JP2016534035A - 筋萎縮性側索硬化症を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

筋萎縮性側索硬化症を治療するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、ＡＬＳを有する被験者から得られた細胞又はＡＬＳを有する被験者におけるＳＭＮ１及び／若しくはＳＭＮ２の発現を調節する方法が提供される。一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、ＡＬＳを治療する方法も提供される。ある実施形態において、ＳＭＮ（ＳＭＮ１、ＳＭＮ２）をコードする遺伝子のＰＲＣ２関連領域をターゲティングする一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、これらの一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＰＲＣ２媒介によるＳＭＮ１又はＳＭＮ２の抑制を軽減又は阻止することにより、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を活性化又は増大する。ある実施形態では、細胞は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に関連する突然変異がないＳＭＮ１遺伝子を含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従い、２０１３年１０月４日に提出された「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＡＭＹＯＴＲＯＰＨＩＣ ＬＡＴＥＲＡＬ ＳＣＬＥＲＯＳＩＳ」と題する米国仮特許出願第６１／８８７，０１９号明細書の利益を請求する。尚、これら出願は全て、その全内容を参照により本明細書に組み込むものとする。
本発明は、オリゴヌクレオチドベースの組成物、並びに疾患を治療する目的でオリゴヌクレオチドベースの組成物を使用する方法に関する。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンに影響を及ぼし、最終的に死を招く進行性の神経変性疾患である。スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ１）などのいくつかの遺伝子がＡＬＳに関連し、これらは、肉腫中に融合／脂肪肉腫中に転位し（ＦＵＳ／ＴＬＳ）、正常なＴＡＲ ＤＮＡ−結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）、運動ニューロン（ＳＭＮ）及びその他の生存の消失に到る。現在、ＡＬＳの治療法はない。
生存運動ニューロン（ＳＭＮ）は、核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）の組み立てへのその関与を通して転写スプライシングに関与するタンパク質である。ｓｎＲＮＰは、前ｍＲＮＡと結合してスプライソソームを形成するタンパク質−ＲＮＡ複合体であり、これは、前ｍＲＮＡをスプライシングして、ほとんどの場合イントロンの除去を引き起こす。３つの遺伝子が、ＳＭＮ又はＳＭＮの変異体をコードし、ＳＭＮ又は、ＳＭＮ１（生存運動ニューロン１、テロメア）、ＳＭＮ２（生存運動ニューロン２、セントロメア）、及びＳＭＮＰ（生存運動ニューロン１、テロメア偽遺伝子）が挙げられる。ＳＭＮ１及びＳＭＮ２は、ヒトにおいて５ｑ１３での遺伝子重複の結果生じる。ＳＭＮ活性が不足すると、特に脊髄運動ニューロンにおいて、広範に広がるスプライシングの欠損が起こり、脊髄下位運動ニューロンの変性を招く。
本発明の態様は、運動ニューロン疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮、進行性球麻痺又は仮性球麻痺などを治療する方法及び組成物に関する。ある実施形態では、ＡＬＳを治療する方法であって、細胞（例えば、運動ニューロン）にＳＭＮの上方制御を引き起こす１つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドを、ＡＬＳを有する被験者に投与するステップを含む方法が提供される。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＳＭＮ遺伝子（例えば、ヒトＳＭＮ１、ヒトＳＭＮ２）のＰＲＣ２関連領域をターゲティングし、これにより該遺伝子の上方制御を引き起こす一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。例えば、本発明のある態様によれば、ＡＬＳを治療する目的で、細胞における完全長ＳＭＮタンパク質の発現を増大する方法が提供される。他の態様では、運動ニューロン疾患（例えば、ＡＬＳ、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮、進行性球麻痺、仮性球麻痺、又はＳＭＡ）を有する患者の細胞（例えば、運動ニューロン）においてＧｅｍ形成を促進する方法及び組成物が本明細書に提供される。従って、ある実施形態では、ニューロンにおけるスプライソソーム完全性を少なくとも部分的に改善する方法及び組成物が提供される。
従って、本明細書に開示する本発明の態様は、細胞におけるＳＭＮ１又はＳＭＮ２を上方制御する上で有用な方法及び組成物を提供する。ある実施形態において、ＳＭＮ（ＳＭＮ１、ＳＭＮ２）をコードする遺伝子のＰＲＣ２関連領域をターゲティングする一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、これらの一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＰＲＣ２媒介によるＳＭＮ１又はＳＭＮ２の抑制を軽減又は阻止することにより、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を活性化又は増大する。ある実施形態では、細胞は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に関連する突然変異がないＳＭＮ１遺伝子を含む。
ある実施形態において、本明細書に記載される方法は、対象細胞においてエキソン７を含む（又は包含する）ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の成熟ｍＲＮＡの発現を増大するのに十分な量で、ＳＭＮ遺伝子のＰＲＣ２関連領域、例えば、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域と相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、ＳＭＮ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを細胞に送達することを含む。ある実施形態では、細胞は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に関連する突然変異がないＳＭＮ１遺伝子を含む。
本発明のある態様によれば、ＳＭＮ遺伝子のＰＲＣ２関連領域、例えば、配列番号１、２、４、若しくは５として記載されるヌクレオチド配列のＰＲＣ２関連領域（例えば、その少なくとも８個の連続したヌクレオチド）と相補的な相補性の領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下に挙げる特徴の少なくとも１つを有する：ａ）５’Ｘ−Ｙ−Ｚの配列（ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｘはオリゴヌクレオチドの５’末端にあり、Ｙは、ミクロＲＮＡのヒトシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である）；ｂ）３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない配列；ｃ）ヌクレオチドの全ての配列に対し閾値レベルに満たない配列同一性を有し、オフターゲット遺伝子の５’末端の上流５０キロベースからオフターゲット遺伝子の３’末端の下流５０キロベースの間にある、第２ヌクレオチド配列と同等の長さの配列；ｄ）少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的な配列；並びにｅ）６０％を超えるＧ−Ｃ含有率を有する配列。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも２つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも３つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の少なくとも４つを有し、これらは各々独立に選択される。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、特徴ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、及びｅ）の各々を有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドが８〜５０ヌクレオチドの長さである配列５’Ｘ−Ｙ−Ｚを有する。
本発明のある態様によれば、配列Ｘ−Ｙ−Ｚを有する一本鎖オリゴヌクレオチドが提供され、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ヒトミクロＲＮＡのシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、この一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＳＭＮ遺伝子のＰＲＣ２関連領域、例えば、配列番号１、２、４、若しくは５として記載されるヌクレオチド配列のＰＲＣ２関連領域と相補的である。本発明のある態様では、配列５’Ｘ−Ｙ−Ｚを有する一本鎖オリゴヌクレオチドが提供され、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ヒトミクロＲＮＡのシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、この一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＳＭＮ遺伝子のＰＲＣ２関連領域、例えば、配列番号１、２、４、若しくは５として記載されるヌクレオチド配列のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的である。ある実施形態では、Ｙは、表１から選択される配列である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号９〜１８のいずれか１つに記載される配列である。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３０〜１３０８７又は１３１０８〜１３１１６のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８個のヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３０〜１３０８７又は１３１０８〜１３１１６のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含み、ここで、提供されるヌクレオチド配列の５’末端は、オリゴヌクレオチドの５’末端である。ある実施形態では、相補性の領域（例えば、少なくとも８個の連続したヌクレオチド）は、配列番号７又は８に記載されるヌクレオチド配列内にも存在する。
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号９〜１４のいずれか１つに記載される配列である。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３０〜８３２９及び１３０９３〜１３０９４のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８個のヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３０〜８３２９及び１３０９３〜１３０９４のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含み、ここで、提供されるヌクレオチド配列の５’末端は、オリゴヌクレオチドの５’末端である。ある実施形態では、少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、配列番号７に記載されるヌクレオチド配列内にも存在する。
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号１５〜１８のいずれか１つに記載される配列である。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号１１５８〜１１５９、１１７１、１４８２〜１４８３、１４８５〜１４８６、２４６５〜２４７１、２４８８〜２４９０、２５４２〜２５４６、２６５６〜２６５７、２８３３〜２８３５、３４３９〜３４４０、３９１６〜３９１８、４４６９〜４４７２、４８２１、５４２９、５５３７、６０６１、７３２７、８３３０〜１３０６１、及び１３０６２〜１３０８７、及び１３１０８〜１３１１６のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８個のヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、配列番号８に記載されるヌクレオチド配列内に存在する。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３０〜１３０８７又は１３１０８〜１３１１６のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが５０ヌクレオチド以下である。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３０〜１３０８７又は１３１０８〜１３１１６のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列の少なくとも８個のヌクレオチドの断片を含む。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、表４に記載されるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、表４又は表６に記載されるヌクレオチド配列の少なくとも８個のヌクレオチドの断片を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、表４又は表６に記載されるヌクレオチド配列から構成される。
本発明のある態様によれば、一般式Ａ−Ｂ−Ｃを含む化合物が提供され、ここで、Ａは、１遺伝子のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドであり、Ｂは、リンカーであり、Ｃは、上記遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドである。ある実施形態では、Ｂは、オリゴヌクレオチド、ペプチド、低ｐＨ不安定結合、又はジスルフィド結合を含む。ある実施形態では、スプライス制御配列は、上記遺伝子のエキソン内に常在する。ある実施形態では、スプライス制御配列は、上記遺伝子のイントロン−エキソン接合部を横断する。ある実施形態では、スプライス制御配列は、上記遺伝子のイントロン内に常在する。ある実施形態では、スプライス制御配列は、少なくとも１つのｈｎＲＮＡＰ結合配列を含む。ある実施形態では、Ｃの配列を有するオリゴヌクレオチドと、１細胞におけるｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列とのハイブリダイゼーションにより、上記細胞におけるｍＲＮＡ前駆体のプロセシングから生じる成熟ｍＲＮＡでの特定のエキソンの封入が起こる。ある実施形態では、Ｃの配列を有するオリゴヌクレオチドと、１細胞におけるｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列とのハイブリダイゼーションにより、上記細胞におけるｍＲＮＡ前駆体のプロセシングから生じる成熟ｍＲＮＡでの特定のイントロン又はエキソンの排除が起こる。
ある実施形態において、遺伝子は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２である。ある実施形態では、スプライス制御配列は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のイントロン６、イントロン７、エキソン７、エキソン８又はイントロン７とエキソン８の接合部に存在する。ある実施形態では、スプライス制御配列は、配列：ＣＡＧＣＡＵＵＡＵＧＡＡＡＧ（配列番号１３１００）を含む。ある実施形態では、Ｂは、以下：ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号１３０８８）；ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣ（配列番号１３０８９）；ＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴ（配列番号１３０９０）；ＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧ（配列番号１３０９０）；及びＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号１３０９２）から選択される配列を含む。
ある実施形態において、Ａは、配列５’Ｘ−Ｙ−Ｚを有し、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ヒトミクロＲＮＡのシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。ある実施形態では、ＳＭＮ遺伝子２のＰＲＣ２関連領域は、配列番号１、２、４、若しくは５内のＰＲＣ２関連領域である。ある実施形態では、Ｙは、表１から選択される配列である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号９〜２３のいずれか１つに記載される配列である。ある実施形態において、Ａは、配列番号３０〜８３２９及び１３０８８〜１３０９４のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８個のヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、Ａは、配列番号３０〜８３２９及び１３０８８〜１３０９４のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含み、ここで、提供されるヌクレオチド配列の５’末端は、Ａの５’末端である。ある実施形態では、少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、配列番号７に記載されるヌクレオチド配列内にも存在する。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号２４〜２９のいずれか１つに記載される配列である。
ある実施形態において、Ａは、配列番号１１５８〜１１５９、１１７１、１４８２〜１４８３、１４８５〜１４８６、２４６５〜２４７１、２４８８〜２４９０、２５４２〜２５４６、２６５６〜２６５７、２８３３〜２８３５、３４３９〜３４４０、３９１６〜３９１８、４４６９〜４４７２、４８２１、５４２９、５５３７、６０６１、７３２７、８３３０〜１３０６１、１３０６２〜１３０８７、及び１３１０８〜１３１１６のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８個のヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、配列番号８に記載されるヌクレオチド配列内に存在する。ある実施形態では、Ａは、３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない。ある実施形態では、Ａは、４個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない。ある実施形態では、Ａ又はＣは、長さ８〜３０ヌクレオチドである。ある実施形態では、Ａは、長さ８〜１０ヌクレオチドであり、ＰＲＣ２関連領域の相補的配列のヌクレオチドの１、２、又は３個を除く全てが、シトシン又はグアノシンヌクレオチドである。ある実施形態では、Ｂは、１〜１０個のチミジン又はウリジンを含むオリゴヌクレオチドである。ある実施形態では、Ｂは、Ａ及びＣに比して、哺乳動物抽出物中で切断を受けやすい。
ある実施形態において、Ａは、以下：ＧＣＴＵＴＧＧＧＡＡＧＵＡＵＧ（配列番号１１３９４）、ＣＵＴＵＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧ（配列番号１１３９５）及びＧＧＴＡＣＡＴＧＡＧＴＧＧＣＴ（配列番号１１４１９）から選択されるヌクレオチド配列を含み；Ｂは、ヌクレオチド配列ＴＴＴＴ又はＵＵＵＵを含み；Ｃは、ヌクレオチド配列ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号１３０８８）；ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣ（配列番号１３０８９）；ＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴ（配列番号１３０９０）；ＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧ（配列番号１３０９１）；又はＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号１３０９２）を含み、ここで、Ａの３’末端はＢの５’末端に連結され、Ｂの３’末端はＣの５’末端に連結されている。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、４個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さが８〜３０ヌクレオチドである。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さが５０ヌクレオチド以下である。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さ８〜１０ヌクレオチドであり、ＰＲＣ２関連領域の相補的配列のヌクレオチドの１、２、又は３個を除く全てが、シトシン又はグアノシンヌクレオチドである。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＳＭＮ遺伝子のＰＲＣ２関連領域、例えば、配列番号１、２、４、若しくは５として記載されるヌクレオチド配列のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的であり、ここで、一本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、以下：
（ａ）（Ｘ）Ｘｘｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘｘＸｘ及び（Ｘ）ｘｘｘｘｘＸ、
（ｂ）（Ｘ）ＸＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘＸ及び（Ｘ）ｘｘｘｘＸＸ、
（ｃ）（Ｘ）ＸＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘＸ及び（Ｘ）ＸｘＸｘＸｘ、
（ｄ）（Ｘ）ｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸｘ、及び（Ｘ）ＸＸＸＸｘｘ、
（ｅ）（Ｘ）ｘＸＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸＸｘＸ及び（Ｘ）ＸＸＸＸＸｘ、並びに
（ｆ）ＸＸＸＸＸＸ、ＸｘＸＸＸＸＸ、ＸＸｘＸＸＸＸ、ＸＸＸｘＸＸＸ、ＸＸＸＸｘＸＸ、ＸＸＸＸＸｘＸ及びＸＸＸＸＸＸｘ
からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１つ又は複数を含み、ここで、「Ｘ」は、ヌクレオチド類似体を示し、（Ｘ）は、任意選択のヌクレオチド類似体を示し、「ｘ」は、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチド単位を示す。
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体である。ある実施形態では、上記の少なくとも１個のヌクレオチド類似体によって、上記の少なくとも１個のヌクレオチド類似体を含まないオリゴヌクレオチドと比較して、１〜５℃の範囲のオリゴヌクレオチドのＴｍの増加が起こる。
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、２’Ｏ−メチルを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、２’Ｏ−メチルを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、又は少なくとも１個の架橋ヌクレオチドを含む。ある実施形態では、架橋ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド又はＥＮＡ修飾ヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドである。
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡヌクレオチド類似体を交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドと２’Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオチドによりフランキングされているデオキシリボヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個又は６個以上のヌクレオチドの間に、修飾されたヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合又は他の結合）を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、全ヌクレオチドの間に、修飾されたヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合又は他の結合）を含む。
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’チオホスフェートを有する。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、その５’又は３’ヌクレオチドに結合したビオチン部分又は他の部分を有する。ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、その５’又は３’末端に、コレステロール、ビタミンＡ、葉酸塩、シグマ受容体リガンド、アプタマー、ＣＰＰなどのペプチド、脂質などの疎水性分子、ＡＳＧＰＲ又は動的ポリ抱合体並びにそれらの変異体を有する。
本発明のある態様によれば、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドのいずれかと、担体とを含む組成物が提供される。ある実施形態では、緩衝液中にオリゴヌクレオチドのいずれかを含む組成物が提供される。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、担体と結合している。ある実施形態では、担体は、ペプチドである。ある実施形態では、担体は、ステロイドである。本発明のある態様によれば、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
本発明のある態様によれば、本明細書に開示する組成物のいずれかを収納する容器を含むキットが提供される。
本発明のいくつかの態様によれば、細胞におけるＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を増大する方法が提供される。ある実施形態では、細胞は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に関連する突然変異がないＳＭＮ１遺伝子を含む。ある実施形態では、細胞は、野生型ＳＭＮ１遺伝子を有する。ある実施形態では、本方法は、細胞に、本明細書に開示する一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれか１つ又は複数を送達するステップを含む。ある実施形態では、細胞への一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、一本鎖オリゴヌクレオチドを含まない対照細胞におけるＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現のレベルより高い（例えば、少なくとも５０％高い）ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現のレベルがもたらされる。
本発明の一部の態様によれば、被験者においてＳＭＮ１又はＳＭＮ２のレベルを増加する方法が提供される。本発明の一部の態様によれば、被験者におけるＳＭＮ１又はＳＭＮ２のレベル低下を伴う状態（例えば、ＡＬＳ、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮、進行性球麻痺、仮性球麻痺）を治療する方法が提供される。ある実施形態では、本方法は、本明細書に開示する一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれか１つ又は複数を被験者に投与するステップを含む。
本発明の態様は、細胞におけるＳＭＮタンパク質の発現を増大する方法に関する。ある実施形態では、細胞は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に関連する突然変異がないＳＭＮ１遺伝子を含む。ある実施形態では、本方法は、上記細胞においてエキソン７を含むＳＭＮ２の成熟ｍＲＮＡの発現を増大するのに十分な量で、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを上記細胞に送達することを含む。ある実施形態では、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な領域は、ＳＭＮ１の対応する領域に対して少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、又は９つ以上のミスマッチを有する。本明細書で用いる「スプライス制御配列」という用語は、ｍＲＮＡ前駆体に存在する場合、細胞におけるそのｍＲＮＡ前駆体のスプライシングに影響を与えるヌクレオチド配列を指す。ある実施形態では、スプライス制御配列は、ｈｎＲＮＡＰタンパク質などの、ｍＲＮＡスプライシングを調節する分子に対する１つ又は複数の結合部位を含む。ある実施形態では、スプライス制御配列は、配列ＣＡＧ又はＡＡＡＧを含む。ある実施形態では、スプライス制御配列は、エキソン（例えば、エキソン７又はエキソン８などのＳＭＮ１又はＳＭＮ２のエキソン）に存在する。ある実施形態では、スプライス制御配列は、イントロン−エキソン接合部（例えば、イントロン６／エキソン７接合部又はイントロン７／エキソン８接合部などのＳＭＮ１又はＳＭＮ２のイントロン−エキソン接合部）を横断する。ある実施形態では、スプライス制御配列は、イントロン（例えば、イントロン６又はイントロン７などのＳＭＮ１又はＳＭＮ２のイントロン）に常在する。ある実施形態では、スプライス制御配列は、配列ＣＡＧＣＡＵＵＡＵＧＡＡＡＧ（配列番号１３１００）又はその一部を含む。
ある実施形態において、第２一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下：ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号１３０８８）；ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣ（配列番号１３０８９）；ＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴ（配列番号１３０９０）；ＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧ（配列番号１３０９１）；又はＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号１３０９２）から選択される配列を含むスプライススイッチングオリゴヌクレオチドである。ある実施形態では、第２一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さが８〜３０ヌクレオチドである。
本発明のある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列５’Ｘ−Ｙ−Ｚを有し、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ヒトミクロＲＮＡのシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。ある実施形態では、ＳＭＮ２遺伝子のＰＲＣ２関連領域は、配列番号１、２、４、若しくは５内のＰＲＣ２関連領域である。ある実施形態では、Ｙは、表１から選択される配列である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号９〜２３のいずれか１つに記載される配列である。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３０〜８３２９及び１３０８８〜１３０９４のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８個のヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３０〜８３２９及び１３０８８〜１３０９４のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含み、ここで、提供されるヌクレオチド配列の５’末端は、第１一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端である。ある実施形態では、少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、配列番号７に記載されるヌクレオチド配列内にも存在する。
