JP2016521556A - Foxp3発現を調節するための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、35U.S.C.§119(e)に従い、2013年6月7日に提出された「COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING FOXP3 EXPRESSION」と題する米国仮特許出願第61/832,677号明細書の利益を主張する。尚、これら文献の各々の内容は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
(a)(X)Xxxxxx、(X)xXxxxx、(X)xxXxxx、(X)xxxXxx、(X)xxxxXx及び(X)xxxxxX、
(b)(X)XXxxxx、(X)XxXxxx、(X)XxxXxx、(X)XxxxXx、(X)XxxxxX、(X)xXXxxx、(X)xXxXxx、(X)xXxxXx、(X)xXxxxX、(X)xxXXxx、(X)xxXxXx、(X)xxXxxX、(X)xxxXXx、(X)xxxXxX及び(X)xxxxXX、
(c)(X)XXXxxx、(X)xXXXxx、(X)xxXXXx、(X)xxxXXX、(X)XXxXxx、(X)XXxxXx、(X)XXxxxX、(X)xXXxXx、(X)xXXxxX、(X)xxXXxX、(X)XxXXxx、(X)XxxXXx、(X)XxxxXX、(X)xXxXXx、(X)xXxxXX、(X)xxXxXX、(X)xXxXxX及び(X)XxXxXx、
(d)(X)xxXXX、(X)xXxXXX、(X)xXXxXX、(X)xXXXxX、(X)xXXXXx、(X)XxxXXXX、(X)XxXxXX、(X)XxXXxX、(X)XxXXx、(X)XXxxXX、(X)XXxXxX、(X)XXxXXx、(X)XXXxxX、(X)XXXxXx、及び(X)XXXXxx、
(e)(X)xXXXXX、(X)XxXXXX、(X)XXxXXX、(X)XXXxXX、(X)XXXXxX及び(X)XXXXXx、並びに
(f)XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX及びXXXXXXx
から選択される1つ又は複数のヌクレオチド配列を含み、ここで、「X」は、ヌクレオチド類似体を示し、(X)は、任意選択のヌクレオチド類似体を示し、「x」は、DNA又はRNAヌクレオチド単位を示す。
表1:ヒトmiRNAのシード配列ではない六量体
(発明を実施するための形態)
本発明の一形態において、細胞でのFOXP3の発現を調節するためのPRC2関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、FOXP3の発現が上方制御又は増大される。ある実施形態では、これらのPRC2関連領域に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが、長いRNA転写物とPRC2との相互作用を阻害することにより、遺伝子発現が上方制御又は増大される。ある実施形態では、PRC2関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが、PRC2と長いRNA転写物との相互作用を阻害し、その結果、ヒストンH3のメチル化の低減及び遺伝子不活性化の低減が起こることにより、遺伝子発現が上方制御又は増大される。ある実施形態では、上記の相互作用は、長いRNAの構造の変化によって、PRC2との結合が阻止又は低減されるために、破壊又は阻害され得る。FOXP3の発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択するための本明細書に開示する方法のいずれかを用いて、オリゴヌクレオチドを選択することができる。
GITR(TNFRSF18とも呼ばれる):NM_004195.2、NM_148901.1、NM_148902.1、NP_004186.1、NP_683699.1、NP_683700.1
IL−10:NM_000572.2、NP_000563.1
FOXP3の発現を活性化又は増強するための候補オリゴヌクレオチドを選択する方法が本明細書において提供される。標的選択方法は、概して、本明細書に開示する構造的及び機能的特徴のいずれかを有する一本鎖オリゴヌクレオチドを選択するステップを含み得る。典型的に、本方法は、FOXP3と機能的に関連するPRC2関連領域、例えば、FOXP3遺伝子に対するPRC2の動員を促進する(例えば、シス(cis)調節様式で)ことにより、FOXP3の発現を調節するlncRNAのPRC2関連領域をターゲティングするオリゴヌクレオチドを同定することを目標とする1つ又は複数のステップを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、核酸(例えば、lncRNA)のPRC2関連領域とハイブリダイズするそれらの能力のために、FOXP3の発現を活性化する候補であると予想される。ある実施形態では、このハイブリダイゼーションイベントは、PRC2と核酸(例えば、lncRNA)との相互作用を破壊し、これにより、FOXP3遺伝子座に対するPRC2及びその関連共抑制因子(例えば、クロマチン再構成因子)の動員を破壊すると理解されている。
PRC2関連領域を同定する、及び/又は選択するステップ;
PRC2関連領域若しくはその一部に対し、要望される程度の配列同一性又は相補性を有する核酸配列を設計するステップ;
