ES2290951T3 - Oligonucleotidos antisentido que combaten el corte y empalme aberrante y metodos de uso de los mismos. - Google Patents
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Abstract
SE PRESENTA UN METODO PARA COMBATIR LA UNION ABERRANTE EN UNA MOLECULA PREM-ARN QUE CONTENGA UNA MUTACION. CUANDO ESTA PRESENTE EN LA PRE-MARN LA MUTACION PRODUCE LA UNION INCORRECTA Y PRODUCE UN PRE-MARN O UN FRAGMENTO DE M-ARN DIFERENTE DEL PRE-MARN CODIFICADO DE FORMA NORMAL POR LA PRE-MARN. EL METODO COMPRENDE LA HIBRIDIZACION DE UN OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO DE LA MOLECULA PRE-MARN PARA CREAR UNA MOLECULA DOBLE BAJO CONDICIONES QUE PERMITAN LA UNION. EL OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO ES DEL TIPO QUE NO ACTIVA LA RNASA H, Y SE SELECCIONA PARA BLOQUEAR UN MIEMBRO DEL CONJUNTO DE ELEMENTOS ABERRANTES UNIDOS CREADOS POR LA MUTACION DE MODO QUE EL INTRON NATIVO SE ELIMINA MEDIANTE LA UNION Y SE PRODUCE LA PRIMERA MOLECULA MARN QUE CODIFICA UN PROTEINA NATIVA. TAMBIEN SE PRESENTAN LOS OLIGONUCLEOTIDOS UTILES PARA DESARROLLAR EL METODO.
Description
Oligonucleótidos antisentido que combaten el
corte y empalme aberrante y métodos de uso de los mismos.
La presente invención se refiere a medicamentos
para combatir el corte y empalme aberrante de moléculas de
pre-ARNm y la regulación por incremento de la
expresión génica y a los oligonucleótidos antisentido útiles para
llevar a cabo los mismos.
El potencial de los oligonucleótidos como
moduladores de la expresión génica se está sometiendo actualmente a
investigación intensa. La mayor parte de los esfuerzos se centran en
la inhibición de la expresión de genes seleccionados como diana
tales como oncogenes o genes virales. Los oligonucleótidos están
dirigidos o bien contra ARN (oligonucleótidos antisentido) (M.
Ghosh y J. Cohen, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 42, 79 (1992);
L. Neckers et al., Crit. Rev. Oncog. 3, 175 (1992)) o bien
contra ADN con el que forman estructuras triples que inhiben la
transcripción mediante la ARN polimerasa II (J. Hanvey et
al., Science 258, 1481 (1992); W. McShan et al., J.
Biol. Chem. 267, 5712 (1992); M. Grigoriev et al., J. Biol.
Chem. 267, 3389 (1992); G. Duval-Valentin et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 504 (1992)). Para lograr un
efecto deseado, los oligonucleótidos deben potenciar una
disminución de la proteína preexistente no deseada evitando
eficazmente su formación de novo. Tales técnicas no son
útiles cuando el objeto es regular por incremento la producción de
la proteína natural. Sin embargo, en los casos en los que la
expresión de un gen está regulada por disminución debido a
mutaciones en el mismo, un medio para regular por incremento la
expresión génica a través de la tecnología antisentido sería
extremadamente útil.
La presente invención proporciona medios para
utilizar oligonucleótidos antisentido para regular por incremento
la expresión de un ADN que contiene una mutación que de otro modo
conduciría a la regulación por disminución de ese gen mediante
corte y empalme aberrante del pre-ARNm para el que
codifica.
En consecuencia, en un primer aspecto de la
presente invención, se proporciona un medicamento para combatir el
corte y empalme aberrante en una molécula de
pre-ARNm que contiene una mutación. Cuando está
presente en el pre-ARNm, la mutación hace que el
pre-ARNm experimente corte y empalme incorrectamente
y produzca un fragmento de ARNm o un ARNm aberrante diferente del
ARNm que resulta normalmente a partir del pre-ARNm.
Más particularmente, la molécula de pre-ARNm
contiene: (i) un primer conjunto de elementos de corte y empalme que
definen un intrón natural que se elimina mediante corte y empalme
cuando la mutación está ausente para producir una primera molécula
de ARNm que codifica para una proteína natural, y (ii) un segundo
conjunto de elementos de corte y empalme inducidos por la mutación
que definen un intrón aberrante diferente del intrón natural, intrón
aberrante que se elimina mediante corte y empalme cuando la
mutación está presente para producir una segunda molécula de ARN
aberrante diferente de la primera molécula de ARNm. El medicamento
comprende un oligonucleótido antisentido que puede hibridar con la
molécula de pre-ARNm para crear una molécula doble
en condiciones que permiten el corte y empalme. El oligonucleótido
antisentido es uno que no activa a la ARNasa H, y se selecciona para
bloquear un miembro del segundo conjunto aberrante de elementos de
corte y empalme de modo que se elimina el intrón natural mediante
corte y empalme y se produce la primera molécula de ARNm que
codifica para una proteína natural.
En un segundo aspecto de la presente invención,
se proporciona un medicamento para regular por incremento la
expresión de una proteína natural en una célula que contiene un ADN
que codifica para la proteína natural. ADN que contiene además una
mutación que produce la regulación por disminución de la proteína
natural mediante el corte y empalme aberrante de la misma. Más
particularmente, el ADN codifica para un pre-ARNm,
teniendo el pre-ARNm las características expuestas
anteriormente. El medicamento comprende un oligonucleótido
antisentido que tiene las características descritas anteriormente,
de modo que se elimina el intrón natural mediante corte y empalme y
se produce la proteína natural por la célula.
Un tercer aspecto de la presente invención es un
oligonucleótido antisentido útil para combatir el corte y empalme
aberrante en una molécula de pre-ARNm que contiene
una mutación. La molécula de pre-ARNm contiene un
primer conjunto y segundo conjunto de elementos de corte y empalme
que tienen las características expuestas anteriormente. El
oligonucleótido antisentido comprende un oligonucleótido que
(i) hibrida con el pre-ARNm para formar una
molécula doble; (ii) no activa a la ARNasa H; y (iii)
bloquea un miembro del segundo conjunto aberrante de elementos de
corte y empalme.
Los anteriores y otros objetos y aspectos de la
presente invención se tratan en detalle en los dibujos en el
presente documento y en la memoria descriptiva expuesta a
continuación.
La figura 1 muestra la estructura de los
pre-ARNm. Los recuadros indican los exones, las
líneas gruesas, los intrones. Las posiciones de las mutaciones (110
y 705) con respecto al nucleótido 1 de IVS 1 e IVS 2,
respectivamente, se muestran por encima del clon HB\Delta6. Los
números por debajo indican la longitud, en nucleótidos, de los
exones y los intrones. Los oligonucleótidos antisentido se indican
mediante las barras cortas numeradas por debajo de los constructos
\beta^{110} e IVS2^{705}, y las rutas de corte y empalme
mediante las líneas discontinuas.
La figura 2 muestra la inversión del corte y
empalme aberrante mediante el oligonucleótido 1 dirigido contra el
punto de ramificación normal en el intrón 1 del
pre-ARNm de la \beta-globina. La
estructura de los productos y los productos intermedios se
representa a la derecha; su tamaño en nucleótidos se muestra a la
izquierda. Un asterisco indica la movilidad aberrante de los
productos intermedios que contienen lazo. Se utilizan las mismas
denominaciones en las figuras siguientes. El carril 1 muestra el
corte y empalme del pre-ARNm de HB\Delta6
control; el carril 2 muestra el corte y empalme del
pre-ARNm de \beta^{110}; los carriles
3-8 muestran el corte y empalme del
pre-ARNm de \beta^{110} en presencia de
cantidades crecientes (indicada en la parte superior de la figura)
del oligonucleótido 1; el carril 9 muestra el corte y empalme del
pre-ARNm de \beta^{110} en presencia de
oligonucleótido 3, dirigido a una secuencia en el intrón 2 del
pre-ARNm de la \beta-globina.
La figura 3 muestra los efectos del
oligonucleótido 2, dirigido contra el sitio de corte y empalme en 3'
aberrante en el intrón 1 del pre-ARNm de
\beta^{110}. El carril 1 muestra el corte y empalme del
pre-ARNm de \beta^{110}; los carriles
2-7 muestran el corte y empalme del
pre-ARNm de \beta^{110} en presencia de
cantidades crecientes (indicadas en la parte superior de la figura)
del oligonucleótido 2.
