JP2022543474A - アンチセンスオリゴヌクレオチドは、abca4の異常スプライシングをレスキューする - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、医学及び免疫学の分野に関する。特に、本発明は、ABCA4関連の状態の処置、予防及び/又は遅延において使用することができる新規アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
ABCA4における常染色体劣性変異は、中心視力喪失によって特徴付けられ、全盲に至ることが多い進行性障害である、スターガルト病を引き起こす。スターガルト病の典型的な特質は、患者の眼底全体にわたり分布した多くの黄色の点(斑点)の存在である。ABCA4遺伝子は、50個のエクソンで構成され、2273個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。このタンパク質は、錐体及び杆体視細胞の外節において発現され、光伝達後の老廃物の除去において重要な役割を果たす。
第1の態様では、本発明は、配列番号4に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに結合する、及び/又は配列番号4に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的である、スプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号8、9及び10からなる群から選択されるポリヌクレオチドに結合するか、又は配列番号8、9及び10からなる群から選択されるポリヌクレオチドと相補的である。より好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号5、6及び7からなる群から選択されるポリヌクレオチドに結合するか、又は配列番号5、6及び7からなる群から選択されるポリヌクレオチドと相補的である。さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号12、13、14、16、17、18、20、21、22、24、25、26、28、29、30、32、33、34、36、37、38、40、41及び42からなる群から選択されるポリヌクレオチドに結合するか、又は配列番号12、13、14、16、17、18、20、21、22、24、25、26、28、29、30、32、33、34、36、37、38、40、41及び42からなる群から選択されるポリヌクレオチドと相補的である。
定義により、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)は、その標的に対して実質的に相補的(アンチセンス)であり、AONが、対応するプレmRNA分子に結合することを可能にし、これにより、理論に制約されることは望まないが、スプライシングに必須なタンパク質の結合を防止する。本発明者らが、ABCA4におけるいくつかの変異について以前に示した通り(国際公開第2018/109011号)、通常、このような結合の欠如は、標的化されたエクソンのスキッピングをもたらす。
c.5196+1013A>G。この変異は、ABCA4のエクソン36及び37の間における129-nt偽エクソンの包含をもたらす。
本文書及びその特許請求の範囲において、動詞「を含む」及びその活用は、その限定されない意味において、この単語の前にある項目が含まれるが、特に言及されていない項目が除外されないことを意味するように使用される。加えて、不定冠詞「1つの(a)」又は「1つの(an)」による要素の参照は、要素のうち唯一のものが存在すると文脈が明らかに要求しない限り、要素のうち2つ以上が存在する可能性を除外しない。よって、不定冠詞「1つの(a)」又は「1つの(an)」は通常、「少なくとも1つ」を意味する。
AON設計
AONを設計するために、変異のそれぞれについて、より小さい目的の領域を選択した。変異c.5196+1013A>Gについて、標的領域は、配列番号8によって表され、変異c.5196+1056A>Gについて、標的領域は、配列番号9によって表され、変異c.5196+1137G>A及びc.5196+1217C>Aについて、標的領域は、配列番号10によって表される。全オリゴヌクレオチドをin silico RNA構造予測に付し、その結果から、8種のAONを設計し、順番を付けた(表2)。
AONの設計後に、HEK293T細胞に、野生型ABCA4遺伝子の一部(配列番号44)又は表2に記載されている異なる標的イントロン36変異、すなわち、c.5196+1013A>G、c.5196+1056A>G及びc.5196+1216C>Aを有する変異体形態(配列番号45、46及び47)のいずれかを含有するミディジーンをトランスフェクトした。変異毎に、野生型又は変異体ミディジーントランスフェクト細胞を、AONなし(NT)、特異的PEに対して設計されたAONあり(c.5196+1216C>Aに対するAON1~4、並びにc.5196+1013A>G及びc.5196+1056A>Gに対するAON5~8)、又は陰性対照として作用するセンスオリゴヌクレオチドあり(SON)(配列番号43)のいずれかで処置した。トランスフェクション48時間後に、細胞を収集し、RNAを単離した。その後、RT-PCR解析を行って、いずれのAONが、スプライス欠損を補正することができたか決定した。
製造業者のプロトコールに従ってヌクレオスピンRNAクリーンアップ(NucleoSpin RNA Clean-up)キット(カタログ番号740955-50;Macherey-Nagel、Duren、Germany)を使用することにより、全RNAを単離した。RNAを定量化し、製造業者の説明書に従ってアイスクリプト(iScript)cDNA合成キット(カタログ番号1708891;Bio-Rad、Hercules、CA)を使用することにより、1μg RNAからcDNAを合成した。最後に、配列番号48及び配列番号49によって表されるABCA4プライマーを使用してネステッドPCRを行うことにより、AONの有効性を評価した。トランスフェクション効率を評価するために、次のプライマー対、配列番号50及び配列番号51を使用して、ロドプシンのエクソン5を増幅した。
図3に示す通り、PE挿入毎に、AONは、スプライシング欠損を完全に又は少なくとも部分的に回復することができる。より詳細には、c.5196+1216C>Aバリアントについて、AON1及びAON2の両方は、異常にスプライスされたミディジーンを正確にスプライスされたバージョンへと完全に変換し、一方、AON3及びAON4は、スプライシング欠損を実質的に回復した(図3A)。c.5196+1056A>G変化について、AON5は、最も強力なAONであるように思われた。AON7について、また、やや小さい程度であるがAON6について、PE含有転写物の大部分も変換された。AON8は、スプライス欠損を部分的に回復することができた(図3B)。最後に、c.5196_1013A>G変化について、AON5及びAON6は、最も強力なAONであるように思われた。AON7は、AON(他のバリアントに対して設計)及びPEの間の1ヌクレオチドミスマッチにもかかわらず、依然として、スプライシングを少なくとも部分的に制御することができた。c.5196_1013A>G変化について、AON8は、いかなる有効性も示さず、この結果は、その位置が、このバリアントによって挿入された129-nt PEの外側にあることを考慮すると、全く予想外という訳でもない(図3C)。