一本鎖オリゴヌクレオチドを、設計した配列に合成するステップ;
合成した一本鎖オリゴヌクレオチドを精製するステップ;並びに
任意選択で、合成した一本鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも1種の薬学的に許容される希釈剤、担体若しくは賦形剤と混合することにより、医薬組成物又は薬剤を形成するステップ
のうち1つ又は複数を含み得る。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個のリボヌクレオチド、少なくとも1個のデオキシリボヌクレオチド、及び/又は少なくとも1個の架橋ヌクレオチドを含んでもよい。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸(Locked Nucleic Acid bases)((LNA)ヌクレオチド、拘束エチル(constrained ethyl)(cEt)ヌクレオチド、又はエチレン架橋型拡散(ethylene bridged nucleic acid)(ENA)ヌクレオチドなどの架橋ヌクレオチドを含んでもよい。このようなヌクレオチドの例は本発明に開示しており、当分野でも公知である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下の米国特許又は米国特許出願:米国特許第7,399,845号明細書、米国特許7,741,457号明細書、米国特許8,022,193号明細書、米国特許7,569,686号明細書、米国特許7,335,765号明細書、米国特許第7,314,923号明細書、米国特許第7,335,765号明細書、米国特許第7,816,333号明細書、米国特許第20110009471号明細書の1つに開示されているヌクレオチド類似体を含み、これら文献の各々の全内容は、あらゆる目的のために本明細書に参照により組み込む。オリゴヌクレオチドは、1つ又は複数の2’O−メチルヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、2’O−メチルヌクレオチドから完全に構成されていてもよい。
の組成物を含み、
式中、X及びYは、独立に、基−O−、
−S−、−N(H)−、N(R)−、−CH2−又は−CH−(二重結合の一部である場合)、
−CH2−O−、−CH2−S−、−CH2−N(H)−、−CH2−N(R)−、−CH2−CH2−又は−CH2−CH−(二重結合の一部である場合)、
−CH=CH−
の群から選択され、ここで、Rは、水素及びC1〜4−アルキルから選択され;Z及びZ*は、独立に、ヌクレオシド間結合、末端基又は保護基から選択され;Bは、天然若しくは非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し;いずれかの配向に非対称基が存在してもよい。
のいずれかに従う少なくとも1つのLNA単位を含み、
式中、Yは、−O−、−S−、−NH−、若しくはN(RH)−であり;Z及びZ*は、独立に、ヌクレオシド間結合、末端基又は保護基から選択され;Bは、天然若しくは非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し;RHは、水素及びC1〜4−アルキルから選択される。
(a)(X)Xxxxxx、(X)xXxxxx、(X)xxXxxx、(X)xxxXxx、(X)xxxxXx及び(X)xxxxxX、
(b)(X)XXxxxx、(X)XxXxxx、(X)XxxXxx、(X)XxxxXx、(X)XxxxxX、(X)xXXxxx、(X)xXxXxx、(X)xXxxXx、(X)xXxxxX、(X)xxXXxx、(X)xxXxXx、(X)xxXxxX、(X)xxxXXx、(X)xxxXxX及び(X)xxxxXX、
(c)(X)XXXxxx、(X)xXXXxx、(X)xxXXXx、(X)xxxXXX、(X)XXxXxx、(X)XXxxXx、(X)XXxxxX、(X)xXXxXx、(X)xXXxxX、(X)xxXXxX、(X)XxXXxx、(X)XxxXXx、(X)XxxxXX、(X)xXxXXx、(X)xXxxXX、(X)xxXxXX、(X)xXxXxX及び(X)XxXxXx、
(d)(X)xxXXX、(X)xXxXXX、(X)xXXxXX、(X)xXXXxX、(X)xXXXXx、(X)XxxXXXX、(X)XxXxXX、(X)XxXXxX、(X)XxXXx、(X)XXxxXX、(X)XXxXxX、(X)XXxXXx、(X)XXXxxX、(X)XXXxXx、及び(X)XXXXxx、
(e)(X)xXXXXX、(X)XxXXXX、(X)XXxXXX、(X)XXXxXX、(X)XXXXxX及び(X)XXXXXx、並びに
(f)XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX及びXXXXXXx、
ここで、「X」は、ヌクレオチド類似体を示し、(X)は、任意のヌクレオチド類似体を示し、「x」は、DNA又はRNAヌクレオチド単位を示す。上に挙げたパターンの各々は、単独、又は開示された他の修飾パターンのいずれかとの組み合わせでオリゴヌクレオチド内に1回又は複数回出現し得る。
EZH1:NM_001991.3、NP_001982.2
EZH2:NM_001203247.1、NM_001203248.1、NM_001203249.1、NM_004456.4、NP_004447.2、NM_152998.2、NP_001190177.1、NP_001190176.1、NP_001190178.1、NP_694543.1