La figura 4 muestra la inversión del corte y
empalme aberrante del pre-ARNm de IVS2^{705}
mediante el oligonucleótido 3 dirigido contra el sitio de corte y
empalme en 3' críptico y el oligonucleótido 4 dirigido contra el
sitio de corte y empalme en 5' aberrante en el intrón 2 del
pre-ARNm de IVS2^{705}. El carril 1 muestra el ARN
de entrada; los carriles 2 y 3 muestran el corte y empalme de los
transcritos control (indicados en la parte superior de la figura);
los carriles 4-8 y 9-13 muestran el
corte y empalme del pre-ARNm de IVS2^{705} en
presencia de oligonucleótido 3 y el oligonucleótido 4,
respectivamente. Las cantidades de los oligonucleótidos en la
reacción se indican en la parte superior. "?" a la izquierda
indica el producto de degradación aparente.
La figura 5 ilustra los efectos de tratar
células IVS2-654 con un oligonucleótido antisentido
de
2'-O-metil-oligorribonucleótido
(17 monómeros) dirigido contra un sitio de corte y empalme en 3'
críptico en presencia del reactivo de transfección
LIPOFECTIN^{TM}. En los carriles 1, 3 y 5, el ARN de la celulosa
total se sometió a reacción en cadena de la polimerasa -
transcriptasa inversa (RT-PCR) llevada a cabo con el
cebador A (específico para detectar el corte y empalme aberrante
del pre-ARNm); en los carriles 2, 4 y 6, se llevó a
cabo la RT-PCR con el cebador C (específico para
detectar el corte y empalme correcto del pre-ARNm).
El pre-ARNm no sometido a corte y empalme y los
productos de corte y empalme aberrante y correcto y aberrante del
mismo se ilustran esquemáticamente por debajo de la ilustración de
los carriles del gel. Los carriles 1 y 2 muestran el corte y empalme
del pre-ARNm de las células tratadas con el
reactivo de transfección LIPOFECTIN^{TM} y
pre-ARNm 3 \muM del
2'-O-metil-oligorribonucleótido;
los carriles 3 y 4 muestran el corte y empalme de las células
tratadas con el reactivo de transfección LIPOFECTIN^{TM} solo;
los carriles 5 y 6 muestran el corte y empalme del
pre-ARNm de las células no tratadas.
La figura 6 es similar a la figura 5 anterior y
muestra los efectos de tratar células IVS2-654* con
el oligonucleótido antisentido 5 y 20 \muM dirigido al sitio de
corte y empalme en 3' críptico en presencia de partículas de
adenovirus deficiente para la replicación. Se llevó a cabo la
reacción de RT-PCR utilizando cebadores que
hibridan con los exones segundo y tercero del gen de la
\beta-globina humana, respectivamente. El carril
1 muestra el corte y empalme del pre-ARNm de las
células no tratadas. Los carriles 2 y 3 muestran el corte y empalme
del pre-ARNm de células tratadas con oligonucleótido
5 y 20 \muM, respectivamente, en presencia del adenovirus.
La figura 7 es similar a la figura 5 anterior, y
muestra los efectos de la electroporación de células
IVS2-654* tratadas con 5 ó 50 \muM de un
oligonucleótido antisentido de
2'-O-metil-oligorribonucleótido,
dirigido a un sitio de corte y empalme en 5' aberrante. El carril 1
muestra el corte y empalme del pre-ARNm de las
células no tratadas. Los carriles 2 y 3 muestran el corte y empalme
de pre-ARNm de las células tratadas con 5 y 50
\muM del oligonucleótido, respectivamente.
Los intrones son partes del ADN eucariota que se
interponen entre las partes codificantes, o "exones", de ese
ADN. Los intrones y exones se transcriben en ARN denominado
"transcrito primario, precursor de ARNm" (o
"pre-ARNm"). Los intrones deben eliminarse del
pre-ARNm de modo que pueda producirse la proteína
natural codificada por los exones (la expresión "proteína
natural", tal como se usa en el presente documento, se refiere a
la proteína que se produce en la naturaleza, de tipo natural o
funcional). La eliminación de los intrones del
pre-ARNm y la unión posterior de los exones se lleva
a cabo en el proceso de corte y empalme.
El proceso de corte y empalme es en realidad una
serie de reacciones, mediadas por factores de corte y empalme, que
se llevan a cabo en el ARN tras la transcripción pero antes de la
traducción. Por tanto, un "pre-ARNm" es un ARN
que contiene tanto exones como intrón/intrones, y un "ARNm" es
un ARN en el que el/los intrón/intrones se ha(n)
eliminado y los exones están unidos entre sí secuencialmente, de modo que la proteína pueda traducirse a partir de ellos mediante los ribosomas.
eliminado y los exones están unidos entre sí secuencialmente, de modo que la proteína pueda traducirse a partir de ellos mediante los ribosomas.
\newpage
Los intrones están definidos por un conjunto de
"elementos de corte y empalme" que son relativamente cortos,
segmentos de ARN conservados que se unen a los diversos factores de
corte y empalme que llevan a cabo las reacciones de corte y
empalme. Por tanto, cada intrón está definido por un sitio de corte
y empalme en 5', un sitio de corte y empalme en 3' y un punto de
ramificación situado entre ellos. Estos elementos de corte y
empalme se "bloquean", tal como se trata en el presente
documento, cuando un oligonucleótido antisentido, ya sea total o
parcialmente, solapa el elemento, o se une al
pre-ARNm en una posición suficientemente próxima al
elemento como para alterar la unión y la función de los factores de
corte y empalme que normalmente mediarían la reacción de corte y
empalme particular que se produce en ese elemento (por ejemplo, se
une al pre-ARNm en una posición dentro de los 3, 6,
9, 12, 15 ó 18 nucleótidos del elemento que va a bloquearse).
La mutación en el pre-ARNm y el
ADN natural puede ser o bien una mutación por sustitución o bien una
mutación por deleción que crea un elemento de corte y empalme
nuevo, aberrante. Por tanto, el elemento de corte y empalme
aberrante es un miembro de un conjunto de elementos de corte y
empalme aberrantes que definen un intrón aberrante. Los miembros
restantes del conjunto aberrante de elementos de corte y empalme
también pueden ser miembros del conjunto de elementos de corte y
empalme que definen el intrón natural. Por ejemplo, si la mutación
crea un nuevo sitio de corte y empalme en 3' aberrante que está
tanto en el sentido de 5' del (es decir, en 5' con respecto al)
sitio de corte y empalme en 3' natural y en el sentido de 3' del (es
decir, en 3' con respecto al) punto de ramificación natural,
entonces el sitio de corte y empalme en 5' natural y el punto de
ramificación natural pueden servir como miembros tanto del conjunto
natural de elementos de corte y empalme como del conjunto aberrante
elementos de corte y empalme. En otras situaciones, la mutación
puede producir regiones naturales del ARN que normalmente están
inactivos, o no desempeña ningún papel como elemento de corte y
empalme, para llegar a activarse y servir como elementos de corte y
empalme. Tales elementos se denominan elementos "crípticos".
Por ejemplo, si la mutación crea un nuevo sitio de corte y empalme
en 3' mutado aberrante que está situado entre el sitio de corte y
empalme en 3' natural y el punto de ramificación natural, puede
activar un punto de ramificación críptico entre el sitio de corte y
empalme en 3' mutado aberrante y el punto de ramificación natural.
En otras situaciones, una mutación puede crear un sitio de corte y
empalme en 5' aberrante adicional que está situado entre el punto
de ramificación natural y el sitio de corte y empalme en 5' natural
y puede activar además un sitio de corte y empalme en 3' críptico y
un punto de ramificación críptico secuencialmente en el sentido de
5' desde el sitio de corte y empalme en 5' mutado aberrante. En esta
situación, el intrón natural llega a dividirse en dos intrones
aberrantes, con un nuevo exón situado entre ellos. Además, en
algunas situaciones en las que un elemento de corte y empalme
natural (particularmente un punto de ramificación) es también un
miembro del conjunto de elementos de corte y empalme aberrantes,
puede ser posible bloquear el elemento natural y activar un
elemento críptico (es decir, un punto de ramificación críptico) que
incluirá los miembros restantes del conjunto natural de elementos
de corte y empalme para forzar el corte y empalme correcto sobre el
corte y empalme incorrecto. Obsérvese además que, cuando se activa
un elemento de corte y empalme críptico, puede situarse o bien en
el intrón o bien en uno de los exones adyacentes. Por tanto,
dependiendo del conjunto de elementos de corte y empalme aberrantes
creado por la mutación particular, puede sintetizarse el
oligonucleótido antisentido para bloquear una variedad de elementos
de corte y empalme diferentes para llevar a cabo la presente
invención: puede bloquear un elemento mutado, un elemento críptico o
un elemento natural; puede bloquear un sitio de corte y empalme en
5', un sitio de corte y empalme en 3', o un punto de ramificación.
En general, no bloqueará un elemento de corte y empalme que también
define el intrón natural, teniendo en cuenta naturalmente la
situación en la que el bloqueo de un elemento de corte y empalme
natural activa a un elemento críptico que sirve entonces como un
miembro sustituto del conjunto natural de elementos de corte y
empalme y participa en el corte y empalme correcto, tal como
se
trató anteriormente.
trató anteriormente.
