ES2918975T3 - Tratamiento de la distrofia facioescapulohumeral - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con ácidos nucleicos, composiciones y métodos para el tratamiento de la distrofia facioscapulohumeral. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de la distrofia facioescapulohumeral

La presente divulgación se refiere a ácidos nucleicos, composiciones y métodos para el tratamiento de la distrofia facioescapulohumeral. Cualquier referencia a métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia debe interpretarse como referencia a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento.

Antecedentes de la invención

La distrofia facioescapulohumeral (FSHD) es una de las distrofias musculares hereditarias más comunes. La patología es causada por una pérdida de marcas epigenéticas dentro del macrosatélite D4Z4 ubicado en la región subtelomérica del cromosoma 4 que conduce a la relajación de la cromatina (1). En el 95% de los pacientes con FSHD (llamados FSHD1), esta relajación de la cromatina está asociada con una contracción de la matriz de D4Z4 (2). En la población general, esta región normalmente se compone de 11 a 150 repeticiones D4Z4, mientras que los pacientes con FSHD1 solo tienen de 1 a 10 repeticiones (3). El 5% restante de los pacientes con FSHD no presentan una contracción de D4Z4, pero el 85% de ellos son portadores de una mutación en el gen modificador epigenético SMCHD1 (4). SMCHD1 está ubicado en el cromosoma 18 y, en la mayoría de los pacientes con FSHD2, las mutaciones conducen a una haploinsuficiencia o a mutaciones negativas dominantes en la proteína SMCDH1, lo que conduce a una unión reducida de la proteína SMCHD1 a la repetición D4Z4 y, en consecuencia, a una pérdida de marcas epigenéticas en esta región (4). En conclusión y a pesar de que se han caracterizado 2 loci independientes de la enfermedad, tanto los pacientes FSHD1 como los FSHD2 son indistinguibles y comparten una hipometilación de D4Z4 en el cromosoma 4. Esta relajación de la cromatina por sí sola no es suficiente para desencadenar la enfermedad y debe estar asociada a un cromosoma 4 permisivo caracterizado por: (i) la presencia de un polimorfismo de longitud de secuencia simple estable (SSLP) permisivo ubicado cadena arriba de D4Z4 (5-7). Se han caracterizado al menos 12 haplotipos diferentes, pero solo varios están asociados con FSHD (7, 8). Estas variaciones de secuencia pueden ser importantes para la conformación de la cromatina, pero se desconoce su papel exacto en el inicio de FSHD; (ii) la presencia de una región 4qA que contiene un sitio de poliadenilación pLAM distal a la última repetición D4Z4 que permite la estabilización del ARNm de DUX4 por la cola de poli(A) (5, 9). De hecho, cada repetición D4Z4 contiene el marco de lectura abierto de un factor de transcripción llamado DUX4 (10, 11) y la relajación de la cromatina da como resultado una represión ineficaz de este gen homeobox doble tanto en FSHD1 como en FSHD2. DUX4 es un factor de transcripción y la expresión génica inducida por DUX4 es la firma molecular principal en los músculos esqueléticos FSHD (12).

Actualmente no existe un tratamiento eficaz disponible para la FSHD. Se ha propuesto un tratamiento para la FSHD mediante la prevención o inhibición de la expresión del factor de transcripción DUX4 en la solicitud WO 2013/016352 utilizando métodos basados en la interferencia de ARN. Sin embargo, los métodos directos de inactivación de genes que utilizan tecnología antisentido o la desactivación de genes basada en ADN a través de tecnologías de corte de enzimas de ADN (meganucleasas, nucleasas con dedos de zinc, TALEN u otras) pueden funcionar bien en células de pacientes con FSHD, pero, como era de esperar, tendrán una baja eficacia in vivo en seres humanos. Esto se debe al hecho de que la transcripción del gen DUX4 se produce al azar en unos pocos mionúcleos solo al principio. Posteriormente, los mionúcleos vecinos están sujetos al efecto de la proteína venenosa DUX4 que modifica su expresión génica (13). Como consecuencia de este mecanismo de péptido venenoso, los enfoques de tratamiento de órganos completos (y no de células) deberán lograr una biodistribución tisular muy alta en para inactivar eficazmente los mionúcleos que transcriben la proteína DUX4. Esto no se puede lograr en la actualidad, ya que la biodistribución tisular de moléculas OAN o enzimas de corte de ADN sigue siendo baja (lit). En consecuencia, el método expuesto en este documento tiene como objetivo la neutralización del péptido venenoso DUX4 en lugar de la inactivación del gen DUX4.

En cualquier caso, actualmente no hay tratamiento disponible para el paciente con FSHD. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de proporcionar un tratamiento de la FSHD.

Sumario de la invención

Los presentes inventores muestran en este documento que el uso de un ácido nucleico señuelo que contiene al menos un sitio de unión para la proteína del factor de transcripción DUX4 es eficaz para bloquear la transcripción de los genes diana de DUX4. La FSHD es una enfermedad causada por la expresión de DUX4 en tejidos o células donde normalmente no debería expresarse, y la expresión corriente abajo de los genes diana de DUX4 que, de otro modo, no se expresan en el mismo grado en condiciones no patológicas. Por tanto, los ácidos nucleicos diseñados por los inventores representan una herramienta terapéutica muy potente para el tratamiento de la FSHD.

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

Por consiguiente, un primer objeto de la divulgación es un ácido nucleico señuelo que puede inhibir la activación de genes mediada por DUX4 uniéndose al sitio de unión al ADN de la proteína del factor de transcripción DUX4.

Un objeto de la invención es un vector viral que porta un ácido nucleico señuelo que comprende uno o más sitios de unión a DUX4, para usar en un método para el tratamiento de la FSHD.

Otro objeto de la divulgación se refiere a una célula recombinante que comprende un ácido nucleico señuelo y a un animal no humano que comprende dicha célula.

Además, la invención también se refiere a un ácido nucleico señuelo que comprende uno o más sitios de unión a la proteína del factor de transcripción DUX4 y que tiene una estructura bicatenaria, para usar en un método para el tratamiento de la FSHD.

En particular, la divulgación se refiere específicamente a un método para el tratamiento de la FSHD en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto una molécula de ácido nucleico señuelo, un vector o una célula según la divulgación.

Otro objeto de la divulgación es un método para inhibir in vitro la actividad de regulación génica de la proteína del factor de transcripción DUX4 a través de la interferencia con su(s) sitio(s) de unión al ADN.

