JP6049143B2 - オリゴヌクレオチド、グルココルチコイド感受性増強剤、医薬組成物、及び発現ベクター - Google Patents

オリゴヌクレオチド、グルココルチコイド感受性増強剤、医薬組成物、及び発現ベクター Download PDF

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本発明は、オリゴヌクレオチド、グルココルチコイド感受性増強剤、医薬組成物、及び発現ベクターに関する。
グルココルチコイドは、副腎皮質で作られるホルモンの一種であり、代謝や免疫に関与する。グルココルチコイドは、強い消炎作用及び免疫抑制作用を有することから、その人工合成物がアレルギー疾患や自己免疫性疾患の治療薬として使用されてきた。
また、グルココルチコイドは、がん化したリンパ球に対して増殖抑制作用を有することから、その人工合成物がリンパ腫及びリンパ性白血病の化学療法に用いられてきた。骨髄抑制や激しい消化器症状などの副作用がグルココルチコイド投与で発現することは非常に稀であることから、グルココルチコイドはリンパ腫及びリンパ性白血病に対して必須の治療薬である。
様々な疾患に使用されてきたグルココルチコイドであるが、患者の中にはグルココルチコイドに対する耐性を発現する症例があり、グルココルチコイドが効かないことがある。グルココルチコイド耐性は、喘息患者の５〜１０％、リウマチ患者の約３０％、炎症性腸疾患患者の２０〜５０％、小児の急性リンパ性白血病患者の１０〜２５％にも上ると報告されており、グルココルチコイド耐性を解除する技術の開発が待たれている。
グルココルチコイド受容体（Glucocorticoid receptor、ＧＲ）については、下記の知見が得られている。
ＧＲは、グルココルチコイドと結合すると、核内で転写因子として働く。
ヒトＧＲ遺伝子の塩基配列は既知である（NR3C1、Gene ID：2908、NCBI Reference Sequence：NC_000005.9）。ヒトＧＲ遺伝子には９個のエキソンが存在し、エキソン９（塩基数４１１１）の内部の選択的スプライシングによって、２つのスプライシングバリアント、ＧＲαとＧＲβが作られる。
ＧＲαは、エキソン１〜９が連結した成熟ｍＲＮＡから翻訳される、７７７アミノ酸残基の蛋白質である。ＧＲαはリガンド依存的に核内移行し、転写因子として働く。
ＧＲβは、エキソン１〜８とエキソン９の一部（エキソン９の５’末端側から２６３１〜４１１１番目）とが連結した成熟ｍＲＮＡから翻訳される、７４２アミノ酸残基の蛋白質である。ＧＲβはリガンド結合ドメインの一部が欠損しており、リガンド結合能を有しない。ＧＲβは、核内において、リガンドと結合したＧＲαと競合的に拮抗し、ＧＲαの転写因子活性を阻害する。
細胞のグルココルチコイド耐性に関しては、下記の報告がなされている。
イヌのリンパ腫及び白血病に由来する細胞株（ＣＬ−１細胞、ＧＬ−１細胞）において、Nuclear factor-κB（ＮＦ−κＢ）の機能を阻害することでグルココルチコイド耐性が解除され、グルココルチコイド添加によって細胞増殖が抑制されることが報告されている（例えば、文献１参照）。このことから、ＮＦ−κＢの機能を阻害すると細胞内のＧＲの発現量が増加し、グルココルチコイドの細胞増殖抑制作用が細胞に及びやすくなるものと考えられた。
また、ヒトのバーキットリンパ腫由来のＲａｊｉ細胞及び急性リンパ性白血病患者の末梢血由来細胞において、ｓｉＲＮＡを用いてＮＦ−κＢの機能を阻害すると、グルココルチコイド耐性が解除されることと、ＧＲαの発現量が増加することが報告されている（例えば、文献２参照）。このことから、細胞内においてＧＲαの発現量が増加することで、グルココルチコイド耐性が解除される可能性が示唆された。
ＧＲの発現に関しては、下記の報告がなされている。
大腸癌細胞株（ＨＴ−２９細胞）及び乳癌細胞株（ＭＣＦ−７細胞）において、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であるトリコスタチンＡや酪酸ナトリウム、及びＤＮＡメチル基転移酵素の阻害剤である５−アザ−２’−デオキシシチジンが、ＧＲαの発現量を増加させＧＲβの発現量を減少させることが報告されている（例えば、文献３参照）。そのとき同時にセリン／アルギニンリッチ蛋白質（Serine/arginine-rich protein、ＳＲ蛋白質）の１種であるＡＳＦ／ＳＦ２の発現量が増加していることから、ＡＳＦ／ＳＦ２は、ＧＲのｍＲＮＡのスプライシング制御に関与している可能性が示唆された。ＳＲ蛋白質はスプライシング因子であり、細胞の核内でプレｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのスプライシングを制御する蛋白質である。
ほかに、２８人の健康なボランティアの末梢血白血球におけるｍＲＮＡの発現量を比較した研究で、ＳＲ蛋白質の１種であるセリン／アルギニンリッチ蛋白質３０ｃ（Serine/arginine-rich protein 30c、ＳＲｐ３０ｃ）の発現量と、ＧＲαとＧＲβとの発現量比（ＧＲα／ＧＲβ）に負の相関関係があることが報告されている（例えば、文献４参照）。
さらに、好中球様細胞株（レチノイン酸によって刺激されたＰＬＢ−９８５細胞）において、ＳＲｐ３０ｃをアンチセンスオリゴヌクレオチドによってノックダウンすると、ＧＲβのｍＲＮＡ発現量が減少しＧＲαのｍＲＮＡ発現量が増加することが報告されている（例えば、文献５参照）。
また、ＧＲ遺伝子にはＡＧＧＡＣという５塩基が比較的高い頻度で存在することが見出され、ＳＲｐ３０ｃの認識配列と予想された（例えば、文献６参照）。
以上の知見から、ＧＲ遺伝子のエキソン９内部の選択的スプライシングは、ＳＲ蛋白質の１種であるＳＲｐ３０ｃによって制御されているものと考えられる。即ち、ＧＲのプレｍＲＮＡのエキソン９には、ＳＲｐ３０ｃが結合する部位が存在し、ＳＲｐ３０ｃはこの部位に結合して、ＧＲのプレｍＲＮＡをＧＲβの成熟ｍＲＮＡへとスプライシングさせているものと考えられる。
ただし、ＳＲｐ３０ｃの機能阻害によって細胞のグルココルチコイド感受性が実際に変化するかについては、これまで報告がなく、不明である。
ところで、ＳＲ蛋白質のリン酸化を抑制することで、その機能を阻害する技術が開示されている。例として、ＳＲ蛋白質のリン酸化酵素の阻害剤であるイソニコチンアミド化合物ＳＲＰＩＮ３４０を抗ウイルス剤として用いる技術が開示されている（例えば、文献７及び文献８参照）。
文献１：Matsuda A, et al. Res. Vet. Sci., 2010, 89(3):378-382.
