CN116171160A - 用于治疗代谢综合征的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于治疗、预防和减轻肥胖、脂肪性肝综合征、糖尿病、肝纤维化、NASH或其他更多的代谢综合征病状或并发症的方法，其包括施用有效量的被设计成预防、限制或调节mRNA分子(优选地ACC和/或DGAT2)的表达的寡核苷酸。

Description

用于治疗代谢综合征的组合物和方法
相关申请交叉引用
本申请要求2020年8月4日提交的美国临时申请第63/061,045号和2020年9月24日提交的美国临时申请第63/082,762号的优先权和权益。上述专利申请中的每一个的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开涉及寡核苷酸用于抑制和控制代谢综合征的用途。在某些实施例中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种RNAi寡核苷酸，所述一种或多种RNAi寡核苷酸抑制受试者的乙酰基CoA羧化酶(ACC)表达和/或抑制受试者的二酰基甘油O-酰基转移酶2(DGAT2)表达。
背景技术
代谢综合征或代谢疾病是一组相关医学病状和相关病理。通常，该综合征与以下五种医学病状中的至少三种相关联：腹部肥胖、血压升高、空腹血糖升高、高血清甘油三酯和低水平的高密度脂蛋白(HDL)水平。患有代谢综合征的个体发展心血管疾病和糖尿病的风险较高。目前，三分之一的美国群体被认为患有代谢综合征和一种或多种所列的病理。尽管治疗取得了进展，但对治疗心血管和代谢疾病的疗法的高的未满足的医疗需求仍然存在。
发明内容
本公开提供了一种在有此需要的受试者中治疗、恢复和/或预防代谢综合征的方法。本公开进一步提供了RNAi寡核苷酸分子，所述RNAi寡核苷酸分子可以限制、控制或消除与代谢综合征相关联的关键基因的表达。此类RNAi寡核苷酸分子是多种双链RNAi寡核苷酸，其中一种可以单独靶向乙酰基CoA羧化酶(ACC或ACAC)，另一种可以单独靶向二酰基甘油O-酰基转移酶2(DGAT2)，或者此类分子的组合可以用于同时或依次靶向ACC和DGAT2。
本公开至少部分地基于寡核苷酸(例如双链寡核苷酸，例如RNAi寡核苷酸)减少ACC或DGAT2表达的发现。因此，鉴定了ACC或DGAT2 mRNA内的靶序列，并且产生了与这些靶序列结合并抑制ACC或DGAT2 mRNA表达的寡核苷酸。如本文所展示的，寡核苷酸在体内抑制鼠、猴和/或人ACC或DGAT2表达。不受理论的束缚，本文所述的靶向ACC的寡核苷酸可用于治疗与ACC表达相关联的疾病、病症或病状，并且本文所述的靶向DGAT2的寡核苷酸可用于治疗与DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状。此外，如本文所展示的、ACC和DGAT2的抑制剂(例如，寡核苷酸)的组合协同作用以降低ACC的表达。当在NASH的小鼠模型中评估时，ACC和DGAT2抑制剂的组合显著地降低血清胆固醇、ALT水平、肝脂肪变性、甘油三酯水平和肝炎症的其他标志物(例如IL-6和IL-12b)。不受理论的束缚，靶向ACC和DGAT2的抑制剂的组合，如本文所述的寡核苷酸，可用于治疗患有病理的疾病、病症或病状，如肝纤维化和/或与代谢综合征相关的病理。
在某些实施例中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抑制ACC表达或活性的组合物和/或抑制受试者中的DGAT2表达或活性的组合物。此类RNAi寡核苷酸分子可以用于治疗患有代谢综合征和相关的病理的受试者，并且因此可以在治疗上有益于患有肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎)、血脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，胰岛素抗性、糖尿病)、心血管疾病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾脏疾病(例如，急性肾脏病症、肾小管功能障碍、近端小管的促炎性变化)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、饮食障碍和过度糖渴求的受试者。
因此，在一个方面中，本公开提供了当本公开的两种寡核苷酸顺序地或同地一起使用时，各自能够抑制ACC或DGAT2或两者的表达的RNAi寡核苷酸分子。此类分子可以单独使用或组合使用，并且可以各自在剂量上变化。在一些方面，每个此类RNAi寡核苷酸分子由形成双链体区域的有义链和反义链组成。在一些实施例中，反义链包括与ACC或DGAT2的互补性区域。在一些实施例中，ACC靶向寡核苷酸包括有义链和反义链，所述有义链包括与SEQID NO:1、29、31、43和55的核苷酸序列中的任一者相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，所述反义链包括与SEQ ID NO:2、30、32、44和56的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在一些实施例中，DGAT2靶向寡核苷酸包括有义链和反义链，所述有义链包括与SEQ ID NO:105、107、111、126、129和137的核苷酸序列中的任一者相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，所述反义链包括与SEQ ID NO:106、108、112、125、130和138的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在一些实施例中，DGAT2靶向寡核苷酸包括有义链和反义链，所述有义链包括与SEQ ID NO:105、107、111、117、119、125、129和137的核苷酸序列中的任一者相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，所述反义链包括与SEQ ID NO:106、108、112、118、120、126、130和138的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在一些实施例中，DGAT2靶向寡核苷酸包括有义链和反义链，所述有义链包括与SEQ ID NO:126、129和137的核苷酸序列中的任一者相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，所述反义链包括与SEQ ID NO:125、130和138的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
在一些实施例中，反义链长度为19至27个核苷酸或长度21至27个核苷酸。在一些实施例中，反义链的长度为22个核苷酸。
在一些实施例中，有义链的长度为19至40个核苷酸。在一些实施例中，有义链的长度为36个核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸具有长度至少19个核苷酸或长度至少21个核苷酸的双链体区域。在一些实施例中，双链体区域长度为20个核苷酸。
在一些实施例中，与ACC或DGAT2互补的区域长度为至少19个连续核苷酸或长度至少21个连续核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸在其3'端处的有义链上包括被示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环。
在一些实施例中，用于减少ACC或DGAT2以用于治疗、逆转和/或预防代谢综合征的寡核苷酸包括反义链和有义链，其中反义链的长度为21至27个核苷酸，并且具有与ACC或DGAT2的互补性区域，其中有义链在其3'端包括被示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1和S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，并且其中反义链和有义链形成长度为至少19个核苷酸的双链结构，但是没有共价连接。
在一些实施例中，环L是四环。在一些实施例中，L长度为4个核苷酸。在一些实施例中，L包括序列GAAA。
在一些实施例中，寡核苷酸包括长度为27个核苷酸的反义链和长度为25个核苷酸的有义链。在一些实施例中，寡核苷酸包括长度为22个核苷酸的反义链和长度为36个核苷酸的有义链。
在一些实施例中，本公开的双链体区域寡核苷酸包括反义链上的3'-突出端序列。在一些实施例中，反义链上的3'-突出端序列长度为2个核苷酸。在一些实施例中，3'-突出端序列仅包括嘌呤核苷酸。在一些实施例中，3'-突出端序列选自AA、GG、AG和GA。在一些实施例中，3'-突出端序列是GG。
在一些实施例中，寡核苷酸包括长度各自在21至23个核苷酸范围内的反义链和有义链。在一些实施例中，寡核苷酸包括长度在19至21个核苷酸范围内的双链体结构。在一些此类实施例中，寡核苷酸包括长度为一个或多个核苷酸的3'-突出端序列，其中所述3'-突出端序列存在于反义链、有义链或反义链和有义链上。在一些实施例中，长度2个核苷酸的3'突出端序列，其中3'突出端序列在反义链上，并且其中有义链长度为21个核苷酸，并且反义链长度为23个核苷酸，使得有义链和反义链形成长度21个核苷酸的双链体。
在一些实施例中，寡核苷酸包括至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施例中，经修饰的核苷酸包括2'-修饰。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸例如用2'-修饰进行修饰。
在一些实施例中，寡核苷酸包括至少一个修饰的核苷酸间键，优选地硫代磷酸酯键。
在一些实施例中，反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包括磷酸酯类似物，例如氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。在一些实施例中，磷酸酯类似物是4'-氧基甲基膦酸酯。
在一些实施例中，寡核苷酸的至少一个核苷酸与一种或多种靶向配体缀合，所述靶向配体如碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质。在一些实施例中，靶向配体包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。在一些实施例中，(GalNAc)部分包括单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。
在一些实施例中，靶向配体与茎-环的L的一个或多个核苷酸缀合。在一些实施例中，茎-环的L的高达4个核苷酸各自与单价GalNAc部分缀合。在一些实施例中，茎-环的L的3个核苷酸各自与单价GalNAc部分缀合。
在一些实施例中，本公开的寡核苷酸是RNAi寡核苷酸。
在一些实施例中，本公开的本公开是包括一种或多种寡核苷酸和药学上可接受的载体、递送剂或赋形剂的药物组合物。
在一些实施例中，本公开提供了一种将寡核苷酸递送至受试者的方法，所述方法包括将药物组合物施用于受试者。
在另一方面，本公开提供了一种通过施用本公开的寡核苷酸来减少细胞、细胞的群体或受试者中的ACC或DGAT2表达的方法。在一些实施例中，一种在细胞、细胞的群体或受试者中减少ACC或DGAT2表达的方法，其包括接触所述细胞或细胞的群体或施用于受试者有效量的本文所述的一种或多种寡核苷酸或其药物组合物的步骤。在一些实施例中，用于减少ACC或DGAT2表达的方法包括减少ACC或DGAT2 mRNA的量或水平、ACC或DGAT2蛋白的量或水平或两者。
在一些实施例中，本公开提供了一种用作治疗剂的药物产品。在一些实施例中，治疗剂作为单一疗法施用，并且是ACC或DGAT2表达的抑制剂。在一些实施例中，本公开提供了一种药物产品，其包括至少第一治疗剂和第二治疗剂，其中所述第一治疗剂是ACC或DGAT2的抑制剂。在一些实施例中，在施用第二治疗剂之前或与施用第二治疗剂间歇地施用治疗剂。在一些实施例中，第一治疗剂与第二治疗剂同时或同时施用，其中所述第一治疗剂是ACC表达的抑制剂，并且其中所述第二治疗剂是DGAT2表达的抑制剂。在一些实施例中，第一治疗剂和第二治疗剂以任一顺序依次施用，其中第一治疗剂是ACC表达的抑制剂，并且其中第二治疗剂是DGAT2表达的抑制剂。
在一些实施例中，第一治疗剂是寡核苷酸，并且是ACC表达的抑制剂，并且第二治疗剂是DGAT2表达的抑制剂。在一些实施例中，第一治疗剂是ACC表达的抑制剂，并且第二治疗剂是寡核苷酸并且是DGAT2表达的抑制剂。在一些实施例中，两种治疗剂都是寡核苷酸。
在一些实施例中，第一治疗剂是寡核苷酸并且是ACC表达的抑制剂，并且第二治疗剂是寡核苷酸并且是DGAT2表达的抑制剂，并且两种治疗剂优先地被递送至肝。在一些实施例中，第一治疗剂是寡核苷酸并且是ACC表达的抑制剂，并且第二治疗剂是寡核苷酸并且是DGAT2表达的抑制剂，并且两种治疗剂优先地被递送至脂肪组织。在一些实施例中，第一治疗剂是寡核苷酸并且是ACC表达的抑制剂并且优先地被递送至肝，并且第二治疗剂是寡核苷酸并且是DGAT2表达的抑制剂并且优先地被递送至脂肪组织。在一些实施例中，第一治疗剂是寡核苷酸并且是ACC表达的抑制剂并且优先地被递送至脂肪组织，并且第二治疗剂是寡核苷酸并且是DGAT2表达的抑制剂并且优先地被递送至肝。
在一些实施例中，本公开提供了组合产品，其包括：(i)ACC抑制寡核苷酸和(ii)DGAT抑制寡核苷酸。在一些实施例中，组合产品是这样的产品，其中组分(i)是包括长度15至30个核苷酸的反义链和长度15至40个核苷酸的有义链的寡核苷酸并且是ACC的抑制剂，并且其中组分(ii)是长度15至30个核苷酸的反义链和长度15至40个核苷酸的有义链的寡核苷酸，并且是DGAT2表达的抑制剂。在一些实施例中，组合产品是包括组分(i)和(ii)及其药学上可接受的盐的组合物。
在一些实施例中，组合产品的组分(i)和(ii)被配制成可注射的悬浮液、凝胶、油、丸剂、片剂、栓剂、粉末、胶囊、气溶胶、软膏、乳膏、贴剂或用于延长和/或缓慢释放的盖仑形式的手段。
在一些实施例中，用本公开的寡核苷酸治疗的受试者患有与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状。在一些实施例中，用于治疗患有与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的一种或多种寡核苷酸或其药物组合物，从而治疗受试者。在一些实施例中，用于治疗的受试者已经接受或正在接受ACC的抑制剂，并且本公开提供了一种施用DGAT2的抑制剂的方法。在一些实施例中，用于治疗的受试者已经接受或正在接受DGAT2的抑制剂，并且本公开提供了一种施用ACC的抑制剂的方法。
在一些实施例中，与ACAC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状选自由以下组成的群组：代谢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、药物诱导的肝病、酒精诱导的肝病、传染性病原体诱导的肝病、炎性肝病、免疫系统功能障碍介导的肝病、血脂异常、心血管疾病、再狭窄、综合征X、代谢综合征、糖尿病、肥胖、高血压、慢性胆管疾病，如原发性硬化胆管炎(PSC)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、胆道闭锁、进行性家族性肝内胆汁淤积3型(PFIC3)、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肝癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胃癌、结肠直肠癌、代谢性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、NAFLD诱导的纤维化或肝硬化、NASH诱导的纤维化或肝硬化、酒精诱导的肝纤维化或肝硬化、药物诱导的肝纤维化或肝硬化、传染性病原体诱导的肝纤维化或肝硬化、寄生虫感染诱导的肝纤维化或肝硬化、细菌感染诱导的肝纤维化或肝硬化、病毒感染诱导的纤维化或肝硬化、HBV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HCV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、双重HCV和HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、放射诱导的或化疗诱导的纤维化或肝硬化、胆道纤维化、由于任何慢性胆汁淤积性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、任何病因的肠纤维化、克罗恩氏病诱导的纤维化、溃疡性结肠炎诱导的纤维化、肠(例如，小肠)纤维化、结肠纤维化、胃纤维化、肺纤维化、继慢性炎性气道疾病之后的肺纤维化，如COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者的肺、结核病、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)。
在另一方面，本公开提供了本公开的寡核苷酸中的任一个或其药物组合物在制造用于治疗与ACAC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的药物中的用途。
在一些实施例中，本公开的寡核苷酸或本公开的药物组合物用于或适于用于治疗与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状。
在另外的方面，本公开的寡核苷酸以用于治疗与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的试剂盒的形式提供。在一些实施例中，试剂盒包括本文所述的寡核苷酸和药学上可接受的载体。在一些实施例中，试剂盒进一步包含包装插页，该包装插页包括向患有与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者施用寡核苷酸的说明书。
在一些方面，本公开提供了用于减少肝纤维化的方法，其包括向患者提供对于a)ACC特异的siRNA和b)对于DGAT2特异的siRNA。
在用途或试剂盒的一些实施例中，与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状选自由以下组成的群组：肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎)、血脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，胰岛素抗性、糖尿病)、心血管疾病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾脏疾病(例如，急性肾脏病症、肾小管功能障碍、近端小管的促炎性变化)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、饮食障碍和过度糖。
附图说明
图1A-1C提供了描绘一般N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)缀合的寡核苷酸的结构和化学修饰模式的示意图。核苷酸位置27-30(未编号)示出了四环结构。2'-OMe＝2'-O甲基；2'-F＝2'-氟。
图2提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水处理的小鼠，在来自用所示的GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中剩余的内源性小ACACA和ACACB mRNA的百分比(％)的图。
图3A-3B提供了描绘相对于未处理的小鼠或用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自用GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸(GalXC-ACAC-5083)处理的小鼠的肝脏样本中剩余的内源性小鼠ACACA和ACACB mRNA的百分比(％)(图3A)或表达％对数(图3B)的图。
图4提供了描述相对于未处理的小鼠或用磷酸盐缓冲液(PBS)处理的小鼠，在来自用GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸(GalXC-ACAC-5083)处理的小鼠的肝脏样本中剩余的如通过蛋白质印迹测量的内源性小鼠ACC1/2(总ACC)蛋白的百分比(％)的图。
图5A提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自用GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸(GalXC-ACAC-5083)处理的小鼠的肝脏样本中如通过天狼星红染色测量的肝脂肪变性水平的图像。
图5B提供了描绘相对于未处理的小鼠或用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自用GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸(GalXC-ACAC-5083)处理的小鼠的肝脏样本中的肝纤维化评分的图。****＝p<0.0001
图5C提供了描绘相对于未处理的小鼠或用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自用所示的GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中剩余的Col1a1 mRNA的百分比(％)的图。*＝p<0.05
图5D提供了描绘相对于未处理的小鼠或用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自用GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸(GalXC-ACAC-5083)处理的小鼠的肝脏样本中剩余的Vim mRNA的百分比(％)的图。**＝p<0.01
图6提供了描绘CD-1小鼠中来自流体动力学注射(HDI)模型的肝脏样本中剩余的ACACA和ACACB mRNA的百分比(％)的图。在皮下给药3mg/kg的与GalNAc缀合并配制在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的ACAC寡核苷酸后三(3)天，经由HDI将编码人ACACA和ACACBmRNA的质粒注射到小鼠中，并且在1天后在来自小鼠的肝样本中测量人ACACA和ACACBmRNA相对于用PBS处理的小鼠的百分比(％)。
图7A-7B提供了描绘在来自CD-1小鼠中的流体动力学注射(HDI)模型的肝脏样本中剩余的ACACA(图7A)和ACACB((图7B)mRNA的百分比(％)的图。在皮下给药0.3、1或3mg/kg的与GalNAc缀合并配制在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的ACAC寡核苷酸后三(3)天，经由HDI将编码人ACACA和ACACB mRNA的质粒注射到小鼠中，并且在1天后测量相对于用PBS处理的小鼠，在来自小鼠的肝脏样本中人ACACA和ACACBmRNA的百分比(％)。
图8A-8D提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的NHP，在来自用指示的GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸处理的非人灵长类动物(NHP)的肝脏样本中剩余的猴ACACA(图8A和8C)和ACACB(图8B和8D)mRNA的百分比(％)的图。
图9提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的NHP，在来自用指示的GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸处理的NHP的肝脏样本中如通过蛋白质印迹测量的ACC1/2(总ACC)蛋白的百分比(％)的图。
图10提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自用所指示的GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中的内源性小鼠DGAT2 mRNA敲低的百分比(％)的图。
图11提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自用不同剂量(0.3、1和3mg/kg)的所指示的GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中的内源性小鼠DGAT2 mRNA敲低的百分比(％)的图。
图12提供了描绘在CD-1小鼠中来自流体动力学注射(HDI)模型的肝脏样本中的DGAT2 mRNA敲低的百分比(％)的图。在皮下给药3mg/kg的与GalNAc缀合并配制在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的DGAT2寡核苷酸后三(3)天，经由HDI将编码人DGAT2mRNA的质粒注射到小鼠中，并且在1天后测量相对于用PBS处理的小鼠，在来自小鼠的肝脏样本中人DGAT2mRNA的百分比(％)。
图13提供了描绘在CD-1小鼠中来自流体动力学注射(HDI)模型的肝脏样本中的DGAT2 mRNA敲低的百分比(％)的图。在皮下给药0.3、1或3mg/kg的与GalNAc缀合并配制在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的DGAT2寡核苷酸后三(3)天，经由HDI将编码人DGAT2mRNA的质粒注射到小鼠中，并且在1天后测量相对于用PBS处理的小鼠，在来自小鼠的肝脏样本中人DGAT2mRNA的百分比(％)。
图14A-14G提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水处理的NHP，在来自用所指示的GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸处理的非人灵长类动物(NHP)的肝脏样本中DGAT2 mRNA敲低的百分比(％)的图。
图15A提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自进食GAN-NASH饮食并用GalNAc缀合的ACAC(GalXC-ACAC-4458)和/或DGAT2(GalXC-ACAC-1463)寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中的内源性小鼠DGAT2 mRNA敲低的百分比(％)的图。
图15B提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自进食GAN-NASH饮食并用所指示的GalNAc缀合的ACAC和/或DGAT2寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中的内源性小鼠DGAT1 mRNA敲低的百分比(％)的图。
图16A-16B提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自进食GAN-NASH饮食并用GalNAc缀合的ACAC(GalXC-ACAC-4458)和/或DGAT2(GalXC-ACAC-1463)寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中的内源性小鼠ACACA(图16A)和ACACB(图16B)mRNA敲低的百分比(％)的图。
图17提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自进食GAN-NASH饮食并用GalNAc缀合的ACAC(GalXC-ACAC-4458)和/或DGAT2(GalXC-ACAC-1463)寡核苷酸处理的小鼠的样本中的血清胆固醇水平的图。
图18提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自进食GAN-NASH饮食并用GalNAc缀合的ACAC(GalXC-ACAC-4458)和/或DGAT2(GalXC-ACAC-1463)寡核苷酸处理的小鼠的样本中的血清ALT水平的图。
图19A-19B提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自进食GAN-NASH饮食并用GalNAc缀合的ACAC(GalXC-ACAC-4458)和/或DGAT2(GalXC-ACAC-1463)寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中的如通过脂质面积％测量的肝脂肪变性的水平的图(图19A)和图像(图19B)。
图20提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自进食GAN-NASH饮食并且用GalNAc缀合的ACAC(GalXC-ACAC-4458)和/或DGAT2(GalXC-ACAC-1463)寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中Srebp1mRNA的百分比(％)的图。
图21A-21B提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自进食GAN-NASH饮食并用所指示的GalNAc缀合的ACAC(GalXC-ACAC-4458)和/或DGAT2(GalXC-ACAC-1463)寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中的如通过F4/80染色测量的巨噬细胞浸润水平的图(图21A)和图像(图21B)。
图22A-22B提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自进食GAN-NASH饮食并用GalNAc缀合的ACAC(GalXC-ACAC-4458)和/或DGAT2(GalXC-ACAC-1463)寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中的如通过鉴定冠状样结构(CLS)的测定所测量的巨噬细胞发病机制的水平的图(图22A)和图像(图22B)。
图23提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自进食GAN-NASH饮食并用GalNAc缀合的ACAC(GalXC-ACAC-4458)和/或DGAT2(GalXC-ACAC-1463)寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中的IL6mRNA的百分比(％)的图。
图24提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自进食GAN-NASH饮食并用GalNAc缀合的ACAC(GalXC-ACAC-4458)和/或DGAT2(GalXC-ACAC-1463)寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中的IL12b mRNA的百分比(％)的图。
图25提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自进食GAN-NASH饮食并用GalNAc缀合的ACAC(GalXC-ACAC-4458)和/或DGAT2(GalXC-ACAC-1463)寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中的Col1a1mRNA的百分比(％)的图。
图26提供了描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，在来自进食GAN-NASH饮食并用GalNAc缀合的ACAC(GalXC-ACAC-4458)和/或DGAT2(GalXC-ACAC-1463)寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中的Timp1mRNA的百分比(％)的图。
具体实施方式
I.定义
如本文所用，如应用于一个或多个感兴趣值的“大约”或“约”是指类似于所述参考值的值。在某些实施例中，“约”是指在所陈述的参考值的任一方向上(大于或小于所陈述的参考值)落入25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的值的范围，除非另有说明或以其他方式从上下文中明显的(除非这种数字将超过可能值的100％)。
如本文所用，“施用(administer)”、“施用(administering)”、“施用(administration)”等是指以药理学上有用的方式(例如，以治疗受试者的病状)向受试者提供物质(例如，寡核苷酸)。
如本文所用，术语“ACC”或“ACAC”是指乙酰基辅酶A羧基酶(乙酰基-CoA)，一种生物素依赖性酶，通过其两种催化活性，生物素羧化酶和羧化转移酶，催化乙酰基-CoA的不可逆羧化以产生丙二酰基CoA。如本申请中使用的术语ACC是指ACC蛋白的两种同种型；ACC1和ACC2。“ACC”也可以指分别编码该蛋白的两种基因ACACA和ACACB。ACC的抑制可以指两种ACC蛋白同种型的抑制、在转录水平上两种ACC基因的抑制、ACC酶促活性的抑制，或所有这些。
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”涵盖基于核酸的分子，其具有与全部或部分靶mRNA(例如，ACC或DGAT2)互补的序列，特别是种子序列，从而能够与mRNA形成双链体。因此，如本文所用，术语“反义寡核苷酸”可以被称为“基于互补核酸的抑制剂”。
如本文所用，“减弱(attenuate)”、“减弱(attenuating)”、“减弱(attenuation)”等是指减少或有效停止。作为非限制性实例，本文的一种或多种治疗可以减少或有效地停止受试者中血脂异常/高甘油三酯血症/高脂血症的发作或进展。这种减弱可以通过例如血脂异常/高甘油三酯血症/高脂血症的一个或多个方面(例如，症状、组织特征和细胞、炎性或免疫活性等)的降低、血脂异常/高甘油三酯血症/高脂血症的一个或多个方面没有可检测到的进展(恶化)、或受试者中血脂异常/高甘油三酯血症/高脂血症没有可检测到的方面(当它们可能是另外预期的时)来例证。
如本文所用，“组合产品”、“组合疗法”、“多疗法”等是指使用多于一种治疗剂或多于一种药剂或模态用于治疗疾病或病症的疗法。包括组合产品的治疗剂可以同时、间歇或以任何序列给药。组合产品可以包括例如两种寡核苷酸或与抗体或小分子药物组合的寡核苷酸。对于此类疗法，所使用的每种药剂的剂量可以变化以优化和/或增强患者结果。
如本文所用，“互补的”是指两个核苷酸(例如，在两个相对核酸上或在单个核酸链的相对区域上)之间的结构关系，其允许两个核苷酸彼此形成碱基对。例如，与相对核酸的嘧啶核苷酸互补的一个核酸的嘌呤核苷酸可以通过彼此形成氢键而碱基配对在一起。在一些实施例中，互补核苷酸可以以沃森-克里克方式或以允许形成稳定双链体的任何其他方式碱基配对。在一些实施例中，两个核酸可以具有彼此互补的多个核苷酸的区域，以形成互补性区域，如本文所述。
如本文所用，“DGAT2”用于指二酰基甘油O-酰基转移酶2。DGAT2是催化甘油三酯的合成中的最终反应的两种酶之一，其中二酰基甘油被共价结合至长链脂肪酰基-CoA分子。如本申请中所用，DGAT2可以指DGAT2蛋白或DGAT2基因。DGAT2的抑制可以指DGAT2蛋白的抑制、在转录水平下DGAT2基因的抑制、DGAT2活性的抑制或所有这些。
如本文所用，“脱氧核糖核苷酸”是指当与核糖核苷酸相比时，具有氢代替在其戊糖的2'位置处的羟基的核苷酸。经修饰的脱氧核糖核苷酸是在除了2'位置以外的原子上具有一个或多个修饰或取代的脱氧核糖核苷酸，包含糖、磷酸基团或碱基中或糖、磷酸基团或碱基的修饰或取代。
如本文所用，“双链RNA”或“dsRNA”是指基本上呈双链体形式的RNA寡核苷酸。在一些实施例中，在共价分离的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成dsRNA寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对。在一些实施例中，在共价连接的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成dsRNA的双链体区域的互补碱基配对。在一些实施例中，dsRNA的双链体区域的互补碱基配对由折叠(例如，经由发夹)以提供碱基配对在一起的互补反平行核苷酸序列的单个核酸链形成。在一些实施例中，dsRNA包括彼此完全双链体化的两个共价分离的核酸链。然而，在一些实施例中，dsRNA包括部分双链体化的两个共价分离的核酸链(例如，在一端或两端处具有突出端)。在一些实施例中，dsRNA包括部分互补的反平行核苷酸序列，并且因此可以具有一个或多个错配，其可以包含内部错配或末端错配。
如本文所用，“双链体”在提及核酸(例如寡核苷酸)时，是指通过两个反平行核苷酸序列的互补碱基配对形成的结构。
如本文所用，“赋形剂”是指可以包含在组合物中，例如以提供或有助于期望的一致性或稳定效应的非治疗剂。
如本文所用，“肝细胞”或“肝细胞”是指肝实质组织的细胞。这些细胞占肝质量的约70％-85％，并且制造血清白蛋白、FBN和凝血因子的凝血酶原组(除了因子3和4外)。用于肝细胞谱系细胞的标志物包含但不限于甲状腺素运载蛋白(Ttr)、谷氨酰胺合成酶(Glul)、肝细胞核因子1a(Hnf1a)和肝细胞核因子4a(Hnf4a)。用于成熟肝细胞的标志物可以包含但不限于细胞色素P450(Cyp3a11)、富马酰基乙酰乙酸水解酶(Fah)、葡萄糖6-磷酸(G6p)、白蛋白(Alb)和OC2-2F8。参见，例如，Huch等人，(2013)《自然(NATURE)》，494:247-50。
如本文所用，“肝毒性剂”是指本身对肝脏有毒性或可以被加工以形成对肝脏有毒性的代谢物的化合物、病毒或其他物质。肝毒性剂可以包括但不限于四氯化碳(CCl4)、对乙酰氨基酚(扑热息痛)、氯乙烯、二茂铁、氯仿、非类固醇抗炎药(如阿司匹林和苯丁酮)。
如本文所用，“不稳定的接头”是指可以被切割(例如，通过酸性pH)的接头。“相当稳定的接头”是指不能被切割的接头。
如本文所用，“肝脏炎症”或“肝炎”是指其中肝脏变得肿胀、功能障碍和/或疼痛的身体状况，特别是由于损伤或感染引起的，如可能由暴露于肝毒性剂引起的。症状可以包含黄疸(皮肤或眼睛的发黄)、疲劳、虚弱、恶心、呕吐、食欲减退和体重减轻。肝脏炎症如果保持未治疗，则可以进展为纤维化、肝硬化、肝衰竭或肝癌。
如本文所用，“肝纤维化(liver fibrosis)”、“肝纤维化(Liver Fibrosis)”或“肝纤维化(fibrosis of the liver)”是指胞外基质蛋白在肝中的过度积累，所述胞外基质蛋白可以包含胶原(I、III和IV)、FBN、粗纤维调节素(undulin)、弹性蛋白、层粘连蛋白、透明质烷和由炎症和肝细胞死亡引起的蛋白聚糖。肝纤维化如果保持未治疗，则可以进展为肝硬化、肝衰竭或肝癌。
如本文所用，“环”是指核酸的未配对区域(例如，寡核苷酸)，其侧翼是彼此充分互补的核酸的两个反平行区域，使得在适当的杂交条件下(例如在磷酸缓冲液中，在细胞中)，在未配对区域侧翼的两个反平行区域杂交以形成双链体(被称为“茎”)。
如本文所用，“代谢综合征”或“代谢性肝病”是指特征在于一组相关的医疗病状和相关的病理的病症，包含但不限于以下医疗病状：腹部肥胖、血压升高、空腹血糖升高、高血清甘油三酯、肝纤维化和低水平的高密度脂蛋白(HDL)水平。如本文所用，术语代谢综合征或代谢性肝病可以涵盖与代谢综合征和代谢性肝病相关联的广泛系列的直接和间接表现、疾病和病理，其中在整个文件中使用病状的扩展列表。
如本文所用，“修饰的核苷酸间键”是指当与包括磷酸二酯键的参考核苷酸间键相比时具有一种或多种化学修饰的核苷酸间键。在一些实施例中，修饰的核苷酸是非天然存在的连接。通常，修饰的核苷酸间键赋予其中存在修饰的核苷酸间键的核酸一种或多种期望的性质。例如，修饰的核苷酸可以改善热稳定性、对降解的抗性、核酸酶抗性、溶解性、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所用，“修饰的核苷酸”是指当与相应的参考核苷酸相比时具有一种或多种化学修饰的核苷酸，所述参考核苷酸选自：腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸。在一些实施例中，修饰的核苷酸在其糖、核碱基和/或磷酸基团中具有一种或多种化学修饰。在一些实施例中，修饰的核苷酸具有与相应的参考核苷酸缀合的一个或多个化学部分。通常，修饰的核苷酸赋予其中存在修饰的核苷酸的核酸一种或多种期望的性质。例如，修饰的核苷酸可以改善热稳定性、对降解的抗性、核酸酶抗性、溶解性、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所用，“带缺口的四环结构”是指以单独的有义(乘客)和反义(引导)链为特征的RNAi寡核苷酸的结构，其中有义链具有与反义链的互补性区域，并且其中至少一条链，通常是有义链，具有四环，其被配置为稳定在至少一条链内形成的相邻茎区域。