En la siguiente descripción detallada de la invención se proporcionan objetos y realizaciones adicionales.

Descripción detallada de la invención

En el contexto de la presente invención, la expresión "ácido nucleico señuelo" indica un ácido nucleico que es capaz de unirse a la proteína del factor de transcripción DUX4 de una manera específica de secuencia y que bloquea la capacidad de la proteína del factor de transcripción DUX4 para actuar sobre un gen sensible a DUX4. Sin pretender limitarse a ninguna teoría, se prevé que la molécula de ácido nucleico señuelo de la presente divulgación actúe inhibiendo competitivamente la unión de DUX4 a sus sitios de unión diana presentes en los genes sensibles a DUX4 (o diana). Los genes sensibles a DUX4 representativos incluyen, sin limitación, ZSCAN4, TRIM43 y MBD3L2. Los expertos en la materia pueden evaluar la eficacia de señuelo de una molécula de ácido nucleico evaluando la expresión de estas proteínas en una célula transfectada con una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación, o transducida con un vector viral que alberga dicho molécula de ácido nucleico señuelo. Otros medios para determinar la actividad señuelo de una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación incluyen el uso de un ensayo con indicadores, en el que un gen indicador, tal como GFP, se coloca bajo el control de un promotor de un gen que responde al factor de transcripción DUX4.

La molécula de ácido nucleico señuelo de la divulgación comprende al menos un sitio de unión a DUX4. Los sitios de unión a DUX4 son conocidos en la técnica, como los descritos previamente en Geng et al., 2012 (14). Los sitios de unión a DUX4 representativos incluyen las secuencias mínimas del motivo de unión a DUX4 en elementos no repetitivos y sitios asociados a MaLR que son TAAYYBAATCA (SEQ ID NO:1) y TAAYBYAATCA (SEQ ID NO:2) respectivamente (según la nomenclatura de la IUPAC, en la que Y denota C o T, y B denota C o G o T). Por supuesto, en la presente invención, puede usarse cualquier secuencia que pueda unirse a la proteína del factor de transcripción DUX4.

En una realización particular, el sitio de unión a DUX4 se selecciona del grupo que consiste en TAACCCAATCA (SEQ ID NO:3), TAATTTAATCA (SEQ ID NO:4), TAATCCAATCA (SEQ ID NO:5) y TAATTGAATCA (SEQ ID NO:6). En una realización particular, el sitio de unión a DUX4 es TAATCCAATCA (SEQ ID NO:5).

El ácido nucleico señuelo de la divulgación puede comprender uno o más sitios de unión a DUX4. En una realización preferida, el ácido nucleico señuelo comprende más de un sitio de unión a DUX4, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o incluso más de siete sitios de unión a DUX4. En esta realización en la que el ácido nucleico señuelo comprende más de un sitio de unión a DUX4, cada sitio de unión se selecciona independientemente de los demás. En otros términos, los múltiples sitios de unión a DUX4 presentes en el ácido nucleico señuelo pueden ser todos iguales o todos diferentes, o varios de los sitios de unión tienen la misma primera secuencia mientras que otros sitios de unión pueden ser de una secuencia o secuencias diferentes de la primera secuencia.

En el caso de un ácido nucleico señuelo que contiene más de un sitio de unión a DUX4, dichos sitios de unión están separados, o pueden o no estar separados por uno o más nucleótidos que no forman parte del sitio de unión. Dichos nucleótidos también se denominan en el presente documento "espaciadores". Dichos espaciadores, si están presentes, pueden incluir uno o más nucleótidos, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más de 20 nucleótidos. En una realización particular, el espaciador o espaciadores están compuestos por nucleótidos aleatorios.

En una realización particular, el ácido nucleico señuelo comprende o consiste en una secuencia bicatenaria seleccionada de:

GTAATCCAATCAT (SEQ ID NO:7);

GAGGTAATCCAATCATGGA (SEQ ID NO:8);

CGTAATCCAATCAGC (SEQ ID NO:9);

TGCGTAATCCAATCAGCGT (SEQ ID NQ:10);

CCTGTGGGAGGTAATCCAATCATGGAGGCAGCCTGTGGGAGGTAATCCAATCA

TGGAGGCAGA (SEQ ID NO:11);

GTGGGAGGTAATCCAATCATGGAGGCAG (SEQ ID NO:13);

CCCATGCGTAATCCAATCAGCGTACGAT (SEQ ID NO:14);

CCTGTGGGAGGTAATCCAATCATGGAGGCAGCCT (SEQ ID NO: 15);

GACCCTGTGGGAGGTAATCCAATCATGGAGGCAGTTTCCC (SEQ ID NO: 16).

En otra realización particular, el ácido nucleico señuelo comprende o consiste en una secuencia bicatenaria seleccionada entre:

CCCATGCGT AAT CCAAT CAGCGT ACG AT (SEQ ID NO: 23)

Según una realización particular, la presente invención implementa un oligonucleótido que comprende o consiste en cualquiera de señuelo-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10 o -11 como se describe en la sección experimental.

Según una realización particular, el oligonucleótido según la presente divulgación comprende o consiste en una secuencia bicatenaria seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO:7 a SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:23. En otra realización particular, el oligonucleótido según la presente divulgación se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO:7 a SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:23.

Para que la proteína del factor de transcripción DUX pueda reconocer y unirse al ácido nucleico señuelo, este ácido nucleico señuelo debe tener una estructura bicatenaria.

Por lo tanto, el señuelo puede estar compuesto por dos secuencias monocatenarias complementarias hibridadas, o puede ser una secuencia aislada que comprende dos regiones complementarias de manera que el oligonucleótido puede formar una molécula bicatenaria autocomplementaria. Además, la estructura bicatenaria se puede obtener utilizando conectores dentro de un oligonucleótido monocatenario, como los conectores de hexaetilenglicol, en los que el oligonucleótido es un oligonucleótido autocomplementario que comprende dos regiones capaces de hibridarse entre sí (los oligonucleótidos representativos que corresponden a esta definición incluye señuelo-4, -5, -6 y -9 representados en las figuras 1 y 6).

En una realización particular, el ácido nucleico señuelo compuesto por una molécula bicatenaria autocomplementaria se diseña de manera que pueda formar una porción bicatenaria que comprenda la secuencia de cualquiera de SEQ ID NO:7 a 16 y SEQ ID NO:23. Para fines ilustrativos de esta realización, y como se muestra en las figuras 1 y 6: - el oligonucleótido monocatenario de SEQ ID NO:24 es autocomplementario y puede formar una porción bicatenaria que comprende la secuencia que se muestra en SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15;

- el oligonucleótido monocatenario de SEQ ID NO:20 es autocomplementario y es capaz de formar una porción bicatenaria que comprende la secuencia que se muestra en SEQ ID NO:13 o SeQ ID NO:16.