文献２：Matsuda A, et al. The 14th International Congress of Immunology, Aug. 2010, Volume 22, Supplement number 1, p. v8.
文献３：Piotrowska H, et al. Arch. Med. Res., 2009, 40:156-162.
文献４：Watanuki T, et al. J. Affect. Disord., 2008, 110(1-2):62-69.
文献５：Xu Q, et al. J. Biol. Chem., 2003, 278:27112-27118.
文献６：Paradis C, et al. RNA, 2007, 13:1287-1300.
文献７：Karakama Y, et al. Antimicrob. Agents Chemother., 2010, 54(8):3179-318.
文献８：国際公開第２００５／０６３２９３号パンフレット
ＳＲ蛋白質リン酸化酵素の阻害剤によってＳＲ蛋白質のリン酸化を抑制する手段（例えば、文献７及び文献８参照）では、特定のＳＲ蛋白質の活性を制御することは難しく、あらゆるＳＲ蛋白質の活性を抑制してしまうおそれがある。
また、ＳＲｐ３０ｃは、ＧＲのほかに、性腺刺激ホルモン受容体のスプライシングにも関与することが知られており、ＳＲｐ３０ｃのみの活性を抑制した場合でも、生体の恒常性を乱す可能性は否定できない。
副作用を起こすことなく細胞のグルココルチコイド感受性を上げるには、ＳＲｐ３０ｃが担っているＧＲスプライシングバリアント制御を選択的に阻害する技術が要求される。
本発明は、上記状況のもとになされた。
上記状況のもと、細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性を有する新規な化合物が必要とされている。
前記課題を解決することを目的に、本開示は、下記のオリゴヌクレオチド、グルココルチコイド感受性増強剤、医薬組成物、及び発現ベクターを開示する。
＜１＞ 生体内において、グルココルチコイド受容体遺伝子のプレｍＲＮＡとセリン／アルギニンリッチ蛋白質３０ｃ（ＳＲｐ３０ｃ）との結合を妨げるオリゴヌクレオチド。
＜２＞ 配列番号２２に示す塩基配列の連続する一部に相補的な１５〜５０塩基長の塩基配列である、前記＜１＞に記載のオリゴヌクレオチド。
＜３＞ 前記配列番号２２に示す塩基配列の連続する一部は、アデニンとグアニンの合計のモル比が５０％以上の塩基配列である、前記＜２＞に記載のオリゴヌクレオチド。
＜４＞ 配列番号１に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、配列番号２に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、配列番号３に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、配列番号４に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号５に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、のいずれかである、前記＜１＞に記載のオリゴヌクレオチド。
＜５＞ 前記＜１＞〜＜４＞に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を有効成分として含むグルココルチコイド感受性増強剤。
＜６＞ 前記＜１＞〜＜４＞に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含む医薬組成物。
＜７＞ 前記＜１＞〜＜４＞に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含む発現ベクター。
本発明によれば、細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
また、本発明によれば、前記オリゴヌクレオチドを有効成分として含むグルココルチコイド感受性増強剤が提供される。
また、本発明によれば、前記オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物が提供される。
さらに、本発明によれば、前記オリゴヌクレオチドを発現する発現ベクターが提供される。
実施例２における細胞増殖抑制率を示すグラフである。 実施例２における細胞増殖抑制率を示すグラフである。 実施例２における細胞増殖抑制率を示すグラフである。 実施例２における細胞増殖抑制率を示すグラフである。 実施例２における細胞増殖抑制率を示すグラフである。 実施例４における細胞増殖抑制率を示すグラフである。
以下に、本発明の実施の形態について順次説明する。なお、これらの説明および実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
＜オリゴヌクレオチド＞
本発明のオリゴヌクレオチドは、生体内において、グルココルチコイド受容体遺伝子（ＧＲ遺伝子）のプレｍＲＮＡと、セリン／アルギニンリッチ蛋白質３０ｃ（Serine/arginine-rich protein 30c、ＳＲｐ３０ｃ）との結合を妨げるオリゴヌクレオチドである。
前記オリゴヌクレオチドは、グルココルチコイド受容体（Glucocorticoid receptor、ＧＲ）のプレｍＲＮＡがＧＲβの成熟ｍＲＮＡへとスプライシングされることを阻害するので、ＧＲαのＧＲβに対する相対的な発現量を増加させると考えられる。その結果、細胞のグルココルチコイド感受性が上昇すると考えられる。
ＧＲのプレｍＲＮＡのエキソン９に存在しＳＲｐ３０ｃが結合する部位（スプライス要素）の候補として、ＧＲのプレｍＲＮＡのエキソン９の連続する一部であって、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）の合計のモル比が５０％以上である塩基配列が挙げられる。
ＳＲ蛋白質はＡ及び／又はＧが豊富な塩基配列と結合しやすいと考えられており、ＳＲ蛋白質の１種であるＳＲｐ３０ｃも、Ａ及び／又はＧが豊富な塩基配列と結合しやすいと考えられる。したがって、ＧＲのプレｍＲＮＡのエキソン９の連続する一部であって、アデニンとグアニンの合計のモル比が５０％以上である塩基配列は前記スプライス要素である可能性が高い。
上記を理由に、ヒトＧＲ遺伝子（NR3C1、Gene ID：2908、NCBI Reference Sequence：NC_000005.9）のエキソン９から、アデニンとグアニンの合計のモル比が５０％以上（好ましくは６０％以上）である例えば１５〜５０塩基長の塩基配列を選択し、この塩基配列に相補的な１５〜５０塩基長の塩基配列を本発明のオリゴヌクレオチドとしてよい。
このオリゴヌクレオチドは、前記スプライス要素に完全に若しくは部分的に重なってＧＲのプレｍＲＮＡに結合するか、または前記スプライス要素に充分に近い位置でＧＲのプレｍＲＮＡに結合するものと考えられる。そのため、ＳＲｐ３０ｃと前記スプライス要素との結合が阻害され、ＧＲβの成熟ｍＲＮＡの作製が阻害され、ＧＲαのＧＲβに対する相対的な発現量が増加するものと考えられる。その結果、細胞のグルココルチコイド感受性が上がるものと考えられる。
配列番号２２に示す塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子の塩基番号１５６０９１〜１５７５８２に相当し、即ち、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の一部（エキソン９の５’末端側から２６２０〜４１１１番目）に相当する。ＧＲβは、ＧＲのプレｍＲＮＡのエキソン１〜８とエキソン９の一部（ヒトにおいては、エキソン９の５’末端側から２６３１〜４１１１番目）とが連結した成熟ｍＲＮＡから翻訳される蛋白質である。したがって、ヒトＧＲのプレｍＲＮＡの配列番号２２に示す塩基配列内に、前記スプライス要素が存在すると考えられる。
上記を理由に、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号２２に示す塩基配列の連続する一部に相補的な１５〜５０塩基長の塩基配列であることが好ましい。
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号２２に示す塩基配列の連続する一部であってアデニンとグアニンの合計のモル比が５０％以上（より好ましくは６０％以上）である塩基配列に相補的な、１５〜５０塩基長の塩基配列であることがより好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、以下のオリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５のいずれかであることが好ましい。オリゴヌクレオチド１〜５は、細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性を有する。
オリゴヌクレオチド１：配列番号１に示す塩基配列（５’−ＣＴＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＡＡＣＣＡＣＡＴＡＡＣＡＴＴＣＴＡＴＡ−３’）であるオリゴヌクレオチド。
