JP7113532B2 - スタルガルト病の処置のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

Description

本発明は、医学およびバイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、眼疾患、好ましくは、黄斑ジストロフィー、より好ましくは、スタルガルト病の処置、予防および／または遅延に適用可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関する。

スタルガルト病（ＳＴＧＤまたはＳＴＧＤ１）は、中心視野の進行性の障害を引き起こす最も一般的な遺伝性黄斑ジストロフィーであり、一般に小児期または青年期に発症し、その後の成人期に発症することはほとんどなく、一般に後に発症する程、それに伴う予後が良好である。この疾患は、８，０００～１０，０００人に１人の罹患率を有し、視細胞特異的なＡＴＰ結合カセットトランスポーターＡＢＣＡ４をコードする遺伝子の疾患を引き起こす突然変異と関連づけられる常染色体劣性遺伝様式を有する。このタンパク質は、２２７３のアミノ酸を含み、主に網膜において発現し、縁および錐体外節円板に集中する。それは、Ｎ－レチニリデン－ホスファチジルエタノールアミンを視細胞円板（photoreceptor disk）の内腔面から細胞質側表面にフリップすると考えられている。スタルガルト病は、網膜色素上皮における、大量に沈着したリポフスチン内容物、有害物質除去の不全および視細胞の著しい減少と密接に関連づけられている。ＡＢＣＡ４がなくなるか、または機能不全のときに、リポフスチンの主要な成分であるジ－レチノイド－ピリジニウム－エタノールアミンが生成される。実際に、ＡＢＣＡ４がスタルガルト病の基となる遺伝子であることを確認した複数の報告が公開され、多く（約１０００）の疾患を引き起こすバリアントを示しており、そのうちの半分以上が一度しか記載されていない。スタルガルト病の症例のおよそ７５％および常染色体劣性遺伝錐体桿体ジストロフィー（ＣＲＤ）の患者のおよそ３０％でＡＢＣＡ４の両アレル性バリアント（Biallelic variant）が特定された。突然変異の大部分が、ミスセンス突然変異であり、ナンセンス突然変異、小さな挿入／欠失、およびＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす突然変異が続く。北欧および米国（約３０％）の異常に高い割合のスタルガルト病症例は、たった１つのＡＢＣＡ４バリアントの結果である。３番目に多いＡＢＣＡ４バリアント、イントロン３８に存在するｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃが、ＡＢＣＡ４のｍＲＮＡにおけるエクソン３９のスキッピング、またはエクソン３９＋エクソン４０のスキッピングのために重症型のスタルガルト病を引き起こすことが、最近示された（Aukrust et al. The intronic ABCA4 c.5461-10T>C variant, frequently seen in patients with Stargardt disease, causes splice defects and reduced ABCA4 protein level. Acta Ophthalmol 2016 Oct 24:1-7；Sangermano et al. 2016. Photoreceptor progenitor mRNA analysis reveals exon skipping resulting from the ABCA4 c.5461-10T>C mutation in Stargardt disease. Ophthtalmology 123(6):1375-1385）。エクソン３９のスキッピングは、１２４ヌクレオチドのフレームシフト欠失をもたらすのに対し、エクソン３９および４０の二重スキップは、２５４ヌクレオチドのフレームシフト欠失をもたらす。特に、タンパク質のそのような短いバージョンは検出されておらず、それは、それらが不安定であるという理由の可能性が高い（Aukrust et al. 2016）。西欧諸国のおよそ７０００人のスタルガルト病患者がこの特定の突然変異に苦しんでいると推定される。

スタルガルト病を処置するための主要な３つの経路の介入は、現在、幹細胞療法、遺伝子補充療法およびさまざまな薬学的なアプローチである。遺伝性眼疾患を処置するための比較的新しい治療法の開発は、突然変異遺伝子から転写されるｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の使用である。ＡＯＮは、一般に、配列が標的ｐｒｅ－ｍＲＮＡ分子の配列と相補的であるため、スプライシングを妨げることができる小さなポリヌクレオチド分子（１６から２５ｍｅｒ）である。想起されるメカニズムは、相補的なＡＯＮの標的配列への結合時に、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ内の標的とされる領域がスプライシング因子を妨げ、それが、その結果として改変されたスプライシングをもたらすようなメカニズムである。治療的に、この方法論は、ａ）突然変異が隠れたスプライシング部位を活性化する遺伝子の正常なスプライシングを再び指示するため、およびｂ）ｍＲＮＡの読み枠が完全なままであり、（部分的に）機能的なタンパク質が産生されるような形で（タンパク質短縮）突然変異を保有するエクソンをスキップするための２つの方法に使用することができる。両方法は、既に重度の遺伝性障害を有する患者に首尾よく適用されている（Scaffidi and Misteli. 2005. Reversal of the cellular phenotype in the premature aging disease Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Nat.Med 11(4):440- 445；Cirak et al. 2011. Restoration of the Dystrophin-associated Glycoprotein Complex after Exon Skipping Therapy in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther 20:462-467；Cirak et al. 2011. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet 378(9791):595-605；Goemans et al. 2011. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med 364(16):1513-1522）。眼疾患に対して、ＡＯＮは、レーバー先天黒内障、またはＬＣＡの処置に有望であることが示された（国際公開第２０１２／１６８４３５号パンフレット；国際公開第２０１３／０３６１０５号パンフレット；国際公開第２０１６／０３４６８０号パンフレット；国際公開第２０１６／１３５３３４号パンフレット）。さらに、国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレットは、アッシャー症候群ＩＩ型の処置、予防または遅延のために、エクソン１３、エクソン５０およびＰＥ４０のスキッピング、ならびに／またはエクソン１２の保持に向けられたＵＳＨ２Ａ ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするためのエクソンスキッピングＡＯＮについて開示している。国際公開第２０１５／００４１３３号パンフレットは、スタルガルト病の処置のために、ＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン１０のスキッピングにＡＯＮを使用することについて開示している。したがって、ＡＯＮは、スタルガルト病を含むいくつかの遺伝性眼疾患の処置におけるエクソンスキッピングに関して記載されてきたが、とりわけ、エクソン保持に関連する場合、スタルガルト病の処置において、さらに特定するなら、エクソン３９スキッピングを引き起こすｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異が原因となるスタルガルト病の処置のために、ＡＯＮベースの方法に対して強いニーズがあるようである。

本発明は、スタルガルト病の処置、遅延または予防に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関する。さらに特定するなら、本発明は、ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおける少なくとも１つのエクソン、好ましくは、エクソン３９のスキッピングを阻害することができるＡＯＮであって、エクソンスキッピングは、イントロン３８におけるｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異などのＡＢＣＡ４遺伝子における（イントロン）突然変異によるものである、ＡＯＮに関する。好ましくは、ＡＯＮは、エクソン３９スキッピングおよび／またはエクソン３９／エクソン４０二重スキッピングを阻害する、予防するまたはブロックすることができる。好ましい実施形態において、本発明のＡＯＮは、配列番号１から３７のいずれか１つの配列を含むか、またはそれからなる。本発明はまた、本発明によるＡＯＮ、および薬学的に許容される担体を含み、硝子体内投与用である医薬組成物に関する。さらに別の態様において、本発明は、本発明によるＡＯＮを発現させるウイルスベクターに関する。さらに別の態様において、本発明は、ヒト眼内の標的組織に対するＡＯＮの効率的な（好ましくは、長期にわたる）放出のための、本発明のＡＯＮを含む、ナノ粒子または任意のタイプの徐放性組成物に関する。別の態様において、本発明は、スタルガルト病の処置、予防または遅延に使用するための、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターに関する。さらに別の態様において、本発明は、ＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とするヒト個体の、それを必要とするスタルガルト病または状態の処置（ＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン３９のスキップを予防するなど）のための方法であって、ヒト個体の細胞を、本発明によるＡＯＮ、医薬組成物またはウイルスベクターと接触させることおよびそれに続いて前記細胞への前記ＡＯＮの侵入を可能にして、その結果、前記細胞に存在する突然変異したヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン３９スキッピングの阻害を可能にすることを含む方法に関する。

ヒトＡＢＣＡ４遺伝子のエクソン３８、イントロン３８、エクソン３９、イントロン３９およびエクソン４０に対して試験したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の相補的な位置の略図である。エクソン３８とエクソン３９の間のイントロン３８におけるｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異の相対的な位置が示されている。 ヒトＡＢＣＡ４遺伝子のエクソン３９およびエクソン４０（太字、両エクソンには下線を引いてある）ならびにそれらの周辺のイントロン配列（太字、下線を引いていない）のＲＮＡ配列（５’から３’；配列番号５０）を示す図である。初めに設計した３７のＡＯＮ配列をＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡに対するそれぞれの相補的な位置とともに示す。ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異の位置を下方へ指し示す矢印により示す。イントロン３８内において、実施例において概略が述べられているＡＯＮ１および１７が結合するホットスポットであるような領域をイタリックのフォントで示し、これは、配列番号６５の配列を有する。ＡＯＮ１２、３１および３２が結合するイントロン３９中のホットスポットについても同じことがいえ、このホットスポットは、配列番号６６の配列を有する。 （図２－１の続き） 以下の順序のヒトＡＢＣＡ４イントロンおよびエクソンを有する配列番号４４である：イントロン３８（小文字）－エクソン３９（大文字、太字および下線）－イントロン３９（小文字）－エクソン４０（大文字、太字およびイタリック）－イントロン４０（小文字）。イントロン３８（ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異をもつ）＝配列番号４５；エクソン３９＝配列番号４６；イントロン３９＝配列番号４７；エクソン４０＝配列番号４８；イントロン４０＝配列番号４９。 （図３－１の続き） （図３－２の続き） イントロン３８中のＳａｌＩおよびＮｏｔＩクローニング部位およびｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異の位置（－１０Ｔ＞Ｃ）を示すミニジーン（ＭＧ）コンストラクトの略図である。ＭＧ１およびＭＧ２については、Sangermano et al. (2016)に記載されている。ＭＧ３（エクソン３９を有する）およびＭＧ４（エクソン３９およびエクソン４０を有する）は、本明細書中で開示されているとおりである。 ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクション後、転写されたｐｒｅ－ｍＲＮＡは、エクソン３９がスプライシングされて除去され、エクソン１がエクソン２と連結されるよう処理されるのに対し、突然変異の非存在下では（レーンＷＴ、野生型ミニジーンコンストラクトによる）エクソン３９はエクソン１とエクソン２の間に存在したままであるという意味でＭＧ３コンストラクト（ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異をもつ場合）が「機能的」であることを示す図である。インサートなしレーンは、ミニジーンコンストラクトにインサートが含まれていない場合のＰＣＲ産物を示す対照である。 さまざまなＡＯＮを用いて、および用いずに行った、５４６１－１０Ｔ突然変異をもつＭＧ３（＋ＭＧ３ ｍｕｔ．）およびＭＧ３野生型（ＭＧ３ ＷＴ）コンストラクトによるＨｅＬａ細胞のトランスフェクション後のバイオアナライザーにおけるＲＴ－ＰＣＲ結果である。初めに配列番号１から１６の１６のＡＯＮを突然変異体バージョンに対して試験した。エクソン３９配列内でアニーリングするプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行い、これにより、下のパネルの「ＨｅＬａ（ＮＴ）」（非トランスフェクションＨｅＬａ細胞）で示したレーンも予想されるレベルでバンドを示すようになる。これは、ＨｅＬａ細胞が野生型ＡＢＣＡ４遺伝子をもつという事実によるものであり、これから明らかにＰＣＲ産物も形成された。陰性対照（「ｃｔｒＡＯＮ」）に、突然変異を有するＭＧ３コンストラクトおよび無関係なＡＯＮをトランスフェクションした。別の陰性対照は、コンストラクトまたはＡＯＮを用いずにトランスフェクション試薬によってのみトランスフェクションされた細胞を表す「Ｍｏｃｋ ｔｒ」レーンである。「Ｒｔ－ｃｔｒ」および「Ｈ₂Ｏ」は、細胞物質を伴わない、ＰＣＲ反応に関するさらなる２つの陰性対照とした。産物バンドの強度の増加は、エクソン３９を含むｍＲＮＡの増加を示唆する。そのようなものはバックグラウンドとしてＨｅＬａ細胞において既に形成されたものに基づいて、実際にＡＯＮがトランスフェクションされていないＷＴシグナルと比較して評価されるべきであるため、「ＷＴ－ｎｏ ＡＯＮ」で示したレーンを１００％として取り、その１００％強度と比較して他のバンドの強度を測定するためにバイオアナライザーソフトウェアを利用した。これは、そのシグナルのおよそ１／３（２９％）がバックグラウンドのＨｅＬａ単独のシグナルによる可能性があることを示している。ＡＯＮを用いて、または用いずに行ったトランスフェクション自体がおよそ７０％へのシグナルのＡＯＮと無関係な増加を示すことができることも示している。しかしながら、ＡＯＮ１、ＡＯＮ３、ＡＯＮ４、ＡＯＮ５、ＡＯＮ６、ＡＯＮ１２、ＡＯＮ１３、およびＡＯＮ１４で検出された強度は１００％に設定したＷＴシグナルの少なくとも８０％へ増加し、ＡＯＮ３、ＡＯＮ４、ＡＯＮ６、およびＡＯＮ１２が最も良く機能して少なくとも９０％の強度であった。これは、これらのＡＯＮがＭＧ３突然変異コンストラクトからのエクソン３９スキッピングを、エクソン３９がスキップされない野生型に近いレベルまでブロックすることができたことを示す。 ＭＧ３コンストラクトおよび示したさまざまなＡＯＮをトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞におけるエクソン３９包含のパーセンテージのｄｄＰＣＲ定量を示すグラフである。３つのパネルＡ、ＢおよびＣは、３つの異なる日にではあるが同一の様式で実施された実験を表す。Ｍｏｃｋは、ＡＯＮがトランスフェクションされていない場合のエクソン３９包含のパーセンテージを表す。 ＭＧ３＿２ミニジーンコンストラクトにおけるインサートの５’→３’の配列（配列番号６７）を示す図である。ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位が末端にある５’および３’末端にそれぞれある。ヒトＡＢＣＡ４遺伝子のエクソン３９（配列番号４６）は大文字である。イントロン３８（配列番号４５、エクソン３９の５’末端にある）およびイントロン３９（配列番号４７、エクソン３９の３’末端にある）に下線を引いてある。ＥｃｏＲＩ部位とインサートの５’末端にあるイントロン３８の間の配列、およびイントロン３９とインサートの３’末端にあるＳａｌＩ部位の間の配列の残部は、実施例に記載されているとおり、骨格プラスミド中に既に存在しているものと同一である。ＲＨＯエクソン３およびＲＨＯエクソン５配列（それぞれ配列番号６８および配列番号６９）は、それぞれＡＢＣＡ４イントロン３８の５’側およびイントロン３９の３’側にあり、太字で示す。 ＭＧ３＿２ミニジーンコンストラクトの概略図を（Ａ）に示す。バイオアナライザーによるＨＥＫ２９３細胞におけるＭＧ３＿２（プラスミド単独）からのエクソン３９を含むおよびそれが排除された増幅産物の位置も（Ｂ）に示す。ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異のために、転写物の大半でエクソン３９（下のバンド）が欠如しており、エクソン３９包含（上のバンド）がはるかに低いレベルで確認された。ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異をもつＭＧ３＿２コンストラクトおよびさまざまなＡＯＮ（複数可）をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞におけるエクソン３９包含のパーセンテージのｄｄＰＣＲ定量を（Ｃ）に示し、ＡＯＮ１、３、４、９、１２、１７、２４、２５、２９、３１、または３２によるトランスフェクションの後の強いエクソン３９包含効果を明らかにした。 （図９－１の続き） ｄｄＰＣＲを使用した、ＨＥＫ２９３細胞においてＭＧ３＿２ミニジーンならびに糖部分における２’－ＯＭｅ修飾により完全に修飾されたＡＯＮ１およびＡＯＮ３２をトランスフェクションされた後のエクソン３９含有のパーセンテージを、それぞれの糖部分に２’－ＯＭｅ修飾の代わりに２’－ＭＯＥ修飾をもつＡＯＮ１およびＡＯＮ３２、ならびにＡＯＮが使用されなかったｍｏｃｋトランスフェクションと比較して示すグラフである。同じオリゴヌクレオチドの２’－ＭＯＥバージョンが利用される場合、有意な効果の増加が確認された。