Las realizaciones ilustrativas del ácido nucleico señuelo compuesto por una molécula bicatenaria autocomplementaria incluyen:

CTGCCT CCAT G ATTGG ATT ACCT CCCACAGG***CCT GTGGG AGGT AAT CCAAT C ATGGAGGCAGCCT***AGG (SEQ ID NO: 24 )

AAACTGCCT CCATG ATTGG ATT ACCT CCCACAGGGT CTTTTG ACCCT GTGGG AG GT AAT CCAAT CAT GG AGGCAGTTT CCCTTTTGGG (SEQ ID NO:20)

AAACTGCCT CCAT GATTGGATT ACCT CCCACAGGGTC***G ACCCTGTGGG AGGT

AAT CCAAT CATGG AGGCAGTTT CCC***GGG (SEQ ID NO:25)

CT GCCT CCAT GATTGGATT ACCT CCCACTTTT GTGGG AGGT AAT CCAAT CATGG AGGCAGTTTTCTGC (SEQ ID NO:26)

TACGCTGATTGGATTACGCATGGGTTTTCCCATGCGTAATCCAATCAGCGTACG

ATTTTTATCG (SEQ ID NO:27)

en las que *** representa un conector, tal como hexaetilenglicol.

Como alternativa, en los oligonucleótidos autocomplementarios monocatenarios que tienen uno o más conectores, como en SEQ ID NO:24 y 25, el conector (representado por "***" arriba) puede ser un conector de nucleótidos, como un TTTT conector

El oligonucleótido de la presente divulgación puede ser de cualquier tipo adecuado. Los tipos de oligonucleótidos representativos incluyen oligodesoxirribonucleótidos, oligorribonucleótidos, morfolinos, 2'-O-metil ribonucleótidos, triciclo-ADN-oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos de ADN de triciclofosforotioato, LNA, pequeños AON modificados con ARN nuclear, tales como AON modificados con U7, U1 o U6 (u otras UsnRNP), o productos conjugados de los mismos, tales como oligonucleótidos conjugados con péptidos o complejados con nanopartículas.

El oligonucleótido de la presente divulgación también puede estar compuesto por una combinación de diferentes químicas de oligonucleótidos. Por ejemplo, pueden introducirse químicas diferentes de la química de desoxirribonucleótidos en uno o ambos extremos del ácido nucleico señuelo de la presente divulgación para mejorar su estabilidad. Por ejemplo, el oligonucleótido de la presente divulgación puede comprender una o más partes que incluyen 2'-O-metil ribonucleótidos y otras partes que contienen desoxirribonucleótidos. En una realización preferida, el oligonucleótido de la presente divulgación comprende una primera secuencia de ácido nucleico que comprende en uno o ambos extremos uno o más tipos de oligonucleótidos consecutivos diferentes de la química de los desoxirribonucleótidos (tal como cualquier química descrita en el párrafo anterior), tales como 2'-O-metil ribonucleótidos, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 2'-O-metil ribonucleótidos consecutivos, y que comprende una parte de desoxirribonucleótido entre estas otras partes químicas, tales como partes de 2'-O-metil ribonucleótido, protegiendo así la parte de desoxirribonucleótido del oligonucleótido en cada uno de sus extremos, y en el que los sitios DUX4 está(n) comprendido(s) dentro de la parte de desoxirribonucleótido del oligonucleótido. Dichos oligonucleótidos incluyen:

GAGGTAATCCAATCATGGA (SEQ ID NO: 17);

UGCGTAATCCAATCAGCGU (SEQ ID NO:18);

GCGUACGAUACCTGTGGGAGGTAATCCAATCATGGAGGCAGCCTGTGGGAGGT

AATCCAATCATGGAGGCAGAAUCCCAUGC (SEQ ID NO:19), y

AAACTGCCT CCAT G ATTGG ATT ACCT CCCACAGGGT CTTTT G ACCCT GTGGG AG

GTAATCCAATCATGGAGGCAGTTTCCCTTTTGGG (SEQ ID NQ:20);

en los que los nucleótidos subrayados representan 2'-O-metil ribonucleótidos.

Además, los enlaces internucleósidos pueden ser de cualquier tipo adecuado, tales como un enlace internucleósido fosfodiéster o un enlace internucleósido fosforotioato. El oligonucleótido de la presente divulgación puede comprender además diferentes tipos de enlaces internucleosídicos a lo largo de la molécula. Por ejemplo, una parte de los nucleósidos puede unirse con enlaces internucleósidos de fosforotioato mientras que otra parte puede estar unida con enlaces internucleósidos fosfodiéster. Los nucleótidos representativos que comprenden enlaces mixtos de fosforotioato y fosfodiéster incluyen:

G*C*G*(U/dT)*A*C*G*A*(U/dT)*A*CCTGTGGGAGGTAATCCAATCATGGAGGCAG

CCTGTGGGAGGTAATCCAATCATGGAGGCAGA*A*(U/d~Q*C*C*C*A*(U/d~n*G*C

(SEQ ID NO: ID NO:17 anterior; señuelo-3 en los ejemplos y figura 1 junto con su cadena complementaria); y

ñuelo-7 en los ejemplos y la figura 1, siendo este oligonucleótido un oligonucleótido autocomplementario monocatenario cuya estructura bicatenaria está formada por SEQ ID NO:16);

en los que * indica enlaces de fosforotioato y en los que los oligonucleótidos subrayados son desoxirribonucleótidos o 2'-O-metil ribonucleótidos.

Estas modificaciones pueden ser ventajosas porque permiten proteger el oligonucleótido señuelo de la degradación a través de enzimas de corte de ADN. Otros medios para proteger el oligonucleótido incluyen la adición de secuencias ITR o la unión del oligonucleótido a proteínas.

Los oligonucleótidos aislados empleados en la práctica de la invención, en general, tienen aproximadamente 10 a aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, y pueden tener, por ejemplo, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20 o aproximadamente 30, o aproximadamente 40, o aproximadamente 50, o aproximadamente 60, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130 o aproximadamente 140, o aproximadamente 150 nucleótidos o más de longitud dependiendo del número de sitios de unión a DUX4 y el tamaño de los espaciadores incluidos en el oligonucleótido, y también en la química del oligonucleótido.