配列番号１の塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の連続する一部（エキソン９の５’末端側から２６２６〜２６５６番目）に相補的な塩基配列である。
オリゴヌクレオチド２：配列番号２に示す塩基配列（５’−ＡＡＡＡＧＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡ−３’）であるオリゴヌクレオチド。
配列番号２の塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の連続する一部（エキソン９の５’末端側から２７９６〜２８２９番目）に相補的な塩基配列である。
オリゴヌクレオチド３：配列番号３に示す塩基配列（５’−ＴＡＡＧＡＴＧＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣＡＣＧＴＡＴＣＣＴ−３’）であるオリゴヌクレオチド。
配列番号３の塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の連続する一部（エキソン９の５’末端側から２８３０〜２８６０番目）に相補的な塩基配列である。
オリゴヌクレオチド４：配列番号４に示す塩基配列（５’−ＴＴＴＧＴＣＣＣＣＡＴＴＡＴＡＴＡＧＣＡＴＴＴ−３’）であるオリゴヌクレオチド。
配列番号４の塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の連続する一部（エキソン９の５’末端側から３７３０〜３７５２番目）に相補的な塩基配列である。
オリゴヌクレオチド５：配列番号５に示す塩基配列（５’−ＣＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＴ−３’）であるオリゴヌクレオチド。
配列番号５の塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の連続する一部（エキソン９の５’末端側から４０８０〜４１００番目）に相補的な塩基配列である。
オリゴヌクレオチド１〜５は、前記スプライス要素に完全に若しくは部分的に重なってＧＲのプレｍＲＮＡに結合するか、または前記スプライス要素に充分に近い位置でＧＲのプレｍＲＮＡに結合するものと考えられる。そのため、ＳＲｐ３０ｃと前記スプライス要素との結合が阻害され、ＧＲβの成熟ｍＲＮＡの作製が阻害され、ＧＲαのＧＲβに対する相対的な発現量が増加するものと考えられる。その結果、細胞のグルココルチコイド感受性が上がるものと考えられる。
オリゴヌクレオチド１〜５は、その塩基配列から、ＧＲのプレｍＲＮＡのエキソン９の特定部位に配列特異的に結合するものと考えられる。そのため、オリゴヌクレオチド１〜５は、ＳＲｐ３０ｃ以外のＳＲ蛋白質の機能には影響を及ぼさず、また、ＳＲｐ３０ｃが制御しているスプライシングのうち、ＧＲのエキソン９以外のスプライシングには影響を及ぼさないと考えられる。
本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５のいずれかと相同性が認められるオリゴヌクレオチドも包含される。
例えば、オリゴヌクレオチド１と相同性が認められるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド１と同等程度の作用を示せばよく、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性、更に好ましくは９５％以上の相同性を有する。オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５のいずれかと相同性が認められるオリゴヌクレオチドについても、上記と同様である。
相同性は、例えば、汎用されている相同性検索アルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（ＮＣＢＩ、又はAltschul, S. F. et al. J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)）を用いた配列比較で決定することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド１と同等程度の作用を示すものであれば、配列番号１と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも包含される。
配列番号１と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド１と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１５〜４５塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１５塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが４５塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、２０〜４０塩基長がより好ましく、２２〜３８塩基長が更に好ましく、２３〜３５塩基長が特に好ましく、２４〜３０塩基長が最も好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド２と同等程度の作用を示すものであれば、配列番号２と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも包含される。
配列番号２と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド２と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１５〜５０塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１５塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが５０塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、２０〜４５塩基長がより好ましく、２５〜４０塩基長が更に好ましく、２８〜３８塩基長が特に好ましく、３０〜３４塩基長が最も好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド３と同等程度の作用を示すものであれば、配列番号３と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも包含される。
配列番号３と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド３と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１５〜４５塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１５塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが４５塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、２０〜４０塩基長がより好ましく、２２〜３８塩基長が更に好ましく、２３〜３５塩基長が特に好ましく、２４〜３０塩基長が最も好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド４と同等程度の作用を示すものであれば、配列番号４と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも包含される。
配列番号４と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド４と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１２〜３５塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１２塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが３５塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、１５〜３２塩基長がより好ましく、１８〜３０塩基長が更に好ましく、２０〜２８塩基長が特に好ましく、２２〜２５塩基長が最も好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド５と同等程度の作用を示すものであれば、配列番号５と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも包含される。