その結果得られるc.5196+1137G>A変異のPEバリアントは、ミディジーンアッセイにおいてほとんど検出不能であったため、iPSC技術を用いて、このPEを標的とするAONの有効性を評価した。他方のアレルにおける部分的ABCA4欠失及びミスセンス変異(c.[2918+775_3328+640del;4462T>C]p.[Ser974Glnfs*64;Cys1488Arg])と併せてc.5196+1137G>Aバリアントを有するSTGD1を有する患者に由来する血液細胞をiPS細胞へとリプログラミングし(Sangermanoら、2016)、その後、30日間にわたり光受容体前駆細胞(PPC)へと分化させた。28日目に、AON1~4(又はSON)を1μMの最終濃度で細胞に添加した。29日目に、シクロヘキシミド(CHX)を添加して、中途終止コドンを有する転写物のナンセンス媒介性崩壊を遮断した。最後に、30日目に、細胞を採取し、RNA解析に付した(上述の通り)。この場合、配列番号52によって表されるエクソン3におけるフォワードプライマー及び配列番号53によって表されるエクソン4におけるリバースプライマーを使用して、アクチン(ACTB)を増幅して、試料を正規化した。
図4において観察され得る通り、PE挿入は、PPCにおいてより容易に検出された。加えて、検査した4種のAONのうち2種(AON2及び3)は、PE含有ABCA4転写物から正確にスプライスされた産物への変換に成功した。
異なるPE(77-nt、129-nt及び177-nt)の全てに対し、AONは、スプライス欠損を有効に回復することができ、これを同定した。c.5196+1013A>Gについて、AON5及びAON6は、最も効果的なAONであるように思われ、一方、c.5196+1056A>Gについて、PE挿入は、AON5、AON6又はAON7によって最もよく防止されたように見える。c.5196+1137G>Aについて、AON2及びAON3は、少なくともPPCにおいて、最も強力であるように見えた。最後に、c.5196+1216C>Aについて、AON1及びAON2は、スプライス欠損を完全に回復したが、AON3及びAON4もまた、スプライシング補正を示した。
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Claims (14)
- 配列番号4に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに結合する、及び/又は配列番号4に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと相補的である、スプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、好ましくは、配列番号8、9及び10からなる群から選択されるポリヌクレオチドに結合するか、又は配列番号8、9及び10からなる群から選択されるポリヌクレオチドと相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド、より好ましくは、配列番号5、6及び7からなる群から選択されるポリヌクレオチドに結合するか、又は配列番号5、6及び7からなる群から選択されるポリヌクレオチドと相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド、さらにより好ましくは、配列番号12、13、14、16、17、18、20、21、22、24、25、26、28、29、30、32、33、34、36、37、38、40、41及び42からなる群から選択されるポリヌクレオチドに結合するか、又は配列番号12、13、14、16、17、18、20、21、22、24、25、26、28、29、30、32、33、34、36、37、38、40、41及び42からなる群から選択されるポリヌクレオチドと相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドが、RNA残基、DNA残基、又はヌクレオチドアナログ若しくは等価物であり得る、請求項1に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 約8~約40ヌクレオチド、好ましくは、約10~約40ヌクレオチド、より好ましくは、約14~約30ヌクレオチド、より好ましくは、16、17、18、19、20、21、22又は23ヌクレオチド等の約16~約23ヌクレオチドの長さを有する、請求項1に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 配列番号11、15、19、23、27、31、35及び39からなる群から選択される配列を含むか、又は配列番号11、15、19、23、27、31、35及び39からなる群から選択される配列からなる、請求項1~3のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 2’-O-メチル修飾されたリボース、2’-O-エチル修飾されたリボース、2’-O-プロピル修飾されたリボース及び/又はこれらの修飾を有するハロゲン化された誘導体等の置換された誘導体等の、少なくとも1個の2’-Oアルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、好ましくは、少なくとも1個の2’-O-プロピル修飾されたリボースを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- ホスホロチオエート骨格を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 当該分子の発現を促す条件下に置かれると、請求項1~4のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現する、ウイルスベクター。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項7に記載のウイルスベクター及び薬学的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物。
- 硝子体内投与用であり、0.05mg~5mgの範囲の総アンチセンスオリゴヌクレオチドの量で投与される、請求項8に記載の医薬組成物。
- 硝子体内投与用であり、片眼当たり0.1~1mgの範囲の、スプライシングを制御するための総アンチセンスオリゴヌクレオチドの量、例えば片眼当たり約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9又は1.0mgのスプライシングを制御するための総アンチセンスオリゴヌクレオチドの量で投与される、請求項8及び9に記載の医薬組成物。
- 医薬としての使用のための、好ましくはABCA4のスプライシングを調整することを必要とするABCA4関連疾患又は状態を処置するための医薬としての使用のための、請求項1~4のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項7に記載のベクター又は請求項8~10のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- ABCA4のスプライシングを調整することを必要とするABCA4関連疾患又は状態を処置するための、請求項1~4のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項7に記載のベクター又は請求項8~10のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
- 細胞におけるABCA4のスプライシングを調整するための方法であって、前記細胞を、請求項1~4のいずれか一項に記載のスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項7に記載のベクター又は請求項8~10のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む方法。
- 前記ABCA4関連疾患又は状態が、スターガルト病である、請求項11に記載の使用のためのスプライシングを制御するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項12に記載の使用又は請求項13に記載の方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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