如本文所用，“寡核苷酸”是指短的核酸(例如，长度小于约100个核苷酸)。寡核苷酸可以是单链的(ss)或双链的。寡核苷酸可以具有双链体区域或可以不具有双链体区域。作为一组非限制性实例，寡核苷酸可以是但不限于小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、干扰RNA的二聚体底物(dsiRNA)、反义寡核苷酸、短siRNA或ss siRNA。在一些实施例中，双链(dsRNA)是RNAi寡核苷酸。
如本文所用，“突出端”是指由延伸超过互补链的末端的一条链或区域产生的末端非碱基配对核苷酸，所述一条链或区域与所述互补链形成双链体。在一些实施例中，突出端包括一个或多个从dsRNA的5'末端或3'末端的双链体区域延伸的未配对的核苷酸。在某些实施例中，突出端是dsRNA的反义链或有义链上的3'或5'突出端。
如本文所用，“磷酸酯类似物”是指模仿磷酸基团的静电和/或空间性质的化学部分。在一些实施例中，磷酸酯类似物位于寡核苷酸的5'末端核苷酸处，代替通常易受酶促去除的5'-磷酸盐。在一些实施例中，5'磷酸酯类似物含有磷酸酶抗性键。磷酸酯类似物的实例包含但不限于5'膦酸酯，例如5'亚甲基膦酸酯(5'-MP)和5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'-VP)。在一些实施例中，寡核苷酸在5'末端核苷酸处的糖的4'-碳位置处具有磷酸酯类似物(被称为“4'-磷酸酯类似物”)。4'-磷酸酯类似物的实例是氧基甲基膦酸酯，其中氧基甲基的氧原子与糖部分(例如在其4'-碳处)或其类似物结合。参见，例如，美国临时专利申请号62/383,207(于2016年9月2日提交)和62/393,401(于2016年9月12日提交)。已经针对寡核苷酸的5'端开发了其他修饰(参见，例如，国际专利申请号WO 2011/133871；美国专利第8,927,513号；和Prakash等人，(2015)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》，43:2993-3011)。
如本文所用，基因(例如，ACC和/或DGAT2)的“降低的表达”是指当与适当的参考(例如，参考细胞、细胞的群体、样本或受试者)相比时，由基因编码的RNA转录物(例如，ACC和/或DGAT2 mRNA)或蛋白质的量或水平的降低，和/或细胞、细胞的群体、样本或受试者中基因活性的量或水平的降低。例如，当与未用dsRNA处理的细胞相比时，使细胞与本文的寡核苷酸(例如，包括具有与包括ACC和/或DGAT2 mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列的反义链的寡核苷酸)接触的行为可以导致ACC和/或DGAT2mRNA、蛋白和/或活性的量或水平的降低(例如，经由通过RNAi途径使ACC和/或DGAT2 mRNA降解)。类似地，并且如本文所用，“减少表达”是指导致基因(例如，ACC和/或DGAT2)的表达减少的行为。如本文所用，“ACC和/或DGAT2表达的减少”是指当与适当的参考(例如，参考细胞、细胞的群体、样本或受试者)相比时，细胞、细胞的群体、样本或受试者中ACC和/或DGAT2 mRNA、ACC和/或DGAT2蛋白和/或ACC和/或DGAT2活性的量或水平降低。
如本文所用，“互补性区域”是指核酸(例如dsRNA)的核苷酸的序列，其与反平行的核苷酸序列充分互补，以允许两个核苷酸序列在适当的杂交条件下(例如在磷酸盐缓冲液中、在细胞中等)杂交。在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括靶向序列，所述靶向序列具有与mRNA靶序列(例如，ACC或DGAT2)互补的区域。
如本文所用，“核糖核苷酸”是指具有核糖作为其戊糖的核苷酸，其在其2'位置处含有羟基。修饰的核糖核苷酸是在除了2'位置以外的原子上具有一个或多个修饰或取代的核糖核苷酸，包含核糖、磷酸基团或碱基中或核糖、磷酸基团或碱基的修饰或取代。
如本文所用，“RNAi寡核苷酸”是指(a)具有有义链(乘客)和反义链(引导)的dsRNA，其中反义链或反义链的一部分被Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶用于切割靶mRNA，或(b)具有单个反义链的单链寡核苷酸，其中反义链(或反义链的一部分)被Ago2核酸内切酶用于切割靶mRNA。
如本文所用，“链”是指通过核苷酸间键(例如，磷酸二酯键或硫代磷酸酯键)连接在一起的单个连续的核苷酸序列。在一些实施例中，链具有两个自由端(例如，5'端和3'端)。
如本文所用，“受试者”意指任何哺乳动物，包含小鼠、兔和人类。在一个实施例中，受试者是人类或NHP。此外，“个体”或“患者”可以与“受试者”互换使用。
如本文所用，“合成的”是指人工合成(例如，使用机器(例如，固态核酸合成器))的核酸或其他分子，或以其他方式不是来源于正常产生该分子的天然来源(例如，细胞或生物体)。
如本文所用，“靶向配体”是指这样的分子(例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质)，所述分子选择性地与感兴趣的组织或细胞的同源分子(例如受体)结合，并且为了将其他物质靶向感兴趣的组织或细胞的目的，可与另一物质缀合。例如，在一些实施例中，靶向配体可以结合至寡核苷酸，以用于将寡核苷酸靶向至感兴趣的特定组织或细胞的目的。在一些实施例中，靶向配体选择性地结合至细胞表面受体。因此，在一些实施例中，当与寡核苷酸缀合时，靶向配体通过与在细胞的表面上表达的受体选择性结合和由细胞对包括寡核苷酸、靶向配体和受体的复合物的内体内化，促进寡核苷酸递送到特定细胞中。在一些实施例中，靶向配体经由接头与寡核苷酸缀合，所述接头在细胞内化之后或期间被切割，使得寡核苷酸在细胞中从靶向配体释放。
如本文所用，“四环”是指增加通过核苷酸的侧翼序列的杂交形成的相邻双链体的稳定性的环。稳定性的增加可检测为相邻茎双链体的解链温度(Tm)的增加，其平均高于由随机选择的核苷酸序列组成的一组相当长度的环预期的相邻茎双链体的Tm。例如，在10mM的NaHPO4中，四环可以赋予包括至少2个碱基对(bp)长度的双链体的发夹至少约50℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约58℃、至少约60℃、至少约65℃或至少约75℃的Tm。在一些实施例中，四环可以通过堆叠相互作用来稳定相邻茎双链体中的bp。另外，四环中的核苷酸之间的相互作用包含但不限于非Watson-Crick碱基配对、堆叠相互作用、氢键合和接触相互作用(Cheong等人(1990)《自然(Nature)》346:680-82；Heus&Pardi(1991)《科学(SCIENCE)》，253:191-94)。在一些实施例中，四环包括3至6个核苷酸或由3至6个核苷酸组成，并且通常是4至5个核苷酸。在某些实施例中，四环包括3个、4个、5个或6个核苷酸或由3个、4个、5个或6个核苷酸组成，所述核苷酸可以被修饰或可以不被修饰(例如，其可以与靶向部分缀合或可以不与靶向部分缀合)。在一个实施例中，四环由4个核苷酸组成。任何核苷酸均可以用于四环中，并且用于此类核苷酸的标准IUPAC-IUB符号可以如Cornish-Bowden(1985)，《核酸研究》，13:3021-30中所述使用。例如，字母“N”可以用来意指任何碱基可以处于该位置，字母“R”可以用来显示A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)可以处于该位置，并且“B”可以用来显示C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)或T(胸腺嘧啶)可以处于该位置。四环的实例包含四环的UNCG家族(例如，UUCG)、四环的GNRA家族(例如，GAAA)和CUUG四环(Woese等人，(1990)《美国国家科学院院刊(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)》，87:8467-8471；Antao等人，(1991)《核酸研究》，19:5901-5905)。DNA四环的实例包含四环的d(GNNA)家族(例如，d(GTTA)、四环的d(GNRA)家族、四环的d(GNAB)家族、四环的d(CNNG)家族和四环的d(TNCG)家族(例如，d(TTCG))。参见，例如，Nakano等人，(2002)《生物化学(BIOCHEM.)》，41:4281-14292；Shinji等人，(2000)NIPPONKAGAKKAI KOEN YOKOSHU 78:731。在一些实施例中，四环被包含在带缺口的四环结构内。
如本文所用，“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指通过例如向受试者施用治疗剂(例如，本文的寡核苷酸)来向有此需要的受试者提供护理的行为，目的是相对于现有病状(例如，疾病、病症)改善受试者的健康和/或福祉，或预防或降低病状的发生的可能性。在一些实施例中，治疗涉及降低受试者经历的病状(例如，疾病、病症)的至少一个体征、症状或促成因素的频率或严重程度。
II.ACC和/或DGAT2表达的寡核苷酸抑制剂
本公开尤其提供了抑制ACC和/或DGAT2表达的寡核苷酸。在一些实施例中，本文中抑制ACC和/或DGAT2表达的寡核苷酸靶向ACC和/或DGAT2mRNA。在一些实施例中，寡核苷酸减少ACC和/或DGAT2表达。
乙酰基CoA羧化酶(ACC)是一种生物素依赖性酶，其催化乙酰基-CoA的不可逆羧化，以通过其两种催化活性即生物素羧化酶(BC)和羧基转移酶(CT)产生丙二酰基-CoA。ACC作为生物素羧基载体蛋白执行第三功能。通过ACC的催化活性产生的丙二酰基-CoA充当脂肪酸的生物合成的底物。ACC在从脂肪酸合成到脂肪酸氧化的转变过程中充当关键的开关调节剂。(Esler&Bense，CELL MOL GASTROENTEROL HEPALLE，(2019)8(2):247–67)。脂肪酸合成的调节在人类脂肪酸的能量代谢中起着重要的作用。出于这个原因，脂肪酸合成的调节剂如ACC被认为是调节与代谢综合征相关联的人类疾病(包含肥胖、糖尿病和心血管并发症)的有吸引力的靶标(Wakil&Abu-Elheiga,(2009)《脂质研究杂志(J LIPID RES.)》，50:S138–S143)。已经进行了一些尝试以在转录水平或通过小分子调节剂调节ACC的活性，以用于多种适应症，从癌症到糖尿病并且甚至作为农业除草剂(Lou等人，(2012)《抗癌药物发现的最新专利(RECENT PAT ANTICANCE DRUG DISCOV.)》，7(2):168-84)。迄今为止，这种努力尚未产生能够对患者进行长期改善的可行治疗剂。根据本公开的RNAi使用提供了不同的方法和寡核苷酸配置的模式以辅助这种努力。
从基因组角度来看，人类基因组含有用于两种不同ACC蛋白的基因；ACACA和ACACB，其分别与两个主要蛋白质同种型ACC1和ACC2相关联。由于基因和蛋白质命名法与该靶标的不一致，导致现有技术中的不一致用法和标记，因此本申请将该靶标统称为ACC。术语ACC将包含基因及其mRNA产物(ACACA和ACACB)以及其相应的蛋白质产物(ACC1和ACC2)。有时，当mRNA或蛋白质同种型之间的差异被突出显示时，本申请将具体指每种同种型。
由于ACC作为脂质代谢途径的调节剂的作用，抑制ACC有希望作为用于治疗代谢综合征和相关病症的治疗剂。尽管几十年来ACC作为鉴定的靶标，对广泛适应症的治疗发展具有吸引力，但ACC仍然很难有意义地监管。使用ACC的小分子抑制剂(ACC1/ACC2)在人体内进行的研究显示，在施用于患有NAFLD的受试者持续一个月后，脂肪生成减少，酮增加并且肝甘油三酯减少(Horton等人，(2017)《细胞转移(CELL METAB.)》，26(2):394-406)。然而，这些相同的患者还经历了血清甘油三酯水平的200％增加。
二酰基甘油O-酰基转移酶2(DGAT2)是催化甘油三酸酯的合成中的最终反应的两种酶之一，其中二酰基甘油与长链脂肪酰基-CoA分子共价结合。增加的血清甘油三酯是代谢综合征的标志，并且在转录水平或通过其他手段调节血清甘油三酯水平是控制病症的相关表现的关键。此外，使用进食导致模拟非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的表型的饮食的小鼠的研究表明，在肝组织中DGAT2的特异性敲低可以导致在这些动物中较低水平的肝脂肪变性的减少，而不增加炎症或纤维化(Walther等人，《肝脏病学(HEPATOLOGY)》，(2019)70(6):1972-85)。然而，与脂肪酸代谢中涉及的一些其他基因靶标相比，DGAT2与更窄范围的功能和可能的活性相关联。还存在另一种酶DGAT1，其与DGAT2共享冗余的和重叠的功能(Chitraju等人，(2019)，《脂质研究杂志》，60(6):1112–20)。然而，先前在该领域中的那些人在发现小分子化合物方面具有有限的成功，该小分子化合物可以可靠地降低这种合成，而对参与脂肪酸代谢的其他相关基因没有广泛的影响。
因此，本公开提供了单独或组合地靶向ACC和DGAT的RNAi治疗剂。
i.ACC和/或DGAT2靶序列
在一些实施例中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)靶向包括ACC和/或DGAT2mRNA的靶序列。在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸对应于ACC和/或DGAT2 mRNA序列内的靶序列。在一些实施例中，寡核苷酸或其部分、片段或链(例如，dsRNA的反义链或引导链)结合或退火至包括ACC和/或DGAT2 mRNA的靶序列，从而抑制ACC和/或DGAT2表达。
在一些实施例中，为了在体内抑制ACC和/或DGAT2表达的目的，寡核苷酸靶向ACC和/或DGAT2靶序列。在一些实施例中，通过靶向ACC和/或DGAT2靶序列的寡核苷酸抑制ACC和/或DGAT2表达的量或程度与寡核苷酸的效力相关。在一些实施例中，通过靶向ACC和/或DGAT2靶序列的寡核苷酸抑制ACC和/或DGAT2表达的量或程度与患有与用寡核苷酸治疗的ACC和/或DGAT2的表达相关联的疾病、病症或病状的受试者或患者中的治疗益处的量或程度相关。
通过检查编码ACC和/或DGAT2的mRNA的核苷酸序列，包含多种不同物种(例如，人、食蟹猴、小鼠和大鼠；参见，例如实例1)的mRNA，并且作为体外和体内试验的结果(参见，例如实例2、实例3和实例4-10)，已经发现ACC和/或DGAT2 mRNA的某些核苷酸序列比其他序列更容易受到基于寡核苷酸的抑制，并且因此可用作本文中的寡核苷酸的靶序列。在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸(例如，dsRNA)的有义链包括ACC和/或DGAT2靶序列。在一些实施例中，本文所述的dsRNA的有义链的一部分或区域包括ACC和/或DGAT2靶序列。在一些实施例中，ACC和/或DGAT2靶序列包括SEQ ID No:149、150、151、152、153、154、155、156、157和158中的任一者的序列或由其组成。在一些实施例中，ACC靶序列包括SEQ ID NO:150、151、152、153、154和155中的任一者的序列或由其组成。在一些实施例中，ACC靶序列包括SEQ IDNO:150和151中的任一者的序列或由其组成。在一些实施例中，DGAT2靶序列包括SEQ IDNO:149、156、157和158中的任一者的序列或由其组成。在一些实施例中，DGAT2靶序列包括SEQ ID NO:156和157中的任一者的序列或由其组成。
ii.ACC和/或DGAT2靶向序列
在一些实施例中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)具有与ACC和/或DGAT2mRNA互补的区域(例如，在ACC和/或DGAT2 mRNA的靶序列内)，以用于靶向细胞中的mRNA并抑制其表达的目的。在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括ACC和/或DGAT2靶向序列(例如，dsRNA的反义链或引导链)，其具有通过互补(Watson-Crick)碱基配对与ACC和/或DGAT2靶序列结合或退火的互补性区域。靶向序列或互补性区域通常具有合适的长度和碱基含量，以实现寡核苷酸(或其链)与ACC和/或DGAT2 mRNA的结合或退火，以用于抑制其表达的目的。在一些实施例中，靶向序列或互补性区域长度为至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约28、至少约29或至少约30个核苷酸。在一些实施例中，靶向序列或互补性区域长度为约12至约30个(例如，12至30个、12至22个、15至25个、17至21个、18至27个、19至27个或15至30个)核苷酸。在一些实施例中，靶向序列或互补性区域长度为约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施例中，靶向序列或互补性区域长度为18个核苷酸。在一些实施例中，靶向序列或互补性区域长度为19个核苷酸。在一些实施例中，靶向序列或互补性区域长度为20个核苷酸。在一些实施例中，靶向序列或互补性区域长度为21个核苷酸。在一些实施例中，靶向序列或互补性区域长度为22个核苷酸。在一些实施例中，靶向序列或互补性区域长度为23个核苷酸。在一些实施例中，靶向序列或互补性区域长度为24个核苷酸。
在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括与ACC和/或DGAT2靶序列完全互补的靶向序列或互补性区域(例如，双链寡核苷酸的反义链或引导链)。在一些实施例中，靶向序列或互补性区域与ACC和/或DGAT2靶序列部分互补。在一些实施例中，寡核苷酸包括与ACC或DGAT2的序列完全互补的靶向序列或互补性区域。
在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83中的任一者的序列互补的靶向序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为18个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83中的任一者的序列互补的靶向序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为19个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83中的任一者的序列互补的靶向序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为20个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与选自SEQ IDNO:29、31和43的序列互补的靶向序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为18个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与选自SEQ ID NO:29、31和43的序列互补的靶向序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为19个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与选自SEQ ID NO:29、31和43的序列互补的靶向序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为20个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:150和151中的任一者的序列互补的靶序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为21个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:150和151中的任一者的序列互补的靶序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为22个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:150和151中的任一者的序列互补的靶序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为23个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:150和151中的任一者的序列互补的靶序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为24个核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147中的任一者的序列互补的靶向序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为18个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQID NO:117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147中的任一者的序列互补的靶序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为19个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147中的任一者的序列互补的靶序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为20个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与选自SEQ ID No:117、119、125、129、137和143的序列互补的靶向序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为18个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与选自SEQ ID No:117、119、125、129、137和143的序列互补的靶向序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为19个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与选自SEQ ID No:117、119、125、129、137和143的序列互补的靶向序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为20个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:156和157中任一者的序列互补的靶序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为21个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQID NO:156和157中任一者的序列互补的靶序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为22个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:156和157中任一者的序列互补的靶序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为23个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:156和157中任一者的序列互补的靶序列或互补性区域，并且靶向序列或互补性区域长度为24个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与ACC或DGAT2的序列部分互补的靶向序列或互补性区域。
在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83中任一者的序列完全互补的靶向序列或互补性区域。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:29、31和43中所示的序列完全互补的靶向序列或互补性区域。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQID NO:117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147中任一者的序列部分互补的靶向序列或互补性区域。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:117、119、125、129、137和143中所示的序列部分互补的靶向序列或互补性区域。
在一些实施例中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括与包括ACC和/或DGAT2 mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域，其中所述连续核苷酸序列长度为约12至约30个核苷酸(例如，长度12至30、12至28、12至26、12至24、12至20、12至18、12至16、14至22、16至20、18至20或18至19个核苷酸)。在一些实施例中，寡核苷酸包括与包括ACC和/或DGAT2 mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域，其中所述连续核苷酸序列长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与包括ACC和/或DGAT2 mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域，其中所述连续核苷酸序列长度为19个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与包括ACC和/或DGAT2 mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域，其中所述连续核苷酸序列长度为20个核苷酸。
在一些实施例中，与ACC或DGAT2靶序列的连续核苷酸互补的寡核苷酸的靶向序列或互补性区域跨越反义链的整个长度。在一些实施例中，与ACC或DGAT2靶序列的连续核苷酸互补的寡核苷酸的互补性区域跨越反义链的整个长度的一部分。在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括与跨越ACC或DGAT2的靶序列的核苷酸1-20的连续的核苷酸段至少部分(例如，完全)互补的互补性区域(例如，在dsRNA的反义链上)。
在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括与对应的ACC和/或DGAT2靶序列具有一个或多个碱基对(bp)错配的靶向序列或互补性区域。在一些实施例中，靶向序列或互补性区域可以与相应的ACC和/或DGAT2靶序列具有高达约1个、高达约2个、高达约3个、高达约4个、高达约5个等错配，条件是靶向序列或互补性区域在适当的杂交条件下结合或退火到ACC和/或DGAT2 mRNA的能力和/或寡核苷酸抑制ACC和/或DGAT2表达的能力被维持。可替代地，靶向序列或互补性区域与相应的ACC和/或DGAT2靶序列可以具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配，条件是靶向序列或互补性区域在适当的杂交条件下结合或退火到ACC和/或DGAT2 mRNA的能力和/或寡核苷酸抑制ACC和/或DGAT2表达的能力被维持。在一些实施例中，寡核苷酸包括与相应的靶序列具有1个错配的靶向序列或互补性区域。在一些实施例中，寡核苷酸包括与相应的靶序列具有2个错配的靶向序列或互补性区域。在一些实施例中，寡核苷酸包括与相应的靶序列具有3个错配的靶向序列或互补性区域。在一些实施例中，寡核苷酸包括与相应的靶序列具有4个错配的靶向序列或互补性区域。在一些实施例中，寡核苷酸包括与相应的靶序列具有5个错配的靶向序列或互补性区域。在一些实施例中，寡核苷酸包括与对应的靶序列的多于一个错配(例如，2、3、4、5个或更多个错配)的靶向序列或互补性区域，其中至少2个(例如，全部)错配被连续定位(例如，一行中的2、3、4、5个或更多个错配)或者其中错配散布在整个靶向序列或互补性区域中。在一些实施例中，寡核苷酸包括与对应的靶序列具有多于一个错配(例如，2、3、4、5个或更多个错配)的靶向序列或互补性区域，其中至少2个(例如，全部)错配被连续定位(例如，一行中的2、3、4、5个或更多个错配)、或者其中至少一个或多个非错配的碱基对位于错配之间，或其组合。
在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域，其中所述靶向序列或互补性区域可以与相应的ACC靶序列具有高达约1个、高达约2个、高达约3个、高达约4个、高达约5个等错配。在一些实施例中，所述寡核苷酸包括与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域，其中靶向序列或互补性区域可以与相应的ACC靶序列具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:29、31、43中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域，其中靶向序列或互补性区域可以与相应的ACC靶序列具有高达约1个、高达约2个、高达约3个、高达约4个、高达约5个等错配。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:29、31、43中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域，其中靶向序列或互补性区域可以与相应的ACC靶序列具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配。
在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域，其中靶向序列或互补性区域可以与相应的DGAT2靶序列具有高达约1个、高达约2个、高达约3个、高达约4个、高达约5个等错配。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ IDNO:117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域，其中靶向序列或互补性区域可以与相应的DGAT2靶序列具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:117、119、125、129、137和143中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域，其中靶向序列或互补性区域可以与相应的DGAT2靶序列具有高达约1个、高达约2个、高达约3个、高达约4个、高达约5个等错配。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:117、119、125、129、137和143中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域，其中靶向序列或互补性区域可以与相应的DGAT2靶序列具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配。
iii.寡核苷酸的类型
多种寡核苷酸类型和/或结构可用于靶向本文方法中的ACC和/或DGAT2，包含但不限于RNAi寡核苷酸、反义寡核苷酸、miRNA等。本文或别处所述的寡核苷酸类型中的任何一种被考虑用作本文并入ACC和/或DGAT2靶向序列的框架。
在一些实施例中，本文的寡核苷酸通过与Dicer参与的上游或下游的RNA干扰(RNAi)途径接合来抑制ACC和/或DGAT2表达。例如，已经开发了RNAi寡核苷酸，其中每条链具有约19-25个核苷酸的大小，具有1-5个核苷酸的至少一个3′突出端(参见，例如，美国专利第8,372,968号)。还开发了更长的寡核苷酸，所述寡核苷酸由Dicer加工以产生活性RNAi产物(参见，例如，美国专利第8,883,996号)。进一步的工作产生延伸的dsRNA，其中至少一条链的至少一端延伸超出双链体靶向区域，包含其中链中的一个包含热力学稳定化四环结构的结构(参见，例如美国专利第8,513,207号和第8,927,705号，以及国际专利申请公开号WO 2010/033225)。此类结构可以包含单链延伸部(在分子的一侧或两侧上)以及双链延伸部。
在一些实施例中，本文的寡核苷酸与Dicer参与(例如Dicer切割)下游的RNAi途径接合。在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸是Dicer底物。在一些实施例中，寡核苷酸在有义链的3'端中具有突出端(例如，长度为1、2或3个核苷酸)。在一些实施例中，寡核苷酸(例如，siRNA)包括与靶RNA反义的21-核苷酸引导链和互补的乘客链，其中两条链退火以形成19bp双链体，和在任一或两个3'端处的2个核苷酸突出端。较长的寡核苷酸设计也是可用的，包含具有23个核苷酸的引导链和21个核苷酸的乘客链的寡核苷酸，其中在分子的右侧存在钝端(乘客链的3'端/引导链的5'端)和在分子的左侧存在两个核苷酸的3'-引导链突出端(乘客链的5'端/引导链的3'端)。在此类分子中，存在21bp双链体区域。参见，例如，美国专利号9,012,138、9,012,621和9,193,753。
在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括长度都在约17至26个(例如，17至26个、20至25个或21-23个)核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸包括长度19-30个核苷酸的反义链和长度19-50个核苷酸的有义链，其中反义链和有义链是分开的链，它们形成不对称的双链体区域，该双链体区域在反义链的3'末端处具有1-4个核苷酸的突出端。在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括长度都在约19-22个核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施例中，有义链和反义链具有相等长度。在一些实施例中，寡核苷酸包括有义链和反义链，使得在有义链或反义链上或在有义链和反义链两者上存在3'突出端。在一些实施例中，对于具有长度都在约21-23个核苷酸范围内的有义和反义链的寡核苷酸，有义链、反义链或有义链和反义链两者上的3'突出端长度为1或2个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸具有22个核苷酸的引导链和20个核苷酸的乘客链，其中在分子的右侧上存在钝端(乘客链的3'端/引导链的5'端)，并且在分子的左侧存在2个核苷酸的3'-引导链突出端(乘客链的5'端/引导链的3'端)。在此类分子中，存在20bp双链体区域。
用于本文的组合物和方法的其他寡核苷酸设计包含：16-聚体siRNAs(参见，例如，《化学和生物学中的核酸(NUCLEIC ACIDS IN CHEMISTRY AND BIOLOGY.)》，Blackburn(编辑)，皇家化学学会(Royal Society of Chemistry)，2006)、shRNAs(例如，具有19bp或更短的茎；参见，例如，Moore等人(2010)，Methods Mol.Biol.629:141-158)、钝性siRNAs(例如，长度为19bps；参见，例如，Kraynack&Baker(2006)RNA 12:163-176)、不对称SiRNA(aiRNA；参见，例如，Sun等人(2008)，《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》，26:1379-1382)、不对称短双链体siRNA(参见，例如，Chang等人，(2009)《分子疗法(Mol.Ther.)》，17:725-32)、forksiRNAs(参见，例如，Hohjoh(2004)FEBS Lett.557:193-198)、ss siRNAs(Elsner(2012)，《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》，30:1063)、哑铃形圆形siRNAs(参见，例如，Abe等人，(2007)，《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc..)》129:15108-09)和小的内部分段的干扰RNA(siRNA；参见，例如，Bramsen等人(2007)，《核酸研究》，35:5886-97)。可以在一些实施例中用于降低或抑制ACC和/或DGAT2的表达的寡核苷酸结构的其他非限制性实例是微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和短siRNA(参见，例如，Hamilton等人，(2002)《EMBO杂志(EMBOJ.)》，21:4671-79；也参见美国专利申请公开号2009/0099115)。
仍然，在一些实施例中，用于减少或抑制本文的ACC和/或DGAT2表达的寡核苷酸是单链的。此类结构可以包含但不限于ss RNAi分子。最近的努力已经证明了ss RNAi分子的活性(参见，例如，Matsui等人，(2016)《分子疗法》，24:946-55)。然而，在一些实施例中，本文的寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)。反义寡核苷酸是具有核碱基序列的单链寡核苷酸，当以5'至3'方向写入时，所述核碱基序列包括特定核酸的靶向区段的反向互补序列，并且被适当地修饰(例如，作为间隔聚体)以便诱导RNA酶H介导的其靶RNA在细胞中的切割或者(例如，作为混合聚体)以便抑制细胞中靶mRNA的翻译。用于本文的ASO可以以本领域已知的任何合适的方式进行修饰，包含例如如在美国专利第9,567,587号中所示的(包含，例如，长度、核碱基的糖部分(嘧啶、嘌呤)，以及核碱基的杂环部分的改变)。此外，几十年来，ASO一直被用于减少特定靶基因的表达(参见，例如，Bennett等人(2017)，《药理学年度评论(Annu.Rev.Pharmacol.)》，57:81-105)。
在一些实施例中，反义寡核苷酸与ACC和/或DGAT2mRNA共享互补性区域。在一些实施例中，反义寡核苷酸靶向鉴定为NM_001093的人ACACB基因的各个区域。在一些实施例中，反义寡核苷酸靶向鉴定为NM_198834的人ACACB基因的各个区域。在一些实施例中，反义寡核苷酸靶向鉴定为NM_001253891.1的人DGAT2基因的各个区域。在一些实施例中，反义寡核苷酸靶向鉴定为NM_032564.5的人DGAT2基因的各个区域。在一些实施例中，反义寡核苷酸的长度为15-50个核苷酸。在一些实施例中，反义寡核苷酸的长度为15-25个核苷酸。在一些实施例中，反义寡核苷酸的长度为22个核苷酸。在一些实施例中，反义寡核苷酸与SEQ IDNO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83中的任一者互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸与SEQ ID NO:29、31和43中的任一者互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸与SEQ ID NO:117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147中的任一者互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸与SEQ ID NO:117、119、125、129、137和143中的任一者互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸的长度为至少15个连续核苷酸。在一些实施例中，反义寡核苷酸的长度为至少19个连续核苷酸。在一些实施例中，反义寡核苷酸的长度为至少20个连续核苷酸。在一些实施例中，反义寡核苷酸与靶序列相差1、2或3个核苷酸。