配列番号５と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド５と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１２〜３５塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１２塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが３５塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、１５〜３０塩基長がより好ましく、１６〜２５塩基長が更に好ましく、１８〜２３塩基長が特に好ましく、２０〜２２塩基長が最も好ましい。
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法等に従って行うことができる。
前記ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９ｍＭ〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９ｍＭ〜約２０ｍＭで、温度が約５０℃〜約７０℃、好ましくは約６０℃〜約６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５のいずれかにおいて塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドも包含される。
例えば、オリゴヌクレオチド１において塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド１と同等程度の作用を示せばよく、塩基の欠失、置換又は付加の位置は特に限定されない。オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５のいずれかにおいて塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドについても、上記と同様である。
オリゴヌクレオチド１において、欠失した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１５塩基であり、好ましくは１塩基〜１０塩基であり、より好ましくは１塩基〜５塩基である。置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１０塩基であり、好ましくは１塩基〜５塩基であり、より好ましくは１塩基又は２塩基である。付加した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１５塩基であり、好ましくは１塩基〜１０塩基であり、より好ましくは１塩基〜５塩基である。
オリゴヌクレオチド１において塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド１と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは２０〜４０塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが２０塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが４０塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、２２〜３８塩基長がより好ましく、２３〜３５塩基長が更に好まし、２４〜３０塩基長が特に好ましい。
オリゴヌクレオチド２において、欠失した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１５塩基であり、好ましくは１塩基〜１０塩基であり、より好ましくは１塩基〜５塩基である。置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１０塩基であり、好ましくは１塩基〜５塩基であり、より好ましくは１塩基又は２塩基である。付加した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１５塩基であり、好ましくは１塩基〜１０塩基であり、より好ましくは１塩基〜５塩基である。
オリゴヌクレオチド２において塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド２と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは２０〜４５塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが２０塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが４５塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、２５〜４０塩基長がより好ましく、２８〜３８塩基長が更に好まし、３０〜３４塩基長が特に好ましい。
オリゴヌクレオチド３において、欠失した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１５塩基であり、好ましくは１塩基〜１０塩基であり、より好ましくは１塩基〜５塩基である。置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１０塩基であり、好ましくは１塩基〜５塩基であり、より好ましくは１塩基又は２塩基である。付加した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１５塩基であり、好ましくは１塩基〜１０塩基であり、より好ましくは１塩基〜５塩基である。
オリゴヌクレオチド３において塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド３と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは２０〜４０塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが２０塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが４０塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、２２〜３８塩基長がより好ましく、２３〜３５塩基長が更に好まし、２４〜３０塩基長が特に好ましい。
オリゴヌクレオチド４において、欠失した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１５塩基であり、好ましくは１塩基〜１０塩基であり、より好ましくは１塩基〜５塩基である。置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１０塩基であり、好ましくは１塩基〜５塩基であり、より好ましくは１塩基又は２塩基である。付加した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１５塩基であり、好ましくは１塩基〜１０塩基であり、より好ましくは１塩基〜５塩基である。
オリゴヌクレオチド４において塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド４と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１５〜３２塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１５塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが３２塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、１８〜３０塩基長がより好ましく、２０〜２８塩基長が更に好まし、２２〜２５塩基長が特に好ましい。
オリゴヌクレオチド５において、欠失した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１５塩基であり、好ましくは１塩基〜１０塩基であり、より好ましくは１塩基〜５塩基である。置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１０塩基であり、好ましくは１塩基〜５塩基であり、より好ましくは１塩基又は２塩基である。付加した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基〜１５塩基であり、好ましくは１塩基〜１０塩基であり、より好ましくは１塩基〜５塩基である。
オリゴヌクレオチド５において塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド５と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１５〜３０塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１５塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが３０塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、１６〜２５塩基長がより好ましく、１８〜２３塩基長が更に好まし、２０〜２２塩基長が特に好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴＤＮＡ及びオリゴＲＮＡのみならず、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡ及びホスホロチオエートオリゴＲＮＡであってよい。