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号２４〜２９のいずれか１つに記載される配列である。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号１１５８〜１１５９、１１７１、１４８２〜１４８３、１４８５〜１４８６、２４６５〜２４７１、２４８８〜２４９０、２５４２〜２５４６、２６５６〜２６５７、２８３３〜２８３５、３４３９〜３４４０、３９１６〜３９１８、４４６９〜４４７２、４８２１、５４２９、５５３７、６０６１、７３２７、８３３０〜１３０６１、１３０６２〜１３０８７、及び１３１０８〜１３１１６のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８個のヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、配列番号８に記載されるヌクレオチド配列内に存在する。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、４個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さが８〜３０ヌクレオチドである。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さ８〜１０ヌクレオチドであり、ＰＲＣ２関連領域の相補的配列のヌクレオチドの１、２、又は３個を除く全てが、シトシン又はグアノシンヌクレオチドである。
ある実施形態において、第１一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２一本鎖オリゴヌクレオチドは、細胞に同時に投与する。ある実施形態では、細胞は被験者において存在し、細胞に送達するステップは、第１一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２一本鎖オリゴヌクレオチドを共製剤として被験者に投与することを含む。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して第２一本鎖オリゴヌクレオチドと共有結合している。ある実施形態では、リンカーは、オリゴヌクレオチド、ペプチド、低ｐＨ不安定性結合、又はジスルフィド結合を含む。ある実施形態では、リンカーは、オリゴヌクレオチドを含み、任意選択で、このオリゴヌクレオチドは、１〜１０のチミジン又はウリジンを含む。ある実施形態では、リンカーは、第１及び第２一本鎖オリゴヌクレオチドに比べ、哺乳動物抽出物において切断されやすい。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、第２一本鎖オリゴヌクレオチドと共有結合していない。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２一本鎖オリゴヌクレオチドは、細胞に個別に送達される。
ある態様によれば、被験者におけるＡＬＳを治療するための方法が提供される。本方法は、ある実施形態では、上記被験者においてＳＭＮタンパク質の発現を増大するのに十分な量で、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを上記被験者に送達することを含む。
本発明のある態様によれば、被験者におけるＡＬＳを治療するための方法が提供され、この方法は、上記被験者においてＳＭＮタンパク質の発現を増大するのに十分な量で、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域と相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを上記被験者に送達することを含む。関連する組成物も提供される。ある実施形態では、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む組成物が提供される。ある実施形態では、１遺伝子のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドと、これにリンカーを介して結合された上記遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む組成物が提供される。ＳＭＮ１又はＳＭＮ２発現を調節する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む関連キットも提供される。
本発明のある態様によれば、本明細書に開示するオリゴヌクレオチド又は化合物のいずれかと、担体を含む組成物が提供される。ある実施形態では、緩衝液中にオリゴヌクレオチドまたは化合物のいずれかを含む組成物が提供される。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、担体と結合している。ある実施形態では、担体は、ペプチドである。ある実施形態では、担体は、ステロイドである。本発明のある態様によれば、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
本発明のある態様によれば、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む組成物が提供される。ある実施形態では、スプライス制御配列は、ＳＭＮ２のエキソン内に常在する。ある実施形態では、エキソンは、エキソン７又は８である。ある実施形態では、スプライス制御配列は、ＳＭＮ２のイントロン−エキソン接合部を横断する。ある実施形態では、イントロン−エキソン接合部は、イントロン６／エキソン７接合部又はイントロン７／エキソン８接合部である。ある実施形態では、スプライス制御配列は、ＳＭＮ２のイントロン内に常在する。ある実施形態では、イントロンは、イントロン６又はイントロン７（配列番号１３１０１）である。ある実施形態では、スプライス制御配列は、配列：ＣＡＧＣＡＵＵＡＵＧＡＡＡＧ（配列番号１３１００）又はその一部を含む。ある実施形態では、スプライス制御配列は、少なくとも１つのｈｎＲＮＡＰ結合配列を含む。ある実施形態では、第２一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下：ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号１３０８８）；ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣ（配列番号１３０８９）；ＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴ（配列番号１３０９０）；ＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧ（配列番号１３０９１）；及びＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号１３０９２）から選択される配列を含む。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列５’Ｘ−Ｙ−Ｚを有し、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ヒトミクロＲＮＡのシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。ある実施形態では、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域は、配列番号１、２、４、若しくは５内のＰＲＣ２関連領域である。ある実施形態では、Ｙは、表１から選択される配列である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号９〜２３のいずれか１つに記載される配列である。ある実施形態において、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３０〜８３２９及び１３０９３〜１３０９４のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８個のヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３０〜８３２９及び１３０９３〜１３０９４のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含み、ここで、提供されるヌクレオチド配列の５’末端は、第１一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端である。ある実施形態では、少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、配列番号７に記載されるヌクレオチド配列内にも存在する。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号２４〜２９のいずれか１つに記載される配列である。ある実施形態において、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下：配列番号１１５８〜１１５９、１１７１、１４８２〜１４８３、１４８５〜１４８６、２４６５〜２４７１、２４８８〜２４９０、２５４２〜２５４６、２６５６〜２６５７、２８３３〜２８３５、３４３９〜３４４０、３９１６〜３９１８、４４６９〜４４７２、４８２１、５４２９、５５３７、６０６１、７３２７、８３３０〜１３０６１、１３０６２〜１３０８７、及び１３１０８〜１３１１６のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８個のヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、配列番号８に記載されるヌクレオチド配列内に存在する。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、３個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、４個以上の連続したグアノシンヌクレオチドを含まない。ある実施形態では、第１及び／又は第２一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さが８〜３０ヌクレオチドである。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さが８〜１０ヌクレオチドであり、ＰＲＣ２関連領域の相補的配列のヌクレオチドの１、２、又は３個を除く全てが、シトシン又はグアノシンヌクレオチドである。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して第２一本鎖オリゴヌクレオチドと共有結合している。ある実施形態では、リンカーは、オリゴヌクレオチド、ペプチド、低ｐＨ不安定性結合、又はジスルフィド結合を含む。ある実施形態では、リンカーは、オリゴヌクレオチドを含み、任意選択で、このオリゴヌクレオチドは、１〜１０個のチミジン又はウリジンを含む。ある実施形態では、リンカーは、第１及び第２一本鎖オリゴヌクレオチドに比べ、哺乳動物抽出物中で切断を受けやすい。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、第２一本鎖オリゴヌクレオチドと共有結合していない。ある実施形態では、組成物は、担体をさらに含む。ある実施形態では、担体は、薬学的に許容される担体である。
本発明の別の態様は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を活性化又は増大するためのオリゴヌクレオチドを選択する方法を提供する。ある実施形態では、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を活性化又は増大するための候補が豊富な（例えば、オリゴヌクレオチドの無作為選択と比較して）オリゴヌクレオチドのセットを選択する方法が提供される。従って、本方法は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を活性化又は増大するオリゴヌクレオチドが豊富な臨床候補のセットを確立するのに用いることができる。このようなライブラリーを用いて、例えば、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２を処置するための治療薬を開発するためのリードオリゴヌクレオチドを同定することもできる。さらに、ある実施形態では、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を活性化する目的で、一本鎖オリゴヌクレオチドの薬物動態学、生体分布、生物学的利用能及び／又は効力を制御するのに有用なオリゴヌクレオチド化学が提供される。
本発明の別の態様によれば、本明細書に開示される組成物のいずれかを収納する容器を含むキットが提供される。本発明の他の態様によれば、１遺伝子のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドを収納する第１容器と；上記遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドを収納する第２容器とを含むキットが提供される。ある実施形態では、スプライス制御配列は、上記遺伝子のエキソン内に常在する。ある実施形態では、スプライス制御配列は、上記遺伝子のイントロン−エキソン接合部を横断する。ある実施形態では、スプライス制御配列は、上記遺伝子のイントロン内に常在する。ある実施形態では、スプライス制御配列は、少なくとも１つのｈｎＲＮＡＰ結合配列を含む。ある実施形態では、Ｃの配列を有するオリゴヌクレオチドと、１細胞におけるｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列とのハイブリダイゼーションにより、上記細胞におけるｍＲＮＡ前駆体のプロセシングから生じる成熟ｍＲＮＡでの特定のエキソンの封入が起こる。ある実施形態では、Ｃの配列を有するオリゴヌクレオチドと、１細胞におけるｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列とのハイブリダイゼーションにより、上記細胞におけるｍＲＮＡ前駆体のプロセシングから生じる成熟ｍＲＮＡでの特定のイントロン又はエキソンの排除が起こる。ある実施形態において、遺伝子は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２である。ある実施形態では、スプライス制御配列は、イントロン６、イントロン７、エキソン７、エキソン８、又はイントロン７とエキソン８の接合部に常在する。ある実施形態では、スプライス制御配列は、配列：ＣＡＧＣＡＵＵＡＵＧＡＡＡＧ（配列番号１３１００）を含む。ある実施形態では、第２一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下：ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号１３０８８）；ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣ（配列番号１３０８９）；ＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴ（配列番号１３０９０）；ＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧ（配列番号ＸＸ）；及びＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号１３０９１）から選択される配列を含む。ある実施形態において、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列５’Ｘ−Ｙ−Ｚを有し、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ヒトミクロＲＮＡのシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。ある実施形態では、ＳＭＮ遺伝子２のＰＲＣ２関連領域は、配列番号１、２、４、若しくは５内のＰＲＣ２関連領域である。ある実施形態では、Ｙは、表１から選択される配列である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号９〜２３のいずれか１つに記載される配列である。ある実施形態において、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３０〜８３２９及び１３０９３〜１３０９４のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８個のヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３０〜８３２９及び１３０９３〜１３０９４のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含み、ここで、提供されるヌクレオチド配列の５’末端は、第１一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端である。ある実施形態では、少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、配列番号７に記載されるヌクレオチド配列内にも存在する。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号２４〜２９のいずれか１つに記載される配列である。ある実施形態において、第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下：配列番号１１５８〜１１５９、１１７１、１４８２〜１４８３、１４８５〜１４８６、２４６５〜２４７１、２４８８〜２４９０、２５４２〜２５４６、２６５６〜２６５７、２８３３〜２８３５、３４３９〜３４４０、３９１６〜３９１８、４４６９〜４４７２、４８２１、５４２９、５５３７、６０６１、７３２７、８３３０〜１３０６１、１３０６２〜１３０８７、及び１３１０８〜１３１１６のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は少なくとも８個のヌクレオチドであるその断片を含む。ある実施形態では、少なくとも８個の連続したヌクレオチドは、配列番号８に記載されるヌクレオチド配列内に存在する。
ＳＭＮ１及びＳＭＮ２ｍＲＮＡプロセシングの概略図を示す。 実施例２で試験した細胞株の遺伝子型及び特許情報の概略を示す表である。また、細胞株中のベースラインＳＭＳタンパク質レベルも示す。 細胞株３８１４における、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令されたオリゴヌクレオチド（オリゴ１〜５２及び５９〜１０１）及びスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（オリゴ５３〜５８）の、ＳＭＮ ｍＲＮＡ発現に対する作用を示すＲＴ−ＰＣＲアッセイ（ＳＭＮ１／２．のエキソン１に対して指令されたＰＣＲプライマー）の結果を表示する。 細胞株３８１３における、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令されたオリゴヌクレオチド（オリゴ１〜５２及び５９〜１０１）及びスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（オリゴ５３〜５８）の、ＳＭＮ ｍＲＮＡ発現に対する作用を示すＲＴ−ＰＣＲアッセイ（ＳＭＮ１／２のエキソン１に対して指令されたＰＣＲプライマー）の結果を表示する。 スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（オリゴ５３〜５８）が、完全長ＳＭＮ２の発現を増大することを示す。結果は、ＤｄｅＩ制限消化後に得られたＰＣＲ産物のゲル分離解析に基づく。２つの細胞株３８１３及び９６７７を試験した。ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域をターゲティングするオリゴ８４は、細胞に単独で送達された場合、完全長ＳＭＮ２の発現に増大を示さなかった。 ＳＭＮ ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｏ）アッセイの結果を提供し、これらは、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令された特定のオリゴヌクレオチド単独では、ＳＭＮ発現が低下した特定の患者線維芽細胞におけるトランスフェクションから２４時間後のＳＭＮ２タンパク質を有意に増加しない（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ処理細胞（破線）と比較して）ことを示している。 ＳＭＮ ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｏ）アッセイの結果を提供し、これらは、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令された特定のオリゴヌクレオチド単独では、ＳＭＮ発現が低下した特定の患者線維芽細胞におけるトランスフェクションから２４時間後のＳＭＮ２タンパク質を有意に増加しない（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ処理細胞（破線）と比較して）ことを示している。 ＳＭＮ ＥＬＩＳＡの結果を提供し、これらは、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令されたオリゴヌクレオチドが、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（オリゴ５３）と組み合わせると、ＳＭＮ発現が低下した患者線維芽細胞におけるトランスフェクションから２４時間後のＳＭＮ２タンパク質を有意に増加する（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ処理細胞（破線）と比較して）ことを示している。 ＳＭＮ ＥＬＩＳＡの結果を提供し、これらは、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令されたオリゴヌクレオチドが、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（オリゴ５３）と組み合わせると、ＳＭＮ発現が低下した患者線維芽細胞におけるトランスフェクションから２４時間後のＳＭＮ２タンパク質を有意に増加する（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ処理細胞（破線）と比較して）ことを示している。 ＳＭＮ ＥＬＩＳＡの結果を提供し、これらは、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令されたオリゴヌクレオチドが、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（オリゴ５４）と組み合わせると、ＳＭＮ発現が低下した患者線維芽細胞におけるトランスフェクションから２４時間後のＳＭＮ２タンパク質を有意に増加する（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ処理細胞（破線）と比較して）ことを示している。 ＳＭＮ ＥＬＩＳＡの結果を提供し、これらは、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令されたオリゴヌクレオチドが、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（オリゴ５４）と組み合わせると、ＳＭＮ発現が低下した患者線維芽細胞におけるトランスフェクションから２４時間後のＳＭＮ２タンパク質を有意に増加する（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ処理細胞（破線）と比較して）ことを示している。 ＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を提供し、これらは、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令されたオリゴヌクレオチドが、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（オリゴ５３又は５４）と組み合わせると、ＳＭＡ患者線維芽細胞におけるトランスフェクションから２４時間後のＳＭＮ２タンパク質を有意に増加する（陰性対照オリゴ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ処理細胞と比較して）ことを示している。ＬＮＡ／２’ＯＭｅの交互オリゴヌクレオチド（ＬＭ設計）及びＤＮＡ／ＬＮＡ交互オリゴヌクレオチド（ＤＬ設計）を試験した。 ＥＥＤノックダウン後のＥＥＤ（胚体外胚葉発生）ｍＲＮＡのレベルを示すグラフを提供する。 ＥＥＤノックダウン後のＳＭＮ２ｍＲＮＡのレベルを示すグラフを提供する。全長（ＦＬ）のレベル及びエキソン７欠失（ｄｅｌ７）ＳＭＮ２ｍＲＮＡのレベルを示す。 対照（細胞のみ、又はリポフェクタミンだけで処理した細胞）と比較した、ＳＭＮオリゴ７７若しくは８３での処理後のＳＭＮ２ｍＲＮＡのレベルを示すグラフを提供する。全長（ＦＬ）のレベル及びエキソン７欠失（ｄｅｌ７）ＳＭＮ２ｍＲＮＡのレベルを示す。 ＳＭＮ２遺伝子座及び図１１〜１４に示す遺伝子座内の特定の領域の位置を示す図を提供する。 ＰＲＣ２成分のノックダウンが、ＳＭＮクロマチンにおけるＥＺＨ２の存在を低減することを示す一連のグラフを提供する。図１１Ｂは、ＥＺＨ２ＣｈＩＰ（クロマチン免疫沈降）データを示し、図１１Ｃは、Ｈ３Ｋ２７ｍ３ＣｈＩＰデータを示す。 ＰＲＣ２成分のノックダウンが、ＳＭＮクロマチンにおけるＥＺＨ２の存在を低減することを示す一連のグラフを提供する。図１１Ｂは、ＥＺＨ２ＣｈＩＰ（クロマチン免疫沈降）データを示し、図１１Ｃは、Ｈ３Ｋ２７ｍ３ＣｈＩＰデータを示す。 ＨＯＸＣ１３プロモータにおけるＨ３、Ｈ３Ｋ４ｍ３、Ｈ３Ｋ２７ｍ３、Ｈ３Ｋ３６ｍ３、ＲＮＡ ｐｏｌＩＩ＿Ｓ２及びＥＺＨ２の存在を示すグラフを提供する。 ＰＲＣ２成分のノックダウンが、転写活性のマークの増加をもたらすことを示す一連のグラフを提供する。図１２Ａは、Ｈ３Ｋ３６ｍ３ＣｈＩＰデータを示し、図１２Ｂは、ＲＮＡ ｐｏｌＩＩＳ２ＣｈＩＰデータを示し、図１２Ｃは、Ｈ３Ｋ４ｍ３ＣｈＩＰデータを示し、図１２Ｄは、Ｈ３ＣｈＩＰデータを示す。 ＰＲＣ２成分のノックダウンが、転写活性のマークの増加をもたらすことを示す一連のグラフを提供する。図１２Ａは、Ｈ３Ｋ３６ｍ３ＣｈＩＰデータを示し、図１２Ｂは、ＲＮＡ ｐｏｌＩＩＳ２ＣｈＩＰデータを示し、図１２Ｃは、Ｈ３Ｋ４ｍ３ＣｈＩＰデータを示し、図１２Ｄは、Ｈ３ＣｈＩＰデータを示す。 ＰＲＣ２成分のノックダウンが、転写活性のマークの増加をもたらすことを示す一連のグラフを提供する。図１２Ａは、Ｈ３Ｋ３６ｍ３ＣｈＩＰデータを示し、図１２Ｂは、ＲＮＡ ｐｏｌＩＩＳ２ＣｈＩＰデータを示し、図１２Ｃは、Ｈ３Ｋ４ｍ３ＣｈＩＰデータを示し、図１２Ｄは、Ｈ３ＣｈＩＰデータを示す。 ＰＲＣ２成分のノックダウンが、転写活性のマークの増加をもたらすことを示す一連のグラフを提供する。図１２Ａは、Ｈ３Ｋ３６ｍ３ＣｈＩＰデータを示し、図１２Ｂは、ＲＮＡ ｐｏｌＩＩＳ２ＣｈＩＰデータを示し、図１２Ｃは、Ｈ３Ｋ４ｍ３ＣｈＩＰデータを示し、図１２Ｄは、Ｈ３ＣｈＩＰデータを示す。 ＳＭＮオリゴ７７及び８３が、対照（９６７７細胞のみ、又は脂質対照）と比較して、ＳＭＮクロマチンにおけるＥＺＨ２を低減することを示すグラフを提供する。ＥＺＨ２ＣｈＩＰデータを示す。 対照（９６７７細胞のみ、又は脂質対照）と比較した、ＳＭＮオリゴ７７若しくは８３で処理後のＳＭＮクロマチンにおけるＨ３Ｋ２７ｍ３を示すグラフを提供する。Ｈ３Ｋ２７ｍ３ＣｈＩＰデータを示す。 対照（９６７７細胞のみ、又は脂質対照）と比較した、ＳＭＮオリゴで処理後のＨＯＸＣ１３プロモータにおけるＨ３、Ｈ３Ｋ４ｍ３、Ｈ３Ｋ２７ｍ３、Ｈ３Ｋ３６ｍ３、ＲＮＡ ｐｏｌＩＩ＿Ｓ２及びＥＺＨ２の存在を示すグラフを提供する。 対照（９６７７細胞のみ、又は脂質対照）と比較した、ＳＭＮオリゴ７７若しくは８３で処理後のＳＭＮクロマチンにおけるＨ３Ｋ３６ｍ３を示すグラフを提供する。Ｈ３Ｋ３６ｍ３ＣｈＩＰデータを示す。 対照（９６７７細胞のみ、又は脂質対照）と比較した、ＳＭＮオリゴ７７若しくは８３で処理後のＳＭＮクロマチンにおけるＲＮＡ ＰｏｌＩＩＳ２を示すグラフを提供する。ＲＮＡ ＰｏｌＩＩＳ２ＣｈＩＰデータを示す。 対照（９６７７細胞のみ、又は脂質対照）と比較した、ＳＭＮオリゴ７７若しくは８３で処理後のＳＭＮクロマチンにおけるＨ３Ｋ４ｍ３を示すグラフを提供する。Ｈ３Ｋ４ｍ３ＣｈＩＰデータを示す。 対照（９６７７細胞のみ、又は脂質対照）と比較した、ＳＭＮオリゴ７７若しくは８３で処理後のＳＭＮクロマチンにおけるヒストン３（Ｈ３）を示すグラフを提供する。Ｈ３ＣｈＩＰデータを示す。 対照（９６７７細胞のみ、又は脂質対照）と比較した、スプライススイッチングオリゴで処理後のＳＭＮクロマチンにおけるＥＺＨ２を示すグラフを提供する。ＥＺＨ２ＣｈＩＰデータを示す。 対照（９６７７細胞のみ、又は脂質対照）と比較した、スプライススイッチングオリゴで処理後のＳＭＮクロマチンにおけるＨ３Ｋ３６ｍ３を示すグラフを提供する。Ｈ３Ｋ３６ｍ３ＣｈＩＰデータを示す。 対照（９６７７細胞のみ、又は脂質対照）と比較した、スプライススイッチングオリゴで処理後のＳＭＮクロマチンにおけるＲＮＡ ＰｏｌＩＩＳ２を示すグラフを提供する。ＲＮＡ ＰｏｌＩＩＳ２ＣｈＩＰデータを示す。 様々なＳＭＮオリゴ（３７、７７、８３、１４３、１４４、若しくは２４３）で処理した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）細胞におけるＳＭＮ１ｍＲＮＡのレベルを示すグラフを提供する。 様々なスプライススイッチングＳＭＮオリゴ（５４ｍ０１若しくは５４ｍ１５）で処理した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）細胞におけるＳＭＮ１ｍＲＮＡのレベルを示すグラフを提供する。 ＳＭＮオリゴ、スプライススイッチングオリゴ、又はこれらの組み合わせで処理した細胞におけるＳＭＮ２ｍＲＮＡレベルを示す一連のグラフを提供する。図１７Ａは、単独又はＳＭＮオリゴ１４３と組み合わせた様々な濃度のスプライススイッチングオリゴについてのデータを示す。図１７Ｂは、単独又はＳＭＮオリゴ８３と組み合わせた様々な濃度のスプライススイッチングオリゴについてのデータを示す。図１７Ｃは、単独又はスプライススイッチングオリゴと組み合わせた様々な濃度のＳＭＮオリゴ１４３についてのデータを示す。図１７Ｄは、単独又はスプライススイッチングオリゴと組み合わせた様々な濃度のＳＭＮオリゴ８３についてのデータを示す。 ＳＭＮオリゴ、スプライススイッチングオリゴ、又はこれらの組み合わせで処理した細胞におけるＳＭＮ２ｍＲＮＡレベルを示す一連のグラフを提供する。図１７Ａは、単独又はＳＭＮオリゴ１４３と組み合わせた様々な濃度のスプライススイッチングオリゴについてのデータを示す。図１７Ｂは、単独又はＳＭＮオリゴ８３と組み合わせた様々な濃度のスプライススイッチングオリゴについてのデータを示す。図１７Ｃは、単独又はスプライススイッチングオリゴと組み合わせた様々な濃度のＳＭＮオリゴ１４３についてのデータを示す。図１７Ｄは、単独又はスプライススイッチングオリゴと組み合わせた様々な濃度のＳＭＮオリゴ８３についてのデータを示す。 ＳＭＮオリゴ、スプライススイッチングオリゴ、又はこれらの組み合わせで処理した細胞におけるＳＭＮ２ｍＲＮＡレベルを示す一連のグラフを提供する。図１７Ａは、単独又はＳＭＮオリゴ１４３と組み合わせた様々な濃度のスプライススイッチングオリゴについてのデータを示す。図１７Ｂは、単独又はＳＭＮオリゴ８３と組み合わせた様々な濃度のスプライススイッチングオリゴについてのデータを示す。図１７Ｃは、単独又はスプライススイッチングオリゴと組み合わせた様々な濃度のＳＭＮオリゴ１４３についてのデータを示す。図１７Ｄは、単独又はスプライススイッチングオリゴと組み合わせた様々な濃度のＳＭＮオリゴ８３についてのデータを示す。 ＳＭＮオリゴ、スプライススイッチングオリゴ、又はこれらの組み合わせで処理した細胞におけるＳＭＮ２ｍＲＮＡレベルを示す一連のグラフを提供する。図１７Ａは、単独又はＳＭＮオリゴ１４３と組み合わせた様々な濃度のスプライススイッチングオリゴについてのデータを示す。図１７Ｂは、単独又はＳＭＮオリゴ８３と組み合わせた様々な濃度のスプライススイッチングオリゴについてのデータを示す。図１７Ｃは、単独又はスプライススイッチングオリゴと組み合わせた様々な濃度のＳＭＮオリゴ１４３についてのデータを示す。図１７Ｄは、単独又はスプライススイッチングオリゴと組み合わせた様々な濃度のＳＭＮオリゴ８３についてのデータを示す。 様々なＳＭＮオリゴで処理したＳＭＡ患者線維芽細胞株ＧＭ０９６７７におけるＳＭＮ２ｍＲＮＡの増加を示すグラフである。ＳＭＮ完全長及びエキソン７欠失（ｄｅｌｔａ７）ｍＲＮＡレベルの両方を示す。 様々なＳＭＮオリゴで処理したＳＭＡ患者線維芽細胞株ＧＭ０９６７７におけるＳＭＮタンパク質の増加を示すグラフである。 様々なスプライススイッチングオリゴで処理したＳＭＡ患者線維芽細胞株ＧＭ０９６７７におけるＳＭＮ２ｍＲＮＡの増加を示すグラフである。 様々なスプライススイッチングオリゴで処理したＳＭＡ患者線維芽細胞株ＧＭ０９６７７におけるＳＭＮタンパク質の増加を示すグラフである。
表の簡単な説明
表１：ヒトｍｉＲＮＡのシード配列ではない六量体
表２：実験室での試験のために作製されたオリゴヌクレオチド配列。ＲＱ（第２カラム）及びＲＱ ＳＥ（第３列）は、対照ウェル（通常、担体のみ）と比較したオリゴの活性、並びに実験の標準誤差又は３重の測定値を示す。［オリゴ］は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験についてはナノモルで、またｉｎ ｖｉｖｏ実験については体重キログラム当たりのミリグラムで示す。
表３：オリゴヌクレオチド修飾の一覧。表３の接尾辞「Ｓｕｐ」は、３’末端ヌクレオチドが、合成の目的で、固体支持体に結合され得ることを示す。一般に、合成のために固体支持体に結合させると、合成されたオリゴヌクレオチドは、固体支持体が最終オリゴヌクレオチド産物の一部ではないように放出されることは理解すべきである。
表４：試験のために作製されたオリゴヌクレオチド配列。この表は、修飾ヌクレオチドの配列を示すものであり、ｌｎａＸは、３’ホスホロチオエート結合を有するＬＮＡヌクレオチドを表し、ｏｍｅＸは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、ｄＸは、デオキシヌクレオチドである。ヌクレオチドコードの末端のｓは、ヌクレオチドが、３’ホスホロチオエート結合を有することを示している。配列の末端における「−Ｓｕｐ」は、３’末端が、３’結合上にリン酸塩又はチオリン酸塩のいずれかを欠いていることを示している。フォーマット化配列のカラムは、表２、７、８及び９において試験したオリゴヌクレオチドに対して、修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの配列を示す。
表５：細胞株
ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３／１７３６３８号パンフレットとして公開された国際（ＰＣＴ）特許出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４１４４０号パンフレットからの付録Ａは、参照により本明細書に組み込むものとし；付録Ａは、様々なオリゴヌクレオチドの試験からのＲＴ−ＰＣＲデータを示す表７を含む。
ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３／１７３６３８号パンフレットとして公開された国際（ＰＣＴ）特許出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４１４４０号パンフレットからの付録Ｂは、参照により本明細書に組み込むものとし；付録Ｂは、様々な組み合わせ処理の試験からのＲＴ−ＰＣＲデータを示す表８を含む。
ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３／１７３６３８号パンフレットとして公開された国際（ＰＣＴ）特許出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４１４４０号パンフレットからの付録Ｃは、参照により本明細書に組み込むものとし；付録Ｃは、様々なオリゴヌクレオチドの試験からのＥＬＩＳＡデータを示す表９を含む。