本発明は、ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおけるエクソン３９のスキッピングを予防する、阻害する、かつ／またはブロックすることができる、あるいはエクソン３９＋エクソン４０の二重スキッピングを予防する、阻害する、かつ／またはブロックすることができる特定のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関する。そのような（二重）スキッピングは、少なくとも比較的一般的なイントロン３８におけるｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ、スタルガルト病を引き起こす突然変異によって引き起こされる場合もあることが示された（Sangermano et al. 2016; Aukrust et al. 2016）。ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン１０のスキップを引き起こすＡＯＮが当該技術分野において知られているが（国際公開第２０１５／００４１３３号パンフレット）、今まで、ＡＯＮがヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおけるエクソン保持に、または言い換えると、ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおけるエクソンスキッピングを阻害するためにも使用できるかどうかはわかっていなかった。本発明の発明者らは、そのようなことがエクソン３９の周辺のイントロンおよびエクソン内、ならびにイントロン／エクソンの境界の特定の配列を特定することによって場合によっては可能であろうと仮説を立てた。その特定の配列は、次に、精製した合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（これは、そのような配列と相補的で、生理的条件下においてそれと結合することになり、異常なスプライシング部位をマスクし、ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからの（単独もしくはエクソン４０と一緒のいずれかの）エクソン３９のスプライシングを（一定のレベルまで）ブロックまたは阻害することができるであろう）の標的とすることができるであろう。エクソン３９のスキップが（エクソン４０と一緒か、またはそうでないかのいずれのスキップであっても）スタルガルト病をもたらすことが知られている。本発明の発明者らは、（単独またはエクソン４０と一緒のいずれかの）エクソン３９のスキッピングを予防する（または一定の程度にまで阻害する）ことができるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が、そのようなエクソン３９スキッピングを引き起こす突然変異をもつヒト対象においてスタルガルト病を処置する、予防するまたは遅延させることを可能にするであろうと想定した。

本発明は、ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおいて少なくとも１つのエクソンのスキッピングを阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、前記エクソンスキッピングは、ＡＢＣＡ４遺伝子における突然変異によるものである、ＡＯＮに関する。好ましい実施形態において、エクソンスキッピングを引き起こす突然変異は、イントロンにある。より好ましくは、前記イントロン突然変異は、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子のイントロン３８におけるｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異である。好ましい一実施形態において、本発明のＡＯＮは、ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおいてエクソン３９スキッピングおよび／またはエクソン３９／エクソン４０二重スキッピングを阻害することができる。別の好ましい実施形態において、本発明によるＡＯＮは、配列番号４４内の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続したヌクレオチドと相補的である配列を含む。好ましくは、本発明のＡＯＮは、好ましくは、配列番号４４の配列内の連続した配列と完全に相補的な２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドを含み、最大で１つのＣｐＧモチーフをさらに含む。より好ましくは、本発明のＡＯＮにはＣｐＧモチーフがない。別の好ましい態様において、本発明によるＡＯＮは、配列番号６５または配列番号６６内の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドと相補的な配列を含むか、またはそれからなる。２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドからなり、配列番号６５または６６によって表される領域と完全に相補的なＡＯＮが最も好ましい。さらに、本発明のＡＯＮ中において、可能なかぎり低いグアノシンのパーセンテージ、好ましくは６０％未満、５０％未満、４０％未満、またさらに３０％未満を維持することが好ましい。また、本発明のＡＯＮ中において、ひと続きのグアノシンを最大で３つ維持し、最大でひと続きの３つのグアノシンを有することが好ましい。極めて好ましい態様において、本発明のＡＯＮは、配列番号１、３、４、５、６、９、１２、１３、１４、１７、２０、２４、２５、２９、３１、および３２、より好ましくは、配列番号１、３、４、６、１２、１７、２４、２５、２９、３１および３２、さらにより好ましくは、配列番号１、１２、１７、２４、２９、３１および３２のうちのいずれか１つの配列を含むか、またはそれからなる。

別の好ましい態様において、本発明によるＡＯＮは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾糖などの少なくとも１つの２’－Ｏアルキル修飾を含むオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）である。別の好ましい実施形態において、前記ＡＯＮ中のすべてのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾されている。別の好ましい態様において、ＡＯＮは、少なくとも１つの２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ、すなわち、２’－メトキシエトキシ）修飾を含む。別の態様において、２’－ＯＭｅおよび２’－ＭＯＥ修飾はともに、オリゴヌクレオチド内の異なるヌクレオシドに存在してもよい。また、本発明によるＡＯＮは、すべてが２’－ＯＭｅ修飾をもつヌクレオシドから構成されてもよく、またはそれは、すべてが２’－ＭＯＥ修飾をもつヌクレオシドから構成されてもよい。さらに別の好ましい実施形態において、本発明によるＡＯＮは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、より好ましくは、ＡＯＮ内のすべての連続したヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって互いに連結されている。

本発明はまた、本発明によるＡＯＮ、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記医薬組成物は、硝子体内投与用であり、好ましくは、各眼当たり合計ＡＯＮが０．０５ｍｇから５ｍｇの範囲の量で投与される。本発明はまた、硝子体内投与用であり、各眼当たり合計ＡＯＮが約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇなど、各眼当たり合計ＡＯＮが０．１から１ｍｇの範囲の量で投与される本発明による医薬組成物に関する。本発明はまた、本発明によるＡＯＮを発現させるウイルスベクターに関する。さらに別の態様において、本発明は、薬剤として使用するための、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターに関する。さらに別の態様において、本発明は、スタルガルト病の処置、予防もしくは遅延に使用するため、またはヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおけるエクソン３９スキッピングの阻害に使用するための、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターに関する。さらに別の実施形態において、本発明は、スタルガルト病の処置、予防もしくは遅延のため、またはヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおけるエクソン３９スキッピングの阻害のための、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターの使用に関する。本発明はさらに、細胞におけるＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節するための方法であって、前記細胞を、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターと接触させることを含む方法に関する。好ましい態様において、本発明は、ＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とする個体の、それを必要とするスタルガルト病または状態の処置のための方法であって、前記個体の細胞を、本発明によるＡＯＮ、本発明による医薬組成物、または本発明によるウイルスベクターと接触させることを含む方法に関する。スプライシングの調節は、好ましくは、イントロン３８におけるｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異によるヒトＡＢＣＡ４遺伝子内の突然変異が原因となるか、またはそれによるものであるエクソン３９スキッピングの阻害を好ましくは含む。

ＡＢＣＡ４に関して、ＡＯＮの細胞への投与／導入の結果である「エクソン保持」、または「エクソンスキッピングを阻害する、ブロックするまたは予防すること」は、エクソン３９、またはエクソン３９＋エクソン４０の両方をヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ（およびそれに続く結果として生じるヒトＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡ）に含めること（またはその存在を維持すること）と解釈されるべきである。通常は、エクソン３９のスキッピング、またはエクソン３９およびエクソン４０のスキッピングを引き起こすことになり、スタルガルト病をもたらす可能性があるＡＢＣＡ４遺伝子における突然変異の存在にもかかわらず、詳細が本明細書において概説されるこのエクソン保持は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への投与後に起こる。「エクソン保持」という用語はまた、細胞内における、好ましくは、成熟ｍＲＮＡに存在すべき特定のエクソン（複数可）を依然として含む成熟ｍＲＮＡの誘発、産生または産生の増加も指す。

「エクソンスキッピング」という用語は、本明細書において１つ以上の特定のエクソンを含まない成熟ｍＲＮＡの様子と定義される（本件の場合、ＡＢＣＡ４遺伝子のエクソン３９、またはエクソン４０と一緒にエクソン３９、これは、「二重スキッピング」とも言及される）。これらのエクソンは、通常、例えば、野生型の状況においてなどエクソンスキッピングが起こらなかった場合に成熟ｍＲＮＡに存在することになるであろう。そのようなエクソンスキッピングのブロックは、スプライシングの酵素的プロセスを可能にするために必要とされる、例えば、（隠れた）スプライスドナー配列または（隠れた）スプライシングアクセプター配列などの配列で妨害することができる分子を用いて、スタルガルト病を引き起こすバリアントを含むｐｒｅ－ｍＲＮＡを発現する細胞をもたらすことによって達成される。

「ｐｒｅ－ｍＲＮＡ」という用語は、転写によって細胞のＤＮＡ鋳型から、例えば核内で合成される、プロセシングされていないか、または部分的にプロセシングされた前駆体ｍＲＮＡを指す。

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（ＡＯＮ）という用語は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ分子、ｈｎＲＮＡ（ヘテロ核ＲＮＡ）またはｍＲＮＡ分子中の標的ヌクレオチド配列と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を指すものと理解される。アンチセンス配列の相補性（または実質的な相補性）の程度は、アンチセンス配列を含む分子が生理的条件下においてＲＮＡ分子中の標的ヌクレオチド配列と安定な二本鎖ハイブリッドを形成することができるような程度であることが好ましい。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「オリゴ」という用語は、本明細書では同義に使用され、標的（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡ配列に対するアンチセンス配列を含むオリゴヌクレオチドを指すものと理解される。