La longitud del oligonucleótido antisentido (es
decir, el número de nucleótidos en él) no es crítica, siempre que
se una selectivamente a la ubicación deseada, y puede determinarse
según procedimientos de rutina. En general, el oligonucleótido
antisentido tendrá desde 8, 10 ó 12 nucleótidos de longitud hasta
20, 30 ó 50 nucleótidos de longitud.
Los oligonucleótidos antisentido que no activan
a la ARNasa H pueden obtenerse según técnicas conocidas. Véase, por
ejemplo, la patente estadounidense número 5.149.797 concedida a
Pederson et al. (Las descripciones de toda la bibliografía
de patentes citadas en el presente documento deben incorporarse al
presente documento como referencia). Tales oligonucleótidos
antisentido, que pueden ser secuencias de desoxirribonucleótido o
ribonucleótido, contienen simplemente cualquier modificación
estructural que dificulta o impide estéricamente la unión de la
ARNasa H a una molécula doble que contiene el oligonucleótido como
un miembro de la misma, modificación estructural que no altera o
impide sustancialmente la formación de la molécula doble. Dado que
las partes del oligonucleótido implicadas en la formación de la
molécula doble son sustancialmente diferentes de las partes
implicadas en la unión a la ARNasa H a ello, se dispone de numerosos
oligonucleótidos antisentido que no activan a la ARNasa H. Por
ejemplo, tales oligonucleótidos antisentido pueden ser
oligonucleótidos en los que al menos uno, o todos, los residuos
fosfato de unión entre nucleótidos son fosfatos modificados, tales
como metilfosfonatos, metilfosfonotioatos, fosforomorfolidatos,
fosforopiperazidatos y fosforamidatos. Por ejemplo, uno sí y uno no
de los residuos fosfato de unión entre nucleótidos pueden
modificarse tal como se describe. En otro ejemplo no limitativo,
tales oligonucleótidos antisentido son oligonucleótidos en los que
al menos uno, o todos, de los nucleótidos contienen un resto de
alquilo inferior en 2' (por ejemplo, alquilo
C_{1}-C_{4}, lineal o ramificado, saturado o
insaturado, tal como metilo, etilo, etenilo, propilo,
1-propenilo, 2-propenilo e
isopropilo). Por ejemplo, uno sí y otro no de los nucleótidos puede
estar modificado tal como se ha descrito. Véase también, P. Furdon
et al., Nucleic Acids Res. 17, 9193-9204
(1989); S. Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,
1401-1405 (1990); C. Baker et al., Nucleic
Acids Res. 18, 3537-3543 (1990); B. Sproat et
al., Nucleic Acids Res. 17, 3373-3386 (1989); R.
Walder y J. Walder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,
5011-5015 (1988).
Los medicamentos, oligonucleótidos y
formulaciones de la presente invención tienen una variedad de usos.
Son útiles en cualquier proceso de fermentación en el que se desee
tener un medio para regular por disminución la expresión de un gene
que va a expresarse hasta un cierto tiempo, tras lo cual se desea
regular por incremento la expresión génica (por ejemplo, regular
por disminución durante la fase de crecimiento de la fermentación y
regular por incremento durante la fase de producción de la
fermentación). Para tal uso, el gen que va a expresarse puede ser
cualquier gen que codifica para una proteína que va a producirse
mediante la fermentación, siempre que el gen contenga un intrón
natural. El gen puede mutarse entonces mediante cualquier medio
adecuado, tal como mutagénesis específica de sitio (véase T.
Kunkel, patente estadounidense número 4.873.192) para crear
deliberadamente un segundo conjunto aberrante de elementos de corte
y empalme que definen un intrón aberrante que regula por
disminución sustancialmente la expresión del gen. El gen puede
insertarse entonces en un vector de expresión adecuado y el vector
de expresión puede insertarse en una célula huésped (por ejemplo,
una célula eucariota tal como una célula de levadura, insecto o
mamífero (por ejemplo, ser humano, rata)) mediante técnicas
recombinantes convencionales. Entonces se hace crecer la célula
huésped en cultivo mediante técnicas fermentativas convencionales.
Cuando se desea regular por incremento la expresión del gen mutado,
se añade entonces al medio de cultivo un oligonucleótido
antisentido, en una formulación adecuada, que se une a un miembro
del segundo conjunto aberrante de elementos de corte y empalme, de
modo que se regula por incremento la expresión del gen.
Los medicamentos, oligonucleótidos y
formulaciones de la presente invención también son útiles como
herramientas in vitro o in vivo para examinar el
corte y empalme en genes de seres humanos o animales que están
regulados en el desarrollo y/o en los tejidos. Tales experimentos
pueden llevarse a cabo mediante los procedimientos descritos más
adelante en el siguiente documento, o modificaciones de los mismos
que serán evidentes para los expertos.
Los medicamentos, oligonucleótidos y
formulaciones de la presente invención también son útiles como
agentes terapéuticos en el tratamiento de una enfermedad que
implica corte y empalme aberrante, tal como
\beta-talasemia (en la que el oligonucleótido se
uniría al pre-ARNm de la
\beta-globina, particularmente la humana),
\alpha-talasemia (en la que el oligonucleótido se
uniría al pre-ARNM de la
\beta-globina), síndrome de
Tay-Sachs (en el que el oligonucleótido se uniría
al pre-ARNm de la subunidad \alpha de la
\beta-hexosaminidasa), fenilcetonuria (en la que
el oligonucleótido se uniría al pre-ARNm de la
fenilalanina hidroxilasa) y ciertas formas de fibrosis quística (en
la que el oligonucleótido se uniría al pre-ARNm del
gen de la fibrosis quística), en las que se han identificado las
mutaciones que conducen al corte y empalme aberrante del
pre-ARNm (véase, por ejemplo, S. Akli et al.,
J. Biol. Chem. 265, 7324 (1990); B. Dworniczak et al.,
Genomics 11, 242 (1991); L-C. Tsui, Trends in
Genet. 8, 392 (1992)).
Ejemplos de \beta-talasemia
que pueden tratarse mediante la presente invención incluyen, pero
sin limitarse a, las de la clase mutante de \beta^{110},
-IVS1^{5}, IVS1^{6}, IVS2^{654}, IVS2^{705} y IVS2^{745}
(es decir, en las que el pre-ARNm de la
\beta-globina lleva las mutaciones mencionadas
anteriormente).
La expresión "oligonucleótido antisentido"
incluye las sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables del
mismo: es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada
del compuesto original y no confieren efectos toxicológicos no
deseados al mismo. Ejemplos de tales sales son (a) sales formadas
con cationes tales como sodio, potasio, NH_{4}^{+}, magnesio,
calcio, poliaminas tales como espermina y espermidina, etc.; (b)
sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por
ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico,
ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (c) sales formadas con
ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido
oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido
fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido
ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido
algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalenosulfónico, ácido
metanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido
naftalenodisulfónico, ácido poligalacturónico, y similares; y (d)
sales formadas de aniones elementales tales como coloro, bromo y
yodo.
Las formulaciones de la presente invención
comprenden el oligonucleótido antisentido en un vehículo fisiológica
o farmacéuticamente aceptable, tal como un vehículo acuoso. Por
tanto, las formulaciones para su uso en la presente invención
incluyen, pero no se limitan a, aquellas adecuadas para la
administración parenteral, incluyendo la administración subcutánea,
intradérmica, intramuscular, intravenosa e intraarterial, así como
la administración tópica (es decir, la administración de una
formulación en aerosol de partículas respirables a los pulmones de
un paciente aquejado de fibrosis quística). Las formulaciones pueden
presentarse convenientemente en forma farmacéutica unitaria y
pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos
en la técnica. La vía de administración más adecuada en cualquier
caso dado puede depender del sujeto, la naturaleza y gravedad del
estado que se está tratando y el principio activo particular que se
está usando.
La presente invención proporciona el uso de
oligonucleótidos antisentido que tienen las características
expuestas anteriormente para la preparación de un medicamento para
regular por incremento la expresión génica en un paciente aquejado
con un trastorno de corte y empalme aberrante, tal como se trató
anteriormente. En la fabricación de un medicamento según la
invención, el oligonucleótido antisentido normalmente se mezcla con,
entre otros, un vehículo aceptable. Naturalmente, el vehículo debe
ser aceptable en el sentido de ser compatible con cualquier otro
componente en la formulación y no debe ser perjudicial para el
paciente. El vehículo puede ser un sólido o un líquido. Pueden
incorporarse uno o más oligonucleótidos antisentido en las
formulaciones de la invención, que pueden prepararse mediante
cualquiera de las técnicas bien conocidas de farmacia que consisten
esencialmente en mezclar los componentes, incluyendo opcionalmente
uno o más componentes terapéuticos auxiliares.