Por ejemplo, el señuelo de ácido nucleico de la presente divulgación puede incluir una porción bicatenaria (ya sea formada por dos oligonucleótidos monocatenarios hibridados o por un único oligonucleótido bicatenario autocomplementario, como se describe anteriormente) que comprende de 13 a 150 nucleótidos de longitud, tal como aproximadamente 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más de 40 nucleótidos de longitud.

Además, según otra realización, el ácido nucleico señuelo está comprendido dentro de un vector. Según la presente invención, un "vector" es cualquier vehículo adecuado capaz de facilitar la transferencia del ácido nucleico señuelo de la presente divulgación a una célula diana. Los vectores adecuados incluyen plásmidos, fagómidos, virus y cualquier otro vehículo adecuado. Tal vector puede incluir, en particular, vectores plasmídicos o vectores virales.

Los vectores virales son un tipo preferido de vectores. Pueden derivar de un lentivirus, tal como el VIH-1, un retrovirus, tal como el virus de la leucemia murina de Moloney, un adenovirus, un virus adenoasociado; virus de tipo SV40; herpesvirus, tal herpes como el VHS-1 y un virus variolovacunal. Se pueden emplear fácilmente otros vectores no nombrados, pero conocidos en la técnica. Entre los vectores que han sido validados para aplicaciones clínicas y que pueden usarse para entregar secuencias antisentido, lentivirus, retrovirus y AAV muestran un mayor potencial para transducir células diana relevantes. En una realización particular de la invención, la célula diana es una célula de estirpe muscular, tal como un mioblasto, o un miotubo, o una miofibra madura. En otra realización, el vector utilizado para dirigirse a dicha célula del linaje muscular es un lentivirus o un AAV.

Cuando el ácido nucleico señuelo de la presente divulgación se incorpora a un vector, dicho ácido nucleico puede tener una longitud compatible con dicho vector, y el tamaño no está tan limitado como cuando se usa un oligonucleótido para poner en práctica la invención. Gracias a esta realización, el vector puede comprender cualquier número de sitios de unión a DUX4 que sea posible introducir dentro del vector teniendo en cuenta sus limitaciones de tamaño. Por ejemplo, la presente divulgación contempla la construcción de concatámeros que contienen múltiples sitios de unión a DUX4. Estos múltiples sitios de unión a DUX4 pueden comprender una única secuencia de unión de DUX4 o sitios de unión a diferentes secuencias. Gracias a este enfoque, se puede introducir una gran cantidad de señuelos de DUX4 dentro de la célula objetivo, lo que provoca una potente inactivación del factor de transcripción DUX4.

Por ejemplo, el vector, tal como un vector viral, como un vector lentiviral o un vector AAV, puede portar 1,2, 3, 4, 5 o más de 5 copias de una secuencia que comprende sitios de unión a DUX4, tales como la secuencia

T CG AG AAT AACCCAAT CAAATT AATTT AAT CAT AAT CCAAT CAAG AT AATT G AAT C

ATGGTAATTGAATCAGGTAATTGAATCATGGTAATCCAATCAC (SEQ ID NO:21),

la secuencia

T CG AGT AATTT AAT CAGCGT ACG AT AAT CCCAT GCGT AAT CCAAT CAGCGTACG A

T AAT CCCATGCGT AAT CCAAT CAGCGT ACG AT AAT CCCAT G CGC (SEQ ID NO:22)

o la secuencia

CCTGTGGGAGGTAATCCAATCATGGAGGCAGCCTGTGGGAGGTAATCCAATCA

TGGAGGCAG (SEQ ID NO:28).

La divulgación se refiere además a un vector, en particular un vector viral, tal como un vector lentiviral o AAV, que comprende un ácido nucleico señuelo que incluye uno o más sitios de unión para una proteína de factor de transcripción. En una realización particular, el vector comprende 1, 2, 3, 4, 5 o más de 5 sitios de unión para un factor de transcripción, tales como sitios de unión para el factor de transcripción DUX4. En otra realización, el vector comprende más de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 o incluso más de 700 sitios de unión, tales como sitios de unión para el factor de transcripción DUX4.

La divulgación también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico señuelo como se describe anteriormente, en particular en forma de oligonucleótido o incluido en un vector, en particular un vector viral como, por ejemplo, un vector lentiviral. Además del oligonucleótido o del vector, una composición farmacéutica también puede incluir un vehículo farmacéutica o fisiológicamente aceptable, tal como solución salina, fosfato de sodio, etc. La composición generalmente estará en forma de líquido, aunque no siempre es necesario que sea así. caso. Los vehículos, excipientes y diluyentes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfatos de calcio, alginato, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, jarabe acuoso, metilcelulosa, metil- y propilhidroxibenzoatos, aceite mineral, etc. La formulación también puede incluir agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, conservantes, agentes tamponadores, etc. En particular, la presente divulgación implica la administración de un oligonucleótido y, por lo tanto, es algo similar a la terapia génica. Los expertos en la técnica reconocerán que los ácidos nucleicos a menudo se administran junto con lípidos (por ejemplo, lípidos catiónicos o lípidos neutros, o mezclas de estos), frecuentemente en forma de liposomas u otro material micro- o nanoestructurado adecuado (por ejemplo, micelas, lipocomplejos, dendrímeros, emulsiones, fases cúbicas, etc.).

Las composiciones descritas en el presente documento se administran generalmente por vía entérica o parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa (i.v.), intraarterial, subcutánea, intramuscular (i.m.), intracerebral, intracerebroventricular (i.c.v.), intratecal (i.t.), intraperitoneal (i.p.), aunque no se excluyen otros tipos de administración.

Pueden formularse preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles según la técnica conocida usando agentes de distribución o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico aceptable por vía parenteral, por ejemplo, tal como una solución en 1,3-butanodiol. Si bien la administración puede ser local (es decir, in situ, directamente en un tejido, tal como el tejido muscular) o sistémica, normalmente la administración será local en el tejido muscular afectado, por ejemplo, al músculo esquelético, al músculo liso, al músculo cardíaco, etc. Según la forma de los oligonucleótidos o vectores que se administren y el tipo de tejido o célula al que se dirigen, pueden usarse técnicas como la electroporación, la sonoporación, una "pistola génica" (que libera partículas de oro recubiertas de ácidos nucleicos), etc.