本文書において、およびその特許請求の範囲において、「含むこと（to comprise）」という動詞およびその活用型は、その語に引き続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目も除外しないことを意味するためにその非限定的な意味で使用される。さらに、文脈が明らかに１つおよび１つだけの要素が存在することを必要としない限り、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素の言及は、１つ超の要素が存在する可能性を排除するものではない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、したがって、通常は「少なくとも１つ」を意味する。

数値（例えば、約１０）と関連して使用される場合、「約」または「およそ」という語は、好ましくは、値が、（１０の）所与の値より０．１％大きいまたは小さい値であってもよいことを意味する。

一実施形態において、本明細書中で定義されるエクソン３９保持分子（またはエクソン３９／４０保持分子）は、特定の配列、好ましくは、配列番号４４内の配列と結合する、かつ／またはそれと相補的で、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡにおいてエクソン３９、またはエクソン３９＋エクソン４０の保持をもたらすＡＯＮである。好ましくは、異常なＡＢＣＡ４の文脈における特定の標的配列の１つとの結合は、当業者に既知の技術によって評価することができる。好ましい技術は、欧州特許第１６１９２４９号明細書に記載されているゲル移動度シフトアッセイである。好ましい実施形態において、エクソン３９保持ＡＯＮ（またはエクソン３９／４０保持ＡＯＮ）は、前記分子の標識標的配列との結合がゲル移動度シフトアッセイで検出できるとすぐに、特定の配列の１つと結合していると判断される。

本発明のすべての実施形態において、エクソン３９保持分子（またはエクソン３９／４０保持分子）は、好ましくはＡＯＮである。好ましくは、本発明によるエクソン３９保持ＡＯＮ（またはエクソン３９／４０保持ＡＯＮ）は、ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン３８、エクソン３９、イントロン３９、エクソン４０、もしくはイントロン４０内の配列、またはヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン３８／エクソン３９、エクソン３９／イントロン３９、イントロン３９／エクソン４０、もしくはエクソン４０／イントロン４０の境界と重なる配列と相補的または実質的に相補的なＡＯＮである。より好ましくは、本発明のＡＯＮは、配列番号１から３７の配列のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。

本発明の文脈において使用される「実質的に相補的な」という用語は、機能性、すなわち、ＡＢＣＡ４エクソン３９のスキッピングのブロック、またはエクソン３９＋エクソン４０のスキッピングのブロックがなおも許容できるかぎり、アンチセンス配列にいくつかのミスマッチが許容されることを示す。好ましくは、相補性は、９０％から１００％である。一般に、これは、２０ヌクレオチドのＡＯＮに１もしくは２つのミスマッチ、または４０ヌクレオチドのＡＯＮに１、２、３もしくは４つのミスマッチ、または６０ヌクレオチドのＡＯＮに１、２、３、４、５もしくは６つのミスマッチなどを許容する。

本発明はまた、ＡＢＣＡ４エクソン３９のスキッピングを阻害もしくはブロックすることができるか、またはエクソン４０と一緒のＡＢＣＡ４エクソン３９のスキッピングを阻害もしくはブロックすることができるＡＯＮを設計するための方法を提供する。まず、前記ＡＯＮは、（生理的条件下において）ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン３８、エクソン３９、イントロン３９、エクソン４０、もしくはイントロン４０内の配列、またはヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン３８／エクソン３９、エクソン３９／イントロン３９、イントロン３９／エクソン４０、もしくはエクソン４０／イントロン４０の境界と重なる配列と結合する、かつ／またはそれと相補的であるよう選択される。その後、好ましい方法において、少なくとも１つの以下の態様が前記エクソン保持ＡＯＮを改善する設計に対してさらに考慮されなければならない：本発明のエクソン保持ＡＯＮは、好ましくは、最大で１つのＣｐＧモチーフを含み、より好ましくは、ＣｐＧモチーフをまったく含まない。ＡＯＮ中のＣｐＧモチーフまたは多数のＣｐＧモチーフ（ＣｐＧアイランド）の存在は、通常、前記ＡＯＮの免疫原性の増加と関連づけられる（Dorn and Kippenberger (2008) Curr Opin Mol Ther 10(1) 10-20）。この免疫原性の増加は、処置される組織、すなわち、眼に損傷を引き起こす可能性もあるため望ましくない。免疫原性は、ＣＤ４＋および／もしくはＣＤ８＋細胞の存在ならびに／または炎症性単核球浸潤を評価することによって動物モデルにおいて評価することができる。免疫原性はまた、当業者に既知の標準的なイムノアッセイを使用して中和抗体および／または前記ＡＯＮを認識する抗体の存在を検出することによって本発明のＡＯＮにより処置された動物またはヒトの血液において評価することもできる。炎症反応、Ｉ型様インターフェロン産生、ＩＬ－１２産生および／または免疫原性の増加は、標準的なイムノアッセイを使用して中和抗体または前記ＡＯＮを認識する抗体の存在または量の増加を検出することによって評価することができる。

本発明は、許容できるＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性を有するＡＯＮを設計することを可能にする。ＲＮＡ結合動態および／または熱力学的特性は、ＡＯＮの融解温度（Ｔｍ、基礎のＴｍおよび最隣接モデルを使用して単鎖ＲＮＡに対する、当業者に既知のオリゴヌクレオチド特性計算機により算出される）および／またはＡＯＮ標的エクソン複合体の自由エネルギー（ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅバージョン４．５を使用して）によって少なくとも部分的に決定される。Ｔｍが高すぎると、ＡＯＮは、あまり特異的でなくなることが予想される。許容できるＴｍおよび自由エネルギーは、ＡＯＮの配列により決まる。したがって、これらのパラメータのそれぞれに対して好ましい範囲を示すのは難しい。許容できるＴｍは、３５から７０℃の間の範囲であってもよく、許容できる自由エネルギーは、１５から４５ｋｃａｌ／ｍｏｌの間の範囲であってもよい。

本発明のＡＯＮは、好ましくは、許容されるレベルの機能活性を示すことができるものである。前記ＡＯＮの機能活性は、好ましくは、一定の許容されるレベルまでＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン３９、またはエクソン３９＋エクソン４０のスキッピングをブロックして、個体に一定の検知可能なレベルの機能的な野生型完全長ＡＢＣＡ４タンパク質をもたらすことである。好ましい実施形態において、ＲＴ－ＰＣＲおよび／またはｄｄＰＣＲ分析によって測定されるＡＢＣＡ４エクソン３９、またはＡＢＣＡ４エクソン３９＋エクソン４０を含む完全長ｍＲＮＡがバックグラウンドシグナルの非存在下において対照ｗｔ ＲＮＡ産物と比較して少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％であるとき、ＡＯＮは、そのエクソンのスキッピングをブロックすると考えられる。図６に見られるとおり、（上で概説した）保持のパーセンテージ範囲は、バックグラウンドシグナルに左右され、バックグラウンドシグナルは、好ましくは、存在すべきではない。したがって、そのようなパーセンテージは、好ましくは、バックグラウンドシグナルを示さない系において、またはそのようなＰＣＲプライマーを使用することによって測定される。本発明の目的は、ＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおけるエクソン３９／４０スキッピングをブロックまたは予防するＡＯＮを提供することである。エクソンスキッピングおよび／またはエクソン保持を求めるためのアッセイは本明細書の実施例に記載されており、エクソン３９保持の増加が見出されるかを評価するために、当業者に既知の技術により補われてもよい。

好ましくは、本発明によるＡＯＮは、配列番号６５、配列番号６６、（配列番号４４として全部を示した、ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異をもつ）ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン３８（配列番号４５）、エクソン３９（配列番号４６）、イントロン３９（配列番号４７）、エクソン４０（配列番号４８）、もしくはイントロン４０（配列番号４９）のヌクレオチド配列、またはヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン３８／エクソン３９、エクソン３９／イントロン３９、イントロン３９／エクソン４０、もしくはエクソン４０／イントロン４０の境界と重なる配列と相補的または実質的に相補的な配列を含み、（実質的に）相補的な部分が、本発明によるＡＯＮの長さの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％、またはさらにより好ましくは９８％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％、またはさらにより好ましくは１００％であるようなＡＯＮである。より好ましくは、ＡＯＮは、イントロン３８とエクソン３９の間の境界を含み、さらにより好ましくは、ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異を含む配列と相補的である。本発明の別の態様において、本発明によるＡＯＮは、配列番号１から１６の配列を含むか、またはそれからなり、より好ましくは、配列番号１、３、４、５、６、９、１２、１３、１４、１７、２０、２４、２５、２９、３１および３２、好ましくは、配列番号１、１２、１７、２４、２９、３１および３２からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

好ましい別の実施形態において、本発明のＡＯＮの相補的な部分の長さは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４１、１４２または１４３ヌクレオチドの長さである。タンパク質のＡＯＮとの結合を改変するため、またはＡＯＮの熱力学的特性を改変するため、より好ましくは、標的ＲＮＡ結合親和性を改変するために、付加的な隣接配列が使用されてもよい。

したがって、相補性の領域にあるすべての塩基が対向する鎖にある塩基と対形成することができることが絶対に必要とされる訳ではない。例えば、ＡＯＮを設計するとき、例えば、相補的な鎖にある塩基と塩基対にならない残基を組み込むことを望むこともできる。細胞の環境下において、ひと続きのヌクレオチドが相補的な部分と十分にハイブリダイズすることができるなら、ミスマッチは、ある程度許容される場合もある。この文脈において、「十分に」は、好ましくは、欧州特許第１６１９２４９号明細書の実施例１に記載されているとおりのゲル移動度シフトアッセイを使用して、ＡＯＮの結合が検出可能であることを意味する。

任意選択で、前記ＡＯＮは、当業者に既知の方法を使用してスタルガルト病患者由来の線維芽細胞から形成された眼杯（optic cup）（または眼杯（eye cup））を使用することによってさらに試験されてもよい。エクソン３９／４０のスキップのブロックは、（Aukrust et al. 2016の記載に従って）ＲＴ－ＰＣＲによって評価することができる。相補的な領域は、組み合わされる場合、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソンに特異的であるよう設計されることが好ましい。そのような特異性は、この系の他の（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡ分子にある実際の配列に依存するため、さまざまな長さの相補的な領域を用いて作り出すことができる。ＡＯＮのサイズを増加させることでＡＯＮが１つ以上の他のｐｒｅ－ｍＲＮＡ分子ともハイブリダイズすることができることになるリスクは低下する。相補性の領域にミスマッチを含むが、ｐｒｅ－ｍＲＮＡの標的とされる領域（複数可）とハイブリダイズする能力および／または結合する能力を保持するＡＯＮを本発明に使用することができることは明らかである。しかしながら、相補的な部分にミスマッチがないＡＯＮは、一般に１つ以上の相補的な領域にそのようなミスマッチを有するＡＯＮよりも高い効率および高い特異性を有するため、少なくとも相補的な部分は、そのようなミスマッチを含まないことが好ましい。さらに高いハイブリダイゼーション強度（すなわち、対向する鎖との相互作用の数を増加させる）は、系のスプライシング機構を妨害するプロセスの効率を増加させる際に有利であると考えられる。好ましくは、相補性は、９０％から１００％である。一般に、これは、２０ヌクレオチドのＡＯＮに１もしくは２つのミスマッチ、または４０ヌクレオチドのＡＯＮに１、２、３もしくは４つのミスマッチ、または６０ヌクレオチドのＡＯＮに１、２、３、４、５もしくは６つのミスマッチなどを許容する。

本発明のＡＯＮは、好ましくは、（標的）対応物配列の非存在下の単離された単鎖分子であり、それは、自己ハイブリダイズしない。本発明のＡＯＮは、好ましくは、ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン３８、エクソン３９、イントロン３９、エクソン４０、もしくはイントロン４０の配列、またはヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン３８／エクソン３９、エクソン３９／イントロン３９、イントロン３９／エクソン４０、もしくはエクソン４０／イントロン４０の境界と重なる配列と相補的であるか、または生理的条件下においてそれと結合する。

本発明の好ましいＡＯＮは、８から１４３ヌクレオチド、より好ましくは１０から４０ヌクレオチド、より好ましくは１２から３０ヌクレオチド、より好ましくは２０から３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、好ましくは、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４１、１４２もしくは１４３ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。より好ましくは、本発明によるＡＯＮは、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。

特定の実施形態において、本発明は、配列番号１から３７からなる群から選択される単鎖ＡＯＮを提供する。本発明によるＡＯＮは、１つ以上のＲＮＡ残基、もしくは１つ以上のＤＮＡ残基、および／または本明細書の下でさらに詳述されることになる１つ以上のヌクレオチドアナログもしくは等価物を含んでもよい。本発明のＡＯＮは、ヌクレアーゼ耐性を高めるため、および／または標的配列に対するＡＯＮの親和性を高めるために修飾された１つ以上の残基を含むことが好ましい。ゆえに、好ましい実施形態において、本ＡＯＮ配列は、少なくとも１つのヌクレオチドアナログまたは等価物を含み、ヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾塩基、および／または修飾骨格、および／または非天然のヌクレオシド間結合あるいはこれらの修飾の組合せを有する残基と定義される。