\newpage
Las formulaciones de la presente invención
pueden comprender disoluciones para inyección estéril acuosas o no
acuosas del principio activo, preparaciones que son preferiblemente
isotónicas con la sangre del receptor deseado y esencialmente
libres de pirógeno. Estas preparaciones pueden contener
antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que hacen que la
formulación sea isotónica con la sangre del receptor deseado. Las
suspensiones estériles acuosas y no acuosas pueden incluir agentes
de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden
presentarse en recipientes de dosis unitarias o múltiples dosis, por
ejemplo viales y ampollas sellados, y pueden almacenarse en un
estado secado por congelación (liofilizado) que sólo requiere la
adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, solución salina
o agua para inyección, inmediatamente antes de su uso.
En la formulación, el oligonucleótido
antisentido puede estar contenido dentro de una vesícula o partícula
lipídica, tal como un liposoma o microcristal, que puede ser
adecuado para la administración parenteral. Las partículas pueden
ser de cualquier estructura adecuada, tal como unilamelar o
plurilamelar, siempre que el oligonucleótido antisentido esté
contenido en ella. Los lípidos cargados positivamente, tales como
N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamoniometilsulfato,
o "DOTAP", son particularmente preferidos para tales vesículas
y partículas. Se conoce bien la preparación de tales partículas
lipídicas. Véanse,por ejemplo, las patentes estadounidenses números
4.880.635 concedida a Janoff et al.; 4.906.477 concedida a
Kurono et al.; 4.911.928 concedida a Wallach; 4.917.951
concedida a Wallach; 4.920.016 concedida a Allen et al.;
4.921.757 concedida a Wheatley et al.; etc.
La dosificación del oligonucleótido antisentido
administrada dependerá del método particular que se esté llevando a
cabo, y cuando se está administrando a un sujeto, dependerá de la
enfermedad, el estado del sujeto, la formulación particular, la vía
de administración, etc. En general, se desean las concentraciones
intracelulares de oligonucleótido de desde 0,05 hasta 50 \muM, o
más particularmente de 0,2 a 5 \muM. Para la administración a un
sujeto tal como un ser human, se emplea una dosificación de desde
aproximadamente 0,01, 0,1 ó 1 mg/Kg hasta 50, 100 ó 150 mg/Kg.
La presente invención se explica en mayor
detalle en los siguientes ejemplos no limitativos. Las secuencias
de nucleótido se presentan en el presente documento mediante una
sola hebra únicamente, en la dirección de 5' a 3', de izquierda a
derecha.
Ejemplo
1
En la figura 1 se ilustra la construcción y
estructura de diversas moléculas de pre-ARNm de
\beta-globina humana. Los recuadros indican los
exones; las líneas gruesas, los intrones. Las posiciones de las
mutaciones (110 y 705) con respecto al nucleótido 1 de IVS 1 e IVS
2, respectivamente, se muestran por encima del clon HB\Delta6.
Los números por debajo indican la longitud, en nucleótidos, de los
exones y los intrones. Los oligonucleótidos antisentido (tratados
en detalle más adelante) se indican mediante las barras cortas
numeradas por debajo de los constructos \beta^{110} e
IVS2^{705}, y las rutas de corte y empalme mediante las líneas
discontinuas. Se transcribieron todos los pre-ARNm
mediante la ARN polimerasa de SP6 (M. Konarska et al., Cell
38, 731 (1984)) a partir de los fragmentos apropiados del gen de la
\beta-globina humana subclonado en el vector
SP64. HB\Delta6 (A. Krainer et al., Cell 36, 993 (1984))
contiene el gen completo de la \beta-globina
humana. El constructo \beta^{110} contiene los exones 1 y 2 y se
subclonó a partir del clon talasémico original (R. Spritz et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2455 (1981)). Antes de la
transcripción, se linealizaron los plásmidos en el sitio BamHI.
Para construir el plásmido IVS2^{705} se subclonó en primer lugar
en SP64 un fragmento de HB\Delta6 que contiene prácticamente el
segundo exón entero, el segundo intrón entero y la mayor parte del
tercer exón, y posteriormente se sometió a mutagénesis específica
del sitio según técnicas conocidas (T. Kunkel et al.,
Methods Enzymol. 154, 367 (1987)) para introducir una mutación de T
a G en el nucleótido 705 del intrón. Entonces se llevó a cabo la
transcripción en un plásmido linealizado en el sitio PvuII.
Ejemplo
2
Se sintetizaron los
2'-O-metil-oligorribonucleótidos
para su uso en los ejemplos descritos en el presente documento
según técnicas conocidas usando reactivos de Glen Research
(Sterling, VA) y se purificaron según técnicas conocidas con el kit
de purificación SUREPURE^{TM} disponible de US Biochemicals.
Los
2'-O-metil-oligorribonucleótidos
producidos se denominan del oligonucleótido 1 al oligonucleótido
5.
El oligonucleótido 1 (GUCAGUGCCUAUCA) (SEQ ID
NO: 1), complementario a los nucleótidos 82-95 del
intrón 1, está dirigido contra el punto de ramificación normal, y
el oligonucleótido 2 (AUAGACUAAUAGGC) (SEQ ID NO: 2),
complementario a los nucleótidos 103-116 del intrón
1, contra el sitio de corte y empalme en 3' aberrante creado por la
mutación \beta^{110} en el intrón 1 del gen de la
\beta-globina. El oligonucleótido 3
(CAUUAUUGCCCUGAAAG) (SEQ ID NO: 3), complementario a los nucleótidos
573-589 del intrón 2, está dirigido contra el sitio
de corte y empalme en 3' críptico en el nucleótido 579 del segundo
intrón y el oligonucleótido 4 (CCUCUUACCUCAGUUAC) (SEQ ID NO: 4),
complementario a los nucleótidos 697-713, está
dirigido contra el sitio de corte y empalme en 5' aberrante creado
por la mutación en el nucleótido 705 en el segundo intrón del
pre-ARNm de IVS2^{705}. El oligonucleótido 5
(GCUAUUACCUUAACCCAG) (SEQ ID NO: 5) está dirigido contra el sitio de
corte y empalme en 5' aberrante creado por la mutación IVS2^{654}
(nucleótidos 643-660 del intrón 2). El
oligonucleótido 6 (GCCUGACCACCAAC) (SEQ ID NO: 6) está dirigido
contra el sitio de corte y empalme en 5' críptico en el exón 1 del
pre-ARNm de la globina (nucleótidos -23 a -10 con
respecto al nucleótido 1 del intrón 1).
Ejemplo
3
En la \beta^{110}- talasemia, una forma de
enfermedad predominante en pacientes de origen griego y chipriota,
una mutación de A a G en el nucleótido 110 del primer intrón del gen
de la \beta-globina humana crea un sitio de corte
y empalme en 3' adicional, aberrante (R. Spritz et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 78, 2455 (1981)). Pese a la presencia del
sitio de corte y empalme en 3' normal, la maquinaria de corte y
empalme usa preferentemente el sitio aberrante, lo que da como
resultado un ARNm sometido a corte y empalme incorrectamente que
contiene 19 nucleótidos de la secuencia del intrón (figura 1). En
células transfectadas con el alelo de la
\beta^{110}-globina (M. Busslinger et
al., Cell 27, 289 (1981); Y. Fukumaki et al., Cell 28,
585 (1982)) o durante el corte y empalme de su transcrito en los
extractos nucleares (R. Reed y T. Maniatis, Cell 41, 95 (1985))
(véase también la figura 2, el carril 2) el ARNm sometido
correctamente a corte y empalme constituye sólo aproximadamente el
10% del producto sometido a corte y empalme, lo que concuerda con
los niveles marcadamente reducidos de hemoglobina normal observados
en los pacientes con esta forma de talasemia. Se encontró que en el
pre-ARNm de \beta^{110}, el sitio de corte y
empalme en 3' aberrante incluye el punto de ramificación normal en
el nucleótido 93 del intrón, que compite con el sitio de corte y
empalme en 3' correcto, y evita así el corte y empalme correcto (R.
Reed y T. Maniatis, Cell 41, 95 (1985)). De manera significativa
para este trabajo, las mutaciones que inactivan el punto de
ramificación normal, activan un punto de ramificación críptico en
el nucleótido 107 y dan como resultado el corte y empalme en el
sitio de corte y empalme en 3' correcto (Y. Zhuangand A. Weiner,
Genes y Dev. 3, 1545 (1989)). El corte y empalme aberrante no puede
continuar debido a la proximidad del punto de ramificación críptico
al sitio de corte y empalme en 3' mutado en la posición 110.