上記の付録Ａ〜Ｃの表７〜９にそれぞれ関する以下のカラム情報に留意されたい。配列番号：使用するオリゴヌクレオチドの塩基配列の配列識別子；オリゴ名：オリゴヌクレオチドの名称；Ａｖｇ ＲＱ：標的遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる発現の平均相対定量；Ａｖｇ ＲＱ ＳＥ；ＲＴ−ＰＣＲによる発現レベルの相対定量の平均の標準誤差；「ｌｉｐｏ単独の対照に対する％ＳＭＮ」は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（トランスフェクション試薬）処理細胞と比較したＳＭＮタンパク質レベル（ｎｇ／ｍｇ全タンパク質）の割合を％に換算したものを指す；「％ＳＭＮ ＣＶＶ」は、変動係数を指す；Ｅｘｐ＃：実験参照番号；標的：標的遺伝子；［オリゴ］別途記載のない限り、用いたオリゴヌクレオチドの濃度（ｎＭ）；細胞株：用いた細胞株；アッセイタイプ：用いたアッセイ；時間（ｈ）：処理後のアッセイの時間；第２薬剤：第２オリゴヌクレオチドの名称（オリゴ名により同定される）又は併用実験で用いた薬剤；［第２］：第２オリゴヌクレオチド又は薬剤の濃度；単位：濃度の単位；第３薬剤：第３オリゴヌクレオチドの名称（オリゴ名により同定される）又は併用実験で用いた薬剤；［第３］：第３オリゴヌクレオチドの又は薬剤の濃度；注記：実験に関するコメント。オリゴ名は、表２及び４に記載するものと一致する。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、ルー・ゲーリッグ（Ｌｏｕ Ｇｅｈｒｉｇ）病及びシャルコー（Ｃｈａｒｃｏｔ）病とも呼ばれ、急速に進行する衰弱、筋萎縮及び線維束形成、筋痙性、発語困難（構音障害）、嚥下困難（嚥下障害）、及び呼吸困難（呼吸困難）を特徴とし、最終的に患者の死を招く。ＡＬＳのこれらの特徴は、随意筋運動を制御するニューロンへの損傷によって生じるものである。
ＡＬＳ患者由来細胞及び動物モデルの両方で、Ｇｅｍの消失が記載されている。Ｇｅｍの消失は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）でも起こることが認識されている。Ｇｅｍ、すなわちコイル小体対（Ｇｅｍｉｎｉ ｏｆ ｃｏｉｌｅｄ ｂｏｄｉｅｓ）は、ＳＭＮタンパク質を含有する小型構造であり、細胞核内にみいだされる。Ｇｅｍは、一般に、直径が０．２ミクロン〜２ミクロンであり、電子顕微鏡下で観察すると、もつれた糸の玉に似ている。Ｇｅｍは、ｓｎＲＮＰ生合成に関与すると考えられている。突然変異型ＳＯＤ１は、ＳＭＮ局在化を改変して、Ｇｅｍ形成を阻止するが、これは、ＳＭＮ過剰発現によって保存される。ＡＬＳの突然変異型ＳＯＤ１マウスモデルにおいて、ＳＭＮの過剰発現により、Ｇｅｍの消失及び疾患発症が遅延した。このように、ある実施形態では、ＳＭＮ発現の誘導は、ＡＬＳ（例えば、突然変異型ＳＯＤ１による家族性ＡＬＳ（ＡＬＳの約１０％））において治療利益をもたらす。ＴＤＰ−４３及びＦＵＳ／ＴＬＳは、核ＧｅｍにおいてＳＭＮと相互作用し、３つのタンパク質の全てが、ＵｓｎＲＮＡのレベルを制御することにより、スプライソソーム維持に機能を果たす。ＦＵＳは、Ｇｅｍ形成に関与し、ＦＵＳ欠損細胞でのＧｅｍの消失は、外性ＳＭＮを過剰発現する細胞において逆転させることができる。このように、ＡＬＳの病原性に関与する共通のプロセスは、ニューロンのスプライソソーム完全性の消失であると考えられ、これによって異常スプライシング及び運動ニューロン細胞死が起こるが、これは、ＳＭＮ含有Ｇｅｍの異常に起因し得る。
従って、運動ニューロン疾患、例えば、ＡＬＳ、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮、進行性球麻痺又は仮性球麻痺を有する被験者の細胞におけるＳＭＮの発現を選択的に誘導する上で有用な方法及び関連する一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の特定のスプライス変異体の発現を誘導するための方法が提供される。従って、ある実施形態では、スプライス変異体によりコードされる特定のＳＭＮタンパク質アイソフォームの、細胞中のレベルを制御する上で有用な方法が提供される。ある実施形態では、方法は、ＡＬＳを治療するのに十分なレベルまでＳＭＮタンパク質の発現を誘導する上で有用である。例えば、本発明のある態様によれば、ＡＬＳを治療することを目的として、１細胞において完全長ＳＭＮタンパク質の発現を増大する方法が提供される。ある実施形態では、本方法は、細胞に、この細胞においてエキソン７を含む（又は包含する）ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の成熟ｍＲＮＡの発現を増大するのに十分な量で、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域と相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを送達するステップを含む。本発明の別の態様を本明細書に詳細に記載する。
従って、ある実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＳＯＤ１、ＦＵＳ／ＴＬＳ、又はＴＤＰ−４３から選択される遺伝子における突然変異を含む細胞又は被験者に、本明細書に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与するステップを含む。ＳＯＤ１、ＦＵＳ／ＴＬＳ、及びＴＤＰ−４３における突然変異は、ヒト及び動物モデルのＡＬＳと関連している。ＡＬＳと関連するＳＯＤ１の突然変異として、Ａ４Ｖ、Ｈ４６Ｒ、Ｇ３７Ｒ、Ｌ３８Ｖ、及びＧ９３Ａが挙げられる。ＡＬＳに関連するＴＤＰ−４３の突然変異としては、以下：Ｄ１６９Ｇ、Ｋ２６３Ｅ、Ｎ２６７Ｓ、Ｇ２８７Ｓ、Ｇ２９０Ａ、Ｓ２９２Ｎ、Ｇ２９４Ａ、Ｇ２９４Ｖ、Ｇ２９５Ｓ、Ｇ２９５Ｒ、Ｇ２９８Ｓ、Ｍ３１１Ｖ、Ａ３１５Ｔ、Ａ３２１Ｇ、Ａ３２１Ｖ、Ｑ３３１Ｋ、Ｓ３３２Ｎ、Ｇ３３５Ｄ、Ｍ３３７Ｖ、Ｑ３４３Ｒ、Ｎ３４５Ｋ、Ｇ３４８Ｃ、Ｇ３４８Ｖ、Ｎ３５２Ｓ、Ｎ３５２Ｔ、Ｒ３６１Ｓ、Ｐ３６３Ａ、Ｙ３７４Ｘ、Ｎ３７８Ｄ、Ｓ３７９Ｐ、Ｓ３７９Ｃ、Ａ３８２Ｔ、Ａ３８２Ｐ、Ｉ３８３Ｖ、Ｇ３８４Ｒ、Ｎ３９０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、及びＳ３９３Ｌが挙げられる。ＡＬＳに関連するＦＵＳ／ＴＬＳの突然変異としては、以下：Ｓ５７ｄｅｌ、Ｇ１５６Ｅ、Ｇ１９１Ｓ、Ｒ２１６Ｃ、Ｇ２２５Ｖ、Ｇ２３０Ｃ、Ｒ２３４Ｃ、Ｒ２３４Ｌ、Ｒ２２４Ｃ、Ｍ２５４Ｖ、Ｓ４０２＿Ｐ４４１ｄｅｌｉｎｓＧＧＧＧ、Ｓ４６２Ｆ、Ｇ４６６ＶｆｓＸ１４、Ｒ４９５Ｘ、Ｇ５０７Ｄ、Ｋ５１０Ｅ、Ｓ５１３Ｐ、Ｒ５１４Ｇ、Ｒ５１４Ｓ、Ｇ５１５Ｃ、Ｈ５１７Ｑ、Ｈ５１７Ｐ、Ｒ５１８Ｋ、Ｒ５１８Ｇ、Ｒ５２１Ｈ、Ｒ５２１Ｇ、Ｒ５２１Ｃ、Ｒ５２２Ｇ、Ｒ５２４Ｓ、Ｒ５２４Ｔ、及びＰ５２５Ｌが挙げられる。前述したように、これらの遺伝子における突然変異は、ＳＭＮ含有Ｇｅｍ形成及び／又は活性に影響を与えることが立証されている。
ＳＯＤ１、ＦＵＳ／ＴＬＳ、及びＴＤＰ−４３に加えて、他の遺伝子及び遺伝子座における突然変異もＡＬＳに関連している。これらの遺伝子を下の表に掲載する。
従って、ある実施形態では、本明細書に記載する方法は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと一緒に、以下：ＳＯＤ１、ＡＬＳ２、ＳＥＴＸ、ＦＵＳ／ＴＬＳ、ＶＡＰＢ、ＡＮＧ、ＴＤＰ−４３、ＦＩＧ４、ＯＰＴＮ、ＡＴＸＮ２、ＶＣＰ、ＵＢＱＬＮ２、ＳＩＧＭＡＲ１、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＰＦＮ１、又はＣ９ｏｒｆ７２から選択される遺伝子におけるＡＬＳに関連する突然変異を含む細胞又は被験者に、本明細書に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与するステップを含む。
ある実施形態では、細胞は、ＡＬＳを有する被験者から取得した細胞又は該被験者に存在する細胞である。ある実施形態では、細胞は、運動ニューロンである。運動ニューロンは、脊椎から筋肉にシグナルを輸送して、運動を起こす遠心性神経（遠心性ニューロンとも呼ばれる）である。運動ニューロンは、筋肉に直接又は間接的にシグナルを輸送することができる。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
本発明のいくつかの態様は、ＡＬＳを有する被験者、又はＡＬＳを有する被験者から得られる細胞若しくは組織に関する。ＡＬＳは、上位及び下位運動ニューロンの変性を特徴とする運動ニューロン疾患であり、最終的に、筋力低下及び全身の委縮を招く。
ある実施形態では、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドで治療する被験者は、１つ又は複数のＡＬＳの症状を有する被験者である。ＡＬＳは、症状（医療専門家による理学的検査によって特定され得る）及び／又は一連の試験（その一部は、ＡＬＳと類似の症状を有する別の疾患からＡＬＳを識別するために設計される）に基づいて診断することができる。ＡＬＳの症状としては、呼吸困難、嚥下困難（例えば、喉にものを詰まらせやすい、流涎、若しくは吐き気）、頸部筋肉の筋力低下による頭部垂下、筋痙攣、線維束性収縮（ｆａｓｃｉｃｕｌａｔｉｏｎ）と呼ばれる筋収縮、緩徐に悪化する筋力低下（一般に、まず腕若しくは手などの身体の一部に影響し、最終的に持ち上げ、階段昇降、及び歩行の困難を招く）、麻痺、言語障害（例えば、緩徐な又は異常な言語パターン）、変声、嗄声、及び減量が挙げられる。以下：衰弱、筋振戦、筋痙攣、筋の単収縮、筋組織の消失、舌の単収縮、反射異常、歩行の堅さ若しくはぎこちなさ、関節での反射増加、泣き笑いの制御困難（時として感情失禁と呼ばれる）、又は咽頭反射の消失のうち１つ又は複数について患者を検査することにより、理学的検査を用いて、患者のこうした症状を特定することができる。ＡＬＳの診断又は診断の補助に用いることができる検査の例として、限定はしないが、以下：他の症状からＡＬＳを識別するための血液及び／又は尿検査；肺筋肉が罹患しているかどうかを調べるための呼吸試験；ＡＬＳに類似している可能性がある頸部の疾患若しくは損傷を特定するための頸椎ＣＴ又はＭＲＩ；どの神経若しくは筋肉が適切に作動していないかを調べるための筋電図；神経伝導検査；遺伝子検査；他の症状からＡＬＳを識別するための頭部ＣＴ若しくはＭＲＩ；嚥下検査；並びに脊椎穿刺（腰椎穿刺）が挙げられる。ＡＬＳ様症状を引き起こす他の状態又は疾患としては、感染症（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、ポリオ、ウエストナイル熱、及びライム病など）、多発性硬化症、ポストポリオ症候群、多巣性運動ニューロパチー、及び脊髄性筋萎縮症が挙げられる。
ある実施形態では、ＡＬＳを有すると診断された被験者を、疾患の進行についてモニターしてもよい。ある実施形態では、ＡＬＳ機能評価スケール（ＡＬＳＦＲＳ、例えば、Ｔｈｅ Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ：Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｄａｉｌｙ Ｌｉｖｉｎｇ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．１９９６；５３（２）：１４１−１４７を参照）、ＡＬＳ機能評価スケール改訂版（ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ、例えば、Ｃｅｄａｒｂａｕｍ ＪＭ，Ｓｔａｍｂｌｅｒ Ｎ，Ｍａｌｔａ Ｅ，Ｆｕｌｌｅｒ Ｃ，Ｈｉｌｔ Ｄ，Ｔｈｕｒｍｏｎｄ Ｂ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ａを参照）又は別の適切なスケールを用いて、被験者をモニターする。ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ：呼吸機能の評価を組み込むＡＬＳ機能評価スケール改訂版。ＢＤＮＦ ＡＬＳ試験群（第３相）。Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ．１９９９ Ｏｃｔ ３１；１６９（１−２）：１３−２１）。ＡＬＳＦＲＳ及びＡＬＳＦＲＳ−Ｒは、次の挙動カテゴリーを測定する：言語、唾液分泌、嚥下、筆記、食物の切断及び器具の扱い（胃瘻造設の有無にかかわらず）、身支度及び衛生、寝返り及び寝具の調整、歩行、階段昇降、並びに呼吸。ＡＬＳＦＲＳ−Ｒはさらに、呼吸困難、起座呼吸、及び補助換気の必要性の追加評価を含む。例示的ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ検査は、ＡＬＳ Ｃ．Ａ．Ｒ．Ｅプロジェクトの下でのＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈウェブサイトを通して提供される（ＡＬＳ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｔｏｏｌ Ｏｎｌｉｎｅを参照）。ある実施形態では、これらのカテゴリー各々の特徴に基づいてスコアを計算してもよい（正常又は軽度障害は、各カテゴリーについて高スコアを付与し、顕著な又は重度障害は、各カテゴリーについて低スコアを付与する）。ある実施形態では、各カテゴリーのスコアを合計して、総合スコアを取得する。ある実施形態では、時間経過による総合スコアの変化を追跡するために、検査を複数回実施してもよい。ある実施形態では、スコアの増加はＡＬＳの進行を示し；スコアの減少又は不変のスコアは、ＡＬＳの安定又は退行を示し得る。
ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ）−相互反応ＲＮＡ
本明細書に記載する本発明の態様は、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ）−相互反応ＲＮＡの発見に関する。ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ）は、ヒストンメチルトランスフェラーゼであり、ヒストンＨ３のメチル化によってゲノム領域のサイレンシングに関与する既知のエピジェネティック制御因子である。他の機能の中でも、ＰＲＣ２は、ＲｅｐＡ、Ｘｉｓｔ、及びＴｓｉｘなどの長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）と相互反応して、ヒストンＨ３−リシン２７のトリメチル化を触媒する。ＰＲＣ２は、４つのサブユニット、Ｅｅｄ、Ｓｕｚ１２、ＲｂＡｐ４８、及びＥｚｈ２を含む。本発明の態様は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子を含むか、又はそれと機能的に近く、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を誘導若しくは増大することができるゲノム領域内から発現されるＲＮＡ（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）のＰＲＣ２関連領域に結合する一本鎖オリゴヌクレオチドの認識に関する。ある実施形態では、この上方制御は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のＰＲＣ２媒介抑制の阻害によって起こると考えられる。
本明細書で用いる「ＰＲＣ２関連領域」という用語は、ＰＲＣ２の成分と直接又は間接的に相互作用するヌクレオチドの配列を含むか、又はこれをコードする核酸の領域を指す。ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡ（例えば、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ））内に存在し得る。ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡをコードするＤＮＡ内に存在し得る。場合によっては、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２相互作用領域とも同様に呼ばれる。
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、ＲＮＡを発現する細胞のｉｎ ｓｉｔｕ紫外線照射に応答してＰＲＣ２の成分に架橋するＲＮＡの領域、又はこのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２の成分をターゲティングする抗体と免疫沈降するＲＮＡの領域、又はこのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＥＺＨ２又はＲＢＢＰ４（上で述べたように、ＰＲＣ２の成分である）に特異的に結合する抗体と共に免疫沈降するＲＮＡの領域、又はこのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２の成分をターゲティングする抗体を用いたＲＮＡ免疫沈降アッセイにおいてヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ）から保護されるＲＮＡの領域、又はこの保護されたＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＥＺＨ２又はＲＢＢＰ４をターゲティングする抗体を用いたＲＮＡ免疫沈降アッセイにおいてヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ）から保護されるＲＮＡの領域、又はこの保護されたＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２の成分をターゲティングする抗体を用いたＲＮＡ免疫沈降アッセイの産物のシークエンシング反応において、比較的高い頻度の配列リード数をもたらすＲＮＡの領域、又はこのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＥＺＨ２又はＲＢＢＰ４に特異的に結合する抗体を用いたＲＮＡ免疫沈降アッセイの産物のシークエンシング反応において、比較的高い頻度の配列リード数をもたらすＲＮＡの領域、又はこの保護されたＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。このような実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、「ピーク」と呼ばれることもある。
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２複合体と相互作用する４０〜６０ヌクレオチドの配列を含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡをコードする４０〜６０ヌクレオチドの配列を含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用する（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）配列を含む、長さ５ｋｂ以下の配列を含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用することがわかっている（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）配列を有する、長さ５ｋｂ以下の配列を含み、この配列内にＲＮＡがコードされている。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用する（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）配列を含む、長さ約４ｋｂの配列を含む。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用することがわかっている（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）配列を有する、長さ約４ｋｂの配列を含み、この配列内にＲＮＡがコードされている。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号９〜２９のいずれか１つに記載されている配列を有する。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、配列番号２４〜２９のいずれか１つに記載されている配列を有する。
ある実施形態において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子を含むか、又はその近傍にあるゲノム領域内のＰＲＣ２関連領域に特異的に結合するか、あるいはこの領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、配列番号９〜２９のいずれか１つに記載されている配列を有するＰＲＣ２関連領域に特異的に結合するか、又はこの領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、配列番号９〜２９のいずれか１つに記載されている配列を有するＰＲＣ２関連領域に特異的に結合するか、又はこの領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが提供され、ここで、上記配列は、これらの配列番号が位置する（例えば、ヒトゲノムにおいて）対応ゲノム領域からの２ｋｂ以下、５ｋｂ以下、若しくは１０ｋｂ以下のフランキング配列と結合している。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３０〜１３０８７又は１３１０８〜１３１１６のいずれか１つに記載されている配列を有する。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、表２に記載されている配列を有する。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドが相補的なＳＭＮ１又はＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域は、配列番号２４〜２９から選択される。ある実施形態では、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下の配列番号：１１５８〜１１５９、１１７１、１４８２〜１４８３、１４８５〜１４８６、２４６５〜２４７１、２４８８〜２４９０、２５４２〜２５４６、２６５６〜２６５７、２８３３〜２８３５、３４３９〜３４４０、３９１６〜３９１８、４４６９〜４４７２、４８２１、５４２９、５５３７、６０６１、７３２７、８３３０〜１３０６１、１３０６２〜１３０８７、及び１３１０８〜１３１１６から選択される配列を含む。ある実施形態では、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドは、１１３９５、１１３９４、１０１６９、及び１０１７０から選択される配列を含む。
本発明の理論に拘束されるわけではないが、これらのオリゴヌクレオチドは、特定の染色体座へのＰＲＣ２の動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を阻止することにより、ＰＲＣ２の結合及び機能を妨害することができる。例えば、ＰＲＣ２関連領域ｌｎｃＲＮＡに特異的に結合するように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドは、ｌｎｃＲＮＡだけではなく、ｌｎｃＲＮＡに結合するＰＲＣ２も、結合クロマチンから安定して置換することができる。置換後、ＰＲＣ２の完全な補体は、２４時間後まで回復されない。さらに、ｌｎｃＲＮＡは、シス（ｃｉｓ）様式でＰＲＣ２を動員して、ｌｎｃＲＮＡが転写された特定の染色体座又はその付近での遺伝子発現を抑制することができる。
ある実施形態において、遺伝子発現を調節する方法が提供され、この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで実施してよい。本明細書の説明全体を通して化合物の使用について述べるときは必ず、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のレベル若しくは活性の低減に関連する状態（例えば、ＡＬＳ）の治療に用いるための医薬組成物又は薬剤の調製における化合物の使用を考慮することが理解されよう。従って、１つの非制限的例として、本発明のこの態様は、疾患の治療に用いるための薬剤の調製における一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を含み、この治療は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を上方制御することを含む。
本発明の別の態様において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択する方法が提供される。本方法は、一般に、候補オリゴヌクレオチドとして、ＰＲＣ２関連領域（例えば、配列番号９〜２９のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列）に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを選択することを含む。ある実施形態では、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富な（例えば、オリゴヌクレオチドの無作為選択と比較して）オリゴヌクレオチドのセットを選択することができる。
ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を調節するための一本鎖オリゴヌクレオチド
本発明の一態様では、１細胞においてＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を調節するための、ＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。ある実施形態では、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現は上方制御又は増大される。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現が上方制御又は増大されるように、長いＲＮＡ転写物とＰＲＣ２の相互作用を阻害する。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現が上方制御又は増大されるように、長いＲＮＡ転写物とＰＲＣ２の相互作用を阻害することにより、ヒストンＨ３のメチル化の低減及び遺伝子不活性化の低減をもたらす。ある実施形態では、上記の相互作用は、ＰＲＣ２との結合を阻止又は低減する長いＲＮＡの構造の変化によって、破壊又は阻害され得る。ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択するための本明細書に開示する方法のいずれかを用いて、オリゴヌクレオチドを選択することができる。
一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜８のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列のＰＲＣ２関連領域と相補的な相補性の領域を含んでいてもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドの相補性の領域は、ＰＲＣ２関連領域の少なくとも６個、例えば、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個又は１６個以上の連続したヌクレオチドと相補的であってよい。
当然のことながら、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２同士の高い相同性のために、ＳＭＮ１のＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＳＭＮ２の対応するＰＲＣ２関連領域とも相補的であることが多い。
ＰＲＣ２関連領域は、染色体において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の５’末端の上流５０キロベースと、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の３’末端の下流５０キロベースとの間の位置に位置するものであってよい。ＰＲＣ２関連領域は、染色体において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の５’末端の上流２５キロベースと、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の３’末端の下流２５キロベースとの間の位置に位置してもよい。ＰＲＣ２関連領域は、染色体において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の５’末端の上流１２キロベースと、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の３’末端の下流１２キロベースとの間の位置に位置してもよい。ＰＲＣ２関連領域は、染色体において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の５’末端の上流５キロベースと、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の３’末端の下流５キロベースとの間の位置に位置してもよい。
ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子に対して、選択されるＰＲＣ２関連領域のゲノム位置は変動し得る。例えば、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の５’末端の上流にあってよい。ＰＲＣ２関連領域は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の３’末端の下流にあってよい。ＰＲＣ２関連領域は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子のイントロン内にあってよい。ＰＲＣ２関連領域は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子のエキソン内にあってよい。ＰＲＣ２関連領域は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子のイントロン−エキソン接合部、５’−ＵＴＲ−エキソン接合部若しくは３’−ＵＴＲ−エキソン接合部を横断してもよい。
一本鎖オリゴヌクレオチドは、式Ｘ−Ｙ−Ｚを有する配列を含んでもよく、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、Ｙは、ミクロＲＮＡのヒトシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、可変長さのヌクレオチド配列である。ある実施形態では、Ｘは、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドである。ある実施形態では、Ｘがオリゴヌクレオチドの５’末端で固定されている場合、オリゴヌクレオチドは、Ｘに５’で連結されたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を一切有していない。ある実施形態では、ペプチド又はステロールなどの他の化合物は、これらがヌクレオチド又はヌクレオチド類似体ではない限り、この実施形態において５’末端で連結されている。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列５’Ｘ−Ｙ−Ｚを有し、長さ８〜５０ヌクレオチドである。こうした配列特性を有するオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ経路を回避すると予想される。従って、ある実施形態では、こうした配列特性を有するオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ分子として細胞内で機能するという意図しない結果をもたらす可能性が低い。Ｙ配列は、表１に記載する長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であってよい。
一本鎖オリゴヌクレオチドは、グアノシンヌクレオチド区間（例えば、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上の連続したグアノシンヌクレオチド）を含まない配列を有してもよい。ある実施形態では、グアノシンヌクレオチド区間を有するオリゴヌクレオチドは、グアノシンヌクレオチド区間のないオリゴヌクレオチドと比較して、増大した非特異的結合及び／又はオフターゲット効果を有する。
一本鎖オリゴヌクレオチドは、オフターゲット遺伝子を包含するか、又はその近傍のゲノム位置に位置する、同等長さの全てのヌクレオチド配列に対して閾値レベルに満たない配列同一性を有する配列を有していてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２以外のあらゆる既知の遺伝子（例えば、あらゆる既知のタンパク質コード遺伝子）を包含するか、又はその近傍のゲノム位置に位置する配列を含まないことを確実にするように設計してもよい。同様の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、いずれか他の既知のＰＲＣ２関連領域、特に、いずれか他の既知の遺伝子（例えば、いずれか既知のタンパク質コード遺伝子）に機能的に関連するＰＲＣ２関連領域に位置する配列を含まないことを確実にするように設計してもよい。どちらの場合にも、オリゴヌクレオチドは、オフターゲット効果を有する低い尤度を有すると予想される。配列同一性の閾値レベルは、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％配列同一性であってよい。
一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの一本鎖ループを含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的な配列を有していてもよい。ある実施形態では、１つ又は複数の一本鎖ループ（例えば、少なくとも２つの一本鎖ループ）を含む二次構造を形成するＲＮＡをコードするＰＲＣ２関連領域と相補的なオリゴヌクレオチドは、無作為に選択したオリゴヌクレオチドと比較して、活性である（例えば、標的遺伝子の発現を活性化又は増大することができる）高い尤度を有することが見出されている。場合によっては、二次構造は、少なくとも２つの一本鎖ループの間に二本鎖ステムを含んでもよい。従って、オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域同士の相補性の領域は、少なくとも１つのループの少なくとも一部をコードするＰＲＣ２関連領域の位置にあってよい。ある態様では、オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域同士の相補性の領域は、ループの少なくとも２つの少なくとも一部をコードするＰＲＣ２関連領域の位置にあってよい。ある態様では、オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域同士の相補性の領域は、二本鎖ステムの少なくとも一部をコードするＰＲＣ２関連領域の位置にあってよい。ある実施形態では、（例えば、ｌｎｃＲＮＡの）ＰＲＣ２関連領域を同定する（例えば、ＲＩＰ−Ｓｅｑ方法又はそれから得られる情報を用いて）。ある実施形態では、ＲＮＡ二次構造予測アルゴリズム、例えば、ＲＮＡｆｏｌｄ、ｍｆｏｌｄを用いて、ＰＲＣ２関連領域を含む予測二次構造ＲＮＡ（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）を決定する。ある実施形態では、少なくとも２つの一本鎖ループの間に二本鎖ステムを含み得る１つ又は複数の一本鎖ループ（例えば、少なくとも２つの一本鎖ループ）を含む二次構造を形成するＲＮＡの領域をターゲティングするように、オリゴヌクレオチドを設計する。