Suz12:NM_015355.2、NP_056170.2
EED1:NM_003797.3、NM_152991.2、NP_003788.2、NP_694536.1
RbAp48:NM_001135255.1、NM_001135256.1、NM_005610.2、NP_001128727.1、NP_001128728.1、NP_005601.1
一形態において、本発明は、研究目的で(例えば、細胞中の遺伝子の機能を研究するために)、細胞(例えば、FOXP3レベルが低下している細胞)における遺伝子発現を調節する方法に関する。別の態様では、本発明は、遺伝子又はエピジェネティック療法のために、細胞(例えば、FOXP3レベルが低下している細胞)における遺伝子発現を調節する方法に関する。細胞は、in vitro、ex vivo又はin vivo(例えば、FOXP3の発現又は活性低下に起因する疾患又は病状を有する被験者において)であってよい。ある実施形態では、細胞における遺伝子発現を調節する方法は、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドを送達することを含む。ある実施形態では、細胞への一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、一本鎖オリゴヌクレオチドが送達されていない対照細胞における遺伝子の発現レベルに比べ、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%又はそれ以上高い遺伝子の発現レベルがもたらされる。特定の実施形態では、細胞への一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、一本鎖オリゴヌクレオチドが送達されていない対照細胞における遺伝子の発現レベルに比べ、少なくとも50%高い遺伝子の発現レベルがもたらされる。
本明細書に記載するオリゴヌクレオチドは、FOXP3のレベル低下と関連する病状(例えば、自己免疫若しくは炎症性疾患などの異常な免疫細胞活性化に関連する疾患又は障害)の治療を目的として、被験者への投与のために製剤化することができる。本明細書に開示するオリゴヌクレオチドのどれを用いても、製剤、組成物及び方法を実施できることは理解すべきである。
一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物は、様々な経路で被験者に送達することができる。経路の例として、静脈内、皮内、局所、直腸、非経口、肛門、膣内、鼻内、肺、眼、皮下、筋内、腹腔内、及び関節内(例:例えば、関節リウマチの場合には関節への注射)投与が挙げられる。「治療に有効な量」という用語は、予測される生理学的応答を賦与するために、治療対象の被験者において要望されるレベルのFOXP3発現をもたらすのに必要な、組成物中に存在するオリゴヌクレオチドの量である。「生理学的に有効な量」という用語は、要望される苦痛緩和又は治癒効果を賦与するために、被験者に送達される量である。「薬学的に許容される担体」という用語は、被験者に対する有意な有害な毒物学的作用を伴うことなく、担体を被験者に投与することができることを意味する。
肺送達は、噴霧化、エアロゾル化、ミセル及び乾燥粉末ベースの製剤の使用など、様々なアプローチにより達成することができる。送達は、液体ネブライザー、エアロゾルベースの吸入器、及び乾燥粉末分散器を用いて、達成することができる。定量装置が好ましい。噴霧器又は吸入器を用いる利点の1つは、装置が自蔵式であるため、汚染の可能性が最小限に抑えられることである。例えば、乾燥粉末分散器は、乾燥粉末として容易に製剤化することができる薬剤を送達する。一本鎖オリゴヌクレオチド組成物は、単独で、又は好適な粉末担体と組み合わせて、凍結乾燥又は噴霧乾燥粉末として安定して貯蔵することができる。吸入用組成物の送達は、タイマー、ドーズカウンター、時間計測装置を含み得る投与タイミング要素、又は時間表示器を用いて実施することができ、これらが装置に内蔵されていれば、エアロゾル薬剤の投与の際の用量追跡、適合性モニタリング、及び/又は患者への用量トリガーが可能になる。
一態様において、本発明は、一本鎖オリゴヌクレオチド(例えば、化合物として、又は組成物の1成分として)を被験者(例えば、ヒト被験者)に投与する方法を特徴とする。一実施形態では、単位用量は、体重1kg当たり約10mg〜25mgである。一実施形態では、単位用量は、体重1kg当たり約1mg〜約100mgである。一実施形態では、単位用量は、体重1kg当たり約0.1mg〜約500mgである。ある実施形態では、単位用量は、体重1kg当たり0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、25、50又は100mg超である。
本発明の特定の態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物を収納する容器を含むキットが提供される。ある実施形態では、組成物は、一本鎖オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。ある実施形態では、医薬組成物の個々の成分を1つの容器内に提供してもよい。あるいは、医薬組成物の成分を2つ以上の容器、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド用の1つの容器と、担体化合物用の少なくとも1つの別の容器に個別に提供するのが望ましい場合もある。キットは、例えば、単一ボックス内の1つ又は複数の容器のようにいくつかの異なる構成でパッケージしてもよい。例えば、キットに備えられた指示書に従い、様々な成分を組み合わせることができる。例えば、医薬組成物を調製及び投与するために、本明細書に記載の方法に従い、上記成分を組み合わせることができる。キットは、さらに送達装置を含んでもよい。
