KR101607629B1

KR101607629B1 - miRNA를 이용한 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료

Info

Publication number: KR101607629B1
Application number: KR1020140183427A
Authority: KR
Inventors: 윤승규; 김정희; 이은별; 최정은
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2016-03-30

Abstract

본 발명은 miR-99a-5p 를 이용한, C형 간염 바이러스(hepatitis C virus, HCV) 감염 질환의 예방 또는 치료에 관한 것이다.

Description

miRNA를 이용한 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 {Prevention or treatment for hepatitis C virus infectious disease using miRNA}

C형 간염 바이러스(hepatitis C virus, HCV)는 전세계적으로 대략 1억 8천만의 사람들이 감염되어 있으며, HCV에 감염된 환자는 급성 간염을 거쳐 일부는 완치되나 대부분(50-80%)의 환자의 경우 만성 감염으로 진행된다. 이러한 만성 간염 환자의 약 20%는 간경화 및 간암이 발병하는 것으로 알려져 있다.

현재 HCV에 대한 백신은 상용화된 것이 없어 의학적 접근의 예방은 불가능한 상황이고, HCV의 표준치료법으로 페길화 인터페론(peg-IFN-α)과 뉴클레오사이드 유사체인 리바비린(ribavirin)의 병행 치료를 사용하고 있으나, 독감 유사 증상(flu like symptom; 발열, 피로, 근육통, 두통 및 오한 등), 빈혈, 호중구 감소증(Neutropenia), 혈소판 감소증(Thrombocytopenia), 혈청 ALT 상승, 신경정신과적 이상, 갑상선 기능 이상, 호흡기 관련 질환(간질성 폐렴 등), 안과적 이상(망막 출혈, 색각 소실 등), 피부 질환(홍반, 발진 등) 또는 탈모 등의 부작용이 있을 수 있다.

또한, 상기 HCV 표준치료법은 HCV의 유전자형(genotype)에 따라 제한적인 효과를 보인다. 유전자형 2와 유전자형 3에 대해서는 약 80%의 지속적인 바이러스성 반응율(sustained virological response, SVR; 치료 종료 후 6개월 동안 혈중 HCV가 검출되지 않는 상태)을 나타내나, 유전자형 1과 유전자형 4는 지속적인 바이러스성 반응율이 50% 미만으로, 재발 가능성이 높다.

최근, 페길화 인터페론과 리바비린 병행치료의 제한적 효과를 극복하고자 DAA(Direct-Acting Antivirals)개념의 치료제 개발이 이루어졌으며, HCV NS3-NS4A 단백질 저해효소(protease inhibitors)로 텔라프레비어(telaprevir)와 보세프레비어(boceprevir)가 승인을 받아 사용되고 있다. 그러나 이들 치료제 역시 유전자형 1b에 제한적으로 효과가 나타나는 것으로 알려져 있으며 치료제 저항성이 우려되고 있다.

따라서, HCV 표준치료법이 듣지 않는 환자들에게 적용될 수 있고, 유전자형에 제한없이 적용 가능한 항-HCV 약물의 개발이 절실한 상태이다.

US 2013-0324589 (2013.12.05) US 2011-0117565 (2011.05.19)

이에, 본 발명자들은 HCV 의 복제를 억제하는 miRNA를 발굴하고, 그 효능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 miR-99a-5p 를 포함하는, C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 miR-99a-5p 의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, C형 간염 바이러스 감염 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 목적은 miR-99a-5p 를 포함하는, C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 HCV 감염 환자의 혈청 및 HCV 감염 세포에서 miR-99a-5p의 발현이 유의적으로 감소하고, miR-99a-5p 를 과발현시킨 세포에 HCV 감염시 HCV의 RNA 가 감소하는 것을 확인함으로써, miR-99a-5p 의 항-HCV 효능을 규명하였다.