iv.双链寡核苷酸
本公开提供了用于靶向ACC和/或DGAT2以及抑制ACC和/或DGAT2表达(例如，经由RNAi途径)的dsRNA，其包括有义链(在本文中也被称为乘客链)和反义链(在本文中也被称为引导链)。在一些实施例中，有义链和反义链是分开的链并且不是共价连接的。在一些实施例中，有义链和反义链是共价连接的。在一些实施例中，有义链和反义链形成双链体区域，其中有义链和反义链或其一部分以互补方式(例如，通过Watson-Crick碱基配对)彼此结合。
在一些实施例中，有义链具有第一区域(R1)和第二区域(R2)，其中R2包括第一子区域(S1)、四环或三环(L)和第二子区域(S2)，其中L位于S1和S2之间，并且其中S1和S2形成第二双链体(D2)。D2可以具有各种长度。在一些实施例中，D2的长度为约1-6bp。在一些实施例中，D2的长度为2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5或4-5bp。在一些实施例中，D2的长度为1、2、3、4、5或6bp。在一些实施例中，D2的长度为6bp。
在一些实施例中，有义链和反义链的R1形成第一双链体(D1)。在一些实施例中，D1的长度为至少约15个(例如，至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个)核苷酸。在一些实施例中，D1的长度在约12至30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、15至22、18至22、18至25、18至27、18至30或21至30个核苷酸)。在一些实施例中，D1的长度为至少12个核苷酸(例如长度为至少12个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸)。在一些实施例中，D1的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施例中，D1的长度为20个核苷酸。在一些实施例中，包括有义链和反义链的D1不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施例中，包括有义链和反义链的D1跨越有义链或反义链或两者的整个长度。在某些实施例中，包括有义链和反义链的D1跨越有义链和反义链两者的整个长度。
在一些实施例中，本文的dsRNA包括有义链和反义链，所述有义链具有SEQ ID NO:1、29、31、43、55、105、107、111、125、129和137中的任一者的序列，所述反义链包括选自SEQID NO:2、30、32、44、56、106、108、11、126、130和138的互补序列，如在表1、3、4、6、8和9中布置的。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括有义链和反义链，所述有义链和反义链包括选自以下的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:25和26；
(b)分别为SEQ ID NO:27和28；
(c)分别为SEQ ID NO:29和30；
(d)分别为SEQ ID NO:31和32；
(e)分别为SEQ ID NO:33和34；
(f)分别为SEQ ID NO:35和36；
(g)分别为SEQ ID NO:37和38；
(h)分别为SEQ ID NO:39和40；
(i)分别为SEQ ID NO:41和42；
(j)分别为SEQ ID NO:43和44；
(k)分别为SEQ ID NO:45和46；
(l)分别为SEQ ID NO:47和48；
(m)分别为SEQ ID NO:49和50；
(n)分别为SEQ ID NO:51和52；
(o)分别为SEQ ID NO:53和54；
(p)分别为SEQ ID NO:55和56；
(q)分别为SEQ ID NO:57和58；
(r)分别为SEQ ID NO:59和60；
(s)分别为SEQ ID NO:61和62；
(t)分别为SEQ ID NO:63和64；
(u)分别为SEQ ID NO:65和66；
(v)分别为SEQ ID NO:67和68；
(w)分别为SEQ ID NO:69和70；
(x)分别为SEQ ID NO:71和72；
(y)分别为SEQ ID NO:73和74；
(z)分别为SEQ ID NO:75和76；
(aa)分别为SEQ ID NO:77和78；
(bb)分别为SEQ ID NO:79和80；
(cc)分别为SEQ ID NO:81和82；以及
(dd)分别为SEQ ID NO:83和84。
在一些实施例中，有义链包括SEQ ID NO:43的序列，并且反义链包括SEQ ID NO:44的序列。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括有义链和反义链，其包括选自以下的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:117和118；
(b)分别为SEQ ID NO:119和120；
(c)分别为SEQ ID NO:121和122；
(d)分别为SEQ ID NO:123和124；
(e)分别为SEQ ID NO:125和126；
(f)分别为SEQ ID NO:127和128；
(g)分别为SEQ ID NO:129和130；
(h)分别为SEQ ID NO:131和132；
(i)分别为SEQ ID NO:133和134；
(j)分别为SEQ ID NO:135和136；
(k)分别为SEQ ID NO:137和138；
(l)分别为SEQ ID NO:139和140；
(m)分别为SEQ ID NO:141和142；
(n)分别为SEQ ID NO:143和144；
(o)分别为SEQ ID NO:145和146；以及
(p)分别为SEQ ID NO:147和148；
在一些实施例中，有义链包括SEQ ID NO:119的序列，并且反义链包括SEQ ID NO:120的序列。在一些实施例中，有义链包括SEQ ID NO:129的序列，并且反义链包括SEQ IDNO:130的序列。
应当理解，在一些实施例中，在描述寡核苷酸或其他核酸的结构时，可以参考序列表中给出的序列。在此类实施例中，当与指定的序列相比时，实际的寡核苷酸或其他核酸可以具有一个或多个替代核苷酸(例如，DNA核苷酸的RNA对应物或RNA核苷酸的DNA对应物)和/或一个或多个修饰的核苷酸和/或一个或多个修饰的核苷酸间键和/或一个或多个其他修饰，同时保留与指定的序列基本上相同或相似的互补性质。
在一些实施例中，本文的双链RNA(dsRNA)包括25核苷酸有义链和27核苷酸反义链，当被Dicer酶作用于其上时，其产生并入到成熟RISC中的反义链。在一些实施例中，dsRNA的有义链长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸)。在一些实施例中，dsRNA的有义链长于25个核苷酸(例如26、27、28、29或30个核苷酸)。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链包括选自SEQ ID NO:160-189的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链包括选自SEQ ID NO:160-189的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列长于25个核苷酸(例如，26、27、28、29或30个核苷酸)。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链包括选自SEQ ID NO:190-205的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链包括选自SEQ ID NO:190-205的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列长于25个核苷酸(例如，26、27、28、29或30个核苷酸)。
在一些实施例中，本文的寡核苷酸具有当与其他5'端相比时在热力学上较不太稳定的一个5'端。在一些实施例中，提供了不对称的寡核苷酸，其包含在有义链的3'端处的钝端和在反义链的3'端处的3'突出端。在一些实施例中，反义链上的3'突出端的长度为约1-8个核苷酸(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)。通常，用于RNAi的寡核苷酸在反义(引导)链的3'端上具有双核苷酸突出端。然而，其他突出端是可能的。在一些实施例中，突出端是3'突出端，其包括1至6个核苷酸的长度，任选地1至5个、1至4个、1至3个、1至2、2至6个、2至5个、2至4个、2至3个、3至6个、3至5个、3至4个、4至6个、4至5个、5至6个核苷酸，或1、2、3、4个、5或6个核苷酸。然而，在一些实施例中，突出端是5'-突出端，其包括1至6个核苷酸的长度，任选地1至5个、1至4个、1至3个、1至2个、2至6个、2至5个、2至4个、2至3个、3至6个、3至5个、3至4个、4至6个、4至5个、5至6个核苷酸或1、2、3、4、5或6个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域，以及包括1至6个核苷酸的长度的5'-突出端。在一些实施例中，寡核苷酸包括有义链，其包括选自SEQ ID NO:160-189、和190-205的核苷酸序列，其中所述寡核苷酸包括有包括1至6个核苷酸的长度的5'突出端。在一些实施例中，寡核苷酸包括反义链，所述反义链包括选自SEQ ID NO:26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146和148的核苷酸序列，其中所述寡核苷酸包括有包括1至6个核苷酸的长度的5'突出端。在一些实施例中，所述寡核苷酸包括有义链和反义链，所述有义链包括选自SEQ IDNO:160-189和190-205的核苷酸序列，所述反义链包括选自SEQ ID NO:26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146和148的核苷酸序列，其中所述寡核苷酸包括有包括1至6个核苷酸的长度的5'-突出端。
在一些实施例中，反义链的3'端上的两个末端核苷酸被修饰。在一些实施例中，反义链的3'端上的两个末端核苷酸与靶mRNA(例如，ACC或DGAT2mRNA)互补。在一些实施例中，反义链的3'端上的两个末端核苷酸与靶不互补。在一些实施例中，本文中寡核苷酸的反义链的3'端上的两个(2)末端核苷酸是未配对的。在一些实施例中，本文中寡核苷酸的反义链的3'端上的两个(2)末端核苷酸包括未配对的GG。在一些实施例中，本文中寡核苷酸的反义链的3'端上的两个(2)末端核苷酸与靶mRNA不互补。在一些实施例中，寡核苷酸的每个3'端上的两个(2)末端核苷酸是GG。在一些实施例中，本文中寡核苷酸的每个3'端上的两个(2)末端GG核苷酸中的一个或两个与靶mRNA不互补。在一些实施例中，在带缺口的四环结构中的寡核苷酸的每个3'端上的两个末端核苷酸是GG。通常，寡核苷酸的每个3'端上的两个末端GG核苷酸中的一个或两个与靶不互补。在一些实施例中，所述寡核苷酸包括与SEQ IDNO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域、其中本文中寡核苷酸的反义链的3'端上的两个(2)末端核苷酸包括未配对的GG。在一些实施例中，寡核苷酸包括反义链，其包括选自SEQ ID NO:26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146和148的核苷酸序列，其中所述寡核苷酸的反义链的3'端上的两(2)个末端核苷酸包括未配对的GG。在一些实施例中，所述寡核苷酸包括有义链和反义链，所述有义链包括选自SEQ ID NO:160-189和190-205的核苷酸序列，所述反义链包括选自SEQ ID NO:26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146和148的核苷酸序列，其中所述寡核苷酸的反义链的3'端上的两(2)个末端核苷酸包括未配对的GG。
在一些实施例中，在有义链和反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。如果在有义链和反义链之间存在多于一个错配，则它们可以被连续定位(例如，一行中2、3或更多个)，或散布在整个互补性区域中。在一些实施例中，有义链的3'端含有一个或多个错配。在一个实施例中，两个错配被并入在有义链的3'端处。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链的3'端处的碱基错配或区段的去稳定化提高了RNAi中合成双链体的效力，可能是通过促进通过Dicer的加工。
在一些实施例中，本文中寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:160和26；
(b)分别为SEQ ID NO:161和28；
(c)分别为SEQ ID NO:162和30；
(d)分别为SEQ ID NO:163和32；
(e)分别为SEQ ID NO:164和34；
(f)分别为SEQ ID NO:165和36；
(g)分别为SEQ ID NO:166和38；
(h)分别为SEQ ID NO:167和40；
(i)分别为SEQ ID NO:168和42；
(j)分别为SEQ ID NO:169和44；
(k)分别为SEQ ID NO:170和46；
(l)分别为SEQ ID NO:171和48；
(m)分别为SEQ ID NO:172和50；
(n)分别为SEQ ID NO:173和52；
(o)分别为SEQ ID NO:174和54；
(p)分别为SEQ ID NO:175和56；
(q)分别为SEQ ID NO:176和58；
(r)分别为SEQ ID NO:177和60；
(s)分别为SEQ ID NO:178和62；
(t)分别为SEQ ID NO:179和64；
(u)分别为SEQ ID NO:180和66；
(v)分别为SEQ ID NO:181和68；
(w)分别为SEQ ID NO:182和70；
(x)分别为SEQ ID NO:183和72；
(y)分别为SEQ ID NO:184和74；
(z)分别为SEQ ID NO:185和76；
(aa)分别为SEQ ID NO:186和78；
(bb)分别为SEQ ID NO:187和80；
(cc)分别为SEQ ID NO:188和82；以及
(dd)分别为SEQ ID NO:189和84，
其中在有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。
在一些实施例中，本文中寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:162和30；
(b)分别为SEQ ID NO:163和32；以及
(c)分别为SEQ ID NO:169和44，
其中在有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。
在一些实施例中，本文中寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:190和118；
(b)分别为SEQ ID NO:191和120；
(c)分别为SEQ ID NO:192和122；
(d)分别为SEQ ID NO:193和124；
(e)分别为SEQ ID NO:194和126；
(f)分别为SEQ ID NO:195和128；
(g)分别为SEQ ID NO:196和130；
(h)分别为SEQ ID NO:197和132；
(i)分别为SEQ ID NO:198和134；
(j)分别为SEQ ID NO:199和136；
(k)分别为SEQ ID NO:200和138；
(l)分别为SEQ ID NO:201和140；
(m)分别为SEQ ID NO:202和142；
(n)分别为SEQ ID NO:203和144；
(o)分别为SEQ ID NO:204和146；以及
(p)分别为SEQ ID NO:205和148，
其中在有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。
在一些实施例中，本文中寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:200和138；
(b)分别为SEQ ID NO:203和144；
(c)分别为SEQ ID NO:194和126；
(d)分别为SEQ ID NO:191和120；
(e)分别为SEQ ID NO:196和130；以及
(f)分别为SEQ ID NO:190和118，
其中在有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。
a.反义链
在一些实施例中，本文公开的用于靶向ACC和/或DGAT2的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括反义链，所述反义链包括如SEQ ID NO:2、30、32、44、56、106、108、112、126、130和138中的任一者所示序列或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸包括反义链，所述反义链包括如SEQ ID NO:2、30、32、44、56、106、108、112、126、130和138中的任一者所示序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸包括反义链，所述反义链包括选自SEQ ID No:2、30、32、44和56的序列或由所述序列组成。在一些实施例中，寡核苷酸包括反义链，所述反义链包括选自SEQ IDNo:30、32和44的序列或由所述序列组成。在一些实施例中，寡核苷酸包括反义链，所述反义链包括选自SEQ ID No:106、108、112、118、120、126、130和128的序列或由所述序列组成。在一些实施例中，寡核苷酸包括反义链，所述反义链包括选自SEQ ID No:118、120、126、130和128的序列或由所述序列组成。
在一些实施例中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括长度高达约50个核苷酸(例如，长度高达50个核苷酸、高达40个核苷酸、高达35个核苷酸、30个核苷酸、高达27个核苷酸、高达25个核苷酸、高达21个核苷酸、高达19个核苷酸、高达17个核苷酸或高达12个核苷酸)的反义链。在一些实施例中，dsRNA包括长度高达约40个核苷酸(例如，长度高达40个核苷酸、高达35个核苷酸、高达30个核苷酸、高达27个核苷酸、高达25个核苷酸、高达21个核苷酸、高达19个核苷酸、高达17个核苷酸或高达12个核苷酸)的反义链。在一些实施例中，寡核苷酸可以具有长度至少约12个核苷酸(例如，长度至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少22个、至少25个、至少27个、至少30个、至少35个或至少38个核苷酸)的反义链。在一些实施例中，寡核苷酸可以具有长度在约12至约40个(例如，12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至22、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)核苷酸的范围内的反义链。在一些实施例中，寡核苷酸可以具有长度12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的反义链。在一些实施例中，寡核苷酸包括长度15至30个核苷酸的反义链。在一些实施例中，本文公开的寡核苷酸中的任何一种的反义链长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括长度22个核苷酸的反义链。
在一些实施例中，寡核苷酸的反义链可以被称为“引导链”。例如，如果反义链可以与RNA诱导的沉默复合物(RISC)接合并且与Argonaute蛋白如Ago2结合，或者与一个或多个类似因子接合或结合，并且直接沉默靶基因，那么它可以被称为引导链。在一些实施例中，与引导链互补的有义链可以被称为“乘客链”。
b.有义链
在一些实施例中，本文用于靶向ACC和/或DGAT2的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括如SEQ ID NO:1、29、31、43、55、105、107、111、125、129和137中的任一者所示有义链序列或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸具有这样的有义链，所述有义链包括如SEQ IDNO:1、29、31、43、55、105、107、111、125、129和137中的任一者所示序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸或由其组成。在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括由如SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145和147中的任一者所示序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个，至少15、至少16、至少17个，至少18个，至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸组成的有义链。在一些实施例中，寡核苷酸包括有义链，所述有义链包括选自SEQ ID No:29、31、43和55的序列或由所述序列组成。在一些实施例中，寡核苷酸包括有义链，所述有义链包括选自SEQ ID No:162、163、169和175的序列或由所述序列组成。在一些实施例中，寡核苷酸包括有义链，所述有义链包括选自SEQ ID No:117、119、125、129、137和143的序列或由所述序列组成。在一些实施例中，寡核苷酸包括有义链，所述有义链包括选自SEQ ID No:190、191、194、196、200和203的序列或由所述序列组成。
在一些实施例中，寡核苷酸包括长度高达约40个核苷酸(例如，长度高达40个核苷酸、高达36个核苷酸、高达30个核苷酸、高达27个核苷酸、高达25个核苷酸、高达21个核苷酸、高达19个核苷酸、高达17个核苷酸或高达12个核苷酸)的有义链(或乘客链)。在一些实施例中，寡核苷酸可以具有长度至少约12个核苷酸(例如，长度至少约12个核苷酸、至少15个核苷酸、至少19个核苷酸、至少21个核苷酸、至少25个核苷酸、至少27个核苷酸、至少30个核苷酸、至少36个核苷酸或至少38个核苷酸)的有义链。在一些实施例中，寡核苷酸可以具有长度在约12至约40个(例如，12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至21、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40个)核苷酸的范围内的有义链。在一些实施例中，寡核苷酸可以具有长度12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的有义链。
在一些实施例中，本文公开的用于靶向ACC mRNA和抑制ACC表达的寡核苷酸包括如SEQ ID NO:160-189中的任一者中所示的有义链序列。在一些实施例中，本文的寡核苷酸具有由如SEQ ID NO:160-189中的任一者中所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸组成的有义链。在一些实施例中，本文公开的用于靶向ACC mRNA和抑制ACC表达的寡核苷酸包括如SEQ ID NO:162、163和169中的任一者中所示的有义链序列。在一些实施例中，本文的寡核苷酸具有包括如SEQ ID NO:162、163和169中的任一者中所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸的有义链。在一些实施例中，本文公开的用于靶向ACC mRNA和抑制ACC表达的寡核苷酸包括如SEQ ID NO:29、31、43中的任一者中所示的有义链序列。在一些实施例中，本文的寡核苷酸具有包括如SEQID NO:29、31和43中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸的有义链。
在一些实施例中，本文公开的用于靶向DGAT2 mRNA和抑制DGAT2表达的寡核苷酸包括如SEQ ID NO:190-205中的任一者中所示的有义链序列。在一些实施例中，本文的寡核苷酸具有由如SEQ ID NO:190-205中的任一者所示序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸组成的有义链。在一些实施例中，本文公开的用于靶向DGAT2mRNA和抑制DGAT2表达的寡核苷酸包括如SEQ ID NO:200、203、194、191、196和190中的任一者中所示的有义链序列。在一些实施例中，本文的寡核苷酸具有包括如SEQ ID NO:200、203、194、191、196和190中的任一者中所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸的有义链。在一些实施例中，本文公开的用于靶向DGAT2 mRNA和抑制DGAT2表达的寡核苷酸包括如SEQ ID NO:137、143、119、125、129和117中的任一者中所示的有义链序列。在一些实施例中，本文的寡核苷酸具有包括如SEQ ID NO:137、143、119、125、129和117中的任一者所示序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸的有义链。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括有义链，所述有义链在有义链的3'端处包括茎-环结构。在一些实施例中，茎-环通过链内碱基配对形成。在一些实施例中，有义链在其5'端处包括茎-环结构。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度2个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度3个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度4个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度5个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度6个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度7个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度8个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度9个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度10个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度11个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度12个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度13个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎-环的茎包括长度14个核苷酸的双链体。
在一些实施例中，茎-环提供针对降解(例如，酶促降解)的寡核苷酸保护，促进或改善靶向和/或递送至靶细胞、组织或器官(例如，肝脏)，或两者。例如，在一些实施例中，茎-环的环由包括一个或多个修饰的核苷酸组成，所述修饰促进、改善或增加靶向靶mRNA(例如，ACC和/或DGAT2 mRNA)、抑制靶基因表达(例如，ACC和/或DGAT2表达)、和/或递送、摄取和/或渗透进入靶细胞、组织或器官(例如肝脏)或其组合。在一些实施例中，茎-环本身或对茎-环的修饰不影响或基本上不影响寡核苷酸的固有基因表达抑制活性，而是促进、改善或增加稳定性(例如，提供对降解的保护)和/或寡核苷酸对靶细胞、组织或器官(例如，肝)的递送、摄取和/或渗透。在某些实施例中，本文的寡核苷酸包括有义链，所述有义链包括(例如在其3'端处)被示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1和S2之间形成长度高达约10个核苷酸(例如长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的单链连接核苷酸的环。在一些实施例中，环(L)长度为3个核苷酸。在一些实施例中，环(L)长度为4个核苷酸。在一些实施例中，环(L)长度为5个核苷酸。在一些实施例中，环(L)长度为6个核苷酸。在一些实施例中，环(L)长度为7个核苷酸。在一些实施例中，环(L)长度为8个核苷酸。在一些实施例中，环(L)长度为9个核苷酸。在一些实施例中，环(L)长度为10个核苷酸。
在一些实施例中，四环包括序列5'-GAAA-3'。在一些实施例中，茎-环包括序列5'-GCAGCCGAAAGGCUGC-3'(SEQ ID NO:159)。
在一些实施例中，有义链在其3'端处包括茎-环结构。在一些实施例中，有义链在其5'端处包括茎-环结构。在一些实施例中，茎是长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14bp的双链体。在一些实施例中，茎-环提供针对降解(例如，酶促降解)的分子保护并且促进用于递送至靶细胞的靶向特性。例如，在一些实施例中，环提供了添加的核苷酸，可以在添加的核苷酸上进行修饰，而基本上不影响寡核苷酸的基因表达抑制活性。在某些实施例中，寡核苷酸是在本文中，其中有义链包括(例如在其3'端处)被示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1和S2之间形成长度高达约10个核苷酸(例如长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的环。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145和147中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域、并且寡核苷酸包括有义链，所述有义链包括(例如，在其3'端处)被示为S1-L-S2的茎-环、其中S1与S2互补，并且其中L在S1和S2之间形成长度4个核苷酸的单链环。图1A-1C描绘了此类寡核苷酸的非限制性实例。
在一些实施例中，具有如本文所述的结构S1-L-S2的茎-环的环(L)是三环。在一些实施例中，寡核苷酸包括与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145和147中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域以及三环。在一些实施例中，三环包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸、配体(例如递送配体)及其组合。
在一些实施例中，具有如上所述的结构S1-L-S2的茎-环的环(L)是四环。在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145和147中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补性区域以及四环。在一些实施例中，四环包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸、配体(例如递送配体)及其组合。
在一些实施例中，茎-环的环(F)是四环(例如，在带缺口的四环结构内)。四环可以含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸及其组合。通常，四环具有4至5个核苷酸。
c.双链体长度
在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体长度为至少12个(例如，至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个)核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。在一些实施例中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为12个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为13个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为14个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为15个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为16个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为17个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为18个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为19个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为20个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为21个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为22个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为23个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为24个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为25个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为26个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为27个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为28个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为29个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为30个核苷酸。在一些实施例中，在有义链和反义链之间形成的双链体不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施例中，在有义链与反义链之间的双链体跨越有义链或反义链的整个长度。在一些实施例中，在有义链和反义链之间的双链体跨越有义链和反义链两者的整个长度。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:160和26；
(b)分别为SEQ ID NO:161和28；
(c)分别为SEQ ID NO:162和30；
(d)分别为SEQ ID NO:163和32；
(e)分别为SEQ ID NO:164和34；
(f)分别为SEQ ID NO:165和36；
(g)分别为SEQ ID NO:166和38；
(h)分别为SEQ ID NO:167和40；
(i)分别为SEQ ID NO:168和42；
(j)分别为SEQ ID NO:169和44；
(k)分别为SEQ ID NO:170和46；
(l)分别为SEQ ID NO:171和48；
(m)分别为SEQ ID NO:172和50；
(n)分别为SEQ ID NO:173和52；
(o)分别为SEQ ID NO:174和54；
(p)分别为SEQ ID NO:175和56；
(q)分别为SEQ ID NO:176和58；
(r)分别为SEQ ID NO:177和60；
(s)分别为SEQ ID NO:178和62；
(t)分别为SEQ ID NO:179和64；
(u)分别为SEQ ID NO:180和66；
(v)分别为SEQ ID NO:181和68；
(w)分别为SEQ ID NO:182和70；
(x)分别为SEQ ID NO:183和72；
(y)分别为SEQ ID NO:184和74；
(z)分别为SEQ ID NO:185和76；
(aa)分别为SEQ ID NO:186和78；
(bb)分别为SEQ ID NO:187和80；
(cc)分别为SEQ ID NO:188和82；以及
(dd)分别为SEQ ID NO:189和84，
其中在有义链和反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。
在一些实施例中，在有义链与反义链之间的双链体跨越有义链或反义链的整个长度。在一些实施例中，在有义链和反义链之间的双链体跨越有义链和反义链两者的整个长度。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:162和30；
(b)分别为SEQ ID NO:163和32；以及
(c)分别为SEQ ID NO:169和44，
其中在有义链和反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。
在一些实施例中，在有义链与反义链之间的双链体跨越有义链或反义链的整个长度。在一些实施例中，在有义链和反义链之间的双链体跨越有义链和反义链两者的整个长度。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:190和118；
(b)分别为SEQ ID NO:191和120；
(c)分别为SEQ ID NO:192和122；
(d)分别为SEQ ID NO:193和124；
(e)分别为SEQ ID NO:194和126；
(f)分别为SEQ ID NO:195和128；
(g)分别为SEQ ID NO:196和130；
(h)分别为SEQ ID NO:197和132；
(i)分别为SEQ ID NO:198和134；
(j)分别为SEQ ID NO:199和136；
(k)分别为SEQ ID NO:200和138；
(l)分别为SEQ ID NO:201和140；
(m)分别为SEQ ID NO:202和142；
(n)分别为SEQ ID NO:203和144；
(o)分别为SEQ ID NO:204和146；以及
(p)分别为SEQ ID NO:205和148，
其中在有义链和反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。
在一些实施例中，在有义链与反义链之间的双链体跨越有义链或反义链的整个长度。在一些实施例中，在有义链和反义链之间的双链体跨越有义链和反义链两者的整个长度。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:200和138；
(b)分别为SEQ ID NO:203和144；
(c)分别为SEQ ID NO:194和126；
(d)分别为SEQ ID NO:191和120；
(e)分别为SEQ ID NO:196和130；以及
(f)分别为SEQ ID NO:190和118，
其中在有义链和反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。
v.寡核苷酸修饰
a.糖修饰
在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)包括经修饰的糖。在一些实施例中，修饰的糖(在本文中也被称为糖类似物)包含修饰的脱氧核糖或核糖部分，其中例如在糖的2'、3'、4'和/或5'碳位置处发生一个或多个修饰。在一些实施例中，经修饰的糖还可以包含非天然替代碳结构，如存在于锁定核酸(“LNA”；参见，例如，Koshkin等人，(1998)《四面体(Tetrahedon)》，54:3607-3630)、未锁定的核酸(“UNA”；参见例如Snead等人(2013)《分子疗法-核酸(Mol.Ther-Nucl.Acids)》2:e103)和桥接核酸(“BNA”；参见，例如，Imanishi&Obika(2002)，《化学通讯(CHEM COMMUN.)》(CAMB)21:1653-1659)中的那些非天然替代碳结构。