Los expertos en la técnica reconocerán que la cantidad de un oligonucleótido o de un vector que contiene un ácido nucleico señuelo a administrar será una cantidad suficiente para inducir la mejora de los síntomas de la FSHD o incluso el tratamiento de la enfermedad. Dicha cantidad puede variar dependiendo de diversos factores, tales como el sexo, la edad, el peso, el estado físico general del paciente, etc., entre otros, y puede determinarse caso por caso. La cantidad también puede variar según otros componentes de un protocolo de tratamiento (por ejemplo, la administración de otros medicamentos, etc.). Generalmente, una dosis adecuada está en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, y más usualmente de aproximadamente 2 mg/kg/día a aproximadamente 10 mg/kg. Si se elige una administración basada en virus del ácido nucleico señuelo, las dosis adecuadas dependerán de diferentes factores, tales como el virus que se emplee, la vía de administración (intramuscular, intravenosa, intraarterial u otra), pero generalmente pueden oscilar entre 109 a 1015 partículas virales/kg. Los expertos en la técnica reconocerán que tales parámetros se elaboran normalmente durante los ensayos clínicos. Además, los expertos en la técnica reconocerán que, aunque los síntomas de la enfermedad pueden aliviarse completamente mediante los tratamientos descritos en el presente documento, este no tiene por qué ser el caso. Incluso un alivio parcial o intermitente de los síntomas puede ser de gran beneficio para el paciente. Además, el tratamiento del paciente puede ser de un solo acontecimiento, o al paciente se le administra el oligonucleótido o el vector en múltiples ocasiones, que pueden realizarse, dependiendo de los resultados obtenidos, con varios días de diferencia, varias semanas de diferencia o varios meses de diferencia, o incluso con varios años de diferencia.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describirán en la siguiente sección experimental, que se considerará únicamente como ilustrativa y que no limita el alcance de esta solicitud.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Señuelos representativos

Los señuelos son ADN bicatenario sintetizado como una sola cadena de ADN (señuelos 4-7) o como 2 oligonucleótidos que se hibridan entre sí (señuelos 1-3). Las modificaciones químicas son: * Modificaciones con 2'O-metilo con enlace fosforotioato. Las bases subrayadas tienen un enlace fosforotioato. Los conectores de hexaetilenglicol están representados por corchetes grises. Los recuadros indican los sitios de unión mínimos a DUX4. Para el señuelo 3, las bases mutadas utilizadas para generar Señuelo3-Mut se indican mediante flechas.

Figura 2: DUX4-Señuelo3 induce una regulación negativa de los genes cadena abajo de DUX4

Se representa el señuelo inyectado. Las flechas indican la posición de las bases mutadas en la hebra superior introducida para crear el Señuelo-Mut. * representa modificaciones con 2'O-metilo con enlace fosforotioato.

Las células FSHD se han transfectado de manera dependiente de la dosis con un señuelo de DUX4 (A) o un señuelo de DUX4 mutado en el día 2 de diferenciación (B). 48 h después de la transfección, se recogieron las células y se extrajo el ARN total. La RT se realizó utilizando oligonucleótidos polidT. A y B: Los niveles de expresión de 3 genes cadena abajo de DUX4 se midieron mediante qPCR. C: Se realizó una PCR que permitió la detección del ARNm de DUX4 y se ejecutó en un gel de agarosa (derecha). Como se esperaba, no se observó modulación del ARNm de DUX4 ya que el señuelo no se dirige al ARNm. Se usó B2M como gen de referencia.

Figura 3: DUX4-señuelo7 induce una regulación negativa de los genes cadena abajo de DUX4

Se representa el señuelo inyectado. Las bases subrayadas tienen un enlace fosforotioato. Las células FSHD se han transfectado con 1 gg de ADN. Cuatro días después de la diferenciación, se recogieron las células y se extrajo el ARN total. A: Se realizó una RT-qPCR para analizar la expresión de 3 genes cadena debajo de DUX4 y 1 gen de control (ZNF217). B: La expresión de DUX4 se analizó mediante PCR. Se usó B2M como gen de referencia. Las moléculas son ADN dúplex lineales con una interrupción en el medio de una hebra (flecha) Los conectores de hexaetilenglicol están representados por corchetes grises.

Figura 4: La transducción de células FSHD con un vector lentiviral que porta el señuelo de DUX4 induce una regulación negativa de los genes de la huella DUX4.

Las células SHD fueron transducidas con un vector lentiviral vacío o portador de (i) 5 veces la secuencia:

T CG AG AAT AACCC AAT C AAATT AATTT AAT C AT AAT CC AAT C AAG AT AATT G AAT C ATGGTAATTGAATCAGGTAATTGAATCATGGTAATCCAATCAC (L1; SEQ ,D N0:21) 0 (¡¡) ,a secuencia:

T CG AGT AATTT AAT CAGCGTACG AT AAT CCC AT GCGTAAT CC AAT C AGCGT ACG A TAATCCCATGCGTAATCCAATCAGCGTACGATAATCCCATGCGC (L2. S£Q |D N022)

Las células se recolectaron los días 3 y 4 después de la inducción de la diferenciación. Se realizaron qPCR para analizar la expresión de 3 genes cadena abajo de DUX4. La expresión de ZNF217 se utilizó como control. Se usó B2M como gen de referencia.

Figura 5: La inyección intramuscular del señuelo 3 induce una regulación negativa de los genes murinos cadena abajo de DUX4

Se sometieron a electroporación ratones C57bL6 con un plásmido de expresión DUX4 (pSC2) y Señuelo3 o Señuelo3-Mut. Cinco días después, se sacrificaron los ratones y se analizaron los niveles de expresión de 3 genes murinos cadena abajo de DUX4. El gen de referencia fue Psma2.

Figura 6: Más señuelos representativos

Los señuelos son ADN bicatenario sintetizado como una sola cadena de ADN (señuelos 6-11, en los que las flechas dobles indican la posición de los extremos 5' y 3' del oligonucleótido) o como 2 oligonucleótidos que se hibridan entre sí (señuelo 3). Las modificaciones químicas son:

• Cursiva: Modificaciones de 2'O-metilo

• Subrayado: bases que tienen un enlace fosforotioato

Los conectores de hexaetilenglicol se representan en los señuelos 6 y 9 como círculos. Los nucleótidos en negrita indican los sitios de unión mínimos a DUX4.

Figura 7: Validación del modelo de ratón

Los músculos tibiales anteriores (TA) se electrotransfirieron con el plásmido pSC2 que codifica DUX4. Los niveles de expresión tanto de DUX4 como de Tm7sf4 se analizaron mediante pPCR. Se realizó un análisis de varianza multiparamétrico (MANOVA) y una prueba a posteriori de Newman-Keuls. Se observó una fuerte correlación entre DUX4 y Tm7sf4 (n=18 músculos TA inyectados; R2 = 0,8948; p = 10e-8).