材料及び方法:
リアルタイム(定量)PCR
以下に記載するように、RNAを細胞から採取して、cDNAに変換した。最終容量20ul/ウェルの96ウェルフォーマット中でリアルタイムPCR(本明細書ではPCR又はqPCR又はqRTPCRとも呼ばれる)を実施した。各ウェルは、2.5ulのcDNA、5.5ulの水、1ulの標的遺伝子プローブ、1ulのハウスキーパープローブ及び10ulのTaqMan(登録商標)Fast Advanced master mix(Life Technologies(商標)、Invitrogen)を含んだ。
ステップ1:95℃で20秒間を1サイクル
ステップ2:95℃で3秒間を40サイクル
ステップ3:60℃で20秒間を40サイクル
FOXP3を上方制御するために、PRC2相互作用領域内でオリゴヌクレオチドを設計した(例えば、図2を参照)。各オリゴヌクレオチドの配列及び構造を表4に示す。表3に、表2又は表4で試験及び記載される特定のオリゴヌクレオチドについて用いるヌクレオチド類似体、修飾及びヌクレオチド間結合の記述を示す。
ヒトT細胞を一人の健常な男性及び一人の健常な女性ドナーから取得した。いずれのドナーも同様の年齢及び健康状態であった。各実験のために、T細胞をドナーから新しく単離し、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて、CD4−陽性について選別した。ヒトT細胞(Stem Cells Technologies)をAnti−Anti(Antibiotic−Antimycotic、Life Technologies(商標)、Invitrogen)の存在下でPRMI1640/10%ウシ胎仔血清中で培養した。細胞を解凍してから、刺激前に1日かけて培養した。
T細胞刺激は、5ng/mlのホルボール12−ミリスタート13−アセタート(PMA)及び1uMのイオノマイシン(Ionomycin)(Sigma)を用いて、5時間にわたり実施した。2×濃度の場合、PMA及びイオノマイシンの用量は2倍であった。初期T細胞刺激条件は、健常な男性ドナー由来のT細胞を用いて決定した。健常な女性ドナー由来のT細胞(表2ではhuT細胞+と称する)を用いて、オリゴヌクレオチドのスクリーニング(以下に記載する)を実施した。
前述のように、T細胞をPMA/イオノマイシンにより5時間刺激した。刺激後、約100,000細胞/ウェルの96ウェルV字底プレートフォーマットに細胞を塗布した。各ウェルは、最終濃度10uMのオリゴヌクレオチドを生成するのに適したオリゴヌクレオチド量を含んだ。ウェル当たりの最終容量は、100ulであった。用量応答実験のために同じ方法を用いた。オリゴヌクレオチドは、裸で(gymnotically)送達した。送達に関して、裸の(gymnotic)(又は裸で(gymnotically))という用語は、トランスフェクション試薬不使用の細胞への薬剤の自然取り込み、又はトランスフェクション試薬不使用の被験者への送達を指す。48時間後、細胞を2000RPM、4℃で、5分間スピンし、氷冷PBS(Life Technologies)で1回洗浄した後、Cell−to−Ctキット(Life Technologies)を用いて細胞溶解物を生成した。使用したバッファーの量は、35ul/ウェルであった。合計50ulの反応容量に対して15ulの溶解物を用いて、cDNAを作製した。続いて、上に概説したように、定量RT−PCRを実施した。
(a)5ng/mlPMA及び1uMイオノマイシン、(b)10ng/mlPMA及び2uMイオノマイシン、(c)DMSOのみ、又は(d)処理なしのいずれかで、T細胞を刺激した。T細胞の活性化及び増殖のためのバイオマーカを評価して、PMA及びイオノマイシン処理がT細胞を好適に刺激したかどうかを決定した。CDKN1Aは、活性細胞増殖時又はその最中に上方制御されるハウスキーパー遺伝子である。CD69及びIL−2RAは、活性化T細胞において上方制御されることがわかっている。CD69、CDKN1A、及びIL−2RAは、PMA及びイオノマイシンでの刺激時に上方制御されることが判明した(図1)。ナイーブT細胞のバイオマーカであるCD62Lは、PMA及びイオノマイシンでの刺激時に下方制御されることが判明した(図1)。これらの結果は、PMA及びイオノマイシンが、T細胞を刺激することができたことを立証するものである。