在一些实施例中，糖中的核苷酸修饰包括2'-修饰。在一些实施例中、2'-修饰可以是2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺、2'-氨基、2'-乙基、2'-氟(2'-F)、2'-氨基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2'-O-NMA)或2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)。在一些实施例中，修饰是2'-F、2'-OMe或2'-MOE。在一些实施例中，糖中的修饰包括糖环的修饰，其可以包括糖环的一个或多个碳的修饰。例如，核苷酸的糖的修饰可以包括糖的2'-氧，其连接至糖的1'-碳或4'-碳，或者2'-氧经由亚乙基或亚甲基桥连接至1'-碳或4'-碳。在一些实施例中，修饰的核苷酸具有缺乏2'-碳至3'-碳键的无环糖。在一些实施例中，修饰的核苷酸具有例如处于糖的4′位置的硫醇基团。
在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸包括至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60或更多个)。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链包括至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35或更多个)。在一些实施例中，寡核苷酸的反义链包括至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个)。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链的所有核苷酸都是经修饰的。在一些实施例中，寡核苷酸的反义链的所有核苷酸都是经修饰的。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸(即有义链和反义链两者)都是经修饰的。在一些实施例中，经修饰的核苷酸包括2'-修饰(例如，2'-F或2'-OMe、2'-MOE和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸)。在一些实施例中，经修饰的核苷酸包括2'-修饰(例如，2'-F或2'-OMe)。
在一些实施例中，本公开提供了具有不同修饰模式的寡核苷酸。在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括具有如在实例和序列表中阐述的修饰模式的有义链和具有如在实例和序列表中阐述的修饰模式的反义链。
在一些实施例中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括具有用2'-F修饰的核苷酸的反义链。在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括反义链，所述反义链包括用2'-F和2'-OMe修饰的核苷酸。在一些实施例中，本文公开的寡核苷酸包括具有用2'-F修饰的核苷酸的有义链。在一些实施例中，本文公开的寡核苷酸包括有义链，所述有义链包括用2'-F和2'-OMe修饰的核苷酸。
在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸包括有义链，其中所述有义链的约10-15％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的核苷酸包括2'-氟修饰。在一些实施例中，有义链的约11％的核苷酸包括2-氟修饰。在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸包括反义链，其中所述反义链的约25-35％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的核苷酸包括2'-氟修饰。在一些实施例中，反义链的约32％的核苷酸包括2'-氟修饰。在一些实施例中，寡核苷酸具有约15-25％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％的包含2'-氟修饰的其核苷酸。在一些实施例中，dsRNAi寡核苷酸中的约19％的核苷酸包括2'-氟修饰。
在一些实施例中，有义链的位置8、9、10或11中的一个或多个用2'-F基团修饰。在一些实施例中，有义链的位置3、8、9、10、12、13和17中的一个或多个用2'-F基团修饰。在一些实施例中，反义链的位置2、3、4、5、7、10和14中的一个或多个用2'-F基团修饰。在一些实施例中，反义链的位置2、3、5、7、10和14中的一个或多个用2'-F基团修饰。在一些实施例中，反义链的位置2、5、7、8、10、12、14、16和19中的一个或多个用2'-F基团修饰。在一些实施例中，反义链的位置2、3、4、5、7、8、10、14、16和19中的一个或多个用2'-F基团修饰。在一些实施例中，在有义链中的位置1-7和12-20处的核苷酸中的每一个处的糖部分用2'-OMe修饰。在一些实施例中，在有义链中的位置1-7、12-27和31-36处的核苷酸中的每一个处的糖部分用2'-OMe修饰。在一些实施例中，在有义链中的位置1-2、4-7、11、14-16和18-20处的核苷酸中的每一个处的糖部分用2'-OMe修饰。在一些实施例中，在有义链中的位置1-2、4-7、11、14-16和18-27和31-36处的核苷酸中的每一个处的糖部分用2'-OMe修饰。在一些实施例中，在反义链中的位置3、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22处的核苷酸中的每一个处的糖部分用2'-OMe修饰。在一些实施例中，反义链中的位置4、6、8、9、11、12、13和15-22处的核苷酸中的每一个处的糖部分用2'-OMe修饰。在一些实施例中，反义链中的位置6、8、9、11-13和15-22处的核苷酸中的每一个处的糖部分用2'-OMe修饰。
本公开提供了具有不同修饰模式的寡核苷酸。在一些实施例中，修饰的寡核苷酸包括具有如图1A-1C所示的修饰模式的有义链序列和具有如图1A-1C所示的修饰模式的反义链。在一些实施例中，对于这些寡核苷酸，有义链的位置8、9、10或11中的一个或多个用2'-F基团修饰。在其他实施例中，对于这些寡核苷酸，在有义链中的位置1-7和12-20处的核苷酸中的每一个处的糖部分用2'-OMe修饰。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:160和26；
(b)分别为SEQ ID NO:161和28；
(c)分别为SEQ ID NO:162和30；
(d)分别为SEQ ID NO:163和32；
(e)分别为SEQ ID NO:164和34；
(f)分别为SEQ ID NO:165和36；
(g)分别为SEQ ID NO:166和38；
(h)分别为SEQ ID NO:167和40；
(i)分别为SEQ ID NO:168和42；
(j)分别为SEQ ID NO:169和44；
(k)分别为SEQ ID NO:170和46；
(l)分别为SEQ ID NO:171和48；
(m)分别为SEQ ID NO:172和50；
(n)分别为SEQ ID NO:173和52；
(o)分别为SEQ ID NO:174和54；
(p)分别为SEQ ID NO:175和56；
(q)分别为SEQ ID NO:176和58；
(r)分别为SEQ ID NO:177和60；
(s)分别为SEQ ID NO:178和62；
(t)分别为SEQ ID NO:179和64；
(u)分别为SEQ ID NO:180和66；
(v)分别为SEQ ID NO:181和68；
(w)分别为SEQ ID NO:182和70；
(x)分别为SEQ ID NO:183和72；
(y)分别为SEQ ID NO:184和74；
(z)分别为SEQ ID NO:185和76；
(aa)分别为SEQ ID NO:186和78；
(bb)分别为SEQ ID NO:187和80；
(cc)分别为SEQ ID NO:188和82；以及
(dd)分别为SEQ ID NO:189和84；
其中所述有义链的位置8、9、10或11中的一个或多个用2'-F基团修饰。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:190和118；
(b)分别为SEQ ID NO:191和120；
(c)分别为SEQ ID NO:192和122；
(d)分别为SEQ ID NO:193和124；
(e)分别为SEQ ID NO:194和126；
(f)分别为SEQ ID NO:195和128；
(g)分别为SEQ ID NO:196和130；
(h)分别为SEQ ID NO:197和132；
(i)分别为SEQ ID NO:198和134；
(j)分别为SEQ ID NO:199和136；
(k)分别为SEQ ID NO:200和138；
(l)分别为SEQ ID NO:201和140；
(m)分别为SEQ ID NO:202和142；
(n)分别为SEQ ID NO:203和144；
(o)分别为SEQ ID NO:204和146；以及
(p)分别为SEQ ID NO:205和148；
其中所述有义链的位置8、9、10或11中的一个或多个用2'-F基团修饰。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸包括反义链，所述反义链在用2'-F修饰的反义链的位置2、5、7、8、10、12、14、16和19处具有核苷酸中的每一个的糖部分，并且所述反义链的每个剩余核苷酸的糖部分用选自由2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺、2'-氨基、2'-乙基、2'-氨基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2'-O-NMA)和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)组成的群组的修饰修饰。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸包括反义链，所述反义链在用2'-F修饰的反义链的位置2、3、5、7、10和14处具有核苷酸中的每一个的糖部分，并且所述反义链的每个剩余核苷酸的糖部分用选自由2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺、2'-氨基、2'-乙基、2'-氨基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2'-O-NMA)和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)组成的群组的修饰修饰。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸包括反义链，所述反义链在用2'-F修饰的反义链的位置2-5、7、10和14处具有核苷酸中的每一个的糖部分，并且所述反义链的每个剩余核苷酸的糖部分用选自由2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺、2'-氨基、2'-乙基、2'-氨基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2'-O-NMA)和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)组成的群组的修饰修饰。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸包括反义链，所述反义链在用2'-F修饰的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22处具有糖部分。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸包括反义链，所述反义链在用2'-OMe修饰的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22处具有糖部分。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸包括反义链，所述反义链在用选自由2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺、2'-氨基、2'-乙基、2'-氨基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2'-O-NMA)和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)组成的群组的修饰修饰的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22处具有糖部分。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸包括有义链，所述有义链在用2'-F修饰的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36处具有糖部分。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸包括有义链，所述有义链在用2'-OMe修饰的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36处具有糖部分。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸包括有义链，所述有义链在用选自由2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺、2'-氨基、2'-乙基、2'-氨基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2'-O-NMA)和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)组成的群组的修饰修饰的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36处具有糖部分。
b.5'末端磷酸酯
在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括有义链和反义链，其中所述反义链包括5'-末端磷酸酯。在一些实施例中，寡核苷酸的5'-末端磷酸酯基团增强与Ago2的相互作用。然而，包括5'-磷酸酯基团的寡核苷酸可能易于经由磷酸酶或其他酶降解，这可以限制其体内生物利用度。在一些实施例中，寡核苷酸包含对此类降解具有抗性的5'磷酸酯的类似物。在一些实施例中，磷酸酯类似物可以是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。在某些实施例中，寡核苷酸链的1'端连接至模拟天然5'-磷酸酯基团(“磷酸酯模拟物”)的静电和空间性质的化学部分。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:160和26；
(b)分别为SEQ ID NO:161和28；
(c)分别为SEQ ID NO:162和30；
(d)分别为SEQ ID NO:163和32；
(e)分别为SEQ ID NO:164和34；
(f)分别为SEQ ID NO:165和36；
(g)分别为SEQ ID NO:166和38；
(h)分别为SEQ ID NO:167和40；
(i)分别为SEQ ID NO:168和42；
(j)分别为SEQ ID NO:169和44；
(k)分别为SEQ ID NO:170和46；
(l)分别为SEQ ID NO:171和48；
(m)分别为SEQ ID NO:172和50；
(n)分别为SEQ ID NO:173和52；
(o)分别为SEQ ID NO:174和54；
(p)分别为SEQ ID NO:175和56；
(q)分别为SEQ ID NO:176和58；
(r)分别为SEQ ID NO:177和60；
(s)分别为SEQ ID NO:178和62；
(t)分别为SEQ ID NO:179和64；
(u)分别为SEQ ID NO:180和66；
(v)分别为SEQ ID NO:181和68；
(w)分别为SEQ ID NO:182和70；
(x)分别为SEQ ID NO:183和72；
(y)分别为SEQ ID NO:184和74；
(z)分别为SEQ ID NO:185和76；
(aa)分别为SEQ ID NO:186和78；
(bb)分别为SEQ ID NO:187和80；
(cc)分别为SEQ ID NO:188和82；以及
(dd)分别为SEQ ID NO:189和84；
其中所述寡核苷酸包括5'-末端磷酸酯，任选地5'-末端磷酸酯类似物。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:162和30；
(b)分别为SEQ ID NO:163和32；以及
(c)分别为SEQ ID NO:169和44；
其中所述寡核苷酸包括5'-末端磷酸酯，任选地5'-末端磷酸酯类似物。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:190和118；
(b)分别为SEQ ID NO:191和120；
(c)分别为SEQ ID NO:192和122；
(d)分别为SEQ ID NO:193和124；
(e)分别为SEQ ID NO:194和126；
(f)分别为SEQ ID NO:195和128；
(g)分别为SEQ ID NO:196和130；
(h)分别为SEQ ID NO:197和132；
(i)分别为SEQ ID NO:198和134；
(j)分别为SEQ ID NO:199和136；
(k)分别为SEQ ID NO:200和138；
(l)分别为SEQ ID NO:201和140；
(m)分别为SEQ ID NO:202和142；
(n)分别为SEQ ID NO:203和144；
(o)分别为SEQ ID NO:204和146；以及
(p)分别为SEQ ID NO:205和148；
其中所述寡核苷酸包括5'-末端磷酸酯，任选地5'-末端磷酸酯类似物。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:200和138；
(b)分别为SEQ ID NO:203和144；
(c)分别为SEQ ID NO:194和126；
(d)分别为SEQ ID NO:191和120；
(e)分别为SEQ ID NO:196和130；以及
(f)分别为SEQ ID NO:190和118；
其中所述寡核苷酸包括5'-末端磷酸酯，任选地5'-末端磷酸酯类似物。
在一些实施例中，寡核苷酸在糖的4'-碳位置处具有磷酸酯类似物(被称为“4'-磷酸酯类似物”)。参见，例如，国际专利申请公开号WO 2018/045317。在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括在5'末端核苷酸处的4'-磷酸酯类似物。在一些实施例中，磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯，其中氧基甲基的氧原子与糖部分(例如，在其4'-碳处)或其类似物结合。在其他实施例中，4'-磷酸酯类似物是硫代甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫代甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子与糖部分的4'-碳或其类似物结合。在某些实施例中，4'-磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯。在一些实施例中，氧基甲基膦酸酯由式–O–CH2–PO(OH)2或–O–CH2–PO(OR)2表示，其中R独立地选自H、CH3、烷基、CH2CH2CN、CH2OCOC(CH3)3、CH2OCH2CH2Si(CH3)3或保护基团。在某些实施例中，烷基为CH2CH3。更典型地，R独立地选自H、CH3或CH2CH3。在一些实施例中，4'-磷酸酯类似物是4'-氧基甲基膦酸酯。在一些实施例中，具有4'-膦酸酯类似物的经修饰的核苷酸是尿苷。在一些实施例中，经修饰的核苷酸是4'-O-单甲基膦酸酯-2'-O-甲基尿苷。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸包括反义链，所述反义链在5'末端核苷酸处包括4'-磷酸酯类似物，其中5'末端核苷酸包括以下结构：
Figure BDA0004119380390000501
4'-单甲基膦酸酯-2'-O-甲基尿苷硫代磷酸酯[甲基膦酸酯-4O-mU]。
c.修饰的核苷内键
在一些实施例中，寡核苷酸可以包括经修饰的核苷间键。在一些实施例中，磷酸盐修饰或取代可以产生包括至少约1个(例如，至少1个、至少2个、至少3个或至少5个)修饰的核苷酸间键的寡核苷酸。在一些实施例中，本文公开的寡核苷酸中的任何一种包括约1至约10个(例如，1至10个、2至8个、4至6个、3至10个、5至10个、1至5个、1至3个或1至2个)修饰的核苷酸间键。在一些实施例中，本文公开的寡核苷酸中的任何一种包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰的核苷酸间键。
修饰的核苷酸间键可以是二硫代磷酸酯键、硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、硫代烷基膦酸酯键、硫代烷基磷酸三酯键、亚磷酰胺键、膦酸酯键或硼磷酸酯键。在一些实施例中，如本文所公开的寡核苷酸中的任何一种的至少一个经修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的一种或多种之间具有硫代磷酸酯键。在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的每一种之间具有硫代磷酸酯键。
在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的每一种之间具有硫代磷酸酯键。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:160和26；
(b)分别为SEQ ID NO:161和28；
(c)分别为SEQ ID NO:162和30；
(d)分别为SEQ ID NO:163和32；
(e)分别为SEQ ID NO:164和34；
(f)分别为SEQ ID NO:165和36；
(g)分别为SEQ ID NO:166和38；
(h)分别为SEQ ID NO:167和40；
(i)分别为SEQ ID NO:168和42；
(j)分别为SEQ ID NO:169和44；
(k)分别为SEQ ID NO:170和46；
(l)分别为SEQ ID NO:171和48；
(m)分别为SEQ ID NO:172和50；
(n)分别为SEQ ID NO:173和52；
(o)分别为SEQ ID NO:174和54；
(p)分别为SEQ ID NO:175和56；
(q)分别为SEQ ID NO:176和58；
(r)分别为SEQ ID NO:177和60；
(s)分别为SEQ ID NO:178和62；
(t)分别为SEQ ID NO:179和64；
(u)分别为SEQ ID NO:180和66；
(v)分别为SEQ ID NO:181和68；
(w)分别为SEQ ID NO:182和70；
(x)分别为SEQ ID NO:183和72；
(y)分别为SEQ ID NO:184和74；
(z)分别为SEQ ID NO:185和76；
(aa)分别为SEQ ID NO:186和78；
(bb)分别为SEQ ID NO:187和80；
(cc)分别为SEQ ID NO:188和82；以及
(dd)分别为SEQ ID NO:189和84，
其中所述寡核苷酸包括经修饰的核苷酸间键。
在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的每一种之间具有硫代磷酸酯键。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:162和30；
(b)分别为SEQ ID NO:163和32；以及
(c)分别为SEQ ID NO:169和44，
其中所述寡核苷酸包括经修饰的核苷酸间键。
在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的每一种之间具有硫代磷酸酯键。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:190和118；
(b)分别为SEQ ID NO:191和120；
(c)分别为SEQ ID NO:192和122；
(d)分别为SEQ ID NO:193和124；
(e)分别为SEQ ID NO:194和126；
(f)分别为SEQ ID NO:195和128；
(g)分别为SEQ ID NO:196和130；
(h)分别为SEQ ID NO:197和132；
(i)分别为SEQ ID NO:198和134；
(j)分别为SEQ ID NO:199和136；
(k)分别为SEQ ID NO:200和138；
(l)分别为SEQ ID NO:201和140；
(m)分别为SEQ ID NO:202和142；
(n)分别为SEQ ID NO:203和144；
(o)分别为SEQ ID NO:204和146；以及
(p)分别为SEQ ID NO:205和148，
其中所述寡核苷酸包括经修饰的核苷酸间键。
在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的每一种之间具有硫代磷酸酯键。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:200和138；
(b)分别为SEQ ID NO:203和144；
(c)分别为SEQ ID NO:194和126；
(d)分别为SEQ ID NO:191和120；
(e)分别为SEQ ID NO:196和130；以及
(f)分别为SEQ ID NO:190和118，
其中所述寡核苷酸包括经修饰的核苷酸间键。
d.碱基修饰
在一些实施例中，本文的寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)具有一个或多个经修饰的核碱基。在一些实施例中，修饰的核碱基(在本文中也被称为碱基类似物)在核苷酸糖部分的1′位置处连接。在某些实施例中，经修饰的核碱基是含氮碱基。在某些实施例中，经修饰的核碱基不含有氮原子。参见，例如，美国专利申请公开号2008/0274462。在一些实施例中，经修饰的核苷酸包括通用碱基。然而，在某些实施例中，经修饰的核苷酸不含有核碱基(无碱基)。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:160和26；
(b)分别为SEQ ID NO:161和28；
(c)分别为SEQ ID NO:162和30；
(d)分别为SEQ ID NO:163和32；
(e)分别为SEQ ID NO:164和34；
(f)分别为SEQ ID NO:165和36；
(g)分别为SEQ ID NO:166和38；
(h)分别为SEQ ID NO:167和40；
(i)分别为SEQ ID NO:168和42；
(j)分别为SEQ ID NO:169和44；
(k)分别为SEQ ID NO:170和46；
(l)分别为SEQ ID NO:171和48；
(m)分别为SEQ ID NO:172和50；
(n)分别为SEQ ID NO:173和52；
(o)分别为SEQ ID NO:174和54；
(p)分别为SEQ ID NO:175和56；
(q)分别为SEQ ID NO:176和58；
(r)分别为SEQ ID NO:177和60；
(s)分别为SEQ ID NO:178和62；
(t)分别为SEQ ID NO:179和64；
(u)分别为SEQ ID NO:180和66；
(v)分别为SEQ ID NO:181和68；
(w)分别为SEQ ID NO:182和70；
(x)分别为SEQ ID NO:183和72；
(y)分别为SEQ ID NO:184和74；
(z)分别为SEQ ID NO:185和76；
(aa)分别为SEQ ID NO:186和78；
(bb)分别为SEQ ID NO:187和80；
(cc)分别为SEQ ID NO:188和82；以及
(dd)分别为SEQ ID NO:189和84，
其中所述寡核苷酸包括一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:162和30；
(b)分别为SEQ ID NO:163和32；以及
(c)分别为SEQ ID NO:169和44，
其中所述寡核苷酸包括一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:190和118；
(b)分别为SEQ ID NO:191和120；
(c)分别为SEQ ID NO:192和122；
(d)分别为SEQ ID NO:193和124；
(e)分别为SEQ ID NO:194和126；
(f)分别为SEQ ID NO:195和128；
(g)分别为SEQ ID NO:196和130；
(h)分别为SEQ ID NO:197和132；
(i)分别为SEQ ID NO:198和134；
(j)分别为SEQ ID NO:199和136；
(k)分别为SEQ ID NO:200和138；
(l)分别为SEQ ID NO:201和140；
(m)分别为SEQ ID NO:202和142；
(n)分别为SEQ ID NO:203和144；
(o)分别为SEQ ID NO:204和146；以及
(p)分别为SEQ ID NO:205和148，
其中所述寡核苷酸包括一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:200和138；
(b)分别为SEQ ID NO:203和144；
(c)分别为SEQ ID NO:194和126；
(d)分别为SEQ ID NO:191和120；
(e)分别为SEQ ID NO:196和130；以及
(f)分别为SEQ ID NO:190和118；
其中所述寡核苷酸包括一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施例中，通用碱基是位于经修饰的核苷酸中的核苷酸糖部分的1′位置处，或核苷酸糖部分取代中的等同位置处的杂环部分，当存在于双链体中时，所述杂环部分可以被定位成与多于一种类型的碱基相对，而不显著改变双链体的结构。在一些实施例中，和与靶核酸完全互补的参考单链核酸(例如，寡核苷酸)相比，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，其具有比用互补核酸形成的双链体更低的Tm。然而，在一些实施例中，当与其中通用碱基已被碱基替换以产生单个错配的参考单链核酸相比时，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，其具有比用包括错配的碱基的核酸形成的双链体更高的Tm。
通用结合核苷酸的非限制性实例包含但不限于肌氨酸、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(参见，美国专利申请公开号2007/0254362；Van Aerschot等人，(1995)《核酸研究》，23:4363-4370；Loakes等人，(1995)《核酸研究》，23:2361-2366；和Loakes&Brown(1994)《核酸研究》，22:4039-4043)。
e.可逆的修饰
虽然可以进行在达到靶细胞之前保护寡核苷酸免受体内环境的某些修饰，但是一旦寡核苷酸到达靶细胞的胞质溶胶，它们就可以降低寡核苷酸的效力或活性。可以进行可逆的修饰，使得分子在细胞外保留期望的性质，然后在进入细胞的胞质环境时被除去。可逆的修饰可以例如通过细胞内酶的作用或通过细胞内部的化学条件(例如，通过经由细胞内谷胱甘肽的还原)去除。
在一些实施例中，可逆地修饰的核苷酸包括谷胱甘肽敏感部分。通常，核酸分子已经用环状二硫化物部分进行了化学修饰，以掩盖由核苷酸间二磷酸键产生的负电荷并改善细胞摄取和核酸酶抗性。参见美国专利申请公开号2011/0294869、国际专利申请公开号WO2014/088920和WO 2015/188197以及Meade等人，(2014)《自然生物技术》，32:1256-1263。核苷酸间二磷酸键的这种可逆修饰被设计成通过胞质溶胶(例如谷胱甘肽)的还原环境在细胞内切割。早期的实例包含报告在细胞内部可切割的中和磷酸三酯修饰(参见，Dellinger等人，(2003)《美国化学学会杂志》，125:940-50)。
在一些实施例中，此类可逆修饰允许在体内施用(例如，通过细胞的血液和/或溶酶体/内体隔室转运)期间进行保护，其中所述寡核苷酸将暴露于核酸酶和其他苛刻的环境条件(例如，pH)。当释放到谷胱甘肽的水平高于细胞外空间的细胞的胞质溶胶中时，修饰被逆转，并且结果是切割的寡核苷酸。使用可逆的谷胱甘肽敏感部分，当与使用不可逆化学修饰可用的选项相比时，可以将空间上较大的化学基团引入都感兴趣的寡核苷酸中。这是因为这些较大的化学基团将在胞质溶胶中去除，因此不应干扰细胞的胞质溶胶内部的寡核苷酸的生物学活性。因此，这些较大的化学基团可以被工程改造为赋予核苷酸或寡核苷酸各种优点，如核酸酶抗性、亲脂性、电荷、热稳定性、特异性和降低的免疫原性。在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分的结构可以被工程改造以修饰其释放的动力学。
在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分连接至核苷酸的糖。在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分连接至经修饰的核苷酸的糖的2'-碳。在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分位于糖的5'-碳，特别是当经修饰的核苷酸是寡核苷酸的5'-末端核苷酸时。在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分位于糖的3'-碳，特别是当经修饰的核苷酸是寡核苷酸的3'-末端核苷酸时。在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分包括磺酰基基团。参见例如2016年8月23日提交的，标题为“包括可逆地修饰的寡核苷酸的组合物及其用途(Compositions ComprisingReversibly Modified Oligonucleotides and Uses Thereof)”的美国临时专利申请第62/378,635号。
vi.靶向配体
在一些实施例中，期望将本公开的寡核苷酸靶向一个或多个细胞或一个或多个器官。这种策略可以帮助避免在其他器官中的不期望作用或避免寡核苷酸在不会从寡核苷酸中获益的细胞、组织或器官中的过度损失。寡核苷酸靶向一个或多个细胞或一个或多个器官可以通过多种方法实现。寡核苷酸与组织或细胞特异性抗体、小分子或靶向配体的缀合可以促进递送至一种或多种靶细胞或组织并改变寡核苷酸在一种或多种靶细胞或组织中的积累(Chernolovskaya等人)，(2019)《药学前沿(Front Pharmacol.)》，10:444)。例如，寡核苷酸与饱和脂肪酸(例如，C22)的缀合可以促进递送至细胞或组织，如脂肪组织，其比常规寡核苷酸配体更容易摄取此类配体。因此，在一些实施例中，修饰本文公开的寡核苷酸以促进组织、细胞或器官的靶向和/或递送(例如，以促进寡核苷酸递送至肝)。在某些实施例中，本文所公开的寡核苷酸是经修饰的，以促进寡核苷酸递送至肝的肝细胞。在某些实施例中，本文所公开的寡核苷酸是经修饰的，以促进寡核苷酸递送至脂肪组织的脂肪细胞。在一些实施例中，寡核苷酸包括与一种或多种靶向配体缀合的至少一个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸)。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:160和26；
(b)分别为SEQ ID NO:161和28；
(c)分别为SEQ ID NO:162和30；
(d)分别为SEQ ID NO:163和32；
(e)分别为SEQ ID NO:164和34；
(f)分别为SEQ ID NO:165和36；
(g)分别为SEQ ID NO:166和38；
(h)分别为SEQ ID NO:167和40；
(i)分别为SEQ ID NO:168和42；
(j)分别为SEQ ID NO:169和44；
(k)分别为SEQ ID NO:170和46；
(l)分别为SEQ ID NO:171和48；
(m)分别为SEQ ID NO:172和50；
(n)分别为SEQ ID NO:173和52；
(o)分别为SEQ ID NO:174和54；
(p)分别为SEQ ID NO:175和56；
(q)分别为SEQ ID NO:176和58；
(r)分别为SEQ ID NO:177和60；
(s)分别为SEQ ID NO:178和62；
(t)分别为SEQ ID NO:179和64；
(u)分别为SEQ ID NO:180和66；
(v)分别为SEQ ID NO:181和68；
(w)分别为SEQ ID NO:182和70；
(x)分别为SEQ ID NO:183和72；
(y)分别为SEQ ID NO:184和74；
(z)分别为SEQ ID NO:185和76；
(aa)分别为SEQ ID NO:186和78；
(bb)分别为SEQ ID NO:187和80；
(cc)分别为SEQ ID NO:188和82；以及
(dd)分别为SEQ ID NO:189和84，
其中所述寡核苷酸包括与至少一个核苷酸缀合的靶向配体。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:162和30；
(b)分别为SEQ ID NO:163和32；以及
(c)分别为SEQ ID NO:169和44，
其中所述寡核苷酸包括与至少一个核苷酸缀合的靶向配体。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:190和118；
(b)分别为SEQ ID NO:191和120；
(c)分别为SEQ ID NO:192和122；
(d)分别为SEQ ID NO:193和124；
(e)分别为SEQ ID NO:194和126；
(f)分别为SEQ ID NO:195和128；
(g)分别为SEQ ID NO:196和130；
(h)分别为SEQ ID NO:197和132；
(i)分别为SEQ ID NO:198和134；
(j)分别为SEQ ID NO:199和136；
(k)分别为SEQ ID NO:200和138；
(l)分别为SEQ ID NO:201和140；
(m)分别为SEQ ID NO:202和142；
(n)分别为SEQ ID NO:203和144；
(o)分别为SEQ ID NO:204和146；以及
(p)分别为SEQ ID NO:205和148，
其中所述寡核苷酸包括与至少一个核苷酸缀合的靶向配体。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:200和138；
(b)分别为SEQ ID NO:203和144；
(c)分别为SEQ ID NO:194和126；
(d)分别为SEQ ID NO:191和120；
(e)分别为SEQ ID NO:196和130；以及
(f)分别为SEQ ID NO:190和118，
其中所述寡核苷酸包括与至少一个核苷酸缀合的靶向配体。
在一些实施例中，靶向配体包括碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白质或蛋白质的一部分(例如，抗体或抗体片段)或脂质。在一些实施例中，靶向配体是适体。例如，靶向配体可以是用于靶向肿瘤脉管系统或神经胶质瘤细胞的RGD肽，靶向肿瘤脉管系统或人造口的CREKA肽，靶向在CNS脉管系统上表达的转铁蛋白受体的转移的乳铁蛋白或适体，或靶向神经胶质瘤细胞上的EGFR的抗EGFR抗体。在某些实施例中，靶向配体是一个或多个GalNAc部分。