ホスホロチオエートヌクレオチドは、ヌクレオチド間の結合部位にあるリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換されたヌクレオチドである。ホスホロチオエートヌクレオチドは、各種の核酸分解酵素に対して耐性があることから、ヌクレオチドよりも安定性が高く好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、安定性の観点から、オリゴＤＮＡが好ましく、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡがより好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、通常のオリゴヌクレオチド合成の方法に従って化学合成することで得ることができる。
また、オリゴヌクレオチド１は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２６２６〜２６５６番目の配列を含む部位を鋳型にして、適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により合成できる。
オリゴヌクレオチド２は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２７９６〜２８２９番目の配列を含む部位を鋳型にして、適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により合成できる。
オリゴヌクレオチド３は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２８３０〜２８６０番目の配列を含む部位を鋳型にして、適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により合成できる。
オリゴヌクレオチド４は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から３７３０〜３７５２番目の配列を含む部位を鋳型にして、適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により合成できる。
オリゴヌクレオチド５は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から４０８０〜４１００番目の配列を含む部位を鋳型にして、適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により合成できる。
本発明において、オリゴヌクレオチドについて言う「細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性」とは、当該オリゴヌクレオチドを細胞に接触させた場合、当該オリゴヌクレオチドを細胞に接触させない場合に比して、細胞のグルココルチコイドに対する感受性を上げる活性をいう。
オリゴヌクレオチドが「細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性」を有するか否かは、当該オリゴヌクレオチドとグルココルチコイドとを細胞に接触させた場合と細胞に接触させない場合とについて、細胞増殖率を比較することで確認できる。例えば、リンパ腫またはリンパ性白血病に由来する細胞に当該オリゴヌクレオチドを導入し、当該細胞の培地にグルココルチコイドを添加して、細胞増殖率が低下することで確認できる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該オリゴヌクレオチドを含む培地で細胞を培養することで、細胞への導入が可能である。このとき、オリゴヌクレオチドとリポフェクタミンとを混合して用いることで、細胞への導入効率を上げることができる。ほかに、電気穿孔法によっても細胞への導入効率を上げることができる。
＜グルココルチコイド感受性増強剤＞
本発明のグルココルチコイド感受性増強剤は、薬学的に許容し得る媒質中に、本発明のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を有効成分として含む。
前記グルココルチコイド感受性増強剤の投与により、細胞におけるＧＲαのＧＲβに対する相対的な発現量を増やすことができる。このため、前記グルココルチコイド感受性増強剤は、生体のグルココルチコイド感受性を増強させる薬剤として用いることができる。
前記グルココルチコイド感受性増強剤の調製に用いられる媒質および製剤用添加物の種類は、特に制限されない。媒質としては、固体媒質（例えば、ゼラチン、乳糖）及び液体媒質（例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液）が挙げられる。製剤用添加物としては、界面活性剤（例えば、糖類、多価アルコール、多価アルコールエステル）、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム）等が挙げられる。
前記グルココルチコイド感受性増強剤は、静脈内投与するのに適した液体媒質に、本発明のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を適当量含有させたものが好ましい。この場合、前記グルココルチコイド感受性増強剤の投与は、適用対象者の静脈内に注射または点滴することにより行われる。
前記グルココルチコイド感受性増強剤は、保存安定性の観点からは、凍結乾燥された状態も好ましい。この場合は用時に液体媒質に溶かして用いればよい。
前記グルココルチコイド感受性増強剤は、通常、副腎皮質ホルモンであるグルココルチコイドと共に用いられる。両者を共に用いる場合、前記グルココルチコイド感受性増強剤は、グルココルチコイドと同時に投与してもよく、グルココルチコイドの投与前に或いはグルココルチコイドの投与後に投与してもよい。
共に用いられるグルココルチコイドは、天然物の精製物でもよく、人工合成物であるステロイド剤（例えば、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン等）でもよい。
前記グルココルチコイド感受性増強剤は、喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患、リウマチや炎症性腸疾患などの自己免疫性疾患、リンパ腫、リンパ性白血病などのステロイド剤の投与対象となりうる全ての患者に投与することができる。
前記グルココルチコイド感受性増強剤は、上記の患者でグルココルチコイド耐性になっている患者に使用するほか、グルココルチコイド耐性になっていない患者にも使用できる。この場合、グルココルチコイド投与量の減量が可能になるという点で有用である。
前記グルココルチコイド感受性増強剤は、対象となる疾患の種類や重傷度などにもよるが、成人１回当たりの有効量として０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの投与が好ましく、０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの投与がより好ましい。投与回数に特に制限はなく、１回投与で用いてもよく、反復投与で用いてもよく、持続投与で用いてもよい。投与間隔および投与期間は、臨床所見、画像所見、血液所見、併存する疾患、既往歴などに応じて、当業者が選択できる。
前記グルココルチコイド感受性増強剤の使用は、ヒトでの使用に限定されない。ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜や、イヌ、ネコ、サル等のペット等に用いてもよい。
前記グルココルチコイド感受性増強剤に有効成分として含まれるオリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
オリゴヌクレオチド１〜５は、ＧＲのプレｍＲＮＡにおけるエキソン９の特定部位に配列特異的に結合し、ＳＲｐ３０ｃと前記スプライス要素との結合を選択的に阻害するものと考えられる。そのため、オリゴヌクレオチド１〜５の少なくとも１種を有効成分として含むグルココルチコイド感受性増強剤は、生体へ投与しても副作用の懸念が少ない。
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容し得る媒質中に、本発明のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含む。
前記医薬組成物は、細胞におけるＧＲαのＧＲβに対する相対的な発現量を増やし、生体のグルココルチコイド感受性を増強させうる医薬組成物を提供するものである。