FOXP3を上方制御するための候補としてオリゴヌクレオチドを設計した。配列番号1〜7、46、又は47に記載する配列内のPRC2相互作用領域と相補的であるように、一本鎖オリゴヌクレオチドを設計した。複数のオリゴヌクレオチドを少なくとも2回反復して試験した。オリゴヌクレオチドの配列及び構造特徴を表4に記載する。手短には、前述のようにT細胞を刺激した後、前述のように、オリゴヌクレオチドの各々を用いて、裸でin vitroでトランスフェクトした。unc−293m01オリゴは、ユニバーサル陰性対照オリゴである。「Cntl un」は、オリゴヌクレオチドを含有しなかったウェルを指し、これも陰性対照として用いた。処理後の刺激T細胞におけるFOXP3発現をqRT−PCRにより評価した。FOXP3発現を上方制御したオリゴヌクレオチドを同定した。FOXP3を上方制御したオリゴヌクレオチドのサブセットを、2つのT細胞バイオマーカ、GITR(TNFRSF18とも呼ばれる)及びIL2RAの発現についてさらに試験した。これら2つのバイオマーカのレベルをqRT−PCRにより測定した。GITRは、Tregのバイオマーカであるため、このバイオマーカの発現増大は、活性化T細胞が、T調節状態にスイッチしていることを示すと考えられる。IL2RAは、活性化T細胞のバイオマーカであるため、IL2RAの減少は、T細胞活性化状態(例えば、T調節状態へのスイッチング)の低減を示すと考えられる。FOXP3及びT細胞バイオマーカ発現に関するさらなる詳細を表2に概説する。
方法:
PMA/イオノマイシンによるT細胞活性化
2つの異なる濃度のPMA/イオノマイシン(1×及び2×)と一緒に、細胞を5時間インキュベートした。1×及び2×濃度のPMA/イオノマイシンは、実施例1に定義したものと同じである。ナイーブT細胞を対照(非処理)として用いた。CD62L(ナイーブ細胞マーカ)及びCD69(活性化細胞マーカ)mRNAレベルを測定した(図3)。
異なる比のDynabeads(2:1又は1:1のビーズ/細胞比)と一緒にヒトT細胞を2、5、24及び48時間インキュベートした。ナイーブT細胞を対照として用いた(非処理)。CD62L(ナイーブT細胞マーカ)及びCD25(活性化T細胞マーカ)mRNAレベルを測定して、T細胞活性化を試験した(図4)。
オリゴを添加する前に、PMA/イオノマイシン又はDynabeads(抗CD3/CD28)で5時間活性化した。GAPDHギャップマーを用いて、最適化トランスフェクション方法を決定した。次に、表4に記載するFOXP3オリゴを、10μMで24、48及び96時間かけて細胞への裸の送達(トランスフェクション試薬不使用のオリゴヌクレオチドの自然取り込み)によってスクリーニングした。2つの個別の実験は、各々2回の生物学的反復で実施した。Foxp3mRNAレベルをqPCRにより測定し、Foxp3タンパク質レベルをフローサイトメトリーにより測定した。GITR及びCTLA4(Tregバイオマーカ)mRNAレベルは、Foxp3オリゴ処理後にも測定した。三重陽性細胞:Foxp3+、CTLA4及びGITR+由来の細胞上清において、抗炎症性サイトカインIL−10を測定した。表からのいくつかのFOXP3オリゴを、次の基準により要望の特性を有するものとして選択した:Foxp3mRNA及びタンパク質レベル、Tregバイオマーカの存在。
PMA/イオノマイシンを用いて、ヒトT細胞を活性化した。CD62L及びCD69mRNAレベルを測定することにより、T細胞の活性化を確認した(図3)。オリゴを活性化ヒトT細胞に送達することができることを立証するためにGAPDHギャップマーオリゴを用いた。GAPDHギャップマーは、オリゴ処理の48時間後に4及び20μMでPMA/Iono活性化T細胞の最大70%mRNAノックダウンを示した(図5)。
方法:
MALAT−1をターゲティングする単一用量25mg/kgのギャップマーで、マウス(n=4)を処理した。投与から1、5及び7日後に血液及び肝臓を採取した。CD4+細胞を血液から選別し、qPCRによりMALAT−1mRNAを測定した。
オリゴをT細胞にin vivoで送達することができることを立証するために、MALAT−1ギャップマーを使用した。単一用量のMALAT−1ギャップマーオリゴヌクレオチドが、CD4+T細胞及び肝臓において、MALAT−1mRNAのレベルを低減することができることが判明した(図17及び18)。これらの結果は、オリゴをT細胞にin vivoで好適に送達することができることを立証するものである。
実施例2で同定したリードオリゴ候補は、マウスFoxP3遺伝子と1又は0のミスマッチを有するように設計された(以下の表7を参照)ため、これらのオリゴをマウスモデルにおいて試験する。マウスモデルの例として、GFP/RFPTregリポータマウス、EAE(多発性硬化症)及びNOD(1型糖尿病)マウスモデル、マウス炎症性疾患モデル、及びヒト化マウスモデルが挙げられる。炎症性疾患モデルの例として、移植片対宿主病(GvHD)モデル、炎症性腸疾患(IBD)モデル、例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎、関節リウマチモデル並びに乾癬モデルが挙げられる。GvHDモデルとしては、MHCミスマッチ若しくはmiHAミスマッチ宿主へのドナー細胞若しくは組織の導入、例えば、BALB/c(H2d)レシピエント株へのC57/B16(H2b)ドナー株脾細胞若しくはT細胞の導入、又はBALB.K(H2k)レシピエント株へのB10.Br(H2k)ドナー株骨髄細胞若しくはT細胞の導入を含む複数のモデルがある(例えば、Schroeder et al.Dis Model Mech.May 2011;4(3):318−333を参照)。IBDモデルとしては、遺伝子モデルIL−10R2−/−×優性陰性TGFβRIIマウス、SAMP1/Yit、Mdr1a−/−、IKKγ−/−、並びに化学薬剤モデル:デキストラン硫酸ナトリウム、2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸、及びオキサゾロンが挙げられる(例えば、Mizoguchi.Prog Mol Biol Transl Sci.2012;105:263−320を参照)。