在一些实施例中，寡核苷酸的1个或更多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自与单独的靶向配体缀合。在一些实施例中，寡核苷酸的2至4个核苷酸各自与单独的靶向配体缀合。在一些实施例中，靶向配体与在有义链或反义链的任一端处的2至4个核苷酸缀合(例如，靶向配体与在有义链或反义链的5'或3'端上的2至4个核苷酸突出端或延伸物缀合)，使得靶向配体类似于牙刷的刷毛，并且寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可以包括在有义链的5'或3'端处的茎-环，并且茎的环的1、2、3或4个核苷酸可以单独地缀合至靶向配体。在一些实施例中，由本公开提供的寡核苷酸(例如，dsRNA)包括在有义链的3'端处的茎-环，其中茎-环的环包括三环或四环，并且其中包括三环或四环的3或4个核苷酸分别单独地缀合至靶向配体。
GalNAc是ASGPR的高亲和力配体，其主要在肝细胞的窦状表面上表达，并在结合、内化和随后清除含有末端半乳糖或GalNAc残基的循环糖蛋白(去唾液酸糖蛋白)方面具有主要作用。GalNAc部分与本公开的寡核苷酸的缀合(间接或直接)可以用于将这些寡核苷酸靶向至在细胞上表达的ASGPR。在一些实施例中，本公开的寡核苷酸与至少一个或多个GalNAc部分缀合，其中GalNAc部分将寡核苷酸靶向至在人类肝细胞(例如，人类肝细胞)上表达的ASGPR。在一些实施例中，GalNAc部分将寡核苷酸靶向至肝。
在一些实施例中，本公开的寡核苷酸直接或间接地与单价GalNAc缀合。在一些实施例中，寡核苷酸直接或间接地与多于一个单价GalNAc缀合(即，与2、3或4个单价GalNAc部分缀合，并且通常与3或4个单价GalNAc部分缀合)。在一些实施例中，寡核苷酸与一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc部分缀合。在一些实施例中，二价、三价或四价GalNAc部分经由支链接头与寡核苷酸缀合。在一些实施例中，单价GalNAc部分与第一核苷酸缀合，并且二价、三价或四价GalNAc部分经由支链接头与第二核苷酸缀合。
在一些实施例中，寡核苷酸的1个或更多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自与GalNAc部分缀合。在一些实施例中，四环的2至4个核苷酸各自与单独的GalNAc缀合。在一些实施例中，三环的1至3个核苷酸各自与单独的GalNAc缀合。在一些实施例中，靶向配体与在有义链或反义链的任一端处的2至4个核苷酸缀合(例如，配体与在有义链或反义链的5′或3′端上的2至4个核苷酸突出端或延伸物缀合)，使得GalNAc部分类似于牙刷的刷毛，并且寡核苷酸类似于牙刷。在一些实施例中，GalNAc部分与有义链的核苷酸缀合。例如，4个GalNAc部分可以与有义链的四环中的核苷酸缀合，其中每个GalNAc部分与1个核苷酸缀合。
在一些实施例中，四环是腺嘌呤和鸟嘌呤核苷酸的任何组合。
在一些实施例中，四环(L)具有经由本文所述的任何接头连接到四环的任一者或多个鸟嘌呤核苷酸的单价GalNAc部分，如下文所描绘(X＝杂原子)：
Figure BDA0004119380390000601
在一些实施例中，四环(L)具有经由本文所述的任何接头连接到四环的任一者或多个腺嘌呤核苷酸的单价GalNAc，如下文所描绘(X＝杂原子)：
Figure BDA0004119380390000611
在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括连接到被称为[ademG-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基甲醇-鸟嘌呤-GalNAc的鸟嘌呤核苷酸的单价GalNAc，如下所述：
Figure BDA0004119380390000612
在一些实施例中，本文的寡核苷酸包括连接至被称为[ademA-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基乙醇-腺嘌呤-GalNAc的腺嘌呤核苷酸的单价GalNAc，如下所述：
Figure BDA0004119380390000621
下面显示了包括5'至3'核苷酸序列GAAA(L＝接头，X＝杂原子)茎连接点的环的这种缀合的实例。这种环可以例如存在于如图1A-1C所示的有义链的位置27-30处。在化学式中，
Figure BDA0004119380390000622
用于描述寡核苷酸链的连接点。
Figure BDA0004119380390000623
适当的方法或化学(例如，点击化学)可以用于将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施例中，靶向配体使用点击接头与核苷酸缀合。在一些实施例中，基于缩醛的接头用于将靶向配体缀合至本文所述的寡核苷酸中的任何一种的核苷酸。基于缩醛的接头公开于例如国际专利申请公开号WO2016/100401中。在一些实施例中，接头是不稳定的接头。然而，在其他实施例中，接头是稳定的。下文示出了包括从5'至3'核苷酸GAAA的环的实例，其中使用缩醛接头将GalNAc部分连接至环的核苷酸。这种环可以例如存在于如图1A-1C所示的有义链中的任一者的位置27-30处。在化学式中，
Figure BDA0004119380390000631
是寡核苷酸链的连接点。/>
Figure BDA0004119380390000632
/>
Figure BDA0004119380390000641
如上所述，各种适当的方法或化学合成技术(例如，点击化学)可以用于将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施例中，靶向配体使用点击接头与核苷酸缀合。在一些实施例中，基于缩醛的接头用于将靶向配体缀合至本文所述的寡核苷酸中的任何一种的核苷酸。基于缩醛的接头公开于例如国际专利申请公开号WO 2016/100401中。在一些实施例中，接头是不稳定的接头。然而，在其他实施例中，接头是稳定的接头。
在一些实施例中，在靶向配体(例如，GalNAc部分)和dsRNA之间提供了双链体延伸(例如，长度高达3、4、5或6bp)。在一些实施例中，本文的寡核苷酸不具有与其缀合的GalNAc。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:160和26；
(b)分别为SEQ ID NO:161和28；
(c)分别为SEQ ID NO:162和30；
(d)分别为SEQ ID NO:163和32；
(e)分别为SEQ ID NO:164和34；
(f)分别为SEQ ID NO:165和36；
(g)分别为SEQ ID NO:166和38；
(h)分别为SEQ ID NO:167和40；
(i)分别为SEQ ID NO:168和42；
(j)分别为SEQ ID NO:169和44；
(k)分别为SEQ ID NO:170和46；
(l)分别为SEQ ID NO:171和48；
(m)分别为SEQ ID NO:172和50；
(n)分别为SEQ ID NO:173和52；
(o)分别为SEQ ID NO:174和54；
(p)分别为SEQ ID NO:175和56；
(q)分别为SEQ ID NO:176和58；
(r)分别为SEQ ID NO:177和60；
(s)分别为SEQ ID NO:178和62；
(t)分别为SEQ ID NO:179和64；
(u)分别为SEQ ID NO:180和66；
(v)分别为SEQ ID NO:181和68；
(w)分别为SEQ ID NO:182和70；
(x)分别为SEQ ID NO:183和72；
(y)分别为SEQ ID NO:184和74；
(z)分别为SEQ ID NO:185和76；
(aa)分别为SEQ ID NO:186和78；
(bb)分别为SEQ ID NO:187和80；
(cc)分别为SEQ ID NO:188和82；以及
(dd)分别为SEQ ID NO:189和84，
其中所述寡核苷酸包括与核苷酸缀合的至少一个GalNAc部分。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:162和30；
(b)分别为SEQ ID NO:163和32；以及
(c)分别为SEQ ID NO:169和44，
其中所述寡核苷酸包括与核苷酸缀合的至少一个GalNAc部分。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:190和118；
(b)分别为SEQ ID NO:191和120；
(c)分别为SEQ ID NO:192和122；
(d)分别为SEQ ID NO:193和124；
(e)分别为SEQ ID NO:194和126；
(f)分别为SEQ ID NO:195和128；
(g)分别为SEQ ID NO:196和130；
(h)分别为SEQ ID NO:197和132；
(i)分别为SEQ ID NO:198和134；
(j)分别为SEQ ID NO:199和136；
(k)分别为SEQ ID NO:200和138；
(l)分别为SEQ ID NO:201和140；
(m)分别为SEQ ID NO:202和142；
(n)分别为SEQ ID NO:203和144；
(o)分别为SEQ ID NO:204和146；以及
(p)分别为SEQ ID NO:205和148，
其中所述寡核苷酸包括与核苷酸缀合的至少一个GalNAc部分。
在一些实施例中，寡核苷酸的有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:200和138；
(b)分别为SEQ ID NO:203和144；
(c)分别为SEQ ID NO:194和126；
(d)分别为SEQ ID NO:191和120；
(e)分别为SEQ ID NO:196和130；以及
(f)分别为SEQ ID NO:190和118，
其中所述寡核苷酸包括与核苷酸缀合的至少一个GalNAc部分。
vii.示例性修饰的寡核苷酸
在一些实施例中，靶向ACC的寡核苷酸包括如表3中所示的有义链和反义链，其中所述寡核苷酸包括具有约2-6个碱基对的双链茎和3-4个核苷酸的环的茎环结构，并且其中所述有义链和反义链包括图1B中所示的修饰模式。在一些实施例中，靶向ACC的寡核苷酸包括如表3中所示的有义链和反义链，其中所述寡核苷酸包括具有约2-6个碱基对的双链茎和3-4个核苷酸的环的茎环结构，其中所述有义链和反义链包括图1B所示的修饰模式并且其中反义链在5'末端核苷酸的4'碳处用氧基甲基膦酸酯修饰。在一些实施例中，寡核苷酸包括有包括SEQ ID NO:159的核苷酸序列的茎环。在一些实施例中，寡核苷酸包括6个碱基对的双链茎和包括一个、两个、三个或四个GalNAc缀合的核苷酸的4个核苷酸的茎环。在一些实施例中，GalNAc缀合的核苷酸是与腺嘌呤核苷酸缀合的单价GalNAc，被称为[ademA-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下文所描绘：
Figure BDA0004119380390000671
在一些实施例中，茎环包括6个碱基对的双链茎和包括核苷酸序列GAAA的环，其中每个腺嘌呤核苷酸是ademA-GalNAc。
在一些实施例中，靶向ACC的寡核苷酸包括如表4，中所示的有义链和反义链，其中所述有义链和反义链包括图1B中所示的修饰模式。在一些实施例中，靶向ACC的寡核苷酸包括如表4中所示的有义链和反义链，其中所述有义链和反义链包括图1B中所示的修饰模式并且其中反义链在5'末端核苷酸的4'碳处用氧基甲基膦酸酯修饰。在一些实施例中，寡核苷酸包括有包括SEQ ID NO:159的核苷酸序列的茎环。在一些实施例中，寡核苷酸包括6个碱基对的双链茎和包括一个、两个、三个或四个GalNAc缀合的核苷酸的4个核苷酸的茎环。在一些实施例中，GalNAc缀合的核苷酸是与腺嘌呤核苷酸缀合的单价GalNAc，被称为[ademA-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下文所描绘：
Figure BDA0004119380390000681
在一些实施例中，茎环包括6个碱基对的双链茎和包括核苷酸序列GAAA的环，其中每个腺嘌呤核苷酸是ademA-GalNAc。
在一些实施例中，靶向DGAT的寡核苷酸包括如表8中所示的有义链和反义链，其中所述寡核苷酸包括具有约2-6个碱基对的双链茎和3-4个核苷酸的环的茎环结构，并且其中所述有义链和反义链包括图1C中所示的修饰模式。在一些实施例中，靶向DGAT的寡核苷酸包括如表8中所示的有义链和反义链，其中所述寡核苷酸包括具有约2-6个碱基对的双链茎和3-4个核苷酸的环的茎环结构，其中所述有义链和反义链包括图1C中所示的修饰模式并且其中反义链在5'末端核苷酸的4'碳处用氧基甲基膦酸酯修饰。在一些实施例中，寡核苷酸包括有包括SEQ ID NO:159的核苷酸序列的茎环。在一些实施例中，寡核苷酸包括6个碱基对的双链茎和包括一个、两个、三个或四个GalNAc缀合的核苷酸的4个核苷酸的茎环。在一些实施例中，GalNAc缀合的核苷酸是与腺嘌呤核苷酸缀合的单价GalNAc，被称为[ademA-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下文所描绘：
Figure BDA0004119380390000682
在一些实施例中，茎环包括6个碱基对的双链茎和包括核苷酸序列GAAA的环，其中每个腺嘌呤核苷酸是ademA-GalNAc。
在一些实施例中，靶向DGAT的寡核苷酸包括如表9中所示的有义链和反义链，其中所述有义链和反义链包括图1C中所示的修饰模式。在一些实施例中，靶向DGAT的寡核苷酸包括如表9中所示的有义链和反义链，其中所述有义链和反义链包括图1C中所示的修饰模式并且其中反义链在5'末端核苷酸的4'碳处用氧基甲基膦酸酯修饰。在一些实施例中，寡核苷酸包括有包括SEQ ID NO:159的核苷酸序列的茎环。在一些实施例中，寡核苷酸包括6个碱基对的双链茎和包括一个、两个、三个或四个GalNAc缀合的核苷酸的4个核苷酸的茎环。在一些实施例中，GalNAc缀合的核苷酸是与腺嘌呤核苷酸缀合的单价GalNAc，被称为[ademA-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下文所描绘：
Figure BDA0004119380390000691
在一些实施例中，茎环包括6个碱基对的双链茎和包括核苷酸序列GAAA的环，其中每个腺嘌呤核苷酸是ademA-GalNAc。
在一些实施例中，本文提供的用于减少ACC表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括：
有义链，所述有义链包括在位置3、8-10、12、13和17处的2'-F修饰的核苷酸、在位置1-2、4-7、11、14-16、18-27和31-36处的2'-OMe修饰的核苷酸、在位置28、29和30处的GalNAc缀合的核苷酸；以及在位置1和位置2之间的硫代磷酸酯键；
反义链，所述反义链包括在位置2、5、7-8、10、12、14、16和19处的2'-F修饰的核苷酸，在位置1、3-4、6、9、11、13、15、17-18和20-22处的2'-OMe、在位置1和2、位置2和3、位置3和4、位置20和21以及位置21和22之间的硫代磷酸酯键，以及在位置1处的5'-末端核苷酸，包括4'-磷酸酯类似物，任选地其中5'-末端核苷酸包括5'-甲氧基膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷[甲基膦酸酯-4O-mU]；其中反义链的位置1-20与有义链的位置1-20形成双链体区域，其中有义链的位置21-36形成茎-环，其中位置27-30形成茎-环的环，任选地其中位置27-30包括四环，其中反义链的位置21和22包括突出端，并且其中有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:160和26；
(b)分别为SEQ ID NO:161和28；
(c)分别为SEQ ID NO:162和30；
(d)分别为SEQ ID NO:163和32；
(e)分别为SEQ ID NO:164和34；
(f)分别为SEQ ID NO:165和36；
(g)分别为SEQ ID NO:166和38；
(h)分别为SEQ ID NO:167和40；
(i)分别为SEQ ID NO:168和42；
(j)分别为SEQ ID NO:169和44；
(k)分别为SEQ ID NO:170和46；
(l)分别为SEQ ID NO:171和48；
(m)分别为SEQ ID NO:172和50；
(n)分别为SEQ ID NO:173和52；
(o)分别为SEQ ID NO:174和54；
(p)分别为SEQ ID NO:175和56；
(q)分别为SEQ ID NO:176和58；
(r)分别为SEQ ID NO:177和60；
(s)分别为SEQ ID NO:178和62；
(t)分别为SEQ ID NO:179和64；
(u)分别为SEQ ID NO:180和66；
(v)分别为SEQ ID NO:181和68；
(w)分别为SEQ ID NO:182和70；
(x)分别为SEQ ID NO:183和72；
(y)分别为SEQ ID NO:184和74；
(z)分别为SEQ ID NO:185和76；
(aa)分别为SEQ ID NO:186和78；
(bb)分别为SEQ ID NO:187和80；
(cc)分别为SEQ ID NO:188和82；以及
(dd)分别为SEQ ID NO:189和84。
在一些实施例中，本文提供的用于减少DGAT2表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括：
有义链，所述有义链包括在位置3、8-10、12、13和17处的2'-F修饰的核苷酸、在位置1-2、4-7、11、14-16、18-27和31-36处的2'-OMe修饰的核苷酸、在位置28、29和30处的GalNAc缀合的核苷酸；以及在位置1和位置2之间的硫代磷酸酯键；
反义链，所述反义链包括在位置2、5、7-8、10、12、14、16和19处的2'-F修饰的核苷酸，在位置1、3-4、6、9、11、13、15、17-18和20-22处的2'-OMe、在位置1和2、位置2和3、位置3和4、位置20和21以及位置21和22之间的硫代磷酸酯键，以及在位置1处的5'-末端核苷酸，包括4'-磷酸酯类似物，任选地其中5'-末端核苷酸包括5'-甲氧基膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷[甲基膦酸酯-4O-mU]；其中反义链的位置1-20与有义链的位置1-20形成双链体区域，其中有义链的位置21-36形成茎-环，其中位置27-30形成茎-环的环，任选地其中位置27-30包括四环，其中反义链的位置21和22包括突出端，并且其中有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:190和118；
(b)分别为SEQ ID NO:191和120；
(c)分别为SEQ ID NO:192和122；
(d)分别为SEQ ID NO:193和124；
(e)分别为SEQ ID NO:194和126；
(f)分别为SEQ ID NO:195和128；
(g)分别为SEQ ID NO:196和130；
(h)分别为SEQ ID NO:197和132；
(i)分别为SEQ ID NO:198和134；
(j)分别为SEQ ID NO:199和136；
(k)分别为SEQ ID NO:200和138；
(l)分别为SEQ ID NO:201和140；
(m)分别为SEQ ID NO:202和142；
(n)分别为SEQ ID NO:203和144；
(o)分别为SEQ ID NO:204和146；以及
(p)分别为SEQ ID NO:205和148。
在一些实施例中，本文提供的用于减少ACC表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括：
有义链，所述有义链包括在位置8-11处的2'-F修饰的核苷酸、在位置1-7、12-27和31-36处的2'-OMe修饰的核苷酸、在位置28、29和30处的GalNAc缀合的核苷酸；以及在位置1和位置2之间的硫代磷酸酯键；
反义链，所述反义链包括在位置2-3、5、7、10和14处的2'-F修饰的核苷酸，在位置1、4、6、8-9、11-13和15-22处的2'-OMe、在位置1和2、位置2和3、位置20和21以及位置21和22之间的硫代磷酸酯键，以及在位置1处的5'-末端核苷酸，包括4'-磷酸酯类似物，任选地其中5'-末端核苷酸包括5'-甲氧基膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷[甲基膦酸酯-4O-mU]；其中反义链的位置1-20与有义链的位置1-20形成双链体区域，其中有义链的位置21-36形成茎-环，其中位置27-30形成茎-环的环，任选地其中位置27-30包括四环，其中反义链的位置21和22包括突出端，并且其中有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:160和26；
(b)分别为SEQ ID NO:161和28；
(c)分别为SEQ ID NO:162和30；
(d)分别为SEQ ID NO:163和32；
(e)分别为SEQ ID NO:164和34；
(f)分别为SEQ ID NO:165和36；
(g)分别为SEQ ID NO:166和38；
(h)分别为SEQ ID NO:167和40；
(i)分别为SEQ ID NO:168和42；
(j)分别为SEQ ID NO:169和44；
(k)分别为SEQ ID NO:170和46；
(l)分别为SEQ ID NO:171和48；
(m)分别为SEQ ID NO:172和50；
(n)分别为SEQ ID NO:173和52；
(o)分别为SEQ ID NO:174和54；
(p)分别为SEQ ID NO:175和56；
(q)分别为SEQ ID NO:176和58；
(r)分别为SEQ ID NO:177和60；
(s)分别为SEQ ID NO:178和62；
(t)分别为SEQ ID NO:179和64；
(u)分别为SEQ ID NO:180和66；
(v)分别为SEQ ID NO:181和68；
(w)分别为SEQ ID NO:182和70；
(x)分别为SEQ ID NO:183和72；
(y)分别为SEQ ID NO:184和74；
(z)分别为SEQ ID NO:185和76；
(aa)分别为SEQ ID NO:186和78；
(bb)分别为SEQ ID NO:187和80；
(cc)分别为SEQ ID NO:188和82；以及
(dd)分别为SEQ ID NO:189和84。
在一些实施例中，本文提供的用于减少DGAT2表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括：
有义链，所述有义链包括在位置8-11处的2'-F修饰的核苷酸、在位置1-7、12-27和31-36处的2'-OMe修饰的核苷酸、在位置28、29和30处的GalNAc缀合的核苷酸；以及在位置1和位置2之间的硫代磷酸酯键；
反义链，所述反义链包括在位置2-3、5、7、10和14处的2'-F修饰的核苷酸，在位置1、4、6、8-9、11-13和15-22处的2'-OMe、在位置1和2、位置2和3、位置20和21以及位置21和22之间的硫代磷酸酯键，以及在位置1处的5'-末端核苷酸，包括4'-磷酸酯类似物，任选地其中5'-末端核苷酸包括5'-甲氧基膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷[甲基膦酸酯-4O-mU]；其中反义链的位置1-20与有义链的位置1-20形成双链体区域，其中有义链的位置21-36形成茎-环，其中位置27-30形成茎-环的环，任选地其中位置27-30包括四环，其中反义链的位置21和22包括突出端，并且其中有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:190和118；
(b)分别为SEQ ID NO:191和120；
(c)分别为SEQ ID NO:192和122；
(d)分别为SEQ ID NO:193和124；
(e)分别为SEQ ID NO:194和126；
(f)分别为SEQ ID NO:195和128；
(g)分别为SEQ ID NO:196和130；
(h)分别为SEQ ID NO:197和132；
(i)分别为SEQ ID NO:198和134；
(j)分别为SEQ ID NO:199和136；
(k)分别为SEQ ID NO:200和138；
(l)分别为SEQ ID NO:201和140；
(m)分别为SEQ ID NO:202和142；
(n)分别为SEQ ID NO:203和144；
(o)分别为SEQ ID NO:204和146；以及
(p)分别为SEQ ID NO:205和148。
在一些实施例中，本文提供的用于减少ACC表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括：
有义链，所述有义链包括在位置8-11处的2'-F修饰的核苷酸、在位置1-7、12-27和31-36处的2'-OMe修饰的核苷酸、在位置28、29和30处的GalNAc缀合的核苷酸；以及在位置1和位置2之间的硫代磷酸酯键；
反义链，所述反义链包括在位置2-5、7、10和14处的2'-F修饰的核苷酸，在位置1、6、8-9、11-13和15-22处的2'-OMe、在位置1和2、位置2和3、位置20和21以及位置21和22之间的硫代磷酸酯键，以及在位置1处的5'-末端核苷酸，包括4'-磷酸酯类似物，任选地其中5'-末端核苷酸包括5'-甲氧基膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷[甲基膦酸酯-4O-mU]；其中反义链的位置1-20与有义链的位置1-20形成双链体区域，其中有义链的位置21-36形成茎-环，其中位置27-30形成茎-环的环，任选地其中位置27-30包括四环，其中反义链的位置21和22包括突出端，并且其中有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:160和26；
(b)分别为SEQ ID NO:161和28；
(c)分别为SEQ ID NO:162和30；
(d)分别为SEQ ID NO:163和32；
(e)分别为SEQ ID NO:164和34；
(f)分别为SEQ ID NO:165和36；
(g)分别为SEQ ID NO:166和38；
(h)分别为SEQ ID NO:167和40；
(i)分别为SEQ ID NO:168和42；
(j)分别为SEQ ID NO:169和44；
(k)分别为SEQ ID NO:170和46；
(l)分别为SEQ ID NO:171和48；
(m)分别为SEQ ID NO:172和50；
(n)分别为SEQ ID NO:173和52；
(o)分别为SEQ ID NO:174和54；
(p)分别为SEQ ID NO:175和56；
(q)分别为SEQ ID NO:176和58；
(r)分别为SEQ ID NO:177和60；
(s)分别为SEQ ID NO:178和62；
(t)分别为SEQ ID NO:179和64；
(u)分别为SEQ ID NO:180和66；
(v)分别为SEQ ID NO:181和68；
(w)分别为SEQ ID NO:182和70；
(x)分别为SEQ ID NO:183和72；
(y)分别为SEQ ID NO:184和74；
(z)分别为SEQ ID NO:185和76；
(aa)分别为SEQ ID NO:186和78；
(bb)分别为SEQ ID NO:187和80；
(cc)分别为SEQ ID NO:188和82；以及
(dd)分别为SEQ ID NO:189和84。
在一些实施例中，本文提供的用于减少DGAT2表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包括：
有义链，所述有义链包括在位置8-11处的2'-F修饰的核苷酸、在位置1-7、12-27和31-36处的2'-OMe修饰的核苷酸、在位置28、29和30处的GalNAc缀合的核苷酸；以及在位置1和位置2之间的硫代磷酸酯键；
反义链，所述反义链包括在位置2-5、7、10和14处的2'-F修饰的核苷酸，在位置1、6、8-9、11-13和15-22处的2'-OMe、在位置1和2、位置2和3、位置20和21以及位置21和22之间的硫代磷酸酯键，以及在位置1处的5'-末端核苷酸，包括4'-磷酸酯类似物，任选地其中5'-末端核苷酸包括5'-甲氧基膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷[甲基膦酸酯-4O-mU)；其中反义链的位置1-20与有义链的位置1-20形成双链体区域，其中有义链的位置21-36形成茎-环，其中位置27-30形成茎-环的环，任选地其中位置27-30包括四环，其中反义链的位置21和22包括突出端，并且其中有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:190和118；
(b)分别为SEQ ID NO:191和120；
(c)分别为SEQ ID NO:192和122；
(d)分别为SEQ ID NO:193和124；
(e)分别为SEQ ID NO:194和126；
(f)分别为SEQ ID NO:195和128；
(g)分别为SEQ ID NO:196和130；
(h)分别为SEQ ID NO:197和132；
(i)分别为SEQ ID NO:198和134；
(j)分别为SEQ ID NO:199和136；
(k)分别为SEQ ID NO:200和138；
(l)分别为SEQ ID NO:201和140；
(m)分别为SEQ ID NO:202和142；
(n)分别为SEQ ID NO:203和144；
(o)分别为SEQ ID NO:204和146；以及
(p)分别为SEQ ID NO:205和148。
在一些实施例中，本公开提供了用于减少ACC和/或DGAT2表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其中所述寡核苷酸包括根据以下的有义链和反义链：
有义链：5'-mX-S-mX-fX-mX-mX-mX-mX-fX-fX-fX-mX-fX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3'；
其与以下杂交：
反义链：5'-[甲基膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-mX-S-mX-fX-mX-fX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-S-mX-S-mX-3'；
其中mX＝2'-O-甲基修饰的核苷酸，fX＝2'-氟修饰的核苷酸，-S-＝硫代磷酸酯键，-＝磷酸二酯键、[甲基膦酸酯-4O-mX]＝5'-甲氧基膦酸酯-4-氧基修饰的核苷酸，并且ademA-GalNAc＝与腺嘌呤核苷酸连接的GalNAc。
在一些实施例中，本公开提供了用于减少ACC和/或DGAT2表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其中所述寡核苷酸包括根据以下的有义链和反义链：
有义链：5'-mX-S-mX-mX-mX-mX-mX-mX-fX-fX-fX-fX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-[ademA-GalNAc]-[ade mA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3'；
其与以下杂交：
反义链：5'-[甲基膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-S-mX-S-mX-3'；
其中mX＝2'-O-甲基修饰的核苷酸，fX＝2'-氟修饰的核苷酸，-S-＝硫代磷酸酯键，-＝磷酸二酯键、[甲基膦酸酯-4O-mX]＝5'-甲氧基膦酸酯-4-氧基修饰的核苷酸，并且ademA-GalNAc＝与腺嘌呤核苷酸连接的GalNAc。
在一些实施例中，本公开提供了用于减少ACC和/或DGAT2表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其中所述寡核苷酸包括根据以下的有义链和反义链：
有义链：5'-mX-S-mX-mX-mX-mX-mX-mX-fX-fX-fX-fX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-[ademA-GalNAc]-[ade mA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3'；
其与以下杂交：
反义链：5'-[甲基膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-S-mX-S-mX-3'；
其中mX＝2'-O-甲基修饰的核苷酸，fX＝2'-氟修饰的核苷酸，-S-＝硫代磷酸酯键，-＝磷酸二酯键、[甲基膦酸酯-4O-mX]＝5'-甲氧基膦酸酯-4-氧基修饰的核苷酸，并且ademA-GalNAc＝与腺嘌呤核苷酸连接的GalNAc。
在一些实施例中，本公开提供了用于减少ACC表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其中所述寡核苷酸包括有义链和反义链，所述反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:206和252；
(b)分别为SEQ ID NO:207和253；
(c)分别为SEQ ID NO:208和254；
(d)分别为SEQ ID NO:209和255；
(e)分别为SEQ ID NO:210和256；
(f)分别为SEQ ID NO:211和257；
(g)分别为SEQ ID NO:212和258；
(h)分别为SEQ ID NO:213和259；
(i)分别为SEQ ID NO:214和260；
(j)分别为SEQ ID NO:215和261；
(k)分别为SEQ ID NO:216和262；
(l)分别为SEQ ID NO:217和263；
(m)分别为SEQ ID NO:218和264；
(n)分别为SEQ ID NO:219和265；
(o)分别为SEQ ID NO:220和266；
(p)分别为SEQ ID NO:221和267；
(q)分别为SEQ ID NO:222和268；
(r)分别为SEQ ID NO:223和269；
(s)分别为SEQ ID NO:224和270；
(t)分别为SEQ ID NO:225和271；
(u)分别为SEQ ID NO:226和272；
(v)分别为SEQ ID NO:227和273；
(w)分别为SEQ ID NO:228和274；
(x)分别为SEQ ID NO:229和275；
(y)分别为SEQ ID NO:230和276；
(z)分别为SEQ ID NO:231和277；
(aa)分别为SEQ ID NO:232和278；
(bb)分别为SEQ ID NO:233和279；
(cc)分别为SEQ ID NO:234和280；以及
(dd)分别为SEQ ID NO:235和281。
在一些实施例中，本公开提供了用于减少ACC表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其中所述寡核苷酸包括有义链和反义链，所述反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:208和254；
(b)分别为SEQ ID NO:209和255；以及
(c)分别为SEQ ID NO:215和261。
在一些实施例中，本公开提供了用于减少DGAT2表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其中所述寡核苷酸包括有义链和反义链，所述有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:236和282；
(b)分别为SEQ ID NO:237和283；
(c)分别为SEQ ID NO:238和284；
(d)分别为SEQ ID NO:239和285；
(e)分别为SEQ ID NO:240和286；
(f)分别为SEQ ID NO:241和287；
(g)分别为SEQ ID NO:242和288；
(h)分别为SEQ ID NO:243和289；
(i)分别为SEQ ID NO:244和290；
(j)分别为SEQ ID NO:245和291；
(k)分别为SEQ ID NO:246和292；
(l)分别为SEQ ID NO:247和293；
(m)分别为SEQ ID NO:248和294；
(n)分别为SEQ ID NO:249和295；
(o)分别为SEQ ID NO:250和296；以及
(p)分别为SEQ ID NO:251和297。
在一些实施例中，本公开提供了用于减少DGAT2表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其中所述寡核苷酸包括有义链和反义链，所述有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:246和292；
(b)分别为SEQ ID NO:249和295；
(c)分别为SEQ ID NO:240和286；
(d)分别为SEQ ID NO:237和283；
(e)分别为SEQ ID NO:242和288；以及
(f)分别为SEQ ID NO:236和282。
在一些实施例中，由本公开提供的用于减少ACC表达的ACC靶向寡核苷酸包括有包括如SEQ ID NO:208中所示的核苷酸序列的有义链和包括如SEQ ID NO:254中所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施例中，由本公开提供的用于减少ACC表达的ACC靶向寡核苷酸包括有包括如SEQ ID NO:209中所示的核苷酸序列的有义链和包括如SEQ ID NO:255中所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施例中，由本公开提供的用于减少ACC表达的ACC靶向寡核苷酸包括有包括如SEQ ID NO:215中所示的核苷酸序列的有义链和包括如SEQ ID NO:261中所示的核苷酸序列的反义链。
在一些实施例中，由本公开提供的用于减少DGAT2表达的DGAT2靶向寡核苷酸包括有包括如SEQ ID NO:246中所示的核苷酸序列的有义链和包括如SEQ ID NO:292中所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施例中，由本公开提供的用于减少DGAT2表达的DGAT2靶向寡核苷酸包括有包括如SEQ ID NO:249中所示的核苷酸序列的有义链和包括如SEQ ID NO:295中所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施例中，由本公开提供的用于减少DGAT2表达的DGAT2靶向寡核苷酸包括有包括如SEQ ID NO:240中所示的核苷酸序列的有义链和包括如SEQ ID NO:286中所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施例中，由本公开提供的用于减少DGAT2表达的DGAT2靶向寡核苷酸包括有包括如SEQ ID NO:237中所示的核苷酸序列的有义链和包括如SEQ ID NO:283中所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施例中，由本公开提供的用于减少DGAT2表达的DGAT2靶向寡核苷酸包括有包括如SEQ ID NO:242中所示的核苷酸序列的有义链和包括如SEQ ID NO:288中所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施例中，由本公开提供的用于减少DGAT2表达的DGAT2靶向寡核苷酸包括有包括如SEQ ID NO:236中所示的核苷酸序列的有义链和包括如SEQ ID NO:282中所示的核苷酸序列的反义链。
III.配方
已经开发了各种配方以促进寡核苷酸的使用。例如，可以使用使降解最小化、促进递送和/或摄取、或为配方中的寡核苷酸提供另一种有益性质的配方将寡核苷酸递送至受试者或细胞环境。在一些实施例中，寡核苷酸在缓冲溶液中配制，所述缓冲溶液如磷酸盐缓冲盐水溶液、脂质体、胶束结构和衣壳。
具有阳离子脂质的寡核苷酸的配方可以用于促进寡核苷酸转染到细胞中。例如，可以使用阳离子脂质，例如lipofectin、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如，聚赖氨酸)。合适的脂质包括Oligofectamine、Lipofectamine(Life Technologies)、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals，Inc.,Boulder,Colo.)或FuGene 6(Roche)，其全部可以根据制造商的说明书使用。