好ましい実施形態において、本ヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾骨格を含む。そのような骨格の例は、モルフォリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチル（formacetyl）およびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル（riboacetyl）骨格、アルケン含有骨格、スルファメート、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、およびアミド骨格によって提供される。ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーは、アンチセンス薬剤として以前に調査された修飾骨格オリゴヌクレオチドである。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が六員環で置換され、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合で置換された無荷電骨格を有する。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、酵素分解に耐性があり、ＲＮａｓｅ Ｈを活性化することよりむしろ翻訳を阻止すること、またはｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングを妨げることによってアンチセンス薬剤として働くようである。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、細胞膜を物理的に破壊する方法によって首尾よく組織培養細胞に送達され、こうしたいくつかの方法を比較した研究の１つは、スクレープローディング（scrape loading）が最も効率的な送達の方法であることを見出したが、モルフォリノ骨格は荷電していないため、カチオン性脂質は、細胞へのモルフォリノオリゴヌクレオチド取り込みの有効なメディエーターではない。最近の報告は、モルフォリノオリゴヌクレオチドによる三重鎖形成を実証し、非イオン性骨格のため、モルフォリノオリゴヌクレオチドがマグネシウムの非存在下において三重鎖を形成することができることをこれらの研究は示した。

骨格の残基間の結合がリン原子を含まないことがさらに好ましく、例えば、短鎖アルキルによって形成される結合またはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合したヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合または１つ以上の短鎖ヘテロ原子結合もしくは複素環式ヌクレオシド間結合である。

好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、修飾ポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500）。ＰＮＡベースの分子は、塩基対の認識に関してＤＮＡ分子の真の模倣物である。ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）－グリシン単位から構成され、ヌクレオベースは、メチレンカルボニル結合によって骨格と連結される。代替的な骨格は、炭素１つ伸長したピロリジンＰＮＡモノマーを含む（Govindaraju and Kumar (2005) Chem Commun 495-497）。ＰＮＡ分子の骨格は荷電したリン酸基を含まないため、ＰＮＡ－ＲＮＡハイブリッドは、通常、それぞれＲＮＡ－ＲＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドよりも安定している（Egholm et al. (1993) Nature 365:566-568）。さらに好ましい骨格は、モルフォリノヌクレオチドアナログまたは等価物を含み、その中のリボースまたはデオキシリボース糖がモルフォリノ六員環（6-membered morpholino ring）で置換されている。最も好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含み、その中のリボースまたはデオキシリボース糖がモルフォリノ六員環で置換されており、隣接するモルフォリノ環間のアニオン性ホスホジエステル結合が非イオン性ホスホロジアミデート結合によって置換されている。

さらに別の実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホジエステル結合にある１つの非橋架酸素の置換を含む。この修飾は、塩基対合をやや不安定にするが、ヌクレアーゼ分解に対する著しい耐性を付加する。好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、Ｈ－ホスホネート、メチルホスホネートおよび３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸またはボラノリン酸を含む。

本発明のさらに好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物は、例えば、－ＯＨ；－Ｆ；１つ以上のヘテロ原子の割り込みがあってもよい置換または非置換、直鎖または分岐の低級（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アリル、またはアラルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキニル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アリル；Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、－メトキシ、－アミノプロポキシ；メトキシエトキシ；ジメチルアミノオキシエトキシ；および－ジメチルアミノエトキシエトキシにより２’、３’および／または５’位において一置換または二置換された１つ以上の糖部分を含む。糖部分は、ピラノースもしくはその誘導体、またはデオキシフラノースもしくはその誘導体、好ましくは、リボースもしくはその誘導体またはデオキシリボースもしくはその誘導体であってもよい。好ましい誘導体化糖部分は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、その中の２’－炭素原子が糖環の３’または４’炭素原子と連結され、それにより二環式の糖部分を形成する。好ましいＬＮＡは、２’－Ｏ、４’－Ｃ－エチレン－架橋化核酸を含む（Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1: 241-242）。これらの置換は、ヌクレオチドアナログまたは等価物をＲＮａｓｅ Ｈおよびヌクレアーゼ耐性にし、標的ＲＮＡに対する親和性を高める。

別の実施形態において、本発明のヌクレオチドアナログまたは等価物は、１つ以上の塩基修飾または置換を含む。修飾塩基は、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび当該技術分野において知られているか、または知られることになるピリミジ塩基およびプリン塩基の他の－アザ、デアザ、－ヒドロキシ、－ハロ、－チオ、チオール、－アルキル、－アルケニル、－アルキニル、チオアルキル誘導体などの合成および天然の塩基を含む。

ＡＯＮのすべての位置が均一に修飾されている必要はないことが当業者に理解される。さらに、上記のアナログまたは等価物の１つ超が、１つのＡＯＮまたはさらにはＡＯＮ内の１つの位置に組み込まれてもよい。特定の実施形態において、本発明のＡＯＮは、少なくとも２つの異なる種類のアナログまたは等価物を有する。本発明による好ましいエクソンスキッピングＡＯＮは、２’－Ｏアルキルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチル修飾リボース（ＲＮＡ）、２’－Ｏ－エチル修飾リボース、２’－Ｏ－プロピル修飾リボース、および／またはハロゲン化誘導体などのこれらの修飾の置換誘導体を含む。本発明による有効なＡＯＮは、（好ましくは完全な）ホスホロチオエート骨格を伴う２’－Ｏ－メチル－リボースを含む。

ＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおけるエクソン３９および４０のスキップを効率的にブロックするために異なるＡＯＮが混ぜ合わされてもよいことも当業者は理解するであろう。好ましい実施形態において、２、３、４、または５つの異なるＡＯＮなどの少なくとも２つのＡＯＮの組合せが本発明の方法に使用される。したがって、本発明はまた、少なくとも１つの本発明によるＡＯＮを含む、１組のＡＯＮに関する。

上で示したとおり、ＡＢＣＡ４遺伝子のイントロン３８におけるｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異の存在は、エクソン３９のスキッピングおよび多くの場合、エクソン４０の共スキッピングを誘導する。したがって、エクソン４０も保持しながらエクソン３９スキッピングを効率的にブロックするＡＯＮを使用することが好ましい。

ＡＯＮは、細胞、好ましくは、網膜細胞へのＡＯＮの取り込みを高める部分に連結されてもよい。そのような部分の例は、コレステロール、炭水化物、ビタミン、ビオチン、脂質、リン脂質、細胞透過性ペプチドであり、以下に限定されるものではないが、アンテナペディア、ＴＡＴ、トランスポータンおよびオリゴアルギニン、ポリアルギニン、オリゴリジンまたはポリリジンなどの正電荷アミノ酸、抗体によってもたらされるものなどの抗原結合ドメイン、抗体のＦａｂフラグメント、またはラクダ類のシングルドメイン抗原結合ドメインなどの単鎖抗原結合ドメインが挙げられる。

本発明によるＡＯＮは、当該技術分野において既知の適した手段を使用して間接的に投与されてもよい。例えば、前記オリゴヌクレオチドを含む転写物をコードする発現ベクターの形態で個体または前記個体の細胞、組織もしくは臓器に与えられてもよい。発現ベクターは、好ましくは細胞、組織、臓器または個体に遺伝子送達媒体により導入される。好ましい実施形態において、本明細書において特定されるＡＯＮの発現または転写を駆動する発現カセットまたは転写カセット（transcription cassette）を含むウイルスベースの発現ベクターが提供される。したがって、本発明は、ＡＯＮの発現を促す条件下に置かれたときに本発明によるＡＯＮを発現させるウイルスベクターを提供する。発現は、Ｕ７プロモーターなどのポリメラーゼＩＩ－プロモーター（Ｐｏｌ ＩＩ）またはＵ６ ＲＮＡプロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターによって駆動されてもよい。好ましい送達媒体は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）などのウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターなどである。また、プラスミド、人工染色体、標的相同組み換えおよび細胞のヒトゲノムへの組み込みに使用可能なプラスミドが、本明細書中で定義されるオリゴヌクレオチドの送達に適切に利用されてもよい。転写がＰｏｌ ＩＩＩプロモーターから行われ、かつ／または転写物がＵ１またはＵ７転写物との融合物の形態であるそうしたベクターが本発明に好ましく、これが小さな転写物の送達に関して良好な結果をもたらす。適した転写物を設計することは技術のある技術者の範囲内にある。Ｐｏｌ ＩＩＩによる転写物が好ましく、Ｕ１またはＵ７転写物との融合転写物の形態が好ましい。そのような融合物は、記載されているとおりに作り出すことができる（Gorman et al., 1998。Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 95(9):4929-34；Suter et al. 1999. Double-target antisense U7 snRNAs promote efficient skipping of an aberrant exon in three human beta-thalassemic mutations. Hum Mol Genet 8(13):2415-23）。

本発明のＡＯＮは、そのまま（裸のまま）送達されてもよい。しかしながら、本発明のＡＯＮはまた、ウイルスベクターによってコードされてもよい。一般に、これは、転写物の一部に本発明によるオリゴヌクレオチドの配列を含むＲＮＡ転写物の形態である。本発明によるＡＡＶベクターは組み換えＡＡＶベクターであり、本明細書中の別の場所で示したＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質のタンパク質の殻に包まれた本発明によるコード化ＡＯＮを含むＡＡＶゲノムの部分を含むＡＡＶベクターを指す。ＡＡＶゲノムの部分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびその他などのアデノ随伴ウイルス血清型由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含んでもよい。カプシドタンパク質から構成されるタンパク質の殻は、ＡＡＶ１、２、３、４、５、８、９およびその他などのＡＡＶ血清型由来のものであってもよい。タンパク質の殻は、カプシドタンパク質の殻と呼ばれる場合もある。ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ遺伝子の１つまたは好ましくはすべてが除去されていてもよいが、依然として機能的なＩＴＲ核酸配列を含んでもよい。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキューおよびパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、機能的なままである限り、野生型配列であってもよく、または野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５、もしくは１００％の配列同一性を有してもよく、または例えば、ヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失もしくは置換によって改変されていてもよい。この状況において、機能性とは、カプシドの殻へのゲノムのパッケージングを指示し、その結果、感染した宿主細胞または標的細胞における発現を可能にさせる能力を指す。本発明の状況において、カプシドタンパク質の殻は、ＡＡＶベクターゲノムＩＴＲと異なる血清型のものであってもよい。したがって、本発明によるＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質の殻、すなわち、正二十面体のカプシドから構成されてもよく、それが、１つのＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３）を含み、一方、ＡＡＶ５ベクターに含まれるＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ベクターを含む任意の上記のＡＡＶ血清型であってもよい。したがって、「ＡＡＶ２ベクター」は、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、例えば、「ＡＡＶ５ベクター」は、ＡＡＶ血清型５のカプシドタンパク質の殻を含み、それにより、どちらも本発明による任意のＡＡＶベクターゲノムＩＴＲを包んでもよい。好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２、５、８またはＡＡＶ血清型９のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２、５、８またはＡＡＶ血清型９に由来する。そのようなＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ５／２、ＡＡＶ５／５、ＡＡＶ５／８、ＡＡＶ５／９、ＡＡＶ８／２、ＡＡＶ８／５、ＡＡＶ８／８、ＡＡＶ８／９、ＡＡＶ９／２、ＡＡＶ９／５、ＡＡＶ９／８、またはＡＡＶ９／９ベクターと呼ばれる。

より好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲはＡＡＶ血清型５に由来し、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／５ベクターと呼ばれる。より好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲはＡＡＶ血清型８に由来し、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／８ベクターと呼ばれる。より好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターはＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲはＡＡＶ血清型９に由来し、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／９ベクターと呼ばれる。より好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質の殻を含み、前記ベクターに存在するＡＡＶゲノムまたはＩＴＲはＡＡＶ血清型２に由来し、そのようなベクターは、ＡＡＶ２／２ベクターと呼ばれる。最適な核酸配列によって表される本発明によるエクソン３９保持ＡＯＮ（またはエクソン３９／エクソン４０保持ＡＯＮ）をコードする核酸分子は、好ましくは、上で特定したＡＡＶゲノムまたはＩＴＲ配列、例えば、コード配列と機能可能に連結された発現調節エレメントおよび３’終結配列を含む発現コンストラクトの間に挿入される。「ＡＡＶヘルパー機能」とは、一般に途中でＡＡＶベクターに与えられるＡＡＶ複製およびパッケージングに必要とされる対応するＡＡＶの機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターに欠けているＡＡＶの機能を補完するが、（ＡＡＶベクターゲノムによってもたらされる）ＡＡＶ ＩＴＲがない。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの２つの主要なＯＲＦ、すなわち、ｒｅｐコード領域およびｃａｐコード領域またはそれらの機能的な実質的に同一の配列を含む。Ｒｅｐ領域およびＣａｐ領域は、当該技術分野において周知である。ＡＡＶヘルパー機能が、ＡＡＶヘルパーコンストラクトに与えられてもよく、これは、プラスミドであってもよい。