一本鎖オリゴヌクレオチドは、３０％超のＧ−Ｃ含有率、４０％超のＧ−Ｃ含有率、５０％超のＧ−Ｃ含有率、６０％超のＧ−Ｃ含有率、７０％超のＧ−Ｃ含有率、又は８０％超のＧ−Ｃ含有率を有する配列を有していてもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドは、１００％以下のＧ−Ｃ含有率、９５％以下のＧ−Ｃ含有率、９０％以下のＧ−Ｃ含有率、又は８０％以下のＧ−Ｃ含有率を有する配列を有していてもよい。オリゴヌクレオチドが、長さ８〜１０ヌクレオチドであるいくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域の相補的配列のヌクレオチドの１、２、３、４、若しくは５個を除く全てが、シトシン又はグアノシンヌクレオチドである。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドが相補的であるＰＲＣ２関連領域の配列は、アデニン及びウラシルから選択される３個以下のヌクレオチドを含む。
一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の当該種の相同体を包含する位置、又はその近傍の位置で、様々な種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サルなど）の染色体と相補的であってもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子を包含するか、又はその近傍のヒトゲノム領域と相補的であってもよいし、また、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のマウス相同体を包含するか、又はその近傍のマウスゲノム領域と相補的であってもよい。例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子を包含するか、又はその近傍のヒトゲノム領域である、配列番号１、２、３、４、若しくは５に記載の配列と相補的であってもよいし、また、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子のマウス相同体を包含するか、又はその近傍のマウスゲノム領域である、配列番号７若しくは８に記載の配列と相補的であってもよい。これらの特徴を有するオリゴヌクレオチドを、複数の種（例えば、ヒト及びマウス）における効力についてｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することができる。このアプローチはまた、対象の疾患について適切な動物が存在する種を選択することにより、ヒトの疾患を治療するための臨床候補薬の開発も促進する。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドの相補性の領域は、ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８〜１５、８〜３０、８〜４０、又は１０〜５０、又は５〜５０、又は５〜４０塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０個の連続したヌクレオチドと相補的である。ある実施形態では、相補性の領域は、ＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的である。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡ配列、又はその一部分に基づいており、前記部分は、５〜４０の連続した塩基対、又は約８〜４０、又は約５〜１５、又は約５〜３０、又は約５〜４０、又は約５〜５０塩基の長さを有する。相補的とは、この用語が当技術分野で用いられている場合、２つのヌクレオチド同士の正確な対合の能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置にあるヌクレオチドが、ＰＲＣ２関連領域の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができれば、その一本鎖オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域は、その位置で互いに相補的であるとみなされる。一本鎖オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域は、各分子内の十分な数の対応位置が、それらの塩基同士が互いに水素結合することができるヌクレオチドにより占められている場合、互いに相補的である。従って、「相補的」とは、こうした安定かつ特異的な結合が、一本鎖オリゴヌクレオチドとＰＲＣ２関連領域との間に起こるのに十分な程度の相補性又は正確な対合を示すために用いられる用語である。例えば、一本鎖ヌクレオチドの一位置にある塩基が、ＰＲＣ２関連領域の対応位置にある塩基と水素結合することができれば、これらの塩基は、その位置で互いに相補的であるとみなされる。１００％の相補性は要求されない。
一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＰＲＣ２関連領域の連続ヌクレオチドと、少なくとも８０％（任意選択で、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）相補的であってよい。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＰＲＣ２関連領域の連続ヌクレオチドの部分と比較して、１、２若しくは３つの塩基ミスマッチを含んでいてもよい。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、１５塩基に対して３つ以下の塩基ミスマッチ、又は１０塩基に対して２つ以下の塩基ミスマッチを有していてもよい。
相補的オリゴヌクレオチド配列が、特異的にハイブリダイズすることが可能なその標的の配列と１００％相補的である必要はないことは当技術分野で理解されよう。ある実施形態では、本発明の開示を目的とする相補的オリゴヌクレオチド配列は、この配列と標的分子（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）の結合が、標的（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）の正常な機能を妨害して、活性の消失（例えば、遺伝子発現の結果として起こる上方制御によるＰＲＣ２関連抑制の阻害）を引き起こし、非特異的結合の回避が要望される条件下で、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ又は治療的処置の場合には、生理学的条件下で、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ場合には、アッセイが好適な緊縮条件で行われる条件下で、配列と非標的配列との非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性があるとき、特異的にハイブリダイズ可能である。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、長さ７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド又はそれ以上である。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さ８〜３０ヌクレオチドである。
ある実施形態において、ＰＲＣ２関連領域は、遺伝子配列と同じＤＮＡ鎖上に存在する（センス）。ある実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、遺伝子配列と逆のＤＮＡ鎖上に存在する（アンチセンス）。ＰＲＣ２関連領域と相補的なオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンス配列のいずれかと結合することができる。塩基対合は、正統なワトソン−クリック塩基対合及び非ワトソン−クリック塩基対合（例えば、ゆらぎ（Ｗｏｂｂｌｅ）塩基対合及びフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）塩基対合）の両方を含んでよい。相補的塩基対合について、アデノシン型塩基（Ａ）は、チミジン型塩基（Ｔ）又はウラシル型塩基（Ｕ）と相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）は、グアノシン型塩基（Ｇ）と相補的であり、また、３−ニトロピロール又は５−ニトロインドールなどのユニバーサル塩基は、Ａ、Ｃ、Ｕ、若しくはＴのいずれともハイブリダイズすることができるため、これらと相補的であるとみなされることは理解されよう。イノシン（Ｉ）も、当技術分野ではユニバーサル塩基と考えられており、Ａ、Ｃ、Ｕ、若しくはＴのいずれとも相補的であるとみなされる。
ある実施形態において、配列表に示す配列を含む本明細書に記載の配列におけるいずれか１つ又は複数のチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）又はウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）を、アデノシンヌクレオチドとの塩基対合（例えば、ワトソン−クリック塩基対による）に好適ないずれか他のヌクレオチドで置換してもよい。ある実施形態では、配列表に示す配列を含む本明細書に記載の配列におけるいずれか１つ又は複数のチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）又はウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）を、異なるピリミジンヌクレオチドで好適に置換してもよいし、その逆も可能である。ある実施形態では、配列表に示す配列を含む本明細書に記載の配列におけるいずれか１つ又は複数のチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）をウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（若しくはその修飾ヌクレオチド）で好適に置換してもよいし、その逆も可能である。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドのＧＣ含有率は、約３０〜６０％であるのが好ましい。実施形態によっては、３つ以上のＧ又はＣが連続して出現するのは好ましくない場合もある。従って、ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３つ以上のグアノシンヌクレオチドの区間を含まない。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、単一の連続した転写物（例えば、非スプライスＲＮＡ）としてゲノム（例えば、ヒトゲノム）内でコードされるＲＮＡに特異的に結合するか、又はこれに対して相補的である。ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ゲノム（例えば、ヒトゲノム）内でコードされるＲＮＡに特異的に結合するか、又はこれに対して相補的であり、ここで、上記ゲノムにおいて、ＲＮＡのコード領域の５’末端と、ＲＮＡのコード領域の３’末端との間の距離は、１ｋｂ未満、２ｋｂ未満、３ｋｂ未満、４ｋｂ未満、５ｋｂ未満、７ｋｂ未満、８ｋｂ未満、９ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、又は２０ｋｂ未満である。
本明細書に記載するどのオリゴヌクレオチドも除外することができることは理解すべきである。
ある実施形態において、本明細書に開示する一本鎖オリゴヌクレオチドは、遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現を少なくとも約５０％（すなわち、通常の１５０％、若しくは１．５倍）、又は約２倍〜約５倍増大し得る。ある実施形態では、発現は、少なくとも約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍若しくは約１００倍、又はこれら数値のいずれかの間の範囲で、増大され得る。また、増大したｍＲＮＡ発現は、増大したタンパク質発現と相関することがわかっている。
本明細書に記載するオリゴヌクレオチド、又はこれらを設計若しくは合成する方法の実施形態のいくつか又は全てにおいて、オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を上方制御し、また、タンパク質コード標準遺伝子と同じ鎖から転写されるＰＲＣ２結合ＲＮＡに特異的に結合するか、又はこれと特異的にハイブリダイズするか、又はこれと相補的であってよい。オリゴヌクレオチドは、標準遺伝子（ｒｅｆＧｅｎｅ）のタンパク質コードセンス鎖のイントロン、エキソン、イントロンエキソン接合部、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、翻訳開始領域、又は翻訳終結領域内で始まるか、又はこれらと重複するＰＲＣ２結合ＲＮＡの領域に結合し得る。
本明細書に記載するオリゴヌクレオチド、又はこれらを設計若しくは合成する方法の実施形態のいくつか又は全てにおいて、オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を上方制御し、また、タンパク質コード標準遺伝子の逆鎖（アンチセンス鎖）から転写されるＰＲＣ２結合ＲＮＡに特異的に結合するか、又はこれと特異的にハイブリダイズするか、又はこれと相補的であってよい。オリゴヌクレオチドは、標準遺伝子のタンパク質コードアンチセンス鎖のイントロン、エキソン、イントロン−エキソン接合部、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、翻訳開始領域、又は翻訳終結領域内で始まるか、又はこれと重複するＰＲＣ２結合ＲＮＡの領域に結合し得る。
本明細書に記載するオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよく、例えば、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオチド結合、修飾されたヌクレオチド及び／又はこれらの組合せを含んでもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、以下に挙げる特性の１つ又は複数を呈示することができる：標的ＲＮＡの実質的な切断又は変性を引き起こさない；；標的ＲＮＡの実質的に完全な切断又は変性を引き起こさない；ＲＮＡｓｅＨ経路を活性化しない；ＲＩＳＣを活性化しない；アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）ファミリータンパク質を一切動員しない；ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）により切断されない；選択的スプライシングを媒介しない；免疫刺激賦活性ではない；ヌクレアーゼ耐性である；非修飾オリゴヌクレオチドと比較して向上した細胞取込みを有する；細胞又は哺乳動物に対して毒性ではない；エンドソーム離脱の向上をもたらし得る；ｌｎｃＲＮＡと、ＰＲＣ２、好ましくはＥｚｈ２サブユニット、任意選択でＳｕｚ１２、Ｅｅｄ、ＲｂＡｐ４６／４８サブユニット若しくはＪａｒｉｄ２などの副因子との相互作用を妨害する；ヒストンＨ３リシン２７メチル化を低減する、及び／又は遺伝子発現を上方制御する。
ＲＮＡと相互作用して、遺伝子発現を調節するように設計されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ標的に結合するように設計されたものとは別個の塩基配列のサブセットである（例えば、ＲＮＡが転写される基礎ゲノムＤＮＡ配列と相補的である）。
スプライススイッチングオリゴヌクレオチド
本発明の態様は、エキソンスキップを最小限に抑えるためにＳＭＮ１又はＳＭＮ２ｍＲＮＡ前駆体をターゲティングする戦略を提供する。従って、本発明の態様は、ＡＬＳの治療に有用な治療化合物を提供する。ある実施形態では、本明細書において「スプライススイッチングオリゴヌクレオチド」と呼ばれるオリゴヌクレオチドが提供され、ＳＭＮ２スプライシングを調節する。ある実施形態では、細胞における完全長ＳＭＮタンパク質の発現を増大するのに有用な方法及び関連組成物、化合物、並びにキットが提供される。本方法は、一般に、１細胞においてエキソン７を含む（又は包含する）ＳＭＮ２の成熟ｍＲＮＡの発現を増大するのに十分な量で、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを上記細胞に送達することを含む。ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれを用いてもよい。スプライス制御配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが、本明細書において、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドと呼ばれる場合もあることは理解すべきである。
スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、典型的に、ｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列（例えば、イントロンのスプライシングサイレンサー配列）と相補的な配列を含み、ｍＲＮＡ前駆体に結合して、そのプロセシングに影響を与えることができる。スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、エキソンの領域、イントロンの領域又はイントロン／エキソン接合部と相補的であってもよい。ある実施形態では、スプライス制御配列は、配列：ＣＡＧＣＡＵＵＡＵＧＡＡＡＧ（配列番号１３１００）又はその一部を含む。ある実施形態では、スプライス制御配列は、少なくとも１つのｈｎＲＮＡＰ結合配列を含む。ある実施形態では、エキソン６の５’スプライス部位との対合についてエキソン７及び８の３’スプライス部位同士の競合が存在し、従って、エキソン８の３’スプライス部位の認識の障害により、エキソン７封入が優先されるという前提に基づいて、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２をターゲティングするスプライススイッチングオリゴヌクレオチドは機能する。ある実施形態では、ＳＭＮ２エキソン７封入及び完全長ＳＭＮタンパク質発現を促進するスプライススイッチングオリゴヌクレオチドが提供され、ここで、オリゴヌクレオチドは、イントロン７／エキソン８接合部と相補的である。ある実施形態では、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のエキソン（例えば、エキソン７）と相補的なセグメントから構成される。ある実施形態では、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）タンパク質により認識される結合モチーフを含むＲＮＡ配列からなる尾部（例えば、非相補的尾部）を含む。ある実施形態では、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、イントロンのスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）と（少なくとも一部が）相補的である。ある実施形態では、ＩＳＳは、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のイントロン６又はイントロン７に存在する。ある実施形態では、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、（例えば、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の）標的エキソン又はイントロンに相補的なアンチセンス部分と、ＳＲタンパク質のスプライシング活性化ドメインに類似した最小ＲＳドメインペプチドとを含む。ある実施形態では、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド又はそれ以上の長さである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さ８〜３０ヌクレオチドである。
リンカー
本明細書に開示するオリゴヌクレオチドのいずれかを、リンカー、例えば、切断性リンカーにより、１個又は複数の他のオリゴヌクレオチドと連結してもよい。従って、ある実施形態では、１遺伝子のＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドであって、リンカーを介して、上記遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドに連結された一本鎖オリゴヌクレオチドを含む化合物が提供される。ある実施形態では、一般式Ａ−Ｂ−Ｃを有する化合物が提供され、ここで、Ａは、１遺伝子のＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドであり、Ｂは、リンカーであり、Ｃは、上記遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドである。ある実施形態では、リンカーＢは、オリゴヌクレオチド、ペプチド、低ｐＨ不安定性結合、又はジスルフィド結合を含む。ある実施形態では、化合物は、５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’のように配向されている。ある実施形態では、化合物は、３’−Ａ−Ｂ−Ｃ−５’のように配向されている。Ｂがオリゴヌクレオチドであるいくつかの実施形態では、Ａの３’末端が、Ｂの５’末端に連結され、Ｂの３’末端が、Ｃの５’末端に連結されている。Ｂがオリゴヌクレオチドであるいくつかの実施形態では、Ａの５’末端が、Ｂの３’末端に連結され、Ｂの５’末端が、Ｃの３’末端に連結されている。Ｂがオリゴヌクレオチドであるいくつかの実施形態では、Ａの５’末端が、Ｂの５’末端に連結され、及び／又はＢの３’末端が、Ｃの３’末端に連結されている。Ｂがオリゴヌクレオチドであるいくつかの実施形態では、Ａの３’末端が、Ｂの３’末端に連結され、及び／又はＢの５’末端が、Ｃの５’末端に連結されている。
「リンカー」という用語は、２つ以上のオリゴヌクレオチドを共有結合することができる化学部分を指す。ある実施形態では、リンカー内に含まれる、又は含有される少なくとも１つの結合は、切断が可能である（例えば、エンドソーム抽出物のような哺乳動物抽出物などの生物学的環境において）ため、結合切断後には、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドはもはや互いに共有結合されていない。ある実施形態において、提供されるリンカーは、リンカーが少なくとも１つの切断可能な結合を含む限りにおいて、非切断性の領域を含んでいてもよいことは理解されよう。
ある実施形態において、リンカーは、オリゴヌクレオチドと比較して、哺乳動物抽出物においてエンドペプチダーゼによる切断を受けやすいポリペプチドを含んでもよい。エンドペプチダーゼは、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サーモリシン、ペプシン、又はエンドペプチダーゼＶ８であってよい。エンドペプチダーゼは、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ、カテプシンＣ、パパイン、カテプシンＳ又はエンドソーム酸性インスリナーゼであってよい。例えば、リンカーは、以下：ＡＬＡＬ、ＡＰＩＳＦＦＥＬＧ、ＦＬ、ＧＦＮ、Ｒ／ＫＸＸ、ＧＲＷＨＴＶＧＬＲＷＥ、ＹＬ、ＧＦ、及びＦＦから選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含み、ここで、Ｘは、いずれかのアミノ酸である。
ある実施形態において、リンカーは、式：−（ＣＨ２）ｎＳ−Ｓ（ＣＨ２）ｍ−を含み、ここで、ｎ及びｍは、独立に、０〜１０の整数である。
ある実施形態において、リンカーは、オリゴヌクレオチドと比較して、哺乳動物抽出物においてエンドヌクレアーゼによる切断を受けやすいオリゴヌクレオチドを含んでもよい。リンカーは、１〜１０個のチミジン又はウリジンを含むヌクレオチド配列を含んでもよい。リンカーは、リン酸ジエステルヌクレオチド間結合を介して連結されたデオキシリボヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有してもよい。リンカーは、リン酸ジエステルヌクレオチド間結合を介して連結された１〜１０個のチミジン又はウリジンを含むヌクレオチド配列を有してもよい。リンカーは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を介して連結された１〜１０個のチミジン又はウリジンを含むヌクレオチド配列を有してもよい。
ある実施形態において、少なくとも１つのリンカーは、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドと比較して、哺乳動物抽出物の存在下で酵素による切断に対し２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上感受性が高い。２つ以上のリンカーを含む化合物中に、様々なリンカーを様々な割合で及び／又は様々な酵素により切断されるように設計することができることは理解すべきである。同様に、２つ以上のリンカーを含む化合物中に、様々なリンカーを様々な組織、細胞又は細胞内コンパートメントにおける切断に対して感受性であるように設計することもできる。これにより、有利なことに、化合物は、様々な割合で、様々な酵素により、又は様々な組織、細胞若しくは細胞内コンパートメントにおいて、化合物から放出されるオリゴヌクレオチドを有することができるため、要望されるｉｎ ｖｉｖｏ位置又は投与から要望の時間後に、単量体オリゴヌクレオチドの放出を制御することが可能になる。
特定の実施形態において、リンカーは、エキソヌクレアーゼがより豊富な血漿、血液若しくは血清中で安定（例えば、それらが相互に結合するオリゴヌクレオチドより安定）しており、エンドヌクレアーゼが比較的豊富な細胞内環境では、より不安定である。ある実施形態では、リンカーは、リンカーの半減期が、本明細書に記載する条件下（例えば、肝臓ホモジネート中）で少なくとも２４、若しくは２８、３２、３６、４８、７２、９６時間又はそれより長ければ、「非切断性」であるとみなされる。反対に、ある実施形態では、リンカーは、リンカーの半減期が、多くとも１０、若しくは８、６、５時間又はそれより短ければ、「切断性」であるとみなされる。
ある実施形態において、リンカーは、ヌクレアーゼ切断性オリゴヌクレオチドリンカーである。ある実施形態では、ヌクレアーゼ切断性リンカーは、オリゴヌクレオチド骨格中に１つ又は複数のリン酸ジエステル結合を含む。例えば、リンカーは、単一のリン酸ジエステル架橋又は２、３、４、５、６、７又は８個以上のリン酸ジエステル結合を、１〜１０デオキシヌクレオチド、例えば、ＲＮＡの場合、ｄＴ、又はリボヌクレオチド、例えば、ｒＵの鎖として含んでもよい。リンカー中にｄＴ又は他のＤＮＡヌクレオチドｄＮを含む場合、特定の実施形態では、切断性リンカーは、１つ又は複数のリン酸ジエステル結合を含む。別の実施形態では、ｒＵ又は他のＲＮＡヌクレオチドｒＮの場合、切断性リンカーは、ホスホロチオエート結合のみから構成されるものであってもよい。ある実施形態では、ヌクレアーゼにより比較的緩徐に切断される（従って、「非切断性」と呼ばれる）ホスホロチオエート結合デオキシヌクレオチドとは対照的に、ホスホロチオエート結合ｒＵは、リボヌクレアーゼによる比較的速い切断を受けるため、ある実施形態において、切断性とみなされる。また、ｄＮ及びｒＮを組み合わせてリンカー領域に結合させることも可能であり、これらは、リン酸ジエステル又はホスホロチオエート結合によって連結される。他の実施形態において、リンカーは、化学的に修飾されたヌクレオチド（依然としてヌクレアーゼにより切断可能である）、例えば、２’−Ｏ−修飾類似体などを含んでもよい。特に、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロヌクレオチドを互いに結合させるか、又はｄＮ若しくはｒＮヌクレオチドと結合させることができる。一般に、ヌクレオチドリンカーの場合、リンカーは、標的と相補的にすることもできるが、通常、標的と相補的ではない化合物の一部である。これは、リンカーが、一般に、標的上のオリゴヌクレオチドの作用に先立って切断さることから、標的に対するリンカーの同一性が重要ではないためである。従って、ある実施形態では、リンカーは、設計されるオリゴヌクレオチドの標的のいずれかと相補的ではない（オリゴ）ヌクレオチドリンカーである。
ある実施形態において、切断可能なリンカーは、意図的に導入されたＲｐホスホロチオエート立体異性体の連続的区間（例えば、４、５、６、７又は８個以上の区間）を含むオリゴヌクレオチドリンカーである。Ｒｐ立体異性体は、Ｓｐ立体異性体とは異なり、ヌクレアーゼ切断を受けやすいことがわかっている（Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１３：４９１−４９９）。このようなリンカーは、ＰＳ結合したオリゴヌクレオチドのラセミ混合物を含まない。というのは、混合型結合は、比較的安定しており、長い区間のＲｐ立体異性体を含まないと考えられ、故に、「非切断性」と考えられるからである。従って、ある実施形態において、リンカーは、４、５、６、７又は８個以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドの区間を含み、ここで、この区間は、実質的量のＳｐ立体異性体を含まないか、又は一切含まない。その量は、１０％毎モルを超えれば実質的であるとみなすことができる。
ある実施形態において、リンカーは、非ヌクレオチドリンカー、例えば、単一のリン酸ジエステル架橋である。このような切断性リンカーの別の例は、ジスルフィド結合、例えば、−（ＣＨ２）ｎＳ−Ｓ（ＣＨ２）ｍ−（ｎ及びｍは、０〜１０の整数である）を含む化学基である。例示的実施形態において、ｎ＝ｍ＝６である。非ヌクレオチドリンカーの別の例は以下に記載する。
リンカーは、化学的又は酵素的切断反応を受けるように設計することができる。化学反応は、例えば、酸性環境での切断（例えば、エンドソーム）、還元的切断（例えば、サイトゾル切断）又は酸化的切断（例えば、肝ミクロソーム中）を含む。切断反応は、再構成反応により開始することもできる。酵素反応は、ヌクレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、レダクターゼなどにより媒介される反応を含んでもよい。例えば、リンカーは、ｐＨ感受性、カテプシン感受性であってもよいし、又は主にエンドソーム及び／若しくはサイトゾル中で切断することもできる。
ある実施形態において、リンカーは、ペプチドを含む。特定の実施形態において、リンカーは、エンドペプチダーゼにより切断可能な配列を有するペプチドを含む。切断可能なペプチド配列に加えて、リンカーは、追加のアミノ酸残基及び／又は非ペプチド化学部分、例えば、アルキル鎖を含んでもよい。特定の実施形態では、リンカーは、カテプシンＢの基質である、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕを含む。例えば、Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ２００７，１８，７０２−７１６に記載されているマレイミドカプロイル−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕリンカーを参照されたい。特定の実施形態では、カテプシンＢ−切断性リンカーは、腫瘍細胞中で切断される。特定の実施形態では、リンカーは、カテプシンＤ、Ｌ、及びＢの基質である、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙを含む（例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ２００６，７，１４２８−１４３４を参照）。特定の実施形態では、カテプシン−切断性リンカーは、ＨｅＬＡ細胞中で切断される。ある実施形態では、リンカーは、カテプシンＢの基質である、Ｐｈｅ−Ｌｙｓを含む。例えば、特定の実施形態では、リンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を含む。例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００２，１２，２１７−２１９に記載のマレイミドカプロイル−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＡリンカーを参照されたい。特定の実施形態では、リンカーは、カテプシンＣの基質である、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−２−ナフチルアミドを含む（例えば、Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９４，３００，２２９−２３５を参照）。特定の実施形態では、カテプシンＣ−切断性リンカーは、肝細胞中で切断される。ある実施形態では、リンカーは、カテプシンＳ切断部位を含む。例えば、ある実施形態では、リンカーは、例えば、Ｌｕｔｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，２８３，３６１８５−３６１９４に記載されているように、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ、又はＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕを含む。特定の実施形態では、カテプシンＳ−切断性リンカーは、抗原提示細胞中で切断される。ある実施形態では、リンカーは、パパイン切断部位を含む。パパインは、典型的に、配列−Ｒ／Ｋ−Ｘ−Ｘを有するペプチドを切断する（例えば、Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９７，５９，６３−８８を参照）。特定の実施形態において、パパイン切断性リンカーは、エンドソーム中で切断される。ある実施形態では、リンカーは、エンドソーム酸性インスリナーゼ切断部位を含む。例えば、ある実施形態では、リンカーは、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、又はＰｈｅ−Ｐｈｅを含む（例えば、Ａｕｔｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９６，３８９，５５−６０を参照）。特定の実施形態では、エンドソーム酸性インスリナーゼ切断性リンカーは、肝細胞中で切断される。
