para incremen-tar la diferenciación de células pluripotentes.

5.- El uso de la reivindicación 4, en el que las células pluripotentes derivan de médula ósea, hígado, bazo, ganglios linfáticos, timo o sangre de cordón umbilical.

6.- El uso de la reivindicación 4, en el que el me-dicamento se administrará después de quimioterapia o radio-terapia.

7.- Uso de una secuencia nucleotídica de fosfodiés-ter sintética, químicamente no modificada, 3’-OH, 5’-OH, seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 3, y un vehículo farmacéuticamente acep-table, para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad que se selecciona del grupo que consiste en un trastorno sanguíneo no maligno, hemoglobinopatía, asma drepanocítica, síndrome mielodisplásico, pancitopenia, ane-mia, trombocitopenia o leucopenia.