関節リウマチモデルとしては、コラーゲン誘導性関節炎、コラーゲン−抗体誘導性関節炎、抗原(例えば、完全フロイントアジュバント中のメチル化BSA)に感作された炎症性関節炎、TNF−aトランスジェニックマウス、SKGマウス、SCIDマウス、DR4−CD4マウス、及びDNaseII−/−IFN−IR−/−マウスが挙げられる(例えば、Asquith et al.Eur.J.Immunol.2009.39:1991−2058を参照)。乾癬モデルとしては、Ttc7fsn/Ttc7fsnマウス、K5−Stat3Cマウス、K14−IL−20マウス、K14−IL−6マウス、K5−潜在型TGFβ1マウス、K10−BMP−6マウス、K14−IL1αマウス、K14−VEGFマウス、IL1−raノックアウトマウス、IRF−2ノックアウトマウス、及びIKK2ノックアウトマウスがある(例えば、Gudjonsson et al.J Invest Dermatol.2007 Jun;127(6):1292−308を参照)。また、適切なマウスモデルは、例えば、Jackson Laboratory(Bar Harbor,Maine)又は別の商業的供給源から入手することも可能である。
ヒトEZH1及びEZH2mRNAをターゲティングし、分解するようにギャップマーを設計した。ギャップマーを用いて、FOXP3発現がEZH1及び/又はEZH2により調節される程度を評価した。
表1:ヒトmiRNAのシード配列ではない六量体
配列番号の範囲:60〜16461
Gランを含まない配列番号:
miRシードを含まない配列番号:
一本鎖オリゴヌクレオチド(標的遺伝子のセンス鎖)
配列番号の範囲:16426〜45713
Gランを含まない配列番号:
miRシードを含まない配列番号:
Claims (57)
- 配列5’−X−Y−Z(Xは、任意のヌクレオチドであり、Yは、ヒトミクロRNAのシード配列ではない、長さ6ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Zは、長さ1〜23ヌクレオチドのヌクレオチド配列である)を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、FOXP3遺伝子のPRC2関連領域の少なくとも8個の連続したヌクレオチドと相補的である一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、3個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない、請求項1に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、4個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない、請求項1又は2に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、8〜30ヌクレオチドの長さである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、8〜10ヌクレオチドの長さであり、かつ前記PRC2関連領域の相補的配列の1、2、若しくは3個を除く全てが、シトシン又はグアノシンヌクレオチドである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1個のヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記少なくとも1個のヌクレオチド類似体が、前記少なくとも1個のヌクレオチド類似体を有していないオリゴヌクレオチドと比較して、1〜5℃の範囲で前記オリゴヌクレオチドのTmの増加をもたらす、請求項6に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1個のヌクレオチドが、2’O−メチルを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、2’O−メチルを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個のリボヌクレオチド、少なくとも1個のデオキシリボヌクレオチド、又は少なくとも1個の架橋ヌクレオチドを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記架橋ヌクレオチドが、LNAヌクレオチド、cEtヌクレオチド又はENA修飾ヌクレオチドである、請求項10に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、LNAヌクレオチドである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド及び2’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを交互に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド及び2’−O−メチルヌクレオチドを交互に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド及びENAヌクレオチド類似体を交互に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド及びLNAヌクレオチドを交互に含む、請求項1〜A7のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドの5’ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである、請求項13〜16のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、LNAヌクレオチド及び2’−O−メチルヌクレオチドを交互に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドの5’ヌクレオチドが、LNAヌクレオチドである、請求項18に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドを含み、これらは、前記デオキシリボヌクレオチドの5’及び3’末端の各々で少なくとも1つのLNAヌクレオチドによりフランキングされている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 少なくとも2つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 全てのヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項21に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドの3’位置の前記ヌクレオチドが、3’ヒドロキシル基を有する、請求項1〜22のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドの3’位置の前記ヌクレオチドが、3’チオホスフェートを有する、請求項1〜22のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 5’ヌクレオチドに結合したビオチン部分をさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 第1染色体において、FOXP3遺伝子のPRC2関連領域の少なくとも8個の連続したヌクレオチドと相補的である相補性の領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであって、ここで、前記オリゴヌクレオチドが、以下:
a)5’−X−Y−Zである配列(Xは、任意のヌクレオチドであり、Xは、オリゴヌクレオチドの5’末端に固定されており、Yは、ミクロRNAのヒトシード配列ではない、長さ6ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Zは、長さ1〜23ヌクレオチドのヌクレオチド配列である);
b)3個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない配列;
c)ヌクレオチドの全ての配列に対し閾値レベルに満たない配列同一性を有し、オフターゲット遺伝子の5’末端の上流50キロベースから前記オフターゲット遺伝子の3’末端の下流50キロベースの間にある、第2ヌクレオチド配列と同等長さの配列;
d)少なくとも2つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するRNAをコードするPRC2関連領域と相補的な配列;並びに/又は
e)60%を超えるG−C含有率を有する配列
の少なくとも1つを有する、一本鎖オリゴヌクレオチド。 - 前記オリゴヌクレオチドが、配列5’−X−Y−Zを有し、前記オリゴヌクレオチドが、8〜50ヌクレオチドの長さである、請求項26の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、細胞に送達されると、前記細胞におけるCTLA4、GITR、及び/又はIL−10発現のレベルを増大することができる、請求項1〜27のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記細胞がT細胞である、請求項28に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、T細胞の集団に送達されると、前記T細胞の集団中のCD4+CD25+FOXP3+T細胞の数を増加させることができる、請求項1〜29のいずれか一項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜30のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
- 緩衝液中に、請求項1〜30のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、担体に結合される、請求項32に記載の組成物。
- 前記担体が、ペプチドである、請求項33に記載の組成物。
- 前記担体が、ステロイドである、請求項33に記載の組成物。
- 請求項31〜35のいずれか1項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
- 請求項31〜36のいずれか1項に記載の組成物を収納する容器を含むキット。
- 細胞におけるFOXP3の発現を増大する方法であって、請求項1〜30のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドを前記細胞に送達することを含む方法。