ある実施形態において、リンカーは、ｐＨ感受性である。特定の実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定性結合を含む。本明細書で用いる場合、低ｐＨ不安定性結合は、酸性条件下（ｐＨ＜７）で選択的に破壊される結合である。このような結合は、細胞エンドソーム及びリソソームが７未満のｐＨを有することから、エンドソーム不安定性結合と呼ばれることもある。例えば、特定の実施形態では、リンカーは、アミン、イミン、エステル、安息香酸イミン、アミノエステル、ジオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、アセタール、ビニルエーテル、ヒドラゾン、アジドメチル−メチル無水マレイン酸、チオプロピオン酸塩、隠ぺいエンドソーム融解剤又はシトラコニル基を含む。
特定の実施形態において、リンカーは、以下から選択される低ｐＨ不安定性結合を含む：ジオール及びケトンを形成するための、酸性環境（例えば、７より小さく、約４より大きいｐＨ）で不安定なケタール；ジオール及びアルデヒドを形成するための、酸性環境（例えば、７より小さく、約４より大きいｐＨ）で不安定なアセタール；アミン及びアルデヒド又はケトンを形成するための、酸性環境（例えば、７より小さく、約４より大きいｐＨ）で不安定なイミン又はイミニウム；酸性条件下で不安定なケイ素−酸素−炭素結合；ケイ素−窒素（シラザン）結合；ケイ素−炭素結合（例えば、アリールシラン、ビニルシラン、及びアリルシラン）；マレアマート（無水マレイン酸誘導体及びアミンから合成されるアミド結合）；オルトエステル；ヒドラゾン；酸性触媒加水分解を受けるように設計された活性化カルボン酸誘導体（例えば、エステル、アミド）；又はビニルエーテル。さらに別の例は、ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ ＦＯＲ ＩＮ ＶＩＶＯ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＯＦ ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳと題する国際特許出願公開番号：国際公開第２００８／０２２３０９号パンフレットに見出すことができ、その内容は、本明細書に参照により組み込むものとする。
ある実施形態では、リンカーは、隠ぺいエンドソーム融解剤を含む。エンドソーム融解ポリマーは、ｐＨの変化に応答して、エンドソームの破壊若しくは溶解を引き起こすか、あるいは、エンドソーム又はリソソームなどの細胞内膜封入小胞からの、通常膜不透過性化合物（ポリヌクレオチド又はタンパク質など）のエスケープを可能にすることができるポリマーである。エンドソーム融解化合物のサブセットは、融合性ペプチドなどの融合性化合物である。融合性ペプチドは、細胞質へのオリゴマー化合物などの物質のエンドソーム放出を促進することができる。例えば、米国特許出願第２００４０１９８６８７号明細書、第２００８０２８１０４１号明細書、第２００８０１５２６６１号明細書、及び第２００９００２３８９０号明細書（本明細書に参照により組み込む）を参照されたい。
リンカーは、臓器／組織特異的切断を受けるように設計することもできる。例えば、様々な組織において発現される特定の標的の場合、他の臓器でのノックダウンは不要な副作用を招き得るため、肝臓におけるノックダウンのみが望ましいことがある。従って、ピロラーゼ（ＴＰＯ）及びグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ−６−Ｐａｓｅ）などの肝臓特異的酵素に対して感受性のリンカーを、アンチセンス作用を主に肝臓に限定するように作製することができる。あるいは、肝臓酵素には感受性ではないが、γグルタミルトランスペプチダーゼなどの腎臓特異的酵素に対して感受性のリンカーを、アンチセンス作用を主に腎臓に限定するように作製することもできる。同様に、経口投与される多量体オリゴヌクレオチドの場合、Ｐｈｅ−Ａｌａ及びＬｅｕ−Ａｌａを切断する腸特異的ペプチドを考慮することができる。同様に、プラスミン（例えば、ＰＨＥＡ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ認識部位）など、腫瘍において過剰発現された酵素により認識される酵素認識部位をリンカーに導入することにより、腫瘍特異的ノックダウンが実現可能になるであろう。リンカーにおける正しい酵素認識部位を選択することにより、様々な臓器において特異的切断及びノックダウンが達成可能になるであろう。加えて、リンカーは、肝臓ターゲティングの場合には、Ｎ−アセチルガラクトサミン、また、腫瘍又は活性化マクロファージターゲティングの場合には、葉酸塩、ビタミンＡ若しくはＲＧＤ−ペプチドなどのターゲティングシグナルを含有することもできる。従って、ある実施形態では、切断性リンカーは、臓器−又は組織特異的、例えば、肝臓特異的、腎臓特異的、腸特異的などである。
オリゴヌクレオチドは、個別のオリゴヌクレオチドのいずれかの部分を介して、例えば、リン酸塩、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）、又は核酸塩基を介して連結することができる。特定の実施形態では、２つのオリゴヌクレオチドを互いに連結する場合、例えば、第１オリゴヌクレオチドの５’末端と第２ヌクレオチドの３’末端に、第１オリゴヌクレオチドの５’末端と第２ヌクレオチドの５’末端に、第１オリゴヌクレオチドの３’末端と第２ヌクレオチドの３’末端にリンカーを結合させることができる。他の実施形態において、２つのオリゴヌクレオチドを互いに連結する場合、例えば、修飾核酸塩基を介して、リンカーを各オリゴヌクレオチドの内部残基に結合することができる。当業者であれば、多量体の場合、多くのこうした並び替えが可能であることは理解されよう。適切なリンカー、及びこうしたリンカーを有する化合物を生成する方法のさらに別の例は、ＭＵＬＴＩＭＥＲＩＣ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳと題する国際特許出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５５５３５号パンフレットに見出すことができ（公開番号国際公開第２０１３０４０４２９号パンフレット）、そのリンカーおよび化学に関する内容は、本明細書に参照により全体を組み込むものとする。
ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を活性化するための候補オリゴヌクレオチドを選択する方法
ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を活性化若しくは増大するための候補オリゴヌクレオチドを選択するための方法が本明細書において提供される。標的選択方法は、一般に、本明細書に記載する構造及び機能的特性のいずれかを有する一本鎖オリゴヌクレオチドを選択するステップを含む。典型的には、本方法は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２と機能的に関連するＰＲＣ２関連領域、例えば、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子に対するＰＲＣ２の動員を促進する（例えば、シス（ｃｉｓ）調節様式で）ことにより、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を調節するｌｎｃＲＮＡのＰＲＣ２関連領域をターゲティングするオリゴヌクレオチドを同定することを目標とする１つ又は複数のステップを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、核酸（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）のＰＲＣ２関連領域とハイブリダイズするそれらの能力によって、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を活性化する候補であると予想される。ある実施形態では、このハイブリダイゼーションイベントは、ＰＲＣ２と核酸（例えば、ｌｎｃＲＮＡ）との相互作用を破壊し、その結果、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子座に対するＰＲＣ２及びその関連共抑制因子（例えば、クロマチン再構成因子）の動員を破壊すると理解されている。
候補オリゴヌクレオチドを選択する方法は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子を包含するか、又はこれらの近傍にある染色体位置（例えば、配列番号１〜８のいずれか１つに記載されている配列を有する染色体位置）に位置するＰＲＣ２関連領域（例えば、配列番号９〜２９のいずれか１つに記載されているヌクレオチド配列）を選択することを含む。ＰＲＣ２関連領域は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子のセンス鎖を含む染色体の鎖に位置していてもよく、この場合、候補オリゴヌクレオチドは、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子のセンス鎖と相補的である（すなわち、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子に対してアンチセンスである）。あるいは、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子のアンチセンス鎖を含む第１染色体の鎖に位置していてもよく、この場合、オリゴヌクレオチドは、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子のアンチセンス鎖（鋳型鎖）と相補的である（すなわち、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子に対してセンスである）。
ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富な候補オリゴヌクレオチドのセットを選択する方法は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子を包含するか、又はこれらの近傍にある染色体位置に位置する１つ又は複数のＰＲＣ２関連領域を選択することを含んでよく、ここで、上記セットにおける各オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数のＰＲＣ２関連領域と相補的なヌクレオチド配列を含む。本明細書で用いる「〜の発現を活性化するオリゴヌクレオチドが豊富なオリゴヌクレオチドのセット」というフレーズは、上記の豊富なセットと同じ物理化学的特性（例えば、同じＧＣ含有率、Ｔｍ、長さなど）のオリゴヌクレオチドの無作為選択と比較して、標的遺伝子（例えば、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２）の発現を活性化するオリゴヌクレオチドの数をより多く有するオリゴヌクレオチドのセットを指す。
一本鎖オリゴヌクレオチドの設計及び／又は合成が、このような配列情報により記載される核酸又はＰＲＣ２関連領域と相補的な配列の設計及び／又は合成を含む場合、当業者は、例えば、当技術分野における一般的知識の一部を成すワトソン−クリック塩基対合の理解により、相補的配列を容易に決定することができる。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドの設計及び／又は合成は、当業者には公知の技術により出発材料からオリゴヌクレオチドを製造することを含み、その際、合成は、ＰＲＣ２関連領域の配列、又はその一部に基づいて実施してよい。
一本鎖オリゴヌクレオチドの設計及び／又は合成の方法は、以下：
ＰＲＣ２関連領域を同定する、及び／又は選択するステップ；
ＰＲＣ２関連領域の配列若しくはその一部に対し、要望される程度の配列同一性又は相補性を有する核酸配列を設計するステップ；
一本鎖オリゴヌクレオチドを、設計した配列に合成するステップ；
合成した一本鎖オリゴヌクレオチドを精製するステップ；並びに
任意選択で、合成した一本鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも１種の薬学的に許容される希釈剤、担体若しくは賦形剤と混合することにより、医薬組成物又は薬剤を形成するステップ
のうち１つ又は複数を含み得る。
このように設計及び／又は合成した一本鎖オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載するように、遺伝子発現を調節する方法に有用となり得る。
好ましくは、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、化学的に合成される。本発明を実施するのに用いられるオリゴヌクレオチドは、公知の化学的合成技術により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾、例えば、ヌクレオチド修飾などの取り込みにより、核酸分解に対して安定化させることができる。例えば、本発明の核酸配列は、ヌクレオチド配列の５’又は３’末端にホスホロチオエートの、少なくとも第１、第２、又は第３ヌクレオチド間結合を含む。別の例として、核酸配列は、２’−修飾ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、又は２’−Ｏ−−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含んでよい。別の例として、核酸配列は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチドを含んでよく、ある実施形態では、ヌクレオチドの全てが、２’−Ｏ−メチル−修飾を含む。ある実施形態では、核酸配列は、ロックされている、すなわち、２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子とをつなぐメチレン架橋により、リボース環が「ロック」されている核酸類似体を含む。
本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドの修飾された化学又はフォーマットのいずれかを互いに組み合わせることができること、並びに、同じ分子内に１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ以上の異なるタイプの修飾を含有させられることは理解されよう。
ある実施形態において、本方法は、合成された一本鎖オリゴヌクレオチドを増幅するステップ、及び／又は一本鎖オリゴヌクレオチド（若しくは増幅された一本鎖オリゴヌクレオチド）を精製するステップ、並びに／又はこのようにして得られた一本鎖オリゴヌクレオチドを配列決定するステップをさらに含んでもよい。
従って、一本鎖オリゴヌクレオチドを調製する方法は、疾患の治療に用いるための医薬組成物又は薬剤の製造に使用される方法であってもよく、任意選択で、上記治療は、ＰＲＣ２関連領域に関連する遺伝子の発現を調節することを含む。
前述した方法において、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２に結合するＲＮＡを同定することを含む方法により、同定若しくは取得することができ、あるいは、同定若しくは取得されている。
このような方法は、以下のステップを含む：核リボ核酸を含有するサンプルを用意するステップ、このサンプルを、ＰＲＣ２又はそのサブユニットと特異的に結合する物質と接触させるステップ、上記物質とサンプル中のタンパク質との複合体を形成させるステップ、複合体を分配するステップ、複合体中に存在する核酸と相補的な核酸を合成するステップ。
一本鎖オリゴヌクレオチドがＰＲＣ２関連領域、又はこのような配列の一部に基づいている場合、これは、その配列に関する情報、例えば、文書又は電子形態で入手可能な配列情報を基にしてよく、こうした情報は、一般に入手可能な科学出版物又は配列データベースに含まれる配列情報を含み得る。
ある実施形態では、候補オリゴヌクレオチドをＡＬＳの動物モデル及び／又は細胞ベースのモデルにおいて試験してもよい。ＡＬＳの動物及び細胞ベースのモデルは、当技術分野で公知である。ＡＬＳの例示的動物モデルとして、以下のものが挙げられる：ＳＯＤ１突然変異型トランスジェニックマウス（例えば、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス）、ＳＯＤ１突然変異型トランスジェニックゼブラフィッシュ、ＡＬＳ２ノックアウトマウス、ＡＬＳ２ノックアウトゼブラフィッシュ、トランスジェニックヒトＷＴ ＦＵＳマウス、ノウンダウン及びトランスジェニック突然変異型ゼブラフィッシュ、ＴＤＰ−４３ノックアウトマウス、トランスジェニック突然変異型ＴＤＰ−４３マウス、トランスジェニック突然変異型ＴＤＰ−４３ゼブラフィッシュ、トランスジェニック突然変異型ＴＤＰ−４３ラット、Ｖｐｓ５４ＷＴマウス、Ｔｂｃｅｐｍｎマウス、神経フィラメント軽鎖過剰発現トランスジェニックマウス、神経フィラメント重鎖過剰発現トランスジェニックマウス、及びペリフェリン過剰発現トランスジェニックマウス（例えば、Ｊａｋｏｂ Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎ Ｍｏｓｅｒ，Ｐａｏｌｏ Ｂｉｇｉｎｉ，ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｊｏｈｎ．Ｔｈｅ ｗｏｂｂｌｅｒ ｍｏｕｓｅ，ａｎ ＡＬＳ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１３；２８８（５−６）：２０７−２２９；並びにＢｒｕｉｊｎ ＬＩ，Ｍｉｌｌｅｒ ＴＭ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＤＷ．Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ＡＬＳ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４；２７：７２３−７４９を参照）。例示的な細胞ベースのモデルとしては、ＡＬＳ患者由来の細胞（一次若しくは細胞株）、例えば、ＮＳＣ−３４／ｈＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）細胞及びＲ４９５ＸＡＬＳ原因突然変異を含むＦＵＳを発現するＨｅＬａ細胞、又はＡＬＳ動物モデル由来の細胞が挙げられる。
ヌクレオチド類似体
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、及び／又は少なくとも１個の架橋ヌクレオチドを含んでもよい。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、抑制エチル（ｃＥｔ）ヌクレオチド、又はエチレン架橋核酸（ＥＮＡ）ヌクレオチドなどの架橋ヌクレオチドを含んでもよい。このようなヌクレオチドの例は本発明に開示しており、当技術分野でも公知である。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下の米国特許又は米国特許出願：米国特許第７，３９９，８４５号明細書、米国特許７，７４１，４５７号明細書、米国特許８，０２２，１９３号明細書、米国特許７，５６９，６８６号明細書、米国特許７，３３５，７６５号明細書、米国特許第７，３１４，９２３号明細書、米国特許第７，３３５，７６５号明細書、米国特許第７，８１６，３３３号明細書、米国特許第２０１１０００９４７１号明細書の１つに開示されているヌクレオチド類似体を含み、これら文献の各々の全内容は、あらゆる目的のために本明細書に参照により組み込む。オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の２’Ｏ−メチルヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、２’Ｏ−メチルヌクレオチドから完全に構成されていてもよい。
多くの場合、一本鎖オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数のヌクレオチド類似体を有する。例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含まないオリゴヌクレオチドと比較して、１℃、２℃、３℃、４℃、又は５℃の範囲でオリゴヌクレオチドのＴｍに上昇をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含んでもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドは、複数のヌクレオチド類似体を含んでもよく、これにより、ヌクレオチド類似体を含まないオリゴヌクレオチドと比較して、合計で２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃又はそれ以上の範囲でオリゴヌクレオチドのＴｍに上昇をもたらす。
オリゴヌクレオチドは、長さ５０ヌクレオチド以下であってよく、ここで、オリゴヌクレオチドの２〜１０、２〜１５、２〜１６、２〜１７、２〜１８、２〜１９、２〜２０、２〜２５、２〜３０、２〜４０、２〜４５、又はそれ以上の個数のヌクレオチドがヌクレオチド類似体である。オリゴヌクレオチドは、長さ８〜３０ヌクレオチドであってよく、ここで、オリゴヌクレオチドの２〜１０、２〜１５、２〜１６、２〜１７、２〜１８、２〜１９、２〜２０、２〜２５、２〜３０のヌクレオチドがヌクレオチド類似体である。
オリゴヌクレオチドは、長さ８〜１５ヌクレオチドであってよく、ここで、オリゴヌクレオチドの２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、２〜１１、２〜１２、２〜１３、２〜１４のヌクレオチドがヌクレオチド類似体である。任意選択で、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個の修飾ヌクレオチドを除いて、全てのヌクレオチドを有してもよい。
オリゴヌクレオチドは、架橋ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）から完全に構成されていてもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、架橋ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）である５’ヌクレオチドを有していてもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである５’ヌクレオチドを有していてもよい。
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で、少なくとも１つの架橋ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）によりフランキングされるデオキシリボヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で、１、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上の架橋ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）によってフランキングされているデオキシリボヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドの３’位は、３’ヒドロキシル基を有してもよい。オリゴヌクレオチドの３’位は、３’チオリン酸塩を有してもよい。
オリゴヌクレオチドは、標識と結合させてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、その５’又は３’末端で、ビオチン部分、コレステロール、ビタミンＡ、葉酸塩、シグマ受容体リガンド、アプタマー、ＣＰＰなどのペプチド、脂質などの疎水性分子、ＡＳＧＰＲ又は動的ポリ抱合体並びにそれらの変異体と結合させてもよい。
好ましくは、一本鎖オリゴヌクレオチドは、以下：修飾された糖部分、及び／又は修飾されたヌクレオチド間結合、及び／又は修飾されたヌクレオチド及び／又はそれらの組合せを含む１つ又は複数の修飾を含む。所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、本明細書に記載する修飾の２つ以上を単一のオリゴヌクレオチド内に、又は１オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオチドに組み込んでもよい。
ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、各々が少なくとも１個のヌクレオチドから構成される２つ以上の化学的に別個の領域を含むキメラオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的に、１つ又は複数の有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増大、細胞内への取込みの増大、標的に対する結合親和性の増大）を賦与する修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つの領域と、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質である１領域を含む。本発明のキメラ一本鎖オリゴヌクレオチドは、前述したように、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造体として形成してもよい。このような化合物は、当技術分野では、ハイブリッド又はギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）とも呼ばれている。こうしたハイブリッド構造体の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定しないが、以下のものがある：米国特許第５，０１３，８３０号明細書；第５，１４９，７９７号明細書；第５，２２０，００７号明細書；第５，２５６，７７５号明細書；第５，３６６，８７８号明細書；第５，４０３，７１１号明細書；第５，４９１，１３３号明細書；第５，５６５，３５０号明細書；第５，６２３，０６５号明細書；第５，６５２，３５５号明細書；第５，６５２，３５６号明細書；及び第５，７００，９２２号明細書。尚、これら文献の各々は、本明細書に参照により組み込むものとする。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、糖の２’位で修飾された少なくとも１個のヌクレオチド、極めて好ましくは２’−Ｏ−アルキル−、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル又は２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含む。別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボース上に２’−フルオロ、２’−アミノ及び２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチド、ＲＮＡの３’末端に脱塩基残基若しくは逆方法塩基を含む。こうした修飾は、常用の方法でオリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して、２’−デオキシオリゴヌクレオチドより高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することがわかっている。
いくつかのヌクレオチド及びヌクレオシド修飾が、それらを組み込んだオリゴヌクレオチドを、ネイティブオリゴデオキシヌクレオチドより、ヌクレアーゼ消化に対して耐性にすることが明らかにされており；これらの修飾されたオリゴは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間にわたってインタクトのまま生存する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例としては、修飾された骨格を含むものがあり、例えば、ホスホロチオエート、リン酸トリエステル、メチルホスホネート、単鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合又は単鎖ヘテロ原子又は複素環式糖間結合が挙げられる。最も好ましいものは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するものであり、特に、以下のものである：ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、〜Ｎ（ＣＨ３）〜Ｏ〜ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる）、ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２及びＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格（ここで、ネイティブリン酸ジエステル骨格は、Ｏ−Ｐ−−Ｏ−ＣＨのように表される）；アミド骨格（Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５，２８：３６６−３７４を参照）；モルホリノ骨格構造（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ及びＷｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号明細書を参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（ここで、オリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル骨格は、ポリアミド骨格で置換されており、ヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ窒素原子と直接又は間接的に結合している；Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５４，１４９７を参照）。リン含有結合としては、限定しないが、ホスホロチオエート、キメラホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートなどのメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィン酸塩、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートなどのホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルリン酸トリエステル、並びに通常の３’−５’結合を有するボラノリン酸塩、これらの２’−５’結合類似体、並びに逆転極性を有するもの（ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対は、３’−５’から５’−３’に、又は２’−５’から５’−２’に連結される）を含む；米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９６号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３０６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；同第５，６２５，０５０号明細書を参照。
モルホリノベースのオリゴマー化合物は、以下：Ｄｗａｉｎｅ Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ及びＤａｖｉｄ Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３−４５１０）；Ｇｅｎｅｓｉｓ，ｖｏｌｕｍｅ ３０，ｉｓｓｕｅ ３，２００１；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｊ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２４３，２０９−２１４；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００，２６，２１６−２２０；Ｌａｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７，９５９１−９５９６；並びに１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号明細書に記載されている。ある実施形態では、モルホリノベースのオリゴマー化合物は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である（例えば、Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３：２３５−２３８，２００１；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．，１２：３５４−３６４，２０１０に記載されている通り；これらの開示内容は、本明細書に参照により全体を組み込むものとする）。
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２に記載されている。
リン原子を内部に含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成される）；シクロサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びフルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びにＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分の混合部分を有する他の骨格であり；以下を参照されたい：米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；同第５，２３５，０３３号明細書；同第５，２６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；同第５，６７７，４３７号明細書；及び同第５，６７７，４３９号明細書。尚、これらの文献は各々、本明細書に参照により組み込む。
また、アラビノヌクレオチド又は修飾されたアラビノヌクレオチド残基に基づく、又はそれらから構築されるオリゴヌクレオチドを含む修飾オリゴヌクレオチドも知られている。アラビノヌクレオチドは、リボヌクレオシドの立体異性体であり、糖環の２’位の立体配置だけが異なる。ある実施形態では、２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆアラビノである。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−フルオロ−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）である（例えば、Ｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４１：３４５７−３４６７，２００２及びＭｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１２：２６５１−２６５４，２００２；に記載されている通り；これらの開示内容は、本明細書に参照により全体を組み込むものとする）。また、同様の修飾を糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオシド上又は２’−５’結合オリゴヌクレオチド内の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位に実施することもできる。