Figura 8: La inyección intramuscular de un vector viral que produce un señuelo de DUX4 induce una regulación negativa de los genes murinos cadena abajo de DUX4

Los músculos tibiales anteriores se inyectaron primero con AAV D3 (n=8) o AAV GFP (n=8) (2,5 10e10 vg/TA). Dos semanas más tarde, los TA se electrotransfirieron con el plásmido pCS2. Los niveles de expresión de DUX4 y Tm7sf4 se investigaron mediante qPCR. *p <0,05 (prueba de la T). Todos los datos representan la media desviación estándar.

Figura 9: La inyección intramuscular de vectores virales que producen diferentes señuelos de DUX4 induce una regulación negativa de los genes murinos cadena abajo de DUX4

Los TA se electrotransfirieron con pCS2 solo (n=18) o pCS2 señuelo (n=12 cada uno). Se investigaron los niveles de expresión de ambos DUX4 y Tm7sf4 por qPCR. Todos los datos representan la media error estándar de la media.

Figura 10: Los señuelos de DUX4 inducen una regulación negativa de un gen cadena abajo de DUX4 Las células FSHD se transfectaron con diferentes señuelos. Las células se recolectaron los días 3 y 4 después de la inducción de la diferenciación. Se realizó una qPCR para analizar la expresión de 3 genes cadena abajo de DUX4 Ejemplos

Material y métodos

Preparación de señuelos

Las secuencias de ADN que contenían el supuesto sitio de unión a DUX4 (en lo sucesivo denominado señuelo) se diseñaron según el motivo DUX4-fl descrito anteriormente (14). Se sintetizaron cuatro oligonucleótidos bicatenarios modificados:

Señuelo-1 (directo: G*A*G*GTAATCCAATCATG*G*A; inverso: U*C*C*ATGATTGGATTACC*U*C),

Señuelo-2 (directo: U*G*CGTAATCCAATCAGCG*U; inverso: A*C*GCTGATTGGATTACGC*A),

Señuelo-3 (directo: G*C*G*U*A*C*G*A*U*A*cctGTGGGAGGTAATCCAATCATGGAGGCAGcctGTGGG AGGTAATCCAATCATGGAGGCAGA*A*U*C*C*C*A*U*G*C; inverso: G*C*A*U*G*G*G*A*U*U*CTGCCTCCATGATTGGATTACCTCCCACaggCTGCCTCC ATGATTGGATTACCTCCCACaggU*A*U*C*G*U*A*C*G*C), y

Señuelo 3-Mut (directo: G*C*G*U*A*C*G*A*U*A*cctGTGGGAGGTACTCCTATGATGGAGGCAGcctGTGGG AGGTACTCCTATGATGGAGGCAGA*A*U*C*C*C*A*U*G*C; inverso: G*C*A*U*G*G*G*A*U*U*CTGCCTCCATCATAGGAGTACCTCCCACaggCTGCCTC CATCATAGGAGTACCTCCCACaggU*A*U*C*G*U*A*C*G*C)

en los que * representa 2'O-metil ribonucleótidos con enlaces fosforotioato.

Se sintetizaron los tres ADN dúplex lineales con un conector de hexaetilenglicol en ambos extremos que imitan el ADN bicatenario:

Señuelo-4 (TCCAATCATGGAGGCAG—CTGCCTCCATGATTGGATTACCTCCCAC—

GTGGGAGGTAA);;

Señuelo-5 (T ACGCT G ATTGGATT ACGCATGGG--CCCATGCGT AAT CCAAT CAGCGT ACG AT--ATCG);

Señuel0-6 (CTGCCTCCATGATTGGATTACCTCCCACAGG— CCTGTGGGAGGTAATCCAATCATGGAGGCAGCCT--AGG).

en los que - representa el conector de hexaetilenglicol.

Se sintetizaron dos dúplex lineales que imitan el ADN bicatenario:

Señuelo7:

A*A*ACTGCCT CCAT G ATTGGATT ACCT CCCACAGGGT CTTTT G ACCCT GTGGG A GGTAATCCAATCATGGAGGCAGTTTCCCTTTTG*G*G

Señuelo7-Mut:

A*A*A*CT GCCT CCAT CAT AGG AGT ACCT CCCACAGGGT CTTTT G ACCCT GTGGG AGGTACTCCTATGATGGAGGCAGTTTCCCTTTTG*G*G

También se sintetizaron más señuelos lineales que imitan el ADN bicatenario y se representan en la figura 6 (señuelos 8 a 11)

Los oligonucleótidos directos e inversos para los señuelos 1, 2 y 3 se hibridaron a una concentración equimolar en un volumen final de 50 gl y se calentaron a 95 °C durante 4 min. Para los señuelos 4 a 11, se calentó una solución de 1 gg/gl a 95 °C durante 4 min. El acoplamiento se realizó con la ligasa T4 según el protocolo del fabricante (Biolabs). Para las construcciones lentivirales, los oligonucleótidos para:

Señuelo L1 (directo: TCGAGAAT AACCCAAT CAAATT AATTT AAT CAT AATCCAAT CAAGAT AATT GAAT C ATGGT AATT GAAT CAGGT AATT GAAT CATGGT AATCCAAT CAC; inverso: TCGAGTGATTGGATTACCATGATTCAATTACCTGATTCAATTACCATGATTCAATT ATCTTGATTGGATTATGATTAAATTAATTTGATTGGGTTATTC) y

Señuelo-L2 (directo: TCGAGTAATTTAATCAGCGTACGATAATCCCATGCGTAATCCAATCAGCGTACGA TAATCCCATGCGTAATCCAATCAGCGTACGATAATCCCATGCGC; inverso: TCGAGCGCATGGGATTATCGTACGCTGATTGGATTACGCATGGGATTATCGTAC GCTGATTGGATTACGCATGGGATTATCGTACGCTGATTAAATTAC)

se hibridaron a una concentración equimolar en un volumen final de 50 pl y se calentaron a 95 °C durante 4 min y después se clonaron en pBlue Script usando el sitio de restricción Xhol, permitiendo así la formación de concatámeros. Este vector lanzadera luego fue digerido por Notl y Apal antes de ser clonado en el vector lentiviral pLL3.7 digerido por las mismas enzimas y previamente modificado para introducir un módulo de neomicina eliminando el gen GFP usando los sitios de restricción Nhel y EcoRI.

Transfección y transducción

Las células utilizadas para la transfección son células FSHD inmortalizadas aisladas de un mosaico de pacientes y descritas previamente (15). Los clones se cultivaron en medio de proliferación [4 vols de DMEM, 1 vol de medio 199, FBS al 20%, gentamicina 50 mg/ml (Life Technologies, Saint Aubin, Francia)] suplementado con insulina 5 mg/ml, dexametasona 0,2 mg/ml, b-FGF 0,5 ng/ml, hEGF 5 ng/ml y fetuina 25 mg/ml. El medio de diferenciación estaba compuesto por DMEM suplementado con insulina (10 mg/ml). Los mioblastos se colocaron en placas a 25000 células/cm2. Dos días más tarde, el medio de proliferación fue reemplazado por medio de diferenciación. La transfección se realizó al día 2 de la diferenciación utilizando el reactivo lipofectamina RNAIMAX según el protocolo del fabricante (Invitrogen) con una proporción de 1:5 entre ADN y RNAIMAX. Las células se recolectaron 4 días después de desencadenar la diferenciación.

Los vectores pLL3.7-Señuelo (L1 y L2) se produjeron en células 293 de riñón embrionario humano mediante transfección cuádruple de plásmidos que codifican proteínas gag-pol, proteína Rev, proteínas de la envuelta (VSVg) y el transgén usando PEI. Tras 48 y 72 h, el vector viral se filtra (0,22 mm) antes de usarse directamente para transducir mioblastos. Las células transducidas se seleccionaron durante 15 días utilizando G418 (0,5 pg/pl de concentración final). Las células transducidas eran células FSHD primarias aisladas de un cuádriceps fetal (16 semanas de desarrollo con 4 repeticiones D4Z4) o de un trapecio adulto (25 años con 4,4 repeticiones D4Z4). A continuación, las células se sembraron en placas a 25000 células/cm2 y, 2 días más tarde, el medio de proliferación fue reemplazado por medio de diferenciación. Las células se recogieron el día 4 de diferenciación.

Experimentos in vivo

Músculos tibiales anteriores (TA) de ratones hembra C57BI6 de 6 a 8 semanas de edad fueron electrotransferidos (modo: LV; voltaje: 200V/cm; longitud del pulso: 20 ms; pulsos: 8; intervalo: 500 ms; polaridad: unipolar) con 2 pg de plásmido de expresión pCS2-mkgDUX4 (Addgene n.° 21156) y 10 pg de Señuelo-3 o Señuelo-3-Mut en un volumen final de 40 pl. Cinco días después de la electrotransferencia, los ratones se sacrificaron y los músculos TA se congelaron en nitrógeno líquido. Los ARN se extrajeron utilizando el kit FastPrep (MP Biomedicals) según las instrucciones del fabricante.

Extracción de ARN y PCR

Se añadió trizol directamente a las células o los músculos de ratón y la extracción de ARN se realizó según el protocolo del fabricante (Life Technologies, Saint Aubin, Francia). La concentración de ARN se determinó utilizando un espectrofotómetro nanodropND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, EE.UU.). La RT se llevó a cabo sobre 1 pg de ARN total con el kit de síntesis de ADNc de primera cadena Transcriptor de Roche (Roche, Meylan, Francia) a 50 °C durante 60 min con 1 pl de oligo dT en un volumen final de 10 pl. Las PCR cuantitativas se realizaron en un volumen final de 9 ml con 0,4 pl de producto RT, 0,18 pl de cada cebador directo e inverso 20 pmol/pl (tabla 1) y 4,5 pl de mezcla maestra SYBR Green 2x (Roche, Meylan, Francia). La qPCR se realizó por triplicado en un sistema de PCR en tiempo real LightCycler 480 (Roche, Meylan, Francia). Las condiciones del ciclado de qPCR fueron 94 °C durante 5 min, seguidas de 50 ciclos a 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 15 s y 72 °C durante 15 s. Las PCR para DUX4 se realizaron como se describió anteriormente (16). Se utilizó B2M normalizado.

Experimentos de transducción de AAV:

Para las construcciones de AAV (pAAV-señuelo), los oligonucleótidos

directo (CCTGTGGGAGGTAATCCAATCATGGAGGCAGCCTGTGGGAGGTAATCCAATCATGGAGGCAG) e inverso (CTGCCTCCATGATTGGATTACCTCCCACAGGCTGCCTCCATGATTGGATTACCTCCCACAGG) se hibridaron a una concentración equimolar en un volumen final de 20 pl y se calentaron a 95 °C durante 4 min y luego se clonaron en el plásmido pGG2 que había sido previamente digerido por las enzimas de restricción Xbal y Hpal (se crearon extremos romos usando Klenow).

Los vectores AAV se produjeron en células de riñón embrionario humano 293 mediante el método de triple transfección utilizando la técnica de precipitación con fosfato de calcio con el plásmido señuelo pAAV, el plásmido pXX6 que codifica las secuencias adenovirales esenciales para la producción de AAV, y el plásmido pRepCAp que codifica la cápside de AAV-1. A continuación, el virus se purifica mediante un ciclo de gradiente de iodixanol y se lava y concentra utilizando la columna Amicon Ultra. Las preparaciones virales finales se mantuvieron en solución de PBS a -80 °C. El título de partículas (número de genomas virales) se determinó mediante PCR cuantitativa. Las inyecciones de TA se realizaron en ratones hembra C57BI6 de 6-8 semanas de edad con 2,5.10e10 genomas virales de AAV.

Resultados

Experimentos in vitro: uso de señuelos de oligonucleótidos

Para seleccionar la trampa más eficiente para DUX4, se diseñaron varios señuelos según el motivo DUX4-fl descrito anteriormente (14). En este artículo, los autores han identificado 2 motivos, TAAYYBAATCA y TAAYBYAATCA (según el código DNA IUB), correspondientes respectivamente a sitios asociados a MaLR y sitios no asociados a repeticiones, lo que da lugar a 18 secuencias posibles. Los inventores seleccionaron 1 de ellos: TAATCCAATCA para diseñar sus señuelos. Se diseñaron varios señuelos (figura 1) y se transfectaron en células FSHD inmortalizadas. Los señuelos-1, -2, -4, -5 y -6 indujeron solo una modificación moderada de la expresión de los genes cadena abajo de DUX4. Sin embargo, se observó una fuerte disminución de la expresión de TRIM43, MBD3L2 y ZSCAN4 de manera dependiente de la dosis en presencia de Señuelo-3 (figura 2A) o Señuelo 7 (figura 3A). Como control, cuando se transfectó Señuelo-3-Mut (que porta la misma secuencia que señuelo-3, pero se mutaron 3 nucleótidos en el motivo DUX4-fl), la disminución fue mucho menos importante (figuras 2 y 3).