因此，在一些实施例中，配方包括脂质纳米颗粒。在一些实施例中，赋形剂包括脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微粒、纳米球或纳米颗粒，或可以以其他方式被配制成用于施用于有此需要的受试者的细胞、组织、器官或身体(参见，例如，《雷明顿：药学的科学与实践(Remington:The SCIENCE和ACTACTICE OF PHARMACE)》，第22版，药物出版社(Pharmaceutical Press)，2013)。
在一些实施例中，本文的配方包括赋形剂。在一些实施例中，赋形剂赋予组合物改进的稳定性、改进的吸收、改进的溶解度和/或活性成分的治疗增强。在一些实施例中，赋形剂是缓冲剂(例如，柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或媒介物(例如缓冲溶液、凡士林、二甲基亚砜或矿物油)。在一些实施例中，将寡核苷酸冻干以用于延长其保质期，然后在使用(例如，施用于受试者)前制成溶液。因此，包括本文所述的寡核苷酸中的任何一种的组合物中的赋形剂可以是淋巴细胞保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)或塌陷温度调节剂(例如葡聚糖、FicollTM或明胶)。
在一些实施例中，药物组合物被配制成与其预期施用途径相容。施用途径的实例包含肠胃外(例如，静脉内、肌内、腹膜内、皮内、皮下)、口服(例如，吸入)、经皮(例如，局部)、经粘膜和直肠施用。
适合可注射使用的药物组合物包含无菌水溶液(其中水溶性)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包含生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(巴斯夫(BASF)，新泽西州帕西帕尼(Passippany,N.J.))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。在许多情况下，将优选的是在组合物中包含等渗剂，例如糖、聚醇，如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。无菌注射溶液可以通过将所需量的寡核苷酸并入到具有上述列举的成分中的一种或组合的选定溶剂中来制备，如果需要，随后过滤灭菌。
在一些实施例中，组合物可以含有至少约0.1％或更多的治疗剂，尽管活性成分的百分比可以是总组合物的重量或体积的约1％至约80％或更多。诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保存期以及其他药理学考虑的因素将被制备此类药物配方领域的技术人员所考虑，因此，多种剂量和治疗方案可能是期望的。
即使若干实施例涉及本文的寡核苷酸中的任何一种的肝靶向的递送，也考虑了其他组织的靶向。
IV.使用方法
i.减少细胞中的ACC和/或DGAT2表达
本公开提供了出于降低ACC和/或DGAT2表达的目的用于将有效量的本文的寡核苷酸中的任何一种接触或递送至细胞或细胞的群体的方法。所述方法可以包含本文描述的步骤，并且这些步骤可以但不一定按照所描述的顺序进行。然而，其他顺序也是可设想的。此外，单独的步骤或多个步骤可以并行和/或在时间上重叠和/或单独地或以多次重复的步骤进行。此外，所述方法可以包含额外的未指定的步骤。
本文的方法可用于任何适当的细胞类型中。在一些实施例中，细胞是表达mRNA的任何细胞(例如，肝细胞、巨噬细胞、单核细胞衍生的细胞、前列腺癌细胞、脑细胞、内分泌组织、骨髓、淋巴结、肺、胆囊、肝、十二指肠、小肠、胰腺、肾、胃肠道、膀胱、脂肪和软组织以及皮肤)。在一些实施例中，细胞是从受试者获得的原代细胞。在一些实施例中，原代细胞已经历有限数量的传代，使得细胞基本上保持了天然的表型性质。在一些实施例中，寡核苷酸递送到的细胞是离体的或体外的(即，可以递送至培养物中的细胞或递送至细胞驻存在其中的生物体)。
在一些实施例中，使用合适的核酸递送方法来递送本文的寡核苷酸，所述方法包含但不限于注射含有寡核苷酸的溶液、用被寡核苷酸覆盖的颗粒轰击、将细胞或细胞的群体暴露于含有寡核苷酸的溶液、或在寡核苷酸的存在下对细胞膜进行电穿孔。可以使用用于将寡核苷酸递送至细胞的其他合适的方法，如脂质介导的载体转运、化学介导的转运和阳离子脂质体转染，如磷酸钙等。
在一些实施例中，ACC和/或DGAT2表达的减少可以通过合适的测定或技术来确定，以评估与ACC和/或DGAT2表达相关的细胞或细胞的群体的一种或多种性质或特征(例如，使用ACC和/或DGAT2表达生物标志物)，或通过评估直接指示ACC和/或DGAT2表达的分子(例如，ACC和/或DGAT2mRNA或ACC和/或DGAT2蛋白)的测定或技术来确定。在一些实施例中，通过将与寡核苷酸接触的细胞或细胞的群体中的ACC和/或DGAT2表达与适当的对照(例如，未与寡核苷酸接触或与对照寡核苷酸接触的适当的细胞或细胞的群体)进行比较，来评估本文的寡核苷酸降低ACC和/或DGAT2表达的程度。在一些实施例中，递送RNAi分子后mRNA表达进入蛋白质的适当对照水平可以是预定的水平或值，使得不需要每次测量对照水平。预定的水平或值可以采取多种形式。在一些实施例中，预定的水平或值可以是单个截止值，如中值或平均值。
在一些实施例中，本文的寡核苷酸的施用导致细胞或细胞的群体中的ACC和/或DGAT2表达的降低。在一些实施例中，当与mRNA的适当对照水平比较时，ACC和/或DGAT2或DGAT表达的降低为约1％或更低、约5％或更低、约10％或更低、约15％或更低、约20％或更低、约25％或更低、约30％或更低、约35％或更低、约40％或更低、约45％或更低、约50％或更低、约55％或更低、约60％或更低、约70％或更低、约80％或更低或约90％或更低。适当的对照水平可以是未与本文的寡核苷酸接触的细胞或细胞的群体中mRNA表达和/或蛋白质翻译的水平。在一些实施例中，在有限期之后评估根据本文的方法将寡核苷酸递送至细胞的效应。例如，在将寡核苷酸引入到细胞中之后至少约8小时、约12小时、约18小时、约24小时；或至少约1、2、3、4、5、6、7或甚至长达14天，可以在细胞中分析mRNA的水平。例如，在一些实施例中，在将寡核苷酸接触或递送至细胞或细胞的群体之后至少约4小时、约8小时、约12小时、约18小时、约24小时；或至少约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约21天、约28天、约35天、约42天、约49天、约56天、约63天、约70天、约77天或约84天或更长时间，在细胞或细胞的群体中确定ACC和/或DGAT2表达。在一些实施例中，在将寡核苷酸接触或递送至细胞或细胞的群体之后至少约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月或更长时间后，在细胞或细胞的群体中确定ACC和/或DGAT2表达。
在一些实施例中，寡核苷酸以转基因的形式递送，所述转基因被工程改造为在细胞中表达寡核苷酸或包括寡核苷酸的链(例如，其有义链和反义链)。在一些实施例中，使用经工程改造以表达本文公开的任何寡核苷酸的转基因递送寡核苷酸。转基因可以使用病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、痘病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒)或非病毒载体(例如，质粒或合成mRNA)递送。在一些实施例中，转基因可以直接注射到受试者。
ii.医疗用途
本公开还提供了治疗受试者(例如，患有与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的人)的用于使用或适于使用的寡核苷酸，所述寡核苷酸将受益于减少ACC和/或DGAT2表达。在一些方面，本公开提供了治疗患有与ACC和/或DGAT2的表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的用于使用或适于使用的寡核苷酸。本公开还提供了在制造用于治疗与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的药物或药物组合物中的用于使用或适于使用的寡核苷酸。在一些实施例中，用于使用或适于使用的寡核苷酸靶向ACC和/或DGAT2mRNA，并且减少ACC和/或DGAT2表达(例如，经由RNAi途径)。在一些实施例中，用于或适于使用的寡核苷酸靶向ACC和/或DGAT2 mRNA，并且减少ACC和/或DGAT2 mRNA或DGAT2 mRNA、ACC和/或DGAT2蛋白和/或ACC和/或DGAT2活性的量或水平。
此外，以下方法可以包含选择患有与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状或易患疾病、病症或病状的受试者。在一些情况下，所述方法可以包含选择具有与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病的标志物的个体，所述疾病如血压升高、胰岛素抵抗、腹部脂肪增加或TG或胆固醇升高或易患所述疾病。
同样地，如下文详述的，该方法还可以包含如下步骤，如测量或获得ACC和/或DGAT2表达的标志物的基线值，然后将这样获得的值与一个或多个其他基线值或在施用寡核苷酸后获得的值进行比较，以评估治疗的有效性。
iii.治疗方法
本公开还提供了用本文的寡核苷酸治疗患有疾病、病症或病状、怀疑患有疾病、病症或病状或处于发展疾病、病症或病状的风险的受试者的方法。在一些方面，本公开提供了使用本文的寡核苷酸治疗或减弱与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的发作或进展的方法。在其他方面，本公开提供了使用本文的寡核苷酸在患有与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者中实现一种或多种治疗益处的方法。在本文方法的一些实施例中，通过施用治疗有效量的本文的寡核苷酸中的任何一种或多种来治疗受试者。在一些实施例中，治疗包括减少ACC和/或DGAT2表达。在一些实施例中，受试者被治疗性地治疗。在一些实施例中，受试者被预防性地治疗。在一些实施例中，受试者已经接受或正在接受用于减少ACC的治疗(例如，ACC靶向寡核苷酸)，并且施用用于减少DGAT2表达的治疗(例如，DGAT2靶向寡核苷酸)。在一些实施例中，受试者已经接受或正在接受用于减少DGAT2的治疗(例如，DGAT2靶向寡核苷酸)，并且施用用于减少ACC表达的治疗(例如，ACC靶向寡核苷酸)。
在本文方法的一些实施例中，将本文的一种或多种寡核苷酸或包括一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用于患有与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者，使得在受试者中减少ACC和/或DGAT2表达，从而治疗受试者。在一些实施例中，在受试者中ACC和/或DGAT2 mRNA的量或水平被降低。在一些实施例中，在受试者中ACC和/或DGAT2和/或蛋白质的量或水平被降低。在一些实施例中，在受试者中ACC和/或DGAT2活性的量或水平被降低。在一些实施例中，受试者的甘油三酯(TG)(例如，一种或多种TG或总TG)的量或水平被降低。在一些实施例中，在受试者中血糖的量或水平被降低。在一些实施例中，在受试者中血压(例如收缩压、舒张压或两者)的量或水平降低。在一些实施例中，在受试者中腹部脂肪的量或水平被降低。在一些实施例中，在受试者中胆固醇的量或水平(例如，总胆固醇、LDL胆固醇和/或HDL胆固醇)被降低。在一些实施例中，在受试者中肝脂肪变性的量或水平被降低。在一些实施例中，在受试者中肝纤维化的量或水平被降低。在一些实施例中，总胆固醇与HDL胆固醇的比率在受试者中改变。在一些实施例中，在受试者中以下各项的任何组合被降低或改变：ACC和/或DGAT2表达、ACC和/或DGAT2 mRNA的量或水平、ACC和/或DGAT2蛋白的量或水平、ACC和/或DGAT2活性的量或水平、血糖的量或水平、腹部脂肪的量或水平，血压的量或水平、TG的量或水平、胆固醇的量或水平和/或总胆固醇与HDL胆固醇的比率、肝脂肪变性的量或水平、和肝纤维化的量或水平。
在本文方法的一些实施例中，将本文的寡核苷酸或包括所述寡核苷酸的药物组合物施用于患有与ACC和/或DGAT2相关联的疾病、病症或病状的受试者，使得当与施用一种或多种寡核苷酸或药物组合物之前的ACC和/或DGAT2表达相比时，ACC和/或DGAT2表达在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施例中，当与未接受一种或多种寡核苷酸或药物组合物或接受一种或多种对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中的ACC和/或DGAT2表达相比时，ACC和/或DGAT2表达在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。
在本文方法的一些实施例中，将本文的一种或多种寡核苷酸或包括所述一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用于患有与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者，使得当与施用所述寡核苷酸或药物组合物之前ACC和/或DGAT2 mRNA的量或水平相比时，在受试者中ACC和/或DGAT2 mRNA的量或水平被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施例中，当与未接受一种或多种寡核苷酸或药物组合物或接受一种或多种对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中ACC和/或DGAT2 mRNA的量或水平相比时，在受试者中ACC和/或DGAT2 mRNA的量或水平被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。
在本文方法的一些实施例中，将本文的一种或多种寡核苷酸或包括所述一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用于患有与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者，使得当与施用所述寡核苷酸或药物组合物之前ACC和/或DGAT2蛋白的量或水平相比时，在受试者中ACC和/或DGAT2蛋白的量或水平被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施例中，当与未接受一种或多种寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、寡核苷酸或药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中ACC和/或DGAT2蛋白的量或水平相比时，在受试者中ACC和/或DGAT2蛋白的量或水平被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。
在本文方法的一些实施例中，将本文的一种或多种寡核苷酸或包括所述一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用于患有与ACC和/或DGAT2相关联的疾病、病症或病状的受试者，使得当与施用所述寡核苷酸或药物组合物之前ACC和/或DGAT2活性的量或水平相比时，在受试者中ACC和/或DGAT2活性/表达的量或水平被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施例中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中ACC和/或DGAT2活性的量或水平相比时，在受试者中ACC和/或DGAT2活性的量或水平被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。
在本文方法的一些实施例中，将本文的寡核苷酸或包括所述寡核苷酸的药物组合物施用于患有与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者，使得当与施用所述寡核苷酸或药物组合物之前的TG的量或水平相比时，在所述受试者中TG的量或水平(例如，一种或多种TG或总TG)被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施例中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中TG的量或水平相比时，在受试者中TG的量或水平被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。
通常，人类患者的正常或期望的TG范围是<150mg/dL血液，其中<100被认为是理想的。在一些实施例中，鉴定或确定选择用于治疗或被治疗的患者具有≥150mg/dL的TG的量或水平。在一些实施例中，鉴定或确定选择用于治疗或被治疗的患者具有的TG的量或水平在150至199mg/dL的范围内，其被视为边界高TG水平。在一些实施例中，鉴定或确定选择用于治疗或被治疗的患者具有的TG的量或水平在200至499mg/dL的范围内，其被视为高TG水平。在一些实施例中，鉴定或确定选择用于治疗或被治疗的患者具有的TG的量或水平在500mg/dL或更高(即，≥500mg/dL)的范围内，其被视为非常高的TG水平。在一些实施例中，鉴定或确定选择用于治疗或被治疗的患者具有≥150mg/dL、≥200mg/dL或≥500mg/dL的TG的量或水平。在一些实施例中，鉴定或确定选择用于治疗或被治疗的患者具有200至499mg/dL、或500mg/dL或更高的TG的量或水平。在一些实施例中，鉴定或确定选择用于治疗或被治疗的患者具有≥200mg/dL的TG的量或水平。在本文方法的一些实施例中，将本文的寡核苷酸或包括所述寡核苷酸的药物组合物施用于患有与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者，使得当与施用所述寡核苷酸或药物组合物之前的胆固醇的量或水平相比时，在所述受试者中胆固醇的量或水平(例如，总胆固醇、LDL胆固醇和/或HDL胆固醇)被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施例中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中胆固醇的量或水平相比时，受试者中胆固醇的量或水平被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。
通常，成人人类患者的正常或期望的胆固醇范围(总胆固醇)是<200mg/dL血液。在一些实施例中，鉴定或确定选择用于治疗或被治疗的患者具有≥200mg/dL的胆固醇的量或水平。在一些实施例中，鉴定或确定选择用于治疗或被治疗的患者具有在200至239mg/dL范围内的胆固醇的量或水平，其被视为边界高胆固醇水平。在一些实施例中，鉴定或确定选择用于治疗或被治疗的患者具有在240mg/dL和更高(即，≥240mg/dL)的范围内的胆固醇的量或水平，其被视为高胆固醇水平。在一些实施例中，鉴定或确定选择用于治疗或被治疗的患者具有200至239mg/dL或240mg/dL或更高的胆固醇的量或水平。在一些实施例中，鉴定或确定选择用于治疗或被治疗的患者具有≥200mg/dL或≥240mg/dL或更高的胆固醇的量或水平。
在本文方法的一些实施例中，将本文的寡核苷酸或包括所述寡核苷酸的药物组合物施用于患有与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者，使得当与施用所述寡核苷酸或药物组合物之前的肝纤维化的量或水平相比时，在所述受试者中肝纤维化的量或水平被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施例中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)的肝纤维化的量或水平相比时，在受试者中肝纤维化的量或水平被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。
在本文方法的一些实施例中，将本文的寡核苷酸或包括所述寡核苷酸的药物组合物施用于患有与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者，使得当与施用所述寡核苷酸或药物组合物之前的肝脂肪变性的量或水平相比时，在所述受试者中肝脂肪变性的量或水平被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施例中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中肝脂肪变性的量或水平相比时，受试者中肝脂肪变性的量或水平被降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。
用于确定受试者或来自受试者的样本中的ACC和/或DGAT2表达、ACC和/或DGAT2mRNA的量或水平、ACC和/或DGAT2蛋白、ACC和/或DGAT2活性、TG、血浆葡萄糖或胆固醇量或活性的合适方法是本领域已知的。此外，本文阐述的实例说明用于确定ACC和/或DGAT2表达的方法。
在一些实施例中，在细胞(例如，肝细胞)、细胞的群体或细胞的组(例如，类器官)、器官(例如，肝)、血液或其部分(例如，血浆)、组织(例如，肝组织)、样本(例如，肝活检样本)或从受试者获得或分离的任何其他合适的生物材料中，ACC和/或DGAT2表达、ACC和/或DGAT2 mRNA、ACC和/或DGAT2蛋白的量或水平、ACC和/或DGAT2活性、TG、血浆葡萄糖或胆固醇被减少。在一些实施例中，ACC和/或DGAT2表达、ACC和/或DGAT2 mRNA、ACC和/或DGAT2蛋白的量或水平、ACC和/或DGAT2活性、TG、血浆葡萄糖或胆固醇或其任何组合在多于一种类型的细胞(例如，肝细胞和一种或多种其他类型的细胞)、多于一组细胞、多于一种器官(例如，肝脏和一种或多种其他器官)、多于一种血液级分(例如，血浆和一种或多种其他血液级分)、多于一种类型的组织(例如，肝组织和一种或多种其他类型的组织)、或多于一种类型的样本(例如，肝活检样本和一种或多种其他类型的活检样本)。
与ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的实例包含但不限于代谢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、药物诱导的肝病、酒精诱导的肝病、传染性病原体诱导的肝病、炎性肝病、免疫系统功能障碍介导的肝病、血脂异常、心血管疾病、再狭窄、综合征X、代谢综合征、糖尿病、肥胖、高血压、慢性胆管疾病，如原发性硬化胆管炎(PSC)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、胆道闭锁、进行性家族性肝内胆汁淤积3型(PFIC3)、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肝癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胃癌、结肠直肠癌、代谢性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、NAFLD诱导的纤维化或肝硬化、NASH诱导的纤维化或肝硬化、酒精诱导的肝纤维化或肝硬化、药物诱导的肝纤维化或肝硬化、传染性病原体诱导的肝纤维化或肝硬化、寄生虫感染诱导的肝纤维化或肝硬化、细菌感染诱导的肝纤维化或肝硬化、病毒感染诱导的纤维化或肝硬化、HBV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HCV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、双重HCV和HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、放射诱导的或化疗诱导的纤维化或肝硬化、胆道纤维化、由于任何慢性胆汁淤积性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、任何病因的肠纤维化、克罗恩氏病诱导的纤维化、溃疡性结肠炎诱导的纤维化、肠(例如小肠)纤维化、结肠纤维化、胃纤维化、肺纤维化、继慢性炎性气道疾病之后的肺纤维化，如COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者的肺、结核病、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、以及其他与ACC和/或DGAT2相关联的代谢相关病症和疾病。本文特别感兴趣的是代谢综合征、高甘油三酯血症、NASH、肥胖或其组合。本文特别感兴趣的是代谢综合征、高甘油三酯血症、NASH、肥胖或其组合。
由于其高特异性，本文的寡核苷酸特异性地靶向患病的细胞和组织的靶基因的mRNA。在预防疾病时，靶基因可以是引发或维持疾病所需的或者已被鉴定为与感染疾病的较高风险相关联的基因。在治疗疾病时，可以使寡核苷酸与表现出疾病的细胞或组织接触。例如，可以将和与ACC和/或DGAT2表达相关联的病症或病状相关联的野生型(即，初始的)或突变的基因的全部或部分基本上相同的寡核苷酸与如肝细胞或其他肝细胞等的感兴趣的细胞或组织类型接触或引入到所述细胞或组织类型中。
在一些实施例中，ACC和/或DGAT基因可以是来自任何哺乳动物如人类靶标的ACC和/或DGAT基因。可以根据本文所述的方法沉默任何ACC和/或DGAT基因。
本文所述的方法通常涉及以有效量的一种或多种寡核苷酸，即能够产生期望的治疗结果的量施用于受试者。治疗上可接受的量可以是可以在治疗上治疗疾病或病症的量。对于任一者受试者来说，适当的剂量将取决于某些因素，包含受试者的大小、体表面积、年龄、待施用的特定组合物、组合物中的活性成分、施用时间和途径、一般健康和同时施用的其他药物。
在一些实施例中，通过肠内(例如，口服、通过胃饲管、通过十二指肠饲管、经由胃造口术或直肠)、胃肠外(例如，皮下注射、静脉内注射或输注、动脉内注射或输注、骨内输注、肌内注射、脑内注射、脑室内注射、鞘内)、局部(例如，经皮、吸入、经由滴眼剂或穿过粘膜)或通过直接注射到靶器官(例如，受试者的肝脏)，向受试者施用本文的组合物中的任何一种。通常，本文的寡核苷酸被静脉内或皮下施用。
作为一组非限制性实例，本文的寡核苷酸通常每季度(每三个月一次)、每两个月(每两个月一次)、每月或每周施用。例如，寡核苷酸可以每周或以两周或三周的间隔施用。可替代地，寡核苷酸可以每天施用。在一些实施例中，向受试者施用一个或多个负荷剂量的寡核苷酸，随后施用一个或多个维持剂量的寡核苷酸。
在一些实施例中，本文的寡核苷酸被单独或组合施用。在一些实施例中，本文的寡核苷酸同时、依次(以任何顺序)或间歇地组合施用。例如，两种寡核苷酸可以同时共施用。可替代地，可以施用一种寡核苷酸，并且随后在任意时间(例如一小时、一天、一周或一个月)施用第二寡核苷酸。
在一些实施例中，待治疗的受试者是人或非人灵长类动物或其他哺乳动物受试者。其他示例性的受试者包含驯养动物，如犬和猫；家畜，如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；和动物如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
V.试剂盒
在一些实施例中，本公开提供了一种包括本文的寡核苷酸和使用说明书的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包括本文的寡核苷酸，以及包含试剂盒和/或其任何组分的使用说明书的包装插页。在一些实施例中，试剂盒在合适的容器中包括本文的寡核苷酸、一种或多种对照以及本领域熟知的各种缓冲剂、试剂、酶和其他标准成分。在一些实施例中，容器包括将寡核苷酸置于其中的至少一个小瓶、孔、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，并且在一些情况下适当地等分。在其中提供额外组分的一些实施例中，试剂盒含有将此组分置于其中的额外容器。所述试剂盒还可以包含用于将所述寡核苷酸和任何其他试剂密闭容纳以进行商业销售的装置。此类容器可以包含将期望的小瓶保留在其中的注射或吹塑模制的塑料容器。容器和/或试剂盒可以包含带有使用说明书和/或警告的标签。
在一些实施例中，试剂盒包括本文的寡核苷酸和药学上可接受的载体，或包括寡核苷酸的药物组合物和用于治疗或延迟与有此需要的受试者的ACC和/或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的进展的说明书。
VI.其他实施例
本公开涉及以下实施例。在整个本节中，术语实施例被缩写为“E”，随后为序值。例如，E1等同于实施例1。
E1.一种用于减少ACC表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括反义链，所述反义链包括如SEQ ID NOs:2、30、32、44和56中的任一者所示序列。
E2.根据实施例1所述的寡核苷酸，其包括有义链，所述有义链包括如SEQ ID NO:1、29、31、43和55中的任一者所示序列。
E3.一种用于减少ACC表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括长度15至30个核苷酸的反义链和长度15至40个核苷酸的有义链，其中所述反义链具有与ACC的靶序列的互补性区域，并且其中所述互补性区域的长度为至少15个连续核苷酸。
E4.根据实施例3所述的寡核苷酸，其中所述互补性区域与ACC的靶序列完全互补。
E5.根据实施例1至4中任一者所述的寡核苷酸，其中所述反义链的长度为19至27个核苷酸。
E6.根据实施例1至5中任一者所述的寡核苷酸，其中所述反义链的长度为21至27个核苷酸，任选地其中所述反义链的长度为22个核苷酸。
E7.根据实施例2至6中任一者所述的寡核苷酸，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域。
E8.根据实施例7所述的寡核苷酸，其中所述有义链的长度为19至40个核苷酸，任选地其中所述有义链的长度为36个核苷酸。
E9.根据实施例7或8所述的寡核苷酸，其中所述双链体区域的长度为至少19个核苷酸。
E10.根据实施例7至9中任一者所述的寡核苷酸，其中所述双链体区域的长度为至少21个核苷酸，任选地其中所述双链体区域的长度为20个核苷酸。
E11.根据实施例3至10中任一者所述的寡核苷酸，其中与ACC的互补性区域的长度为至少19个连续核苷酸。
E12.根据实施例3至11中任一者所述的寡核苷酸，其中与ACC的互补性区域的长度为至少21个连续核苷酸。
E13.根据实施例3至12中任一者所述的寡核苷酸，其中所述反义链包括如SEQ IDNO:2、30、32、44和56中的任一者中所示的序列。
E14.根据实施例3至13中任一者所述的寡核苷酸，其中所述有义链包括如SEQ IDNO:1、29、31、43和55中的任一者中所示的序列。
E15.根据实施例3至14中任一者所述的寡核苷酸，其中所述有义链在其3'端包括被示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度3至5个核苷酸的环。
E16.一种用于减少ACC表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括反义链和有义链，其中所述反义链的长度为21至27个核苷酸，并且具有与ACC的互补性区域，其中所述有义链在其3'端处包括被示为S1-L-S2的茎-环、其中S1与S2互补，并且其中L在S1和S2之间形成长度3至5个核苷酸的环，并且其中所述反义链和所述有义链形成长度至少19个核苷酸的双链体结构，但不共价连接。
E17.根据实施例16所述的寡核苷酸，其中所述互补性区域与ACC mRNA的至少19个连续核苷酸完全互补。
E18.根据实施例15至17中任一者所述的寡核苷酸，其中L为四环。
E19.根据实施例15至18中任一者所述的寡核苷酸，其中L长度为4个核苷酸。
E20.根据实施例15至19中任一者所述的寡核苷酸，其中L包括阐述为GAAA的序列。
E21.根据实施例3至20中任一者所述的寡核苷酸，其中所述反义链的长度为27个核苷酸，并且所述有义链的长度为25个核苷酸，任选地其中所述反义链的长度为22个核苷酸，并且所述有义链的长度为36个核苷酸。
E22.根据实施例21所述的寡核苷酸，其中所述反义链和有义链形成长度25个核苷酸的双链体区域，任选地其中所述双链体的长度为20个核苷酸。
E23.根据实施例16至20中任一者所述的寡核苷酸，其包括长度2个核苷酸的反义链上的3'突出端序列。
E24.根据实施例7至16中任一者所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括长度各自在21至23个核苷酸的范围内的反义链和有义链。
E25.根据实施例24所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括长度在19至21个核苷酸的范围内的双链体结构。
E26.根据实施例24或25所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括长度为一个或多个核苷酸的3'突出端序列，其中所述3'突出端序列存在于反义链、有义链或反义链和有义链上。
E27.根据实施例24或25所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括长度2个核苷酸的3′突出端序列，其中所述3′突出端序列在所述反义链上，并且其中所述有义链长度为21个核苷酸，并且所述反义链长度为23个核苷酸，使得所述有义链和反义链形成长度21个核苷酸的双链体。
E28.根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个经修饰的核苷酸。
E29.根据实施例28所述的寡核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸包括2'-修饰。
E30.根据实施例29所述的寡核苷酸，其中所述2'-修饰是选自2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸的修饰。
E31.根据实施例28至30中任一者所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸都是经修饰的。
E32.根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个经修饰的核苷酸间键。
E33.根据实施例32所述的寡核苷酸，其中所述至少一个经修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
E34.根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包括磷酸酯类似物。
E35.根据实施例34所述的寡核苷酸，其中所述磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。
E36.根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一个核苷酸与一种或多种靶向配体缀合。
E37.根据实施例36所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包括碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质。
E38.根据实施例36所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包括大小范围为C10至C24长的饱和脂肪酸部分。
E39.根据实施例38所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包括长度为C16的饱和脂肪酸部分。
E40.根据实施例38所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包括长度为C24的饱和脂肪酸部分。
E41.根据实施例36所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
E42.根据实施例41所述的寡核苷酸，其中所述GalNAc部分是单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。
E43.根据实施例15至20中任一者所述的寡核苷酸，其中所述茎-环的L的高达4个核苷酸各自与单价GalNAc部分缀合。
E44.根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是RNAi寡核苷酸。
E45.一种药物组合物，其包括根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸和药学上可接受的载体、递送剂或赋形剂。
E46.一种用于减少DGAT2表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括反义链，所述反义链包括如SEQ ID NO:106、108、112、126、130和138中的任一者中所示的序列。
E47.根据实施例46所述的寡核苷酸，其包括有义链，所述有义链包括如SEQ IDNO:105、107、111、125、129和137中的任一者中所示的序列。
E48.一种用于减少DGAT2表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括长度15至30个核苷酸的反义链和长度15至40个核苷酸的有义链，其中所述反义链具有与DGAT2的靶序列的互补性区域，并且其中所述互补性区域长度为至少15个连续核苷酸。
E49.根据实施例48所述的寡核苷酸，其中所述互补性区域与DGAT2的靶序列完全互补。
E50.根据实施例46至49中任一者所述的寡核苷酸，其中所述反义链的长度为19至27个核苷酸。
E51.根据实施例46至50中任一者所述的寡核苷酸，其中所述反义链的长度为21至27个核苷酸，任选地其中所述反义链的长度为22个核苷酸。
E52.根据实施例47至51中任一者所述的寡核苷酸，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域。
E53.根据实施例52所述的寡核苷酸，其中所述有义链的长度为19至40个核苷酸，任选地其中所述有义链的长度为36个核苷酸。
E54.根据实施例52或53所述的寡核苷酸，其中所述双链体区域长度为至少19个核苷酸。
E55.根据实施例52至54中任一者所述的寡核苷酸，其中所述双链体区域长度为至少21个核苷酸，任选地其中所述双链体区域长度为20个核苷酸。
E56.根据实施例48至55中任一者所述的寡核苷酸，其中与ACC的互补性区域长度为至少19个连续核苷酸。
E57.根据实施例48至56中任一者所述的寡核苷酸，其中与DGAT2的互补性区域长度为至少21个连续核苷酸。
E58.根据实施例48至57中任一者所述的寡核苷酸，其中所述反义链包括如SEQ IDNO:106、108、112、126、130和138中的任一者中所述阐述的序列。
E59.根据实施例48至58中任一者所述的寡核苷酸，其中所述有义链包括如SEQ IDNO:105、107、111、125、129和137中的任一者中所述阐述的序列。
E60.根据实施例48至59中任一者所述的寡核苷酸，其中所述有义链在其3'端包括被示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度3至5个核苷酸的环。
E61.一种用于减少DGAT2表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括反义链和有义链，其中所述反义链长度为21至27个核苷酸，并且具有与DGAT2的互补性区域，其中所述有义链在其3'端处包括被示为S1-L-S2的茎-环：其中S1与S2互补，并且其中L在S1和S2之间形成长度3至5个核苷酸的环，并且其中所述反义链和所述有义链形成长度至少19个核苷酸的双链体结构，但不共价连接。
E62.根据实施例61所述的寡核苷酸，其中所述互补性区域与DGAT2mRNA的至少19个连续核苷酸完全互补。
E63.根据实施例60至62中任一者所述的寡核苷酸，其中L为四环。
E64.根据实施例60至63中任一者所述的寡核苷酸，其中L长度为4个核苷酸。
E65.根据实施例60至64中任一者所述的寡核苷酸，其中L包括阐述为GAAA的序列。