Para probar si los oligonucleótidos antisentido
dirigidos contra la secuencia del punto de ramificación normal
forzarían la maquinaria de corte y empalme para seleccionar el punto
de ramificación críptico y generar un ARNm sometido a corte y
empalme correctamente, se dirigió un
2'-O-metil-oligonucleótido
de 14 nucleótidos de largo (oligonucleótido 1, (SEQ ID NO: 1))
contra la secuencia del punto de ramificación en el intrón 1 del
pre-ARNm de la \beta-globina. Se
seleccionaron los
2'-O-metil-oligonucleótidos
para este y posteriores experimentos, puesto que son resistentes a
las nucleasas y forman híbridos estables con el ARN que no se
degradan por la ARNasa H (H. Inoue et al., Nucleic Acids
Res. 15, 6131 (1987); H. Inoue et al., FEBS Lett. 215, 327
(1987); B. Sproat et al., Nucleic Acids Res. 17, 3373
(1989)). La degradación por la ARNasa H, observada por ejemplo
cuando se usan oligodesoxinucleótidos antisentido o sus derivados de
fosforotioato, destruiría el pre-ARNm sustrato y
evitaría cualquier corte y empalme.
La figura 2 muestra la inversión del corte y
empalme aberrante mediante el oligonucleótido 1 dirigido contra el
punto de ramificación normal en el intrón 1 del
pre-ARNm de la \beta-globina. Se
llevó a cabo el corte y empalme del pre-ARNm de
\beta^{110} marcado con P^{32} (aproximadamente 10^{5} cpm
por reacción, 25 fmoles) in vitro en extracto nuclear de
células HeLa durante 2 horas, esencialmente tal como se describe
(A. Krainer et al., Cell 36, 993 (1984); Z. Dominski y R.
Kole, Mol. Cell. Biol. 12, 2108 (1992)) excepto en que el volumen
de la reacción se dobló hasta 50 \mul. Los productos de la
reacción se analizaron en un gel de secuenciación de poliacrilamida
al 8% y se visualizaron mediante autorradiografía. La estructura de
los productos y los productos intermedios se representa a la
derecha, su tamaño en nucleótidos se muestra a la izquierda. Un
asterisco indica la movilidad aberrante de los productos intermedios
que contienen lazo. Carril 1, corte y empalme del
pre-ARNm de HB\Delta6 control. Carril 2, corte y
empalme del pre-ARNm de \beta^{110}. Carriles
3-8, corte y empalme del pre-ARNm de
\beta^{110} en presencia de cantidades crecientes (indicadas en
la parte superior de la figura) del oligonucleótido 1. Carril 9,
corte y empalme del pre-ARNm de \beta^{110} en
presencia del oligonucleótido 3, dirigido a una secuencia en el
intrón 2 del pre-ARNm de la
\beta-globina.
El análisis de estos datos muestra que en la
reacción control sin el oligonucleótido (figura 2, carril 2), la
razón de los productos sometidos a corte y empalme de manera
incorrecta con respecto a los sometidos de manera correcta es de
aproximadamente 9:1. La adición del oligonucleótido 1 a
concentraciones de 0,01 a 1,0 mg por reacción
(0,05-5 \muM) produce inhibición dependiente de la
dosis del corte y empalme aberrante e inducción del corte y empalme
correcto del sustrato (figura 2, carriles 3-6). A
1,0 \mug del oligonucleótido, la razón de los productos sometidos
a corte y empalme se invierte a 1:5. El efecto del oligonucleótido
es específico de la secuencia, puesto que la adición de 1 \mug de
un oligonucleótido dirigido contra el sitio de corte y empalme en
3' críptico en el segundo intrón del gen de la
\beta-globina (oligonucleótido 3, (SEQ ID NO: 3);
véase también más adelante) no afecta a la razón original de los
productos sometidos a corte y empalme (figura 2, carril 9). A 2,0 y
4,0 \mug del oligonucleótido 1, se inhibe el corte y empalme en
ambos sitios de corte y empalme y se genera un fragmento de ARN de
243 monómeros (figura 2, carriles 7-8). Este
fragmento se acumula sólo en condiciones de corte y empalme, es
decir en presencia de ATP y otros componentes de la mezcla de corte
y empalme mixture, y lo más probablemente representa un producto de
escisión en el sitio de la unión del oligonucleótido mediante una
nucleasa dependiente de ATP.
El sitio de corte y empalme en 3' aberrante
generado por la mutación de \beta^{110} también parece ser una
diana para la inversión del corte y empalme aberrante mediante un
oligonucleótido antisentido. El bloqueo de esta secuencia debe ser
la forma más simple de forzar a la maquinaria de corte y empalme
para que use el sitio de corte y empalme en 3' original al final
del intrón. Sin embargo, 14 monómeros (oligonucleótido 2, (SEQ ID
NO: 2)) dirigido contra el sitio de corte y empalme aberrante no fue
eficaz; a concentraciones crecientes del oligonucleótido se inhibió
la acumulación de ambos productos sometidos a corte y empalme,
inhibiéndose algo más eficazmente el correcto (figura 3, carriles
2-5). Se llevó a cabo el corte y empalme en las
mismas condiciones que las descritas en relación con la figura 2.
Resulta interesante que la primera etapa de la reacción de corte y
empalme, la escisión en el sitio de corte y empalme en 5' y la
formación del producto intermedio de exón - lazo, parece resultar
menos afectada por el oligonucleótido 2 que la formación del
producto sometido a corte y empalme final. Esto se muestra por la
presencia de estos productos intermedios incluso cuando se
añadieron 1 ó 2 \mug del oligonucleótido a la reacción de corte y
empalme (figura 3, carriles 5-6). A 4 \mug por
reacción, se inhibió la escisión en el sitio de corte y empalme en
5' (figura 3, carril 7).
Los diferentes efectos del oligonucleótido 1 y
el oligonucleótido 2 reflejan las interacciones complejas entre los
oligonucleótidos, los numerosos factores del corte y empalme y los
elementos de secuencia situados en el tramo de 37 nucleótidos entre
el punto de ramificación normal y el sitio de corte y empalme en 3'
correcto. Claramente, el oligonucleótido 1, hibridado con el punto
de ramificación normal en el extremo 5' de esta región, evita la
unión de los factores de corte y empalme a esta secuencia,
forzándolos a seleccionar el punto de ramificación críptico en el
sentido de 3'. Esto conduce a la inhibición del corte y empalme
aberrante y a la inducción del corte y empalme correcto del
pre-ARNm de \beta^{110}. Por el contrario, la
hibridación del oligonucleótido 2 con su secuencia diana situada
centralmente puede impedir la unión de un gran número de factores
de corte y empalme que se unen en esta región y evitar cualquier
corte y empalme. Obsérvese también que este oligonucleótido bloquea
una parte significativa del tracto de polipirimidina que es esencial
para el corte y empalme de ambos sitios de corte y empalme en 3'
correcto y aberrante. Ésta es una explicación alternativa de porqué
este oligonucleótido no pudo restablecer la ruta de corte y empalme
correcto.
Ejemplo
4
No obstante se probó adicionalmente si puede
usarse, un sitio de corte y empalme en 3' aberrante como una diana
para la inversión del corte y empalme incorrecto en
pre-ARNm que llevaba una mutación de T a G en la
posición 705 del segundo intrón del gen de la
\beta-globina humana. Esta mutación
(IVS2^{705}) encontrada en pacientes con talasemia mediterránea,
crea un sitio de corte y empalme en 5' aberrante adicional 145
nucleótidos en el sentido de 5' del sitio de corte y empalme en 3'
normal (C. Dobkin y A. Bank, J. Biol. Chem. 260, 16332 (1985)).
Durante el corte y empalme, se activa un sitio de corte y empalme en
3' críptico en la posición 579 del intrón, dando como resultado la
eliminación de los nucleótidos 1-578 y
706-850 como intrones separados y la incorporación
de la parte restante del intrón en el producto sometido a corte y
empalme (figura 1). En este ARN, las distancias entre cada uno de
los elementos de secuencia implicados en el corte y empalme superó
los 100 nucleótidos y no deben esperarse efectos de impedimento
estérico por el oligonucleótido.
En la figura 4 se muestra la inversión del corte
y empalme aberrante del pre-ARNm de IVS2^{705}
mediante el oligonucleótido 3 (SEQ ID NO: 3) dirigido contra el
sitio de corte y empalme en 3' críptico y el oligonucleótido 4 (SEQ
ID NO: 4) dirigido contra el sitio de corte y empalme en 5'
aberrante en el intrón 2 del pre-ARNm de
IVS2^{705}. Las condiciones de la reacción de corte y empalme
fueron las mismas que las descritas con relación a la figura 2
anterior, excepto porque antes de usar el transcrito de ARN se
purificó mediante electroforesis en un gel de secuenciación al 6%.
Carril 1, ARN de entrada. Carriles 2 y 3, corte y empalme de los
transcritos control (indicados en la parte superior de la figura).