A continuación, se estudió el nivel de expresión de DUX4 en las células transfectadas. Dado que los señuelos atrapan a DUX4, no se esperaba ninguna variación en el ARNm de DUX4. Como se muestra en la figura 2C, la transfección de señuelo-3 o señuelo-3-Mut no indujo una modificación de la expresión de DUX4. Se obtuvieron resultados similares con el señuelo 7 (Figura 3B).

Experimentos in vitro: uso de vectores virales

También se vectorizó un señuelo y se introdujeron el señuelo-L1 y L2 en los mioblastos FSHD usando un vector lentiviral. La presencia de señuelos L1 o L2 en estas células indujo una expresión negativa de los genes cadena abajo de DUX4 (TRIM43, MBD3L2, DEFB103 y ZSCAN4), pero no se observó una regulación negativa de ZNF217 (como se esperaba, ZNF217 no es uno de los genes "huella" de DUX4). Este experimento se realizó 3 veces (figura 4).

Experimentos in vivo

La capacidad de señuelo-3 para atrapar DUX4 también se investigó in vivo. Los inventores cotransfectaron un plásmido de expresión DUX4 y Señuelo-3 o Señuelo-3-Mut en el músculo tibial anterior (TA) de ratones hembra C57BI6 de 6 a 8 semanas de edad. Como se muestra en la figura 5, mientras que Señuelo-3-Mut no pudo inhibir la expresión de los genes cadena abajo de DUX4, con Señuelo-3 la expresión de estos genes se redujo de 2,5 a 6 veces.

Experimentos in vivo: validación adicional del enfoque

Se realizaron más experimentos in vivo (figuras 7-9) para confirmar el potente efecto de los señuelos.

En primer lugar, se verificó la correlación entre la expresión de DUX4 y un gen diana DUX4 (mTm7sf4) en músculos TA de ratón, después de la electrotransferencia del plásmido pSC2 que codifica DUX4. La figura 7 muestra una correlación estricta entre la expresión de DUX4 y la expresión de mT m7sf4. En consecuencia, este gen diana se utilizó para determinar el efecto de los señuelos in vivo.

Luego, los vectores AAV que llevan en su genoma dos sitios de unión a DUX4 como se representa en la figura 8 se produjeron e inyectaron en músculos TA de ratones que también recibieron mediante electrotransferencia un plásmido codificante de DUX4. Los resultados demuestran que el AAV que porta el oligonucleótido señuelo (AAV D3) disminuye significativamente la expresión de mTm7sf4 en comparación con un AAV de control que porta GFP, lo que demuestra que se puede lograr una inhibición eficaz de DUX4 in vivo a través de la transferencia de señuelos viral.

Los oligonucleótidos señuelo también se electrotransfirieron directamente a los músculos TA de ratones en presencia de un plásmido codificante de DUX4 (figura 9). Los resultados muestran una fuerte disminución de la expresión de Tm7sf4 en presencia de los señuelos en comparación con la electrotransferencia del plásmido codificante de DUX4 solo, lo que demuestra que los señuelos de oligonucleótidos de diferentes secuencias también lograron una inhibición eficiente de DUX4 in vivo.

La figura 10 muestra que la transfección de señuelos de oligonucleótidos de diferentes secuencias conduce a una disminución de la expresión de 3 genes cadena abajo de DUX4.

En conjunto, estos datos muestran que los señuelos de DUX4 son herramientas poderosas para lograr la represión de los genes diana de DUX4. Por lo tanto, estos señuelos, tanto si se administren como oligonucleótidos o como parte de un genoma viral, representan herramientas inestimables para el tratamiento de la FSHD.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1 Un vector viral que comprende un señuelo de ácido nucleico de DUX4 para su uso en un método para el tratamiento de la FSHD, en el que el señuelo de ácido nucleico de DUX4 comprende uno o más sitios de unión a DUX4.
2. 2. - El vector viral para su uso según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico comprende 1,2, 3, 4, 5 o más de 5 sitios de unión a DUX4.
3. 3. - El vector viral para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el/los sitio(s) de unión a DUX4 tiene(n) la secuencia TAAYYBAATCA (SEQ ID NO:1) o TAAYBYAATCA (SEQ ID NO:2).
4. 4. - El vector viral para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el/los sitio(s) de unión a DUX4 se selecciona(n) del grupo que consiste en TAACCCAATCA (SEQ ID NO:3), TAATTTAATCA (SEQ ID NO:4), TAATCCAATCA (SEQ ID NO:5), y TAATTGAATCA (SEQ ID NO:6).
5. 5. - El vector viral para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, que comprende la secuencia de SEQ ID NO:21,22 o 28.
6. 6. - El vector viral para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el vector viral es un vector lentiviral o un vector AAV.
7. 7.- Un señuelo de ácido nucleico de DUX 4, para su uso en un método para el tratamiento de la FSHD, en el que el señuelo de ácido nucleico comprende uno o más sitios de unión a DUX4 y tiene una estructura bicatenaria.
8. 8. - El señuelo de ácido nucleico de DUX4 para su uso según la reivindicación 7, que comprende 1,2, 3, 4, 5 o más de 5 sitios de unión a DUX4.
9. 9. - El señuelo de ácido nucleico de DUX4 para su uso según la reivindicación 7 u 8, en el que el/los sitio(s) de unión a DUX4 tiene(n) la secuencia TAAYYBAATCA (SEQ ID NO:1) o TAAYBYAATCA (SEQ ID NO:2).
10. 10. - El señuelo de ácido nucleico de DUX4 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el/los sitio(s) de unión a DUX4 se selecciona(n) del grupo que consiste en TAACCCAATCA (SEQ ID NO:3), TAATTTAATCA (SEQ ID NO:4), TAATCCAATCA (SEQ ID NO:5) y TAATTGAATCA (SEQ ID NO:6).
11. 11. - El señuelo de ácido nucleico de DUX4 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que es un oligonucleótido.
12. 12. - El señuelo de ácido nucleico de DUX4 para su uso según la reivindicación 11, en el que el oligonucleótido comprende o consiste en la secuencia que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID NO:7 a 28, tal como la secuencia que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID NO:7 a 22.