ヘルパーコンストラクトの宿主細胞への導入は、例えば、本明細書において特定されるＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムの導入の前またはそれと同時のトランスフォーメーション、トランスフェクション、またはトランスダクションによって行われてもよい。したがって、本発明のＡＡＶヘルパーコンストラクトは、一方でＡＡＶベクターのカプシドタンパク質の殻に関して、他方で前記ＡＡＶベクター複製およびパッケージングにおいて存在するＡＡＶゲノムに関して血清型の所望の組合せをもたらすように選択されてもよい。「ＡＡＶヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ複製およびパッケージングに必要とされる付加的な機能を提供する。

適したＡＡＶヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１型および２型など）およびワクチニアウイルスが挙げられる。参照によって本明細書に組み込む米国特許第６，５３１，４５６号明細書に記載されているとおり、ヘルパーウイルスによってもたらされる付加的な機能も、ベクターにより宿主細胞に導入することができる。好ましくは、本発明による組み換えＡＡＶベクターに存在するＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）遺伝子またはｃａｐ（カプシド）遺伝子などのウイルスタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列を含まない。ＡＡＶゲノムは、例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）をコードする遺伝子あるいは当該技術分野において既知の化学的に、酵素的にもしくは別の方法で検知可能なおよび／または選択可能な産生物をコードする遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈなど）などのマーカー遺伝子あるいはレポーター遺伝子をさらに含んでもよい。好ましくは、本発明によるＡＡＶベクターは、構築され、本明細書の実施例の方法に従って作製される。本発明による好ましいＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクター、好ましくは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９またはＡＡＶ２／２ベクターであり、ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン３８、エクソン３９、イントロン３９、エクソン４０、もしくはイントロン４０のヌクレオチド配列、またはヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン３８／エクソン３９、エクソン３９／イントロン３９、イントロン３９／エクソン４０、もしくはエクソン４０／イントロン４０の境界と重なる配列と相補的または実質的に相補的な配列を含むか、または好ましくは、それからなる本発明によるＡＯＮを発現させる。本発明によるさらに好ましいＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクター、好ましくは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９またはＡＡＶ２／２ベクターであり、配列番号１から３７のいずれか１つを含むか、または好ましくは、それからなる本発明によるＡＯＮを発現させる。

個体または前記個体の細胞、組織、臓器に本発明によるＡＯＮを与える手段の改善は、これまでに既に成し遂げられた進歩を考慮して予想される。そのような将来的な改善は、当然、本発明の方法を使用したｍＲＮＡの再構築に関して言及した効果を達成するために組み込まれてもよい。本発明によるＡＯＮは、そのまま個体、前記個体の細胞、組織もしくは臓器に送達されてもよい。本発明によるＡＯＮを投与するとき、ＡＯＮを送達方法と適合した溶液に溶解させることが好ましい。水溶液にプラスミドを与えることによって網膜細胞にＡＯＮ発現のためのプラスミドが与えられてもよい。あるいは、ＡＯＮまたはＡＯＮ発現のためのプラスミドに対する好ましい送達方法は、ウイルスベクターまたはナノ粒子である。好ましくは、ウイルスベクターまたはナノ粒子は、網膜細胞に送達される。網膜細胞またはその他の関連した細胞へのそのような送達は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいてであってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡＯＮ送達に使用することができるナノ粒子および微粒子は、当該技術分野において周知である。あるいは、既知のトランスフェクション試薬を使用したトランスフェクションによってプラスミドが与えられてもよい。静脈内、皮下、筋肉内、くも膜下腔内および／または室内投与に対して、溶液は生理的食塩液であることが好ましい。本発明において特に好ましいのは、本明細書中で定義される各成分の細胞へおよび／または細胞（好ましくは、網膜細胞）中への送達を助けることになる賦形剤またはトランスフェクション試薬の使用である。本明細書中で定義される複合体を形成した各成分、またはベシクルもしくはリポソームに閉じ込められた各成分を細胞膜を通して送達する複合体、ナノ粒子、ミセル、ベシクルおよび／またはリポソームを形成することができる賦形剤またはトランスフェクション試薬が好ましい。こうした賦形剤の多くは、当該技術分野において知られている。適した賦形剤またはトランスフェクション試薬は、本明細書中で定義される各成分を細胞、好ましくは、網膜細胞に送達することができる粒子に自己集合することができるポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＥｘＧｅｎ５００（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もしくはその誘導体、またはポリプロピレンイミンもしくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）および誘導体を含む類似のカチオン性ポリマー、合成の両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ－１８）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ、ＤＯＴＡＰおよび／またはウイルスカプシドタンパク質を含む。そのような賦形剤は、網膜細胞を含む多種多様の培養細胞にＡＯＮを効率的に送達することが示された。それらの高いトランスフェクション潜在性は、全細胞生存に関して除外された低から中程度の毒性と組み合わされる。構造変更の容易さが、さらなる変更ならびにそれらのさらなる（ｉｎ ｖｉｖｏ）核酸運搬特性および毒性の分析を可能にするために使用されてもよい。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎは、リポソームトランスフェクション剤の例である。これは、カチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）（メチル硫酸塩であるＤＯＴＡＰと比較）および中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の２つの脂質構成成分からなる。中性構成成分が細胞内放出を仲介する。送達システムの別のグループは高分子ナノ粒子である。ＡＯＮを、細胞膜を越えて細胞中に送達することができるカチオン性ナノ粒子を製剤化するために、ＤＮＡトランスフェクション試薬として周知のジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランのようなポリカチオンが、シアノアクリル酸ブチル（ＰＢＣＡ）およびシアノアクリル酸ヘキシル（ＰＨＣＡ）と組み合わされてもよい。こうした一般的なナノ粒子材料に加えて、カチオン性ペプチドプロタミンが、コロイドを用いてオリゴヌクレオチドを製剤化するための代替的なアプローチを提供する。このコロイドナノ粒子系は、いわゆる、プロティクル（proticle）を形成することができ、これは、単純な自己集合プロセスによって作製することができ、ＡＯＮをパッケージングし、ＡＯＮの細胞内放出を仲介することができる。当業者は、ＡＯＮをＡＢＣＡ４バリアント関連疾患または状態の予防、処置または遅延のために送達すべく本発明に使用するためのＡＯＮをパッケージングおよび送達するために任意の上記またはその他の商業的に入手可能な代替的賦形剤および送達システムを選択し、適合させることができる。「ＡＢＣＡ４バリアント関連疾患または状態の予防、処置または遅延」は、本明細書において、好ましくは、ＡＢＣＡ４遺伝子の遺伝的欠陥に起因する部分的もしくは完全な視力障害もしくは失明の進行を予防する、停止させる、止める、または反転させることと定義される。

さらに、本発明によるＡＯＮは、細胞、細胞質および／またはその核への取り込みを促進するよう設計された標的化リガンドと特異的に共有結合的または非共有結合的に連結されてもよいであろう。そのようなリガンドは、（ｉ）細胞、組織もしくは臓器に特異的な細胞取り込みを促進するエレメントを認識する（以下に限定されるものではないがペプチ（様）構造を含む）化合物ならびに／あるいは（ｉｉ）細胞への取り込みおよび／またはベシクル、例えば、エンドソームもしくはリソソームからのオリゴヌクレオチドの細胞内放出を促進することができる化学的化合物を含んでもよいであろう。したがって、好ましい実施形態において、本発明によるＡＯＮは、組成物または薬剤、あるいは少なくとも、細胞への送達および／もしくはその送達デバイスのためならびに／または細胞内送達を向上させるための賦形剤および／または標的化リガンドとともに提供される組成物として製剤化される。

組成物が本明細書の後で定義される補助的な化合物などの付加的な成分を含む場合、組成物の各成分は、１つの単一の組合せまたは組成物または調製物として製剤化されなくてもよい。それらの素性に応じて、当業者は、どの製剤のタイプが本明細書中で定義される各成分に最も適切であるかがわかるであろう。好ましい実施形態において、本発明は、本発明によるＡＯＮ、さらに本明細書の後で定義される補助的な化合物を含むキット・オブ・パーツの形態である組成物または調製物を提供する。必要とされる場合、本発明によるＡＯＮまたは本発明によるＡＯＮを発現させるベクター、好ましくは、ウイルスベクターは、薬学的に許容される担体を添加することによって薬学的に活性な混合物に組み込まれてもよい。したがって、本発明はまた、本発明によるＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクターおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物、好ましくは、医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は、担体、増量剤、保存料、補助薬、可溶化剤および／または希釈剤を含む任意の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。そのような薬学的に許容される担体、増量剤、保存料、補助薬、可溶化剤および／または希釈剤は、例えば、Remington（Remington 2000. The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams Wilkins）において見つけることができる。前記組成物のそれぞれの特徴は、本明細書の前で定義した。

投与の好ましい経路は、水溶液または特に、眼内投与に適合した製剤の硝子体内注射による。欧州特許第２４２５８１４号明細書は、とりわけペプチドまたは核酸薬物の眼内（硝子体内）投与に適合した水中油型エマルジョンについて開示している。このエマルジョンは、硝子体液よりも密度が低いため、エマルジョンは硝子体の上部に浮かんで、注射された薬物が視野を悪くするのを回避する。

本発明による複数の異なるＡＯＮが使用される場合、本明細書において定義される濃度または用量は、使用されたすべてのＡＯＮの合計濃度もしくは用量または使用されたか、もしくは添加されたそれぞれのＡＯＮの濃度もしくは用量を指してもよい。したがって、一実施形態において、使用される本発明によるＡＯＮのそれぞれの量または合計量が、０．０１から２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０５から２０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与される組成物が提供される。適した硝子体内用量は、各眼当たり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇなど、各眼当たり０．０５ｍｇから５ｍｇの間、好ましくは０．１から１ｍｇの間であろう。

本発明による好ましいＡＯＮは、個体のＡＢＣＡ４バリアント関連疾患または状態の処置のためのものである。好ましくは、前記ＡＢＣＡ４バリアントは、ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃバリアントであるが、他のＡＢＣＡ４突然変異もエクソン３９またはエクソン３９／４０のスキッピングを引き起こす可能性があることは排除できないため、それも本発明のＡＯＮによってブロックすることができる。したがって、本発明のＡＯＮは、好ましくは、既知のｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異が原因となるスタルガルト病に使用されるが、（機能的な）ＡＢＣＡ４タンパク質の減少をもたらすＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン３９、またはエクソン３９／４０のスキップが原因となるいずれの疾患にも使用することができる。ここで、この特定の突然変異がそのスプライシング効果を引き起こすことが解明されたが、ＡＢＣＡ４突然変異の非常に大きな範囲を考慮すると、他の突然変異が同じスプライシングの改変を引き起こすことも排除できず、これもまた、本発明のＡＯＮによって予防することができる。したがって、本発明は、ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異またはＡＢＣＡ４遺伝子における（まだわかっていない）別の突然変異が原因である可能性があるＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン３９のスキッピングをブロックまたは予防するＡＯＮに関する。

本発明のすべての実施形態において、「処置」という用語は、ＡＢＣＡ４バリアント関連疾患または状態の予防および／または遅延をまた含むと理解される。本発明によるＡＯＮを使用して処置することができる個体は、既にＡＢＣＡ４バリアント関連疾患または状態を有すると診断されていてもよい。あるいは、本発明によるＡＯＮを使用して処置することができる個体は、まだスタルガルト病などのＡＢＣＡ４バリアント関連疾患または状態を有すると診断されていなくてもよいが、個体の遺伝的背景を考慮にいれると将来的にそのような疾患または状態を発症するリスクが高い個体であってもよい。好ましい個体はヒト個体である。好ましい実施形態において、ＡＢＣＡ４バリアント関連疾患または状態は、スタルガルト病である。したがって、本発明は、ＡＢＣＡ４のスプライシングを調節することを必要とするＡＢＣＡ４バリアント関連疾患もしくは状態を処置するための薬剤として使用するため、およびＡＢＣＡ４バリアント関連疾患もしくは状態の予防、処置もしくは遅延のための薬剤として使用するための本発明によるＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物をさらに提供する。前記使用のそれぞれの特徴は、本明細書の前で定義した。