ＰＣＴ公開番号：国際公開第９９／６７３７８号パンフレットは、相補的メッセンジャーＲＮＡとの結合による遺伝子発現の配列特異的阻害向上を目的とするアラビノ核酸（ＡＮＡ）オリゴマー及びその類似体を開示している。
他の好ましい修飾としては、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）がある（例えば、国際公開第２００５／０４２７７７号パンフレット、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，Ｓｕｐｐｌ １：２４１−２４２，２００１；Ｓｕｒｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１５：７４９−７５７，２００４；Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８：１４４−１４９，２００６及びＨｏｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ（Ｏｘｆ），４９：１７１−１７２，２００５；これらの開示内容は、本明細書に参照により全体を組み込むものとする）。好ましいＥＮＡとしては、限定しないが、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン架橋核酸が挙げられる。
ＬＮＡの例は、国際公開第２００８／０４３７５３号パンフレットに記載されており、下記の一般式：

の組成物を含み、
式中、Ｘ及びＹは、独立に、基−Ｏ−、
−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−又は−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、
−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、
−ＣＨ＝ＣＨ−
の群から選択され、ここで、Ｒは、水素及びＣ１〜４−アルキルから選択され；Ｚ及びＺ＊は、独立に、ヌクレオシド間結合、末端基又は保護基から選択され；Ｂは、天然若しくは非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し；いずれかの配向に非対称基が存在してもよい。
好ましくは、本明細書に記載するオリゴヌクレオチドに用いられるＬＮＡは、下記式：

のいずれかに従う少なくとも１つのＬＮＡ単位を含み、
式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、若しくはＮ（ＲＨ）−であり；Ｚ及びＺ＊は、独立に、ヌクレオシド間結合、末端基又は保護基から選択され；Ｂは、天然若しくは非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し；ＲＨは、水素及びＣ１〜４−アルキルから選択される。
ある実施形態において、本明細書に記載するオリゴヌクレオチドに用いられるロックド核酸（ＬＮＡ）は、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２のスキーム２に示される式のいずれかに従う少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）単位を含む。
ある実施形態において、本発明のオリゴマーに用いられるＬＮＡは、以下：−０−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−０−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−０−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲＨ）−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲＨ）−Ｏ−、−０−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−から選択されるヌクレオシド間結合を含み、ここで、ＲＨは、水素及びＣ１〜４−アルキルから選択される。
具体的に好ましいＬＮＡ単位を以下のスキーム２に示す：
「チオ−ＬＮＡ」という用語は、一般式におけるＸ又はＹの少なくとも１つが、Ｓ又は−ＣＨ２−Ｓ−から選択される、ロックドヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、β−Ｄ及びα−Ｌ−立体配置のいずれであってもよい。
「アミノ−ＬＮＡ」という用語は、一般式におけるＸ又はＹの少なくとも１つが、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、及び−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−（Ｒは、水素及びＣ１〜４−アルキルから選択される）から選択される、ロックドヌクレオチドを含む。アミノ−ＬＮＡは、β−Ｄ及びα−Ｌ−立体配置のいずれであってもよい。
「オキシ−ＬＮＡ」という用語は、一般式におけるＸ又はＹの少なくとも１つが、−Ｏ−又は−ＣＨ２−Ｏ−を示す、ロックドヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、β−Ｄ及びα−Ｌ−立体配置のいずれであってもよい。
「ｅｎａ−ＬＮＡ」という用語は、一般式におけるＹが、−ＣＨ２−Ｏ−である（−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂに対して２’−位置に結合している）ロックドヌクレオチドを含む。
ＬＮＡは、本明細書でさらに詳しく説明する。
また、１つ又は複数の置換された糖部分を含んでもよく、例えば、２’位置にある以下のものの１つが挙げられる：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２又はＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎは、１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換された低級アルキル、アルカリル若しくはアルキリル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；ＲＮＡ切断性基（ｃｌｅａｖｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）；リポータ基；インターカレータ；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を向上させるための基；又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させるための基並びに同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾としては、２’−メトキシエトキシ［２’−０−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、また、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる］がある（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）。他の好ましい修飾としては、２’−メトキシ（２’−０−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。また、類似の修飾をオリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位に実施してもよい。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基に代わりシクロブチルなどの糖模倣物を有していてもよい。
一本鎖オリゴヌクレオチドはまた、上記に加え、又は代わって、核酸塩基（一般に、当技術分野では単純に「塩基」と呼ぶ）修飾又は置換を含んでもよい。本明細書で用いる「非修飾」又は「天然の」ヌクレアーゼは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、天然の核酸に稀に又は一時的にしか認められない核酸塩基、例えば、以下を含む：ヒポキサチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に、５−メチルシトシン（５−メチル−２’−デオキシシトシンとも呼ばれ、当技術分野では５−Ｍｅ−Ｃと呼ばれることが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲントビオシルＨＭＣ、イソシトシン、プソイドイソシトシン、並びに合成の核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン、又は他のヘテロ置換されたアルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−プロピルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリン及び２，６−ジアミノプリン又は他のジアミノプリン。例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，“ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８０，ｐｐ７５−７７；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５：４５１３（１９８７））を参照。例えば、イノシンなどの当技術分野において周知の「ユニバーサル」塩基も含んでよい。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二重らせんの安定性を０．６〜１．２℃増大することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｃｒｏｏｋｅ，及びＬｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｃｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、これを塩基置換として用いてよい。
所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、本明細書に記載する修飾の２つ以上を単一のオリゴヌクレオチド内に、あるいは、１オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオチドに組み込んでもよい。
ある実施形態において、糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわちヌクレオチド単位の骨格を新しい基で置換する。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持する。こうしたオリゴマー化合物の１つ、すなわち優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置換されている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的米国特許としては、限定しないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらは各々、参照により本明細書に組み込む。ＰＮＡ化合物についての別の教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。
一本鎖オリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数の核酸塩基（多くの場合、当技術分野では単に「塩基」と呼ばれる）修飾又は置換を含んでもよい。本明細書で用いる「非修飾」又は「天然の」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、他の合成及び天然核酸塩基、例えば、以下を含む：５−メチルシトシン（５−Ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイド−ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、並びに他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、とりわけ５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニン。
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されているもの、“Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，８５８〜８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１，３０，６１３頁により開示されているもの、並びにＳａｎｇｈｖｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，２８９〜３０２頁，Ｃｒｏｏｋｅ，及びＬｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３によって開示されているものを含む。これら核酸塩基のいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大するのにとりわけ有用である。このようなものとして、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、並びにＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリンが挙げられ、これらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、並びに５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重らせんの安定性を０．６〜１．２℃増大することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、これらは現時点で好ましい塩基置換であり、特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組合せた場合、さらに好ましい塩基置換である。修飾された核酸塩基は、以下：米国特許第３，６８７，８０８号明細書、並びに同第４，８４５，２０５号明細書；同第５，１３０，３０２号明細書；同第５，１３４，０６６号明細書；同第５，１７５，２７３号明細書；同第５，３６７，０６６号明細書；同第５，４３２，２７２号明細書；同第５，４５７，１８７号明細書；同第５，４５９，２５５号明細書；同第５，４８４，９０８号明細書；同第５，５０２，１７７号明細書；同第５，５２５，７１１号明細書；同第５，５５２，５４０号明細書；同第５，５８７，４６９号明細書；同第５，５９６，０９１号明細書；同第５，６１４，６１７号明細書；同第５，７５０，６９２号明細書、及び同第５，６８１，９４１号明細書に記載されており、これらは各々、参照により本明細書に組み込む。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞の取込みを増強する、１つ又は複数の部分若しくはコンジュゲートに化学的に連結させる。例えば、同じ、若しくは異なるタイプの１つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドを互いに結合させることができ；又は一本鎖オリゴヌクレオチドを１細胞型若しくは組織型に対して増強された特異性を有するターゲティング部分と結合させることができる。このような部分としては、限定しないが、以下のものが挙げられる：コレステロール部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｃｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５，１４，９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５，１２６４、２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）。また、以下：米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書；同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書；同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書、及び同第５，６８８，９４１号明細書を参照されたい。尚、これらは各々、参照により本明細書に組み込むものとする。
これらの部分又はコンジュゲートは、一次又は二次ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含んでもよい。本発明のコンジュゲート基としては、インターカレータ、リポータ分子、ポリイミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強するための基；又はオリゴマーの薬物動態学的特性を増強するための基が挙げられる。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クーマリン、及び色素が挙げられる。本発明に関して、薬力学的特性を増強する基には、取込みを向上させ、分解に対する耐性を増強し、及び／又は標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本発明に関して、薬物動態学的特性を増強する基には、本発明の化合物の取込み、分布、代謝又は排出を向上させる基が含まれる。代表的コンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日に提出された国際特許出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号パンフレット、及び米国特許第６，２８７，８６０号明細書に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。コンジュゲート部分は、限定しないが、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含む。例えば、以下の文献を参照されたい：米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書；同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書；同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書、及び同第５，６８８，９４１号明細書。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド修飾は、オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端の修飾を含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’末端は、ヒドロキシル基又はチオホスフェートを含む。別の分子（例えば、ビオチン部分又は発蛍光団）を一本鎖オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端に結合することができることは理解すべきである。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’ヌクレオチドに結合したビオチン部分を含む。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ＥＮＡ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、又は２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡ修飾ヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとロックド核酸ヌクレオチドを交互に含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸ヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを交互に含む。
ある実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、ロックド核酸ヌクレオチドである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’及び３’末端の各々で少なくとも１個のロックド核酸ヌクレオチドによりフランキングされているデオキシリボヌクレオチドを含む。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基又は３’チオホスフェートを有する。
ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個のヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、全てのヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
一本鎖オリゴヌクレオチドが、本明細書に記載する修飾の任意の組合せを有してもよいことは理解すべきである。
オリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンの１つ又は複数を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。
（ａ）（Ｘ）Ｘｘｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘｘＸｘ及び（Ｘ）ｘｘｘｘｘＸ、
（ｂ）（Ｘ）ＸＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘＸ及び（Ｘ）ｘｘｘｘＸＸ、
（ｃ）（Ｘ）ＸＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘＸ及び（Ｘ）ＸｘＸｘＸｘ、
（ｄ）（Ｘ）ｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸｘ、及び（Ｘ）ＸＸＸＸｘｘ、
（ｅ）（Ｘ）ｘＸＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸＸｘＸ及び（Ｘ）ＸＸＸＸＸｘ、並びに
（ｆ）ＸＸＸＸＸＸ、ＸｘＸＸＸＸＸ、ＸＸｘＸＸＸＸ、ＸＸＸｘＸＸＸ、ＸＸＸＸｘＸＸ、ＸＸＸＸＸｘＸ及びＸＸＸＸＸＸｘ
ここで、「Ｘ」は、ヌクレオチド類似体を示し、（Ｘ）は、任意のヌクレオチド類似体を示し、「ｘ」は、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチド単位を示す。上に挙げたパターンの各々は、単独、又は開示された他の修飾パターンのいずれかとの組み合わせでオリゴヌクレオチド内に１回又は複数回出現し得る。
遺伝子発現を調節する方法
ある実施形態においては、細胞におけるＳＭＮタンパク質の発現を増大する方法が提供される。ある実施形態では、本方法は、１細胞においてエキソン７を含む（又は包含する）ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の成熟ｍＲＮＡの発現を増大するのに十分な量で、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域と相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを上記細胞に送達することを含む。第１及び第２一本鎖オリゴヌクレオチドは、一緒に又は個別に送達してよい。第１及び第２一本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに連結してもよいし、連結されていない、すなわち個別であってもよい。
本発明のある実施形態において、被験者におけるＡＬＳを治療するための方法が提供される。ある実施形態では、本方法は、１被験者における完全長ＳＭＮタンパク質の発現を、ＡＬＳに関連する１つ又は複数の状態を改善するのに十分なレベルまで増大するのに十分な量で、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域と相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを上記被験者に投与することを含む。第１及び第２一本鎖オリゴヌクレオチドは、一緒に又は個別に投与してよい。第１及び第２一本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに連結してもよいし、連結されていない、すなわち個別であってもよい。第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、第２一本鎖オリゴヌクレオチドの投与から１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間又はそれ以上の時間以内に投与してよい。第１一本鎖オリゴヌクレオチドは、第２一本鎖オリゴヌクレオチドの前又は後に投与してよい。オリゴヌクレオチドは、被験者の必要性及び／又は治療する医師の判断に応じて１回又は複数回投与してよい。ある態様では、オリゴヌクレオチドは、サイクルに従い投与してよい。投与サイクルは変動し得る；例えば、投与サイクルは、第２オリゴ−第１オリゴ−第２オリゴ−第１オリゴの繰り返し；又は第１オリゴ−第２オリゴ−第１オリゴ−第２オリゴの繰り返し；又は第１オリゴ−第２オリゴ−第２オリゴ−第１オリゴ−第１オリゴ−第２オリゴ−第２オリゴ−第１オリゴの繰り返しであってもよい。当業者であれば、特定の被験者を治療するのに適した投与サイクル及び投与間隔を選択することができよう。
一態様において、本発明は、研究を目的とする（例えば、細胞における遺伝子の機能を研究するための）、細胞（例えば、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２レベルが低減した細胞）における遺伝子発現を調節する方法に関する。別の形態では、本発明は、遺伝子又はエピジェネティック療法を目的とする、細胞（例えば、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２レベルが低減した細胞）における遺伝子発現を調節する方法に関する。細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現又は活性の低減を原因とする疾患を有する被験者において）であってよい。ある実施形態では、細胞における遺伝子発現を調節する方法は、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドを送達することを含む。ある実施形態では、細胞への一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、一本鎖オリゴヌクレオチドが送達されていない対照細胞における遺伝子の発現レベルに比べ、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％又はそれ以上高い遺伝子の発現レベルがもたらされる。特定の実施形態では、細胞への一本鎖オリゴヌクレオチドの送達によって、一本鎖オリゴヌクレオチドが送達されていない対照細胞における遺伝子の発現レベルに比べ、少なくとも５０％高い遺伝子の発現レベルがもたらされる。
本発明の別の態様において、方法は、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物を被験者（例えば、ヒト）に投与して、被験者におけるタンパク質レベルを増大することを含む。ある実施形態では、タンパク質レベルの増大は、投与前の被験者におけるタンパク質の量に比べ、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、又はそれ以上高い。
別の例として、細胞におけるＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現を増大するために、本方法は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子を包含するか、又はこれらの近傍にあるゲノム位置に位置する（例えば、長い非コードＲＮＡの）ＰＲＣ２関連領域と十分相補的である一本鎖オリゴヌクレオチド配列を細胞に導入することを含む。
別の態様において、本発明は、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２の発現又は活性レベル低下に関連する状態（例えば、ＡＬＳ）を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドを投与することを含む。
被験者は、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ウシ、又はウマを含み得る。好ましい実施形態において、被験者は、ヒトである。一本鎖オリゴヌクレオチドは、ヒトを含む動物における病態の治療薬中の治療部分として使用されてきた。一本鎖オリゴヌクレオチドは、細胞、組織及び動物、特にヒトの治療のための治療計画に有用となるように設計することができる治療法である。
治療薬の場合、ＡＬＳを有することが疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与することにより治療する。例えば、非制限的な一実施形態では、本方法は、治療が必要な動物に、本明細書に記載する治療有効量の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与するステップを含む。
製剤、送達及び投与
本明細書に記載するオリゴヌクレオチドは、ＳＭＮタンパク質のレベル又は活性低下に関連する状態（例えば、ＡＬＳ）を治療する目的で、被験者への投与のために製剤化することができる。本明細書に開示するオリゴヌクレオチドのどれを用いても、製剤、組成物及び方法を実施できることは理解すべきである。ある実施形態において、１遺伝子のＰＲＣ２関連領域と相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、上記遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む製剤が提供される。ある実施形態では、１遺伝子のＰＲＣ２関連領域と相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、これにリンカーを介して連結された上記遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む製剤が提供される。従って、ある実施形態では、１遺伝子のＰＲＣ２関連領域と相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドが、上記遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドと連結されており、また別の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは連結されていない。連結されていない一本鎖オリゴヌクレオチドは、同時に（例えば、同じ組成物内で）又は個別に、被験者に投与するか、又は細胞に送達することができる。
製剤は、好都合には単位剤形で提供することができ、製薬の分野で公知のいずれかの方法により調製してもよい。単一剤形を製造するのに担体物質と組み合わせることができる活性成分（例えば、本発明のオリゴヌクレオチド又は化合物）の量は、治療しようとする宿主、具体的投与方式、例えば、皮内若しくは吸入などに応じて変動する。単一剤形を製造するのに担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果、例えば、腫瘍退縮をもたらす化合物の量である。
本発明の医薬製剤は、製剤の製造に関する分野で公知のいずれかの方法に従い調製することができる。このような製剤は、甘味料、香味料、着色剤及び防腐剤を含有してよい。製剤は、製造に好適であり、非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合してもよい。製剤は、１種以上の希釈剤、乳化剤、防腐剤、緩衝剤、賦形剤などを含んでもよく、液体、粉末、エマルション、凍結乾燥した粉末、スプレー、クリーム、ローション、徐放剤、錠剤、丸薬、ゲル、パッチ、インプラントなどの形態で提供することができる。
製剤化した一本鎖オリゴヌクレオチド組成物は、多様な状態を呈するものであってよい。ある例では、組成物は、少なくとも部分的に結晶性、均質に結晶性、及び／又は無水性（例えば、含水率が８０％、５０％、３０％、２０％、若しくは１０％未満）である。別の例では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、水相、例えば、水を含む溶液状である。水相又は結晶性組成物は、例えば、送達ビヒクル、例えば、リポソーム（特に、水相の場合）又は粒子（例えば、結晶性組成物に好適となり得るようなミクロ粒子）に組み込むことができる。一般に、意図する投与方法と適合性である方法で、一本鎖オリゴヌクレオチド組成物を製剤化する。
ある実施形態において、組成物は、以下の方法の少なくとも１つにより調製する：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動層乾燥、若しくはこれらの技術の組合せ；又は脂質を用いた超音波処理、フリーズドライ、縮合及びその他の自己組織化。
一本鎖オリゴヌクレオチド調製物は、別の薬剤、例えば、別の治療薬又は一本鎖オリゴヌクレオチドを安定化する物質、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドと複合体化するタンパク質と組み合わせて製剤化又は投与する（一緒に、若しくは個別に）ことができる。別の薬剤は、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、ＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの広特異性ＲＮＡｓｅ阻害剤）などを含む。ある実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドと併用される他の薬剤は、ＳＭＮ発現の調節も行う薬剤である。ある実施形態では、他の薬剤は、成長ホルモン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒドロキシカルバミド（ヒドロキシ尿素）、天然のポリフェノール化合物（例えば、レスベラトロール、クルクミン）、プロラクチン、又はサルブタモールである。用いることができるヒストンデアセチラーゼ阻害剤の例として、脂肪族化合物（例えば、酪酸塩（例えば、酪酸ナトリウム及びフェニル酪酸ナトリウム）及びバルプロ酸）、ベンザミド（例えば、Ｍ３４４）、及びヒドロキサム酸（例えば、ＣＢＨＡ、ＳＢＨＡ、エンチノスタット（ＭＳ−２７５））パノビノスタット（ＬＢＨ−５８９）、トリコスタチンＡ、ボリノスタット（ＳＡＨＡ））が挙げられる。