따라서, miR-99a-5p 는 항-HCV 효능을 나타내며 이를 통해 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제로 개발될 수 있다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 C형 간염 바이러스(hepatitis C virus) 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 miR-99a-5p 의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, C형 간염 바이러스 감염 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 miR-99a-5p 를 포함하는, C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

마이크로 알앤에이(microRNA, miRNA 또는 miR) 는 다양한 유전자 발현을 조절하는 non-coding RNA을 말하며, mRNA의 번역을 억제하거나, mRNA의 분해를 유도함으로써 전사 후 단계에서 유전자의 발현을 억제하거나 타겟 RNA의 분해를 유도한다. 전사 후 조절은 세포 내 신호전달과 같이 정확하고 정밀한 유전자 발현이 요구되는 과정에서 강력한 조절 방법으로 이용되고 있으며, 외부자극에 의한 유전자의 발현변화 중 절반 정도가 전사 후 단계에서 조절되므로, 전사 후 조절이 전체 유전자의 발현조절에서 매우 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. 몇몇 연구에서는 miRNA는 세포 분화, 증식, 세포사멸, 발생, 면역, 물질대사 및 줄기세포 유지 등과 같은 많은 생물학적 과정을 통제하는 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. miRNA 는 펩타이드나 항체 치료제와 달리 개발 기간이 짧고, 확실한 질환 표적 유전자만 밝혀진다면 이론적으로 모두 치료제를 개발할 수 있다는 장점이 있다. 또한, miRNA는 일반적으로 1개가 아닌 복수의 표적 유전자의 발현을 동시에 조절함으로 매우 높은 특이성과 효능을 가지고 있다.

본 발명에서, miR-99a-5p 는 인간을 포함한 동물, 예를 들어 원숭이, 침팬지, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등으로부터 유래할 수 있으며, 인간 유래의 것이 바람직하다.

본 발명에서, miR-99a-5p 를 구성하는 핵산 분자는 각각 18 내지 100 nt(nucleotide) 길이를 가질 수 있다. 바람직한 일예로, 상기 핵산 분자는 19 내지 25nt 길이, 더욱 바람직하게는 21, 22 또는 23nt 길이의 성숙 miRNA 형태일 수 있고, 바람직한 다른 일예로 50 내지 100nt, 더욱 바람직하게는 65-95nt 길이의 전구체 miRNA 형태일 수도 있다.

상기 성숙 miRNA 또는 전구체 miRNA 형태의 miR-99a-5p 핵산 분자의 염기서열 정보는 미국국립보건원 유전자은행(NIH GenBank) 및 miRBASE(http://www.mirbase.org/) 등의 공지된 유전자데이터베이스에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간 miR-99a-5p 의 성숙 형태의 염기서열은 유전자 등록번호 MIMAT0000097(서열번호 1), 전구체 형태는 MI0000101(서열번호 2)로 등록되어 있다.

유전자 이름	서열정보		서열번호
hsa-miR-99a-5p	성숙형태	aacccguagauccgaucuugug	1
hsa-miR-99a-5p	전구체 형태	cccauuggcauaaacccguagauccgaucuuguggugaaguggaccgcacaagcucgcuucuaugggucugugucagugug	2

또한, 본 발명에서 사용되는 miR-99a-5p 는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, miRNA 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실, 치환 또는 삽입에 의해 변형되더라도 상기 miRNA 핵산 분자와 기능적으로 동등한 작용을 할 수 있는 변이체를 포함하는 개념이다. 예를 들어, 본 발명의 miR-99a-5p 는 각 해당 서열번호의 염기서열과 80% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 것을 포함할 수 있다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘을 이용하여 뉴클레오티드의 서열을 표적 유전자의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 miRNA 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 성숙 miRNA 분자는 주로 단일 가닥으로 존재하지만, 전구체 miRNA 분자는 이중가닥을 형성할 수 있는 부분적인 자가-상보적인 구조(예를 들어 스템-루프 구조)를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 분자는 RNA, PNA(peptide nucleic acids) 또는 LNA(locked nucleic acid) 같은 형태로 구성될 수 있다.