前記医薬組成物の調製に用いられる媒質および製剤用添加物の種類は、特に制限されない。媒質および製剤用添加物としては、前記グルココルチコイド感受性増強剤について既述した固体媒質、液体媒質、界面活性剤、緩衝剤などが挙げられる。
前記医薬組成物は、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、がん、内分泌疾患、精神疾患、感染症、外傷などの各種の疾患や身体損傷の治療のために使用することができる。なかでも、前記医薬組成物は、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、リンパ腫、リンパ性白血病などのステロイド剤の投与対象となりうる患者に好適である。
前記医薬組成物は、血管内投与、膀胱投与、腹腔内投与、局所投与等の方法で患者に投与することができる。
したがって、前記医薬組成物によれば、各種の疾患や身体損傷（例えば、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、がん、内分泌疾患、精神疾患、感染症、外傷など）の治療方法が提供される。当該治療方法は、各種の疾患や身体損傷（例えば、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、がん、内分泌疾患、精神疾患、感染症、外傷など）の患者に、前記医薬組成物を投与することを含む。当該治療方法において「治療」とは、症状の改善であればよく、重症化の抑制や症状の軽減若しくは緩和もこの用語に包摂される。
前記医薬組成物は、副腎皮質ホルモンであるグルココルチコイドと共に用いることができる。両者を共に用いる場合、前記医薬組成物は、グルココルチコイドと同時に投与してもよく、グルココルチコイドの投与前に或いはグルココルチコイドの投与後に投与してもよい。
共に用いられるグルココルチコイドは、天然物の精製物でもよく、人工合成物であるステロイド剤（例えば、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン等）でもよい。
前記医薬組成物の使用は、ヒトでの使用に限定されない。ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜や、イヌ、ネコ、サル等のペット等に用いてもよい。
前記医薬組成物に含まれるオリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
オリゴヌクレオチド１〜５は、ＧＲのプレｍＲＮＡにおけるエキソン９の特定部位に配列特異的に結合し、ＳＲｐ３０ｃと前記スプライス要素との結合を選択的に阻害するものと考えられる。そのため、オリゴヌクレオチド１〜５の少なくとも１種を有効成分として含む医薬組成物は、生体へ投与しても副作用の懸念が少ない。
＜発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、本発明のオリゴヌクレオチドを含み、本発明のオリゴヌクレオチドの発現に用いられる。前記発現ベクターは、本発明のオリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）を一方の鎖に含む二本鎖ヌクレオチド（好ましくは二本鎖ＤＮＡ）を、任意のベクターに挿入することにより得ることができる。
前記二本鎖ヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主細胞中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5等）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージＤＮＡ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス由来のベクターを用いることもできる。
オリゴヌクレオチド１を一方の鎖に含む二本鎖ヌクレオチドは、例えば、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２６２６〜２６５６番目を鋳型にして、適当な制限酵素部位を含むプライマーを用いて、ＰＣＲ法により合成できる。
オリゴヌクレオチド２のオリゴヌクレオチドを一方の鎖に含む二本鎖ヌクレオチドは、例えば、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２７９６〜２８２９番目を鋳型にして、適当な制限酵素部位を含むプライマーを用いて、ＰＣＲ法により合成できる。
オリゴヌクレオチド３を一方の鎖に含む二本鎖ヌクレオチドは、例えば、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２８３０〜２８６０番目を鋳型にして、適当な制限酵素部位を含むプライマーを用いて、ＰＣＲ法により合成できる。
オリゴヌクレオチド４を一方の鎖に含む二本鎖ヌクレオチドは、例えば、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から３７３０〜３７５２番目を鋳型にして、適当な制限酵素部位を含むプライマーを用いて、ＰＣＲ法により合成できる。
オリゴヌクレオチド５を一方の鎖に含む二本鎖ヌクレオチドは、例えば、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から４０８０〜４１００番目を鋳型にして、適当な制限酵素部位を含むプライマーを用いて、ＰＣＲ法により合成できる。
そして、このようにして得た二本鎖ヌクレオチドを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入すれば、前記発現ベクターが得られる。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその趣旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
〔ＧＲα及びＧＲβの発現量の検討〕
［オリゴヌクレオチドの用意］
細胞内に導入するオリゴヌクレオチドとして、オリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５を用意した。これらのオリゴヌクレオチドは、常法の化学合成によって得た。これらの塩基配列を表１に示す。
Figure 0006049143
表１において、「エキソン９中の対応位置」とは、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９（塩基数４１１０）において、各オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列が存在する位置（エキソン９の５’末端側から数えた塩基番号）である。換言すれば、例えば、オリゴヌクレオチド１の塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２６２６〜２６５６番目の塩基配列に相補的な塩基配列である。
［細胞の培養］
実験には、ヒトのバーキットリンパ腫由来のＲａｊｉ細胞（Japan Health Science Foundation製）を用いた。
Ｒａｊｉ細胞は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）（Filtoron製）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco製）を用いて、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気で培養し維持した。
［オリゴヌクレオチドの細胞内への導入］
２×１０６個のＲａｊｉ細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて洗浄後、Amaxa cell line Nucleofector Kit V（Lonza製）のトランスフェクション用試薬１００μｌに懸濁した。オリゴヌクレオチドを３００ｎＭの濃度となるように添加した後、速やかにNucleofector I device（Lonza製）を用いて電気穿孔法による細胞内への導入を行なった。
濃度依存性を確かめる実験においては、オリゴヌクレオチドの濃度を５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭとした。
Ｒａｊｉ細胞は、前記培地で２４時間培養した後、以降の各種実験に供した。
［ＧＲα及びＧＲβの発現量の測定］
オリゴヌクレオチドを導入したＲａｊｉ細胞における、ＧＲα及びＧＲβの発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法及びＰＣＲ法により測定した。内在性コントロールとしては、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現量を測定した。