本発明は、ＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節することを必要とするＡＢＣＡ４バリアント関連疾患または状態の処置のための本発明によるＡＯＮの使用、もしくは本発明によるウイルスベクターの使用、または本発明による組成物をさらに提供する。好ましい実施形態において、および本発明のすべての態様に関して、ＡＢＣＡ４バリアント関連障害、疾患または状態は、ヒトＡＢＣＡ４遺伝子のエクソン３８におけるｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異が原因となる。

本発明は、薬剤の調製のため、ＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節する必要があるＡＢＣＡ４バリアント関連疾患または状態を処置するための薬剤の調製のため、およびＡＢＣＡ４バリアント関連疾患または状態の予防、処置または遅延のための薬剤の調製のための、本発明によるＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物の使用をさらに提供する。したがって、別の態様において、薬剤の調製のため、ＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節する必要がある状態を処置するための薬剤の調製のため、およびＡＢＣＡ４バリアント関連疾患または状態の予防、処置または遅延のための薬剤の調製のための、本明細書中で定義されるＡＯＮ、ウイルスベクターまたは組成物の使用が提供される。

本発明による使用または方法における処置は、少なくとも１回であり、１週間、１カ月、数カ月、１、２、３、４、５、６年またはそれ以上、例えば、一生涯続く。本発明による使用のための本明細書中で定義されるとおりのＡＯＮまたはその等価物のそれぞれは、ＡＢＣＡ４バリアント関連疾患または状態に既に冒されているか、またはそれを発症するリスクがある個体の細胞、組織および／または臓器へのｉｎ ｖｉｖｏにおける直接の投与に適していてもよく、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて直接投与されてもよい。本発明のＡＯＮ、組成物、化合物または補助的な化合物の投与の頻度は、疾患の重症度、患者の年齢、患者の突然変異、ＡＯＮの数（例えば、用量）、前記ＡＯＮの配合、投与の経路などのいくつかのパラメータにより左右される可能性もある。頻度は、１日１回、週に１回、２週間、もしくは３週間もしくは４週間もしくは５週間またはそれより長い期間に少なくとも１回の間で変化することもある。本発明によるＡＯＮの用量範囲は、好ましくは、厳しい手順要件が存在する臨床試験の用量漸増試験（ｉｎ ｖｉｖｏにおける使用）に基づいて設計される。本明細書中で定義されるとおりのＡＯＮは、０．０１から２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５から２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で使用されてもよい。適した硝子体内用量は、各眼当たり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇなど、各眼当たり０．０５ｍｇから５ｍｇの間、好ましくは０．１から１ｍｇの間であろう。好ましい実施形態において、本明細書中で定義されるとおりのＡＯＮの０．１ｎＭから１μＭの範囲の濃度が使用される。好ましくは、この範囲は、網膜細胞または網膜組織などの細胞モデルにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用のためのものである。より好ましくは、使用される濃度は、１から４００ｎＭ、さらにより好ましくは１０から２００ｎＭ、さらにより好ましくは５０から１００ｎＭの範囲である。いくつかのＡＯＮが使用される場合、この濃度もしくは用量は、ＡＯＮの合計濃度もしくは用量または添加されたそれぞれのＡＯＮの濃度もしくは用量を指す場合もある。好ましい実施形態において、本発明による分子のための送達媒体として、本明細書の前に記載されているウイルスベクター、好ましくは、ＡＡＶベクターは、１回の注射当たり１×１０⁹～１×１０¹⁷ウイルス粒子、より好ましくは、１回の注射あたり１×１０¹⁰～１×１０¹²ウイルス粒子の範囲の用量で投与される。上で示したとおりのＡＯＮの濃度または用量の範囲は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける使用に対して好ましい濃度または用量である。当業者は、使用されるＡＯＮ、処置される標的細胞、遺伝子標的およびその発現レベル、使用される培地ならびにトランスフェクションおよびインキュベーション条件に応じて、使用されるＡＯＮの濃度または用量がさらに変化することもあり、さらに最適化される必要がある場合もあることを理解するであろう。

本発明による使用のための本発明によるＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物は、ＡＢＣＡ４バリアント関連疾患もしくは状態に既に冒されているか、またはそれを発症するリスクがある個体の細胞、組織および／または器官へのｉｎ ｖｉｖｏにおける投与に適していてもよく、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて投与されてもよい。本発明による前記ＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物は、疾患もしくは状態に既に冒されているか、またはそのリスクがある個体の細胞、組織および／または器官へｉｎ ｖｉｖｏにおいて直接または間接的に投与されてもよく、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて直接または間接的に投与されてもよい。スタルガルト病は網膜に顕著な形質を有するため、細胞が網膜細胞であることが好ましく、かつ前記組織が網膜であることがさらに好ましく、かつ／または前記器官が眼であることがさらに好ましい。

本発明は、細胞におけるＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節するための方法であって、細胞、好ましくは、網膜細胞を、本発明によるＡＯＮ（したがって、エクソン３９のスキッピングをブロックするＡＯＮ）、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と接触させることを含む方法をさらに提供する。この態様の特徴は、好ましくは、本明細書の前で定義されたものである。細胞を本発明によるＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と接触させることは、当業者に既知の任意の方法によって行われてもよい。本明細書に記載されているＡＯＮ、ウイルスベクターおよび組成物の送達のための方法の使用が含まれる。接触させることは、直接的または間接的であってもよく、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてであってもよい。

本発明は、ＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とする個体の、それを必要とするＡＢＣＡ４バリアント関連疾患または状態の処置のための方法であって、前記個体の細胞、好ましくは、網膜細胞を、本発明によるＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と接触させて、前記ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン３９のスプライシングを予防またはブロックすることを含む方法をさらに提供する。この態様の特徴は、好ましくは、本明細書の前で定義されたものである。細胞、好ましくは、網膜細胞を、本発明によるＡＯＮ、または本発明によるウイルスベクター、または本発明による組成物と接触させることは、当業者に既知の任意の方法によって行われてもよい。本明細書に記載されているＡＯＮ、ウイルスベクターおよび組成物の送達のための方法の使用が含まれる。接触させることは、直接または間接的であってもよく、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてであってもよい。別に指示がある場合を除いて、本明細書に記載されている各実施形態は、本明細書に記載されている別の実施形態と組み合わされてもよい。

本明細書で提供した配列情報は、エラーを伴って特定された塩基を含める必要があるほど狭く解釈されるべきではない。当業者は、エラーを伴って特定されたそのような塩基を特定することができ、そのようなエラーの正し方を知っている。本明細書において引用されているすべての特許および参照文献は、その全体を参照によって本明細書に組み込む。
本発明は次の態様にも関する。
（１）ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおいて少なくとも１つのエクソンのスキッピングを阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、前記エクソンスキッピングは、ＡＢＣＡ４遺伝子における変異によるものである、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）。
（２）前記エクソンスキッピングを引き起こす前記変異は、イントロンにある、上記（１）に記載のＡＯＮ。
（３）前記変異は、前記ヒトＡＢＣＡ４遺伝子のイントロン３８におけるｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ変異である、上記（２）に記載のＡＯＮ。
（４）前記ＡＯＮは、エクソン３９スキッピングおよび／またはエクソン３９／エクソン４０二重スキッピングを阻害することができる、上記（１）から（３）のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
（５）配列番号４５、４６、４７、４８、４９、６５、もしくは６６、またはその一部のヌクレオチド配列、あるいは前記ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン３８／エクソン３９、エクソン３９／イントロン３９、イントロン３９／エクソン４０、またはエクソン４０／イントロン４０の境界と重なる配列と相補的なヌクレオチド配列を含むＡＯＮ。
（６）前記相補的な配列は、イントロン３８とエクソン３９の間の境界を含む、上記（５）に記載のＡＯＮ。
（７）前記相補的な配列は、前記ヒトＡＢＣＡ４遺伝子のイントロン３８におけるｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ変異を含む、上記（５）または（６）に記載のＡＯＮ。
（８）前記ＡＯＮは、配列番号４４内の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の連続したヌクレオチドと相補的な配列を含むか、またはそれからなる、上記（１）から（７）のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
（９）前記ＡＯＮは、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドを含み、最大で１つのＣｐＧモチーフをさらに含む、上記（８）に記載のＡＯＮ。
（１０）前記ＡＯＮは、配列番号６５または配列番号６６内の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の連続したヌクレオチドと相補的な配列を含むか、またはそれからなる、上記（８）に記載のＡＯＮ。
（１１）前記ＡＯＮは、配列番号１、３、４、５、６、９、１２、１３、１４、１７、２０、２４、２５、２９、３１、および３２のうちのいずれか１つの配列を含むか、またはそれからなる、上記（９）または（１０）に記載のＡＯＮ。
（１２）前記ＡＯＮは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾糖などの少なくとも１つの２’－Ｏアルキル修飾を含むオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）である、上記（１）から（１１）のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
（１３）前記ＡＯＮは、少なくとも１つの２’－メトキシエトキシ（２’－ＭＯＥ）修飾を含むオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）である、上記（１）から（１２）のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
（１４）前記ＡＯＮは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を有し、好ましくは、すべての連続したヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって互いに連結されている、上記（１）から（１３）のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
（１５）硝子体内投与用である、上記（１）から（１４）のいずれか一項に記載のＡＯＮ、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（１６）前記組成物は、各眼当たり合計ＡＯＮが０．０５から５ｍｇの間の範囲、好ましくは、各眼当たり合計ＡＯＮが約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇなど、各眼あたり合計ＡＯＮが０．１から１ｍｇの間の範囲で投与される、上記（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）上記（１）から（１１）のいずれか一項に記載のＡＯＮを発現させるウイルスベクター。
（１８）薬剤として使用するための、上記（１）から（１４）のいずれか一項に記載のＡＯＮ、上記（１５）または（１６）に記載の医薬組成物、または上記（１７）に記載のウイルスベクター。
（１９）スタルガルト病の処置、予防または遅延に使用するための、上記（１）から（１４）のいずれか一項に記載のＡＯＮ、上記（１５）もしくは（１６）に記載の医薬組成物、または上記（１７）に記載のウイルスベクター。
（２０）スタルガルト病の処置、予防または遅延のための、上記（１）から（１４）のいずれか一項に記載のＡＯＮ、上記（１５）または（１６）に記載の医薬組成物、または上記（１７）に記載のウイルスベクターの使用。
（２１）細胞におけるＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節するための方法であって、前記細胞を、上記（１）から（１４）のいずれか一項に記載のＡＯＮ、上記（１５）または（１６）に記載の医薬組成物、または上記（１７）に記載のウイルスベクターと接触させることを含む方法。
（２２）ＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングの調節を必要とする個体の、それを必要とするスタルガルト病または状態の処置のための方法であって、前記個体の細胞を、上記（１）から（１４）のいずれか一項に記載のＡＯＮ、上記（１５）もしくは（１６）に記載の医薬組成物、または上記（１７）に記載のウイルスベクターと接触させることを含む方法。

[実施例１]
ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン３９スキップをブロックするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の形成および試験
ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン３９スキッピングをブロックする能力に関して試験するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン３８とエクソン３９の間のイントロン３８中、エクソン３９中、およびエクソン３９とエクソン４０の間のイントロン３９中ならびにイントロンとエクソンの境界に存在するエクソンまたはイントロンスプライシング部位（ＥＳＳおよびＩＳＳ）のいずれかを標的として設計した（図１および２）。この目的は、長過ぎないＡＯＮ（製造目的のため、投与効率のためおよびそれが自己アニーリングを制限することになろう）、最大で１つのＣｐＧモチーフを含むＡＯＮ、および高過ぎるパーセンテージのグアノシンを含まないＡＯＮを設計することであった。初めに設計したすべてのＡＯＮを表１に示す。すべてのＡＯＮの長さは、２０から２５ヌクレオチドの範囲内にあり、すべてのＡＯＮは、完全に２’－Ｏ－メチル修飾されている。すべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。製造後、ＡＯＮを水中で復元して、１００μＭの最終濃度にした。

ミニジーン（mini-gene）の構築
ヒト網膜芽細胞腫ＷＥＲＩ－Ｒｂ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１６９（商標））細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ；カタログ番号Ｓ１８１）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ４３３３－１００ＭＬ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１１８７５－０８５）中で増殖させた。ＤＮＡ単離のために、ＷＥＲＩ－Ｒｂ－１細胞の１つのＴ７５フラスコを回収し、３００×ｇで５分間遠心分離して、細胞ペレットを回収した。製造業者の説明書に従ってＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅキットを使用してＤＮＡを抽出した。ＤＮＡは、キットが提供する２００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＡＥ中に溶出した。収率を増加させるために、その溶離液を、同じカラムを２回通過させた。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してＤＮＡ濃度を測定し、さらなる使用のためにサンプルを－２０℃で保存した。