본 발명의 상기 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 상기 miR-99a-5p 의 발현을 증가시키기 위하여, miR-99a-5p 핵산을 포함하는 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 상기 miRNA 자체를 포함할 수도 있으나 이와 기능적으로 동등한 단편을 포함할 수도 있으며, 상기 miRNA 의 단편은 상기 miRNA 의 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 종자 서열(seed sequence)은 miRNA가 타겟을 인식할 때 완전한 상보성을 가지고 결합하는 miRNA 내 일부 영역의 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 이는 miRNA가 타겟에 결합하기 위해 필수적으로 요구되는 부분이다. 또한, 상기 miRNA는 성숙 형태의 miRNA, 전구체 형태의 miRNA일 수 있다.

miR-99a-5p 가 생체에 투여될 경우 세포 내에서 miRNA가 활성화되어 기능하는 경로에 관여하여 miRNA의 발현 수준을 증가 시키거나, 활성을 증대시킬 수 있다. 또한, miRNA에 직접적으로 작용하거나 또는 miRNA의 상위 조절자에 간접적으로 작용하여 miRNA의 발현을 전사 수준에서 증대시키거나, 발현된 miRNA의 분해를 감소시키거나, 그 활성을 증대함으로써, miRNA의 발현 수준 또는 그 활성을 증대시킬 수 있다.

본 발명에서, miR-99a-5p 핵산 분자는 벡터에 포함되거나 세포에 도입된 형태로 제공될 수 있다.

일 구현예로, 상기 miRNA 핵산 분자는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함되어 제공될 수 있다. 본 발명에서 miRNA 핵산 분자는, 핵산 및 DEAE-덱스트란의 복합체, 핵산 및 핵 단백질의 복합체, 핵산 및 지질의 복합체 등의 다양한 형질도입 기술을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있는데, 이를 위해 상기 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태로 제공될 수 있다. 바람직하게, 상기 전달체는 벡터일 수 있고, 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 벡터(viral vector)로서 예를 들면, 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 발현 벡터는, 형질도입된 세포의 선별을 용이하게 하기 위하여 선별마커를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들, 예를 들어 녹색 형광 단백질, 퓨로마이신, 네오마이신, 하이그로마이신, 히스티디놀 디하이드로게나제(hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Gpt) 등을 예시할 수 있다.

다른 일구현예로, 본 발명에서 miRNA 핵산 분자는, 세포에 도입된 형태로 제공될 수 있다. 이러한 세포는 miRNA 핵산 분자를 높은 수준으로 발현할 수 있게 되며, 이러한 세포를 간 조직에 이식함으로써 HCV 감염으로부터 개체를 보호할 수 있다.

세포 내로 도입하는 방법으로는, G-fectin, Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀을 포함하는 전달시약과 함께 세포 내로 도입되거나, 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 세포 내 흡수를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

본 발명에서 C형 간염 바이러스 감염 질환이란, C형 간염 바이러스가 감염되어 발생할 수 있는 질환을 말한다. 구체적으로, C형 간염 바이러스에 의해 발생한 C형 간염, 이러한 C형 간염 상태가 만성화 되어 발생될 수 있는 C형 간염 바이러스에 의한 간섬유화, 간경화 및 간암일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, C형 간염 바이러스가 감염되어 발생하는 모든 질병일 수 있다.

일 구현예로, 본 발명의 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 치료 효율을 증가시키기 위해 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 다른 치료법과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체란, 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 예를 들어, 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 용액 또는 현탁액(예를 들어, 마이크로입자, 리포솜, 또는 세포와 통합된) 형태로 제제화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조되어 투여될 수 있다. 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 핵산 분자의 바이러스성 또는 비바이러스성 기술에 의한 운반 또는 핵산 분자를 발현하는 세포의 이식을 포함한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물 및 치료 방법은 HCV 감염이 발생할 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

본 발명의 조성물의 유효량의 범위 또는 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 및 조사되는 방사선량을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 1일 당 0.001 ㎍/kg-100 mg/kg(체중)으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적에 적합한 약학 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물을 이용하면 C형 간염 바이러스의 복제를 저해하여 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료가 가능하다.