Carriles 4-8 y 9-13, corte y empalme
del pre-ARN de IVS2^{705} en presencia del
oligonucleótido 3 y el oligonucleótido 4, respectivamente. Las
cantidades de los oligonucleótidos en la reacción se indican en la
parte superior. "?" a la izquierda indica producto de
degradación aparente.
El transcrito control que contiene el segundo
intrón del pre-ARNm de la
\beta-globina normal se somete a corte y empalme
eficazmente (figura 4, carril 2) generando los productos intermedios
esperados (el exón en 5' y los grandes lazos) y el producto
sometido a corte y empalme correctamente, de 451 nucleótidos de
longitud. El corte y empalme del pre-ARNm de
IVS2^{705} también es eficaz y da lugar a un producto sometido a
corte y empalme adicional de 577 nucleótidos de longitud y un
producto intermedio esperado de 348 monómeros, que resulta de la
ruta de corte y empalme aberrante producida por la mutación (figura
4, carril 3). La razón 1:2 de los ARN sometidos a corte y empalme
de manera correcta con respecto a los sometidos de manera incorrecta
es similar a la observada previamente in vivo. El
oligonucleótido 3 (figura 1) dirigido al sitio de corte y empalme
en 3' críptico activado en el nucleótido 579 es muy activo,
induciendo la inversión del corte y empalme dependiente de la dosis
para la ruta de corte y empalme correcta (figura 4, carriles
4-8). A 0,1 y 0,4 \mug del oligonucleótido por
reacción, la inversión es prácticamente completa. También se obtiene
un corte y empalme correcto a concentraciones similares del
oligonucleótido 4 (figura 1) dirigido contra el sitio de corte y
empalme en 5' aberrante creado por la mutación en el nucleótido 705
del segundo intrón (figura 4, carriles 9-13). A 1 y
2 \mug por reacción, ninguno de los oligonucleótidos tuvo efectos
adicionales, a 4 \mug por reacción (20 \muM) se inhibió todo el
corte y empalme (no mostrado). Las bandas adicionales, incluyendo
una banda fuerte marcada mediante "?" en una figura se deben lo
más probablemente a la degradación por nucleasa del
pre-ARNm largo (1301 nucleótidos).
Estos resultados muestran que el sitio de corte
y empalme en 3' críptico, así como el sitio de corte y empalme en
5' mutado, proporcionan dianas adecuadas para la inversión
específica del corte y empalme aberrante. Los efectos similares de
los oligonucleótidos 3 y 4 sugieren que no hay diferencias
principales en su accesibilidad a los sitios de corte y empalme
diana. Ambos oligonucleótidos son aproximadamente 10 veces más
eficaces que el oligonucleótido 1 usado en los experimentos
mostrados en la figura 2. Esta mayor eficacia puede deberse a
varios factores. Los oligonucleótidos 3 y 4 son tres nucleótidos más
largos que el oligonucleótido 1 y pueden formar híbridos más
estables con el ARN. Bloquean los sitios de corte y empalme
aberrantes, permitiendo que la maquinaria de corte y empalme
utilice los sitios de corte y empalme correctos y, presumiblemente,
el punto de ramificación correcto. Por el contrario, en el
pre-ARNm de \beta^{110}, el oligonucleótido 1
fuerza a la maquinaria de corte y empalme a usar una secuencia
subóptima de punto de ramificación críptico, que puede dar como
resultado una generación relativamente ineficaz del ARNm sometido a
corte y empalme correctamente. En los experimentos mostrados en la
figura 4, el pre-ARNm de entrada largo apenas es
detectable tras 2 horas de reacción, lo que sugiere su
inestabilidad. Por tanto, aunque las concentraciones molares de los
oligonucleótidos eran esencialmente las mismas que en los
experimentos anteriores, pueden haber estado en un mayor exceso con
respecto al pre-ARNm sustrato.
En los experimentos presentados anteriormente,
los oligonucleótidos se añadían simultáneamente con los otros
componentes de la reacción de corte y empalme. La hibridación previa
del oligonucleótidos con el pre-ARNm no aumentó su
eficacia y los oligonucleótidos añadidos 15 minutos tras el comienzo
de la reacción, es decir, una vez que los complejos de corte y
empalme tenían posibilidad de formarse (B. Ruskin y M. Green, Cell
43, 131 (1985)), fueron casi igual de eficaces (datos no
mostrados). Estos resultados indican que los oligonucleótidos que
contienen la modificación de
2'-O-metilo pueden competir
eficazmente por sus secuencias diana con los factores de corte y
empalme. La alta actividad de estos compuesto se debe lo más
probablemente a su fuerte hibridación con el ARN.
Ejemplo
5
Este experimento se lleva a cabo esencialmente
tal como se describió anteriormente, excepto en que las mutaciones
talasémicas son las mutaciones IVS1-5 y
IVS1-6, en las que se muta el sitio de corte y
empalme en 5' auténtico de IVS1. El corte y empalme aberrante que
da como resultado talasemia se debe aparentemente al hecho de que
las mutaciones IVS1-5 y
IVS1-debilitan el sitio de corte y empalme en 5' y
permiten que el sitio de corte y empalme críptico situado 16
nucleótidos en el sentido de 5' compita satisfactoriamente por los
factores de corte y empalme. En este experimento se probó si un
oligonucleótido antisentido para el sitio de corte y empalme
críptico puede invertir el corte y empalme aberrante de nuevo al
sitio de corte y empalme en 5' mutado y restaurar el corte y
empalme correcto a pesar de las mutaciones, puesto que los sitios de
corte y empalme similares a los mutados parecen ser funcionales en
otros pre-ARNm. El oligonucleótido empleado es el
oligonucleótido 6 (SEQ ID NO: 6), un
2-O-metil-oligorribonucleótido
tal como se describe en el ejemplo 2 anterior.
Ejemplo
6
Estos experimentos se llevan a cabo
esencialmente tal como se describió anteriormente, excepto en que se
emplea el pre-ARNm de la
\beta-globina humana que contiene la mutación
IVS2^{654} y se emplea el oligonucleótido 5 (SEQ ID NO: 5).
La mutación IVS2^{654}, identificada
frecuentemente en los individuos talasémicos de origen chino, afecta
al corte y empalme creando un sitio de corte y empalme en 5'
adicional en el nucleótido 653 y activando el sitio de corte y
empalme en 3' críptico común en el nucleótido 579 del intrón 2. La
eficacia del corte y empalme aberrante del pre-ARNm
de IVS2^{654} es superior que para el pre-ARNm de
IVS2^{705} y sólo son detectables pequeñas cantidades de producto
sometido a corte y empalme correctamente, con respecto al aberrante,
durante el corte y empalme in vitro. A pesar de la alta
eficacia del corte y empalme aberrante, el oligonucleótido 3,
dirigido contra el sitio de corte y empalme en 3' críptico, así como
el oligonucleótido 5, dirigido contra el sitio de corte y empalme
en 5' aberrante, restauraron el corte y empalme correcto eficazmente
a concentraciones similares a las descritas anteriormente. A
concentraciones de 2 \muM de cualquiera de los oligonucleótidos,
el producto sometido a corte y empalme correctamente se acumula y el
producto aberrante es prácticamente indetectable (datos no
mostrados).
Ejemplo
7
Este experimento se lleva a cabo esencialmente
tal como se describió anteriormente para restaurar el corte y
empalme correcto en el pre-ARNm mutante de
\beta-110, excepto en que el oligonucleótido se
une a una secuencia situada justo en el sentido de 5' de la
secuencia del punto de ramificación natural del intrón 1 del gen de
la \beta-globina (nucleótidos
75-88). La secuencia del oligonucleótido es:
CCCAAAGACUAUCC (SEQ ID NO: 7). Se restaura el corte y empalme
correcto.
\newpage
Ejemplo
8
Se construyó una serie de líneas celulares
estables mediante la transfección de células HeLa y células CHO con
genes de globina talasémica clonados por el promotor temprano
inmediato del citomegalovirus (CMV). Los genes incluyen la mutación
IVS1-110, IVS2-654 y
IVS1-5.
Las líneas celulares estables se obtienen según
técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Current Protocols in
Molecular Biology (P. Ausubel. et al. eds. 1987). En resumen,
se cotransfectan las células con plásmidos que llevan genes de
globina talasémica por el promotor de CMV y plásmidos que llevan el
gen de resistencia a neomicina como marcador seleccionable
(pSV2neo). La transfección se realiza o bien mediante
electroporación, (Z. Dominski y R. Kole, Mol. Cel. Biol. 11:
6075-6083 (1991); Z. Dominski y R. Kole, Mol. Cell.