一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド調製物は、別の一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、第２遺伝子の発現及び／若しくはｍＲＮＡプロセシングを調節する第２一本鎖オリゴヌクレオチド又は第１遺伝子の発現を調節する第２一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。さらに別の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０、又は１００以上の異なる一本鎖オリゴヌクレオチド種を含んでもよい。こうした一本鎖オリゴヌクレオチドは、同様の数の異なる遺伝子に関して、遺伝子発現を媒介することができる。一実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチド調製物は、少なくとも１種の第２治療薬（例えば、オリゴヌクレオチド以外の薬剤）を含む。
送達経路
一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物は、様々な経路で被験者に送達することができる。経路の例として、静脈内、皮内、局所、直腸、非経口、肛門、膣内、鼻内、肺、眼などが挙げられる。「治療に有効な量」という用語は、予想される生理学的応答を賦与するために、治療対象の被験者において要望されるレベルのＳＭＮ１又はＳＭＮ２発現をもたらすのに必要な、組成物中に存在するオリゴヌクレオチドの量である。「生理学的に有効な量」という用語は、要望される苦痛緩和又は治癒効果を賦与するために、被験者に送達される量である。「薬学的に許容される担体」という用語は、被験者に対する有意な有害な毒物学的効果を伴わずに、担体を被験者に投与することができることを意味する。
本発明の一本鎖オリゴヌクレオチド分子は、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。こうした組成物は、典型的に、１種又は複数種の一本鎖オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」という表現は、製剤投与に適合性のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性の物質のためのこのような媒質及び薬剤の使用は、当技術分野では公知である。従来の媒質又は薬剤が活性化合物と非適合性である場合を除いて、組成物におけるその使用が考慮される。また、追加の活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
本発明の医薬組成物は、局所又は全身治療のいずれが要望されるか、また治療しようとする部位に応じていくつかの方法で投与することができる。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻内、経皮など）、経口又は非経口であってよい。非経口投与には、静脈内持続注入法、皮下、腹腔内若しくは筋内注射、又はクモ膜下腔内若しくは脳室内投与が含まれる。
投与の経路及び部位は、ターゲティングを増強するように選択してよい。例えば、筋肉細胞をターゲティングするためには、対象の筋肉への筋内注射が、理にかなった選択であろう。肺細胞は、エアロゾル形態の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与することにより、ターゲティングすることができる。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルを一本鎖オリゴヌクレオチドでコーティングして、オリゴヌクレオチドを機械的に導入することによりターゲティングすることができる。
局所投与とは、製剤を被験者の表面に直接接触させることによる、被験者への送達を指す。局所投与の最も一般的形態は、皮膚に対するものであるが、本明細書に開示する組成物は、身体の他の表面、例えば、眼、粘膜、体腔の表面又は内面にも直接適用することができる。前述したように、最も一般的な局所送達は、皮膚に対するものである。この用語は、限定しないが、局所及び経皮を含む複数の投与経路を包含する。これらの投与方式は、典型的に、皮膚の透過障壁の浸透及び標的組織又は層への有効な送達を含む。局所投与は、表皮及び真皮に浸透して、最終的に組成物の全身送達を達成する手段として用いることができる。局所投与は、被験者の表皮若しくは真皮、又はその特定の層、又は下層組織にオリゴヌクレオチドを選択的に投与する手段として用いることができる。
局所投与のための製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、点滴薬、座薬、スプレー、液剤及び粉末剤が挙げられる。従来の製剤用担体、水性、粉末若しくは油性基剤、増粘剤などが必要であるか、又は望ましい場合もある。また、コーティングされたコンドーム、手袋などが有用な場合もある。
経皮送達は、脂溶性治療薬の投与のための貴重な経路である。真皮は、表皮より透過性であるため、擦りむいた、熱傷を受けた、又はむき出しの皮膚からの吸収は、はるかに高速である。炎症及び皮膚への血流を増加する他の生理学的状態もまた、経皮吸収を増強する。この経路を介した吸収は、油性ビヒクルの使用（塗擦）又は１種以上の浸透促進剤の使用により、増強され得る。経皮経路により本明細書に開示する組成物を送達する他の有効な方法としては、皮膚の水和、及び徐放性局所パッチの使用がある。経皮経路は、全身及び／又は局所療法のために本明細書に開示する組成物を送達する潜在的に有効な手段を提供する。加えて、イオン導入法（電界の影響下での生体膜を介したイオン性溶質の輸送）、音波泳動又は超音波泳動（生体膜、特に皮膚及び角質を通した各種治療薬の吸収を増強するための超音波の使用）、並びに投与位置及び投与部位での貯留に関するビヒクル特性の最適化も、皮膚及び粘膜部位を介した局所適用組成物の輸送を増強する上で有用な方法である。
経口及び鼻粘膜は、他の投与経路に比して利点を提供する。例えば、これらの膜を介して投与されたオリゴヌクレオチドは、作用の迅速な開始を有し、治療血漿レベルをもたらし、肝代謝の初回通過効果を回避し、有害な胃腸（ＧＩ）環境へのオリゴヌクレオチドの暴露を回避する。さらに別の利点は、オリゴヌクレオチドを容易に適用、局在化及び除去することができるような膜部位に対する容易な接近を含む。
経口送達の場合、組成物は、口腔の表面、例えば、舌下面及び口腔底の粘膜又は頬の内側表面を構成する頬粘膜にターゲティングすることができる。舌下粘膜は、比較的透過性であるため、多くの薬剤の迅速な吸収及び許容可能な生体利用可能性をもたらす。さらに、舌下粘膜は、好都合で、許容可能かつ容易に接触可能である。
一本鎖オリゴヌクレオチドの医薬組成物は、計量噴霧ディスペンサーから、前述したような混合ミセル医薬製剤及び噴霧剤を、吸入せずに、口腔に噴霧することによりヒトの口腔に投与することもできる。一実施形態では、ディスペンサーをまず振盪した後、医薬組成物及び噴霧剤を口腔に噴霧する。
経口投与のための組成物としては、粉末若しくは顆粒、水中の懸濁液若しくは溶液、シロップ、エマルション、エリキシール又は非水性媒体、錠剤、カプセル、ロゼンジ、又はトローチが挙げられる。錠剤の場合、用いることができる担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム、及びリン酸の塩がある。デンプンなどの各種崩壊剤、並びにステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクなどの潤滑剤が一般に錠剤に用いられている。カプセル形態への経口投与の場合、有用な希釈剤は、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールである。経口用途に水性懸濁液が必要な場合、核酸組成物は、乳化及び懸濁剤と組み合わせることができる。要望される場合には、特定の甘味料及び／又は香味料を添加してもよい。
非経口投与には、静脈内持続注入法、皮下、腹腔内又は筋内注射、クモ膜下腔内又は脳室内投与が含まれる。ある実施形態において、非経口投与は、疾患の部位への直接の投与（例えば、腫瘍への注射）を含む。
非経口投与のための製剤は、滅菌水溶液を含んでもよく、こうした水溶液は、緩衝剤、希釈剤及びその他の好適な添加剤をさらに含有してもよい。脳室内投与は、例えば、レザバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進してもよい。静脈内での使用の場合、溶質の合計濃度を制御して、製剤を等張性にしなければならない。
本明細書に記載する一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれも眼組織に投与することができる。例えば、組成物は、眼の表面又は周辺組織、例えば、瞼の内部に適用することができる。眼への投与の場合、軟膏又は点滴可能な液体を、アプリケータ又は点眼器などの当技術分野では公知の眼投与装置により投与してよい。このような組成物は、ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリ（ビニルアルコール）などのムコミメティック剤（ｍｕｃｏｉｍｉｍｅｔｉｃｓ）、ソルビン酸、ＥＤＴＡ若しくは塩化ベンジルクロニウムなどの防腐剤、並びに通常量の希釈剤及び／又は担体を含んでもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドはまた、眼の内部に投与することもでき、これを選択した部位又は構造体に導入することができる針若しくは他の送達装置により導入することができる。
肺送達組成物は、患者が分散液を吸入することにより送達することができ、これによって、分散液内の組成物、好ましくは一本鎖オリゴヌクレオチドが、肺に到達し、そこで、組成物が肺胞領域を通して直接血液循環中に容易に吸収されるようにすることができる。肺送達は、肺の疾患を治療するための全身送達及び局在化送達の両方に有効となり得る。
肺送達は、噴霧化、エアロゾル化、ミセル及び乾燥粉末ベースの製剤の使用など、様々なアプローチにより達成することができる。送達は、液体ネブライザー、エアロゾルベースの吸入器、及び乾燥粉末分散器を用いて、達成することができる。定量装置が好ましい。噴霧器又は吸入器を用いる利点の１つは、装置が自蔵式であるため、汚染の可能性が最小限に抑えられることである。例えば、乾燥粉末分散器は、乾燥粉末として容易に製剤化することができる薬剤を送達する。一本鎖オリゴヌクレオチド組成物は、単独で、又は好適な粉末担体と組み合わせて、凍結乾燥又は噴霧乾燥粉末として安定して貯蔵することができる。吸入用組成物の送達は、タイマー、ドーズカウンター、時間計測装置を含み得る投与タイミング要素、又は時間表示器を用いて実施することができ、これらが装置に内蔵されていれば、エアロゾル薬剤の投与の際の用量追跡、適合性モニタリング、及び／又は患者への用量トリガーが可能になる。
「粉末」という用語は、流動性であって、吸入装置に容易に分散させることができ、被験者によって吸入されて、粒子が肺に到達し、肺胞への浸透を可能にするような微細に分散した固体粒子から構成される組成物を意味する。従って、こうした粉末は、「呼吸用（ｒｅｓｐｉｒａｂｌｅ）」と言われる。好ましくは、平均粒度は、粒径約１０μｍ未満であり、好ましくは比較的均一の球状形の分布をしている。より好ましくは、粒径は、約７．５μｍ未満であり、極めて好ましくは約５．０μｍ未満である。通常、粒度分布は、直径約０．１μｍ〜約５μｍ、特に約０．３μｍ〜約５μｍである。
「乾燥（した）」という用語は、組成物が、約１０重量％（％ｗ）未満の水、通常約５％ｗ未満、好ましくは約３％ｗ未満の含水率を有することを意味する。乾燥組成物は、粒子が、エアロゾルを形成するように、吸入装置中に容易に分散可能であるものでよい。
担体として有用な様々なタイプの医薬用賦形剤としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定剤、炭水化物、アミノ酸及びポリペプチドなどの充填剤；ｐＨ調節剤若しくは緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩等がある。これらの担体は、結晶性又は非晶性形態のいずれであってもよいし、両者の混合物であってもよい。
好適なｐＨ調節剤又は緩衝剤としては、有機酸と塩基から調製される有機塩、例えば、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどがあり、クエン酸ナトリウムが好ましい。ミセル状一本鎖オリゴヌクレオチド製剤の肺投与は、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロエタン、ジメチルフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ブタン、イソブタン、ジメチルエーテル及びその他の非ＣＦＣ及びＣＦＣ噴霧剤などの噴霧剤を含む定量噴霧装置を用いて達成することができる。
例示的装置としては、血管系に導入される装置、例えば、血管組織の管腔に挿入される装置、又は装置自体が血管系の一部を形成するもの、例えば、ステント、カテーテル、心臓弁、及びその他の血管装置が挙げられる。これらの装置、例えば、カテーテル又はステントは、肺、心臓、又は脚の血管系に配置することができる。
他の装置としては、非血管装置、例えば、腹腔内、臓器若しくは腺組織に移植される装置、例えば、人工臓器がある。こうした装置は、一本鎖オリゴヌクレオチドに加えて治療物質を放出することができる。例えば、ある装置は、インスリンを放出することができる。
一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物の単位用量又は計測用量は、埋め込みデバイスによって投与される。デバイスは、被験者内のパラメータを監視するセンサーを含んでもよい。例えば、デバイスは、例えば、ポンプ、並びに任意選択で付属の電子部品を含んでもよい。
組織、例えば、細胞又は臓器を一本鎖オリゴヌクレオチドによりｅｘ ｖｉｖｏで処置した後、被験者に投与又は移植することができる。組織は、オートロガス、同種異系、又は異種間組織であってよい。例えば、組織を処置して、移植片対宿主病を軽減することができる。他の実施形態では、組織は、同種異系であり、組織を処置して、その組織における不要な遺伝子発現を特徴とする障害を治療することができる。例えば、組織、例えば、造血細胞、例えば、骨髄造血細胞を処置して、不要な細胞増殖を阻害することができる。オートロガス又は移植片のいずれであっても、処置した組織の導入と、他の療法を組み合せることができる。ある実施において、一本鎖オリゴヌクレオチドで処置した細胞を、例えば、半透性多孔質隔膜により、他の細胞から遮断するが、この隔膜は、細胞がインプラントから流出するのを阻止するが、身体からの分子は細胞に到達させると共に、これら細胞が生成する分子が身体に進入することを可能にする。一実施形態では、多孔質隔膜は、アルギニン酸塩から形成される。
一実施形態において、避妊用具を一本鎖オリゴヌクレオチドでコーティング又は包含する。例示的避妊用具としては、コンドーム、ペッサリー、ＩＵＤ（子宮内避妊用具、スポンジ、膣内シース、及び避妊用具がある。
投薬
一態様において、本発明は、一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、化合物として、又は組成物の１成分として）を被験者（例えば、ヒト被験者）に投与する方法を特徴とする。ある実施形態では、本方法は、単位用量中の化合物（例えば、本明細書に開示するように、一般式Ａ−Ｂ−Ｃの化合物、又は一本鎖オリゴヌクレオチド）を被験者に投与することを含む。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜２５ｍｇである。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約１００ｍｇである。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇである。ある実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、５、１０、２５、５０又は１００ｍｇ超である。
規定量は、疾患又は障害、例えば、ＳＭＮ１若しくはＳＭＮ２に関連する疾患又は障害を治療又は予防するのに有効な量であってよい。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内若しくは筋内）、吸入投与、又は局所適用によって投与することができる。
ある実施形態において、単位用量は、毎日投与する。ある実施形態では、１日１回より頻度は少なく、例えば、２日、４日、８日若しくは３０日毎に１回投与する。別の実施形態では、単位用量をある頻度で（例えば、規則的な頻度で）投与しない。例えば、単位用量を単一回投与してよい。ある実施形態では、単位用量を１日１回より多く、例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間毎等に１回投与する。
一実施形態において、被験者に、初期用量及び１回又は複数回の維持用量の一本鎖オリゴヌクレオチドを投与する。維持用量は、一般に初期用量より少なく、例えば、初期用量の半分である。維持計画は、１日につき０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲、例えば、１日につき体重１ｋｇ当たり１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、又は０．０００１ｍｇの用量又は複数回用量で被験者を治療することを含む。維持用量は、１日、５日、１０日、又は３０日毎に１回以下投与してもよい。さらに、治療計画は、一定期間継続してよいが、これは、特定の疾患の性質、その重症度及び患者の全身状態に応じて変動する。ある実施形態では、投薬は、１日に１回以下、例えば、２４、３６、４８、又はそれ以上の時間毎に１回以下、例えば、５又は８日毎に１回以下送達してもよい。治療後に、その状態の変化及び病態の症状の改善について患者をモニターする。オリゴヌクレオチドの用量は、患者が現状の投薬レベルに有意に応答しない場合には、増加してもよいし、あるいは、病態の症状の改善が認められる、病態が除去されるか、又は望ましくない副作用が認められる場合には、用量を減らしてもよい。
有効量は、特定の状況下で必要に応じて、又は適切と考えられれば、単一用量又は２回以上の用量で投与することができる。反復又は頻繁な注入を促進することが要望される場合には、送達装置、例えば、ポンプ、半永久的ステント（例えば、静脈内、腹腔内、大槽内若しくは嚢内）、又はレザバーの埋め込みが妥当であろう。
ある実施形態において、医薬組成物は、複数の一本鎖オリゴヌクレオチド種を含む。ある実施形態では、医薬組成物は、１遺伝子（例えば、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２）のＰＲＣ２関連領域と相補的な第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、１遺伝子（ＳＭＮ１又はＳＭＮ２）のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む。ある実施形態では、医薬組成物は、一般式Ａ−Ｂ−Ｃを含む化合物を含み、ここで、Ａは、１遺伝子のＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドであり、Ｂは、リンカーであり、Ｃは、上記遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドである。
別の実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド種は、天然に存在する標的配列（例えば、ＰＲＣ２関連領域）に関して、別の種と重複せず、かつ隣接していない配列を有する。別の実施形態では、複数の一本鎖オリゴヌクレオチド種が、異なるＰＲＣ２関連領域に対して特異的である。別の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、対立遺伝子特異的である。ある態様では、別の治療法と共に、一本鎖オリゴヌクレオチドで患者を治療する。
治療が成功したら、患者は、病態の再発を防ぐために維持療法を受けることが望ましい場合もあり、この場合、本発明の化合物を、体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲の維持用量で投与する。
一本鎖オリゴヌクレオチド組成物の濃度は、障害を治療若しくは予防する上で、又はヒトにおける生理学的条件を調節する上で十分な量である。投与される一本鎖オリゴヌクレオチドの濃度又は量は、薬剤について決定されたパラメータ、並びに投与方法、例えば、経鼻、口腔内、肺などに応じて変動する。例えば、経鼻製剤は、鼻腔の刺激又は炎症を防ぐために、成分によっては、はるかに低濃度が要求される傾向があると考えられる。時には、好適な経鼻製剤を提供するために、経口製剤を１０〜１００倍希釈するのが望ましい場合もある。
いくつかの要因が、被験者を有効に治療するのに要求される用量に影響を与え得るが、このような要因として、限定しないが、障害の重症度、治療歴、被験者の全般的健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患などがある。さらに、治療有効量の一本鎖オリゴヌクレオチドによる被験者の治療は、単一療法を含んでもよいし、又は、好ましくは、一連の療法を含んでもよい。また、治療に用いる一本鎖オリゴヌクレオチドの有効量が、特定の治療の過程で増減し得ることは理解されよう。例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド組成物を投与した後、被験者をモニターすることができる。モニタリングから得た情報に基づき、追加量の一本鎖オリゴヌクレオチド組成物を投与することができる。
投薬は、治療しようとする疾患状態の重症度及び応答性に左右され、治療コースは、数日から数ヵ月、あるいは、治癒が達成されるか、又は疾患状態の軽減が達成されるまで継続する。最適な投薬スケジュールは、患者の身体におけるＳＭＮ１又はＳＭＮ２発現レベルの測定値から計算することができる。通常の当業者であれば、最適な投薬量、投与方法及び反復速度を容易に決定することができる。最適な投薬量は、個々の化合物の相対的効能に応じて変動し得るが、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルで有効であると認められるＥＣ５０に基づいて推定することができる。ある実施形態では、動物モデルは、ヒトＳＭＮ１又はＳＭＮ２を発現するトランスジェニック動物を含む。別の実施形態では、試験のための組成物は、動物モデルにおけるＳＭＮ１又はＳＭＮ２とヒトにおけるＳＭＮ１又はＳＭＮ２との間で保存されている配列に対して、少なくとも内部領域内で、相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。
一実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラス又は拡散性注入）、内皮、腹腔内、筋内、クモ膜下腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、口腔、舌下、内視鏡、直腸、経口、膣、局所、肺、鼻内、尿道又は眼などの経路によるものである。投与は、被験者又は例えば、医療供給者などの別の人によって実施することができる。組成物は、計測された用量で、又は定用量を送達するディスペンサーにより提供することができる。選択される送達方法については以下に、より詳しく述べる。
キット
本発明の特定の形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物を収納する容器を含むキットが提供される。ある実施形態では、キットは、１遺伝子のＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを収納する容器と；その遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを収納する第２の容器とを含む。ある実施形態では、キットは、１遺伝子のＰＲＣ２関連領域と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドと、その遺伝子のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドとを収納する容器を含む。ある実施形態では、組成物は、一本鎖オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。ある実施形態では、医薬組成物の個々の成分を１つの容器内に提供してもよい。あるいは、医薬組成物の成分を２つ以上の容器、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド用の１つの容器と、担体化合物用の少なくとも１つの別の容器に個別に提供するのが望ましい場合もある。キットは、例えば、単一ボックス内の１つ又は複数の容器のようにいくつかの異なる構成でパッケージしてもよい。例えば、キットに備えられた指示書に従い、様々な成分を組み合わせることができる。例えば、医薬組成物を調製及び投与するために、本明細書に記載の方法に従い、上記成分を組み合わせることができる。キットは、さらに送達装置を含んでもよい。
本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、これらは限定するものとして何ら解釈すべきではない。本明細書を通じて引用した参照物（参照文献、発行された特許、公開特許出願、及び係属特許出願など）は全て、本明細書に参照によって明示的に組み込まれるものとする。
本発明を以下の実施例においてさらに詳しく説明するが、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：ＳＭＮ１を上方制御するＰＲＣ関連領域をターゲティングするオリゴヌクレオチド
材料及び方法：
リアルタイムＰＣＲ
Ｐｒｏｍｅｇａ ＳＶ ９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎシステム又はＤＮＡｓｅステップを省いたＴｒｉｚｏｌを用いて、細胞からＲＮＡを回収した。個別のパイロット実験において、５０ｎｇのＲＮＡが、逆転写酵素反応のための十分な鋳型であることが判明した。細胞から回収されたＲＮＡを基準化して、５０ｎｇのＲＮＡを各逆転写反応に投入した。限界に達するには希薄過ぎたいくつかのサンプルについて、最大投入量を添加した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩキットを用いて、逆転写酵素反応を実施し、ｉｃｙｃｌｅｒ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、ｃＤＮＡサンプルに対してリアルタイムＰＣＲを実施した。各標的遺伝子についてのｍＲＮＡ発現のベースラインレベルを、上に概説したように定量ＰＣＲで決定した。また、構成的に発現される各種ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡについてもベースラインレベルを決定した。標的遺伝子とほぼ同じレベルのベースライン発現を有する「対照」ハウスキーピング遺伝子を比較の目的で選択した。
タンパク質発現（ＥＬＩＳＡ）
ＳＭＮタンパク質を決定するＥＬＩＳＡを製造者の指示に従い実施した（ＳＭＮ ＥＬＩＳＡキット＃ＡＤＩ−９００−２０９、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。データをビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔ＃：２３２２５）により測定される全タンパク質に対して正規化した。
細胞培養
ヒト肝細胞Ｈｅｐ３Ｂ、ヒト肝細胞ＨｅｐＧ２細胞、マウス肝癌Ｈｅｐａ１〜６細胞、及びヒト腎臓近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）を、当技術分野で公知の条件を用いて培養した（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）。試験した他の細胞株は、ニューロン細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、Ｕ−８７）及びＳＭＮ患者線維芽細胞であった。本明細書に記載する実験に用いた細胞株の詳細を表５に記載する。
オリゴヌクレオチド設計
ＳＭＮ１を上方制御するために、ＰＲＣ−２相互作用領域内でオリゴヌクレオチドを設計した。各オリゴヌクレオチドの配列及び構造を表２に示す。続く表に、表２に記載した特定の試験オリゴヌクレオチドについて用いたヌクレオチド類似体、修飾及びヌクレオチド間結合の説明を提供する。
オリゴヌクレオチドによる細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション
細胞を５００ｕＬ当たり２５，０００細胞の密度で２４ウェルプレートの各ウェルに接種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及び一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、トランスフェクションを実施した。対照ウェルは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみを含有した。トランスフェクションから４８時間後、約２００ｕＬの細胞培養上澄みをＥＬＩＳＡのために−８０℃で保存した。トランスフェクションから４８時間後、細胞からＲＮＡを回収し、上に概説したように定量ＰＣＲを実施した。各オリゴヌクレオチドによる標的ｍＲＮＡ発現の誘導率（％）を、オリゴヌクレオチドの存在下でのｍＲＮＡレベルを対照（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみ）の存在下でのｍＲＮＡに対して基準化することにより決定した。これを「対照」ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ発現の増大と並べて比較した。
結果：
一本鎖オリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ送達によりＳＭＮ１発現が上方制御された
ＳＭＮ１発現を上方制御するための候補としてのオリゴヌクレオチドを設計した。合計５２の一本鎖オリゴヌクレオチドを、配列番号１、２、４、又は５に記載される配列内のＰＲＣ２相互作用領域と相補的であるように設計した。オリゴヌクレオチドは、少なくとも２回反復して試験した。オリゴヌクレオチドの配列及び構造上の特徴を表２に記載する。手短には、前述したように、オリゴヌクレオチドで細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトした。処理後の細胞におけるＳＭＮ１発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ＳＭＮ１発現を上方制御したオリゴヌクレオチドを同定した。さらに詳細を表２に概説する。
表７は、オリゴヌクレオチドを特定の濃度［オリゴ］で細胞にトランスフェクトし、４８又は７２時間後にＲＮＡを調製して、ｑＲＴＰＣＲアッセイを実施することにより、完全長（ＦＬ）又はΔ７ＳＭＮのｍＲＮＡレベルを決定した実験からの結果をさらに示す。他の形態では、オリゴを１０μＭで、裸で（ｇｙｍｎｏｔｉｃａｌｌｙ）細胞に投与し、処理から９日後にＲＮＡを回収した。試験した細胞株は、ニューロン細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、Ｕ−８７）及びＳＭＮ患者線維芽細胞であった。
表８は、オリゴヌクレオチドを特定の濃度（［オリゴ］、［２回目］、［３回目］）で、１種又は２種の更なるオリゴ又は小分子化合物のいずれかと組み合わせて細胞にトランスフェクトし、４８又は７２時間後にＲＮＡを調製して、ｑＲＴＰＣＲアッセイを実施することにより、完全長（ＦＬ）又はΔ７ＳＭＮのｍＲＮＡレベルを決定した実験からの結果をさらに示す。試験した細胞株は、ＳＭＮ患者線維芽細胞であった。
表９は、オリゴヌクレオチドを特定の濃度（［オリゴ］、［２回目］、［３回目］）で、１種若しくは２種の更なるオリゴのいずれかと組み合わせて、又は二量体として、又は裸の（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）処理により、細胞にトランスフェクトし、２４、４８、７２又は２１６時間後に細胞溶解物を調製して、ＥＬＩＳＡアッセイを実施することにより、ＳＭＮタンパク質レベルを決定した、実験からの結果をさらに示す。試験した細胞株は、ＳＭＮ患者線維芽細胞であった。
一本鎖オリゴヌクレオチド（標的遺伝子のアンチセンス鎖）
配列番号範囲：３０〜８３２９、１３０８８〜１３０９４
Ｇランを含まない配列番号例：
ｍｉＲシードを含まない配列番号例：


一本鎖オリゴヌクレオチド（標的遺伝子のセンス鎖）
Ｇランを含まない配列番号例：
ｍｉＲシードを含まない配列番号例：
実施例２：ＳＭＮ２及びスプライススイッチングオリゴヌクレオチドを上方制御するＰＲＣ２相互作用領域をターゲティングするオリゴヌクレオチドを用いた、ＳＭＮ２転写物を含有するエキソン７の選択的上方制御
オリゴ設計：
ＳＭＮ１／２遺伝子座におけるＰＲＣ２相互作用領域（ｌｎｃＲＮＡピーク）をターゲティングするオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴは、表４に概略を示すように、様々なＤＮＡ塩基修飾、修飾配置、ヌクレオシド間結合及びオリゴ間リンカー（オリゴ１〜５２及び５９〜１０１）を用いて合成した。
スプライススイッチングオリゴ（ＳＳＯ）をＳＭＮ２の配列に基づいて設計した。このようなＳＳＯの長さ及び化学の様々な修飾を作製した（オリゴ５３〜５８）。
バイオインフォーマティック分析を用いて、ユニバーサル陰性対照オリゴ（オリゴ２３２〜２９３）も設計した。
方法：
細胞培養：
６つの線維芽細胞株と１つのリンパ芽球細胞株をＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから取得した（図２）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（線維芽細胞）を用いて、又はエレクトロポレーション若しくは援助のない送達（リンパ芽球）によるいずれかで、細胞をオリゴでトランスフェクトして、ＳＭＮ１／２ｍＲＮＡ及びタンパク質発現に対するオリゴヌクレオチドの作用を確認した。実験は全て、生物学的に３回繰り返して実施した。
ｍＲＮＡ及びタンパク質発現：
ｍＲＮＡ発現−
１．第１日に、ＳＭＮ発現の低下した患者の線維芽細胞を１００ｕＬ当たり５，０００細胞の密度で９６ウェルプレートの各ウェルに接種した。
２．第２日に、製造者の指示に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用い、１０ｎＭ又は３０ｎＭのいずれかのオリゴでトランスフェクションを実施した。
３．トランスフェクションから４８時間後に、Ａｍｂｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴキットを用いて、製造者の指示に従い、細胞からｑＲＴ−ＰＣＲ結果を直接取得した。
４．ＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓでのＴａｑｍａｎ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲを用いて、定量ＰＣＲ評価を完了し、デルタデルタＣｔ方法を用いて、ＳＭＮ発現をハウスキーパ遺伝子（Ｂ２Ｍ）に対して基準化することにより、ｍＲＮＡ発現の変化を定量した。
タンパク質発現（ＥＬＩＳＡ）−