도 1은 어떠한 바이러스에도 감염되지 않은 환자(Normal)와 HCV에 감염되어 만성 간 질환(Chronic liver disease, CLD)이 유발된 환자의 혈청에서 각각 정량적 실시간 RT PCR(quantitative Real-time RT PCR)을 통해 miR-99a-5p의 상대적 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 pJFH-1의 구조를 알 수 있는 개열지도를 나타낸다.
도 3은 HCV 가 감염되지 않은 Huh7 세포(Mock 로 표시), 및 HCVcc(Hepatitis C Virus cell culture)를 감염시킨 후 6, 9 및 12일 째 수확한 Huh7 세포(HCVcc Infection 으로 표시)에서 각각 정량적 실시간 RT PCR을 통해 miR-99a-5p의 상대적 발현 정도를 확인한 결과가 유의적인 의미가 있음을 나타낸다.
도 4는 miR-99a-5p의 mimic을 형질도입한 Huh7 세포(miR-99a-5p mimics 로 표시)와 miR-99a-5p의 mimic을 형질도입하지 않은 Huh7 세포(Scrembled로 표시)에서 각각 정량적 실시간 RT PCR을 통해 miR-99a-5p의 상대적 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 Huh7 세포에 miR-99a-5p의 mimic을 형질도입하고 HCVcc(Hepatitis C Virus cell culture)를 감염시킨 후 48시간이 지난 후 수확한 Huh7 세포(miR-99a-5p mimics 로 표시)와, miR-99a-5p의 형질도입 없이 HCVcc 를 감염시킨 Huh7 세포(Scrembled 로 표시)에서 각각 정량적 실시간 RT PCR을 통해 HCV RNA 의 상대적 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. HCV 감염된 만성 간 질환 환자의 혈청에서 miR -99a-5p의 발현 감소 확인

만성 간염을 유발하는 주요 바이러스인 HCV에 감염되어 만성 간 질환(chronic liver disease, CLD)이 유발된 환자의 혈청에서 miR-99a-5p 의 발현 정도를 알아보기 위해 miR-99a-5p 프로브를 이용한 정량적 실시간 RT PCR(quantitative Real-time RT PCR)을 실시하였다.

서울 성모병원 내원 환자 중 임상시험심사위원회(Institutional Review Board, IRB)에서 승인된 환자에서 HCV에 감염되어 만성 간염(Chronic hepatitis C, CHC)이 유발된 환자 및 대조군으로서 어떠한 바이러스에도 감염되지 않은 환자(Normal)를 선별하고, 그로부터 총 혈액(total blood)을 얻었다. 상기 얻은 혈액에서 원심분리기(centrifuge, HANIL union 32R, 2,000rpm)를 이용하여 혈청을 분리하였다.

분리된 혈청에서 miRNA을 정제하기 위해 Genolution사의 Serum miRNA purification kit를 이용하였다. 추출된 miRNA 에서 miR-99a-5p(서열번호 1)의 특이적인 cDNA를 합성하기 위해 miR-99a-5p의 특이적 프라이머(Assay ID : 435)를　 Applied Biosystems사에 의뢰하여 제작하였으며 이를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA, Lightcycler 480 probe master(Roche), miR-99a-5p 특이적 형광 프로브 및 프라이머(Assay ID : 435)를 이용하여 정량적 실시간 RT PCR 을 수행하였다.

실험 결과, 대조군(Normal)의 혈청에 비하여, HCV에 의해 만성 간 질환이 유발된 환자의 혈청(HCV-CLD)에서 특이적으로 miR-99a-5p의 발현이 유의적으로 감소되어 있는 것을 확인하였다(도 1).

실시예 2. HCV 감염된 Huh7 세포에서 miR -99a-5p의 발현 감소 확인

HCV는 마우스(mouse)와 같은 소 동물에 감염되지 않고, 유일한 동물 모델이 침팬지(chimpanzee)이기 때문에, 현재 HCV 연구의 대부분은 in vitro 감염 모델(infection model)을 통해 이루어지고 있다.