Biol. 12: 2108-2114 (1992)), o bien mediante el
método del fosfato de calcio. Las células se sembraron en placa y
tras 24-48 horas se expusieron a medio selectivo
que contenía G418. Las colonias supervivientes se extendieron y se
sometieron a ensayo para determinar la expresión del ARNm de la
globina talasémica, tal como sigue.
El ARN total se aísla de aproximadamente
10^{5} células usando un Tri-Reagent comercial
(Molecular Research Center, Cincinnati, OH) siguiendo el protocolo
del fabricante. Este método permite el fácil procesamiento de un
gran número de pequeñas muestras y da altos rendimientos de ARN de
buena calidad. Los patrones de corte y empalme se analizan mediante
RT-PCR usando la rTth polimerasa y siguiendo el
protocolo de los fabricantes (Perkin Elmer). No se requiere más del
1-5% de ARN aislado para la detección del ARN
sometido a corte y empalme en las células transfectadas
transitoriamente, por lo que el método es suficientemente sensible
para la fácil detección en líneas celulares estables. La etapa de
la transcriptasa inversa se lleva a cabo con un cebador en 3' que
hibrida con las secuencias aberrantes en el ARNm talasémico y abarca
la unión del corte y empalme. Esto garantiza que el ADN
contaminante y el ARN de la globina normal no se detectan y no
interfieren con el ensayo. Las líneas celulares clonadas que
expresan el pre-ARNm talasémico se utilizan para el
tratamiento con los
2'-O-metil-oligonucleótidos
antisentido, tal como se describe más adelante.
Ejemplo
9
Se hacen crecer las células producidas en el
ejemplo 8 anterior en placas de cultivo de 24 pocillos que contienen
200 \mul de medio por pocillo. Se siembran 2 x 10^{4} células
por pocillo y cuando se unen, se tratan con 200 \mul de medio que
contiene hasta una concentración de 50 \muM de oligonucleótidos
antisentido. Las células se cultivan hasta 4 días en presencia del
oligonucleótido antes de alcanzar la confluencia (2 - 3 x 10^{5}
células). Dado que los
2'-O-metil-oligonucleótidos
son muy estables en el medio que contiene suero, el medio se cambia
no más de cada dos días. La concentración de 50 \muM (40 mg por
pocillo) del oligonucleótido representa un exceso de 100 veces con
respecto a la requerida para provocar la restauración eficaz del
corte y empalme in vitro. Incluso a esta concentración, la
síntesis de un único oligonucleótido a una escala de 1 \mumolar,
que da 1 - 1,6 mg del oligonucleótido, proporciona material
suficiente para de 25 a 40 muestras.
En un enfoque alternativo, las células se tratan
previamente con el reactivo Lipofectin^{TM} (DOTMA, de BRL) a una
concentración de 10 \mug/ml antes de la adición de los
oligonucleótidos, según técnicas conocidas. (C. Bennett et
al., Mol. Pharm. 41: 1023-1033 (1992)).
Tras el tratamiento, se aísla el ARN total como
anteriormente y se somete a ensayo para determinar la presencia de
ARNm sometido a corte y empalme correctamente mediante
RT-PCR. La amplificación de los cebadores se lleva
a cabo en presencia de ATP marcado con alfa-P^{32}
para aumentar la sensibilidad de la detección y reducir el número
de ciclos a 15.
Los ejemplos anteriores son ilustrativos de la
presente invención, y no se interpretan como limitativos de la
misma. La invención se define mediante las reivindicaciones
siguientes, incluyéndose en ella equivalentes de las
reivindicaciones.
Ejemplo
10
Se utilizó una línea celular basada en HeLa
transfectada establemente con el clon de la
\beta-globina humana que lleva una mutación
talasémica IVS2-654 para llevar a cabo los
experimentos siguientes. Un subclón de la línea celular
ISV2-654 expresa predominantemente ARNm de
\beta-globina sometido a corte y empalme de manera
aberrante y pequeñas cantidades de muestras sometidas a corte y
empalme correctamente. Un segundo subclón, denominado
ISV2-654*, expresa ARNm de
\beta-globina sometido a corte y empalme de manera
aberrante y correcta en aproximadamente una razón de 1:1.
Aproximadamente 10^{5} de las células IVS2-654
crecidas en monocapa se trataron con 3 \muM del
2'-O-metil- oligorribonucleótido (17
monómeros) antisentido para el sitio de corte y empalme en 3'
críptico [oligonucleótido 3; CAUUAUUGCCCUGAAAG; (SEQ ID NO: 3)] en
presencia de 20 \mug/ml del reactivo de transfección de liposomas
LIPOFECTIN^{TM} (BRL) según las especificaciones del fabricante
durante 5 horas en medio OPTI-MEM sin suero. Tras la
incubación, se extrajo el medio y se devolvieron las células al
medio de crecimiento normal (MEM + 10% de suero bovino fetal). Las
células no tratadas y las células tratadas con lipofección sólo se
utilizaron como controles. Tras el crecimiento durante la noche, se
aisló el ARN celular total usando Tri-Reagent
(Molecular Research Center, Cincinnati, OH) siguiendo el protocolo
del fabricante. Se cuantificó el ARN mediante la absorbancia
a 260 nm.
a 260 nm.
El análisis de corte y empalme se llevó a cabo
mediante transcriptasa inversa - PCR (RT-PCR). Se
sometió a ensayo una cantidad igual de ARN de cada muestra usando
un kit rTth RT-PCR (Cetus-Perkin
Elmer). Se siguió el protocolo del fabricante con la excepción de
que se añadió 1 \muCi de dATP marcado con
\alpha-P^{32} a la reacción de
RT-PCR. Se analizaron los productos de la PCR en gel
de poliacrilamida no desnaturalizante al 8%. Se utilizó un
oligonucleótido que hibrida con el segundo exón del gen de la
\beta-globina humana como un cebador común. El
cebador específico para el corte y empalme aberrante (cebador A)
abarcó la unión de corte y empalme aberrante, mientras que el
cebador para el corte y empalme correcto (cebador C) abarcó la
unión de corte y empalme correcta (figura 5). Se llevó a cabo
RT-PCR con el cebador A en los carriles 1, 3 y 5 y
con el cebador C en los carriles 2, 4 y 6. La cantidad de producto
de PCR cargado en los carriles 1, 3 y 5 fue de 1/5 de la de los
carriles 2, 4 y 6. Los carriles 1 y 2 muestran el corte y empalme
del pre-ARNm de las células tratadas con el
reactivo LIPOFECTIN^{TM} y
2'-O-metil-oligorribonucleótido
3 \muM; los carriles 3 y 4 muestran el corte y empalme de
pre-ARNm de las células tratadas con reactivo
LIPOFECTIN^{TM} solo; y los carriles 5 y 6 muestran el corte y
empalme de pre-ARNm de las células no tratadas.
Obsérvese el aumento visualmente detectable en el corte y empalme
correcto para las células tratadas con el oligonucleótido en
presencia del reactivo LIPOFECTIN^{TM} en el carril 2.
Ejemplo
11
Aproximadamente 10^{5} de células
ISV2-654* crecidas en monocapa durante la noche se
trataron con
2'-O-metil-oligorribonucleótido
5 y 20 \muM (17 monómeros) antisentido para el sitio de corte y
empalme en 3' críptico (SEQ ID NO: 3) en presencia de 10^{6}
partículas de adenovirus deficiente en replicación (cepa
dl-312, una donación del Dr. Hu de la Universidad
de Carolina del Norte en Chapel Hill). Se preincubaron el virus y el
oligonucleótido durante 30 minutos en OPTI-MEM,
entonces se añadieron al cultivo celular y la incubación continuó
durante 2 horas. Se aspiró el medio y se sustituyó con un medio de
crecimiento normal. Tras un crecimiento durante la noche, se aisló
el ARN total tal como se describió anteriormente. Se llevó a cabo la
reacción de RT-PCR igual que anteriormente, con la
excepción de que los cebadores hibridaron con los exones segundo y
tercero del gen de la \beta-globina humana,
respectivamente. El análisis de los productos fue tal como se
facilita en el ejemplo 10 anteriormente, con la excepción de que se
cargaron en el gel cantidades iguales de productos de PCR. Los
resultados se ilustran en la figura 6. El carril 1 mostró el corte y
empalme de las células no tratadas; y los carriles 2 y 3 mostraron
el corte y empalme de las células tratadas con oligonucleótido 5 y
20 \muM, respectivamente, en presencia de adenovirus. Obsérvese el
aumento visualmente detectable en el corte y empalme correcto,
junto con una disminución correspondiente en el corte y empalme
aberrante y de una manera dependiente de la dosis, para las células
tratadas con oligonucleótido 5 y 20 \muM.
Ejemplo
12
Aproximadamente 10^{5} células
IVS2-654* crecidas durante la noche en monocapa se
trataron con tripsina y se transfirieron en 0,5 ml de
OPTI-MEM a una cubeta de electroporación de 10 mm.