ＳＭＮタンパク質を定量するためのＥＬＩＳＡを製造者の指示（ＳＭＮ ＥＬＩＳＡキット＃ＡＤＩ−９００−２０９、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従い、実施した。手短には、ＳＭＮ線維芽細胞は、第１日に、２４ウェル組織培養物塗布プレートのウェル当たり４０，０００細胞で培養した。第２日に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用い、オリゴで細胞をトランスフェクトし、処理から２４及び４８時間後に細胞溶解物を調製した。ＥＬＩＳＡを製造者の指示に従い実施した。続いて、オリゴヌクレオチドにより誘導されたＳＭＮタンパク質レベルを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ処理単独により誘導されたＳＭＮタンパク質レベルに対して基準化することにより、ＳＭＮタンパク質の誘導倍率を決定した。
スプライススイッチングアッセイ（ＤｄｅＩアッセイ）−
ＳＭＮ２由来転写物は、ＳＭＮ１中にヌクレオチド多型が存在しないために導入されたユニークなＤｄｅＩ制限エレメントを含有し、ＳＭＮ２産物のより高速な遊走によって、ＳＭＮ１由来の転写物から識別される。手短には、上に記載したように、ＳＳＯを含む、又は含まない各々３０ｎＭのＰＲＣ２相互作用領域ターゲティングオリゴヌクレオチドで、ＳＭＮ発現の低下した患者の線維芽細胞を処理した。ＳＭＮエキソン５フォワードプライマー及びエキソン８リバースプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施することにより、ｃＤＮＡを生成した後、これらをＤｄｅＩで消化した。ＳＭＮ１転写物がもし存在すれば、これは、ＤｄｅＩ消化ＳＭＮ２転写物より低速で遊走するため、ゲルの上から１番目のバンドとして認められる。上から２番目のバンドは、完全長ＳＭＮ２（正確にスプライスされた形態）を示し、３番目のバンドは、不正確にスプライスされたＳＭＮ２Δ７を示す（図５）。
結果
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）はいずれも、運動ニューロンが変性して死ぬ神経変性疾患であり、筋低下を招き、最後には麻痺を引き起こす。いずれの場合にも、運動ニューロンは、スプライソソーム完全性の欠損を呈し、これはＧｅｍ（コイル小体対（Ｇｅｍｉｎｉ ｏｆ ｃｏｉｌｅｄ ｂｏｄｙ））の破壊によって示される。
ある実施形態において、ＳＭＮ１遺伝子は、エキソン７の少なくとも一部を含む欠失又は他の突然変異のいずれかのために、ＳＭＮタンパク質を正しくコードすることができないように突然変異している。しかし、ＳＭＡ患者は、一般に、少量のＳＭＳタンパク質を依然として発現するＳＭＮ２遺伝子の少なくとも１つのコピー（多くは、２つ以上のコピーを有する）を保持している。ＳＭＮ２遺伝子は、エキソン７においてＣからＴへの突然変異を有し（ＳＭＮ１と比較して）、これは、エキソン７がより高い頻度でスプライスされるように、そのｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを改変する。その結果、完全長ＳＭＮタンパク質は、正常レベルの約１０％しかＳＭＮ２から生成されない（図１を参照）。
６つのＳＭＡ線維芽細胞株と１つのリンパ芽球細胞株をＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから取得した（図２）。ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令されたオリゴヌクレオチド（オリゴ１〜５２及び５９〜１０１）で細胞をトランスフェクトし、ＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施して、ＳＭＮｍＲＮＡ発現に対する作用を評価した。（細胞株３８１４及び３８１３の結果については、図３及び４を参照）。ＳＭＮのＰＲＣ２関連領域に対して指令されるオリゴは、野生型ＳＭＮ１が、例えば、ＡＬＳを有する被験者からの細胞に存在するとき、ＳＭＮタンパク質発現をさらに増強し得る。別個の実験で、ＳＭＮ２のイントロン７におけるスプラス制御配列に対して指令されたオリゴヌクレオチド（オリゴ５３〜５８）で細胞をトランスフェクトし、ＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施して、ＳＭＮｍＲＮＡ発現に対する作用を評価した（細胞株３８１４及び３８１３の結果については、図３及び４を参照）。スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（オリゴ５３〜５８）は、ＤｄｅＩ制限消化後に得られたＰＣＲ産物のゲル分離解析に基づき、完全長ＳＭＮ２の発現を増大することが判明したのに対し；ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令された特定のオリゴヌクレオチドは増大しなかった（図５）。
ＳＭＮ ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｏ）アッセイを実施したところ、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令された特定のオリゴヌクレオチド単独では、いくつかのＳＭＡ患者線維芽細胞におけるトランスフェクションから２４時間後の完全長ＳＭＮタンパク質を有意に増加しなかったことが判明した。（図６）しかし、同じＳＭＮ ＥＬＩＳＡアッセイは、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令されたオリゴヌクレオチドは、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（オリゴ５３又は５４）と組み合わせると、ＳＭＡ患者線維芽細胞におけるトランスフェクションから２４時間後の完全長ＳＭＮタンパク質を有意に増加し、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド単独で観察されたものを超えたことを示した。（図７及び８）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施して、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域に対して指令されたオリゴヌクレオチドが、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（オリゴ５３又は５４）と組み合わせると、ＳＭＡ患者線維芽細胞におけるトランスフェクションから２４時間後にＳＭＮタンパク質を有意に増加したことがわかった。（図９）これらの実験は、ＬＮＡと２’ＯＭｅヌクレオチド又はＤＮＡとＬＮＡヌクレオチドのいずれかを交互に有する修飾オリゴヌクレオチドについて実施した。
要約すると、実施例２の結果は、ＳＭＮ２のＰＲＣ２関連領域をターゲティングする特定のオリゴが、ＳＭＮ ＲＮＡ発現（例えば、ＳＭＮΔ７転写物の）ＳＭＡ患者由来線維芽細胞を誘導することを示している。これらの結果はまた、ある実施形態では、スプライススイッチングオリゴはＳＭＮ ＲＮＡ発現を誘導しないかもしれないが、ＳＭＮ ＲＮＡスプライシングを完全長転写物に変換し得ることも示している。最後に、これらの結果は、スプライススイッチングオリゴとＰＲＣ２関連領域ターゲティングオリゴとの組み合わせが、ＳＭＡ患者由来の細胞における完全長ＳＭＮタンパク質を実質的に増加することを示している。
実施例３：ＰＲＣ２作用機構の確認
材料及び方法：
オリゴヌクレオチド
実施例３で用いたオリゴを以下の表６及び／又は表４に示す（フォーマット化配列の構造的特徴については表３を参照のこと）。
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）用量応答曲線
非ヒト霊長類カニクイザル線維芽細胞（ＮＨＰ）をＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃｏｒｉｅｌｌ ｃａｔ＃：ＡＧ２１３２９）から購入し、ヌクレオシドと、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１５％ＦＢＳを含むＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ）Ａｌｐｈａ改変培地（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）中で培養した。細胞を９６ウェルプレートのウェル当たり１×１０４細胞で平板培養した。２４時間後、オリゴヌクレオチドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ＃１１６６８−０１９）と一緒に細胞にトランスフェクトして、２００〜１．５ｎＭ最終濃度にわたる用量応答曲線を作成した。ｍＲＮＡ発現分析前の４８時間にわたって、培地を取り替えずに、オリゴを細胞と結合させた。
ｑＰＣＲ
ＳＭＮ完全長（ＦＬ）ｑＰＣＲの場合、Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｃｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ＃４３９１８５１Ｃ及び４３９１８５２Ｃ）を用い、製造者の指示に従ってｃＤＮＡを調製した。以前設計されたＴａｑＭａｎプローブ（ＩＤＴ）（Ｈｕａ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ ２４：１６３４−１６４４）及びハウスキーピングＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎアッセイ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ＃Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１）を用いて、ｑＰＣＲを実施した。ΔΔＣｔ法により分析を実施した。
完全長ＳＭＮプローブ：
フォワードプライマー：５’−ＧＣＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＴＡ−３’（配列番号１３１１７）
リバースプライマー：５’−ＣＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＣ−３’（配列番号１３１１８）
プローブ５’−ＴＡＣＡＴＧＡＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＴＡＣＴ−３’（配列番号１３１１９）
ＳＭＮ完全長（ＦＬ）及びΔ７（ｄｅｌ７）ＳＭＮｑＰＣＲの場合、Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｃｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ＃４３９１８５１Ｃ及び４３９１８５２Ｃ）を用い、製造者の指示に従ってｃＤＮＡを調製した。以前設計されたＴａｑＭａｎプローブ（ＩＤＴ）（Ｈｕａ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ ２４：１６３４−１６４４）及びハウスキーピングＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎアッセイ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ＃Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１）を用いて、ｑＰＣＲを実施した。ΔΔＣｔ法により分析を実施した。
完全長ＳＭＮプローブ：
フォワードプライマー：５’−ＧＣＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＴＡ−３’（配列番号１３１１７）
リバースプライマー：５’−ＣＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＣ−３’（配列番号１３１１８）
プローブ５’−ＴＡＣＡＴＧＡＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＴＡＣＴ−３’（配列番号１３１１９）
Δ７ＳＭＮプローブ：
フォワードプライマー：５’−ＴＧＧＡＣＣＡＣＣＡＡＴＡＡＴＴＣＣＣＣ−３’（配列番号１３１２０）
リバースプライマー：５’−ＡＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＴＣＣＡＴＡＴＡＡＴＡＧＣＣ−３’（配列番号１３１２１）
プローブ５’−ＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＧ−３’（配列番号１３１２２）
スプライススイッチングオリゴと組み合わせたＰＲＣ２関連ＳＭＮオリゴの実験
スプライススイッチングオリゴと組み合わせたＰＲＣ２関連ＳＭＮオリゴの作用を評価するために、２つの異なる方法から成るマトリックス化手法を採用した。（ｉ）ＰＣＲ２ＳＭＮオリゴの濃度を３０ｎＭに維持しながら、スプライススイッチングオリゴを次の濃度１９２、９６、４８、２４、１２、６、３及び１．５ｐＭで組み合わせた。（ｉｉ）スプライススイッチングオリゴの濃度を３００ｎＭに維持しながら、ＰＣＲ２ＳＭＮオリゴを次の濃度１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６ｎＭで組み合わせた。
各実験セットについて、これらの組み合わせを、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから取得したＳＭＡ由来線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ ｃａｔ＃：ＧＭ９６７７）に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用い、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。細胞を９６ウェルプレートのウェル当たり１×１０４細胞で平板培養した。翌日、細胞をそれぞれのオリゴの組み合わせでトランスフェクトした。ｍＲＮＡ発現分析前の４８時間にわたって、培地を取り替えずに、オリゴを細胞上に放置した。
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
細胞を室温で１０分間１％ホルムアルデヒドと架橋させた後、グリシンでクエンチングした。クロマチンを調製して、３００〜５００ｂｐのサイズ範囲まで音波破砕（Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２００）した。Ｈ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、ＥＺＨ２、及びＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ Ｓｅｒｉｎｅ２（Ａｂｃａｍ）及びＨ３Ｋ４ｍｅ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗体をプロテインＧ磁気ビーズ（ＮＥＢ）に結合させ、洗浄した後、ＩＰブロッキングバッファー中に再懸濁させた。クロマチン溶解物をビーズに添加してから、４℃で一晩免疫沈降させた。免疫沈降物を洗浄し、ＲＮａｓｅ Ａ（Ｒｏｃｈｅ）処理し、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｒｏｃｈｅ）処理した後、６５℃で一晩のインキュベーションによって架橋を逆転させた。ＤＮＡを精製、沈降、及びヌクレアーゼ非含有水中に再懸濁させた。ＤＮＡの濃縮を決定するためにカスタムＴａｑｍａｎプローブセットを使用した。
結果：
ＳＭＮ発現がＰＲＣ２により調節されていること、及びＰＲＣ２関連領域をターゲティングするように設計したＳＭＮオリゴがＳＭＮ発現を上方制御することができることを確認するために、実験を実施した。最初に、ＰＲＣ２複合体の１成分であるＥＥＤを、ＥＥＤに特異的な３つのｓｉＲＮＡを用い、ＧＭ０９６７７細胞においてノックダウンした。ＥＥＤｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ（ＥＥＤ＃３：カタログ番号ＳＩ００３７６２９９；ＥＥＤ＃６：カタログ番号ＳＩ０３０３７３３５）から購入した。標準的プロトコルを用いて、ＲＮＡを処理細胞から抽出した。３日にわたる５０ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡによるｓｉＲＮＡ処置後、ＥＥＤ及びＳＭＮ２ｍＲＮＡレベルを測定した。ＥＥＤｓｉＲＮＡ処理後に、完全長ＳＭＮ２ｍＲＮＡレベルが上方制御されたことを認め、ＳＭＮ発現調節におけるＰＲＣ２の関与を確認した（図１０）。次に、表４又は表６に記載する、３０ｎＭ濃度のＳＭＮオリゴ７７及び８３（ＳＭＮにおけるＰＲＣ２関連領域をターゲティングするように設計されている）で、細胞を３日間処理した。続いて、ＲＮＡを抽出し、ＳＭＮ２レベルを測定した。ＳＭＮオリゴ７７及び８３の両方が、対照と比較してＳＭＮ２レベルを上方制御することが判明し（図１０）、ＰＲＣ２関連領域をターゲティングするオリゴが、ＳＭＮレベルを上方制御することができることを確認した。
次に、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を用いて、ＳＭＮ遺伝子座でのクロマチン状態を決定した（図１１Ａ）。ＰＲＣ２成分ＥＥＤ及びＥＺＨ２のノックダウンが、ＳＭＮクロマチンにおけるＥＺＨ２の存在を低減したことが認められた（図１１Ｂ）。ヒストン３は、ＥＺＨ２、すなわちＰＲＣ２複合体中のヒストンメチルトランスフェラーゼ酵素の作用によりリシン２７でトリメチル化される（Ｈ３Ｋ２７ｍ３修飾）。また、このＨ３Ｋ２７ｍ３修飾は、転写を抑制すると理解されている。ＥＥＤ及びＥＺＨ１／２のノックダウンはまた、Ｈ３Ｋ２７ｍ３マークも若干低減した（図１１Ｃ）。Ｈ３Ｋ２７ｍ３マークの消失を認めるには、より長い時間を必要とするため、Ｈ３Ｋ２７ｍ３の低減は、ＥＺＨ２の低減ほど大きくなかった。これらのデータは、ＰＲＣ２成分のノックダウンが、ＳＭＮ遺伝子クロマチンにおけるＥＺＨ２及びＨ３Ｋ２７ｍ３の存在の低減をもたらすことを明らかにし、ＰＲＣ２が、ＳＭＮ遺伝子で正常に作用することを示している。さらに、ＰＲＣ２成分のノックダウンが、転写活性のマークの増大、例えば、ＳＭＮ遺伝子座の領域内のＲＮＡ ＰｏｌＩＩＳ２及びＨ３Ｋ３６ｍ３の増大をもたらすことも認められた（図１２）。Ｈ３Ｋ３６ｍ３修飾は、転写伸長のマークである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びＨ３Ｋ３６ｍ３の存在の増大は、ＰＲＣ２のノックダウンが、ＳＭＮ転写の増大をもたらすことを示している。従って、ＰＲＣ２は、確かにＳＭＮ遺伝子の転写を正常に抑制する。ＨＯＸＣ１３遺伝子は、ＰＲＣ２により抑制されることがわかっているため、これをＥＥＤ及びＥＺＨ１／２ノックダウンの陽性対照として用いた。このように、ＥＥＤノックダウンは、ＥＺＨ２を低減し、抑制型Ｈ３Ｋ２７メチル化マークを低減し、転写伸長のＨ３Ｋ３６メチル化マークを増大すると共に、このゲノム位置でＲＮＡポリメラーゼＩＩの存在を増大することが判明した（図１１Ｄ）。
続いて、ＳＭＮオリゴでの処理後、クロマチン状態を測定した。ＧＭ０９６７７細胞を３０ｎＭ濃度のＳＭＮオリゴ７７及び８３で３日間処理した。オリゴ７７及び８３は、ＳＭＮ遺伝子座においてＥＺＨ２会合を低減したことが判明した（図１３Ａ）。ＥＺＨ２会合の消失は、スプライススイッチングオリゴを用いた場合には観察されなかった。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３は、ＳＭＮオリゴ８３処理により低減したが、これは、ＥＺＨ２（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抑制型クロマチン修飾を適用するヒストンメチルトランスフェラーゼ）の動員を阻止するオリゴ処理と一致している（図１３Ｂ）。オリゴ処理は、ＨＯＸＣ１３プロモータクロマチン含量に影響しなかった（図１３Ｃ）。後者の結果は、これらのオリゴがＳＭＮ遺伝子に対するＰＲＣ２の動員しか阻止せず、別のＰＲＣ２調節遺伝子であるＨＯＸＣ１３でのＰＲＣ２活性に影響を及ぼさないことから、オリゴの作用の選択性を示すものである。ＳＭＮオリゴ処理はまた、ＰＲＣ２成分のノックダウンと同様に、転写伸長のマーク、例えば、Ｈ３Ｋ３６ｍ３及びＲＮＡ ｐｏｌＩＩＳ２も増加した（図１４）。これに対して、例示的スプライススイッチングオリゴは、転写伸長のマークを増加しなかった（図１５）。これらの結果は、ＳＭＮ上方制御オリゴ処理が、ＳＭＮ遺伝子に対するＰＲＣ２の動員の阻害と一致する様式で、転写を増大することを示している。
次に、ＳＭＮ１発現のレベルを評価するために、ＳＭＮオリゴを非ヒト霊長類（ＮＨＰ）細胞で試験した。多くのＳＭＮオリゴが、用量依存的に、ＮＨＰ細胞中のＳＭＮ１のレベルを上方制御することが認められた（図１６Ａ）。エキソン７排除は、ＳＭＡ患者に起こるヒトに特有の現象であり、ＮＨＰでは観察されない（Ｒｏｃｈｅｔｔｅ ＣＦ ｅｔａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２００１ Ｍａｒ；１０８（３）：２５５−６６．ＰＭＩＤ：１１３５４６４０）。その結果、例示的スプライススイッチングオリゴは、ＮＨＰ細胞においてＳＭＮ発現を上方制御することができなかった（図１６Ｂ）。
これらの結果から、ＰＲＣ２関連領域ＲＮＡをターゲティングするオリゴヌクレオチド（本明細書では、ＰＲＣ２ターゲティングオリゴと呼ばれる場合もある）は、野生型ＳＭＮ１の発現を上方制御することができることが確認される。これらの結果は、特に、ＳＭＮ上方制御によるＡＬＳ患者の治療に関して重要である。何故なら、ＡＬＳ患者は、典型的に、野生型ＳＭＮ１遺伝子を有するため、ＰＲＣ２ターゲティングオリゴによる上方制御に応答性となり得るからである。
次に、複数の作用機構を有するオリゴが、相乗効果を有するか否かを決定するために、ＰＲＣ２関連領域をターゲティングするように設計されたＳＭＮオリゴ及びＳＭＮスプライススイッチングオリゴ処理を組み合わせた。ＳＭＮ ＰＲＣ２ターゲティングオリゴをスプライススイッチングオリゴと組み合わせて細胞を処理すると、単独のオリゴ処理と比較してＳＭＮ２の上方制御が増大することが判明した（図１７）。
最後に、ＰＲＣ２関連領域をターゲティングするように設計された複数のＳＭＮオリゴをＧＭ０９６７７細胞において、それらがＳＭＮ２ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを上方制御する能力について試験した。ＧＭ０９６７７細胞を３０ｎＭ濃度のＳＭＮオリゴで３日間処理した。試験した全てのオリゴが、完全長ＳＭＮｍＲＮＡをある程度まで上方制御し、一部のオリゴは、ＳＭＮｍＲＮＡを対照レベルの２倍超上方制御することが判明した（図１８）。試験したオリゴは、対照レベルの少なくとも２倍ＳＭＮタンパク質を上方制御することもわかった（図１９）。また、いくつかのスプライススイッチングオリゴは、ＧＭ０９６７７細胞において、それらがＳＭＮ２ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを上方制御する能力についても試験した。ＧＭ０９６７７細胞を３０ｎＭ濃度のスプライシングオリゴで３日間処理した。試験した全てのスプライススイッチングオリゴが、完全長ＳＭＮｍＲＮＡをある程度まで上方制御し、一部のオリゴは、ＳＭＮｍＲＮＡを対照レベルの２倍超上方制御することが判明した（図２０）。また、試験したスプライススイッチングオリゴは、対照レベルの少なくとも３倍ＳＭＮタンパク質を上方制御することもわかった（図２１）。
まとめると、ＰＲＣ２ノックダウンは、ＳＭＮ発現、ＲＮＡポリメラーゼ占有率及び活性化クロマチンマーク（転写活性化を示す）を増大すると共に、ＳＭＮ遺伝子とＥＺＨ２の会合を低減することが判明した。同様に、ＰＲＣ２関連領域をターゲティングするように設計されたＳＭＮオリゴもまた、ＳＭＮ１及び２発現、ＲＮＡポリメラーゼ占有率及び活性化クロマチンマーク（転写活性化を示す）を増大すると共に、ＳＭＮ遺伝子とＥＺＨ２の会合を低減した。さらに、様々な作用機構に関与する組み合わせたオリゴは、単独のオリゴの使用と比較してＳＭＮ発現増大をもたらし得る。
以上記載した明細書は、当業者が本発明を実施する上で十分であると考えられる。本発明は、記載した例によって範囲を限定されることはない。何故なら、これらの例は本発明の一態様の単なる例示として意図されるに過ぎず、他の機能的に同等の実施形態が、本発明の範囲に含まれるからである。本明細書に示し、説明したもの以外の本発明の様々な変更は、以上の説明から当業者には明らかになることであり、これらは、添付した特許請求の範囲に含まれる。本発明の利点及び目的は、本発明の各実施形態により必ずしも包含されているわけではない。

Claims (46)

  1. ＡＬＳを有する被験者の細胞におけるＳＭＮの発現を増大する方法であって、ＳＭＮ遺伝子のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的である相補性の領域を含む、第１一本鎖オリゴヌクレオチドを前記細胞に送達することを含む方法。
  2. 前記細胞が、ＳＯＤ１、ＡＬＳ２、ＳＥＴＸ、ＦＵＳ／ＴＬＳ、ＶＡＰＢ、ＡＮＧ、ＴＤＰ−４３、ＦＩＧ４、ＯＰＴＮ、ＡＴＸＮ２、ＶＣＰ、ＵＢＱＬＮ２、ＳＩＧＭＡＲ１、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＰＦＮ１、又はＣ９ｏｒｆ７２においてＡＬＳに関連する遺伝子改変を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞が、ＳＯＤ１においてＡＬＳに関連する遺伝子改変を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記細胞が、運動ニューロンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’Ｘ−Ｙ−Ｚである配列を含み、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであって、Ｘは、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に固定されており、Ｙは、ヒトミクロＲＮＡのシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、長さ８〜３０ヌクレオチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記方法が、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドを投与することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記スプライス制御配列が、ＳＭＮ２のエキソンに常在する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記エキソンが、エキソン７又はエキソン８である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記スプライス制御配列が、ＳＭＮ２のイントロン−エキソン接合部を横断する、請求項７に記載の方法。
  11. 前記イントロン−エキソン接合部が、イントロン６／エキソン７接合部又はイントロン７／エキソン８接合部である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記スプライス制御配列が、ＳＭＮ２のイントロンに常在する、請求項７に記載の方法。
  13. 前記イントロンが、イントロン６又はイントロン７である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、前記第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを同時に投与する、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記第１一本鎖オリゴヌクレオチドが、リンカーを介して前記第２一本鎖オリゴヌクレオチドと共有結合している、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記リンカーが、オリゴヌクレオチド、ペプチド、低ｐＨ不安定性結合、又はジスルフィド結合を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記第１一本鎖オリゴヌクレオチド又は第２一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体である、請求項７〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記第１一本鎖オリゴヌクレオチド又は第２一本鎖オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、又は少なくとも１個の架橋ヌクレオチドを含む、請求項７〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記第２一本鎖オリゴヌクレオチドが、８〜３０ヌクレオチドの長さである、請求項７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記細胞が、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に関連する突然変異がないＳＭＮ１遺伝子を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. ＡＬＳを有する被験者におけるＳＭＮのレベルを増加する方法であって、ＳＭＮ遺伝子のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的である相補性の領域を含む、第１一本鎖オリゴヌクレオチドを前記被験者に投与することを含む方法。
  22. ＡＬＳを治療する方法であって、ＳＭＮ遺伝子のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的である相補性の領域を含む、第１一本鎖オリゴヌクレオチドを前記被験者に投与することを含む方法。
  23. 前記被験者が、ＳＯＤ１、ＦＵＳ／ＴＬＳ、又はＴＤＰ−４３から選択される遺伝子における突然変異を有する、請求項２１又は２２に記載の方法。
  24. 前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、クモ膜下腔内に投与される、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’Ｘ−Ｙ−Ｚである配列を含み、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであって、Ｘは、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に固定されており、Ｙは、ヒトミクロＲＮＡのシード配列ではない、長さ６ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Ｚは、長さ１〜２３ヌクレオチドのヌクレオチド配列である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記第１一本鎖オリゴヌクレオチドが、長さ８〜３０ヌクレオチドである、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記第１一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体である、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記方法が、ＳＭＮ２のｍＲＮＡ前駆体のスプライス制御配列と相補的な第２一本鎖オリゴヌクレオチドを投与することをさらに含む、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記スプライス制御配列が、ＳＭＮ２のエキソンに常在する、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記エキソンが、エキソン７又はエキソン８である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記スプライス制御配列が、ＳＭＮ２のイントロン−エキソン接合部を横断する、請求項２８に記載の方法。
  32. 前記イントロン−エキソン接合部が、イントロン６／エキソン７接合部又はイントロン７／エキソン８接合部である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記スプライス制御配列が、ＳＭＮ２のイントロンに常在する、請求項２８に記載の方法。
  34. 前記イントロンが、イントロン６又はイントロン７である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記第１一本鎖オリゴヌクレオチドと、前記第２一本鎖オリゴヌクレオチドとを同時に投与する、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記第１一本鎖オリゴヌクレオチドが、リンカーを介して前記第２一本鎖オリゴヌクレオチドと共有結合している、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記リンカーが、オリゴヌクレオチド、ペプチド、低ｐＨ不安定性結合、又はジスルフィド結合を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記第２一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体である、請求項２８〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記第１一本鎖オリゴヌクレオチド又は第２一本鎖オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、又は少なくとも１個の架橋ヌクレオチドを含む、請求項２８〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記第２一本鎖オリゴヌクレオチドが、８〜３０ヌクレオチドの長さである、請求項３８〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. スプライソソーム欠損を有する細胞においてＧｅｍ形成を促進する方法であって、
    ＳＭＮ遺伝子のＰＲＣ２関連領域の少なくとも８個の連続したヌクレオチドと相補的である相補性の領域を含む、一本鎖オリゴヌクレオチドを前記細胞に送達することを含む方法。
  42. 前記細胞が、運動ニューロン疾患を有する患者の運動ニューロンである、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記運動ニューロン疾患が、ＡＬＳ又はＳＭＡである、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記細胞への前記一本鎖オリゴヌクレオチドの送達前及び／又は送達後に、前記細胞におけるスプライソソーム完全性を評価することをさらに含む、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. スプライソソーム完全性の評価が、前記細胞の核におけるＦＵＳ、ＴＤＰ−４３、ＳＭＮ、Ｇｅｍｉｎ３、Ｇｅｍｉｎ４又は別のＧｅｍマーカの局在化を決定することを含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記細胞が、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に関連する突然変異がないＳＭＮ１遺伝子を含む、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
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