E66.根据实施例46至65中任一者所述的寡核苷酸，其中所述反义链的长度为27个核苷酸，并且所述有义链的长度为25个核苷酸，任选地其中所述反义链的长度为22个核苷酸，并且所述有义链的长度为36个核苷酸。
E67.根据实施例66所述的寡核苷酸，其中所述反义链和有义链形成长度25个核苷酸的双链体区域，任选地其中所述双链体长度为20个核苷酸。
E68.根据实施例48至65中任一者所述的寡核苷酸，其包括长度2个核苷酸的反义链上的3'突出端序列。
E69.根据实施例52至61中任一者所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括反义链和有义链，所述反义链和有义链的长度各自在21至23个核苷酸的范围内。
E70.根据实施例69所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括长度在19至21个核苷酸的范围内的双链体结构。
E71.根据实施例69或70所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括长度为一个或多个核苷酸的3'突出端序列，其中所述3'突出端序列存在于反义链、有义链或反义链和有义链上。
E72.根据实施例69或70所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括长度2个核苷酸的3'-突出端序列，其中所述3'-突出端序列在所述反义链上，并且其中所述有义链长度为21个核苷酸，并且所述反义链长度为23个核苷酸，使得所述有义链和反义链形成长度21个核苷酸的双链体。
E73.根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个经修饰的核苷酸。
E74.根据实施例73所述的寡核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸包括2'-修饰。
E75.根据实施例74所述的寡核苷酸，其中所述2'-修饰是选自2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸的修饰。
E76.根据实施例73至75中任一者所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸都是经修饰的。
E77.根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个经修饰的核苷酸间键。
E78.根据实施例77所述的寡核苷酸，其中所述至少一个经修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
E79.根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包括磷酸酯类似物。
E80.根据实施例79所述的寡核苷酸，其中所述磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。
E81.根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一个核苷酸与一种或多种靶向配体缀合。
E82.根据实施例81所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包括碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质。
E83.根据实施例82所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包括大小范围为C10至C24长的饱和脂肪酸部分。
E84.根据实施例83所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包括C16饱和脂肪酸部分。
E85.根据实施例83所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包括C22饱和脂肪酸部分。
E86.根据实施例82所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
E87.根据实施例86所述的寡核苷酸，其中所述GalNAc部分是单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。
E88.根据实施例60至65中任一者所述的寡核苷酸，其中所述茎-环的L的高达4个核苷酸各自与单价GalNAc部分缀合。
E89.根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是RNAi寡核苷酸。
E90.一种药物组合物，其包括根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸和药学上可接受的载体、递送剂或赋形剂。
E91.一种药物组合物，其包括至少第一治疗剂和第二治疗剂，其中所述第一治疗剂是ACC的抑制剂，并且其中所述第二治疗剂是DGAT2表达的抑制剂。
E92.一种药物组合物，其包括至少第一治疗剂和第二治疗剂，其中所述第一治疗剂是寡核苷酸并且是ACC表达的抑制剂，并且其中所述第二治疗剂是DGAT2表达的抑制剂。
E93.一种药物组合物，其包括至少第一治疗剂和第二治疗剂，其中所述第一治疗剂是ACC表达的抑制剂，并且其中所述第二治疗剂是寡核苷酸并且是DGAT2表达的抑制剂。
E94.一种药物组合物，其包括至少第一治疗剂和第二治疗剂，其中所述第一治疗剂是选自实施例1至45中任一者所述的寡核苷酸并且是ACC表达的抑制剂，并且其中所述第二治疗剂是选自实施例46至89中任一者所述的寡核苷酸并且是DGAT表达的抑制剂。
E95.一种组合产品，其包括：(i)具有如SEQ ID NO:2、30、32、44和56中的任一者中所示的反义链的ACC抑制寡核苷酸；和(ii)如SEQ ID NO:1、29、31、43和55中任一者所示有义链，以及(iii)用如SEQ ID NO:106、108、112、126、130、138中的任一者中所示的反义链的DGAT抑制；和(iv)如SEQ ID NO:105、107、111、125、129和137中的任一者中所示的有义链。
E96.根据实施例95所述的组合产品，其中组分(i)是包括长度15至30个核苷酸的反义链的寡核苷酸，并且其中组分(ii)是长度15至40个核苷酸的有义链，并且是ACC表达的抑制剂，并且其中组分(iii)是包括长度15至30个核苷酸的反义链的寡核苷酸，并且其中组分(iv)是长度15至40个核苷酸的有义链并且是DGAT2表达的抑制剂。根据实施例97所述的组合产品，其中所述组合产品是包括组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)及其药学上可接受的盐的组合物。
E97.根据实施例95或96所述的组合产品，其中组分(i)和(ii)被配制成可注射悬浮液、凝胶、油、丸剂、片剂、栓剂、粉末、胶囊、气溶胶、软膏、乳膏、贴剂或用于延长和/或缓慢释放的盖仑形式的手段。
E98.根据实施例94至96中任一者所述的组合产品，其用于治疗炎性、代谢性、纤维化或胆汁淤积性疾病。
E99.根据实施例98所述的用于使用的组合产品，其中所述疾病选自由以下组成的群组：所述疾病选自由以下组成的群组：代谢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、药物诱导的肝病、酒精诱导的肝病、传染性病原体诱导的肝病、炎性肝病、免疫系统功能障碍介导的肝病、血脂异常、心血管疾病、再狭窄、综合征X、代谢综合征、糖尿病、肥胖、高血压、慢性胆管疾病，如原发性硬化胆管炎(PSC)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、胆道闭锁、进行性家族性肝内胆汁淤积3型(PFIC3)、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肝癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胃癌、结肠直肠癌、代谢性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、NAFLD诱导的纤维化或肝硬化、NASH诱导的纤维化或肝硬化、酒精诱导的肝纤维化或肝硬化、药物诱导的肝纤维化或肝硬化、传染性病原体诱导的肝纤维化或肝硬化、寄生虫感染诱导的肝纤维化或肝硬化、细菌感染诱导的肝纤维化或肝硬化、病毒感染诱导的纤维化或肝硬化、HBV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HCV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、双重HCV和HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、放射诱导的或化疗诱导的纤维化或肝硬化、胆道纤维化、由于任何慢性胆汁淤积性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、任何病因的肠纤维化、克罗恩氏病诱导的纤维化、溃疡性结肠炎诱导的纤维化、肠(例如小肠)纤维化、结肠纤维化、胃纤维化、肺纤维化、继慢性炎性气道疾病之后的肺纤维化，如COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者的肺、结核病、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)。
E100.一种向受试者递送寡核苷酸的方法，所述方法包括向受试者施用选自实施例95至99中任一者所述的药物组合物。
E101.一种用于减少细胞、细胞的群体或受试者中的ACC表达的方法，所述方法包括以下步骤：使细胞或细胞的群体与根据实施例1至44中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例45所述的药物组合物接触；或向所述受试者施用根据实施例1至44中任一者所述的寡核苷酸，或根据实施例45所述的药物组合物。
E102.根据实施例101所述的方法，其中减少ACC表达包括减少ACC mRNA的量或水平、ACC蛋白的量或水平或两者。
E103.根据实施例101或102所述的方法，其中所述受试者患有与ACC表达相关联的疾病、病症或病状。
E104.一种用于治疗患有与ACC表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施例1至44中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例45所述的药物组合物，从而治疗所述受试者。
E105.一种用于在受试者中降低肝纤维化的量或水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施例1至44中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例45所述的药物组合物。
E106.一种用于治疗患有与ACC表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施例1至44中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例45所述的药物组合物，从而治疗所述受试者，其中所述治疗有效量是0.03、0.075、0.15、0.3、0.75、1.5、3、6、12、24、60、120或600mg/kg。
E107.一种用于治疗患有与ACC表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施例1至44中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例45所述的药物组合物，从而治疗所述受试者，其中所述治疗有效量是1.5、3、6或12mg/kg。
E108.一种用于治疗患有与ACC表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的寡核苷酸或其药物组合物，从而治疗所述受试者，所述寡核苷酸包括(i)选自SEQ ID No:1、29、31、43和55的有义链和(ii)选自SEQ IDNo:2、30、32、44和56的反义链。
E109.根据实施例103至108中任一者的方法，其中与ACC表达相关联的疾病、病症或病状选自由以下组成的群组：代谢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、药物诱导的肝病、酒精诱导的肝病、传染性病原体诱导的肝病、炎性肝病、免疫系统功能障碍介导的肝病、血脂异常、心血管疾病、再狭窄、综合征X、代谢综合征、糖尿病、肥胖、高血压、慢性胆管疾病，如原发性硬化胆管炎(PSC)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、胆道闭锁、
进行性家族性肝内胆汁淤积3型(PFIC3)、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肝癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胃癌、结肠直肠癌、代谢性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、NAFLD诱导的纤维化或肝硬化、NASH诱导的纤维化或肝硬化、酒精诱导的肝纤维化或肝硬化、药物诱导的肝纤维化或肝硬化、传染性病原体诱导的肝纤维化或肝硬化、寄生虫感染诱导的肝纤维化或肝硬化、细菌感染诱导的肝纤维化或肝硬化、病毒感染诱导的纤维化或肝硬化、HBV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HCV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、双重HCV和HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、放射诱导的或化疗诱导的纤维化或肝硬化、胆道纤维化、由于任何慢性胆汁淤积性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、任何病因的肠纤维化、克罗恩氏病诱导的纤维化、溃疡性结肠炎诱导的纤维化、肠(例如小肠)纤维化、结肠纤维化、胃纤维化、肺纤维化、继慢性炎性气道疾病之后的肺纤维化，如COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者的肺、结核病、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)。
E110.根据实施例109所述的方法，其中与ACC表达相关联的疾病、病症或病状是代谢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NASD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
E111.根据实施例103至110中任一者所述的方法，其中与ACC表达相关联的疾病、病症或病状是或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
E112.根据实施例103至110中任一者所述的方法，其中所述寡核苷酸或药物组合物与第二组合物或治疗剂组合施用。
E113.根据实施例1至44中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例45所述的药物组合物在制造用于治疗与ACC表达相关联的疾病、病症或病状的药物中的用途。
E114.根据实施例1至44中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例45所述的药物组合物，其用于或适于用于治疗与ACC表达相关联的疾病、病症或病状。
E115.一种试剂盒，其包括根据实施例1至44中任一者所述的寡核苷酸、任选的药学上可接受的载体，以及包括施用于患有与ACC表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的说明书的包装插页。
E116.根据实施例114所述的寡核苷酸的用途或根据实施例115所述的试剂盒的用途，其中与ACC表达相关联的疾病、病症或病状选自由以下组成的群组：代谢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、药物诱导的肝病、酒精诱导的肝病、传染性病原体诱导的肝病、炎性肝病、免疫系统功能障碍介导的肝病、血脂异常、心血管疾病、再狭窄、综合征X、代谢综合征、糖尿病、肥胖、高血压、慢性胆管疾病，如原发性硬化胆管炎(PSC)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、胆道闭锁、进行性家族性肝内胆汁淤积3型(PFIC3)、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肝癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胃癌、结肠直肠癌、代谢性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、NAFLD诱导的纤维化或肝硬化、NASH诱导的纤维化或肝硬化、酒精诱导的肝纤维化或肝硬化、药物诱导的肝纤维化或肝硬化、传染性病原体诱导的肝纤维化或肝硬化、寄生虫感染诱导的肝纤维化或肝硬化、细菌感染诱导的肝纤维化或肝硬化、病毒感染诱导的纤维化或肝硬化、HBV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HCV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、双重HCV和HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、放射诱导的或化疗诱导的纤维化或肝硬化、胆道纤维化、由于任何慢性胆汁淤积性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、任何病因的肠纤维化、克罗恩氏病诱导的纤维化、溃疡性结肠炎诱导的纤维化、肠(例如小肠)纤维化、结肠纤维化、胃纤维化、肺纤维化、继慢性炎性气道疾病之后的肺纤维化，如COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者的肺、结核病、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)。
E117.根据实施例114所述的寡核苷酸的用途或根据实施例115所述的试剂盒的用途，其中与ACC表达相关联的疾病、病症或病状是心血管疾病、II型糖尿病、高甘油三酯血症、NASH、肥胖或其组合。
E118.一种用于在细胞、细胞的群体或受试者中减少DGAT2表达的方法，所述方法包括以下步骤：使所述细胞或细胞的群体与根据实施例46至88中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例89所述的药物组合物接触；或向所述受试者施用根据实施例46至88中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例89所述的药物组合物。
E119.根据实施例118所述的方法，其中减少DGAT2表达包括减少DGAT2 mRNA的量或水平、DGAT2蛋白的量或水平或两者。
E120.根据实施例118或119中任一者所述的方法，其中所述受试者患有与DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状。
E121.一种用于治疗患有与DGAT2表达相关的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施例46至89中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例90所述的药物组合物，从而治疗所述受试者。
E122.一种用于在受试者中降低肝纤维化的量或水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施例46至89中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例90所述的药物组合物。
E123.一种用于治疗患有与DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施例46至89中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例90所述的药物组合物，从而治疗所述受试者，其中所述治疗有效量是0.03、0.075、0.15、0.3、0.75、1.5、3、6、12、24、60、120或600mg/kg。
E124.一种用于治疗患有与DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施例46至89中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例90所述的药物组合物，从而治疗所述受试者，其中所述治疗有效量是1.5、3、6或12mg/kg。
E125.一种用于治疗患有与DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的寡核苷酸或其药物组合物，从而治疗所述受试者，所述寡核苷酸包括(i)选自SEQ ID NO:105、107、111、125、129和137的有义链，和(ii)选自SEQ ID NO:106、108、112、126、130和138的反义链。
E126.根据实施例118至125中任一者所述的方法，其中与DGAT2表达相关联的所述疾病、病症或病状选自由以下组成的群组：代谢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、药物诱导的肝病、酒精诱导的肝病、传染性病原体诱导的肝病、炎性肝病、免疫系统功能障碍介导的肝病、血脂异常、心血管疾病、再狭窄、综合征X、代谢综合征、糖尿病、肥胖、高血压、慢性胆管疾病，如原发性硬化胆管炎(PSC)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、胆道闭锁、进行性家族性肝内胆汁淤积3型(PFIC3)、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肝癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胃癌、结肠直肠癌、代谢性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、NAFLD诱导的纤维化或肝硬化、NASH诱导的纤维化或肝硬化、酒精诱导的肝纤维化或肝硬化、药物诱导的肝纤维化或肝硬化、传染性病原体诱导的肝纤维化或肝硬化、寄生虫感染诱导的肝纤维化或肝硬化、细菌感染诱导的肝纤维化或肝硬化、病毒感染诱导的纤维化或肝硬化、HBV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HCV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、双重HCV和HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、放射诱导的或化疗诱导的纤维化或肝硬化、胆道纤维化、由于任何慢性胆汁淤积性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、任何病因的肠纤维化、克罗恩氏病诱导的纤维化、溃疡性结肠炎诱导的纤维化、肠(例如小肠)纤维化、结肠纤维化、胃纤维化、肺纤维化、继慢性炎性气道疾病之后的肺纤维化，如COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者的肺、结核病、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)。
E127.根据实施例126所述的方法，其中与DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状是代谢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NASD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
E128.根据实施例120至127中任一者所述的方法，其中与DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状是或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
E129.根据实施例120至128中任一者所述的方法，其中所述寡核苷酸或药物组合物与第二组合物或治疗剂组合施用。
E130.根据实施例46至89中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例90所述的药物组合物在制造用于治疗与DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的药物中的用途。
E131.根据实施例46至89中任一者所述的寡核苷酸或根据实施例90所述的药物组合物，其用于或适于用于治疗与DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状。
E132.一种试剂盒，其包括根据实施例46至89中任一者所述的寡核苷酸、任选的药学上可接受的载体和包括施用于患有与DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的说明书的包装插页。
E133.根据实施例131所述的寡核苷酸的用途或根据实施例132所述的试剂盒，其中与DGAT2表达相关联的所述疾病、病症或病状选自由以下组成的群组：高甘油三酯血症、肥胖、高脂血症、异常脂质和/或胆固醇代谢、动脉粥样硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病、纯合子和杂合子家族性高胆固醇血症和他汀类药物抗性高胆固醇血症。
E134.根据实施例131所述的寡核苷酸或药物组合物的用于使用的用途或根据实施例132所述的试剂盒，其中与DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状是心血管疾病、II型糖尿病、高甘油三酯血症、NASH、肥胖或其组合。
E135.一种用于在细胞、细胞的群体或受试者中减少ACC或DGAT2表达的方法，所述方法由以下组成：向所述受试者共同施用第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，每种寡核苷酸包括长度15-30个核苷酸的有义序列和长度15-30个核苷酸的互补反义序列，其中所述第一寡核苷酸是ACC的抑制剂，并且所述第二寡核苷酸是DGAT2的抑制剂。
E136.一种用于治疗患有与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者共同施用治疗有效量的两种寡核苷酸，从而治疗受试者，每种寡核苷酸包括长度15至50个核苷酸的有义链和长度15至30个核苷酸的反义链，其中所述第一有义链包括如SEQ ID Nos 1、29、31、43、55、105、107、111、125、129和137中的任一者中所示的序列，并且其中所述第一反义链包括选自SEQ ID NO:2、30、32、44、56、106、108、112、126、130和138的互补序列，并且所述第二有义链包括如SEQ ID NO:1、29、31、43、55、105、107、111、125、129和137中的任一者中所示的序列，并且其中所述第二反义链包括选自SEQ ID NO:2、30、32、44、56、106、108、112、126、130和138的互补序列，条件是第一寡核苷酸的有义链和第二寡核苷酸的有义链不同。
E137.一种用于治疗患有与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括同时地、间歇地或以任何顺序依次向受试者施用治疗有效量的两种寡核苷酸，从而治疗所述受试者，每种寡核苷酸包括长度15至50个核苷酸的有义链和长度15至30个核苷酸的反义链，其中第一有义链包括如SEQ ID No:1、29、31、43、55、105、107、111、125、129和137中的任一者中所示的序列，并且其中所述第一反义链包括选自SEQ IDNO:2、30、32、44、56、106、108、112、126、130和138的互补序列，并且所述第二有义链包括如SEQ ID NO:1、29、31、43、55、105、107、111、125、129和137中的任一者中所示的序列、并且其中所述第二反义链包括选自SEQ ID NO:2、30、32、44、56、106、108、112、126、130和138的互补序列、条件是第一寡核苷酸的有义链和第二寡核苷酸的有义链不相同。
E138.根据实施例135至137中任一者所述的方法，其中减少ACC或DGAT2表达包括减少ACC或DGAT2 mRNA的量或水平、ACC或DGAT2蛋白的量或水平或其任何组合。
E139.一种用于在受试者中降低肝纤维化的量或水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施例135至137中任一者所述的寡核苷酸。
E140.根据实施例135所述的方法，其中所述受试者患有与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状。
E141.一种用于治疗患有与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施例135至137中任一者所述的寡核苷酸。
E142.一种用于治疗患有与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸，从而治疗所述受试者，其中所述治疗有效量是0.03、0.075、0.15、0.3、0.75、1.5、3、6、12、24、60、120或600mg/kg每种寡核苷酸。
E143.一种用于治疗患有与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据前述实施例中任一者所述的寡核苷酸，从而治疗所述受试者，其中所述治疗有效量是1.5、3、6或12mg/kg每种寡核苷酸。
E144.根据实施例140至143中任一者所述的方法，其中与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状选自由以下组成的群组：代谢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、药物诱导的肝病、酒精诱导的肝病、传染性病原体诱导的肝病、炎性肝病、免疫系统功能障碍介导的肝病、血脂异常、心血管疾病、再狭窄、综合征X、代谢综合征、糖尿病、肥胖、高血压、慢性胆管疾病，如原发性硬化胆管炎(PSC)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、胆道闭锁、进行性家族性肝内胆汁淤积3型(PFIC3)、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肝癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胃癌、结肠直肠癌、代谢性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、NAFLD诱导的纤维化或肝硬化、NASH诱导的纤维化或肝硬化、酒精诱导的肝纤维化或肝硬化、药物诱导的肝纤维化或肝硬化、传染性病原体诱导的肝纤维化或肝硬化、寄生虫感染诱导的肝纤维化或肝硬化、细菌感染诱导的肝纤维化或肝硬化、病毒感染诱导的纤维化或肝硬化、HBV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HCV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、双重HCV和HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、放射诱导的或化疗诱导的纤维化或肝硬化、胆道纤维化、由于任何慢性胆汁淤积性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、任何病因的肠纤维化、克罗恩氏病诱导的纤维化、溃疡性结肠炎诱导的纤维化、肠(例如小肠)纤维化、结肠纤维化、胃纤维化、肺纤维化、继慢性炎性气道疾病之后的肺纤维化，如COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者的肺、结核病、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)。
E145.根据实施例144所述的方法，其中与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状是心血管疾病、II型糖尿病、高甘油三酯血症、NASH、肥胖或其组合。
E146.根据实施例95至99中任一者所述的组合产品在制造用于治疗与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的药物中的用途。
E147.根据实施例95至99中任一者所述的组合产品，其用于或适于用于治疗与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状。
E148.一种试剂盒，其包括根据实施例95至99中任一者所述的组合产品、任选的药学可接受的载体和包括施用于患有与ACC或DGAT2表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的说明书的包装插页。
E149.一种治疗代谢综合征的方法，其包括向有此需要的患者施用治疗有效量的ACC基因的双链RNA(dsRNA)抑制剂和DGAT2基因的dsRNA抑制剂，其中此类dsRNA分子阻止或抑制ACC和DGAT2基因的表达和/或功能。
E150.根据实施例149所述的方法，其包括同时施用ACC基因的dsRNA抑制剂和DGAT2基因的dsRNA抑制剂。
实例
虽然已经参考在以下实例中阐述的特定实施例描述了本公开，但是本领域技术人员应该理解，在不脱离本公开的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变，并且可以用等同物替代。此外，以下实例以说明的方式提供，并且不旨在以任何方式限制本公开的范围。另外，可以进行修改以适应情况、材料、物质组成、工艺、一个或多个工艺步骤、本公开的目标、精神和范围。所有此类修改意图在本公开的范围内。利用本领域熟知的标准技术或下文具体描述的技术。
实例1：双链RNAi寡核苷酸的制备
寡核苷酸合成和纯化前述实例中所述的双链RNAi(dsRNA)寡核苷酸是使用本文所述的方法化学合成的。一般来说，使用如针对19-23聚体siRNA所述的固相寡核苷酸合成方法来合成dsRNAi寡核苷酸(参见，例如，Scaringe等人，(1990)《核酸研究》，18:5433-41和Usman等人，(1987)《美国化学学会杂志》，109:7845-46；还参见，美国专利号5,804,683、5,831,071、5,998,203、6,008,400、6,111,086、6,117,657、6,353,098、6,362,323、6,437,117和6,469,158)。
根据标准方法(整合的DNA技术(Integrated DNA Technologies)；衣阿华州科拉尔维尔(Coralville、IA))合成单独的RNA链并HPLC纯化。例如，使用固相亚磷酰胺化学来合成RNA寡核苷酸，使用标准技术(Damha&Olgivie(1993)，《分子生物学方法(METHODSMOL.BIOL.)》，20:81-114；Wincott等人，(1995)《核酸研究》，23:2677-84)在NAP-5柱(Amersham Pharmacia Biotech；新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway，NJ))上脱保护和脱盐。使用15分钟的阶梯线性梯度，在Amersham Source 15Q柱(1.0cm×25cm；AmershamPharmacia Biotech)上使用离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)纯化低聚物。梯度从90:10缓冲液A:B至52:48缓冲液A:B变化，其中缓冲液A为100mM Tris pH 8.5，并且缓冲液B为100mM Tris pH 8.5，1M NaCl。在260nm处监测样本，并且收集对应于全长寡核苷酸种类的峰，汇集，在NAP-5柱上脱盐，并且冻干。
在Beckman PACE 5000(Beckman Coulter，Inc.；加利福尼亚州富勒顿(Fullerton，CA))上通过毛细管电泳(CE)确定每种低聚物的纯度。CE毛细管具有100μm内径并且含有ssDNA 100R凝胶(Beckman-Coulter)。通常，将约0.6nmol的寡核苷酸注射到毛细管中，在444V/cm的电场中运行，并且通过在260nm处的UV吸光度进行检测。变性Tris-硼酸盐-7M-尿素运行缓冲液购自Beckman-Coulter。获得如由CE评估的至少90％纯的寡核糖核苷酸，用于下文所述的实验中。遵循制造商推荐的方案，通过在Voyager DETMBiospectometry Work Station(Applied Biosystems；加利福尼亚州福斯特市(FosterCity，CA))上矩阵辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法验证化合物同一性。获得了所有低聚物的相对分子质量，通常在预期分子质量的0.2％以内。
双链体的制备
将单链RNA低聚物重悬浮(例如，以100μM浓度)在由100mM乙酸钾、30mM HEPES(pH7.5)组成的双链体缓冲液中。将互补有义链和反义链以相等摩尔量混合，以产生例如50μM双链体的最终溶液。将样本在RNA缓冲液(IDT)中加热至100℃持续5′，并且允许在使用前冷却至室温。将dsRNA寡核苷酸储存在-20℃下。将单链RNA低聚物在-80℃下冻干储存或在无核酸酶的水中储存。
实例2：RNAi寡核苷酸抑制体内ACAC表达
ACACA和ACACB双重靶向工具化合物序列鉴定
在小鼠中在体内进行序列筛选，以鉴定对ACCA和ACACB均具有活性的工具化合物。为了鉴定有效的序列，使用基于计算机的算法通过计算产生ACACA和ACACB靶序列，该序列适合于测定RNAi途径对总ACAC表达的抑制。该算法提供了与小鼠或所有三种物种(小鼠、食蟹猴、人；表2)互补的RNAi寡核苷酸引导链序列。12个所选的dsRNA的核苷酸序列(表1)用于生成相应的双链RNAi寡核苷酸，所述双链RNAi寡核苷酸包括具有36聚体乘客链和22聚体引导链(反义链)的带缺口的四环GalNAc缀合的结构(在本文中被称为“GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸”)。36聚体链包含形成茎-环的序列(SEQ ID NO:159)。此外，包括GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸的乘客链和引导链的核苷酸序列具有经修饰的核苷酸和硫代磷酸酯键的不同模式(关于用于本筛选的GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸的结构和化学修饰模式的示意图，参见图1A)。包括四环的三个腺苷核苷酸各自与GalNAc部分(CAS#：14131-60-3)缀合。筛选提供了针对ACCA和ACCB mRNA的三次主动命中(图2)。GalXC-ACAC-5083(基于小鼠序列也被称为GalXC-ACAC-4458)是在所有三种物种中靶向ACACA和ACACB的唯一序列，其与所有六种转录物具有100％同一性。
表1：用于鉴定用于小鼠研究的工具化合物的GalXC化合物候选物。
Figure BDA0004119380390001061
Figure BDA0004119380390001071
实例3：RNAi寡核苷酸抑制ACAC表达和体内研究