Ｒａｊｉ細胞はＰＢＳで洗浄した後、FastPure RNA Kit（Takara bio製）を用いてＲＮＡを抽出し、PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit（Takara bio製）を用いて逆転写反応を行なった。得られたｃＤＮＡは、Platinum Taq DNA polymerase（Invitrogen製）及び目的遺伝子に特異的なＰＣＲ用プライマー（表２にその塩基配列を示す）を用いて増幅した。ＰＣＲ条件は、初回解離処理を９４℃で２分間行ない、解離（９４℃、３０秒間）、アニーリング（５５℃、３０秒間）、伸長（７２℃、１分間）を３５サイクル行なった。さらに最終伸長を７２℃で４分間行なった。
Figure 0006049143
ＰＣＲ後、エチジウムブロマイド添加２％アガロースゲルによる二次元電気泳動でＤＮＡを分離し、バンドの輝度をイメージアナライザー Gel Print 2000i/VGA（Genomic Solutions製）によって数値化した。
オリゴヌクレオチド１〜５のいずれかを導入したＲａｊｉ細胞における、ＧＡＰＤＨ、ＧＲα及びＧＲβの発現量を表３に示す。表３中の「ＧＲα／ＧＲβの相対値」は、オリゴヌクレオチドを導入していない細胞における「ＧＲαの発現量をＧＲβの発現量で除した値」を１としたときの相対値である。
また、濃度を変えてオリゴヌクレオチド１を導入したＲａｊｉ細胞における、ＧＡＰＤＨ、ＧＲα及びＧＲβの発現量を表４に示す。
なお、各実験は３回行った。表３及び表４にはその平均を示す。
Figure 0006049143
Figure 0006049143
表３に明らかなように、オリゴヌクレオチド１〜５のいずれかを導入した細胞では、「ＧＲα／ＧＲβの相対値」が１．１を超えていた。このことから、これらのオリゴヌクレオチドを細胞内に導入することにより、細胞のグルココルチコイド感受性が上昇する可能性が示唆された。
表４に明らかなように、オリゴヌクレオチド１は、濃度依存的にＧＲβの発現量を低下させた。
＜実施例２＞
〔オリゴヌクレオチド導入細胞のグルココルチコイド感受性の検討〕
［オリゴヌクレオチド１導入細胞］
オリゴヌクレオチド１の導入による細胞のグルココルチコイド感受性の変化を検討するため、５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込み試験を行い、細胞増殖の定量を行った。グルココルチコイドとしてデキサメサゾン（Biomol製）を使用し、デキサメサゾンの濃度は、０μＭ（添加なし）、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、及び１０μＭとした。
細胞周期を同期化するため、Ｒａｊｉ細胞を血清の入っていないＲＰＭＩ１６４０培地中で１２時間培養した後、血清の入ったＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し９６穴プレートに播種した。
デキサメサゾンの添加後２２時間培養し、ＢｒｄＵを添加してさらに２時間培養した。遠心分離した後、上清を捨て、乾燥させ固定した後、ペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵ抗体と１時間、室温で反応させた。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、テトラメチルベンジディンを加え、適度な発色が得られた段階でＨ２ＳＯ４（１Ｍ）を添加して反応を停止した。よく攪拌した後、プレートリーダーによって４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を表５に示す。
デキサメサゾンを添加していないＲａｊｉ細胞を対照として、前記吸光度の相対比によって細胞増殖抑制率（％）を算出した。その結果を表６及び図１に示す。ここで、統計学的有意差の判定には、一元配置分散分析法及び多重比較法を用いた。多重比較としてはＴｕｋｅｙ法を使用した。危険率Ｐ＜ ．０５（ｖｓオリゴヌクレオチド無添加）を有意な差とした。
なお、各実験は３回行った。表５及び表６にはその平均を示す。
Figure 0006049143
Figure 0006049143
表５、表６及び図１に明らかなように、オリゴヌクレオチド１を導入したＲａｊｉ細胞では、オリゴヌクレオチドを導入していないＲａｊｉ細胞に比べて、デキサメサゾンの添加により、ＢｒｄＵの取り込み量が有意に低下し、また、細胞増殖抑制率が有意に増加した。このことから、オリゴヌクレオチド１を導入することにより、細胞のグルココルチコイド感受性が上昇したことが分る。
したがって、本発明によれば、細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性を有するオリゴヌクレオチドを提供できる。
［オリゴヌクレオチド２〜５導入細胞］
上記と同様にしてＢｒｄＵ取り込み試験を行い、オリゴヌクレオチド２〜５いずれかの導入による細胞のグルココルチコイド感受性の変化を検討した。細胞増殖抑制率（％）を表７及び図２〜図５に示す。なお、各実験は４回行い、表７にはその平均を示す。
Figure 0006049143
表７及び図２〜図５に明らかなように、オリゴヌクレオチド２〜５のいずれかを導入したＲａｊｉ細胞では、オリゴヌクレオチドを導入していないＲａｊｉ細胞に比べて、デキサメサゾンによる細胞増殖抑制率が有意に増加した。このことから、オリゴヌクレオチド２〜５のいずれかを導入することにより、細胞のグルココルチコイド感受性が上昇したことが分る。
したがって、本発明によれば、細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性を有するオリゴヌクレオチドを提供できる。
＜実施例３＞
〔エストロゲン受容体の発現量の検討〕
エストロゲン受容体（ＥＲ）には２つのスプライシングバリアント、ＥＲαとＥＲβが存在する。ＥＲのｍＲＮＡのスプライシング制御に、ＳＲｐ３０ｃが関与することが知られている。
オリゴヌクレオチド１を導入したＲａｊｉ細胞における、ＥＲα及びＥＲβの発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法及びＰＣＲ法により測定した。
実施例１における［細胞の培養］及び［オリゴヌクレオチドの細胞内への導入］と同様にして、オリゴヌクレオチド１を導入したＲａｊｉ細胞を得た。なお、オリゴヌクレオチド１の細胞内への導入時の濃度は、３００ｎＭとした。
［エストロゲン受容体の発現量の測定］
Ｒａｊｉ細胞はＰＢＳで洗浄した後、FastPure RNA Kit（Takara bio製）を用いてＲＮＡを抽出し、PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit（Takara bio製）を用いて逆転写反応を行なった。得られたｃＤＮＡは、Platinum Taq DNA polymerase（Invitrogen製）及び目的遺伝子に特異的なＰＣＲ用プライマー（表８にその塩基配列を示す）を用いて増幅した。ＰＣＲ条件は、初回解離処理を９４℃で２分間行ない、解離（９４℃、３０秒間）、アニーリング（５５℃、３０秒間）、伸長（７２℃、１分間）を３５サイクル行なった。さらに最終伸長を７２℃で４分間行なった。
内在性コントロールとして、配列番号１０及び１１のＰＣＲプライマーを用いてＧＡＰＤＨの発現量を測定した。
Figure 0006049143
ＰＣＲ後、エチジウムブロマイド添加２％アガロースゲルによる二次元電気泳動でＤＮＡを分離し、バンドの輝度をイメージアナライザー Gel Print 2000i/VGA（Genomic Solutions製）によって数値化した。
オリゴヌクレオチド１を導入したＲａｊｉ細胞における、ＧＡＰＤＨ、ＥＲα及びＥＲβの発現量を表９に示す。表９中の「ＥＲα／ＥＲβの相対値」は、オリゴヌクレオチドを導入していない細胞における「ＥＲαの発現量をＥＲβの発現量で除した値」を１としたときの相対値である。
Figure 0006049143
表９に明らかなように、オリゴヌクレオチド１を導入しても、「ＥＲα／ＥＲβの相対値」がほぼ１であった。このことから、オリゴヌクレオチド１を細胞に導入しても、ＥＲのｍＲＮＡのスプライシング制御に影響を及ぼさないことが分る。
＜実施例４＞
〔オリゴヌクレオチドの抗腫瘍効果の検討〕
［オリゴヌクレオチド４発現用ベクターの作製］
オリゴヌクレオチド４をベクターへ挿入するため、表１０に示すオリゴヌクレオチドを用意した。
Figure 0006049143
上記の２種類のオリゴヌクレオチド、ＯＮ４−Ｓｅｎｓｅ及びＯＮ４−Ａｎｔｉｓｅｎｓｅをそれぞれ５０μＭとなるように混和し、アニーリング処理（９５℃で３０秒、続いて７２℃で２分間、続いて３７℃で２分間、続いて２５℃で２分間）を行い、二本鎖ＤＮＡを作製した。この二本鎖ＤＮＡを以降の実験に使用するまで−２０℃で保管した。
RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector（Takara bio製）と上記二本鎖ＤＮＡを混和し、Ligation kit（Takara bio製）を用いてライゲーションを行った。同様に、キットに附属のコントロールＤＮＡもRNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vectorとのライゲーションを行い、陰性コントロール用のベクターとした。