５’および３’末端にそれぞれＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限部位を含む野生型インサート（ＷＴ）を形成するために、３００ｎｇのＷＥＲＩ－Ｒｂ－１ ＤＮＡを鋳型として使用し、標的配列の増幅を、以下のプライマーセットとともにＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号Ｆ５３０Ｌ）を使用して行った。
ＭＧ１ ＷＴ（Sangermano et al. 2016）：
ＭＧ１－Ｆ ５’－ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＡＴＧＣＣＴＴＧＡＧＧ－３’（配列番号５１）
ＭＧ１－Ｒ ５’－ＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＣＴ－３’（配列番号５２）
ＭＧ２ ＷＴ（Sangermano et al. 2016）：
ＭＧ２－Ｆ ５’－ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＴＴＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣＴＴＧＴＡＡ－３’（配列番号３８）
ＭＧ２－Ｒ ５’－ＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＡＣＡＧＴＣＴＧＡＴＧＣＡＧ－３’（配列番号３９）
ＭＧ３ ＷＴ（本明細書中で開示されている、エクソン３９のみ）：
ＭＧ３－Ｆ ５’－ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＴＣＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＧＴ－３’（配列番号５３）
ＭＧ３－Ｒ ５’－ＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧ－３’（配列番号５４）
ＭＧ４ ＷＴ（本明細書中で開示されている、エクソン３９およびエクソン４０）：
ＭＧ４－Ｆ ５’－ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＴＣＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＧＴ－３’（配列番号５３）
ＭＧ４－Ｒ ５’－ＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴ－３’（配列番号５５）

ＭＧ３インサートは、イントロン３８の位置－１５０から始まり、イントロン３９の＋１５２で終わるのに対し、ＭＧ４インサートは、イントロン３８の位置－１５０から始まり（ＭＧ３と同じ）、イントロン４０の位置＋２４６で終わる。得られたＰＣＲ産物を、製造業者の手順に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ；カタログ番号７４０６０９．２５０）でゲル精製した。異なる長さの隣接イントロンを有する突然変異インサートを、５’および３’末端にそれぞれにＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限部位を含むｇＢｌｏｃｋｓとしてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに注文した。

ＤＮＡインサート（上で概説した野生型および突然変異ｇＢｌｏｃｋフラグメント）および宿主ベクターｐＥＴ０１ Ｅｘｏｎｔｒａｐベクター（ＭｏＢｉＴｅｃ ＧｍｂＨ；カタログ番号Ｋ２０１０）を、当該技術分野において既知の一般的な手順を使用してＳａｌＩおよびＮｏｔＩによって消化し、独立してともに連結した。ベクター中のインサートの存在を、以下のプライマー対を使用したＰＣＲによって調べた：エクソン１順方向：５’－ＣＣＡＧＧＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号４０）およびエクソン２逆方向：５’－ＡＴＴＧＣＡＧＡＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＧ－３’（配列番号４１）。イントロン３８の一部（突然変異を有する、および有さない）およびエクソン３９全体、ならびにイントロン３９の一部（ＭＧ１、ＭＧ２およびＭＧ３）を有する得られたコンストラクトを図４に模式的に示す（上のパネル）。

本発明のＡＯＮを使用することによるエクソン３９／エクソン４０二重スキッピングのブロックを調査するための、単一のベクター中にイントロン３８の一部（突然変異を有する、および有さない）、エクソン３９の全体、イントロン３９の全体、エクソン４０の全体、およびイントロン４０の一部を含むコンストラクトを得るために同様のアプローチを使用した。エクソン３９の上流のイントロン３８の突然変異位置とともにエクソン３９およびエクソン４０を含むコンストラクト（ＭＧ４）を図４に示す（下のパネル）。

細胞培養、トランスフェクション、ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成
ＨｅＬａ細胞を、１０％ ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ中において培養した。細胞を２×１０⁵細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播いた。連続したトランスフェクションのために、播いた１日後に、その細胞に、１０％ ＦＢＳを加えた１ｍｌのＤＭＥＭ中においてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１６６８０１９）を使用して２００～５００ｎｇのプラスミドをトランスフェクションし、６時間インキュベートした後、培地を補給した。２４時間後、細胞に、５００μｌの培地中において１００～２５０ｎＭのＡＯＮをトランスフェクションした。ＡＯＮトランスフェクションの２４時間後にＲＮＡを単離した。二重トランスフェクションのために、播いた１日後に、その細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌ３００００１５）を使用して１０％ ＦＢＳを含む５００μＬのＤＭＥＭ中において２００～５００ｎｇのプラスミド＋２５０ｎＭのＡＯＮをコトランスフェクションした。６時間のインキュベーション後、培地を補給した。ＲＮＡを、２４～４８時間後に単離した。このために、細胞をＰＢＳで洗浄し、３５０μｌのＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット、＃７４１３６）で溶解させた。製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４１３６）を使用してＲＮＡを単離した。キットとともに供給されたｇＤＮＡ Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒカラムを使用してゲノムＤＮＡを除去した。３０μｌのＲＮＡｓｅフリー水中にＲＮＡを溶出した。収率を増加させるために、その溶離液を、同じカラムを２回通過させた。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してＲＮＡ濃度を測定し、さらなる使用のためにサンプルを－８０℃で保存した。ｃＤＮＡ合成のために、１０００ｎｇのＲＮＡを、ランダムヘキサマープライマーを用いたＭａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号ＥＰ０７４２）のための鋳型として使用し、製造業者の説明書に従って処理した。対照として非ＲＴサンプル（酵素なし）を含ませ、他のサンプルとともに分析した。

ＰＣＲ、バイオアナライザーおよびｄｄＰＣＲ
基本的には、ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡのフラグメントは、依然としてエクソン３９を含む場合、一方または両方のＰＣＲプライマーがそのエクソン内にあるとき、ＰＣＲを使用して特異的に増幅することが可能である。ｍＲＮＡ中にエクソン３９が依然として存在しているかどうかを見るために、１００ｎｇのｃＤＮＡを形成し、鋳型および標的配列の増幅として使用した。これは、以下のプライマーを使用して行った：エクソン３９順方向：５’－ＣＴＧＣＴＣＡＴＴＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＡ－３’（配列番号４２）およびエクソン３９逆方向：５’－ＣＡＡＡＣＣＧＧＧＣＡＴＡＧＡＣＡＴＣＴＧ－３’（配列番号４３）。エクソン３９配列においてこれらの両プライマーがアニーリングし、これにより、エクソン３９を含むバックグラウンドｍＲＮＡ（ＨｅＬａ細胞中）が共増幅されることになる。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号Ｆ５３０Ｌ）を使用してＰＣＲ反応を行った。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００ソフトウェアを使用したＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（ＤＮＡ １０００キット、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりＰＣＲフラグメントを解析した。

ｄｄＰＣＲ分析のために、ＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してサンプルを分析した。プラスミドのエクソン１および２を増幅するプライマーならびにＡＢＣＡ４エクソン３９およびプラスミドエクソン１を標的とする２つのプローブからなる特製のアッセイを形成する（ＩＤＴ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。実験構成および分析を製造業者の手順に従って実施する（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＱＸ２００システム）。

結 果
図６は、さまざまなＡＯＮを用いて、および用いずに行ったｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異をもつＭＧ３コンストラクト（＋ＭＧ３ ｍｕｔ．）またはＭＧ３野生型コンストラクト（＋ＭＧ３ ＷＴ）によるＨｅＬａ細胞のトランスフェクション後のバイオアナライザーにおけるＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。初めに、配列番号１から１６の１６のＡＯＮを試験した（図２および表１を参照）。エクソン３９配列内でアニーリングするプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行い、これにより、下のパネルの「ＨｅＬａ（ＮＴ）」（非トランスフェクションＨｅＬａ細胞）で示したレーンも予想されるレベルでバンドを示すようになる。これは、ＨｅＬａ細胞が野生型ＡＢＣＡ４遺伝子をもつという事実によるものであり、これから明らかにｍＲＮＡが産生され、これからまたその後、陽性ＰＣＲ産物が形成される。陰性対照（「ｃｔｒＡＯＮ」）は、突然変異を有するＭＧ３コンストラクトおよび無関係の非ＡＢＣＡ４アニーリングＡＯＮによるトランスフェクションであった。別の陰性対照は、コンストラクトまたはＡＯＮを用いずにトランスフェクション試薬によってのみトランスフェクションされた細胞を表す「Ｍｏｃｋ ｔｒ」レーンである。「Ｒｔ－ｃｔｒ」および「Ｈ₂Ｏ」は、細胞物質を伴わない、ＰＣＲ反応に関するさらなる２つの陰性対照であり、シグナルを示さない。

産物バンドの強度の増加は、エクソン３９を含むｍＲＮＡコピーの増加を示唆する。そのようなものはバックグラウンドとしてＨｅＬａ細胞において既に形成されたものに基づいて、実際に、ＡＯＮがトランスフェクションされていないＷＴシグナルと比較して評価されるべきであるため、「ＷＴ－ｎｏ ＡＯＮ」で示したレーンを１００％として取り、その１００％強度と比較して他のバンドの強度を測定するためにバイオアナライザーソフトウェアを利用した。これは、およそ１／３（２９％）が、少なくともバックグラウンドのＨｅＬａ単独のシグナルによるものであることを示す。といっても、それは、ＰＣＲ反応であるため、発現レベルの差を示すための最高の測定法ではない。このデータは、ＡＯＮを用いて、または用いずに行ったトランスフェクション自体がこの構成を使用しておよそ７０％へのＡＯＮと無関係なシグナルの増加を示すことができることを示す。しかしながら、ＡＯＮ１、ＡＯＮ３、ＡＯＮ４、ＡＯＮ５、ＡＯＮ６、ＡＯＮ１２、ＡＯＮ１３、およびＡＯＮ１４で検出された強度は、１００％に設定したＷＴシグナルの少なくとも８０％へ増加し、ＡＯＮ３、ＡＯＮ４、ＡＯＮ６、およびＡＯＮ１２が最も良く機能して少なくとも９０％の強度であった。これは、これらのＡＯＮがｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異をもつＭＧ３コンストラクトからのエクソン３９スキッピングを、エクソン３９がスキップされない野生型の状態に近いレベルまで阻害することができることを示す。

[実施例２]
ＨＥＫ２９３細胞においてヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン３９スキップをブロックするためのＡＯＮのｄｄＰＣＲ分析を使用したさらなる試験
実施例１に記載し、初めに試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドを、定量的でアイソフォーム特異的なｄｄＰＣＲアッセイを使用してＨＥＫ２９３細胞においてさらに評価した。簡単に述べると、ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異を含むＡＢＣＡ４エクソン３９ミニジーン（ＭＧ３）をＨＥＫ２９３細胞において一時的に発現させ、さまざまなＡＯＮで処理した。非ＡＯＮ処理（ｍｏｃｋ）サンプルを基準対照として使用した。ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン３９のスキッピングをブロックするＡＯＮの能力を定量するためにｄｄＰＣＲアッセイを使用した。

細胞培養条件、トランスフェクション、ＲＮＡ単離
ＭＧ３については実施例１に記載した。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ中で培養した。０．２×１０⁶細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートに細胞を播いた。各処理条件に２つのサンプル（反復）を使用した。二重トランスフェクションのために、播いた１日後に、その細胞に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１０％ ＦＢＳを加えた１ｍＬのＤＭＥＭ中において１：２のｗ／ｖ比で、７５ｎｇのＭＧ３プラスミドおよび２５０ｎＭのＡＯＮをトランスフェクションした。製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４１３６）を使用してトランスフェクションの２４時間後にＲＮＡを単離した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してＲＮＡ濃度を測定し、さらなる使用のためにサンプルを－８０℃で保存した。

ｄｄＰＣＲ定量
ｄｄＰＣＲは、供給業者の手順に従ってＯｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｄｄＰＣＲ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してＱＸ２００システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において行った。アッセイには、それぞれ９００ｎＭの順方向および逆方向プライマーおよび２５０ｎＭの標識プローブが含まれた。ＡＯＮ７、８、９、１０、１１、２６、２７、２８、および２９に関しては、５’－ＡＧＣＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＴＧＴ－３’（配列番号５６）を順方向プライマーとしておよび５’－ＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＣＴＴＧ－３’（配列番号５７）を逆方向プライマーとしてならびに５’－ＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＣ－３’（配列番号５８）をプローブとして使用してエクソン３９包含を評価した。残りのＡＯＮに関しては、５’－ＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴＧＴＧＧＴ－３’（配列番号５９）を順方向プライマーとして、５’－ＴＧＴＧＣＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＧＧＧ－３’（配列番号６０）を逆方向プライマーとしておよび５’－ＧＧＴＣＡＡＴＧＡＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡ－３’（配列番号６１）をプローブとして使用してエクソン３９包含を評価した。５’－ＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴＧＴＧＧＴ－３’（配列番号６２）を順方向プライマーとして、５’－ＣＡＡＧＧＴＣＴＧＡＡＧＧＴＣＡＣＧＧＧ－３’（配列番号６３）を逆方向プライマーとしておよび５’－ＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＡＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡ－３’（配列番号６４）をプローブとして使用してエクソン３９排除を評価した。エクソン３９包含のパーセンテージは、式：（エクソン３９包含×１００）／（エクソン３９包含＋エクソン３９排除）を使用して算出した。