小鼠研究：GalXC-ACAC-5083(SEQ ID NO:175和56，具有图1A中的修饰模式)被用作评估CDAHFD鼠模型中NASH表型(胆碱缺乏、L-氨基酸确定的高脂肪饮食，其由60kcal％脂肪和0.1重量％甲硫氨酸组成)的工具化合物。简言之，将8周龄的雄性C57BL/6J小鼠置于CDAHFD上持续12周，其中从第6周开始，以5mg/kg的每周剂量皮下施用GalXC-ACAC-5083。在12周结束时，收集肝脏样本用于分子和组织病理学终点分析。从小鼠肝脏分离的总RNA用于通过qRT-PCR评估相对ACACA和ACACB mRNA表达。来自生命技术公司的TaqMan RT-qPCR探针用于评价ACACA(Mm01304275_g1)和ACACB(Mm01204688_m1)。GalXC-ACAC-5083治疗将靶基因的ACACA和ACACB mRNA有效地降低了75％(图3A-3B)。使用ACC1/2识别抗体(CellSignaling 3662S)，通过蛋白质印迹分析在小鼠肝脏中确定蛋白质表达。通过蛋白质印迹上的扫描密度测量法来定量相对蛋白质丰度，并且在图4中示出。进行免疫组织化学以可视化用ACC抗体(Cell signaling，3662S)免疫染色的肝组织学切片中的蛋白质表达模式。通过GalXC-ACAC显著降低肝细胞中的ACC1/2表达。
最后，通过Picro-Sirius Red对经GalXC-ACAC治疗的或对照肝组织学切片进行染色，以可视化肝胶原含量。如图5A所示，胶原表达减少，表明由于GalXC-ACAC治疗，肝纤维化减少。另外，如图5B所示，组织病理学评分证实在GalXC-ACAC-5083治疗的组中肝纤维化的显著降低。另外，当与PBS处理的动物相比时，ACAC抑制导致肝纤维化标志物基因Col1a1和Vim的表达减少(图5C-5D)。
人/食蟹猴ACACA和ACACB靶向候选物序列鉴定
为了鉴定靶向人和食蟹猴ACACA和ACACB的额外的RNAi寡核苷酸抑制剂，基于互补性标准：与人和猴ACACA的100％互补性，以及针对人ACACB允许的序列高达一个错配，鉴定了三十个序列。(表2，SEQ ID NO:150人ACACA NM_198834、SEQ ID NO:151人ACACB NM_001093、SEQ ID NO:152食蟹猴ACACA XM_015438408、SEQ ID NO:153食蟹猴ACACB XM_015430785)。序列分析显示，一些引导链序列也与小鼠中的相应的靶序列互补(SEQ ID NO:154小鼠ACACA NM_133360和SEQ ID NO:155小鼠ACACB NM_133904；表2)。在本文所述的筛选中鉴定的基准对照GalXC-ACAC-5083是靶向所有三种物种中的ACACA和ACACB的唯一序列。
表2：人、猴和小鼠ACAC mRNA的靶序列
物种 基因同种型 参考 SEQ ID NO
人(Hs) ACACA NM_198834 150
人(Hs) ACACB NM_001093 151
食蟹猴(Mf) ACACA XM_015438408 152
食蟹猴(Mf) ACACB XM_015430785 153
小鼠(Mm) ACACA NM_133360 154
小鼠(Mm) ACACB NM_133904 155
选择30个dsiRNA命中的核苷酸序列(表3)用于在体内评估。简言之，核苷酸序列用于产生30种相应的双链RNAi寡核苷酸，其包括具有36聚体乘客链和22聚体引导链的带缺口的四环GalNAc缀合的结构(在本文中被称为“GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸”)。表3示出了缺乏带缺口的四环序列的20聚体乘客链，而表4示出了包括带缺口的四环序列的36聚体乘客链。此外，包括GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸的乘客链和引导链的核苷酸序列具有经修饰的核苷酸和硫代磷酸酯键的不同模式(关于GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸的结构和化学修饰模式的示意图，参见图1B)。包括四环的三个腺苷核苷酸各自与GalNAc部分(CAS#：14131-60-3)缀合。
表3：GalNAc缀合的人/食蟹猴ACACA和ACACB靶向候选序列
Figure BDA0004119380390001081
/>
Figure BDA0004119380390001091
/>
Figure BDA0004119380390001101
表4：GalNAc缀合的人/食蟹猴ACACA和ACACB靶向候选序列
Figure BDA0004119380390001102
/>
Figure BDA0004119380390001111
/>
Figure BDA0004119380390001121
/>
Figure BDA0004119380390001131
在经工程改造以在体内小鼠肝细胞中瞬时表达人ACACA和ACACB mRNA的小鼠中评价表4中列出的GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸。简言之，用剂量水平为3mg/kg的GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸皮下处理6-8周龄的雌性CD-1小鼠。三天(72小时)后，在普遍存在的巨细胞病毒(CMV)启动子序列的控制下，向小鼠流体动力学注射相等量的编码完整人ACACA和ACACB基因同种型的DNA质粒。在引入质粒后二十小时，收集肝脏样本。相对于仅用相同体积的PBS处理的小鼠，对来自这些小鼠的总RNA进行针对ACACA和ACACB mRNA两者的qRT-PCR分析。购买自生命技术公司的TaqMan RT-qPCR探针用于评估ACACA(Hs01046048_m1)和ACACB(Hs01565914_m1)。使用包含在质粒上的NeoR基因，针对转染效率归一化所述值。
如图6所示，所测试的包含基准寡核苷酸GalXC-ACAC-5083的十二种GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸抑制ACACA和ACACB表达，如通过相对于用PBS处理的小鼠，来自寡核苷酸处理的小鼠的肝脏样本中的减少量的ACACA和ACACB mRNA所确定。图6示出了所测试的30种GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸中的11种在比基准GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸ACAC-5083更大的程度上抑制ACACA和ACACB mRNA表达。
在剂量响应研究中测试了包括基准在内的六种化合物，这些化合物在3mg/kg时显示出抑制ACACA和ACACB的表达。简言之，用剂量为0.3、1和3mg/kg的GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸皮下处理6-8周龄的雌性CD-1小鼠。四(4)天(96小时)后，在普遍存在的巨细胞病毒(CMV)启动子序列的控制下，向小鼠流体动力学注射相等量的编码完整人ACACA和ACACB基因同种型的DNA质粒。在引入质粒后二十(20)小时，收集肝脏样本。相对于仅用相同体积的PBS处理的小鼠，对源自这些小鼠的总RNA进行针对ACACA和ACACB mRNA两者的qRT-PCR分析。使用包含在质粒上的NeoR基因，针对转染效率归一化所述值。如图7A-7B所示，GalXC-ACAC-2389、GalXC-ACAC-2392和GalXC-ACAC-4204显示针对人ACACA和ACACB的0.3-1mg/kg的ED50。
选择这三种化合物用于评估其在非人灵长类动物(NHP)中抑制ACACA/B表达的能力。表5中列出的GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸包括化学修饰的核苷酸，其具有如图1C所述的模式，其中引导链位置4上的2'-O-甲基修饰的核苷酸被改变为2'-氟。
表5：在NHP中评估的GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸
Figure BDA0004119380390001141
Figure BDA0004119380390001151
非人灵长类动物(NHP)研究
在食蟹猴(食蟹猴)中评估表5中列出的GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸。在本研究中，对猴进行分组，使得它们的平均体重(约5.4kg)在对照和实验组之间相当。每个队列含有两个雄性受试者和三个雌性受试者。在研究第0天，以6mg/kg的剂量皮下施用GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸。在给药前一周(第-7天)，在给药日(第0天)以及在给药后28、54和86天采集血液样本。在研究第-7、28、56和84天时收集超声引导的核心针肝活检。在每个时间点，对源自肝活检样本的总RNA进行qRT-PCR分析，以相对于用相当体积的PBS处理的那些，测量寡核苷酸处理的猴中的ACACA和ACACB mRNA。为了归一化数据，相对于两个参考基因PPIB和18SrRNA的几何平均值进行测量。购买自生命科技有限公司的以下TaqMan qPCR探针用于评估基因表达：猴ACACA Mf01051583_m1、猴ACACB Mf01565923_m1、PPIB Mf02802985_m1和r18SHs99999901_s1。如图8A和图8B(第28天)所示，用表5中列出的GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸处理NHP抑制肝中的ACACA和ACACB表达，如通过相对于用PBS处理的NHP，来自寡核苷酸处理的NHP的肝脏样本中的减少量的ACACA和ACACB mRNA所确定的。经处理的NHP的肝脏样本中的ACACA和ACACB mRNA的平均百分比降低在每个治疗组的数据点集合上方指示，并且平均值随时间的图在图8C和图8D中示出。对于评估的所有时间点，GalXC-ACAC显著抑制ACACA和ACACB mRNA表达。在同一样本中，使用ACC单克隆抗体(Cell Signaling，#3676S)通过蛋白质印迹检测ACC1/2蛋白水平。如图9所示，在56天时间点，如相对于纽带蛋白对照归一化的，GalXC-ACAC寡核苷酸抑制ACC1/2蛋白表达。这些结果证实，用GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸处理NHP降低肝中ACACA和ACACB mRNA的量，并且同时降低肝中ACC1/2蛋白的量。
总而言之，这些结果显示，被设计成靶向人的总ACAC mRNA的GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸抑制体内的总ACAC表达(如通过ACACA和ACACB mRNA和ACC1/2蛋白的量的减少所确定的)。
实例4：RNAi寡核苷酸抑制体内DGAT2表达
DGAT2靶向工具化合物序列鉴定
在小鼠中在体内进行序列筛选，以鉴定针对DGAT2具有活性的工具化合物。为了鉴定有效的序列，使用基于计算机的算法通过计算生成DGAT2靶序列，该序列适合于测定RNAi途径对DGAT2表达的抑制。该算法提供了与小鼠或所有三种物种(小鼠、猴、人)互补的RNAi寡核苷酸引导链序列。16个所选的dsiRNA的核苷酸序列用于生成相应的双链RNAi寡核苷酸，所述双链RNAi寡核苷酸包括具有36聚体乘客链和22聚体引导链的带缺口的四环GalNAc缀合的结构(在本文中被称为“GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸”)(表6)。此外，包括GalNAc缀合的ACAC寡核苷酸的乘客链和引导链的核苷酸序列具有经修饰的核苷酸和硫代磷酸酯键的不同模式(关于用于此筛选的GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸的一般结构和化学修饰模式的示意图，参见例如，图1C)。包括四环的三个腺苷核苷酸各自与GalNAc部分(CAS#：14131-60-3)缀合。筛选提供了针对DGAT2mRNA的五次主动命中(图10)。
表6：用于鉴定用于小鼠研究的工具化合物的GalXC化合物候选物
Figure BDA0004119380390001161
Figure BDA0004119380390001171
在剂量响应研究中测试了在3mg/kg下显示抑制DGAT2表达的三种化合物。简言之，用剂量为0.3、1和3mg/kg的GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸皮下处理6-8周龄的雌性CD-1小鼠。在给药后4天对小鼠实施安乐死。相对于仅用相同体积的PBS处理的小鼠，对源自这些小鼠的总RNA进行针对DGAT2 mRNA的qRT-PCR分析(Taqman探针：Mm00499536_m1，目录号4331182)。用Ppib内部对照(Taqman探针：Mm00478295_m1，目录号4331182)归一化这些值。如图11所示，GalXC-DGAT2-1452和GalXC-DGAT2-1533针对小鼠DGAT2显示<1mg/kg的ED50。
实例5：RNAi寡核苷酸抑制体内DGAT2表达
人/食蟹猴DGAT2靶向候选物序列鉴定
为了鉴定靶向人和cyno DGAT2的额外的RNAi寡核苷酸抑制剂，基于互补性标准：与人和猴DGAT2的100％互补性来鉴定十六个序列。(表7，人DGAT2 NM_032564.5和NM_001253891.1、猕猴DGAT2XM_005579118.2)。序列分析显示，一些引导链序列也与小鼠中的相应靶序列互补(小DGAT2 NM_026384.3；表7)。
表7：人、猴和小鼠DGAT2 mRNA的靶序列
Figure BDA0004119380390001172
选择十六个DsiRNA命中的核苷酸序列(表8)用于在体内评估。简言之，核苷酸序列用于产生16种相应的双链RNAi寡核苷酸，所述RNAi寡核苷酸包括具有36聚体乘客链和22聚体引导链的带缺口的四环GalNAc缀合的结构(在本文中被称为“GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸”)。表8示出了缺乏带缺口的四环序列的20聚体乘客链，而表9示出了包含带缺口的四环序列的36聚体乘客链。此外，包括GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸的乘客链和引导链的核苷酸序列具有经修饰的核苷酸和硫代磷酸酯键的不同模式(例如，关于GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸的一般结构和化学修饰模式的示意图，参见图1C)。包括四环的三个腺苷核苷酸各自与GalNAc部分(CAS#：14131-60-3)缀合。
表8：GalNAc缀合的人/Cyno DGAT2靶向候选物序列
Figure BDA0004119380390001181
Figure BDA0004119380390001191
表9：GalNAc缀合的人/Cyno DGAT2靶向候选物序列
Figure BDA0004119380390001192
/>
Figure BDA0004119380390001201
在经工程改造以在小鼠肝细胞中体内瞬时表达人DGAT2 mRNA的小鼠中评价表9中列出的GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸。简言之，用剂量为3mg/kg的GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸皮下处理6-8周龄的雌性CD-1小鼠。四天(96小时)后，在普遍存在的巨细胞病毒(CMV)启动子序列的控制下，向小鼠流体动力学注射相等量的编码完整人DGAT2基因的DNA质粒。在引入质粒后二十小时，收集肝脏样本。相对于仅用相同体积的PBS处理的小鼠，对源自这些小鼠的总RNA进行针对DGAT2 mRNA的qRT-PCR分析。TaqMan RT-qPCR探针Hs01045913(目录号4331182)购自生命技术公司以评估DGAT2。使用包含在质粒上的NeoR基因，针对转染效率归一化所述值。
如图12所示，所测试的十二种GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸抑制了DGAT2的表达，如通过相对于用PBS处理的小鼠，在来自寡核苷酸处理的小鼠的肝样品中的DGAT2 mRNA的减少量所确定的。
在剂量响应研究中测试了在3mg/kg下显示抑制DGAT2表达的三种化合物。简言之，用剂量为0.3、1和3mg/kg的GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸皮下处理6-8周龄的雌性CD-1小鼠。四天(96小时)后，在普遍存在的巨细胞病毒(CMV)启动子序列的控制下，向小鼠流体动力学注射相等量的编码完整人DGAT2基因同种型的DNA质粒。在引入质粒后20小时，收集肝脏样本。相对于仅用相同体积的PBS处理的小鼠，对源自这些小鼠的总RNA进行针对DGAT2mRNA的qRT-PCR分析。使用包含在质粒上的NeoR基因，针对转染效率归一化所述值。如图13所示，GalXC-DGAT2-0509、GalXC-DGAT2-0898和GalXC-DGAT2-1074针对人DGAT2显示<1mg/kg的ED50。
非人灵长类动物(NHP)研究
在图12中测试的化合物中，选择六种用于评估其在非人灵长类动物(NHP)中抑制DGAT2表达的能力。表10中列出的GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸包括具有如图1C中所述的模式的化学修饰的核苷酸，其中在引导链位置4上的2'-O-甲基修饰的核苷酸改变为2'氟。
在食蟹猴(食蟹猴)中评价表10中列出的GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸。在本研究中，对猴进行分组，使得其平均体重(约6kg)在对照和实验组之间相当。每个队列含有雄性和雌性受试者。在研究第0天，以6mg/kg的剂量皮下施用GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸。在给药前一周(第-7天)，在给药日(第0天)以及在给药后28、54和86天采集血液样本。在研究第-7、28、56和84天时收集超声引导的核心针肝活检。在每个时间点，对源自肝活检样本的总RNA进行qRT-PCR分析，以相对于用相当体积的PBS处理的那些，测量寡核苷酸处理的猴中的DGAT2 mRNA。为了归一化数据，相对于两个参考基因PPIB和18S rRNA的几何平均值进行测量。购买自生命科技有限公司的以下TaqMan qPCR探针用于评估如实例3中所述的基因表达。如图14A-14G，用表10中列出的GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸处理NHP抑制肝中的DGAT2表达，如通过相对于用PBS处理的NHP，来自寡核苷酸处理的NHP的肝脏样本中DGAT2 mRNA的减少量所确定的。在图14B-14G中，显示了第4周(第28天)和第12周(第84天)经处理的NHPs的肝脏样品中DGAT2 mRNA的平均减少百分比，以及平均值随时间的图。在第4周时，评估的所有GalNAc缀合的寡核苷酸将DGAT2表达降低了至少75％。这些结果证实，用GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸处理NHP降低肝中DGAT2 mRNA的量。
总而言之，这些结果显示，被设计成靶向人DGAT2 mRNA的GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸体内抑制表达。
表10：在NHP中评估的GalNAc缀合的DGAT2寡核苷酸
Figure BDA0004119380390001221
实例6：组合RNAi寡核苷酸在体内抑制ACAC和DGAT2表达
小鼠研究
在GAN-NASH喂养的小鼠中组合地评价GalXC-ACAC-4458(化学修饰模式如图1A所示)和GalXC-DGAT2-1463(化学修饰模式如图1C所示)寡核苷酸。简言之，在饮食20周后，从Taconic Biosciences公司获得GAN-NASH喂养的小鼠，其喂食由40kcal％的脂肪、20kcal％的果糖和2％胆固醇组成的饮食。根据表11中所示的研究设计，在第27周开始每周一次同时皮下给药。
表11：对ACAC和DGAT2的组合寡核苷酸抑制的研究设计
Figure BDA0004119380390001222
Figure BDA0004119380390001231
/>
在第六周剂量后，在第33周、在末次给药后一周收获小鼠并制备用于研究，并进行完全尸检。除了目标mRNA水平之外，还研究了以下类别的终点：全身(例如胆固醇)、肝脂肪变性、肝脏炎症和肝纤维化。结果的详细汇总在表12中找到，其中如果p值>0.05相对于单独的GalXC-ACAC治疗，则突出显示组合数据。
表12：ACAC和DGAT2组合研究中调查的终点的汇总
Figure BDA0004119380390001232
Figure BDA0004119380390001241
1-在DGAT2队列中升高(相对于单独的饮食)但在组合队列中归一化的ALP
2在GAN-NASH激发后48周、天狼星红染色稳健。
在肝中测量响应于GalXC-ACAC和GalXC-DGAT2寡核苷酸组合的目标mRNA水平的测量。在单独的GalXC-DGAT2治疗和联合治疗中均显示了>95％的DGAT2 mRNA敲低(图15A)，但未观察到DGAT1 mRNA的敲低(图15B)。在单独的GalXC-ACAC治疗组中分别观察到在ACACA和ACACB mRNA中75％和52％的敲低(图16A和16B)。值得注意的是，虽然未观察到对DGAT2mRNA水平的组合效应，但是GalXC-ACAC与GalXC-DGAT2的组合导致比在单独的GalXC-ACAC治疗组中更大的ACACA和ACACB mRNA的敲低。响应于组合、ACACA的抑制从75％增加到90％，同时响应于组合，ACACB mRNA的抑制从52％增加到97％。该数据代表GalXC-ACAC和GalXC-DGAT2联合治疗对ACACA和ACACB靶mRNA水平的出人意料的协同效应。
为了评估体内对GalXC-ACAC和GalXC-DGAT2寡核苷酸组合的全身应答，在研究结束时测量了总血清胆固醇以及肝酶丙氨酸转氨酶(ALT)。当与PBS或单独的单一治疗组相比时，在联合治疗组中血清胆固醇(图17)和ALT水平(图18)降低。这些数据显示，与任一种单独的单一疗法相比，GalXC-ACAC/GalXC-DGAT2联合治疗可以在治疗肝病的全身作用中赋予累加或协同效应。
为了研究GalXC-ACAC和GalXC-DGAT2寡核苷酸组合对肝脂肪变性的作用，定量了如通过肝脂质的面积％评估的脂肪变性(图19A和19B)。另外，测量肝TG(表12)以及Srebp1(一种肝脂肪变性的mRNA标志物)，如图20所示。与任何一种单独的任一治疗组相比，如通过肝脂质的面积％评估的肝脂肪变性在联合治疗组中显示降低，而肝TG和Srebp1 mRNA水平在联合治疗中恢复到基线水平或低于基线水平。
为了研究GalXC-ACAC和GalXC-DGAT2寡核苷酸组合对肝脏炎症的作用，通过F4/80巨噬细胞标记物的可视化来评估巨噬细胞浸润和发病机制(图21A和21B)以及针对冠状样结构(CLS)的测定(图22A和22B)。与PBS或GalXC-ACAC或GalXC-DGAT2单一治疗组或联合治疗组相比，在F4/80染色或CLS测定中未观察到显著变化。还测量了肝脏炎症的细胞因子标志物IL6和IL12b的肝水平。当与PBS或任一种单独的单一治疗组相比时，在联合治疗组中IL6(图23)和IL12b(图24)的肝水平降低。这些数据一起表明，联合治疗不赋予肝脏炎症。最后，通过测量肝纤维化标志物基因Col1a1和Timp1的表达来探索GalXC-ACAC和GalXC-DGAT2寡核苷酸组合对肝脏炎症的作用。与PBS或GalXC-ACAC或GalXC-DGAT2单一治疗组相比，在组合治疗组中Col1a1(图25)和Timp1(图26)mRNA水平均降低。这些数据显示，与单独的单一疗法或单独的单独疗法的总和相比，GalXC-ACAC/GalXC-DGAT2联合治疗可以在肝纤维化的治疗中赋予累加或协同效应。在每种分子5mg/kg的剂量下，同时施用，肝脏数据显示靶基因的增强的抑制，这在使用单独的任何一种siRNA中均未观察到。这些数据证实在蛋白质敲低中，当前公开的ACC siRNA和DGAT2 siRNA抑制剂的组合的协同效应。这些效应继而可以导致从如本文提供的与代谢综合征相关联的病理的缓解增加。总之，当视为整体时，来自GalXC-ACAC/GalXC-DGAT2寡核苷酸组合的该研究的数据支持这样的假设，即与单一药剂治疗相比，组合治疗可能对全身性肝病、肝脂肪变性和肝纤维化的可测量终点具有改善的效果。此外，如通过巨噬细胞浸润和致病性测定或通过肝脏细胞因子水平所测量的，联合治疗没有引起肝脏炎症的任何增加。同样值得注意的是，与单独的GalXC-ACAC治疗相比，GalXC-ACAC/GalXC-DGAT2寡核苷酸组合在ACAC mRNA敲低的程度上显示出协同活性，这表明了迄今尚未描述的组合作用机制。
序列表
Figure BDA0004119380390001261
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Figure BDA0004119380390001271
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Figure BDA0004119380390001281
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Figure BDA0004119380390001791
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Claims (35)

1.一种寡核苷酸，其包括：
(i)反义链，所述反义链包括与ACC的靶序列的互补性区域，其中所述反义链包括选自SEQ ID No:2、30、32、44和56的核苷酸序列；或
(ii)反义链，所述反义链包括与DGAT2的靶序列的互补性区域，其中所述反义链包括选自SEQ ID No:118、120、126、130、138和144的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括(i)的所述反义链和包括选自SEQ ID No:1、29、31、43和55的核苷酸序列的有义链；或包括(ii)的所述反义链和包括选自SEQ ID No:117、119、125、129、137和143的核苷酸序列的有义链。
3.一种寡核苷酸，其包括：
(i)长度15-30个核苷酸的反义链和长度15-40个核苷酸的有义链，其中所述反义链具有与SEQ ID No:150或151所示ACC的靶序列的互补性区域，并且其中所述互补性区域长度为至少15个连续核苷酸；或
(ii)长度15-30个核苷酸的反义链和长度15-40个核苷酸的有义链，其中所述反义链具有与SEQ ID NO:156或157所示DGAT2的靶序列的互补性区域，并且其中所述互补性区域长度为至少15个连续核苷酸。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中所述有义链的长度为36个核苷酸，和/或所述反义链的长度为22个核苷酸。
5.根据权利要求3或4所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括(i)的所述反义链和有义链，并且其中所述反义链包括选自SEQ ID No:2、30、32、44和56的核苷酸序列，并且任选地所述有义链包括选自SEQ ID No:1、29、31、43和55的核苷酸序列；或包括(ii)的所述反义链和有义链，并且其中所述反义链包括选自SEQ ID No:118、120、126、130、138和144的核苷酸序列，并且任选地所述有义链包括选自SEQ ID No:117、119、125、129、137和143的核苷酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸，其中与所述ACC或DGAT2的靶序列的所述互补性区域长度为至少19个连续核苷酸。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链和所述有义链形成双链体区域，任选地其中所述双链体区域长度为至少19个核苷酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的寡核苷酸，其中所述互补性区域(i)与所述ACC或DGAT2靶序列的长度相差不超过3个核苷酸，或(ii)与所述ACC或DGAT2靶序列完全互补。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链的3'端包括被阐述为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1和S2之间形成长度3-5个核苷酸的环，并且任选地其中L是四环。
10.根据权利要求9所述的寡核苷酸，其中所述四环包括序列5'-GAAA-3'。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链包括长度一个或多个核苷酸的3'突出端序列，任选地其中所述3'突出端序列长度为2个核苷酸，并且进一步任选地其中所述3'突出端序列为GG。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个经修饰的核苷酸。
13.根据权利要求12所述的寡核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸包括2'-修饰，任选地其中所述2'-修饰是选自2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸的修饰。
14.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中(i)所述有义链的约10-15％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的所述核苷酸包括2'-氟修饰；(ii)所述反义链的约25-35％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的所述核苷酸包括2'-氟修饰；和/或(iii)所述寡核苷酸的约15-25％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％的所述核苷酸包括2'-氟修饰。
15.根据权利要求13至14中任一项所述的寡核苷酸，其中(i)所述有义链包括36个核苷酸，其中位置从5'至3'编号为1-36，其中位置8-11包括2'-氟修饰；和/或(ii)所述反义链包括22个核苷酸，其中位置从5'至3'编号为1-22，并且其中位置2、3、5、7、10和14和任选地位置4包括2'-氟修饰。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个修饰的核苷酸间键，任选地其中所述至少一个修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链的所述5'核苷酸的糖的4'-碳包括磷酸酯类似物，任选地其中所述磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯，并且进一步任选地其中所述磷酸酯类似物是包括4'-氧基甲基膦酸酯的4'-磷酸酯类似物。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一个核苷酸与一种或多种靶向配体缀合，其中所述一种或多种靶向配体选自碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽、脂质和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
19.根据权利要求18所述的寡核苷酸，其中所述GalNac部分是单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。
20.根据权利要求2至19中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:162和30；
(b)分别为SEQ ID NO:163和32；
(c)分别为SEQ ID NO:169和44；
(d)分别为SEQ ID NO:200和138；
(e)分别为SEQ ID NO:203和144；
(f)分别为SEQ ID NO:194和126；
(g)分别为SEQ ID NO:191和120；
(h)分别为SEQ ID NO:196和130；以及
(i)分别为SEQ ID NO:190和118。
21.根据权利要求2至19中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链和反义链包括选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:208和254；
(b)分别为SEQ ID NO:209和255；
(c)分别为SEQ ID NO:215和261；
(d)分别为SEQ ID NO:246和292；
(e)分别为SEQ ID NO:249和295；
(f)分别为SEQ ID NO:240和286；
(g)分别为SEQ ID NO:237和283；
(h)分别为SEQ ID NO:242和288；以及
(i)分别为SEQ ID NO:236和282。
22.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至21中任一项所述的寡核苷酸和药学上可接受的载体、递送剂或赋形剂。
23.一种组合物，其包括ACC表达的抑制剂和DGAT2表达的抑制剂。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述ACC表达的抑制剂和所述DGAT2表达的抑制剂各自是寡核苷酸。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述ACC表达的抑制剂包括：
(a)长度15-30个核苷酸的反义链和长度15-40个核苷酸的有义链，其中所述反义链具有与SEQ ID No:150或151所示ACC的靶序列的互补性区域，并且其中所述互补性区域长度为至少15个连续核苷酸；
(b)包括与ACC的靶序列的互补性区域的反义链，其中所述反义链包括选自SEQ ID No:2、30、32、44和56的核苷酸序列，以及任选地包括选自SEQ ID No:1、29、31、43和55的核苷酸序列的有义链；或
(c)包括选自以下的核苷酸序列的反义链和有义链：
(i)分别为SEQ ID NO:162和30；
(ii)分别为SEQ ID NO:163和32；
(iii)分别为SEQ ID NO:169和44；
(iv)分别为SEQ ID NO:208和254；
(v)分别为SEQ ID NO:209和255；以及
(vi)分别为SEQ ID NO:215和261。
26.根据权利要求24或25所述的组合物，其中所述DGAT2表达的抑制剂包括：
(a)长度15-30个核苷酸的反义链和长度15-40个核苷酸的有义链，其中所述反义链具有与SEQ ID No:156或157中所示的DGAT2的靶序列的互补性区域，并且其中所述互补性区域长度为至少15个连续核苷酸；
(b)包括与DGAT2的靶序列的互补性区域的反义链，其中所述反义链包括选自SEQ IDNo:118、120、126、130、138和144的核苷酸序列，以及任选地包括选自SEQ ID No:117、119、125、129、137和143的核苷酸序列的有义链；或
(c)包括选自以下的核苷酸序列的反义链和有义链：
(i)分别为SEQ ID NO:200和138；
(ii)分别为SEQ ID NO:203和144；
(iii)分别为SEQ ID NO:194和126；
(iv)分别为SEQ ID NO:191和120；
(v)分别为SEQ ID NO:196和130；
(vi)分别为SEQ ID NO:190和118；
(vii)分别为SEQ ID NO:246和292；
(viii)分别为SEQ ID NO:249和295；
(ix)分别为SEQ ID NO:240和286；
(x)分别为SEQ ID NO:237和283；
(xi)分别为SEQ ID NO:242和288；以及
(xii)分别为SEQ ID NO:236和282。
27.一种在有此需要的受试者中治疗炎性、代谢性、纤维化或胆汁淤积性疾病的方法，其包括施用根据权利要求1至21中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求22所述的药物组合物或根据权利要求23至26中任一项所述的组合物。
28.一种在已经接受或正接受ACC抑制剂的有此需要的受试者中治疗炎性、代谢性、纤维化或胆汁淤积性疾病的方法，其包括施用DGAT2抑制剂。
29.一种在已经接受或正接受DGAT2抑制剂的有此需要的受试者中治疗炎性、代谢性、纤维化或胆汁淤积性疾病的方法，其包括施用ACC抑制剂。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所述疾病选自由以下组成的群组，所述疾病选自由以下组成的群组：代谢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、药物诱导的肝病、酒精诱导的肝病、传染性病原体诱导的肝病、炎性肝病、免疫系统功能障碍介导的肝病、血脂异常、心血管疾病、再狭窄、综合征X、代谢综合征、糖尿病、肥胖、高血压、慢性胆管疾病、原发性硬化胆管炎(PSC)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、胆道闭锁、进行性家族性肝内胆汁淤积3型(PFIC3)、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肝癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胃癌、结肠直肠癌、代谢性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、NAFLD诱导的纤维化或肝硬化、NASH诱导的纤维化或肝硬化、酒精诱导的肝纤维化或肝硬化、药物诱导的肝纤维化或肝硬化、传染性病原体诱导的肝纤维化或肝硬化、寄生虫感染诱导的肝纤维化或肝硬化、细菌感染诱导的肝纤维化或肝硬化、病毒感染诱导的纤维化或肝硬化、HBV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HCV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、双重HCV和HIV感染诱导的肝纤维化或肝硬化、放射诱导的或化疗诱导的纤维化或肝硬化、胆道纤维化、由于任何慢性胆汁淤积性疾病诱导的肝纤维化或肝硬化、任何病因的肠纤维化、克罗恩氏病诱导的纤维化、溃疡性结肠炎诱导的纤维化、肠(例如小肠)纤维化、结肠纤维化、胃纤维化、肺纤维化、继慢性炎性气道疾病之后的肺纤维化、COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者的肺、结核病、肺纤维化和特发性肺纤维化(IPF)。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病是代谢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
32.一种在有此需要的受试者中减少肝纤维化的量的方法，其包括施用根据权利要求1至21中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求22所述的药物组合物或根据权利要求23至26中任一项所述的组合物。
33.一种治疗与ACC和/或DGAT表达相关联的疾病、病症或病状的方法，其包括向有此需要的受试者施用根据权利要求1至21中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求22所述的药物组合物或根据权利要求23至26中任一项所述的组合物。
34.根据权利要求1至21中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求22所述的药物组合物或根据权利要求23至26中任一项所述的组合物在制造用于治疗与ACC和/或DGAT表达相关联的疾病、病症或病状的药物中的用途。
35.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至21中任一项所述的寡核苷酸、根据权利要求22所述的药物组合物或根据权利要求23至26中任一项所述的组合物，以及包括施用于患有与ACC和/或DGAT表达相关联的疾病、病症或病状的受试者的说明书的包装插页。
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