JFH-1 주(strain)을 이용하여 HCVcc(Hepatitis C Virus cell culture; in vitro 세포배양으로 확립된 HCV 감염모델을 통해 배양된 세포에서 얻어진 HCV) 시스템을 구축한 일본 국립 전염병 연구소(National Institute of Infectious Diseases)로부터 감염 클론(infectious clone)인 JFH-1 클론을 포함하는 벡터(vector)인 pJFH-1(도 2)을 제공받아 HCVcc 시스템을 구축하였다.

재조합 HCV 감염 모델(Recombinant infectious HCV model)을 구축하기 위하여 in vitro 전사(transcription)을 통해 합성된 감염성 있는 HCV 게놈(genome)을 전기천공법(electroporation)을 통해 Huh7 세포(한국세포주은행) 에 유입시켰으며 3일 마다 계대하여 세포를 배양하였다.

전기천공 이후 Huh7 세포 내의 HCV RNA는 정량적 실시간 RT PCR 을 통해 확인하였다. Trizol LS reagents(Invitrogen)를 이용하여 총 RNA(total RNA)를 추출하고 추출된 RNA 2μg을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA, Lightcycler 480 probe master(Roche), HCV 5'-UTR 특이적 형광 프로브(서열번호 3) 및 프라이머 (서열번호 4 및 5)를 이용하여 정량적 실시간 RT PCR 을 수행하였다.

유전자 이름	서열(5'→ 3')	서열번호
HCV 5'UTR probe	CTGCGGAACCGGTGAGTACAC	3
HCV 5'UTR Forward Primer	GCGCCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTC	4
HCV 5'UTR Reverse Primer	ACCACAAGGCCTTTCGCAACCCAACGCTAC	5

전기천공(Electroporation) 수행 3일 이후 총 RNA(total RNA) 1μg 당 약 1 x 10⁶개(copies)이상이 검출되었으며 세포 배양액으로 배출된 HCVcc의 양을 HCV RNA 수준을 통해 확인해 본 결과 HCV RNA가 배양액 1ml 당 RNA 1μg당 약 1 x 10⁷개 수준으로 유지되는 것을 확인하였다. 이를 통해 HCV 연구의 실험적 토대가 되는 in vitro HCV 감염 시스템(infectious system)이 구축된 것을 확인하였다.

In vitro HCV 감염 시스템을 이용하여 HCV 감염에 따른 miR-99a-5p의 발현 변화를 확인하였다.　 10-cm 배양접시(culture dish)에 1.5 x 10⁶개의 Huh7 세포를 식종(seeding)한 후 다음날 HCVcc를 감염시켰다. 이후 3일에 한 번씩 세포와 배양액은 1:4 비율로 계대배양 하였다.

HCVcc 감염 시킨 Huh7 세포를 6, 9 그리고 12일 째 수확(harvest)하여 miR-99a-5p의 발현 수준을 정량적 실시간 RT PCR 을 통해 확인하였다. Trizol LS reagents(Invitrogen)를 이용하여 총 RNA(total RNA)를 추출하고 추출된 RNA 2μg을 이용하여 cDNA를 합성하였다. miR-99a-5p의 특이적인 cDNA를 합성하기 위해 miR-99a-5p의 특이적 primer(Assay ID : 435)를　 Applied Biosystems사에 의뢰하여 제작하였으며 이를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA, Lightcycler 480 probe master(Roche), miR-99a-5p 특이적 형광 프로브 및 프라이머(Assay ID : 435)를 이용하여 정량적 실시간 RT PCR 을 수행하였다.

실험 결과, HCV 가 감염된 Huh7 세포에서 특이적으로 miR-99a-5p의 발현이 유의적으로(*P<0.1, **P<0.05) 감소되어 있는 것을 확인하였다(도 3).