Se añadió 2'-O-metil-
oligorribonucleótido 5 ó 50 \muM antisentido para el sitio de
corte y empalme en 5' aberrante [oligonucleótido 4; (CCUCUUAC
CUCAGUUAC) (SEQ ID NO: 4)] por muestra y se sometió a electroporación la muestra con un pulso de 1500 V usando un conjunto electroporador del Laboratorio de Electrónica de la Universidad de Wisconsin a 0,75 \muF. Tras la electroporación, se resuspendieron las células en medio de crecimiento normal y se hicieron crecer en monocapa durante la noche. Se aisló el ARN total tal como se describió anteriormente y se analizó mediante RT-PCR, tal como se describió en el ejemplo 11 anteriormente.
CUCAGUUAC) (SEQ ID NO: 4)] por muestra y se sometió a electroporación la muestra con un pulso de 1500 V usando un conjunto electroporador del Laboratorio de Electrónica de la Universidad de Wisconsin a 0,75 \muF. Tras la electroporación, se resuspendieron las células en medio de crecimiento normal y se hicieron crecer en monocapa durante la noche. Se aisló el ARN total tal como se describió anteriormente y se analizó mediante RT-PCR, tal como se describió en el ejemplo 11 anteriormente.
Los resultados se ilustran en la figura 7.
Obsérvese una disminución visualmente detectable en el corte y
empalme aberrante, junto con un aumento correspondiente en el corte
y empalme correcto, particularmente cuando se administra 50 \muM
del oligonucleótido.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Kole, Ryszard
\hskip3.9cmDominski, Zbigniew T.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Oligonucleótidos antisentido que combate el corte y empalme aberrante y métodos de uso de los mismos
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Kenneth D. Sibley: Bell. Seltzer. Park y Gibson
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Post Office Drawer 34009
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Charlotte
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Carolina del Norte
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL 28234
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patent In Release nº 1.0. Versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sibley. Kenneth D.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31.665
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 5470-63
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 919-881-3140
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 919-881-3175
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 575102
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGUCAGUGCCU AUCA
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAUAGACUAAU AGGC
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAUUAUUGCC CUGAAAG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCUCUUACCU CAGUUAC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCUAUUACCU UAACCCAG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCUGACCAC CAAC
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCAAAGACU AUCC
\hfill14
Claims (21)
1. Un oligonucleótido antisentido para su uso
como un medicamento para combatir el corte y empalme aberrante en
una molécula de pre-ARNm que contiene una
mutación,
- en el que dicha molécula de pre-ARNm contiene un primer conjunto de elementos de corte y empalme que definen un intrón natural que se elimina mediante corte y empalme cuando dicha mutación está ausente para producir una primera molécula de ARNm que codifica para una proteína natural;
- y en el que dicho pre-ARNm contiene además un segundo conjunto de elementos de corte y empalme inducidos por dicha mutación y que definen un intrón aberrante diferente de dicho intrón natural, intrón aberrante que se elimina mediante corte y empalme cuando dicha mutación está presente para producir una segunda molécula de ARNm aberrante diferente de dicha primera molécula de ARNm;
comprendiendo dicho medicamento:
- un oligonucleótido antisentido que puede hibridar con dicha molécula de pre-ARNm para crear una molécula doble en condiciones que permiten el corte y empalme,
- en el que dicho oligonucleótido antisentido no activa a la ARNasa H;
- y en el que dicho oligonucleótido bloquea un miembro de dicho segundo conjunto aberrante de elementos de corte y empalme;
de modo que se elimina dicho intrón
natural mediante corte y empalme y se produce dicha primera molécula
de ARNm que codifica para una proteína, y en el que dicha etapa de
hibridación se lleva a cabo en una célula, y en el que dicho primer
ARNm se traduce en dicha proteína
natural.
2. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 1, en el que dicho oligonucleótido antisentido
bloquea un elemento de corte y empalme mutado.
3. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 1, en el que dicho oligonucleótido antisentido
bloquea un elemento de corte y empalme natural.
4. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 1, en el que dicho oligonucleótido antisentido
bloquea un elemento de corte y empalme críptico.
5. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 1, en el que dicho oligonucleótido antisentido
bloquea un sitio de corte y empalme en 5'.
6. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 1, en el que dicho oligonucleótido antisentido
bloquea un sitio de corte y empalme en 3'.
7. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 1, en el que dicho oligonucleótido antisentido
bloquea un punto de ramificación.
8. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 1, en el que dicha proteína natural es la
\beta-globina.
9. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 1, en el que dicha proteína natural es la
\beta-globina humana.
10. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 1, en el que dicho oligonucleótido antisentido tiene
desde 8 hasta 50 nucleótidos de longitud.
11. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 1, en el que dicho oligonucleótido antisentido
contiene un residuo fosfato de unión entre nucleótidos modificado
seleccionado del grupo que consiste en metilfosfonatos,
metilfosfonotioatos, fosforomorfolidatos, fosforopiperazidatos y
fosforamidatos.
12. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 1, en el que dicho oligonucleótido antisentido
contiene un nucleótido que tiene un sustituyente de alquilo
inferior en la posición 2' del mismo.
13. Un oligonucleótido antisentido para su uso
como un medicamento para regular por incremento la expresión de una
proteína natural en una célula que contiene ADN que codifica para
dicha proteína natural, ADN que contiene una mutación que produce la
regulación por disminución de dicha proteína natural mediante el
corte y empalme aberrante del mismo,
- en el que dicho ADN codifica para un pre-ARNm;
- en el que dicho pre-ARNm contiene un primer conjunto de elementos de corte y empalme que definen un intrón natural que se elimina mediante corte y empalme cuando dicha mutación está ausente para producir un primer ARNm que codifica para dicha proteína natural;
- y en el que dicho pre-ARNm contiene además un segundo conjunto de elementos de corte y empalme inducidos por dicha mutación y que definen un intrón aberrante diferente de dicho intrón natural, intrón aberrante que se elimina mediante corte y empalme cuando dicha mutación está presente para producir un segundo ARNm aberrante diferente de dicho primer ARNm;
comprendiendo dicho medicamento:
- un oligonucleótido antisentido que hibrida con dicho pre-ARNm para crear un doble del mismo en condiciones que permiten el corte y empalme,
- en el que dicho oligonucleótido antisentido no activa a la ARNasa H;
- y en el que dicho oligonucleótido antisentido bloquea un miembro de dicho segundo conjunto aberrante de elementos de corte y empalme; de modo que se elimina dicho intrón natural mediante corte y empalme y se produce dicha proteína natural.
14. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 13, en el que dicha célula es una célula eucariota
seleccionada del grupo que consiste en células de levadura, insecto
y mamífero.
15. Oligonucleótido antisentido en una
disolución de vehículo acuosa fisiológicamente aceptable para
combatir el corte y empalme aberrante in vivo en una
molécula de pre-ARNm que contiene una mutación,
- en el que dicha molécula de pre-ARNm contiene un primer conjunto de elementos de corte y empalme que definen un intrón natural que se elimina mediante corte y empalme cuando dicha mutación está ausente para producir una primera molécula de ARNm que codifica para una proteína natural;
- y en el que dicho pre-ARNm contiene además un segundo conjunto de elementos de corte y empalme inducidos por dicha mutación y que definen un intrón aberrante diferente de dicho intrón natural, intrón aberrante que se elimina preferentemente mediante corte y empalme cuando dicha mutación está presente para producir una segunda molécula de ARNm aberrante diferente de dicha primera molécula de ARNm;
comprendiendo dicho oligonucleótido antisentido
un oligonucleótido que:
- (i)
- hibrida con dicho pre-ARNm para formar una molécula doble;
- (ii)
- no activa a la ARNasa H; y
- (iii)
- bloquea un miembro de dicho segundo conjunto aberrante de elementos de corte y empalme.
16. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 15, en el que dicho oligonucleótido tiene de 8 a 50
nucleótidos de longitud.
17. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 15, en el que dicho oligonucleótido contiene un
residuo fosfato de unión entre nucleótidos modificado seleccionado
del grupo que consiste en metilfosfonatos, metilfosfonotioatos,
fosforomorfolidatos, fosforopiperazidatos y fosforamidatos.
18. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 16, en el que dicho oligonucleótido antisentido
contiene un nucleótido que tiene un sustituyente de alquilo
inferior en la posición 2' del mismo.
19. Oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 16 en una vesícula lipídica.
20. Uso de oligonucleótido antisentido según la
reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad que implica el corte y empalme
aberrante.
21. Uso de un oligonucleótido antisentido según
la reivindicación 20, en el que dicha enfermedad se selecciona del
grupo que consiste en \beta-talasemia,
\alpha-talasemia, síndrome de
Tay-Sachs, fenilcetonuria y fibrosis quística.
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