表１１に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、上記ベクターと二本鎖ＤＮＡがライゲーションされ環状プラスミド（プラスミドベクター）が作製されたことを確認した。
Figure 0006049143
上記で得たプラスミドベクターをHIT competent cells HIT-DH5a（RBC Bioscience製）と混和し、４℃で５分間保持した後、寒天培地に播種し、３７℃で１８時間の培養を行った。
発生した大腸菌コロニーを採取し、表１１に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、プラスミドベクターが大腸菌に導入されていることを確認した。
上記プラスミドベクターを導入した大腸菌を液体培地に播種し、３７℃で１６時間の培養を行った後、Endofree plasmid purification kit（Qiagen製）を用いてプラスミドベクターを抽出した。表１１に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、目的のプラスミドベクターが抽出されたことを確認した。
上記プラスミドベクターとpCMV-VSV-G envelope vector（Cell Biolabs製）をFuGene HD transfection reagent（Roche製）を用いてPlatinum-GP retroviral packaging cell line（Cell Biolabs製）に導入し、レトロウイルスベクターを作製した。このレトロウイルスベクターを含む培養上清を回収しフィルトレーション後、−２０℃で保管した。
［オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞の作製］
上記培養上清を含む培地でＲａｊｉ細胞を４８時間培養し、レトロウイルスベクターをＲａｊｉ細胞に感染させ、オリゴヌクレオチド４を恒常的に発現するＲａｊｉ細胞（この細胞は、蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎによって標識されている。）を作製した。
そして、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞をＦＡＣＳソーティングにより分取した。
［ＧＲα及びＧＲβの発現量の測定］
実施例１における［ＧＲα及びＧＲβの発現量の測定］と同様にして、オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞における、ＧＲα及びＧＲβの発現量を測定した。内在性コントロールとしては、ＧＡＰＤＨの発現量を測定した。
ＧＡＰＤＨ、ＧＲα及びＧＲβの発現量を表１２に示す。表１２中の「ＧＲα／ＧＲβの相対値」は、コントロールＲａｊｉ細胞における「ＧＲαの発現量をＧＲβの発現量で除した値」を１としたときの相対値である。なお、実験は３回行い、表１２にはその平均を示す。
Figure 0006049143
表１２に明らかなように、オリゴヌクレオチド４を恒常的に発現させると、ＧＲαの発現量が増加し、ＧＲβの発現量が減少することが確認された。
［グルココルチコイド感受性の検討］
オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞のグルココルチコイド感受性を検討するため、実施例２と同様にしてＢｒｄＵ取り込み試験を行い、細胞増殖の定量を行った。デキサメサゾンの濃度は、０μＭ（添加なし）及び５μＭとした。吸光度の測定結果を表１３に示す。なお、各実験は３回行い、表１３にはその平均を示す。
Figure 0006049143
表１３に明らかなように、オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞では、コントロールＲａｊｉ細胞に比べて、デキサメサゾンの添加によりＢｒｄＵの取り込み量が有意に低下した。このことから、オリゴヌクレオチド４の恒常的な発現により、グルココルチコイド感受性が高まることが確認された。
［ｉｎ ｖｉｖｏ試験］
６週齢のＳＣＩＤマウス（ｎ＝１０）に、オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞及びコントロールＲａｊｉ細胞をそれぞれ１×１０７細胞／匹、腹腔内に接種し、デキサメサゾン１５ｍｇ／ｋｇを毎日、腹腔内投与して観察した。生存率（％）を表１４に示し、生存曲線を図６に示す。
Figure 0006049143
表１４及び図６に明らかなように、コントロールＲａｊｉ細胞を接種したマウスと、オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞を接種したマウスとは、同程度の致死率であった。コントロールＲａｊｉ細胞を接種したマウスにデキサメサゾンを投与しても、マウスの生存率を上昇させなかったが、オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞を接種したマウスにデキサメサゾンを投与すると、マウスの生存率を顕著に上昇させた。
＜実施例５＞
〔オリゴヌクレオチドのブロッキング活性の検討〕
オリゴヌクレオチド４によってＳＲｐ３０ｃとＧＲのプレｍＲＮＡとの結合が阻害されていることを確認するため、ＲＮＡクロマチン免疫沈降反応を行った。
［ＲＮＡクロマチン免疫沈降反応］
オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞及びコントロールＲａｊｉ細胞を１％ホルムアルデヒドで固定し、核酸とタンパク質をクロスリンケージさせた。
各細胞を洗浄後、RNA ChIP-IT kit（Active motif製）を用いて、細胞の溶解、ＤＮａｓｅ処理、及び抗ＲＮａｓｅ処理を行い、抗ＳＲｐ３０ｃ抗体とprotein G magnetic beads（以下「ビーズ」）で免疫沈降反応（４℃で４時間の反応）を行った。
続いて、ビーズを回収し洗浄し、脱クロスリンケージ処理を行った。
表１５に示すプライマーを使用し、ＲＴ−ＰＣＲ法及びＰＣＲ法により、ＳＲｐ３０ｃと結合していたＧＲのプレｍＲＮＡを検出した。ＰＣＲ条件は、初回解離処理を９４℃で２分間行ない、解離（９４℃、３０秒間）、アニーリング（５５℃、３０秒間）、伸長（７２℃、１分間）を３５サイクル行なった。さらに最終伸長を７２℃で４分間行なった。
なお、表１５に示すプライマーは、ＧＲのプレｍＲＮＡの一部であって、ヒトＧＲ遺伝子の塩基番号１５２８７３〜１５３５５６に対応する部位を増幅するように設計した。
Figure 0006049143
ＰＣＲ後、エチジウムブロマイド添加２％アガロースゲルによる二次元電気泳動でＤＮＡを分離し、バンドの輝度をイメージアナライザー Gel Print 2000i/VGA（Genomic Solutions製）によって数値化した。陽性コントロールの輝度を１としたときの相対値を表１６に示す。なお、実験は３回行い、表１６にはその平均を示す。
Figure 0006049143
表１６に明らかなように、オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞からの抽出物においては、ＳＲｐ３０ｃと結合していたＧＲのプレｍＲＮＡの量が有意に低かった。オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞においては、ＳＲｐ３０ｃとＧＲのプレｍＲＮＡの結合が阻害されていることが確認された。
２０１１年１２月１５日に出願の日本国出願番号第２０１１−２７４８９７号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (5)

  1. 配列番号１に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、
    配列番号２に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、
    配列番号３に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、
    配列番号４に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、及び、
    配列番号５に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、
    のいずれかであるオリゴヌクレオチド。
  2. ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 請求項１又は請求項２に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を有効成分として含むグルココルチコイド感受性増強剤。
  4. 請求項１又は請求項２に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含む医薬組成物。
  5. 請求項１又は請求項２に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含む発現ベクター。
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