실시예 3. miR -99a-5p mimics 처리를 통한 HCV 복제 저해 확인

HCV 감염된 혈청과 세포에서 miR-99a-5p의 발현 감소를 확인하였는 바, 다음으로는 miR-99a-5p의 발현을 인위적으로 증가시켰을 경우, HCV 복제 저해 효과를 확인하였다.

　miR-99a-5p의 과발현을 통한 HCV 복제 저해 효과를 확인하기 위하여 miR-99a-5p의 mimic (서열번호 1)을 제작하였다. miR-99a 는 헤어핀 구조로 되어있으며 이 중 활성 부위(active site)라고 알려진 부위는 5' → 3'으로 이루어진 miR-99a-5p 부분과 3' → 5' 으로 이루어진 miR-99a-3p가 존재한다. 이 중 miR-99a-5p를 Genolution사에 의뢰하여 합성하였으며 miR-99a-5p의 과발현 여부는 Applied Biosystems사의 Assay ID :435를 통한 정량적 실시간 RT PCR 을 통해 확인하였다.

그 결과, miR-99a-5p의 mimic을 형질도입 한 세포에서 miR-99a-5p의 양이 Huh7 세포에 비하여 약 4,000배 정도 증가하는 것을 확인하였다(도 4).

다음으로,　6-cm 배양접시(culture dish)에 7 x 10⁵Huh7 세포를 4.5ml 10% FBS DMEM media에 식종(seeding)하면서 동시에 최종 처리 농도가 50 nM이 되도록 miR-99a-5p를 G-fectin(Genolution)과 500 μl의 PBS에서 혼합(mix)하여 형질도입(transfection)하였다. 다음 날, 혈청이 없는 상태의 DMEM으로 배지로 교체한 후 HCVcc를 감염시켰다. 4시간 후에 다시 10% FBS가 포함되어있는 DMEM으로 교체한 후 48시간이 지난 후에 세포를 수확(harvest)하여 HCV RNA수준을 정량적 실시간 RT PCR 을 통해 확인하였다.

　그 결과, miR-99a-5p를 과발현시킨 후 HCVcc 를 감염시킨 Huh7 세포의 경우, miR-99a-5p의 형질도입 없이 HCVcc 를 감염시킨 Huh7 세포에 비하여 HCV RNA가 약 60% 감소된 것을 확인할 수 있었다(***P<0.005)(도 5). 따라서, miR-99a-5p의 HCV 복제 저해 활성을 확인할 수 있었다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Prevention or treatment for hepatitis C virus infectious disase using miRNA <130> DPP20145980KR <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens, mature miR-99a-5p <400> 1 aacccguaga uccgaucuug ug 22 <210> 2 <211> 81 <212> RNA <213> Homo sapiens, miR-99a-5p precursor <400> 2 cccauuggca uaaacccgua gauccgaucu uguggugaag uggaccgcac aagcucgcuu 60 cuaugggucu gugucagugu g 81 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV 5'UTR probe <400> 3 ctgcggaacc ggtgagtaca c 21 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV 5'UTR Forward Primer <400> 4 gcgcctagcc atggcgttag tatgagtgtc 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV 5'UTR Reverse Primer <400> 5 accacaaggc ctttcgcaac ccaacgctac 30

Claims

miR-99a-5p 를 포함하는, C형 간염, C형 간염 바이러스(hepatitis C virus)에 의한 간섬유화 및 C형 간염 바이러스에 의한 간경화로 이루어진 군에서 선택되는, C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 miR-99a-5p 는 성숙 형태의 miR-99a-5p, 또는 전구체 형태의 miR-99a-5p인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 miR-99a-5p 는 벡터에 포함되거나 세포에 도입된 형태로 제공되는 것인, 약학 조성물.
삭제
miR-99a-5p 를 포함하는, C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 miR-99a-5p 는 성숙 형태의 miR-99a-5p, 또는 전구체 형태의 miR-99a-5p인, 조성물.
제5항에 있어서, 상기 miR-99a-5p 는 벡터에 포함되거나 세포에 도입된 형태로 제공되는 것인, 조성물.