- 前記細胞への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを含まない対照細胞中のFOXP3の発現のレベルより少なくとも50%高いFOXP3の発現のレベルがもたらされる、請求項38に記載の方法。
- 前記細胞への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを含まない適切な対照細胞と比較して、増加したレベルのCTLA4、GITR、及び/又はIL−10発現がもたらされる、請求項38又は39に記載の方法。
- 前記細胞への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを含まない対照細胞におけるCTLA4、GITR、及び/又はIL−10発現のレベルより少なくとも30%高いCTLA4、GITR、及び/又はIL−10の発現のレベルがもたらされる、請求項40に記載の方法。
- 前記細胞が、T細胞である、請求項38〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 被験者におけるFOXP3の発現を増大する方法であって、請求項1〜30のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドを前記被験者に投与することを含む方法。
- 前記被験者への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない適切な対照被験者と比較して、前記被験者において増加したレベルのCTLA4、GITR、及び/又はIL−10発現がもたらされる、請求項43に記載の方法。
- 前記被験者への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない適切な対照被験者におけるCTLA4、GITR、及び/又はIL−10発現のレベルより少なくとも30%高いCTLA4、GITR、及び/又はIL−10の発現のレベルがもたらされる、請求項44に記載の方法。
- 前記被験者への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない対照被験者のT細胞と比較して、前記被験者のT細胞において増加したレベルのCTLA4、GITR、及び/又はIL−10発現がもたらされる、請求項43に記載の方法。
- 前記被験者への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが投与されていない前記対照被験者のT細胞におけるCTLA4、GITR、及び/又はIL−10発現のレベルより少なくとも30%高いCTLA4、GITR、及び/又はIL−10の発現のレベルが、前記被験者のT細胞にもたらされる、請求項46に記載の方法。
- 前記被験者への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドを投与していない対照被験者と比較して、CD4+CD25+FOXP3+T細胞の数の増加が、前記被験者にもたらされる、請求項43〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験者への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが投与されていない前記対照被験者におけるCD4+CD25+FOXP3+T細胞の数より少なくとも30%多いCD4+CD25+FOXP3+T細胞の数が、前記被験者にもたらされる、請求項48に記載の方法。
- 被験者におけるFOXP3のレベル低下に関連する状態又は疾患を治療する方法であって、請求項1〜30のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドを前記被験者に投与することを含む方法。
- 前記病状又は疾患が、異常な免疫細胞活性化に関連する、請求項50に記載の方法。
- 細胞においてFOXP3の発現を増大する方法であって、前記細胞へのEZH1 mRNA若しくはEZH2 mRNAの少なくとも8個の連続したヌクレオチドと相補的な相補性の領域を有するオリゴヌクレオチドを前記細胞に送達することを含む方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、8〜30ヌクレオチドの長さである、請求項52に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1個のヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体である、請求項52又は53に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ギャップマーを含む、請求項52〜54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ギャップマーが、少なくとも2個のヌクレオチド類似体により両側がフランキングされた少なくとも4個のDNAヌクレオチドから成る中央領域を含む、請求項55に記載の方法。
- 少なくとも2個のヌクレオチド類似体が、少なくとも1個のLNA又は少なくとも1個の2’−O修飾リボヌクレオチドである、請求項55に記載の方法。
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