結 果
ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異をもつＭＧ３コンストラクトおよびＡＯＮ（複数可）をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞におけるエクソン３９包含のパーセンテージのｄｄＰＣＲ定量を図７に示す。ＡＯＮを、異なる日にバッチで評価し、その結果を対応する非ＡＯＮ処理（ｍｏｃｋ）対照とともに実験毎に表す。データは、平均値±標準偏差として示す。未処置の「ｍｏｃｋ」条件では、転写物のおよそ１０％においてエクソン３９包含が確認された。多くのＡＯＮは、ｍｏｃｋと比較して、エクソン３９を含む転写物のパーセンテージを増加させることができた。図７Ａにおいて確認できるとおり、ＡＯＮ３１が包含の最高のパーセンテージ（すなわち６２％）を示し、ＡＯＮ３２、ＡＯＮ１２およびＡＯＮ１が続き、それらは、それぞれ４９％、４３％および４１％のパーセンテージを示した。ＡＯＮ１７、ＡＯＮ２０およびＡＯＮ３５も低い程度ではあるがエクソン包含の増加をもたらした。

重要なことに、ＡＯＮ１２、ＡＯＮ３１およびＡＯＮ３２は、ＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡのイントロン３９にある一部重なる領域に結合し、これは、以下の配列を有するホットスポットの存在を示す：５’－ＵＧＧＵＡＧＣＣＧＡＧＧＣＣＣＡＵＧＧＡＧＣＡＵＧＧＧＣＣＣＵＧＧＧ－３’（配列番号６５）。ＡＯＮ１およびＡＯＮ１７も一部重なる領域に結合し、これは、イントロン３８のホットスポットの存在を示す（５’－ＵＵＧＣＣＣＵＧＵＧＣＵＧＵＣＣＵＧＵＧＡＧＡＧＣＡＵＣＵＧＧ－３’（配列番号６６）。両ホットスポットを図２にイタリックのフォントで示す。

[実施例３]
代替（ＭＧ３＿２）ミニジーンコンストラクトを使用した、ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン３９スキップをブロックするためのＡＯＮの試験
実施例１および実施例２に記載し、そこで示されるとおりに試験したさまざまなＡＯＮを新しいミニジーンコンストラクトを使用してさらに評価した。簡単に述べると、ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異を含む新しいＡＢＣＡ４エクソン３９ミニジーン（本明細書においてＭＧ３＿２と呼ぶ）をＨＥＫ２９３細胞において一時的に発現させて、さまざまなＡＯＮで処理した。非ＡＯＮ処理（ｍｏｃｋ）サンプルを基準対照として使用した。さらに、ＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡと相補的でないスクランブルＡＯＮを対照として使用した。ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン３９のスキッピングをブロックするＡＯＮの能力を定量するために、定量的でアイソフォーム特異的なｄｄＰＣＲアッセイを使用した。

ミニジーンＭＧ３＿２の構築
ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異を含む、ＡＢＣＡ４エクソン３９配列およびその隣接イントロン領域を含むＤＮＡインサートを、５’および３’末端にそれぞれＥｃｏＲ１およびＳａｌＩ部位をもつｇＢｌｏｃｋ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として化学合成し、ｐＣＩ－ｎｅｏ－ｍａｍｍａｌｉａｎスプライシングベクター（国際公開第２０１６／００５５１４号パンフレット；国際公開第２０１７／１８６７３９号パンフレットに記載されている）に挿入して、（ヒトＡＢＣＡ４イントロン３８－エクソン３９－イントロン３９配列を除く）すべての配列を元のまま残した。図８は、ＭＧ３＿２コンストラクトの配列およびその中のＡＢＣＡ４配列の位置を示す。

細胞培養、トランスフェクション、ＲＮＡ単離
実施例２に記載したとおりに、ＨＥＫ２９３細胞を培養し、播いた。連続したトランスフェクションのために、播いた１日後に、その細胞に、ｍａｘＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１：３のｗ／ｗのＤＮＡ：ＰＥＩ比で使用して、１０％ ＦＢＳを加えた１ｍＬのＤＭＥＭ中において５０ｎｇのプラスミドをトランスフェクションした。２４時間後、細胞に、１ｍＬの培地中においてＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：２のｗ／ｖ比で使用して２５０ｎＭのＡＯＮをトランスフェクションした。製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＡＯＮトランスフェクションの２４時間後にＲＮＡを単離した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してＲＮＡ濃度を測定し、さらなる使用のためにサンプルを－８０℃で保存した。

ｄｄＰＣＲ定量
ｄｄＰＣＲを、実施例２に記載したとおりに行った。５’－ＴＡＣＡＴＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＣＡＣＴＴＣ－３’（配列番号７０）を順方向プライマーとして、５’－ＧＡＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴ－３’（配列番号７１）を逆方向プライマーとしておよび５’－ＡＡＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＧＣ－３’（配列番号７２）をプローブとして使用してエクソン３９包含を評価した。配列番号７０のプライマーを順方向プライマーとして、５’－ＧＣＡＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＴ－３’（配列番号７３）を逆方向プライマーとしておよび５’－ＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧ－３’（配列番号７４）をプローブとして使用してエクソン３９排除を評価した。エクソン３９包含のパーセンテージを実施例２のとおりに算出した。

結 果
図９Ａは、ＭＧ３＿２ミニジーンコンストラクトの概略版を示す。初めに、ＨＥＫ２９３細胞に、プラスミド単独をトランスフェクションし、ＲＮＡを、ＲＨＯエクソン３および５領域からのプライマーを使用してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物をバイオアナライザーにおいて分析した（図９Ｂ）。ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異のために、転写物の大半でエクソン３９が欠如しており（下のバンド）、実際にエクソン３９包含（上のバンド）がはるかに低いレベルで確認された。

ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異をもつＭＧ３＿２コンストラクトおよびＡＯＮ（複数可）をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞におけるエクソン３９包含のパーセンテージのｄｄＰＣＲ定量を図９Ｃに示す。データは、平均値±標準偏差として示す。スクランブル対照（Ｓｃｒ． Ｃｏｎｔと示した）は、ＭＧ３＿２コンストラクトおよび無関係の非相補的なＡＯＮによるトランスフェクションを指す。「Ｍｏｃｋ」は、非ＡＯＮ処置（陰性対照）を指す。ｍｏｃｋ条件では、転写物の１１％でエクソン３９包含が確認された。多くのＡＯＮがこのバックグラウンドパーセンテージを増加させることができた。ＡＯＮ３２は、エクソン３９包含の最高のパーセンテージ（４９％）を示し、これは、実施例２で述べた結果と一致する。また、ＡＯＮ３２は、ＡＯＮ３１およびＡＯＮ１２と一部重複し、これらも、エクソン３９包含の量を増加させた。これは、配列番号６５の配列が本当にＡＯＮアニーリングおよびエクソン３９保持の誘導に関するホットスポットを表すことを確認する。実施例２においてエクソン３９包含の増加をもたらしたＡＯＮ１およびＡＯＮ１７もこの試験においてプラスの効果を示し、これは、配列番号６６の配列もＡＯＮアニーリングおよびエクソン３９保持の誘導に関するホットスポットを表すことを確認する。エクソン３９包含の増加を示した他のＡＯＮは、ＡＯＮ３、４、９、２４、２５、および２９であった。

[実施例４]
ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン３９スキップをブロックするための、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）修飾を有するＡＯＮ
エクソン３９包含に対するＡＯＮの効果をさらに検討するために、ＡＯＮ１およびＡＯＮ３２を、それぞれのヌクレオシドに２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）修飾を伴い形成し、それぞれのヌクレオシドに２’－ＯＭｅ修飾を含むＡＯＮ１およびＡＯＮ３２（上の実施例で使用した）と比較した。ＡＯＮ１－ＭＯＥおよびＡＯＮ３２－ＭＯＥのヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン３９のスキッピングをブロックする能力を評価し、ＡＯＮ１およびＡＯＮ３２と比較した。簡単に述べると、ｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ突然変異を含むＡＢＣＡ４エクソン３９ミニジーン（ＭＧ３＿２、実施例３を参照）を、ＨＥＫ２９３細胞において一時的に発現させ、さまざまなＡＯＮで処理した。非ＡＯＮ処理サンプルを基準対照として使用した。ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡからのエクソン３９のスキッピングをブロックするＡＯＮの能力を定量するために、定量的でアイソフォーム特異的なｄｄＰＣＲアッセイを使用した。ＨＥＫ２９３細胞を、上記のとおり培養し、播き、２５０ｎＭのＡＯＮを５０ｎｇのプラスミドの文脈でトランスフェクションした。ｄｄＰＣＲを実施し、エクソン包含パーセンテージの計算は、実施例３に記載したとおりとした。結果を平均値±標準偏差として図１０に示す。「Ｍｏｃｋ」は、非ＡＯＮ処置（すなわち、陰性対照）を指す。未処置の「ｍｏｃｋ」条件では、転写物のおよそ１４％でエクソン３９包含が確認され、これは、実施例３で確認されたものと一致して、（ともに２’－ＯＭｅ修飾を有する）ＡＯＮ１およびＡＯＮ３２による処理後に有意に増加した。ＡＯＮ１の効果（転写物のおよそ２４％がエクソン３９を保持した）は、ＡＯＮ１ ＭＯＥでおよそ４０％まで増加し、これは、（より安定している可能性が最も高い）２’－ＭＯＥ修飾オリゴヌクレオチドを使用した場合の、改善されたより効率的なエクソン３９保持を示した。同様の傾向がＡＯＮ３２でも認められた。ＡＯＮ３２（２’－Ｏ－メチル化学作用（chemistry））処理サンプルでは、転写物のおよそ４５％がエクソン３９を保持したのに対し、ＡＯＮ３２ ＭＯＥ（２’－Ｏ－メトキシエチル化学作用）処理サンプルでは、転写物のおよそ５８％がエクソン３９を保持した。

Claims (15)

1. ヒトＡＢＣＡ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおいて少なくとも１つのエクソンのスキッピングを阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、前記エクソンスキッピングは、ＡＢＣＡ４遺伝子のイントロン３８におけるｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ変異によるものであり、前記ＡＯＮは、エクソン３９スキッピングおよび／またはエクソン３９／エクソン４０二重スキッピングを阻害することができるものであり、前記ＡＯＮは、配列番号６５又は配列番号６６内の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の連続したヌクレオチドと相補的な配列を含むか、またはそれからなる、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）。
2. 前記相補的な配列は、前記ヒトＡＢＣＡ４遺伝子のイントロン３８におけるｃ．５４６１－１０Ｔ＞Ｃ変異を含む、請求項１に記載のＡＯＮ。
3. 前記ＡＯＮは、配列番号１、３、４、５、６、９、１２、１３、１４、１７、２０、２４、２５、２９、３１、および３２のうちのいずれか１つの配列を含むか、またはそれからなる、請求項１または２に記載のＡＯＮ。
4. 前記ＡＯＮは、少なくとも１つの２’－Ｏアルキル修飾を含むオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）である、請求項１から３のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
5. 前記ＡＯＮは、少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾糖を含むオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）である、請求項１から４のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
6. 前記ＡＯＮは、少なくとも１つの２’－メトキシエトキシ（２’－ＭＯＥ）修飾を含むオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）である、請求項１から５のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
7. 前記ＡＯＮは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を有している、請求項１から６のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
8. 前記ＡＯＮは、すべての連続したヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって互いに連結されている、請求項１から７のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
9. 硝子体内投与用である、請求項１から８のいずれか一項に記載のＡＯＮ、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
10. 前記組成物は、各眼当たり合計ＡＯＮが０．０５から５ｍｇの間の範囲で投与される、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記組成物は、各眼当たり合計ＡＯＮが０．１から１ｍｇの間の範囲で投与される、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記組成物は、各眼当たり合計ＡＯＮが０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇ投与される、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 請求項１から３のいずれか一項に記載のＡＯＮを発現させるウイルスベクター。
14. 薬剤として使用するための、請求項１から８のいずれか一項に記載のＡＯＮ、請求項９から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１３に記載のウイルスベクター。
15. スタルガルト病の処置、予防または遅延に使用するための、請求項１から８のいずれか一項に記載のＡＯＮ、請求項９から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１３に記載のウイルスベクター。

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